ΣΥΝΘΕΣΕΙΣ ΑΝΑΛΟΓΩΝ ΤΗΣ ΜΙΝΟΞΙΔΙΛΗΣ, ΤΗΣ ΑΣΙΤΡΕΤΙΝΗΣ ΚΑΙ ΤΟΥ ΨΩΡΑΛΕΝΙΟΥ ΚΑΤΑΛΛΗΛΩΝ ΓΙΑ ΜΕΛΕΤΕΣ ΣΧΕΣΗΣ ΔΟΜΗΣ-ΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ ΔΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑΣ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑΤΑ ΧΗΜΕΙΑΣ & ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΣΤΑΥΡΟΣ Ε. ΜΠΑΡΙΑΜΗΣ Χηµικός ΣΥΝΘΕΣΕΙΣ ΑΝΑΛΟΓΩΝ ΤΗΣ ΜΙΝΟΞΙΔΙΛΗΣ, ΤΗΣ ΑΣΙΤΡΕΤΙΝΗΣ ΚΑΙ ΤΟΥ ΨΩΡΑΛΕΝΙΟΥ ΚΑΤΑΛΛΗΛΩΝ ΓΙΑ ΜΕΛΕΤΕΣ ΣΧΕΣΗΣ ΔΟΜΗΣ-ΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ ΔΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗ για την απόκτηση Διδακτορικού Διπλώµατος ΠΑΤΡΑ 2012

2 ΣΤΑΥΡΟΣ Ε. ΜΠΑΡΙΑΜΗΣ, 2012 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ, 2012 Η παρούσα διδακτορική διατριβή εκπονήθηκε στο ερευνητικό εργαστήριο Συνθετικής Οργανικής Χηµείας (soclab.chem.upatras.gr) του Τοµέα Οργανικής Χηµείας, Βιοχηµείας και Xηµείας Φυσικών Προϊόντων του Τµήµατος Χηµείας του Πανεπιστηµίου Πατρών στo πλαίσιo του Διατµηµατικού Προγράµµατος Μεταπτυχιακών Σπουδών «Ιατρική Χηµεία: Σχεδιασµός & Ανάπτυξη Φαρµακευτικών Προϊόντων». Ευχαριστούµε την Επιτροπή Ερευνών του Πανεπιστήµιο Πατρών (προγράµµα βασικής έρευνας «ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΣ ΚΑΡΑΘΕΟΔΩΡΗ») και το Κοινωφελές Ίδρυµα «ΛΕΩΝΙΔΑΣ ΖΕΡΒΑΣ» που χρηµατοδότησαν την παρούσα διατριβή.

3 UIVERSITY F PATRAS DEPARTMETS F CEMISTRY & PARMACY STAVRS E. BARIAMIS CEMIST SYTESES F AALGS F MIXIDIL, ACITRETI AD PSRALES SUITABLE FR STRUCTURE-ACTIVITY RELATISIP STUDIES PhD Thesis PATRAS 2012

4 STAVRS E. BARIAMIS, 2012 UIVERSITY F PATRAS, 2012 The research described in the present thesis was carried out in the Synthetic rganic Chemistry Laboratory (soclab.chem.upatras.gr), rganic Chemistry, Biochemistry and atural Products Chemistry Section of the Department of Chemistry (University of Patras, Greece) in the context of the postgraduade program Medicinal Chemistry: Drug Design and Development. We would like to thank the Research Committee of the University of Patras (basic research Program Constantin Carathéodory ) and the Beneficial Institution Leonidas Zervas for funding the present work

5 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ Τµήµα Χηµείας Τµήµα Φαρµακευτικής ΔΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ «ΙΑΤΡΙΚΗ ΧΗΜΕΙΑ: Σχεδιασµός & Ανάπτυξη Φαρµακευτικών Προϊόντων» ΣΤΑΥΡΟΣ Ε. ΜΠΑΡΙΑΜΗΣ Χηµικός Υποβλήθηκε στο Τµήµα Χηµείας Τοµέας Οργανικής Χηµείας, Βιοχηµείας & Χηµείας Φυσικών Προϊόντων Τριµελής Συµβουλευτική Επιτροπή: Διονύσιος Παπαϊωάννου, Επιβλέπων, Καθηγητής Τµήµατος Χηµείας, Παν. Πατρών Παύλος Κορδοπάτης, Καθηγητής Τµήµατος Φαρµακευτικής, Παν. Πατρών Κωνσταντίνος Αθανασόπουλος, Επίκ. Καθηγητής Τµήµατος Χηµείας, Παν. Πατρών Επταµελής Εξεταστική Επιτροπή: Διονύσιος Παπαϊωάννου, Επιβλέπων, Καθηγητής Τµήµατος Χηµείας Παν. Πατρών Παύλος Κορδοπάτης, Καθηγητής Τµήµατος Φαρµακευτικής Παν. Πατρών Κωνσταντίνος Αθανασόπουλος, Επίκ. Καθηγητής Τµήµατος Χηµείας Παν. Πατρών Δήµητρα Χατζηπαύλου-Λίτινα, Καθηγήτρια Τµήµατος Φαρµακευτικής ΑΠΘ Θεόδωρος Τσεγενίδης, Καθηγητής Τµήµατος Χηµείας Παν. Πατρών Γεράσιµος Τσιβγούλης, Επικ. Καθηγητής Τµήµατος Χηµείας Παν. Πατρών Θεόδωρος Τσέλιος, Επικ. Καθηγητής Τµήµατος Χηµείας Παν. Πατρών

6

7 UIVERSITY F PATRAS Department of Chemistry Department of Pharmacy ITERDEPARTMETAL PRGRAM F PSTGRADUATE STUDΙES «MEDICIAL CEMISTRY: Drug Design & Development» STAVRS E. BARIAMIS CEMIST It was submitted in the Department of Chemistry Section of rganic Chemistry, Biochemistry and atural Products Chemistry Advisory Committee: Dionissios Papaioannou, Supervisor, Professor (Chemistry Depart., Univ. Patras) Paul Cordopatis, Professor (Pharmacy Depart., Univ. Patras) Constantinos Athanassopoulos, Assist. Professor (Chemistry Depart., Univ. Patras) Evaluation Committee: Dionissios Papaioannou, Supervisor, Professor (Chemistry Depart., Univ. Patras) Paul Cordopatis, Professor (Pharmacy Depart., Univ. Patras) Constantinos Athanassopoulos, Assist. Professor (Chemistry Depart., Univ. Patras) Dimitra adjipavlou-litina, Professor, (Pharmacy Depart., AUTh) Theodore Tsegenidis, Professor (Chemistry Depart., Univ. Patras) Gerasimos Tsivgoulis, Assist. Professor (Chemistry Depart., Univ. Patras) Theodore Tselios, Assist. Professor (Chemistry Depart., Univ. Patras)

8

9 Στους γονείς µου, στα αδέρφια µου και σε όλους όσους µου συµπαραστάθηκαν και πίστεψαν σε εµένα

10

11 Τα αγαθά κόποις κτώνται Αριστοτέλης ( π.χ)

12

13 Eυχαριστίες I Ευχαριστίες Κατά τη διάρκεια εκπόνησης της παρούσας διατριβής, είχα την τύχη να έχω την καθοδήγηση και την στήριξη πολλών αξιόλογων ανθρώπων, που ο καθένας µε τον τρόπο του συνέβαλλε στην ολοκληρωσή της. Από την θέση αυτή αισθάνοµαι, ως ελάχιστη οφειλή, την ανάγκη να ευχαριστήσω θερµά: τον επιβλέποντα καθηγητή µου, Καθηγητή κ. Διονύσιο Παπαϊωάννου, τόσο για την υπόδειξη του συγκεκριµένου θέµατος και την διαρκή καθοδήγησή του µε τις πολύτιµες επιστηµονικές του συµβουλές στο µαγευτικό χώρο της Οργανικής Συνθετικής Χηµείας, όσο και για την συνεχή ηθική συµπαράσταση και εµπιστοσύνη που έδειξε στο πρόσωπό µου, καθ όλη την διάρκεια εκπόνησης και συγγραφής της παρούσας διατριβής. Αποτελεί για µένα ένα πρότυπο ακαδηµαϊκού δασκάλου και ανθρώπου. τον Καθηγητή κ. Παύλος Κορδοπάτη, µέλος της τριµελούς συµβουλευτικής επιτροπής, για το συνεχές ενδιαφέρον του σε όλη την διάρκεια εκπόνησης της διατριβής και την καλοπροαίρετη κριτική του. τον Επίκουρο Καθηγητή και εξαιρετικό φίλο, κ. Κωνσταντίνο Αθανασόπουλο, µέλος της τριµελούς συµβουλευτικής επιτροπής, για την συνεχή παρότρυνσή του και το ενδιαφέρον του, την ηθική στηριξή του, τις γνώσεις που µου µετέδωσε και την άψογη συνεργασία µας όλα αυτά τα χρόνια τόσο µέσα στο εργαστήριο, όσο και έξω από αυτό. την Καθηγήτρια κα. Δήµητρα Χατζηπαύλου-Λίτινα, µέλος της επταµελούς εξεταστικής επιτροπής για το συνεχές ενδιαφέρον της και τις εξαιρετικά χρήσιµες υποδείξεις της, οι οποίες συνέβαλαν αποφασιστικά στην ολοκλήρωση της παρούσας διατριβής, αλλά και για την διεξαγωγή πειραµάτων βιολογικής αποτίµησης του µεγαλύτερου µέρους της. τον Καθηγητή κ. Θεόδωρο Τσεγενίδη και τους Επίκουρους Καθηγητές κ. Γεράσιµο Τσιβγούλη και κ. Θεόδωρο Τσέλιο, µέλη της επταµελούς εξεταστικής επιτροπής, για τις πολύ εποικοδοµητικές συµβουλές τους και την καλοπροαίρετη κριτική τους έτσι ώστε το παρόν πόνηµα να παρουσιαστεί όσο το δυνατόν αρτιότερο.

