ΕΛΕΥΘΕΡΕΣ ΡΙΖΕΣ: ΒΑΣΙΚΕΣ ENNOIΕΣ, ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΣΤΑΘΕΡΟΤΗΤΑ

Transcript

1 ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΠΡΩΤΟ ΕΛΕΥΘΕΡΕΣ ΡΙΖΕΣ: ΒΑΣΙΚΕΣ ENNIΕΣ, ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΣΤΑΘΕΡΟΤΗΤΑ 1.1. Εισαγωγή Ο όρος ελεύθερη ρίζα στην περίοδο του 19ου αιώνα είχε την έννοια τμήματος ενός μορίου που είχε ανεξάρτητη ύπαρξη. Με την εξέλιξη όμως της θεωρίας του δεσμού και την αναγνώριση της τετρασθένιας του άνθρακα, ο όρος ελεύθερη ρίζα μεταβλήθηκε. Αναγνωρίσθηκε ότι οι ελεύθερες ρίζες είναι μόρια, τα οποία θα μπορούσαν να έχουν ανεξάρτητη ύπαρξη κάτω από ορισμένες συνθήκες. Από πειράματα όμως, όπου γίνονταν η υπόθεση της δημιουργίας της ρίζας του μεθυλίου (CH3 ), το τελικό προϊόν που λαμβάνονταν ήταν το αιθάνιο (CH3-CH3). Πιστεύονταν λοιπόν ότι οι "ελεύθερες ρίζες", τουλάχιστον για οργανικές ενώσεις, δεν υπάρχουν σε σταθερή μορφή. Η αντίληψη για τις ελεύθερες ρίζες άλλαξε με την ανακάλυψη το 1900 από τον Gomberg. Στην προσπάθειά του να παρασκευάσει το εξαφαινυλοαιθάνιο από διαλύματα χλωριούχου τριφαινυλομεθυλίου με άργυρο ή ψευδάργυρο, παρέλαβε κίτρινα διαλύματα μιας ουσίας που αποχρωματίζονταν πολύ γρήγορα από τον αέρα ή με ιώδιο. Η παρατήρηση αυτή κατά τη γνώμη του ήταν το αποτέλεσμα της σύνθεσης της τριφαινυλομεθυλο-ρίζας, όπως δείχνει η αντίδραση: (C 6 H 5 ) 3 C Cl + Ag (C 6 H 5 ) 3 C + AgCl 2(C 6 H 5 ) 3 C (C 6 H 5 ) 3 C (C 6 H 5 ) 3 C Μία άλλη σημαντική παρατήρηση έγινε το 1929 από τον Paneth που τεκμηρίωσε την ύπαρξη ελευθέρων ριζών σε αέρια φάση. Διαβίβαση αζώτου 1

2 σε δοκιμαστικό σωληνίσκο που περιείχε τετραμεθυλομόλυβδο, δημιούργησε ατμό που περνούσε στη συνέχεια από φούρνο 450 0C. Αρχικά υπήρχε εναπόθεση ενός στρώματος μολύβδου (σχηματισμός μεταλλικού καθρέπτη) από τη διάσπαση του τετρααιθυλομολύβδου, ενώ στη συνέχεια το αέριο προϊόν περνούσε από δεύτερη μεταλλική εναπόθεση (ψευδαργύρου ή αντιμονίου) θερμαινόμενη σε C. Οι αντιδράσεις που ελάμβαναν χώρα είναι: C (CH 3 ) 4 Pb 4CH 3 + Pb 4CH 3 2CH 3 + Pb (CH 3 ) 4 Pb + Zn (CH 3 ) 2 Zn Τα επόμενα χρόνια έγιναν πειράματα με άλλες αντιδράσεις και τα αποτελέσματα τεκμηρίωναν την ύπαρξη ελευθέρων οργανικών ριζών. Η ανακάλυψη τους διαλεύκανε μηχανισμούς οργανικών αντιδράσεων, όπως την προσθήκη anti-markovnikow του υδροβρωμίου σε ολεφίνες και την ομολυτική αρωματική υποκατάσταση. Το 1937, ο Flory (Βραβείο Νόμπελ Χημείας, 1974), που θεωρείται ο "πατέρας" της χημείας των πολυμερών, πρότεινε το μηχανισμό ελευθέρων ριζών στον πολυμερισμό προσθήκης. Αρκετές συνθετικές μέθοδοι παραγωγής συνθετικών ελαστικών από στυρόλιο και βουταδιένιο καθώς και πολυαιθυλενίου χρησιμοποιούν τον ριζικό πολυμερισμό. Ελεύθερη ρίζα με τη νεώτερη έννοια, είναι άτομο ή ομάδα ατόμων (ανόργανα ή οργανικά μόρια) που φέρει ένα ασύζευκτο (unpaired) ηλεκτρόνιο. Υπάρχουν και οι διρίζες όπου τα δύο ασύζευκτα ηλεκτρόνια βρίσκονται σε κάποια απόσταση μεταξύ τους αλλά στο ίδιο μόριο. Με την έννοια αυτή τα άτομα του χλωρίου (Cl) και του νατρίου (Να), το μόριο του μονοξειδίου του αζώτου (ΝΟ ) και η μεθυλική ρίζα (CH3 ) είναι ελεύθερες ρίζες. 2

3 1.2. Σχηματισμός Ελευθέρων Ριζών Οι βασικές μέθοδοι παραγωγής ελευθέρων ριζών στην Οργανική Χημεία είναι οι παρακάτω: α. Ομολυτικές διασπάσεις όπου το ζεύγος ηλεκτρονίου διαχωρίζεται ομολυτικά: A B A + B β. Οξειδοαναγωγικές αντιδράσεις με μεταφορά ηλεκτρονίου: Fe 3+ + R R Fe 2+ + γ. Από την αντίδραση ριζών με άλλες οργανικές ενώσεις: Br + C 2 H 6 HBr + C 2 H 5 Η ομολυτική διάσπαση απαιτεί μικρότερη ενέργεια από την ετερολυτική διάσπαση, και είναι πιο εύκολο να διασπασθεί ομολυτικά ένας δεσμός, τουλάχιστον στην αέρια φάση. Η ενέργεια για την ομολυτική διάσπαση ενός δεσμού μπορεί να γίνει με φωτόλυση ή με θερμόλυση. Στην περίπτωση της φωτόλυσης του χλωρίου, για παράδειγμα, η υπεριώδης περιοχή του φωτός (UV) έχει αρκετή ενέργεια για να την προκαλέσει: Cl 2 Cl Cl + Το χλώριο απορροφά UV ακτινοβολία στα 220nm, που αναλογεί σε ενέργεια 143kcal/mol, ενώ η ενέργεια διάσπασης του δεσμού χλωρίου είναι μόνο 58kcal/mol. Τα άτομα που σχηματίζονται θα περιέχουν επιπλέον ενέργεια, μέχρι 85kcal/mol μεταξύ τους, η οποία θα διασκορπισθεί μέσω συγκρούσεων και αντιδράσεων. Η πλέον συχνή αντίδραση ελευθέρων ριζών αυτής της κατηγορίας είναι η αλυσιδωτή αντίδραση της χλωρίωσης αλκανίων: 3

4 Cl 2 2Cl έναρξη Cl + R H HCl + R διάδοση R + Cl 2 R Cl + Cl διάδοση Μετά από χιλιάδες τέτοιους κύκλους αντιδράσεων όπου σχηματίζονται R Cl και HCl και αναπαράγονται ρίζες Cl τελικά επέρχονται και ανασυνδυασμοί ριζών που οδηγούν στον τερματισμό της αντίδρασης: 2Cl Cl 2, 2R R R, R + Cl R Cl Η διάσπαση του μορίου του χλωρίου μπορεί να επιτευχθεί και θερμικά, αλλά η αντίδραση αυτή είναι πολύ αργή σε θερμοκρασίες δωματίου, που όμως αυξάνεται ικανοποιητικά σε θερμοκρασίες άνω των 500 0C. Οι οργανικές ενώσεις που χρησιμοποιούνται συνήθως για την έναρξη μιας αλυσιδωτής ριζικής αντίδρασης είναι κυρίως τα υπεροξείδια και οι αζωενώσεις. Οι πιο συχνά χρησιμοποιούμενες ενώσεις είναι: Το διβενζοϋλο υπεροξείδιο: Δ (Ph = C 6 H 5 ), Ph C C Ph 2Ph C και το αζω-δις-ισοβουτυλονιτρίλιο: N N 2 + N 2 CN CN CN Ο δεσμός Ο Ο για να διασπασθεί απαιτεί ενέργεια ενεργοποίησης περίπου 35kcal/mol, πράγμα που σημαίνει ότι το υπεροξείδιο θα διασπασθεί σε σημαντικό βαθμό στους 100 0C. Ο δεσμός όμως C N είναι πιο σταθερός και απαιτεί ενέργεια της τάξης των 73kcal/mol, αλλά οι αζω-ενώσεις προτιμούνται λόγω της δημιουργίας δραστικών ριζών και αζώτου που εκλύεται ως αέριο. 4

5 Τα βήματα της θερμοδιάσπασης των υπεροξειδίων μπορούν να παρουσιασθούν με τις παρακάτω εξισώσεις: R R' R + R' διαλκυλοϋπεροξείδια αλκοξυ-ρίζες θ R C C R' R C + R' -C 2 διακυλοϋπεροξείδια ακυλοξυ-ρίζες R C + R' R C R' R + C 2 + R' υπεροξυ-εστέρες Οι ακυλοξυ-ρίζες έχουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον γιατί διασπώνται μετέπειτα σε ανθρακο-ρίζες (με το μονήρες ηλεκτρόνιο στον άνθρακα) και διοξείδιο του άνθρακα. Από τις παραμέτρους ενεργοποίησης (activation parameters) σε μια σειρά από υπεροξείδια φαίνεται ότι όσο πιο σταθερή είναι η ρίζα που σχηματίζεται τόσο χαμηλότερη είναι η ενέργεια ενεργοποίησης, δηλαδή ευκολότερη η διάσπαση, του υπεροξειδίου. Για τον λόγω αυτό οι tertβουτυλο-ρίζες σχηματίζονται ευκολότερα από τις μεθυλο-ρίζες. Οι φαινυλορίζες είναι ασταθείς ως σ-ρίζες, αλλά οι βενζυλο-ρίζες που σταθεροποιούνται με συντονισμό σχηματίζονται εύκολα. CH 3 C CH 3 C + t Bu ( t Bu = (CH 3 ) 3 C ) t Bu CH 3 + C 2 + t Bu 5

