ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΟΙ ΚΑΙ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΑ: ΔΙΑΣΠΟΡΑ ΑΝΘΕΚΤΙΚΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ ΚΑΙ ΤΩΝ ΑΝΤΙΣΤΟΙΧΩΝ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΣΤΟ ΥΔΑΤΙΝΟ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝ

Transcript

1 ο ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΟ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΟ ΣΥΝΕΔΡΙΟ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΗΧΑΝΙΚΗΣ, ΠΑΤΡΑ, 4-6 ΙΟΥΝΙΟΥ, 2015 ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΟΙ ΚΑΙ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΑ: ΔΙΑΣΠΟΡΑ ΑΝΘΕΚΤΙΚΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ ΚΑΙ ΤΩΝ ΑΝΤΙΣΤΟΙΧΩΝ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΣΤΟ ΥΔΑΤΙΝΟ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝ Γεώργιος Νιάρχος, Ιωσηφίνα Γουνάκη, Δανάη Βενιέρη Σχολή Μηχανικών Περιβάλλοντος, Πολυτεχνείο Κρήτης, Πολυτεχνειούπολη, 73 Χανιά ΠΕΡΙΛΗΨΗ Τα τελευταία χρόνια παρατηρείται σταθερή ανάπτυξη της ανησυχίας στην επιστημονική κοινότητα και στο ευρύ κοινό, όσον αφορά στην ανάπτυξη ανθεκτικότητας βακτηρίων στα αντιβιοτικά. Το πρόβλημα αναδείχθηκε με την εμφάνιση πολυανθεκτικών βακτηρίων, τα οποία συνιστούν πλέον μια νέα μορφή πανδημίας. Σκοπός της παρούσας έρευνας ήταν ο έλεγχος της ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικά περιβαλλοντικών βακτηριακών στελεχών, καθώς και η απομόνωση και ταυτοποίηση των αντίστοιχων γονιδίων ανθεκτικότητας. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η Ελλάδα συγκαταλέγεται στις ευρωπαϊκές χώρες με τα υψηλότερα επίπεδα μικροβιακής αντοχής, γεγονός που πιθανότατα συνδέεται με την υψηλή κατανάλωση αντιβιοτικών [1]. Το γεγονός αυτό υποδεικνύει την σχέση ανάμεσα στη χρήση αντιβιοτικών και στην ανάπτυξη της ανθεκτικότητας. Ύπαρξη γονιδίων ανθεκτικότητας εντοπίζεται όχι μόνο σε κλινικά στελέχη αλλά και σε περιβαλλοντικά, γεγονός που καταδεικνύει την έκταση του προβλήματος. Η περιβαλλοντική διάσταση του προβλήματος αφορά τη μεταφορά και την εξάπλωση γονιδίων ανθεκτικότητας μέσω της χρήσης και της μεταφοράς αντιβιοτικών στο περιβάλλον. Οι εγκαταστάσεις επεξεργασίας λυμάτων και τα εκτροφεία ζώων κρίνονται άμεσα επηρεαζόμενοι χώροι από την ανθρωπογενή δραστηριότητα [2]. Συχνά τα υπάρχοντα δεδομένα που χρησιμοποιούνται για την εκτίμηση των περιβαλλοντικών επιπτώσεων των αντιβιοτικών δεν επαρκούν για να τεκμηριώσουν το χρονικό διάστημα για το οποίο τα βακτήρια διατηρούν την μικροβιακή τους αντοχή, απουσία διαφόρων στρες. Από τη μία πλευρά, οι γνώσεις μας σχετικά με την υπολειμματική συγκέντρωση των αντιβιοτικών ουσιών και τις επιπτώσεις τους στα ελεύθερα στο περιβάλλον βακτήρια είναι ελλιπής και αντιφατική, ιδίως