14 Eυχαριστίες II τον Καθηγητή κ. Νικόλαο Καραµάνο και τον συνεργάτη του Δρ. Πέτρο Δέδε, για την ουσιαστική επίβλεψη και συµβολή τους σε πειράµατα βιολογικής αποτίµησης µέρους της παρούσας διατριβής, που διεξήχθησαν στο εργαστήριο Βιοχηµείας του Τµήµατος Χηµείας (Πανεπιστήµιο Πατρών). τον Καθηγητή κ. Γεώργιο Μαρούλη για την ουσιαστική συµβολή του σε πειράµατα ab initio θεωρητικών υπολογισµών µέρους της παρούσας διατριβής, που διεξήχθησαν στο εργαστήριο Θεωρητικής Χηµείας και Φυσικοχηµείας του Τµήµατος Χηµείας (Πανεπιστήµιο Πατρών). τον Καθηγητή κ. Giovanni Sindona και την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια κα. Anna apoli (Τµήµα Χηµείας, Πανεπιστήµιο Calabria - Ιταλία) τόσο για την πολύτιµη συµβολή τους στην καταγραφή φασµάτων RMS, όσο και για την ζεστή φιλοξενία τους στο πλαίσιο του θερινού διεθνούς σχολείου Εφαρµοσµένης Φασµατοσκοπίας Μαζών [Bernadino Telesio - Residential School on Applied Mass Spectrometry & Related Topics]. τον Καθηγητή κ. George W. Francis (Τµήµα Χηµείας, Πανεπιστήµιο Bergen - Νορβηγία) τόσο για την πολύτιµη συµβολή του στην καταγραφή φασµάτων RMS, όσο και για τη φιλοξενία του στο εργαστήριο του, την αµέριστη συµπαράσταση και καθοδηγησή του το διάστηµα που εργάστηκα µαζί του. τον Καθηγητή κ. Ιωάννη Ματσούκα, διευθυντή του ΜΠΣ «Ιατρική Χηµεία», για το ιδιαίτερο ενδιαφέρον και την ενθάρρυνσή του. Επιπλέον, θα ήθελα να ευχαριστήσω τους συναδέλφους Δρ. Μαρία Μηλιτσοπούλου και Δρ. Θωµά Γαρνέλη για την βοήθεια και συµπαράσταση τους στο εργαστήριο, ιδιαιτέρως κατά την έναρξη της ερευνητικής µου δραστηριότητας σε αυτό. Επιπροσθέτως ιδιαίτερες ευχαριστίες θα ήθελα να αποδόσω στον πολύ καλό µου φίλο, συνάδελφο και σηµαντικό συνεργάτη, Δρ. Γεώργιο Μαγουλά για την αµέριστη συµπαράσταση και το κουράγιο που µου έδινε κατά τη διάρκεια της επίπονης εργαστηριακής εργασίας, αλλά και για τις πολύ χρήσιµες συζητήσεις και σκέψεις που κάναµε έξω από αυτό. Ευχαριστώ πολύ τον συνάδελφο και φίλο, Δηµήτρη Βαχλιώτη για την σηµαντική και συνεχή

15 Eυχαριστίες III βοήθειά του στη λήψη φασµάτων MR και στοιχεικακών αναλύσεων (Εργαστήριο Ενόργανης Ανάλυσης, Παν. Πατρών). Θα ήταν παράληψη να µην ευχαριστήσω τους συναδέλφους και συνεργάτες όλα αυτά τα χρόνια στο εργαστήριο Δρ. Πέτρο Μοσχίδη, Βίκυ Κοκκινογούλη, Αντώνη Κατσιαρίδη, Μάριο Κροκίδη, Δηµήτρη Θεοδοσόπουλο, Μάγδα Ελισσαίου, Άντρι Άµπετ, Marilena Marin, Βασιλική Παράσογλου, Τόνια Αντωνίου, Νάγια Τσουκαλά, Αθηνά Σιδηροπούλου, Αγγελική Μουτσιοπούλου και Μαρίνα Μπαντζή για την εποικοδο- µητική συνεργασία µας και τη συµβολή τους στο πολύ καλό κλίµα που επικράτησε µέσα στο εργαστήριο, γεγονός ιδιαίτερα σηµαντικό για την αντιµετώπιση του άγχους και της κούρασης, που µας κατέβαλε αρκετές φορές. Επιπλέον θα ήθελα να ευχαριστήσω του συνάδελφους Κωνσταντή Κονιδάρη, Τάσο Καµπόλη, Δέσποινα Λαιµού, Λίνα Κέππα, Γιάννη Τραντάκη, Αντρέα Νταή, Κώστα Σιδέρη, Γιάννη Σαριγιάννη, Κώστα Κηλαηδόνη, Χάρη Αναστασόπουλο που ο καθένα συνέβαλε µε το ξεχωριστό του τρόπο στην ολοκλήρωση της παρούσας διατριβής. Θα ήθελα να ευχαριστήσω το τµήµα Χηµείας για την εκπαίδευση και την φιλοξενία όλα αυτά τα χρόνια και την Επιτροπή Ερευνών του Πανεπιστήµιο Πατρών, η οποία µέσω του προγράµµατος βασικής έρευνας «ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΣ ΚΑΡΑΘΕΟΔΩΡΗ» χρηµατοδότησε το µεγαλύτερο µέρος της παρούσας διατριβής. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω το Κοινωφελές Ίδρυµα «ΛΕΩΝΙΔΑΣ ΖΕΡΒΑΣ» και τον προεδρό του Καθηγητή Αθανάσιο Γιωτάκη για την τιµή που µου έκαναν να µε βραβεύσουν για την επιστηµονική µου πρόοδο και να χρηµατοδοτήσουν µέρος της παρούσας διατριβής. Τέλος, θέλω να εκφράσω τις πιο θερµές ευχαριστίες µου στους γονείς µου Ευάγγελο και Παναγιώτα και στα αδέρφια µου Γεώργιο και Χρήστο για τη στήριξη, κατανόηση, εµπιστοσύνη, αγάπη, ηθική και υλική συµπαράσταση που δείχνουν όλα αυτά τα χρόνια. Χωρίς αυτούς, τίποτα δεν θα ήταν δυνατό. Ελπίζω να δικαιώσω τις προσδοκίες τους στα χρόνια που θα έρθουν. Πάτρα, Σταύρος Ε. Μπαριάµης

16 Δημοσιεύσεις IV

17 Δημοσιεύσεις V Δηµοσιεύσεις Από την έρευνα που διεξήχθηκε στο πλαίσιο της παρούσας διατριβής, προέκυψαν οι παρακάτω δηµοσιεύσεις. 1. Syntheses, Antiproliferative Activity and Theoretical Characterization of Acitretin-Type Retinoids with Changes in the Lipophilic Part G. E. Magoulas; S. E. Bariamis; C. M. Athanassopoulos; A. askopoulos; P. Dedes; M. Krokidis;. K. Karamanos; D. Kletsas, D. Papaioannou; G. Maroulis. European Journal of Medicinal Chemistry, 2011, 46, Does conjugation of antioxidants improve their antioxidative/anti-inflammatory potential? D. adjipavlou-litina; G. E. Magoulas; S. E. Bariamis; K. Avgoustakis; D. Drainas; D. Papaioannou, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2010, 18, Synthetic Studies Towards the Development of ovel Minoxidil Analogs and Conjugates with Polyamines. G. E. Magoulas; S. E. Bariamis; C. M. Athanassopoulos; D. Papaioannou, Tetrahedron Letters, 2010, 51, (2E,4E,6E)-3-Methyl-7-(pyren-1-yl)octa-2,4,6-trienoic acid. S. E. Bariamis; G. E. Magoulas; C. M. Athanassopoulos; D. Papaioannou; M. J. Manos; V. astopoulos, Acta Cryst. E, 2009, E65, o Trioxsalen Derivatives with antioxidant/anti-inflammatory activity. D. adjipavlou-litina; S. E. Bariamis; M. Militsopoulou; C. M. Athanassopoulos; D. Papaioannou. Journal of Enzyme Inhibition & Medicinal Chemistry, 2009, 24, Synthetic Studies towards the Development of Psoralen Acidic Retinoid Conjugates and ybrids. M. Militsopoulou; S. E. Bariamis; C. M. Athanassopoulos; D. Papaioannou. Synthesis, 2008, 21,