6 Ph CH 2 C Ph CH 2 C + t Bu t Bu Ph CH 2 + C 2 + t Bu Στην περίπτωση των αζω-ενώσεων ο σχηματισμός των ριζών είναι αποτέλεσμα της μεταβατικής κατάστασης, όπου ο ριζικός χαρακτήρας δεν έχει ανάγκη να αναπτυχθεί σε μεγάλο βαθμό και η αντίδραση "έχει στόχο" την δημιουργία του σταθερού μορίου του αζώτου. R N N R' R N N R' R + N N + = R' Η αντίδραση αυτή είναι εξώθερμη. Οι δεσμοί R N υπόκεινται σε έκταση κατά τη μεταβατική κατάσταση και σε ασύμμετρες αζω-ενώσεις ο δεσμός που θα διασπασθεί πρώτος θα είναι της σταθερότερης ρίζας Οι οξειδοαναγωγικές αντιδράσεις με μεταφορά ηλεκτρονίου παράγουν επίσης ελεύθερες ρίζες. Η μεταφορά ηλεκτρονίων μπορεί να συμβεί σε ουδέτερα και φορτισμένα μόρια, όπως στην αντίδραση Fenton και με την οξείδωση του Ag 2+. H Fe 2+ [H H] Fe 3+ + H + H RCH + Ag 2+ [RCH] + Ag + + RC + H + Στις αντιδράσεις αυτές έχουμε δύο στάδια, όπου στο πρώτο γίνεται μεταφορά ηλεκτρονίου και στο δεύτερο επέρχεται διάσπαση με σχηματισμό της ρίζας και του ιόντος. Συνήθως οι αντιδράσεις αυτές γίνονται με τη 6

7 βοήθεια ενός μεταλλικού άλατος ή ηλεκτροχημικά. Παραδείγματα τέτοιων αντιδράσεων παρουσιάζονται παρακάτω: α. Οξείδωση καρβοξυλικών οξέων με οξειδωτικό άλας μετάλλου: RCH + M 2+ (M 2+ = Ce 4+, Pb 4+, Co 3+ ) RC + M+ + H+ RC R + C2 β. Ηλεκτροχημική οξείδωση καρβοξυλικών αλάτων (αντίδραση Kolbe): RC - -e - RC R + C 2 γ. Οξείδωση αλκυλοαρωματικών ενώσεων με χημική ή ηλεκτροχημική μέθοδο (Nu = νουκλεόφιλο αντιδραστήριο): -e - ή Ce 4+ Nu PhCH 3 PhCH 3 PhCH 2 + NuH + δ. Aναγωγή διαζωνιακών αλάτων: PhN2 + + Cu + PhN2 + Cu 2+ PhN2 Ph + N2 ε. Aναγωγή αρωματικών και αλειφατικών αλκυλαλογονιδίων με ηλεκτροχημική αντίδραση: + e - Ph X Ph X Ph + X + e - R X R + X 1.3. Τύποι και Στερεοδιαμορφώσεις Ελευθέρων Ριζών Οι ελεύθερες οργανικές ρίζες είναι στην ουσία εξαιρετικά ασταθείς ενώσεις με χρόνο ημιζωής μικρότερο του 10-3 s. Υπάρχει μεγάλη ποικιλία οργανικών ελευθέρων ριζών και η σταθερότητά τους οφείλεται κυρίως σε δομές συντονισμού ή στερεοχημική παρεμπόδιση για αντιδράσεις του ατόμου που φέρει το μονήρες-ασύζευκτο ηλεκτρόνιο. Μία γνωστή σταθερή ελεύθερη ρίζα που χρησιμοποιείται στις μετρήσεις σταθερών του Ηλεκτρονικού 7

8 Παραμαγνητικού Συντονισμού (ΗΠΣ) είναι το διφαινυλοπικρυλυδραζύλιο (DPPH, Diphenylpicrylhydrazyl radical): 2 N DPPH N N N 2 2 N Η ένωση αυτή που εμφανίζεται υπό μορφή κρυστάλλων βαθέως πορφυρού χρώματος, παραμένει σταθερή επί χρόνια (στο ψυγείο, μακριά από αέρα, φως και υγρασία) λόγω των πολλαπλών δομών συντονισμού και της παρουσίας των νιτρο- ομάδων που έλκουν ηλεκτρόνια. Άλλες σταθερές ελεύθερες ρίζες στην Οργανική Χημεία είναι η ελεύθερη ρίζα Galvinoxyl και τα νιτροξείδια (nitroxides). t Bu CH t Bu Galvinoxyl radical t Bu t Bu Τα νιτροξείδια είναι ενώσεις με τη ομάδα που φέρει τριών ηλεκτρονίων δεσμό Ν Ο. Η μορφή αυτή δικαιολογεί ότι δεν υπάρχει διμερισμός μέσω των ατόμων οξυγόνου και αζώτου. Οι ενώσεις αυτές χρησιμοποιούνται στη δέσμευση δραστικών ελευθέρων ριζών, όπως τις ρίζες υδροξυλίου (ΗΟ ), το υπεροξειδικό ανιόν (Ο2 - ) και άλλες οργανικές ρίζες (R ). R R R N N N R R R Η γεωμετρική και ηλεκτρονική δομή των ελευθέρων ριζών έχει μεγάλη σημασία για την Φυσική και Χημεία γιατί εξηγεί τη σταθερότητά τους και τις αντιδράσεις τους. Η διαμόρφωση ή γεωμετρία του ριζικού κέντρου προσδιορίζει την διαρρύθμιση στο χώρο των ατόμων που ενώνονται με το 8

9 κέντρο. Μία ρίζα ΑΧ3 μπορεί να είναι επίπεδη ή πυραμιδική, ενώ μία ρίζα ΑΧ2 μπορεί να γραμμική ή μη γραμμική. X A X επίπεδη X X A X X πυραμιδική A X A X X X γραμμική μη γραμμική Η στερεοδιαμόρφωση (configuration) των ισομερών της ελεύθερης ρίζας στις διάφορες δομές γίνεται με διάφορους τρόπους γύρω από το κέντρο του ασύζευκτου ηλεκτρονίου. Για τις ρίζες, αλλαγή της στερεοδιαμόρφωσης σημαίνει αλλαγή στον υβριδισμό του ατόμου που φέρει το ασύζευκτο ηλεκτρόνιο. Στην περίπτωση της πυραμιδικής δομής της ρίζας ΑΧ3 υπάρχουν δύο ταυτόσημες στερεοδιαμορφώσεις συνδεδεμένες με μία επίπεδη δομή, που είναι η μεταβατική διάρθρωση στην διεργασία μετατροπής: Σχήμα 1.1. Στερεοδιατάξεις της ρίζας ΑΧ 3 και ενεργειακό διάγραμμα. Οι διαμορφώσεις των ελευθέρων ριζών μπορούν να μετατραπούν η μία στην άλλη με στροφή γύρω από έναν απλό δεσμό. Για παράδειγμα, η αιθυλική ρίζα (CH3CH2 ) έχει δύο χαρακτηριστικές διαμορφώσεις. Στη διαβαθμισμένη διαμόρφωση (staggered conformations) η ηλεκτρονική τροχιά 9

10 με το ασύζευκτο ηλεκτρόνιο επισκιάζει έναν από τους β-c-h δεσμούς, ενώ στην εκλειπτική διαμόρφωση (eclipsed conformation) δεν συμβαίνει. H HH H H H H διαβαθμισμένη διαμόρφωση (staggered) H H H εκλειπτική διαμόρφωση(eclipsed) Οι ελεύθερες ρίζες μπορούν να έχουν διάφορες ηλεκτρονικές καταστάσεις ανάλογα με το πως πληρούνται τα τροχιακά. Η ρίζα ΝΗ2 βρίσκεται σε δύο χαρακτηριστικές ηλεκτρονικές καταστάσεις. Η πιο σταθερή 2Β1 (οι ονομασίες προέρχονται από τη θεωρία των ομάδων, group theory) όπου το ασύζευκτο ηλεκτρόνιο είναι στην p τροχιά κάθετα στο επίπεδο του μορίου (b1). Η δομή αυτή της ρίζας αποκαλείται τύπος π. Η άλλη ηλεκτρονική κατάσταση 2Α1, με δύο ηλεκτρόνια στο p τροχιακό και ένα ηλεκτρόνιο στο sp2 τροχιακό στο επίπεδο του μορίου (a1), αποκαλείται τύπος σ. Αλλαγή της γεωμετρίας ή ενός υποκατάστατη μπορεί να μετατρέψει τις σχετικές ενέργειες των ηλεκτρονικών καταστάσεων. 2Β 1(π) 2Α 1(σ) Οι κυριότερες ρίζες στην Οργανική Χημείας είναι εκείνες όπου το μονήρες-ασύζευκτο ηλεκτρόνιο είναι στο άτομο του άνθρακα. Τέτοιες ελεύθερες ρίζες που έχουν μελετηθεί με διαφόρους τρόπους και έχει πιστοποιηθεί η δομή τους με Ηλεκτρονικό Παραμαγνητικό Συντονισμό (Electron Paramagnetic Resonance, ή Electron Spin Resonance, ESR) είναι: 10