όσον αφορά στην αντοχή. Από την άλλη, υπάρχει ένας τεράστιος όγκος αποδείξεων ότι η ανθεκτικότητα στα αντιβιοτικά υπάρχει ήδη σε φυσικά περιβάλλοντα και ότι ανταλλάσσεται μεταξύ των βακτηρίων για τουλάχιστον μια δεκαετία. Συμπερασματικά τα παθογόνα ανθρώπων ζώων και φυτών καθώς και άλλα βακτήρια που απομονώθηκαν από διαφορετικούς βιότοπους (μεταξύ των οποίων και μονάδες επεξεργασίας λυμάτων) μοιράζονται ένα κοινό σύνολο των καθοριστικών γονιδίων αντίστασης που μπορεί εύκολα να ανταλλάσσονται [3, 4]. Στο πλαίσιο αυτό στόχοι της παρούσας εργασίας ήταν: α) η απομόνωση βακτηρίων από το υδάτινο κυρίως περιβάλλον και ο έλεγχος ανθεκτικότητάς τους σε ποικιλία αντιβιοτικών (β-λακτάμες & τετρακυκλίνες), β) η εύρεση της ελάχιστης ανασταλτικής συγκέντρωσης (ΜΙC) για καθένα από τα υπό μελέτη αντιβιοτικά, γ) η σύγκριση της ανθεκτικότητας ανάμεσα σε μικροβιακά στελέχη διαφορετικής προέλευσης και δ) η ταυτοποίηση των αντίστοιχων γονιδίων ανθεκτικότητας. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Συνολικά συλλέχθηκαν δείγματα από α) θαλασσινό νερό, β) είσοδο και έξοδο δύο εγκαταστάσεων επεξεργασίας λυμάτων και γ) από τα κόπρανα ενός ορνιθοτροφείου, στην ευρύτερη περιοχή των Χανίων. Η δειγματοληψία πραγματοποιήθηκε κατά τους μήνες Μάιο, Ιούνιο και Σεπτέμβριο του Τα υγρά δείγματα αναλύθηκαν με τη μέθοδο διήθησης διαμέσου μεμβράνης (φίλτρα νιτροκυτταρίνης) με διάμετρο πόρων 0,45μm. Οι μεμβράνες τοποθετήθηκαν σε εκλεκτικά θρεπτικά υποστρώματα: m-endo Agar Les, Slanetz & Bartley medium, Agar (HiMedia) και ακολούθησε επώαση στους 37 o C για 24h/48h, ανάλογα με την ομάδα βακτηρίων. Όσον αφορά στο κοπρανώδες υλικό πραγματοποιήθηκε απευθείας καλλιέργεια στα εκλεκτικά θρεπτικά υλικά. Κατόπιν επώασης έγινε βιοχημική ταυτοποίηση των απομονωμένων βακτηρίων με το σύστημα API (Biomerieux). Στόχος ήταν η απομόνωση βακτηριακών στελεχών που ανήκουν στις οικογένειες Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, και Enterococcaceae. Η κατανομή και η προέλευση των βακτηρίων που απομονώθηκαν φαίνεται στο σχήμα 1. Η ανθεκτικότητα των στελεχών εξετάστηκε σε αντιβιοτικά που ανήκουν στις β-λακτάμες και στις τετρακυκλίνες. Συγκεκριμένα εξετάστηκαν αντιβιοτικά ευρείας χρήσης που εντάσσονται σε 4 διαφορετικές κλάσεις: Ampicillin (Πενικιλλίνες), Cefaclor (Κεφαλοσπορίνες 2 ης γενιάς), Imipenem (Καρμπαπενέμες) και Tetracycline (Τετρακυκλίνες). Η μέθοδος που χρησιμοποιήθηκε είναι η μέθοδος ελάχιστης ανασταλτικής συγκέντρωσης (Minimum Inhibitory Concentration MIC), με μικρο-αραιώσεις σε ζωμό Mueller-Hinton Broth (Broth Microdillution). Το εύρος των συγκεντρώσεων των αντιβιοτικών, επιλέχθηκε με σκοπό να καλύπτει το