18 Δημοσιεύσεις VI

19 Περιεχόμενα 1 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Συντµήσεις... 7 Περίληψη Αbstract A. Γενικό Μέρος A.1 Ρετινοειδή A.1.1. Γενικά A.1.2. Συνθετικά Ρετινοειδή A.1.3. Μεθοδολογίες Σύνθεσης Ρετινοειδών Α Γενικά Α Σχηματισμός δεσμού Csp 2 =Csp 2 μέσω αντιδράσεων συμπύκνωσης Α Αντιδράσεις συμπύκνωσης: Wittig και orner-wadsworth-emmons Α Ολεφινοποίηση Julia Α Ολεφινοποίηση Peterson Α Σχηματισμός δεσμού Csp 2 -Csp 2 και Csp 2 -Csp μέσω αντιδράσεων που καταλύονται από μέταλλα Α Γενικά Α Αντίδραση σύζευξης egishi Α Αντίδραση Stille Α Αντίδραση σύζευξης Suzuki Α Αντίδραση Sonogashira Α Αντίδραση eck Α Αλδολικές συμπυκνώσεις Α Απλή αλδολική συμπύκνωση Α Αλδολική αντίδραση τύπου-mukaiyama Α Αντίδραση Reformatsky Α.1.4. Φυσικές Ιδιότητες Ρετινοειδών Α.1.5. Βιολογία/Βιοχηµεία Ρετινοειδών Α Γενικά Α Φυσική Προέλευση και Μεταβολισμός Α Μηχανισμός Δράσης Ρετινοειδών Α Γενικά Α Κυτταροπλασματικές πρωτεΐνες δέσμευσης ρετινοειδών Α Γενικά χαρακτηριστικά Α Πρωτεΐνες CRBPs Α Πρωτεΐνες CRABP-I και CRABP-II Α Πυρηνικοί υποδοχείς ρετινοειδών Α Γενικά χαρακτηριστικά Α RAR εκλεκτικότητα: Ρετινοειδή και Αρωτινοειδή Α RXR εκλεκτικότητα: Ρεξινοειδή Α Αλληλεπίδραση CRABP-ΙΙ με RARs... 85

20 Περιεχόμενα 2 Α.2. Ψωραλένια A.2.1. Γενικά Α.2.2. Μεθοδολογίες Σύνθεσης Ψωραλενίων Α Γενικά Α Δημιουργία του φουρανικού δακτυλίου Α Δημιουργία του πυρονικού δακτυλίου Α Ταυτόχρονος σχηματισμός φουρανικού και πυρονικού δακτυλίου Α.2.3. Βιοσύνθεση Ψωραλενίων Α.2.4. Βιολογικές Δράσεις Ψωραλενίων Α Γενικά Α Μηχανισμός δράσης ψωραλενίων Α Ψωραλένια και ψωρίαση Α Αντιοξειδωτική και αντιφλεγμονώδης δράση ψωραλενίων Α Aντιμικρoβιακή δράση ψωραλενίων Α Aντικαρκινική δράση ψωραλενίων A.3. Μινοξιδίλη Α.3.1. Γενικά Α.3.2. Μεθοδολογίες σύνθεσης µινοξιδίλης Α Σύνθεση υποκατεστημένων πυριμιδινικών -οξειδίων, μέσω κυκλοποίησης ενός γραμμικού ενδιαμέσου Α Χρήση υποκατεστημένων πυριμιδινικών Ν-οξειδίων Α.3.3. Βιολογικές δράσεις µινοξιδίλης Α Γενικά Α Μινοξιδίλη και ανάπτυξη τριχοφυΐας Α Θειϊκή μινοξιδίλη και κανάλια Κ Α Κυτταρική αποκρίσης της μινοξιδίλης B. Σκοπός B.1. Ολική σύνθεση αναλόγων της Ασιτρετίνης µε µεταβολές στο λιπόφιλο τµήµα της B.2. Χηµική τροποποίηση ψωραλενίων για την σύνθεση νέων αναλόγων, υβριδίων και συζευγµάτων τους µε βιολoγικό ενδιαφέρον Β.3. Ολική σύνθεση πρωτότυπων αναλόγων και συζευγµάτων της Μινοξιδίλης µε πολυαµίνες και άλλα, βιολογικώς δραστικά, µόρια Γ. Συζήτηση Συµπεράσµατα Γ.1 Ολική σύνθεση αναλόγων της Ασιτρετίνης µε µεταβολές στο λιπόφιλο τµήµα της Γ.1.1. Γενικά Γ.1.2. Συνθετικό Μέρος Γ Σύνθεση των ενώσεων-κλειδιών Γ Σύνθεση των αναλόγων

21 Περιεχόμενα 3 Γ Σύνθεση του αναλόγου Γ Προσπάθεια σύνθεση των αναλόγων Γ Σύνθεση των αναλόγων Γ.1.3. Μελέτη της αντιπολλαπλασιαστικής δραστικότητας των ασιτρετινικών αναλόγων έναντι MCF-7 καρκινικών επιθηλιακών κυττάρων μαστού Γ.1.4. Θεωρητικοί υπολογισμοί ασιτρετινικών αναλόγων και QSAR μελέτη Γ.1.5. Συμπεράσματα Γ.2 Χηµική τροποποίηση ψωραλενίων για την σύνθεση νέων αναλόγων, υβριδίων και συζευγµάτων τους µε βιολογικό ενδιαφέρον Γ.2.1. Γενικά Γ.2.2. Χημική τροποποίηση του τριοξαλενίου και σύνθεση αναλόγων αυτού Γ Σύνθεση των συνθετικών ενδιαμέσων Γ Σύνθεση των πολυαμινικών συζευγμάτων Γ Σύνθεση των εστερικών συζευγμάτων 312 και Γ Σύνθεση των υβριδικών αναλόγων (315, 317 και 318) τριοξαλενίουρετινοειδών Γ Σύνθεση των αναλόγων 319, 322 και Γ Βιολογική αποτίμηση αναλόγων τριοξαλενίου ως αντιοξειδωτικών και αντιφλεγμονωδών παραγώντων και ως αναστολέων του ενζύμου λιποξυγονάση και της λιπιδικής υπεροξείδωσης Γ Συμπεράσματα Γ.2.3. Χημική τροποποίηση μεθοξυψωραλενίων και σύνθεση αναλόγων αυτών Γ Σύνθεση των συνθετικών ενδιαμέσων Γ Σύνθεση των αναλόγων και Γ Σύνθεση της ξανθοτοξόλης, της μπεργκαπτόλης και των βρομιωμένων αναλόγων τους 330 και Γ Βιολογική αποτίμηση αναλόγων ξανθοτοξενίου και μπεργκαπτενίου ως αντιοξειδωτικών και αντιφλεγμονωδών παραγόντων, και ως αναστολεών του ενζύμου λιποξυγονάση και της λιπιδικής υπεροξείδωσης Γ Συμπεράσματα Γ.3 Ολική σύνθεση πρωτότυπων αναλόγων και συζευγµάτων της Μινοξιδίλης µε πολυαµίνες και άλλα, βιολογικώς δραστικά, µόρια Γ.3.1. Γενικά Γ.3.2. Σύνθεση των αναλόγων Γ.3.3. Σύνθεση των συζευγμάτων Γ.3.4. Σύνθεση των συζευγμάτων της μινοξιδίλης με βιοδραστικά μόρια Γ.3.5. Συμπεράσματα Δ. Πειραµατικό Μέρος Δ.1. Γενικό Πειραµατικό Οργανολογία Δ.2. Ολική σύνθεση αναλόγων της Ασιτρετίνης µε µεταβολές στο λιπόφιλο τµήµα της Δ.2.1. Σύνθεση των ενώσεων κλειδιών Δ.2.2. Γενική Συνθετική Πορεία για την αντίδραση orner-emmons Δ Σύνθεση των α,β-ακόρεστων αιθυλεστέρων 376, 381 και Δ Σύνθεση της α,β-ακόρεστης μεθυλοκετόνης Δ.2.3. Γενική πορεία για την αναγωγή των καρβονυλικών ενώσεων 359, 362 και 369 με χρήση ΝaB 4. Σύνθεση των ενώσεων 361, 364 και