11 η ρίζα μεθυλίου: CH3 με επίπεδη δομή η ρίζα αιθυλίου: CH3CH2 με ελαφρά πυραμιδική μορφή η ρίζα βινυλίου: ανάλογα με τους υποκαταστάτες είναι γραμμική ή μη R 3 H t-bu Me 3 Si H Αλλά υπάρχουν και πολυάριθμες οργανικές ελεύθερες ρίζες όπως είναι οι εξής: ελεύθερες ρίζες όπου το ασύζευκτο ηλεκτρόνιο βρίσκεται σε άτομο που δεν είναι ο άνθρακας: π.χ. ένα μέταλλο ή πυρίτιο: Si, Ge, Sn (R3Si, R3Ge, R3Sn ) ελεύθερες ρίζες με το ασύζευκτο ηλεκτρόνιο στο άζωτο: α. διαλκυλοαμινυλο- ρίζες: R2N β. αμιδυλο- ρίζες: νιτροξείδια, που παρουσιάζουν δύο μεσομερείς μορφές όπου το ασύζευκτο ηλεκτρόνιο είναι είτε στο άζωτο είτε στο οξυγόνο: Σύμφωνα όμως με το φάσμα ΗΠΣ και τις σταθερές σύζευξης, η πυκνότητα του spin είναι , πράγμα που σημαίνει ότι η φορτισμένη μορφή είναι η πιο σημαντική και η δομή της έχει πυραμιδική διάταξη: 11

12 N θ =20 0 ελεύθερες ρίζες με ασύζευκτο ηλεκτρόνιο στο φωσφόρο: φωσφυνιλικές ρίζες, που έχουν δύο ηλεκτρονικές δομές την π και σ. Στην π το ασύζευκτο ηλεκτρόνιο είναι σε p τροχιακό του φωσφόρου και κάθετα στο επίπεδο των δεσμών: ελεύθερες ρίζες με το ασύζευκτο ηλεκτρόνιο στο οξυγόνο: αλκόξυλο- ρίζες R ελεύθερες ρίζες με το ασύζευκτο ηλεκτρόνιο στο θείο: α. θειϋλο- ρίζες: CH3 S β. σουλφουνυλο- ρίζες: R S γ. σουλφυνυλο- ρίζες: H H S H 12

13 1.4. Σταθερότητα Ελευθέρων Ριζών Η σταθερότητα χημικών ουσιών, όπως οι ελεύθερες ρίζες, είναι μία αμφίδρομη ιδιότητα σχετιζόμενη με τη σχετική ταχύτητα αποσύνθεσης ή σχηματισμού τους και εξαρτάται από το περιβάλλον και τις συνθήκες. Όσο σταθερότερη είναι μία ελεύθερη ρίζα τόσο πιο εύκολος είναι ο σχηματισμός της. Οι ελεύθερες ρίζες που είναι πολύ ασταθείς και δραστικές ενώσεις εξουδετερώνονται βασικά αντιδρώντας μεταξύ τους ή με άλλες ρίζες. Οι δύο βασικές παράμετροι που παίζουν ρόλο στη σταθερότητα είναι θερμοδυναμική και κινητική σταθερότητα. Η θερμοδυναμική σταθερότητα (thermodynamic stability) ποσοτικά σχετίζεται με την ενθαλπία (ΔΗ της διάσπασης του δεσμού R H για να δώσει τις ρίζες R και H, που στην ουσία είναι η ενέργεια (ομολυτικής) διάσπασης του δεσμού (BDE, bond dissociation energy): ΔΗ R H R + H Οι κύριοι παράγοντες σταθερότητας μιας ελεύθερης ρίζας είναι συζυγία, η υπερσυζυγία και ο υβριδισμός αλλά και από στερεοχημικούς παράγοντες στο κέντρο του μορίου με το ασύζευκτο ηλεκτρόνιο. Σταθερές ελεύθερες ρίζες οργανικών ενώσεων είναι πολύ λίγες και οφείλονται σε ισχυρή απεντόπιση του ηλεκτρικού φορτίου του μονήρους ασύζευκτου ηλεκτρονίου σε βενζολικούς δακτυλίους και με πολλαπλές δομές συντονισμού που σταθεροποιούν την ελεύθερη ρίζα. Μία ρίζα θεωρείται σταθερή όταν η ημιζωή της είναι μεγαλύτερη του 10-3 s (t 1/2 >10-3 s). Σταθερές ελεύθερες ρίζες είναι: διφαινυλοπικρυλυδραζίλιο (DPPH) με g=2.0036, γαλβινοξυλο-ρίζα (galvinoxyl radical) και ορισμένα νιτροξείδια που φέρουν το δεσμό Ν Ο και που χρησιμοποιούνται ως δεσμευτές ριζών σε διάφορες πειραματικές μεθόδους (spin trapping). Η πλειοψηφία των οργανικών ελευθέρων ριζών είναι εξαιρετικά ασταθείς και η διάρκεια ημιζωής τους είναι της τάξης του χιλιοστού του δευτερολέπτου και μικρότερη, ονομαζόμενες και βραχύβιες (short-lived). Η ενέργεια σταθερότητας των οργανικών ελευθέρων ριζών (συμβολίζονται ως 13

14 R ) συγκρίνεται με την ενέργεια σταθερότητας του μεθυλίου (CH3 ) με την εξίσωση: Es(R ) = BDE (CH3 H) BDE(R H) όπου E s (R ) είναι η διαφορά της ενέργειας διάσπασης του δεσμού C Η του μεθανίου, ως αναφορά, και του δεσμού R H του μορίου που σχετίζεται με τη ρίζα R. Θετική τιμή της Εs(R ) σημαίνει ότι η R είναι πιο σταθερή από τη ρίζα μεθυλίου. Επειδή η ρίζα μεθυλίου είναι επίπεδη με το ασύζευκτο ηλεκτρόνιο σε 2p τροχιακό που δεν έχει καθόλου απεντόπιση ηλεκτρονικού φορτίου, θεωρείται ότι η ενέργεια σταθερότητας του είναι σχεδόν μηδέν. Με τον τρόπο αυτό συγκρίνονται οι σταθερότητες των διαφόρων οργανικών ριζών. Μερικές τιμές της Es(R ) δείχνουν πόσο σταθερότερες είναι ορισμένες ρίζες, μετά την απόσπαση του Η σε σχέση με τη ρίζα μεθυλίου (μεθάνιο): R H Es(R ) CH3 H 0 CH3CH2 H 4 (CH3)3C H 10 PhCH2 H 20 NH2CH2 H 10 Ph H 18 Ph3C H 28 Ph H -6 F 3 C H -3 Η σχέση αυτή για τη σταθερότητα των ελευθέρων ριζών δείχνει ότι το ασύζευκτο ηλεκτρόνιο αλληλεπιδρά με το σκελετό του μορίου. Στην περίπτωση της ρίζας μεθυλίου το μονήρες ηλεκτρόνιο δεν σταθεροποιείται (η 14

15 ρίζα μεθυλίου είναι εξαιρετικά ασταθής), που δικαιολογείται από την τοποθέτησή του στο 2p τροχιακό σε ορθή γωνία ως προς τα άλλα τροχιακά της επίπεδης ρίζας. Οι παράγοντες που συμβάλλουν στη θερμοδυναμική σταθερότητα των ελευθέρων ριζών είναι αρκετοί. Βασικός παράγοντας είναι η υπερσυζυγία (hyperconjugation, έννοια που πρωτοεπινοήθηκε από τον R.S. Mulliken, University of Chicago, 1939) και παίζει σημαντικό ρόλο στην σειρά σταθερότητας των αλκυλο- ριζών: (CH3)3C > (CH3)2CH > CH3CH2 > CH3 τριτοταγές δευτεροταγές πρωτοταγές Η ερμηνεία για τον τρόπο που αλληλεπιδρούν τα τροχιακά είναι η ακόλουθη. Το 2p τροχιακό που έχει το ασύζευκτο ηλεκτρόνιο αλληλεπιδρά με τα π και π* τροχιακά της αλκυλο ομάδας δίπλα στο κέντρο της ρίζας. Οι αλληλεπιδράσεις σταθεροποιούν τα δύο ηλεκτρόνια σε αυτό το τροχιακό και αποσταθεροποιείται το ασύζευκτο ηλεκτρόνιο, το συνολικό αποτέλεσμα είναι ενεργειακά ευνοϊκό. Οι σχετικές σταθερότητες των τριτοταγών, δευτεροταγών και πρωτοταγών ριζών αλκυλίου ερμηνεύονται με τον απεντοπισμό των ηλεκτρονίων, μέσω της επικάλυψης του τροχιακού του ασύζευκτου ηλεκτρονίου και τροχιακού της αλκυλομάδας. Μέσω της επικάλυψης, μεμονωμένα ηλεκτρόνια μπορούν, ως ένα βαθμό, να βοηθήσουν στη σύνδεση τριών πυρήνων δύο ανθράκων και ενός υδρογόνου. Αυτό το είδος απεντοπισμού ονομάζεται υπερσυζυγία. Στο σχήμα 1.2. φαίνονται οι αλληλεπιδράσεις των τροχιακών που σχετίζονται με την υπερσυζυγία σε μία αλκυλο- ρίζα. Σχήμα 1.2. Υπερσυζυγία και αλληλεπιδράσεις τροχιακών σε αλκυλο- ρίζα. 15