2 ο ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΟ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΟ ΣΥΝΕΔΡΙΟ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΗΧΑΝΙΚΗΣ, ΠΑΤΡΑ, 4-6 ΙΟΥΝΙΟΥ, 2015 εύρος των κλινικά δοσολογούμενων ποσοτήτων. Η ανθεκτικότητα των μικροοργανισμών κρίθηκε βάσει του ISO :2007 ( και των δεδομένων χρησιμοποιούμενων συγκεντρώσεων του EUCAST για κλινικά στελέχη ( Συγκεκριμένα; Με βάση τα παραπάνω οι μικροοργανισμοί κατηγοριοποιήθηκαν ως ανθεκτικοί (Resistant), μετρίως ευαίσθητοι (Intermediate) και ευαίσθητοι (Susceptible). sp. salmonicida paucimobilis Burkholderia cepacia sp. ornitholytica Seratia odorifera Κοπρανώδες υλικό ζωικής προέλευσης (ορνιθοτροφείο) Υγρά απόβλητα Θαλασσινό νερό Συνολικός αριθμός στελεχών Σχήμα 1. Βακτηριακά στελέχη που απομονώθηκαν από τα περιβαλλοντικά δείγματα. Ως ελάχιστη ανασταλτική συγκέντρωση θεωρήθηκε αυτή που περιορίζει την ανάπτυξη των βακτηρίων τουλάχιστον κατά % (MIC ). Η εκτίμηση της ανάπτυξης των μικροοργανισμών, έγινε βάσει της οπτικής απορρόφησης του εναιωρήματος χρησιμοποιώντας φασματοφωτόμετρο υπό ακτινοβολία μήκους κύματος 540nm. Για την ανίχνευση γονιδίων ανθεκτικότητας στα υπό μελέτη αντιβιοτικά πραγματοποιήθηκε απομόνωση DNA με χρήση ενζύμων proteinase-k και lysozyme καθώς και με το Invisorb Plasmid Midi Kit (Stratec Molecular). Η ανίχνευση των γονιδίων ανθεκτικότητας έγινε μέσω Αλυσιδωτής Αντίδρασης Πολυμεράσης (PCR). Τα γονίδια, οι εκκινητές, το μέγεθος των προϊόντων PCR, καθώς και οι βιβλιογραφικές αναφορές, βάσει των οποίων εκτελέστηκαν τα αντίστοιχα προγράμματα PCR φαίνονται στον πίνακα 1. Γονίδιο teta tetb tetm ampc blatem blaoxa blapse Πίνακας 1: Αλληλουχίες εκκινητών & μέγεθος προϊόντων PCR για την ανίχνευση γονιδίων ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικά. Αλληλουχία εκκινητή (5 3 ) Μέγεθος προϊόντος Βιβλιογραφική PCR (bp) αναφορά CGATATCACTGATGGCGATG TGTCCGACAAGTTGCATGAT 318 [5] TTGGTTAGGGGCAAGTTTTG GTAATGGGCCAATAACACCG 659 [6] GTTAAATAGTGTTCTTGGAG CTAAGATATGGCTCTAACAA 600 [7] TTCTATCAAMACTGGCARCC CCYTTTTATGTACCCAYGA 5 [8] AAAGATGCTGAAGATCA TTTGGTATGGCTTCATTC 4 [9] AAGAAACGCTACTCGCCTGC CCACTCAACCCATCCTACCC 478 [] ACCGTATTGAGCCTGATTTA ATTGAAGCCTGTGTTTGAGC 1 []

3 Βακτηριακά στελέχη ο ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΟ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΟ ΣΥΝΕΔΡΙΟ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΗΧΑΝΙΚΗΣ, ΠΑΤΡΑ, 4-6 ΙΟΥΝΙΟΥ, 2015 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ & ΣΥΖΗΤΗΣΗ Tα απομονωμένα στελέχη που εξετάστηκαν για την ευαισθησία τους στα 4 αντιβιοτικά, εμφάνισαν ποικίλα προφίλ ανθεκτικότητας. Από αυτά, το 86,4% των στελεχών εμφάνισε πολυανθεκτικότητα με τον συντελεστή MAR index (Multiple Antibiotic Resistance Index) να κυμαίνεται από έως 0,75. Συγκεκριμένα, 27,3% των απομονωμένων βακτηρίων ήταν ανθεκτικά σε 3 αντιβιοτικά και % ήταν ανθεκτικά σε 2 αντιβιοτικά. Συνολικά, 9,1% παρουσίασαν τουλάχιστον μέτρια ανθεκτικότητα και στα 4 αντιβιοτικά. Η ανθεκτικότητα των βακτηριακών στελεχών στα υπό μελέτη αντιβιοτικά φαίνεται συνολικά στο σχήμα 2. Η μεγαλύτερη ανθεκτικότητα παρουσιάστηκε στην Ampicillin, στην οποία το 55,6% των Εντεροκόκκων ήταν ανθεκτικοί. Αντιθέτως, μεγάλη ευαισθησία παρουσιάστηκε στην Imipenem, όπου μόνο το 13,6% των εξεταζόμενων στελεχών παρουσίασε μέτρια ανθεκτικότητα. Στην Tetracycline εμφανίστηκε ανθεκτικότητα στο 68,2% των στελεχών και στο Cefaclor στο 45,4% Ampicillin Cefaclor Imipenem Tetracycline 3 Ανθεκτικό Ενδιάμεσο Ευαίσθητο Σχήμα 2. Ανθεκτικότητα των βακτηριακών στελεχών στα υπό μελέτη αντιβιοτικά Ανάμεσα σε στελέχη του ίδιου είδους εμφανίστηκε συχνά μεγαλύτερη ανθεκτικότητα σε στελέχη προερχόμενα από υγρά απόβλητα, σε σύγκριση με τα αντίστοιχα που προέρχονταν από θαλασσινό νερό ή ζωικό κοπρανώδες υλικό (σχήμα 3). Τα στελέχη που προέρχονταν από εγκαταστάσεις επεξεργασίας υγρών αποβλήτων παρουσίασαν στο σύνολό τους ανθεκτικότητα σε ποσοστό 61,36%, ενώ τα προερχόμενα από θαλασσινό νερό % και από κοπρανώδες υλικό ζωικής προέλευσης 33,3%. Το φαινόμενο αυτό συμφωνεί με την θεωρία της μεταφοράς γονιδίων ανθεκτικότητας από ανθρωπογενείς δραστηριότητες στο περιβάλλον. Ωστόσο, υπήρξαν και λίγες περιπτώσεις όπου στελέχη θαλασσινού δείγματος είχαν πολύ μεγαλύτερη ανθεκτικότητα από στελέχη προερχόμενα από ανθρωπογενείς δραστηριότητες (σχήμα 4). Το φαινόμενο αυτό δείχνει ότι η ανθεκτικότητα μπορεί να εμφανιστεί και εν απουσία αντιβιοτικών ουσιών, καθώς η ανάπτυξη γονιδίων ανθεκτικότητας επηρεάζεται και από περιβαλλοντικούς παράγοντες. Ωστόσο, δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διακυμάνσεις στην τιμή της MIC ανάμεσα σε στελέχη του ίδιου είδους προερχόμενα από είσοδο και από έξοδο εγκατάστασης επεξεργασίας λυμάτων. Αυτό σημαίνει ότι οι διεργασίες που συντελούνται κατά την επεξεργασία των υγρών λυμάτων δεν επηρεάζουν ούτε θετικά ούτε αρνητικά την ανάπτυξη ανθεκτικότητας.

4 Ανθεκτικά βακτηριακά στελέχη % ο ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΟ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΟ ΣΥΝΕΔΡΙΟ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΗΧΑΝΙΚΗΣ, ΠΑΤΡΑ, 4-6 ΙΟΥΝΙΟΥ, 2015 Seratia Seratia 0,06 0, 0, 0, Ampicillin , Cefaclor 12,5 12,5 6, 1, , , 0,06 0,06 0,06 0,06 0, Imipenem ,5 2 2,5 1,56 0,2 12,5 6, Tetracycline Σχήμα 3: Ελάχιστη ανασταλτική συγκέντρωση των αντιβιοτικών για τα βακτηριακά στελέχη που απομονώθηκαν α) από υγρά απόβλητα, β) θαλασσινό νερό και γ) ζωικό κοπρανώδες υλικό Υγρά απόβλητα Θαλασσινό νερό Ζωικό κοπρανώδες υλικό Ampicillin Cefaclor Imipenem Tetracycline Αντιβιοτικό Σχήμα 4: Ανθεκτικότητα βακτηριακών στελεχών ανάλογα με την προέλευσή τους.