22 Περιεχόμενα 4 Δ.2.4. Γενική πορεία για την αναγωγή των καρβονυλικών ενώσεων 376, 381 και 387 με χρήση Al 3. Σύνθεση των ενώσεων 377, 382 και Δ.2.5. Γενική πορεία για την την παρασκευή των αλάτων φωσφωνίου Δ Σύνθεση των αλάτων φωσφωνίου 362 και Δ Σύνθεση των βρομιδίων αλκυλοφαινυλοσφωνίου 371, Δ.2.6. Γενική συνθετική πορεία για την αντίδραση Wittig Δ Σύνθεση των τετραενικών αιθυλεστέρων 363 και Δ Σύνθεση του τετραενικού αιθυλεστέρα Δ Σύνθεση των τριενικών αιθυλεστέρων Δ.2.7. Γενική πειραματική πορεία για την αντίδραση σαπωνοποίησης των εστέρων. Σύνθεση των τελικών οξέων 301, 302 και Δ.3. Χηµική τροποποίηση ψωραλενίων για την σύνθεση νέων αναλόγων, υβριδίων και συζευγµάτων τους µε βιολογικό ενδιαφέρον Δ.3.1. Χηµική τροποποίηση του τριοξαλενίου & σύνθεση αναλόγων αυτού Δ Σύνθεση των συνθετικών ενδιαµέσων Δ Σύνθεση του «ενεργού» α,β-ακόρεστου εστέρα Δ Σύνθεση των πολυαµινικών συζευγµάτων Δ Σύνθεση των εστερικών συζευγµάτων 312 και Δ Σύνθεση των υβριδικών αναλόγων 315, 317 και Δ Σύνθεση των αναλόγων 319, 322 και Δ Σύνθεση του E-3-(τριοξαλεν-4 -υλο)προπενοϊκού αιθυλεστέρα (319) Δ Σύνθεση των υδροξαµικών παραγώγων 322 και Δ.3.2. Χηµική τροποποίηση µεθοξυψωραλενίων και σύνθεση αναλόγων αυτών Δ Σύνθεση των βρωμιδίων 410 και Δ Σύνθεση των αναλόγων 325 και Δ Σύνθεση των εστέρων 324 και Δ Όξινη διάσπαση των εστέρων 324 & 334. Σύνθεση των οξέων 325 & Δ Σύνθεση των αναλόγων 332 και Δ Σύνθεση των ενδιαμέσων 416 και Δ Σύνθεση των εστέρων 331 και Δ Όξινη διάσπαση των εστέρων 331 & 337. Σύνθεση των οξέων 332 & Δ Σύνθεση των οξέων 333 και Δ Σύνθεση των εστέρων Δ Σύνθεση των αναλόγων 329, 330, 335 και Δ.4. Σύνθεση αναλόγων της µινοξιδίλης & συζευγµάτων της µε πολυαµίνες & άλλα βιοδραστικά µόρια Δ.4.1. Σύνθεση των προστατευμένων πολυαμινικών αναλόγων Δ.4.2. Σύνθεση αναλόγων της μινοξιδίλης με πολυαμίνες, που συνδέονται μέσω κοινών ατόμων αζώτου Δ Γενική πειραματική πορεία για την αντίδραση υποκατεστημένων χλωροπυριμιδινών με τις προστατευμένες πολυαμίνες Δ Σύνθεση των μονοϋποκατεστημένων παραγώγων 422 και Δ Σύνθεση των διϋποκατεστημένων παραγώγων 430 και Δ Γενική πειραματική πορεία για την παρασκευή των Ν-οξειδίων Δ Οξείδωση με το σύστημα φθαλικός ανυδρίτης Δ Οξείδωση με m-χλωροϋπερβενζοϊκό οξύ (m-cpba) Δ Γενική πειραματική πορεία για την την εισαγωγή του δακτυλίου της πιπεριδίνης στα Ν-οξείδια

23 Περιεχόμενα 5 Δ Γενική πειραματική πορεία για την απομάκρυνση της Boc-ομάδας Δ.4.3. Σύνθεση συζευγμάτων της μινοξιδίλης με πολυαμίνες Δ Σύνθεση του ενεργού ενδιαμέσου της μινοξιδίλη 437a Δ Γενική πειραματική πορεία για σύνθεση των πολυαμινι-κών συζευγμάτων της μινοξιδίλης Δ Γενική πειραματική πορεία για την απομάκρυνση της Boc-ομάδας και Τrtομάδας Δ.4.4. Σύνθεση συζευγμάτων της μινοξιδίλης με άλλα βιοδραστικά μόρια Ε. Παράρτηµα

24 Συντμήσεις 6

25 Συντμήσεις 7 Συντµήσεις Οι συντµήσεις που χρησιµοποιούνται στην παρούσα διατριβή έχουν προταθεί από την Επιτροπή Βιοχηµικής ονοµατολογίας της Διεθνούς Ένωσης Καθαρής και Εφαρµοσµένης Χηµείας (IUPAC) και της Διεθνούς Ένωσης Βιοχηµείας (IUB). Οι προτάσεις αυτές ανακοινώθηκαν το 1972 και συµπληρώθηκαν σταδιακά µέχρι το [1] Αci Ac AcEt β-ala AIB Asp ATRA BT BA Boc Βoc 2 CRBPs (Cellular Retinol Binding Proteins) CΑRBPs (Cellular Retinoic acid Acid Binding Proteins) DBU DCC DCU DCE DCM DEAD DIBAL DIEA DMAP DMF DMS DA ESI-MS all-trans-ρετινοϊκό οξύ της ρετινόλης Κυτταροπλασµατικές πρωτεΐνες πρόσδεσης του ρετινοϊκού οξεός Ασιτρετίνη Οξικό οξύ Οξικός αιθυλεστέρας β-αλανίνη Αζωδισισοβουτυρυλονιτρίλιο Ασπαραγινικό οξύ Τριτ-βουτυλιωµένο υδροξυ-τολουόλιο Τριτ-βουτυλυδροξυανισόλη Τριτ-βουτοξυκαρβονυλο- Τριτ-βουτοξυκαρβονυλικός ανυδρίτης Κυτταροπλασµατικές πρωτεΐνες πρόσδεσης 1,8,-διαζαδικυκλο[5.4.0]- ενδεκ-7-ένιο Ν,Ν - δικυκλοεξυλοκαρβοδιιµίδιο Ν,Ν -δικυκλοεξυλουρία Διχλωροαιθάνιο Διχλωροµεθάνιο Αζωδικαρβοξυλικός διαιθυλεστέρας Διϊσοβουτυλοαργίλιο υδρίδιο Διϊσοπροπυλαιθυλαµίνη 4-διµεθυλαµινοπυριδίνη Διµεθυλοφορµαµίδιο Διµεθυλοσουλφοξείδιο Δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ Φασµατοµετρία µάζας ιονισµού ψεκαζοµένου διαλύµατος µε ηλεκτρόνια [1] [IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical omenclature (JCB), onmeclature and Symbolism for Aminoacids and Peptides, Recommendations, Eur. J. Biochem., 1984, 138, 9 and J. Biol. Chem., 1989, 264, 663].

26 Συντμήσεις 8 Et 2 FCC FT-IR Gly h BTU ex Bt PLC LDA Leu Lys MCPBA MeC Me min ΜΜP n-buli BS CS ΝΟΕ Phe p-ts Διαιθυλαιθέρας Χρωµατογραφία στήλης ταχείας ανάπτυξης Fourier Transform Φασµατοσκοπία Υπερύθρου Γλυκίνη Ώρες Εξαφθοροφωσφονικό βενζοτριαζολ-1-υλοξυ- (τετραµεθυλο) ουρονικό άλας Κανονικό εξάνιο 1-υδροξυβενζοτριαζόλιο Υγρή Χρωµατογραφία Υψηλής Επιδόσεως Διϊσοπροπυλαµίδιο λιθίου Λευκίνη Λυσίνη µ-χλωροϋπεροξυ-βενζοϊκό οξύ Ακετονιτρίλιο Μεθανόλη Λεπτά Μεταλλοπρωτεάσες του εξωκυττάριου υλικού Κανονικό βουτυλολίθιο -βρωµοσουκινιµίδιο -χλωροσουκινιµίδιο uclear verhauser effect Φαινυλαλανίνη π-τολουενοσουλφονικό οξύ PCTr-Cl Πολυµερής ο- χλωροτριτυλοχλωρίδιορητίνη PyBrP RARs (Retinoid Acid Receptors) Εξαφθοροφωσφορικό βενζοτριαζολ-1-υλοξυτρις(πυρρολιδινο) φωσφόνιο άλας Πυρηνικοί Υποδοχείς Ρετινοϊκού οξέος RBPs (Retinol Binding Proteins) RΧRs (Retinoid X Receptors) RA rt Su TEA TFA Τfa TFE TF ΤIMP Πρωτεΐνες δέσµευσης της ρετινόλης Πυρηνικοί Υποδοχείς Ρετινοεϊδών Χ Ριβονουκλεϊκό οξύ Θερµοκρασία περιβάλλοντος -υδροξυ-σουκινιµίδιο τριαιθυλαµίνη Τριφθοροξικό οξύ Τριφθοροακετυλ-οµάδα Τριφθοροαιθανόλη τετραϋδροφουράνιο Ειδικοί ενδογενείς

27 Συντμήσεις 9 TIPSCl TLC Tol TPP (Ph 3 P) TPP Trt Tyr UV αναστολείς µεταλλοπρωτεασών Τριϊσοπροπυλοσιλυλοχλωρίδιο Χρωµατογραφία λεπτής στοιβάδας Τολουόλιο τριφαινυλοφωσφίνη τριφαινυλοφωσφινοξείδιο τριφαινυλοµεθυλοµάδα Τυροσίνη Ακτινοβολία υπεριώδους