16 Ένα άλλο φαινόμενο που σταθεροποιεί τις ελεύθερες ρίζες είναι ο συντονισμός ή μεσομέρεια (resonance or mesomerism). Συντονισμός είναι το φαινόμενο κατά το οποίο ένα μόριο μπορεί να παρουσιασθεί με δύο ή περισσότερες δομές που διαφέρουν μόνο στη διευθέτηση των ηλεκτρονίων με σταθερή τη διευθέτηση των ατομικών πυρήνων. Το μόριο είναι υβρίδιο όλων των δομών, οι οποίες είναι παρόμοιας σταθερότητας (ενεργειακό περιεχόμενο). Το υβρίδιο συντονισμού είναι σταθερότερο από τις συμμετέχουσες δομές, που ονομάζεται ενέργεια συντονισμού. Ο συντονισμός σταθεροποιεί ρίζες σε ακόρεστα συστήματα. Μερικά παραδείγματα δομών συντονισμού ή μεσομέρειας. Σχήμα 1.3. Ελεύθερες ρίζες και δομές συντονισμού (αλλυλικές και βενζυλικές δομές). Η σταθερότητα των ελευθέρων αυτών ριζών εξηγείται όπως με τις τροχιακές αλληλεπιδράσεις των αλκυλο- ριζών μέσω του υπερσυζυγιακού φαινομένου, αλλά το αποτέλεσμα είναι μεγαλύτερο γιατί τα πολλαπλά π τροχιακά είναι ενεργειακά πλησιέστερα με το τροχιακό του ασύζευκτου ηλεκτρονίου, και οι δομές συντονισμού τα καθιστούν σταθερότερα. Η κινητική σταθερότητα των ελευθέρων ριζών γενικά οφείλεται σε στερεοχημική παρεμπόδιση. Όταν υπάρχει μεγάλη συγκέντρωση χημικών δομών γύρω από το ριζικό κέντρο η δραστικότητά του με άλλη ρίζα ή μόριο μειώνεται δραστικά. Η ημιζωή της ελεύθερης ρίζας αυξάνεται σημαντικά,άνω του χιλιοστού του δευτερολέπτου (>10-3s). Σε αρκετές περιπτώσεις οι ρίζες σταθεροποιούνται και διατηρούνται για αρκετό χρονικό διάστημα ώστε να μελετηθούν με τις κανονικές φασματοσκοπικές τεχνικές. Παράδειγμα αποτελεί η 2,4,6-τρι-tert- βουτυλοφαινυλο-ρίζα, αν και ηλεκτρονικά είναι 16

17 ασταθής όπως η φαινυλο- ρίζα, η ημιζωή της είναι περίπου 0.1s. Μετατρέπεται σε μια ενεργειακά ασύμβατη δομή με ενδομοριακή 1,4- μεταφορά υδρογόνου. πυριτίου: Άλλες σταθερές ρίζες(στερεοχημική παρεμπόδιση) είναι ενώσεις ημιζωή: 6s ημιζωή: 200s Η σταθερότητα της ρίζας του τριφαινυλομεθυλίου (Ph)3C δεν οφείλεται σε συζυγιακό φαινόμενο, αλλά κυρίως σε στερεοχημική παρεμπόδιση, λόγω του ότι τα τρία φαινύλια δεν είναι σε ένα επίπεδο αλλά σε τρείς διαφορετικές στερεοχημικά θέσεις. Η ρίζα αυτή αντί να σχηματίσει το εξαφαινυλοαιθάνιο (Α) με την αντίδραση δύο ριζών καταλήγει στη δομή (Β): Με το κεφάλαιο αυτό εξετάσαμε τα διάφορα δεδομένα που παίζουν ρόλο στο σχηματισμό και τη σταθερότητα των ελευθέρων ριζών. 17

18 ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΔΕΥΤΕΡΟ ΜΕΛΕΤΗ ΕΛΕΥΘΕΡΩΝ ΡΙΖΩΝ: ΦΑΣΜΑΤΟΣΚΟΠΙΑ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΟΥ ΠΑΡΑΜΑΓΝΗΤΙΚΟΥ ΣΥΝΤΟΝΙΣΜΟΥ 2.1. Εισαγωγή Οι ελεύθερες ρίζες και η δομή τους μπορούν να μελετηθούν κυρίως με τη φασματοσκοπία Ηλεκτρονικού Παραμαγνητικού Συντονισμού (ΗΠΣ) (Electron Paramagnetic Resonance, EPR ή Electron Spin Resonance, ESR). Επίσης, οι ελεύθερες ρίζες ανάλογα με τη σταθερότητα και την ιδιαίτερη δομή τους μπορούν να μελετηθούν και με υπεριώδη-ορατή ακτινοβολία (UV-VIS spectroscopy), καθώς και με μια παραλλαγή του Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού (NMR) που λέγεται Χημικώς Επαγόμενη Δυναμική Πυρηνική Πόλωση (Chemically Induced Dynamic Nuclear Polarization, CIDNP) και με φασματομετρία μάζας (mass spectrometry). Η ΗΠΣ είναι η κατάλληλη φασματοσκοπική τεχνική για τη μελέτη ελευθέρων ριζών οι οποίες παρουσιάζουν παραμαγνητικές ιδιότητες. Η μέθοδος είναι πολύ ευαίσθητη και ανιχνεύει ελεύθερες ρίζες σε συγκεντρώσεις της τάξης 10-8 Μ, παρέχοντας πληροφορίες για την φύση και την ποσότητα της ρίζας και της δομής της (στερεοχημική διαμόρφωση, απεντοπισμός του ασύζευκτου ηλεκτρονίου). Η ελεύθερη ρίζα τοποθετημένη μέσα σε ένα μαγνητικό πεδίο και υποβαλλόμενη σε ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία μικροκυμάτων συμπεριφέρεται παραμαγνητικά, λόγω της συνεχούς περιστροφής του ασύζευκτου ηλεκτρονίου που δημιουργεί μαγνητική ροπή και προσανατολίζεται κατά δύο κατευθύνσεις, μία προς την κατεύθυνση του εξωτερικού πεδίου και μία σε αντίθετη κατεύθυνση. Το φάσμα ΗΠΣ είναι ανάλογο του Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού (ΠΜΣ) αλλά λόγω του ότι το ηλεκτρόνιο έχει πολύ μεγαλύτερη μαγνητική ροπή από τον πυρήνα του πρωτονίου, απαιτεί περισσότερη ενέργεια για να αναστραφεί το spin του. Σε 18

19 ένα πεδίο 3200 Gauss, όπου η απορρόφηση στο ΠΜΣ θα συνέβαινε περίπου στα 14 ΜΗz (ραδιοκύματα), η απορρόφηση στον ΗΠΣ συμβαίνει σε υψηλότερη συχνότητα, περίπου σε 9000 MHz, δηλαδή στην περιοχή των μικροκυμάτων Ηλεκτρονικός Παραμαγνητικός Συντονισμός (ΗΠΣ) (Electron Paramagnetic Resonance, EPR) Ο Ηλεκτρονικός Παραμαγνητικός Συντονισμός (ΗΠΣ) ανακαλύφθηκε νωρίτερα από τον Πυρηνικό Μαγνητικό Συντονισμό (ΠΜΣ) αλλά αναπτύχθηκε αργότερα και με ορισμένες δυσκολίες λόγω της μικρής διάρκειας ζωής των ελευθέρων ριζών. Οι βασικές αρχές του ΗΠΣ είναι παρόμοιες με τον ΠΜΣ, με μόνη διαφορά ότι το φαινόμενο οφείλεται σε συντονισμό ασύζευκτου ηλεκτρονικού spin και όχι spin πρωτονίου. Η έννοια του spin ανακοινώθηκε το 1925 από τους Uhlenbeck και Goudsmit, όπου πρότειναν ότι ένα ηλεκτρόνιο έχει μαγνητική ροπή (magnetic moment, spin). Το ηλεκτρόνιο ως αποτέλεσμα της περιστροφής του γύρω από τον άξονά του παρουσιάζει άνυσμα μαγνητικής ροπής και το spin του χαρακτηρίζεται από τον κβαντικό αριθμό s. Η κβαντομηχανική δείχνει ότι το ηλεκτρόνιο έχει δύο καταστάσεις του spin που ανταποκρίνονται σε δύο προσανατολισμούς στο χώρο. Κάθε φορτισμένο σωματίδιο που περιστρέφεται γύρω από τον εαυτό του συμπεριφέρεται ως ένας μικροσκοπικός μαγνήτης με τους πόλους του κατά μήκος του άξονα περιστροφής του. Γενικά, τα άτομα ή μόρια δεν είναι παραμαγνητικά γιατί τα ηλεκτρόνιά τους συνδυάζονται σε ζεύγη με αντίθετο spin ( ) και τα μαγνητικά τους δίπολα αλληλοαναιρούνται. Όταν όμως το μόριο περιέχει περιττό αριθμό ηλεκτρονίων, όπως οι ενώσεις N, N2, ή όταν στη θεμελιώδη κατάσταση το μόριο περιλαμβάνει δύο ηλεκτρόνια με παράλληλη κατεύθυνση spin ( ), όπως το οξυγόνο (Ο2), τότε εμφανίζεται μαγνητική ροπή και το μόριο καλείται παραμαγνητικό. Ασύζευκτα ηλεκτρόνια παρουσιάζουν διάφορες χημικές ενώσεις, όπως τα στοιχεία 19

20 μετάπτωσης και τα σύμπλοκά τους (διάφορα μεταλλικά ιόντα) καθώς και οι ελεύθερες ρίζες. Όλες αυτές οι ενώσεις που έχουν παραμαγνητικές ιδιότητες μπορούν να μελετηθούν με τον ΗΠΣ. Η ΗΠΣ χρησιμοποιεί μικρότερους μαγνήτες, περίπου 0.3 Tesla, σε σχέση με τον ΠΜΣ, και η ακτινοβολία συντονισμού είναι της περιοχής των μικροκυμάτων. στροφορμή περιφοράς (orbital angular momentun) μαγνητική ροπή περιφοράς (orbital magnetic moment) l e - μ = γ e l s e - μ = 2γ e s στροφορμή σπίν (spin angular momentum) μαγνητική ροπή (spin magnetic moment) Σχήμα 2.1. Στροφορμή (angular momentum) και μαγνητική ροπή (magnetic moment) του ηλεκτρονίου από την περιστροφή γύρω από τον άξονά του. To spin του ηλεκτρονίου χαρακτηρίζεται από δύο κβαντικούς αριθμούς που διαφέρουν μεταξύ τους κατά μία ακέραια μονάδα, ms = ± 1/2 (μαγνητικός κβαντικός αριθμός ηλεκτρονικού spin). Σύμφωνα λοιπόν με τη θεωρία της κβαντομηχανικής οι δύο κατευθύνσεις των καταστάσεων του spin έχουν ίσες τιμές (eigenvalues), που είναι msh/2π, όπου ms = ±1/2, και h η παγκόσμια σταθερά του Planck (h = 6,6256X10-27 erg.sec) από την εξίσωση Ε= hv, (Ε η ακτινοβολούμενη κβαντική ενέργεια και ν η συχνότητα). Οι δύο τιμές του ms σημαίνει ότι το ηλεκτρόνιο με +1/2 βρίσκεται στην κατάσταση α και -1/2 στην κατάσταση β. Από πειράματα έχει βρεθεί ότι η μαγνητική ροπή του spin του ηλεκτρονίου (μs) και το άνυσμά του (μsz) δίδονται από τις εξισώσεις: μs = ge β e s(s+1) μsz = -ge βe ms = γs ms h/2π 20