5 Ελάχιστη ανασταλτική συγκέντρωση αντιβιοτικού (μg/ml) ο ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΟ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΟ ΣΥΝΕΔΡΙΟ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΗΧΑΝΙΚΗΣ, ΠΑΤΡΑ, 4-6 ΙΟΥΝΙΟΥ, 2015 Γενικά, το γεγονός της ανάπτυξης ή όχι της ανθεκτικότητας των βακτηρίων στις εγκαταστάσεις επεξεργασίας λυμάτων είναι ακόμα υπό συζήτηση. Δεν έχουν ακόμα εδραιωθεί οι σύνδεσμοι μεταξύ της παρουσίας αντιβιοτικών σε μονάδες επεξεργασίας λυμάτων και την ανάπτυξη ανθεκτικών βακτηρίων, καθώς η μεταβίβαση της ανθεκτικότητας σε συγκεντρώσεις τόσο χαμηλές όσο αυτές που έχουν βρεθεί σε διάφορες μελέτες στο περιβάλλον. Ωστόσο, βάσει αναφορών, τα λύματα ή ακόμα και αυτά που έχουν υποστεί επεξεργασία περιέχουν υψηλότερες αναλογίες διαφόρων ανθεκτικών βακτηριακών πληθυσμών σε σχέση με τα αντίστοιχα ποσοστά που περιέχονται σε επιφανειακά ή θαλασσινά ύδατα [11]. Σύμφωνα με αυτές τις μελέτες οι συνθήκες στις μονάδες επεξεργασίας λυμάτων είναι ευνοϊκές για τον πολλαπλασιασμό των ανθεκτικών βακτηρίων, ο οποίος με τη σειρά του μπορεί να μεταφέρει γονίδια ανθεκτικότητας σε ευαίσθητα βακτήρια. Παράδειγμα τέτοιας έρευνας είναι των Watkisnon et al. (2007), σύμφωνα με την οποία τα ποσοστά πολυανθεκτικών βακτηρίων ήταν σημαντικά υψηλότερα από τα αναμενόμενα σε περιοχές πλησίον εγκαταστάσεων επεξεργασίας αποβλήτων [12]. Οι Munir et al. (2011) ανέφεραν υψηλές συγκεντρώσεις βακτηρίων ανθεκτικών σε τετρακυκλίνη και σουλφοναμίδη και των αντίστοιχων γονιδίων σε ακατέργαστα λύματα πέντε σταθμών στην Αμερική. Αυτές οι συγκεντρώσεις μειώθηκαν αρκετές τάξεις μεγέθους στην εκροή, ενώ παράλληλα, δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στις συγκεντρώσεις που αναφέρθηκαν συγκρίνοντας λύματα πριν και μετά το στάδιο της απολύμανσης [13]. Οι Schülter et al. (2007) κατόπιν δοκιμών σε πληθώρα βακτηρίων και αντιβιοτικών κατέληξαν ότι οι μονάδες επεξεργασίας λυμάτων αποτελούν δεξαμενές για ποικίλα στοιχεία αντίστασης σε αντιβιοτικά. Σύμφωνα με τους τελευταίους η υψηλή πυκνότητα μικροβίων και η ποικιλότητα στα βιοφίλμ και στην ενεργό ιλύ μπορούν να διευκολύνουν τη γενετική ανταλλαγή σε εγκαταστάσεις επεξεργασίας λυμάτων [14]. Τα βακτήρια που έχουν ήδη γίνει ανθεκτικά μέσω της χρήσης των αντιβιοτικών στην ιατρική θεραπεία είναι μια σημαντική πηγή για την ανθεκτικότητα που συναντάμε σε μονάδες επεξεργασίας λυμάτων. Σύμφωνα με τους Bolaji et al. (2011) σε μια μελέτη για την παρουσία ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικά σε νοσοκομειακά λύματα στη Νιγηρία, στελέχη των βακτηρίων που απομονώθηκαν (Enterobacter aerogenes, putida, fluorescens, Klebsiella edwardsii, Proteus mirabilis, aeruginosa, Shigella spp & Flavobacterium meningosepticum) είχαν γίνει ανθεκτικά σε όλα τα υπό δοκιμή αντιβιοτικά της μελέτης [15]. Γενικά, η άποψη που επικρατεί είναι ότι τα βακτήρια που έχουν ήδη δείξει ανθεκτικότητα σε αντιβιοτικά δεν θα έχουν απαραιτήτως εκλεκτικό πλεονέκτημα σε εγκαταστάσεις επεξεργασίας λυμάτων. Δυστυχώς, η όλη πληροφόρηση όσον αφορά στο συγκεκριμένο θέμα θεωρείται ελλιπής. Δεδομένου ότι οικογένειες βακτηρίων όπως αυτές που μελετήθηκαν στην παρούσα εργασία βρίσκονται συστηματικά στα απόβλητα επιβάλλεται περαιτέρω διερεύνηση σε συνάρτηση πάντα με τις εκάστοτε περιβαλλοντικές συνθήκες. Όσον αφορά στο θαλασσινό νερό περισσότερο από το 90% των βακτηριακών στελεχών που περιέχονται σε αυτό είναι ανθεκτικά σε περισσότερα από ένα αντιβιοτικά και 20% είναι ανθεκτικά τουλάχιστον σε πέντε, στοιχείο που συμφωνεί και με την παρούσα εργασία [16]. Το γεγονός αυτό δείχνει την έκταση της μεταβολής των υδάτινων οικοσυστημάτων από την ανθρώπινη δράση. Ο εντοπισμός γονιδίων ανθεκτικότητας σε επιφανειακά & θαλάσσια ύδατα έχει αναδείξει ότι υπάρχει συσχέτιση μεταξύ ανθεκτικότητας των βακτηρίων και παρουσίας κυρίως αστικών λυμάτων [17] ,51 55, ,96 28,91 22,22,15 17,92 0 1,69 0,09 6 0,42 Tetracycline Imipenem Cefaclor Ampicillin Enterobacteriaceae Pseudomonadaceae Enterococcaceae Σχήμα 5: Μέση τιμή ελάχιστης ανασταλτικής συγκέντρωσης των υπό μελέτη αντιβιοτικών στις οικογένειες των απομονωθέντων βακτηρίων.