28 Περίληψη-Abstract 10

29 Περίληψη-Abstract 11 Περίληψη Το αντικείµενο της παρούσας διατριβής είναι συνθέσεις αναλόγων της Ασιτρετίνης, των Ψωραλενίων και της Μινοξιδίλης κατάλληλων για Μελέτες Σχέσης Δοµής-Βιολογικής Δραστικότητας Στο πρώτο µέρος της διατριβής περιγράφονται συνθετικές µεθοδολογίες που αναπτύχθηκαν για την ολική σύνθεση αναλόγων της ασιτρετίνης (6), ενός συνθετικού αρωµατικού ρετινοειδούς 2 ης γενιάς, µε µεταβολές στο λιπόφιλο τµήµα της. Η επιλογή της ασιτρετίνης έγκειται στο γεγογός ότι τα φυσικά απαντώµενα ρετινοειδή, όπως και τα συνθετικά τους ανάλογα διαδραµατίζουν ένα σηµαντικό ρόλο σε πλήθος βιολογικών λειτουργιών (όραση, ανάπτυξη, αναπαραγωγή, κυτταρική διαφοροποίηση), χορηγούνται ως φάρµακα επιλογής σε δερµατολογικές παθήσεις, όπως η ψωρίαση, και πιο πρόσφατα στην χηµειο-προφύλαξη και την θεραπεία του καρκίνου. Στην περίπτωση της ασιτρετίνης έχει αναφερθεί ότι αναστέλλει τον πολλαπλασιασµό κυτ-ταρικών καρκινικών σειρών, όπως οι L-60, SCC4, SCC15, MCF-7 και A431. Αν και ρετινοειδή, ασκούν την δράση τους µέσω της αλληλεπίδρασης µε τους πυρηνικούς τους υποδοχείς, RARs και RXRs, ρυθµίζοντας την µεταγραφή συγκεκριµένων γονιδίων, η ασιτρετίνη εµφανίζει χαµηλή συγγένεια για τους πυρηνικούς υποδοχείς, ενώ έχει βρεθεί ότι διαµεσολαβεί στην απελευθέρωση του ATRA εκτοπίζοντας το τελευταίο από την µεταφορική πρωτεΐνη CRABP-ΙΙ και ευνοώντας έτσι την δηµιουργία του µεταγραφικού συµπλόκου RAR-ATRA. Στο πλαίσιο της παρούσας διατριβής συντέθηκαν τα ανάλογα της ασιτρετίνης 301, 302 και (Σχ. Ι), που περιλαµβάνουν µεταβολές µόνο το λιπόφιλο τµήµα της. Οι αλλαγές αυτές έχουν ως σκοπό τη µελέτη της επίδρασής τους στην βιολογική δράση µε τροποποίηση α) του όγκου (steric bulk) του δακτυλίου, β) της γωνίας στρέψης µεταξύ του λιπόφιλου και του παρεµβαλλόµενου τµήµατος, γ) της ηλεκτρο-νικής πυκνότητας και δ) της λιποφιλικότητας. Το λιπόφιλο τµήµα των συντιθέµενων αναλόγων περιέχει ηλεκτρονιοελκτικές οµάδες, όπως CF 3 ή F (ανάλογα 301 και 302), επιπλέον αρω-µατικούς δακτυλίους (ανάλογο 304) ή περιορίζει διαµορφωτικά το C 8 -C 9 διπλό δεσµό των ρετινοειδών, µέσω ενσωµάτωσής του σε έναν αρωµατικό δακτύλιο (ανάλογα ).

30 Περίληψη-Abstract 12 Οι συνθετικές µεθοδολογίες που αναπτύχθηκαν περιλαµβάνουν τη χρήση εµπορικά διαθέσιµων αρωµατικών αλδεϋδών ή µεθυλοκετονών, ως πρώτων υλών, και κατάλληλων στερεοχηµικά καθαρών συνθονίων. Τα συνθόνια αυτά είναι οι αλλυλικές E- αλδεΰδες , τα οποία ανοικοδοµούν, µέσω αντιδράσεων Wittig, την πολυενική αλυσίδα των ασιτρετινικών αναλόγων. Τα συνθόνια αυτά συντέθηκαν στερεοεκλεκτικά µε νέες υψηλής απόδοσης µεθοδολογίες, χρησιµοποιώντας την υδροξυακετόνη ως πρώτη ύλη Me 6 Et 352 Et Et X R 1 : F F 3 C CF 3 F F R 1 & 9 R 2 : Me R 2 Σχήµα Ι: Ρετινοειδή του τύπου της ασιτρετίνης (6), µε µεταβολές στο λιπόφιλο τµήµα (ανάλογα 301, 302, ), που συντέθηκαν στο πλαίσιο της παρούσας διατριβής. Scheme I: Acitretin (6)-type retinoinds with changes in the lipophilic part (analogs 301, 302, ), which were synthesized in the context of the present thesis.

31 Περίληψη-Abstract 13 Στη συνέχεια, τα νεοσυντέθεντα ανάλογα, µαζί µε άλλα που είχαν συντεθεί παλαιότερα στο εργαστήριό µας, αξιολογήθηκαν ως προς την αναστολή του πολλαπλασιασµού καρκινικών κυττάρων MCF-7 του µαστού. Επιπλέον υπολογίστηκαν αb initio, οι δίεδρες γωνίες, η διπολική ροπή και η λιποφιλικότητα των ασιτρετινικών αναλόγων. ι θεωρητικές παράµετροι οδήγησαν σε συµπεράσµατα που σχετίζουν την παρουσία µιας ή περισσοτέρων ΟΜe-οµάδων, την επίπεδη γεωµετρία, την υψηλή διπολική ροπή και την χαµηλή λιποφιλικότητα µε την ισχυρή αντιπολλαπλαστιαστική δράση και ακολούθως αναµένεται να οδηγήσουν στο σχεδιασµό νέων αναλόγων της ασιτρετίνης µε βελτιωµένες φαρµακολογικές ιδιότητες. Στο δεύτερο µέρος της διατριβής µελετήθηκαν αντιπροσωπευτικοί εκπρόσωποι της µεγάλης οικογένειας των ψωραλενίων, όπως είναι το συνθετικό ανάλογο τους, το τριοξαλένιο (256), και τα φυσικώς απαντώµενα ανάλογα, το µπερκαπτένιο (226) και το ξανθοτοξένιο (255). Τα ψωραλένια χαρακτηρίζονται ως φωτοµεταλλαξιογόνες ουσίες και χρησιµοποιούνται σε συνδυασµό µε την UVA ακτινοβολία (PUVA) ή/και µαζί µε άλλες δραστικές ουσίες, 256 π.χ. ρετινοειδή (RePUVA, πολυτροπική θεραπεία) για τη συστηµατική αντιµετώπιση δερµατικών υπερπολλαπλασιαστικών ασθενειών, όπως Me είναι η ψωρίαση. Κύριο στόχο αποτέλεσε η χηµική τροποποίηση των παραπάνω ψωραλενίων µε σκοπό την σύνθεση νέων αναλόγων, 226 υβριδίων και συζευγµάτων τους µε βιολογικό ενδιαφέρον. Για την σύνθεση νέων µοριακών οντοτήτων, οι οποίες θα µπορέσουν να αποτελέσουν εν δυνάµει στόχους για φαρµακολογικές εφαρµογές, τα ψωραλένια τροποποιήθηκαν µέσω αντιδράσεων ηλεκτρονιόφιλης Me 255 αρωµατικής υποκατάστασης, ώστε να φέρουν κατάλληλους υποκαταστάτες για την περαιτέρω παραγωγοποίησή τους. Τα ανάλογα αυτά διακρίνονται σε δυο κατηγορίες, στα ανάλογα του τριοξαλενίου και τα ανάλογα των µεθοξυψωραλενίων (ξανθοτοξένιο και µπεργκαπτένιο).

32 Περίληψη-Abstract 14 χηµική τροποποιήση του τριοξαλενίου, µέσω αντιδράσεων ηλεκτρονιόφιλης αρωµατικής υποκατάστασης, ακολοθούµενες από αντιδράσεις Wittig, eck, Μitsunobu ή σύζευξη Suzuki, µας επέτρεψαν την σύνθεση αναλόγων του τριοξαλενίου, τα οποία φέρουν υποκατάσταση στην 4 -θέση και αποτελούν σηµαντικές ενώσεις ( ) για την περαιτέρω παραγωγοποίησή του. Θεωρήσαµε αρκετά ενδιαφέρον να συνδυάσουµε το τριοξαλένιο, σε ένα µόνο µόριο, µε ρετινοειδή, όπως είναι η ασιτρετίνη και το ΑTRA. Αυτό επετεύχθηκε µέσω των ακόλουθων τριών µοριακών οντoτήτων: α) του συµµετρικού (309) και των ασύµµετρων πολυαµινικών συζεύγµατων (310 και 311), β) των εστερικών συζεύγµατων (312 και 313) και γ) των υβριδικών αναλόγων τριοξαλενίου-ασιτρετίνης (315, 317 και 318). Για τη σύνθεση των πολυαµινικών συζευγµάτων ( ), το τριοξαλένιο τροποποιήθηκε ώστε να φέρει έναν α,βακόρεστο συνδέτη, όπως είναι ο «ενεργός» εστέρας 308 (Σχ. ΙΙ). Για την χηµική τροποποίηση τόσο του ξανθοτοξενίου, όσο και του µπεργκαπτενίου, χρησιµοποιήθηκαν οι µεθοδολογίες που είχαµε εφαρµόσει στην περίπτωση του τριοξαλενίου. Σηµαντικά ενδιάµεσα αποτελούν τα βρωµίδια 410 και 411 του ξανθοτοξενίου και του µπεργκαπτενίου, στις 5 - και 8 -θέσεις αντίστοιχα, τα οποία συντέθηκαν για πρώτη φορά µε εκλεκτική βροµίωση, σε ένα µόνο στάδιο. Αποτελούν τις ενώσεις-κλειδιά για την σύνθεση των αναλόγων και 415, µέσω των αντιδράσεων Wittig, eck, Μitsunobu και σύζευξης Suzuki (Σχ. ΙΙΙ). Τα νεοσυντεθέντα ανάλογα του τριοξαλενίου και των µεθοξυψωραλενίων αξιολογήθηκαν ως προς την αντιοξειδωτική/ αντιφλεγ- µονώδη δράση τους και ως αναστολείς τις λιποξυγονάσης (LX). Από τα ανάλογα αυτά, οι ενώσεις 320 (IC 50 = 9.4 µm), 327 (IC 50 = 6 µm) και 331 (IC 50 = 7.5 µm) είχαν παρουσιάσει ισχυρότερη αναστολή στη LX και σηµαντική αντιφλεγµονώδης δράση.