21 όπου ge 2 (Lande splitting factor, Lande φασματοσκοπικός συντελεστής διάσπασης) β e = X10-21 erg gauss -1 (Bohr magneton) γ s = rad s -1 gauss -1 (gyromagnetic ratio, γυρομαγνητικό πηλίκο) s = 1/2, m s = ± 1/2 Όταν απουσιάζει το εξωτερικό μαγνητικό πεδίο, το ηλεκτρονικό spin προσανατολίζεται τυχαία στο χώρο και τα διάφορα ανύσματα αλληλοαναιρούν το ένα το άλλο λόγω του μεγάλου αριθμού που υπάρχει. Όταν όμως εφαρμοσθεί εξωτερικό μαγνητικό πεδίο Βο τότε το ηλεκτρόνιο αποκτά ενέργεια που καλείται ενέργεια Zeeman (energy Zeeman): Ε = -μs Βo, Ε = - μs Βο cosθ = - μsz Βο και τελικά η εξίσωση γίνεται: Ε = -γ s /2π m s Β ο = g e β e m s Β ο (όπου Θ είναι η γωνία μεταξύ του ανύσματος μs και της προβολής μsz πάνω στον άξονα του εξωτερικού μαγνητικού πεδίου Βο). Για τις δύο καταστάσεις που υπάρχουν λόγω του μαγνητικού κβαντικού αριθμού του spin m s = + 1/2 και m s = - 1/2 θα υπάρξει μια διαφορά ενέργειας: ΔΕ = ge βe Bo Αυτό το φαινόμενο σημαίνει ότι το εξωτερικό μαγνητικό πεδίο Βο διέσπασε τις εκφυλισμένες καταστάσεις α και β των δύο καταστάσεων του spin. To φαινόμενο αυτό αναπαριστάται διαγραμματικά με το παρακάτω σχήμα 2.2. Εάν στο σύστημα εφαρμοσθεί ένα ταλαντούμενο μαγνητικό πεδίο Β 1, που εξασκείται από μια ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία με συχνότητα ω ο, κάθετα ως προς το στατικό μαγνητικό πεδίο, έτσι ώστε να είναι Β 1 Βο, ώστε να ισχύει: hω ο 2π = hν 0 = g e β e B 0 = ΔΕ 21

22 τότε προκαλείται μία μετάβαση ανάμεσα στα επίπεδα α και β, που καλείται ηλεκτρονικός παραμαγνητικός συντονισμός. m s = +(1/2) Ενέργεια m s = +(1/2) ΔΕ = hv o = g e β e B o m s = - (1/2) Εξωτερικό μαγνητικό πεδίο 0 B o Σχήμα 2.2. Ενεργειακά επίπεδα των ηλεκτρονικών spins με την επίδραση εξωτερικού μαγνητικού πεδίου Βο, η παράλληλη (ms=+1/2) και η αντιπαράλληλη (ms=-1/2) κατεύθυνση της μαγνητικής ροπής του ηλεκτρονίου σε σχέση με το εξωτερικό πεδίο σημειώνονται με τα βέλη και. Η απορρόφηση και επαγόμενη εκπομπή είναι περίπου οι ίδιες, και οι πληθυσμοί των καταστάσεων σε κάθε ενεργειακό επίπεδο τείνουν να εξισωθούν. Παρόλα αυτά ένας επιπλέον πληθυσμός ηλεκτρονίων, της τάξης του 10-3 (δηλαδή 1 στα 1.000) στο χαμηλότερο επίπεδο διατηρείται λόγω φαινομένων αποκατάστασης (relaxation phenomena). Σε αντίθεση με το πυρηνικό spin του πρωτονίου όπου ο επιπλέον πληθυσμός είναι μόνο 10-5 των πυρήνων (δηλαδή ένας πυρήνας στους ) βρίσκεται επιπλέον στη χαμηλότερη ενεργειακή στάθμη και σε αυτό το μικρό πληθυσμιακό αριθμό οφείλονται οι ενεργειακές μεταβάσεις στο NMR) σε θερμοκρασία δωματίου με ΔΕ περίπου cal/mol. Από την άποψη αυτή είναι ευκολότερο να παρατηρηθεί ένα σήμα στον Ηλεκτρονικό Παραμαγνητικό Συντονισμό από ότι στον Πυρηνικό Μαγνητικό Συντονισμό (μικρότερη ευαισθησία). 22

23 Η κατανομή των δύο πληθυσμών στα δύο ενεργειακά επίπεδα δίδεται από την εξίσωση Boltzmann: nα/nβ = exp [-ΔE/kT] Από πρακτική άποψη, στην φασματοσκοπία ΗΠΣ οι συνθήκες συντονισμού για τη συχνότητα διατηρείται σταθερή με μια πηγή μικροκυμάτων σε περίπου 9 GHz και το εξωτερικό μαγνητικό πεδίο μεταβάλλεται Τεχνική Φασματοσκοπίας Ηλεκτρονικού Παραμαγνητικού Συντονισμού Στην φασματοσκοπία ΗΠΣ το μαγνητικό πεδίο που χρησιμοποιείται είναι της τάξης των Tesla (1-10 Gauss). Συνήθως το πεδίο που χρησιμοποιείται είναι 0.3 Tesla και η ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία μικροκυμάτων της τάξης των 9-10 GHz (1010 c/s) ή μήκος κύματος 3 cm -1. Το μαγνητικό πεδίο στα περισσότερα εμπορικά φασματόμετρα ΗΠΣ ενισχύεται με σωληνοειδές πηνίο για την παραγωγή εναλλασσόμενου μαγνητικού πεδίου ισχύος μερικών μικρο-tesla και μια γεννήτρια σάρωσης για ευρύ πεδίο gauss. Η πηγή ακτινοβολίας, της περιοχής των μικροκυμάτων, παράγεται μέσω της βαλβίδας Klystron. Το φάσμα ΗΠΣ λαμβάνεται με την καταγραφή της απορρόφησης της ακτινοβολίας από το δείγμα, που είναι μέσα σε σωληνίσκο ή πεπλατυσμένη κυψελίδα από quartz, καθώς σαρώνεται το μαγνητικό πεδίο. Η καταγραφή του φάσματος, σε αντίθεση με τον ΠΜΣ, είναι η γραφική παράσταση της πρώτης παραγώγου συνάρτησης της καμπύλης της απορρόφησης ως προς το μαγνητικό (dα/dβ), γιατί με τον τρόπο αυτό έχουμε καλύτερη σχέση σήματος/θορύβου. Χωρίς την πρώτη παράγωγο θα λαμβάνονταν ένα πολύπλοκο φάσμα με πολλές κορυφές που θα ήταν δύσκολο να ερμηνευθεί. 23

24 Σχηματική παράσταση φασματογράφου ΗΠΣ Σχήμα 2.3. Φασματόμετρο Ηλεκτρονικού Παραμαγνητικού Συντονισμού. Καταγραφή φάσματος με απλή απορρόφηση και με την πρώτη παράγωγο. 24

25 Σχήμα 2.4. Φασματόμετρο Ηλεκτρονικού Παραμαγνητικού Συντονισμού. (τα πρώτα φασματόμετρα ΗΠΣ ήταν της Varian, ενώ τα τελευταία χρόνια τα κυριότερα φασματόμετρα ΗΠΣ είναι της Bruker και της Jeol). Η χρήση ηλεκτρονικού υπολογιστή και η λήψη πολλών φασμάτων (μετασχηματισμός Fourier) έχει βελτιώσει σημαντικά τη λήψη φασμάτων και την προσομοίωσή τους Μελέτη των Φασμάτων ΗΠΣ και Διερεύνηση της δομής ελευθέρων ριζών Ένα φάσμα ΗΠΣ περιγράφεται από το φασματοσκοπικό συντελεστή διάσπασης (g, spectroscopic splitting factor), την υπέρλεπτη υφή του φάσματος με τις παραμέτρους σύζευξης (hyperfine coupling constants) και το εύρος των κορυφών, δηλαδή το εύρος των φασματοσκοπικών κορυφών στο 1/2 της έντασης (line-widths). φασματοσκοπικός συντελεστής διάσπασης g (spectroscopic splitting factor), είναι μία σταθερά ειδική για κάθε ελεύθερη ρίζα. Το ασύζευκτο ηλεκτρόνιο της ελεύθερης ρίζας έχει τροχιακή κινητική στροφορμή λόγω της κίνησης στο χώρο και μια κινητική στροφορμή του spin λόγω της περιστροφής γύρω από τον άξονά του. Ο φασματοσκοπικός συντελεστής g εκφράζει τη σύζευξη αυτών των δύο κινητικών στροφορμών, και η αλληλεπίδραση καλείται σύζευξη τροχιακού-spin (spin-orbit coupling), που 25