6 Αριθμός βακτηρίων % ο ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΟ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΟ ΣΥΝΕΔΡΙΟ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΗΧΑΝΙΚΗΣ, ΠΑΤΡΑ, 4-6 ΙΟΥΝΙΟΥ, 2015 Όσον αφορά στις οικογένειες βακτηρίων που εξετάστηκαν, στην Τετρακυκλίνη η πιο ανθεκτική ήταν αυτή των Εντεροκόκκων, στην Κεφακλόρη αυτή των Ψευδομονάδων και στην Αμπικιλλίνη των Εντεροβακτηρίων (σχήμα 5). Αντίθετα, τα επίπεδα ανθεκτικότητας στην Ιμιπενέμη ήταν εξαιρετικά χαμηλά σε όλες τις οικογένειες των βακτηρίων. Το διαφορετικό προφίλ ανθεκτικότητας σχετίζεται άμεσα με τα αντίστοιχα γονίδια ανθεκτικότητας που περιέχονται κάθε φορά. Τα γονίδια που εξετάστηκαν ήταν γονίδια ανθεκτικότητας στα Τετρακυκλίνες (teta, tetb &tetm) και γονίδια ανθεκτικότητας στις β-λακτάμες (ampc, blapse, blaoxa & blatem). Στην παρούσα εργασία η ανθεκτικότητα στην Τετρακυκλίνη σημειώθηκε κυρίως σε είδη και, στα οποία ταυτοποιήθηκε η παρουσία των αντίστοιχων γονιδίων teta, tetb και tetm (σχήμα 6). Το γονίδιο tetb βρέθηκε σε ποσοστά 67% και 80% στις δύο οικογένειες Pseudomonodaceae και Enterococcaceae, αντίστοιχα ενώ τα γονίδια teta και tetm είχαν διαφορετική παρουσία, καθώς το πρώτο ανιχνεύθηκε στην πλειοψηφία των ανθεκτικών Ψευδομονάδων (67%) και το δεύτερο στην πλειοψηφία των Εντεροκόκκων (80%). Επίσης, πολλά από τα βακτηριακά στελέχη που εξετάστηκαν διέθεταν περισσότερα του ενός γονίδια tet. To % των απομονωμένων βακτηριακών στελεχών είχαν τα γονίδια teta & tetb και 17% είχαν τα γονίδια tetb & tetm. Η ανθεκτικότητα στις Τετρακυκλίνες είναι ευρέως διαδεδομένη σε πολλούς μικροοργανισμούς καθώς έχει ταυτοποιηθεί σε Gram-αρνητικά και σε 22 Gram-θετικά βακτήρια, ενώ ταυτόχρονα συναντάται σε πολυανθεκτικά βακτηριακά είδη. Συνήθως η εν λόγω ανθεκτικότητα σχετίζεται με γονίδια που βρίσκονται σε πλασμίδια ή τρανσποσόνια, τα οποία δρουν με τρεις διαφορετικούς μηχανισμούς: 1) εκροή του αντιβιοτικού από το εσωτερικό του κυττάρου με κατανάλωση ενέργειας, 2) τροποποίηση των ριβοσωμάτων για την αποτροπή σύνδεσης με το αντιβιοτικό και 3) παραγωγή ενζύμων που αναστέλλουν τη δράση του αντιβιοτικού. Τα γονίδια teta και tetb σχετίζονται με τον πρώτο μηχανισμό, ενώ το γονίδιο tetm με το δεύτερο και τρίτο [6]. Παρόλο που η πλειοψηφία αυτών των γονίδιων βρίσκεται στα πλασμίδια, το tetm μπορεί να βρεθεί και στο κεντρικό χρωμόσωμα των βακτηρίων. Εντούτοις, λαμβάνοντας υπόψη τη διαρκή και συχνά άκριτη μετακίνηση πλασμιδίων μεταξύ των βακτηριακών πληθυσμών υπογραμμίζεται η σημασία εύρεσης των γονιδίων teta, tetb και tetm, τα οποία μπορούν να μετακινούνται και να προάγουν την ανθεκτικότητα βακτηρίων έναντι των Τετρακυκλίνων. Είναι ενδιαφέρον το γεγονός ότι δεν μεταφέρονται όλα τα γονίδια εντός ενός βακτηριακού πληθυσμού με τον ίδιο τρόπο. Πολλές φορές ενώ ένα στέλεχος φέρει πολλά tet γονίδια, μόνο κάποια από αυτά μεταφέρονται αναλόγως τη θέση που βρίσκονται (σε πλασμίδιο ή στο χρωμόσωμα). 