33 Περίληψη-Abstract 15 G 312: G=C 2 313: G=CC 2 Me X R 3 4' ' 5' 314: X = tbu 315: X = X 319: R 3 = C=CC 2 Et 320: R 3 = C=CC 2 tbu 321: R 3 = C=CC 2 322: R 3 = C=CC()tBu 323: R 3 = C=CC() 395: R 3 = C 2 Cl 396: R 3 = C 2 397: R 3 = C= 398: R 3 = C 399: R 3 = Br 400: R 3 = C()C 3 401: R 3 = C()C 2 Br : X = tbu 317: X = Me Σχήµα ΙI: Ανάλογα και συζεύγµατα του τριοξαλενίου που συντέθηκαν στο πλαίσιο της παρούσας διατριβής. Scheme ΙI: Trioxsalen analogs and conjugates, which were synthesized in the context of the present thesis.

34 Περίληψη-Abstract 16 Br 5 Me 5 8 Me Br 411 X X Me 324: X = tbu 325: X = 326: X = Et 327: X = nbu X Z 329: X =, Z = 330: X =, Z = Br Me 331: X = tbu 332: X = Me : X = Me 334: X = tbu 415: X = X X Z 335: X =, Z = 336: X =, Z = Br Me 337: X = tbu 338: X = X Me 339 Σχήµα ΙΙI: Ανάλογα του ξανθοτοξενίου και του µπεργκαπτενίου, που συντέθηκαν στο πλαίσιο της παρούσας διατριβής. Scheme ΙIΙ: Xanthotoxen and Bergapten analogs, which were synthesized in the context of the present thesis.

35 Περίληψη-Abstract 17 Στο τρίτο µέρος της διατριβής ασχοληθήκαµε µε την µινοξιδίλη (270), η οποία θεωρείται αντιπερτασικός παράγοντας και µέσω του ενεργού µεταβολίτη της, τη σουλφονική µινοξιδίλη, ενεργοποιεί τους διαύλους Κ + -ΑΤΡ. Επιπλέον, η µινοξιδίλη αποτελεί το φάρµακο επιλογής για την τοπική αντιµετώπιση της ανδρογενούς αλωπεκίας, αφού η χρήση της συνοδεύεται από την ενίσχυση και ανάπτυξη του τριχωτού της κεφαλής. Θεωρήσαµε ενδιαφέρουσα τη δυνατότητα ενσωµάτωσης της µινοξιδίλης και των φυσικών πολυαµινών σε ένα µόνο µόριο. Η επιλογή της χρήσης των πολυαµινών βασίζεται στις ενδιαφέρουσες βιολογικές ιδιότητες που εµφανίζουν από µόνες τους ή συζευγµένες µε βιοδραστικά µόρια, καθώς και από την δυνατότητα που έχουν να χρησιµοποιούνται ως µέσα που βελτιώνουν τις βιολογικές ιδιότητες των συζευγµένων µορίων Επιπλέον, παρότι έχουν συντεθεί αρκετά ανάλογα της µινοξιδίλης µέχρι σήµερα δεν έχει αναφερθεί στην βιβλιογραφία σύνθεση αναλόγων µε πολυαµίνες. Η σύνθεση τέτοιου τύπου αναλόγων επετεύχθηκε µέσω δύο µοριακών οντοτήτων: α) των αναλόγων της µινοξιδίλης που ενσωµατώνουν τις πολυαµίνες στο δακτύλιο της 2,6-διαµινοπυριµιδίνης (ανάλογα ) και β) των µονο- ή διϋποκατεστηµένων πολυαµινικών συζεύγµατων της µινοξιδίλης (ανάλογα ). Στην παρούσα διατριβή επιλέξαµε τις πολυαµίνες πουτρεσκίνη (PUT), σπερµιδίνη (SPD) και σπερµίνη (SPM). Για την ολική σύνθεση των πολυαµινικών αναλόγων της µινοξιδίλης, τα οποία ενσωµατώνουν στο σκελετό τους µια ( ) ή δυο ( ) πολυαµίνες, χρησιµοποιήσαµε κατάλληλα υποκατεστηµένες χλωροπυριµιδίνες και ορθογωνικά προστευµένες πολυαµίνες. Στην περίπτωση των συζευγµάτων ( ) χρειάστηκε να «ενεργοποιήσουµε» την µινοξιδίλη προς ένα ενδιάµεσο (437a), το οποίο αντιδρά απευθείας µε τις ορθογωνικά προστευµένες πολυαµίνες. Επιπλέον, συνθέσαµε συζεύγµατα της µινοξιδίλης µε άλλα βιοδραστικά µόρια, όπως είναι τα ρετινοειδή (ένωση 350), τα οποια χρησιµοποι-ούνται συνδυαστικά µε την µινοξιδίλη στην θεραπεία της ανδρογενούς αλωπεκίας και µε αντιοξειδωτικούς παράγοντες, όπως η ντοπαµίνη (ένωση 351) (Σχ.IV)

36 Περίληψη-Abstract 18 2 PUT 2 2 SPD 2 2 SPM 2 Cl R 4 Cl R 4 = 2 or Cl R 5 2 n 340: R 5 =, n = 2 341: R 5 = (C 2 ) 4 (C 2 ) 3 2, n = 1 R 5 n 342: R 5 =, n = 2 343: R 5 = (C 2 ) 4 (C 2 ) 3 2, n = 1 n R 5 R 6 : a 2 R Me Σχήµα IV: Ανάλογα και συζεύγµατα της µινοξιδίλης, που συντέθηκαν στο πλαίσιο της παρούσας διατριβής. Scheme ΙV: Minoxidil analogs and conjugates, which were synthesized in the context of the present thesis.

37 Περίληψη-Abstract 19 Αbstract The present thesis describes syntheses of analogs of Acitretin, Psoralens and Minoxidil, suitable for Structure-Activity- Related studies. The first part refers to the developent of synthetic methodologies for the total syntheses of acitretin-type retinoids, with changes in the lipophilic part. We chose acitretin (6), a second generation synthetic aromatic retinoid, based on the fact that retinoids generally play a very important role in a variety of biological functions such as growth, vision, reproduction, cell differentiation, and they are administered as drugs of choice in dermatological disorders, such as psoriasis. Moreover, retinoids can serve as potential chemotherapeutic and anticancer agents. It has been shown that acitretin inhibits proliferation in a series of cell lines such as L-60, SCC4, SCC15, MCF-7 and A431. The mechanism by which acitretin acts seems not to be through binding with the retinoid receptors (it has low affinity for RARs) but through the displacement of ATRA from CRABPs (it has high affinity for CRABPs) and therefore by increasing the ATRA occupancy of the nuclear receptors (RARs). In the context of the present thesis efficient methodologies for the total syntheses of acitretin-type analogs (compounds 301, 302 and ), incorporating changes in the lipophilic part, were realized (Scheme I). These changes were designed in order to alter a) the steric bulk of the aromatic ring, b) the dihedral angle between the lipophilic part and the spacer, c) the electron density and d) the lipophilicity. The desired changes were imposed by the use of appropriate electron withdrawing (F, CF 3 ) groups (analogs 301 and 302), the presence of additional aromatic rings (analog 304) and/or the incorporation of the C 8 -C 9 double bond within a benzene ring as exemplified with acitretin analogs These designed analogs were readily obtained by using commercially available aromatic aldehydes and methyl ketones as starting materials, convergent synthetic methodologies and the Wittig reaction for the assembly of the polyene chain. Key-building blocks in the assembly of the triene/tetraene chain were the allylic aldehydes , all prepared

38 Περίληψη-Abstract 20 stereoselectively (E-configuration) through new methodologies, involving commercially available hydroxyacetone, as the starting material. The second part of the thesis refers to the chemical modification of selected psoralens, such as trioxsalen (256), bergapten (226) and xanthotoxen (255) in order to synthesize new analogs, hybrids and conjugates with biological interest. Psoralens are reffered as photomutant agents and are commonly used in combination with ultraviolet A light radiation for the systemic treatment by photochemotherapy (PUVA) of skin hyperproliferative diseases like psoriasis. Also, psoralens are combined with retinoids, like acitretin, in a multimodality therapeutic strategy, coined as RePUVA therapy. In order to prepare the new synthetic analogs, psoralens and particularly trioxsalen, bergapten and xanthotoxen (also known as 5 - and 8 -methoxypsoralen respectively) were converted through electro- philic aromatic substitution reactions to suitable keycompounds for their further derivatization. The initial chemical modification of trioxsalen was followed by either Wittig, eck or Mitsunobu reactions or Suzuki coupling, which allowed the ready access of 4 modified trioxsalen derivatives ( ) which were successfully used for the preparation of a variety of trioxsalen analogs and conjugates. We furthermore considered it of interest to examine the pos- sibility of incorporating psoralen and retinoid units, like acitretin, in a single molecule. We envisaged that this can be accomplished through the following three molecular entities: a) a polyamine conjugate, such as the symmetric conjugate 309 and the asymmetric conjugates 310 and 311, b) an ester conjugate (analogs 312 and 313), or c) a hybrid (analogs 315, 317 and 318). For the preparation of polyamine conjugates, trioxsalen was modified in order to incorporate an α,β-unsaturated succinimidyl active ester functionality (compound 308). For the chemical modification of xanthotoxen and bergapten, the synthetic protocols used for the trioxsalen were applied. Keycompounds were the bromides 410 and 411, which were obtained selectively in one step for the first time. The projected 5 - and 8 - analogs ( and 415) were obtained from the above mentioned