26 εξαρτάται από το ηλεκτρονικό περιβάλλον. Δύο ρίζες με διαφορετικές τιμές g συντονίζονται σε διαφορετικά πεδία [hωο/2π = hvo = ge βe Bo =ΔE]. Οι ποικιλίες τιμών του g ( στις περισσότερες ρίζες είναι 2) από μια ρίζα σε άλλη μπορεί να είναι μικρή, αλλά αρκετά μεγάλη για να παρέχει χρήσιμες πληροφορίες ως προς την δομή της. H 3 C CH 3 H 3 C H 3 C C C N N C C 6 H 5 g= DMP C g= Σχήμα 2.5. Φάσματα ΗΠΣ ορισμένων ελευθέρων ριζών και οι τιμές του g. Η υπέρλεπτη σύζευξη (hyperfine coupling) είναι η κατάτμηση των κορυφών του φάσματος ΗΠΣ, όπως και στην περίπτωση του NMR, ανάλογα με τις συζεύξεις του ασύζευκτου ηλεκτρονίου με τους πυρήνες που γειτονεύουν και οι οποίοι έχουν μη μηδενικό πυρηνικό spin (1H, 13C, 14N, 15N, 19F κλπ). Όταν το ηλεκτρόνιο είναι κοντά (σε α ή β θέση μετά από έναν δεσμό) σε άτομο τότε υπάρχει αλληλεπίδραση με τον πυρήνα και προκύπτει διάσπαση των κορυφών του. Στο φάσμα που προκύπτει λέγεται υπέρλεπτη σύζευξη και εκφράζεται με τον πολλαπλασιασμό των φασματοσκοπικών κορυφών του σήματος ΗΠΣ. 26

27 Εάν έχουμε μόνο το ασύζευκτο ηλεκτρόνιο μιας ρίζας τότε λαμβάνουμε μία κορυφή (πρώτη παράγωγο), αλλά εάν δίπλα του υπάρχει ένα άτομο υδρογόνου, Η, που έχει μαγνητικό κβαντικό αριθμό του spin I = ±1/2, τότε η σύζευξη του πυρήνα με τους δύο δυνατούς προσανατολισμούς (mi = ± 1/2), παράλληλα και αντιπαράλληλα του ηλεκτρονικού spin (ms = ± 1/2), δημιουργεί 4 ενεργειακά επίπεδα : e N αe αn Βο e N αg βn ενεργειακά επίπεδα από τη σύζευξη e N βe βn ασύζευκτου ηλεκτρονίου με Η (Ι = 1/2) e N βe αn Στη φασματοσκοπία ΗΠΣ οι τιμές του εξωτερικού μαγνητικού πεδίου Βο ανταποκρίνονται στο συντονισμό των ηλεκτρονικών spin στα ενεργειακά επίπεδα, αe βe, άρα παρατηρούνται δύο μεταβάσεις (1) και (2). (σχήμα 2.6). δύο ενεργειακά επίπεδα Ενέργεια Β ο Σχήμα 2.6. Μεταβάσεις σε δύο ενεργειακά επίπεδα με δύο κορυφές στο φάσμα Η. ι ενεργειακές μεταβάσεις οφείλονται στη σύζευξη ασύζευκτου ηλεκτρονίου-πυρήνα πρωτονίου (Ι = 1/2). 27

28 Οι δύο ενεργειακές μεταβάσεις είναι ίσες σε ενέργεια και ένταση αλλά συμβαίνουν σε διαφορετικά πεδία δίνοντας δύο κορυφές στο φάσμα. Η διαφορά a(η) ονομάζεται σταθερά υπέρλεπτης σύζευξης (hyperfine coupling constant) και είναι παρόμοια με τη σταθερά σύζευξης πρωτονίου/πρωτονίου, JHH, στον Πυρηνικό Μαγνητικό Συντονισμό (NMR). Ο γενικός κανόνας για τη διάσπαση της φασματοσκοπική κορυφή του ΗΠΣ σήματος δίνεται από τον τύπο 2Ι+1 κορυφές, όπου Ι είναι ο πυρηνικός κβαντικός αριθμός του spin (nuclear spin quantum number). ι πυρήνες 1 Η, 19 F, 15 Ν, 13 C έχουν Ι = 1/2, οι πυρήνες 14Ν Ι = 1, ο πυρήνας Cu2+ Ι = 3/2, ο πυρήνας Mn2+ Ι = 5/2. Όταν το ασύζευκτο ηλεκτρόνιο βρίσκεται πάνω σε άτομο άνθρακα που συνδέεται με άτομα υδρογόνου (Ηα) τότε υπάρχει σύζευξη ηλεκτρονίου Ηα και ο αριθμός των κορυφών είναι n+1, όπου n είναι ο αριθμός των πρωτονίων. Η ένταση των κορυφών επίσης διαφέρει και δίδεται από το τρίγωνο του Pascal. Στην περίπτωση της ελεύθερης ρίζας μεθυλίου (CH3 ) οι κορυφές είναι 3+1 = 4 και η ένταση 1:3:3:1, ενώ η σταθερά σύζευξης a(η)=23.0 Gauss. Ms=+1/2 M I +3/2 1/2hA +1/2 1/2 3/2 Μετάβαση ZEEMAN m I = 1/2 m I =+1/2 S=1/2 Ms= 1/2 B Σχήμα 2.7. Φάσμα ΗΠΣ της ρίζας μεθυλίου και τα ενεργειακά επίπεδα που δίδουν τις 4 φασματοσκοπικές κορυφές. 28

29 Σε μια ανθρακική αλυσίδα με ασύζευκτο ηλεκτρόνιο πάνω στον άνθρακα μπορούν να υπάρξουν συζεύξεις με πρωτόνια Ηα και Ηβ (όπου το πρωτόνιο βρίσκεται σε α και β θέση. Το φάσμα ΗΠΣ εξαρτάται από τις σταθερές a(ηα) και a(ηβ), αλλά ανάλογα με τη στερεοχημική δομή της ελεύθερης ρίζας μπορούν να υπάρξουν και συζεύξεις με πρωτόνια και σε γ και δ θέση: a(ηγ) και a(ηδ). Οι συζεύξεις α δίδουν πληροφορίες για τη διαμόρφωση της ρίζας (υβριδισμός του ριζικού κέντρου), ενώ η σύζευξη β πληροφορίες για τις στερεοχημικές διατάξεις της ρίζας. ms = +1/ Hz 1.61 Hz +3/2 +1/2 +1/2 1/2 Φάσμα ESR: α 1 (CH 2 )= 17.4G α 2 (ΟΗ)= 1.15G CH 2 -H 1/2 3/2 s =1/2 α G α G 3/2 1/2 ms = 1/2 1/2 +1/2 +1/2 +3/2 B Σχήμα 2.8. Φάσμα ΗΠΣ της ελεύθερης ρίζας CΗ 2-ΟΗ με υπέρλεπτη υφή φάσματος αποτελούμενο από 6 κορυφές ως αποτέλεσμα σύζευξης του Ηα και Ηβ πρωτονίου. 29

30 Σχήμα 2.9. Φάσματα ΗΠΣ του βενζολίου, του ναφθαλινίου και του α,α-διφαινυλο-βπικρυλουδραζυλίου(dpph) σε διάλυμα βενζολίου (ο φασμα-τοσκοπικός συντελεστής διάσπασης g = 2,0036 χρησιμοποιείται για τη βαθμονόμηση των φασμάτων). 30

31 Σχήμα Φάσματα ΗΠΣ και προσομοίωση των φασμάτων. 31

32 2.5.Προσομοίωση φασμάτων Ηλεκτρονικού Παραμαγνητικού Συντονισμού Τα φάσματα ΗΠΣ είναι αρκετά πολύπλοκα και δημιουργούν σημαντικά προβλήματα στους ερευνητές που προσπαθούν να διευκρινίσουν τη δομή μιας ελεύθερης ρίζας και τις σταθερές σύζευξης. Για το λόγο αυτό έχουν αναπτυχθεί διάφορα προγράμματα προσομοίωσης των φασμάτων (simulation) με απλές παραμέτρους και κανόνες κβαντομηχανικής για το spin και την πολλαπλότητα των κορυφών. Παρακάτω δίδεται ένα απλό παράδειγμα προσομοίωσης φάσματος ΗΠΣ. 3,4 dimethoxy benzaldehyde: EPR spectrum with strong spectral lines. Simulation: aldehyde proton-ch(0.16 G), 2-H(1H, 0.25 G), 3-CH 3 (3H, 3.84 G), 4-CH 3 (3H, 3.90 G), 5-H (1H, 0.16 G), 6-H (1H, 4.15 G) Σχήμα Φάσμα ΗΠΣ και η προσομοίωσή του με ένα από τα προγράμματα. 32

33 Σχήμα Φάσμα ΗΠΣ και η προσομοίωσή του με ένα από τα προγράμματα. Τα τελευταία χρόνια υπάρχουν διάφορες πηγές στο διαδίκτυο (internet) που διαθέτουν ελεύθερα τα προγράμματα αυτά. Επίσης η εταιρία Bruker διαθέτει δωρεάν ένα CD-RM με τα ηλεκτρονικά προγράμματα για προσομοίωση φασμάτων ΗΠΣ. (R.Morse and A.I.Smirnov. Recent computer applications in EPR spectroscopy. Electron Spin Resonance vol 15,Specialist Periodical Reports, Royal Society of Chemistry, Cambridge, 1996). 33

34 Πηγές στο διαδίκτυο για προσομοίωση φασμάτων ΗΠΣ: Win Sim Program (Prof. Mason, USA) : Illinois EPR Research Center, University of Illinois, Urbana, USA: Bimedical EPR Research Center, Medical College of Wisconsin, Milwaukee, USA: Pulsed EPR Center at Albert Einstein University in New York, USA: Bruker Instruments, web site (USA Germany): & JEL web site: Scientific Software Services web site: Virginia Polytechnic Institute and State University, Dpt Chemistry: Notre Dame Radiation Chemistry Data Center: Bristol University, England: Wilmad EPR Products: ENDR site NorthWestern University, Dpt of Chemistry: Biophysical Society EPR data: Biomedical Magnetic Resonance Laboratory, Urbana-Champaign, University of Illinois: Prof. Richard Cammack, King;s College, University of London, Database- EPR: (anonymous FTP): xenon.che.ilstu.edu. (epr-list-request@xenon.che.ilstu.edu) 34