90% 80% 70% Pseudomonadaceae Enterococcaceae Enterobacteriaceae 60% % 40% 30% 20% % 0% teta tetb tetm ampc blapse blaoxa blatem Γονίδιο ανθεκτικότητας Σχήμα 6: Παρουσία γονιδίων ανθεκτικότητας στα απομονωμένα βακτηριακά στελέχη. Τα γονίδια ανθεκτικότητας έναντι των β-λακταμών ανιχνεύθηκαν σε όλες τις οικογένειες των απομονωμένων βακτηριακών στελεχών, όπως φαίνεται στο σχήμα 6. Σε μεγαλύτερο ποσοστό ανιχνεύθηκε το γονίδιο bla-pse, ακολουθούμενο από τα bla-oxa, bla-tem και ampc.

7 ο ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΟ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΟ ΣΥΝΕΔΡΙΟ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΗΧΑΝΙΚΗΣ, ΠΑΤΡΑ, 4-6 ΙΟΥΝΙΟΥ, 2015 Μέλη της οικογένειας Enterobacteriaceae παράγουν β-λακταμάσες και άλλα ένζυμα, τα οποία υδρολύουν τις β-λακτάμες. Τέτοιου είδους ένζυμα έχουν ανιχνευθεί σε ποικίλα βακτηριακά είδη όπως Enetrobacter cloacae, aeruginosa, Citribacter freundii, marcescens, Shigella flexneri, Shigella sonnei, και Proteus mirabilis [8]. Το γεγονός ότι τα επιλεγμένα γονίδια για την αντοχή στις β-λακτάμες ανιχνεύθηκαν και στις τρεις οικογένειες των βακτηρίων επιβεβαιώνει τη μεταβίβασή τους στους περιβαλλοντικούς μικροβιακούς πληθυσμούς, θέτοντας σε κίνδυνο τη δημόσια υγεία. Το 60-90% των Gram-αρνητικών βακτηρίων είναι ικανά να ανταλλάσσουν πλασμίδια, τα οποία φέρουν γονίδια ανθεκτικότητας, μέσω οριζόντιας μεταφοράς γονιδίων. Τα πλασμίδια είναι δυνατόν να μεταφέρονται σε ευαίσθητα στελέχη του ίδιου ή ακόμα και διαφορετικού είδους επάγοντας την ανθεκτικότητα έναντι στα αντίστοιχα αντιβιοτικά. Εάν λάβουμε υπόψη ότι κάποιοι βακτηριακοί πληθυσμοί, όπως αυτοί των Εντεροκόκκων, ανθίστανται στη διακύμανση των περιβαλλοντικών συνθηκών καθώς και σε μεθόδους απολύμανσης κι επεξεργασίας νερού και αποβλήτων, καθίσταται εμφανής η σημασία μεταβίβασης ανθεκτικότητας και η ύπαρξη των αντίστοιχων γονιδίων. Εκτός από την οικολογική ανησυχία υπάρχει ένα αυξανόμενο ενδιαφέρον για τις πιθανές επιπτώσεις στην ανθρώπινη υγεία από την παρουσία των πολυανθεκτικών βακτηρίων και των αντίστοιχων γονιδίων στο περιβάλλον. Έχει αναφερθεί αύξηση πολυανθεκτικότητας σε πολλά παθογόνα βακτήρια, τα οποία εγκυμονούν κινδύνους για τον άνθρωπο. Οι εγκαταστάσεις επεξεργασίας λυμάτων μπορούν να παρέχουν ευνοϊκές προϋποθέσεις για τη δημιουργία και την εξάπλωση ανθεκτικών βακτηρίων, τα οποία στη συνέχεια διοχετεύονται στο υδάτινο κυρίως περιβάλλον. Η εξάπλωση των γονιδίων ανθεκτικότητας στα φυσικά οικοσυστήματα μπορεί να διαταράξει τη δυναμική του πληθυσμού και τη φυσιολογία των φυσικών βακτηριακών πληθυσμών, εγείροντας κινδύνους και ανησυχίες, όσον αφορά στην αντιμετώπιση βακτηριακών λοιμώξεων και καταπολέμηση πολυανθεκτικών μικροοργανισμών. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Πολυανθεκτικά βακτήρια των οικογενειών Pseudomonodaceae, Enterobacteriaceae και Enterococcaceae απομονώθηκαν από υγρά απόβλητα, θαλασσινό νερό και ζωικό κοπρανώδες υλικό. Η ανθεκτικότητα των απομονωμένων στελεχών σημειώθηκε σε Τετρακυκλίνες και β-λακτάμες. Παρατηρήθηκε διαφοροποίηση σε σχέση με την προέλευση των στελεχών. Τα βακτήρια που προέρχονται από τα υγρά απόβλητα παρουσίασαν υψηλότερες ελάχιστες ανασταλτικές συγκεντρώσεις για την πλειοψηφία των αντιβιοτικών, στα οποία εξετάστηκαν. Ωστόσο, στην παρούσα εργασία, η επεξεργασία των αποβλήτων δεν φάνηκε να επηρεάζει το προφίλ ανθεκτικότητας των βακτηριακών στελεχών. Γονίδια ανθεκτικότητας ανιχνεύθηκαν και στις τρεις οικογένειες βακτηρίων. Η εύρεση των γονιδίων σε όλες τις οικογένειες και σε διαφορετικά βακτηριακά είδη, επισημαίνει τη μεταβίβαση γενετικού υλικού μεταξύ των βακτηριακών πληθυσμών και των γονιδίων ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικά, τα οποία επάγουν την αντοχή βακτηρίων έναντι ποικιλίας αντιβιοτικών. Αυτό το γεγονός εγείρει ανησυχία όσον αφορά στην προστασία της δημόσιας υγείας και την καταπολέμηση πολυανθεκτικών βακτηριακών στελεχών. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ [1] European Surveillance of Antimicrobial Consumption Network, ESAC Yearbook [2] Pruden, A., & Arabi, M. Antimicrobial Resistance in the Environment. Wiley-Blackwell, (2012) [3] Martinez, J.L. Environ. Pollut. 157:2893 (2009). [4] Kümmerer, K. Pharmaceuticals in the Environment. Berlin, Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg, 2001 [5] Tennstedt, T., Szcepanowski, R., Krahn, I., Pühler, A., Schlüter, A. Plasmid. 53:218 (2005). [6] Ng, L.K., Martin, I., Alfa, M., Mulvey, M. Mol. Cel. Probes. 15:209 (2001). [7] Akinbowale, O.L., Peng, H., Barton, M.D. J. Appl. Microbiol. 3:2016 (2007). [8] Schwartz, T., Kohnen, W., Jansen, B., Obst, U. FEMS Microbiol. Ecol. 43:5 (2003). [9] Speldooren, V., Heym, B., Labia, R., Nicolas-Chanoine, M.H. Antimicrob. Agents Chemother. 42:879 (1998). [] Bert, F., Branger, C., Lambert-Zachovsky, N. J. Antimicrob. Chemother. :11 (2002). [11] Bouki, C., Venieri, D., Diamadopoulos, E. Ecotoxicol. Environ. Safety. 91:1 (2013). [12] Watkinson, A.J., Micalizzi, G.B., Graham, G.M., Bates, J.B., Costanzo, S.D. Appl. Environ. Microbiol. 73:5667 (2007). [13] Munir, M., Wong, K., Xagoraraki, I. Water Res. 45:681 (2011). [14] Schlüter, A., Szczepanowski, R., Pühler, A., Top, E.M. Fems Microbiol. Rev. 31:449 (2007). [15] Bolaji, A.S, Akande, I.O, Iromini, F.A, Adewoye, S.O., Opasola, O.A. Eur. J.Exp. Biol. 1:66 (2011). [16] Baquero, F., Martínez, J.L., Cantón, R. Curr. Opin. Biotechnol. 19:260 (2008). [17] Kümmerer, Κ. Pharmaceuticals in the Environment. Berlin, Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg (2001).