39 Περίληψη-Abstract 21 bromides by either Wittig, eck or Mitsunobu reactions or Suzuki coupling (Schemes II and III). The new psoralen analogs were evaluated for their antioxidative/antiinflammatory activity and as inhibitiors of lipoxygenase (LX). The results showed that the analogs 320 (IC 50 = 9.4 µm), 327 (IC 50 = 6 µm) and 331 (IC 50 = 7.5 µm) were the most potent inhibitors of LX having at the same time potent antiinflammatory activity. The final part of the thesis refers to minoxidil (270), an antihypertensive agent and a peripheral vasolidator. Moreover, minoxidil is the drug of choice in the clinical management of male pattern baldness, also known as androgenic alopecia. Its use is associated with hirsutism and hypertrichosis. We therefore considered interesting to examine the possibility of incorporating minoxidil and naturally occurring polyamine molecules in a single compound. aturally occurring polyamines, or their conjugates with other biomolecules, show interesting biological activities. Furthermore, conjugation of biologically interesting molecules with polyamines is a means of either improving the activity of the non-polyamine moiety or combining the activities of the conjugated molecules. Although several analogs of MX have been synthesized, none incorporating polyamines have been so far reported. We envisaged that such modification could be accomplished through the following two molecular entities: a) a polyamine-modified minoxidil (analogs ) and b) a minoxidil polyamine conjugate (analogs ). In the present study, we chose to use putrescine (PUT), spermidine (SPD), and spermine (SPM) as poyamines for the preparation of the above mentioned molecular entities(scheme IV). For the total synthesis of polyamine-modified minoxidil analogs we used suitable substituted chloropyrimidines and orthogonally protected polymines. In the case of the minoxidil polyamine conjugates (analogs ), we first converted minoxidil itself to an activated intermediate (compound 437a), which could react directly with orthogonally protected polymines. Moreover, we synthesized conjugates of minoxidil with other bioactive molecules such as acitretin (analog 350) and dopamine (analog 351).

40 Περίληψη-Abstract 22

41 A. Γενικός Μέρος 23 A. Γενικό Μέρος A.1 Ρετινοειδή... 25! A.1.1. Γενικά... 25! A.1.2. Συνθετικά Ρετινοειδή... 27! A.1.3. Μεθοδολογίες Σύνθεσης Ρετινοειδών... 34! Α Γενικά... 34! Α Σχηματισμός δεσμού Csp 2 =Csp 2 μέσω αντιδράσεων συμπύκνωσης... 36! Α Αντιδράσεις συμπύκνωσης: Wittig και orner-wadsworth-emmons... 36! Α Ολεφινοποίηση Julia... 39! Α Ολεφινοποίηση Peterson... 40! Α Σχηματισμός δεσμού Csp 2 -Csp 2 και Csp 2 -Csp μέσω αντιδράσεων που καταλύονται από μέταλλα... 41! Α Γενικά... 41! Α Αντίδραση σύζευξης egishi... 43! Α Αντίδραση Stille... 45! Α Αντίδραση σύζευξης Suzuki... 46! Α Αντίδραση Sonogashira... 48! Α Αντίδραση eck... 50! Α Αλδολικές συμπυκνώσεις... 52! Α Απλή αλδολική συμπύκνωση... 52! Α Αλδολική αντίδραση τύπου-mukaiyama... 53! Α Αντίδραση Reformatsky... 54! Α.1.4. Φυσικές Ιδιότητες Ρετινοειδών... 55! Α.1.5. Βιολογία/Βιοχηµεία Ρετινοειδών... 57! Α Γενικά... 57! Α Φυσική Προέλευση και Μεταβολισμός... 58!

42 A. Γενικός Μέρος 24 Α Μηχανισμός Δράσης Ρετινοειδών... 61! Α Γενικά... 61! Α Κυτταροπλασματικές πρωτεΐνες δέσμευσης ρετινοειδών... 62! Α Γενικά χαρακτηριστικά... 62! Α Πρωτεΐνες CRBPs... 63! Α Πρωτεΐνες CRABP-I και CRABP-II... 65! Α Πυρηνικοί υποδοχείς ρετινοειδών... 76! Α Γενικά χαρακτηριστικά... 76! Α RAR εκλεκτικότητα: Ρετινοειδή και Αρωτινοειδή... 80! Α RXR εκλεκτικότητα: Ρεξινοειδή... 83! Α Αλληλεπίδραση CRABP-ΙΙ με RARs... 85! Α.2. Ψωραλένια... 87! A.2.1. Γενικά... 87! Α.2.2. Μεθοδολογίες Σύνθεσης Ψωραλενίων... 88! Α Γενικά... 88! Α Δημιουργία του φουρανικού δακτυλίου... 89! Α Δημιουργία του πυρονικού δακτυλίου... 97! Α Ταυτόχρονος σχηματισμός φουρανικού και πυρονικού δακτυλίου ! Α.2.3. Βιοσύνθεση Ψωραλενίων ! Α.2.4. Βιολογικές Δράσεις Ψωραλενίων ! Α Γενικά ! Α Μηχανισμός δράσης ψωραλενίων ! Α Ψωραλένια και ψωρίαση ! Α Αντιοξειδωτική και αντιφλεγμονώδης δράση ψωραλενίων ! Α Aντιμικρoβιακή δράση ψωραλενίων ! Α Aντικαρκινική δράση ψωραλενίων ! A.3. Μινοξιδίλη ! Α.3.1. Γενικά ! Α.3.2. Μεθοδολογίες σύνθεσης µινοξιδίλης ! Α Σύνθεση υποκατεστημένων πυριμιδινικών -οξειδίων, μέσω κυκλοποίησης ενός γραμμικού ενδιαμέσου ! Α Χρήση υποκατεστημένων πυριμιδινικών Ν-οξειδίων ! Α.3.3. Βιολογικές δράσεις µινοξιδίλης ! Α Γενικά ! Α Μινοξιδίλη και ανάπτυξη τριχοφυΐας ! Α Θειϊκή μινοξιδίλη και κανάλια Κ ! Α Κυτταρική αποκρίσης της μινοξιδίλης !

43 A. Γενικός Μέρος 25 A.1 Ρετινοειδή A.1.1. Γενικά Το 1912 ο Funk [2] εισήγαγε τον όρο "βιταµίνη" (vitamine, vita: ζωή και amine: αµίνη) για να περιγράψει τη σηµασία της παρουσίας στην τροφή αζωτούχων βάσεων για την πρόληψη ασθενειών, όπως µπέρι-µπέρι, σκορβούτο και πελλάγρα. Αργότερα ο McCollum [3] αναγνώρισε τη σηµασία δυο ουσιών, της "λιποδιαλυτής Α" και της "υδατοδιαλυτής Β". Μάλιστα, διαφωνώντας µε τη χηµική υπόνοια της κατάληξης "-ine", ο Drummond [4] πρότεινε την αφαίρεση του τελικού "e", µετονοµάζοντας τις ουσίες σε vitamin A και vitamin B. Παράλληλα, πρότεινε τα υπόλοιπα µέλη της οικογένειας των βιταµινών να χαρακτηρίζονται ως vitamin C, D κ.λ.π. Το 1931 καθορίστηκε η δοµή της βιταµίνης Α από τον Karrer, [5] ο οποίος πρότεινε το όνοµα αξεροφθόλη (axerophthol), [6] βασισµένος στην δράση της έναντι της ξηροφθαλµίας. Το 1934 ο Wald [7] αποµόνωσε από ζωικό αµφιβληστροειδή χιτώνα µια ουσία που την αποκάλεσε "ρετινένιο" (retinene). Ο Morton [8] ισχυριζόµενος ότι αυτή η ένωση ήταν η αλδεΰδη της βιταµίνης Α, την ονόµασε ρετιναλδεΰδη (αντί για ρετινάλη, retinal). [9] Το 1976 χρησιµοποιήθηκε ο όρος «ρετινοειδή» [10] για να περιγράψει ολόκληρη την οικογένεια των µορίων, που περιλάµβανε την ρετινόλη (1), τη ρετινάλη (2), το ρετινοϊκό οξύ (3) και µια πληθώρα συνθετικών τους αναλόγων. Ο όρος "ρετινοειδή" προϊδέαζε τον εξέχοντα ρόλο που θα διαδραµάτιζαν οι ενώσεις αυτές στο µοντέρνο κόσµο της κυτταρικής βιολογίας και της ιατρικής έρευνας (όχι µόνο στη διατροφή και την όραση) και τόνιζε την πιθανή βιολογική και µηχανιστική σχέση ανάµεσα στους µεταβολίτες της ρετινόλης και στα στεροειδή. Το 1982 η Διεθνής Ένωση Βασικής και [2]. Funk, C., J.State Med. 1912, 20, 341. [3]. McCollum, E. V.; Kennedy, C. J. Biol. Chem. 1916, 24, 491 [4]. Drummond, J. C. Biochem. J. 1920, 14, 660. [5]. Karrer, P.; Morf, R.; Schoepp, K. elv. Chim. Acta, 1931, 14, [6]. Euler,.; Karrer, P.; Solmssen, U. elv. Chim. Acta, 1938, 21, 211. [7]. Wald, G., ature (Lond.), 1934, 134, 65. [8]. Morton, R.A., ature (Lond.), 1944, 153, 69. [9]. Morton, R.A. and Goodwin, T.W., ature (Lond.), 1944, 153, 405. [10]. Sporn, M.B., Dunlop,.M., ewton, D.L.; Smith, J.M., Fed. Proc. 1976, 35, 1332.