35 2.6. Βιβλιογραφία Κεφαλαίων 1 και Ingram DJ. Free Radicals as Studied by ESR. Butterworths, London, Bass AM, Broida HP, eds. Formation and Trapping of Free Radicals. Academic Press, N.Y, Blois MS, Bronn HW, Lemmon RM, Lindblom R, Weissbluth M, Free Radicals in Biological Systems. Academic Press, New York, Pryor WA. Free Radicals. McGraw-Hill, New York, Norman RC and Gilbert BC. Electron-spin Resonance Studies of Shortlived rganic Radicals. In: Gold V, ed. Advances in Physical rganic Chemistry. Academic Press, London, vol 5: , Ayscough PB. Electron Spin Resonance in Chemistry. Menthuen, London, Alger RS. Electron Paramagnetic Resonance. Interscience Publs, Wiley & Sons, New York, Gerson F. High Resolution ESR Spectroscopy. Wiley-Verlag Chemie, Weinheim, Atherton NM. Electron Spin Resonance. Ellis Hardwood, Chichester, Symons M. Chemical and Biochemical Aspects of ESR Spectroscopy. Van Nostrand Reinhold, New York, Wertz JE, and Bolton JR. Elementary Theory and Practical Applications of ESR. MacGraw-Hill, New York, 1972 (2nd ed. Chapman and Hall, London, 1986). 12. Giese B. Radicals in rganic Synthesis: Formation of Carbon-Carbon Bonds. Pergamon Press, xford, Βαλαβανίδης Α. Βασικές Αρχές Μοριακής Φασματοσκοπίας και Εφαρμογές στην Οργανική Χημεία. Σύγχρονα Θέματα, Αθήνα, Pryor WA, eds. Free Radicals in Biology. Academic Press, New York, Vols 1-12, Rice-Evans CA, Diplock AT, Symons MCR. Techniques in Free Radical Research. Elsevier, Amsterdam,

36 16. Motherwell WB and Crich D. Free Radical Chain Reactions in rganic Synthesis. Academic Press, New York, Weil JA, Bolton JR and Wertz JE. Electron Paramagnetic Resonance: Elementary Theory and Practical Applications. Wiley, New York, Fossey J, Lefort D and Sorba J. Free Radicals in rganic Chemistry. Wiley & Sons, Chichester, England, Poole CP. Electron Spin Resonance. A Comprehensive Treatise on Experimental Techniques. Interscience Publs, Wiley & Sons, N.Y, 1967., 2 nd ed, Doverpubls, 1997 (New York). 20. Alfassi ZB. N-Centered Radicals. Wiley, Chichester, Alfassi ZB. General Aspects of the Chemistry of Radicals. Viley-VCH, Weinheim, Rosen GM, Britigan BE, Halpern HJ, Pon S. Free Radicals in Biology and Detection by Spin Trapping. xford University Press, New York, Parsons AF. An Introduction to Free Radical Chemistry. Blackwell Science, xford, Perkins MJ. Radical Chemistry-The Fundamentals. xford University Press, New York, Sajfutdinor RG, Ivanovna L. Electronic Paramagnetic Resonance in Biochemistry & Biology, Klumer Academic, publs, Schweiger A, Jeschke G. Principles of Pulse Electronic Paramagnetic Resonance, xford University Press, xford, Denisov ET, Denisova TG, Polidova TG. Handbook of Free Radical Initiators, Wiley, Chichester, Gerson f. Electron Spin Resonance Spectroscopy for rganic Chemists. Wiley-VCH, Weinheim, Bender C, Berliner LJ, eds. EPR: Instrumental Methods (Biological Magnetic Resonance S.). Klumer Academic/Plenumm Publishers, Dorddrecht, Afanas er IB, Denisov ET. xidation and Antioxidants in rganic Chemistry & Biology. Marcel Dekker, New York,

37 ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΤΡΙΤΟ ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΚΑΙ ΜΕΛΕΤΗΣ ΦΑΣΜΑΤΩΝ ΕΛΕΥΘΕΡΩΝ ΡΙΖΩΝ ΜΕ ΗΠΣ ΚΑΙ ΑΛΛΕΣ ΜΕΘΟΔΟΥΣ 3.1. Εισαγωγή Η μικρή διάρκεια ζωής των ελεύθερων ριζών, ιδιαίτερα οργανικών μορίων, στις διάφορες μελέτες χημικών αντιδράσεων στην Οργανική Χημεία, στη Βιοχημεία και σε ποικίλες εφαρμογές στην Βιολογία και την Ιατρική, δημιουργούσαν σημαντικά προβλήματα στη λήψη φασμάτων ΗΠΣ. Τις τελευταίες δεκαετίες έχουν εφαρμοσθεί διάφορες μέθοδοι παραγωγής ελευθέρων ριζών και μεθοδολογίες τεχνικής φύσης για τη λήψη των φασμάτων τους με ΗΠΣ ή τον ποσοτικό προσδιορισμό τους με αντιδράσεις που δίδουν ουσίες που απορροφούν στο υπεριώδες-ορατό ή παράγουν συγκεκριμένα προϊόντα που μπορούν να εκτιμηθούν ποιοτικά και ποσοτικά με χρωματογραφικές μεθόδους Μέθοδος Συνεχούς Ταχείας Ροής στον Ηλεκτρονικό Παραμαγνητικό Συντονισμό Εάν η παραγωγή ελευθέρων ριζών σε ένα σύστημα μπορεί να διατηρηθεί σε ικανοποιητική συγκέντρωση, άνω του 10-6 Μ, τότε υπάρχει δυνατότητα να παρατηρηθεί και να καταγραφεί το φάσμα ΗΠΣ. Στην Οργανική Χημεία ελεύθερες ρίζες οργανικών ενώσεων, με απόσπαση ενός υδρογόνου από τη ρίζα υδροξυλίου, που παράγεται φωτοχημικά ή με οξειδοαναγωγική αντίδραση Fenton, μπορούν να δημιουργηθούν με το σύστημα της συνεχούς ροής τριών διαλυμάτων (continuous fast flow): π.χ. (1) διάλυμα υπεροξειδίου του υδρογόνου, (2) διάλυμα δισθενούς σιδήρου ή τριχλωριούχου τιτανίου και (3) διάλυμα της οργανικής ένωσης-υπόστρωμα. Τα τρία διαλύματα διοχετεύονται ταυτόχρονα από ξεχωριστούς σωλήνες με 37

38 περισταλτική αντλία και δευτερόλεπτα πριν εισέλθουν στην διαπλατυσμένη κυψελίδα quartz του ΗΠΣ, που είναι τοποθετημένη κοιλότητα (cavity) του μηχανήματος ανάμεσα στους μαγνήτες, αναμιγνύονται με απλή συνένωση των τριών ρευμάτων (απλή κατασκευή από teflon). Η συγκέντρωση των ριζών που σχηματίζονται είναι ικανοποιητική, παρά τις σημαντικές απώλειες λόγω τερματισμού. Το ph του διαλύματος μπορεί να μεταβληθεί με την προσθήκη θειικού οξέος ή αμμωνίας στο ένα εκ των διαλυμάτων: Ti 3+ + H 2 2 Ti 4+ + H + H H + CH 3 CH 2 H CH 2 CH 2 H (α) CH 3 CHH (β) 3.3. Μέθοδος δέσμευσης Eλευθέρων ριζών με Spin Trapping Μία άλλη πολύ διαδεδομένη μέθοδος μελέτης των ελευθέρων ριζών είναι η δέσμευσή τους με νιτροξείδια και νιτρόνες (spin trap), ενώσεις που φέρουν την ομάδα: N Με τον τρόπο αυτό η ελεύθερη ρίζα που δημιουργείται σε ένα διάλυμα αντιδρά με το νιτροξείδιο, το spin της δεσμεύεται (spin trapped) και σχηματίζει μία δευτερεύουσα "σταθερότερη" ρίζα (the spin adduct) το φάσμα της οποίας μπορεί να μελετηθεί. Από το φάσμα ΗΠΣ του spin adduct, που είναι πιο πολύπλοκο, και από την υπέρλεπτη υφή των συζεύξεων μπορεί κανείς να διερευνήσει το είδος της αρχικής ρίζας που δημιουργήθηκε. Η μέθοδος του spin trapping ανακαλύφθηκε από τον καθηγητή E.Janzen (University of Guelph, ntario, Kαναδάς) το 1968 και από τότε έχει εξελιχθεί σε σημαντικό κλάδο της χημείας των ελευθέρων ριζών και της Οργανικής Χημείας, με σημαντικές εφαρμογές στη βιοχημεία, βιολογία και την ιατρική. 38

39 Η πειραματική διεργασία της μεθόδου δέσμευσης ριζών εξαρτάται από το είδος του νιτροξειδίου, την διαλυτότητα, το είδος της ρίζας που δεσμεύεται, την αδρανή φύση του διαλύτη, την ημιζωή του spin adduct, και το εάν απαιτείται να γίνει υποξυγόνωση του διαλύματος. Οι ουσίες που είναι εμπορικά διαθέσιμες (τα τελευταία χρόνια έχουν επιτευχθεί συνθέσεις νέων spin traps που έχουν εξειδικευμένες ιδιότητες ως προς τη δέσμευση ελευθέρων ριζών και ορισμένες χρησιμοποιούνται ως αντιοξειδωτικά και αντικαρκινογόνα φάρμακα) χωρίζονται σε δύο κατηγορίες: τα νιτροξείδια (nitroxides) και τις νιτρόνες (nitrones). Τα νιτροξείδια (ή aminoxyls κατά την IUPAC) είναι "σταθερές" ελεύθερες ρίζες γιατί το ασύζευκτο ηλεκτρόνιο σταθεροποιείται με συντονισμό στο μονομερές μεταξύ αζώτου και οξυγόνου και δεν μπορεί να σχηματίσει διμερές: R R R R N N N N R R R R Μονομερείς μορφές σταθερές Διμερής ασταθής μορφή Τα πιο σταθερά νιτροξείδια είναι εκείνα όπου το R είναι ομάδες μεθυλίων που περιορίζουν σημαντικά την τάση του διμερισμού, όπως το ευρύτατα διαδεδομένο 2-μέθυλο-2-νιτρωδοπροπάνιο (ΜΝΡ): CH 3 H 3 C C N CH 3 To MNP έχει το πλεονέκτημα, σε σχέση με τις νιτρόνες, ότι η ελεύθερη ρίζα προστίθεται πάνω στο άζωτο και έτσι δίνει spin adducts που είναι εύκολο να διακριθούν από το φάσμα ΗΠΣ και την υπέρλεπτη υφή σύζευξης. Άλλο νιτροξείδιο είναι νιτροζοβενζόλιο (νιτρωδοβενζόλιο): Ph N=. 39

40 a N >>>a βh 1N και 2Η a N >>>a βh 1N και 3Η H 3 C N C(CH 3 ) 3 a N =15.25G a βh =11.3G (3H) C 6 H 5 H 2 C N C(CH 3 ) 3 a N =15.4G a βh =8.25G (2H) C 6 H 5 HC N C(CH 3 ) 3 CH 3 a N =14.79G, a βh =3.73G Σχήμα 3.1. Παραδείγματα δέσμευσης ριζών με νιτροξείδια και φάσματα με υπέρλεπτη υφή σύζευξης που ερμηνεύονται σχετικώς απλά από το spin adduct που σχηματίζεται. Οι νιτρόνες έχουν τη γενική δομική μονάδα: 40

41 R R R C N C R R και η πιο απλή ένωση της κατηγορίας αυτής είναι η Ν-tert-βουτυλο νιτρόνη: H 2 C N C(CH 3 ) 3 και η Ν-tert-βουτυλο-α-φαινυλο νιτρόνη: Ph CH N C(CH 3 ) 3 Στην κατηγορία αυτή όμως υπάγονται και άλλες σημαντικές ενώσεις spin traps που χρησιμοποιούνται ευρύτατα λόγω των ιδιοτήτων τους να δεσμεύουν ρίζες ΗΟ, τη ρίζα του υπεροξειδικού ανιόντος (Ο 2 -) και την υπεροξυλο-ρίζα ΗΟ-Ο, όπως είναι το DMP (5,5-Dimethyl-1-pyrroline N- oxide, 5,5-διμεθυλο-1-πυρρολινο Ν-οξείδιο): H 3 C H 3 C N Πολλές από τις ενώσεις αυτές χρησιμοποιούνται σε πειράματα στη βιολογία και την ιατρική λόγω της σταθερότητας και των γνωστών φασμάτων που δίνουν με οξυγονούχες ελεύθερες ρίζες. 41

42 Σχήμα 3.2. Χαρακτηριστικές δομές ενώσεων δεσμευτών ελευθέρων ριζών (spin traps) που χρησιμοποιούνται ευρύτατα σε πειράματα. Η μέθοδος spin trapping χρησιμοποιείται ευρύτατα για τη δέσμευση ελευθέρων ριζών. Σε πειράματα όπου απαιτείται δέσμευση της ρίζας υδροξυλίου (ένδειξη για μηχανισμούς τοξικών δράσεων και καρκινογένεσης, λόγω του ότι η ρίζα αυτή αποτελεί κυρίαρχο στοιχείο στην έναρξη βλαβών σε βιομόρια και στο DNA σε βιολογικά συστήματα) χρησιμοποιείται το DMP στο διάλυμα με την τοξική ουσία που κάτω από οξειδωτικές συνθήκες παράγει την ρίζα υδροξυλίου. Το φάσμα ΗΠΣ της δεσμευμένης ρίζας παρουσιάζει 4 κορυφές με ένταση 1:2:2:1 και με παραμέτρους διάσπασης a Ν = a Η = 15.8 G. 42

43 H 3 C + H H 3 C H H 3 C N H 3 C N H spin trap spin adduct Σχήμα 3.3. Η αντίδραση προσθήκης της ρίζας ΗΟ στο DMP και το φάσμα EPR του προκύπτοντος spin adduct, με τις χαρακτηριστικές τέσσερις κορυφές με αναλογία υψών Εάν απαιτείται επιπλέον επιβεβαίωση του φάσματος και στο κατά πόσο η ρίζα είναι πράγματι του υδροξυλίου και παράγεται κάτω από συγκεκριμένες συνθήκες, μπορεί να προστεθεί ένας ενδιάμεσος δεσμευτής (secondary trap) που αντιδρά με την ρίζα υδροξυλίου και μετά η νέα αυτή ρίζα δεσμεύεται από το DMP. Τέτοιες δευτερεύουσες ενώσεις είναι η αιθυλική αλκοόλη (CH 3 CH 2 H), το φορμικό νάτριο (HCNa), το διμεθυλοσουλφοξείδιο DMS (CH 3 ) 2 S και άλλα απλά μόρια. Στην περίπτωση της αιθυλικής αλκοόλης η ρίζα είναι η CH(H)CH 3 και το ΗΠΣ φάσμα με DMP παρουσιάζει 6 κορυφές, με παραμέτρους a N= 15.8G, a H= 23.2 G. H + CH 3 CH 2 H H 2 + CH 3 CHH CH 3 CHH + H 3 C H 3 C N H 3 C H 3 C N H CH(H)CH 3 43

44 Σχήμα 3.4. Η αντίδραση προσθήκης της ρίζας CH(H)CH 3 στο DMP και το φάσμα EPR του προκύπτοντος spin adduct, με τις χαρακτηριστικές έξι ισοϋψείς κορυφές. Εάν χρησιμοποιήσουμε HCNa τότε η ρίζα υδροξυλίου αφαιρεί πρώτα ένα άτομο υδρογόνου από το εν διαστάσει άλας και η δευτερεύουσα ρίζα C - δεσμεύεται από το DMP (spin adduct) και δίδει φάσμα ΗΠΣ με 6 κορυφές, αλλά ελαφρά διαφορετικής υφής από το προηγούμενο φάσμα, με παραμέτρους a N = 15.6 G, a H = 19.0 G. H C + H H 2 + C H 3 C H 3 C N + C H 3 C H 3 C N H C spin trap spin adduct 3.5. Η αντίδραση προσθήκης της ρίζας C στο DMP και το φάσμα EPR του προκύπτοντος spin adduct, με τις χαρακτηριστικές έξι ισοϋψείς κορυφές(a H=19.0G, a N=15.6G, g=2.0055). 44

45 Η μέθοδος της δέσμευσης ριζών έχουν πολυάριθμες εφαρμογές σε συστήματα in vivo και in vitro στη βιολογία και την ιατρική. Οι δεσμευτές ριζών μπορούν να διοχετευθούν σε πειραματόζωα με τη τροφή τους καθώς και η τοξική ουσία. Στα ούρα, στο αίμα ή σε όργανα που μπορούν να εκχυλισθούν αργότερα, ανιχνεύονται οι δεσμευμένες ρίζες και η σχέση τους συσχετίζεται με βλάβες που προκλήθηκαν στα πειραματόζωα. Για παράδειγμα, ο τετραχλωράνθρακας που είναι καρκινογόνος ένωση βρέθηκε ότι μεταβολίζεται στο εσωτερικό του σώματος του πειραμα-τοζώου στη ρίζα CCl 3 που με το οξυγόνο μετατρέπεται σε Cl 3 C και με τη σειρά της αντιδρά με λιπίδια μεμβρανών και πρωτεΐνες προκαλώντας τελικά κακοήθη νεοπλάσματα. Με τη χρήση spin traps μπορούν να προσδιορισθούν οι ελεύθερες ρίζες που προκαλούν βλάβες στο DNA των κυττάρων και το είδος των βλαβών. Παρόμοια πειράματα γίνονται για την υπεροξείδωση των λιπιδίων των μεμβρανών, τις βλάβες στις πρωτεΐνες και την αναστολή διαφόρων ενζύμων από οξυγονούχες ελεύθερες ρίζες. Σχήμα 3.6. Φάσμα ΗΠΣ της επισημασμένης με 13 C τριχλωρομεθυλο-δεσμευμένης ρίζας (spin adduct), που δημιουργήθηκε στα μικροσωμάτια του ήπατος ποντικών, σε σύγκριση με το φάσμα χωρίς επισήμανση. 45

46 3.4. Βιβλιογραφία 1. Janzen EG. Spin trapping. Accounts of Chemical Research 4: 31-39, Janzen EG. Spin trapping. Methods in Enzymology, vol. 105: , Rosen GM, Filkstein E. Use of spin traps in biological systems. Adv. Free Radical in Biology and Medicine 1: , Janzen EG, Stronks HJ, Dubose CM, Poyer JL, McCay PB. Chemistry and biology of spin-trapping. Radicals associated with halocarbon metabolism in vitro and in vivo. Environ Health Perspect 64: , Buettner GR. Spin trapping: ESR parameters of spin adducts. Free Radicals in Biology and Medicine 3: , Mason RP, Maples KR, Knecht KT. In vivo detection of free radical metabolites by spin trapping. In: Specialist Periodical Reports: Electron Spin Resonance, vol. 1 B. Royal Society of Chemistry, London, Goldstein BD, Witz G. Free radicals and carcinogenesis. Free Rad Res Comms 11: 3-10, Dizdaroglu M. Chemical determination of free radical-induced damage to DNA. Free Rad Biol Med 10: , Rice-Evans CA, Diplock AT, Symons MCR. Techniques in Free Radical Research. Elsevier, Amsterdam, Frenkei K, Zhong Z, Wei H, et al. Quantitative high-performance liquid chromatography analysis of DNA oxidized in vitro and in vivo. Analyt Biochem 196: , Halliwell B, Auroma A, eds. DNA and Free Radicals. Ellis Horwood, Chichester, Degray JA, Mason RP. Biological spin trapping. Specialist Periodical Reports: Electron Spin Resonance, No. 14, RSC, London, Wiseman H, Halliwell B. Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species : role in inflammatory disease and progression to cancer. Biochem J 313: 17-29,