44 A. Γενικός Μέρος 26 Εφαρµοσµένης Χηµείας (IUPAC) και η Διεθνής Ένωση Βιοχηµείας (IUB) [11] όρισε ότι: «τα ρετινοειδή είναι µια τάξη ενώσεων που αποτελούνται από τέσσερις ισοπρενοειδείς µονάδες συνδεόµενες κεφαλή µε ουρά και προέρχονται από µια αρχική ένωση που περιέχει ένα µονοκυκλικό τµήµα, µια αλυσίδα πέντε διπλών δεσµών C-C και µια λειτουργική οµάδα στην άκρη της αλυσίδας». Τα ρετινοειδή λοιπόν αποτελούνται δοµικά από τρία ευδιάκριτα τµήµατα (Σχ. 2): Ένα λιπόφιλο τµήµα (κυκλοεξενικός δακτύλιος) Ένα υδρόφιλο τµήµα (πολική οµάδα στο άλλο άκρο του µορίου) Μια πολυακόρεστη αλυσίδα που παρεµβάλλεται µεταξύ των δύο προαναφερθέντων τµηµάτων (παρεµβαλλόµενο τµήµα). Σχήµα 2. Δοµικά τµήµατα του ATRA(3). Τη στιγµή που δηµοσιεύθηκε ο ανωτέρω ορισµός ήταν ήδη ξεπερασµένος, καθώς είχαν συντεθεί ανάλογα τρικυκλικά, χωρίς ισοπρενοειδή αλυσίδα, τα οποία ήταν πιο δραστικά από την ρετινόλη ή το ρετινοϊκό οξύ. Το 1985 ορίστηκε [12] ως ρετινοειδές κάθε ουσία η οποία µπορεί να προκαλέσει βιολογική απόκριση προσδεµένη και ενεργοποιώντας ένα συγκεκριµένο υποδοχέα ή υποδοχείς. Αυτός ο ορισµός επέτρεψε και σε άλλα µόρια (π.χ. πολυκυκλικά ή χωρίς ισοπρενοειδή αλυσίδα) να κατηγοριοποιηθούν ως ρετινοειδή, µε βάση τη βιολογική τους δράση. [11]. IUPAC IUB Joint Commission on Biochemical omenclature. Eur. J. Biochem., 1982, 129, 1. [12]. Sporn, M.B.; Roberts, A.B. What is a retinoid? Ciba Found. Symp. 1985, 113, 1.

45 A. Γενικός Μέρος 27 Καθώς το 13-cis-ρετινοϊκό οξύ, το οποίο είναι αναµφισβήτητα ρετινοειδές, δρα χωρίς την ενεργοποίηση κάποιου υποδοχέα, προτάθηκε τελικά ένας άλλος ορισµός, συνδυασµός των δυο παραπάνω, σύµφωνα µε τον οποίο ρετινοειδές είναι: «κάθε ουσία που µοιάζει ως προς τη δοµή µε τη ρετινόλη ή µπορεί να δράσει µέσω υποδοχέα». [13] Τα ρετινοειδή παίζουν ουσιαστικό ρόλο στην όραση, αύξηση, αναπαραγωγή καθώς επίσης και στη µιτωτική δραστηριότητα και διαφοροποίηση διαφόρων επιθηλιακών και µη κυτταρικών πληθυσµών. [14,15] Δυστυχώς όµως, τα ρετινοειδή είναι τοξικές ενώσεις όταν ληφθούν σε περίσσεια, είναι ερεθιστικά του δέρµατος και εξαιρετικά τερατογενή. Με στόχο τη βελτίωση του λόγου θεραπευτική δράση προς τοξικότητα ως προς το ρετινοϊκό οξύ έχει συντεθεί και αξιολογηθεί βιολογικά ένας εξαιρετικά µεγάλος αριθµός αναλόγων. Ένας άλλος στόχος είναι βέβαια η επίτευξη καλύτερης εκλεκτικότητας για διάφορες θεραπευτικές εφαρµογές, π.χ. στη δερµατολογία, την ογκολογία, τη ρευµατολογία και την ανοσολογία. [16] A.1.2. Συνθετικά Ρετινοειδή Η πρόοδος που έχει συντελεστεί τις τελευταίες δεκαετίες είναι τεράστια, ενώ στα επόµενα χρόνια αναµένονται σπουδαίες εξελίξεις στη χηµεία, βιολογία και κλινική εφαρµογή των ρετινοειδών. Η ανακάλυψη των πυρηνικών υποδοχέων των ρετινοειδών (retinoid nuclear receptor proteins) οδήγησε στην ανάγκη σύνθεσης ρετινοειδών που εκλεκτικά θα προσδένονται και θα ενεργοποιούν ένα συγκεκριµένο υποδοχέα, ελαχιστοποιώντας τις παράπλευρες αντιδράσεις. [13]. Barua, B.A.; Furr, C.F. Retinoid Protocols. Methods in Molecular Biology (Redfern, C.P.F. Ed.), 1998, vol. 69, 1. [14]. Tsambaos, D.; Zimmerman, B., In Psoriasis, Roenigk,.. and Mailbach,.I., Eds. Marcel Dekker Inc. ew York, 1991, 659. [15]. Ross, A.C. FASEB J., 1993, 7, 317 [16]. Για γενικές μονογραφίες βλέπε: (a) Sporn, M.B.; Roberts, A.B.; Goodman, D.S. The Retinoids: Biology, Chemistry and Medicine, 2nd Ed., Raven Press, ew York, 1994; (b) Dawson, M.I.; kimura, W..; Chemistry and Biology of Synthetic Retinoids, CRC Press, Boca Raton, 1990; (c) Parker, L., Methods in Enzymology, Academic Press, ew York, 1990, vol. 189, part A and 1991, vol. 190, part B.

46 A. Γενικός Μέρος 28 Έτσι, ρετινοειδή εκλεκτικά ως προς έναν υποδοχέα, [17,18] ανταγωνιστές ρετινοειδών [19,20] και πληθώρα άλλων αναλόγων έχουν προκαλέσει το συνθετικό και ερευνητικό ενδιαφέρον. Τα διάφορα συνθετικά ανάλογα διακρίνονται σύµφωνα µε το τµήµα του µορίου (Σχ. 2), το οποίο έχει υποστεί τη µεταβολή (λιπόφιλο, παρεµβαλόµενο ή/και υδρόφιλο τµήµα). ι αλλαγές που συνήθως εµφανίζονται στο λιπόφιλο τµήµα ενός ρετινοειδούς περιλαµβάνουν α) την τροποποίηση των υποκαταστατών του κυκλοεξενικού δακτυλίου του ρετινοικού οξέος, όπως για παράδειγµα το 4,5 εποξυρετινοϊκό οξύ (4), [21] β) την αρωµατοποιήση του κυκλοεξενικού δακτυλίου, όπως για παράδειγµα η ασιτρετίνη (6) και τα παράγωγά της 7-9, [22] γ) κυκλικές ή άκυκλες δοµές, όπως για παράδειγµα το νορβορνενικό ανάλογο 5 [23] και το άκυκλο ανάλογο 12, [24] και δ) αρωµατικά ή ετεροαρωµατικά ανάλογα όπως οι ρετιναλδεΰδες 10a-b [25] και τα ετεροαροτινοειδή 11 (Χ = Ο, Ν, S) [26] (Σχ. 3). [17]. Lehmann, J.M.; Dawson, M.I.; obbs, P.D.; usmann, M.; Pfahl, M. Cancer Res., 1991, 51, [18].Bernard, B.A.; Bernardon, J-M.; Delescluse, C.; Martin, B.; Lenoir, M-C.; Maignan, J.; Charpentier, B.; Pilgrim, W.R.; Reichert, U.; Shroot, B. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1992, 186, 977. [19]. Eyrolles, L.; Kawachi, E.; Matsushima, Y.; akajima,.; Kagechika,.; ashimoto, Y.; Shudo, K. Med. Chem. Res., 1992, 2, 361. [20]. Kaneko, S.; Kagechika,.; Kawatchi, E.; ashimoto, Y.; Shudo, K. Med. Chem. Res., 1991, 1, 220. [21]. John, K.V.; Lakshmanan, M.R.; Cama,.R. Biochem. J., 1967, 103, 539. [22]. Mayer,.; Bollag, W.; anni, R.; Ruegg, R. Experientia, 1978, 34, [23]. Dawson, M.I.; obbs, P.D.; Kuhlmann, K.; Fung, V.A.; elmes, C.T.; Chao, W.R. J. Med. Chem., 1980, 23, [24]. Muto, Y.; Moriwaki,.; mori, M. J. Cancer Res., 1981, 72, 974. [25]. a) Ivanova, D.; Kolev, V.; Lazarova T.; Padros, E. Tetrahedron Lett.., 1999, 40, 2645; b) Ivanova, D.; Gaudon, C.;. Rossin, A.; Bourguet, W.; Gronemeyer,. Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, [26]. Liu, S.; Brown, C.W.; Berlin, K.D.; Dhar, A.; Guruswamy, S.; Brown, D.; Gardner, G.J.; Birrer, M. J.; Benbrook, D.M. J. Med. Chem., 2004, 47, 999.