Σχολή Επιστημών Υγείας-Τμήμα Ιατρικής Μ.Π.Σ. Βασικών Ιατρικών Επιστημών. Διδακτορική Διατριβή

Transcript

1 Σχολή Επιστημών Υγείας-Τμήμα Ιατρικής Μ.Π.Σ. Βασικών Ιατρικών Επιστημών Διδακτορική Διατριβή Τα συστατικά στοιχεία του συστήματος λιπιδίων και λιποπρωτεϊνών ως κεντρικοί ρυθμιστές στην εμφάνιση της παχυσαρκίας και της μη αλκοολικής λιπώδους νόσου του ήπατος σε πειραματικά μοντέλα ποντικών Ελένη Α. Καραβία Χημικός, MSc. Πάτρα,

2 Επιβλέπων Καθηγητής Κυριάκος Η. Κυπραίος Αναπληρωτής Καθηγητής Φαρμακολογίας Τμήματος Ιατρικής, Σχολή Επιστημών Υγείας, Πανεπιστημίου Πατρών Τα μέλη της επταμελούς εξεταστικής επιτροπής: Κυριάκος Η. Κυπραίος, Αναπληρωτής Καθηγητής, Τομέας Φαρμακολογίας, Τμήματος Ιατρικής, Σχολή Επιστημών Υγείας,Πανεπιστημίου Πατρών Διονύσης Ι. Παπαχρήστου, Επίκουρος Καθηγητής, Τομέας Βασικών Ιατρικών Επιστημών ΙΙ, Τμήματος Ιατρικής, Σχολή Επιστημών Υγείας, Πανεπιστημίου Πατρών Peter Voshol, Associate Professor, Director of Disease Model Core, Metabolic Research Laboratories, University of Cambridge, United Kingdom Γεωργία Βουκελάτου, Επίκουρος Καθηγήτρια, Τομέας Βασικών Ιατρικών Επιστημών ΙΙ, Τμήμα Ιατρικής, Σχολή Επιστημών Υγείας, Πανεπιστημίου Πατρών Βασιλική Γκρέκα-Σπηλιώτη, Καθηγήτρια, Τομέας Παιδιατρικής, Μαιευτικής, Γυναικολογίας, Τμήμα Ιατρικής, Σχολή Επιστημών Υγείας, Πανεπιστημίου Πατρών Βενετσάνα Κυριαζοπούλου, Καθηγήτρια, Τομέας Παθολογίας Ι, Τμήμα Ιατρικής, Σχολή Επιστημών Υγείας, Πανεπιστημίου Πατρών Φωτεινή Παληογιάννη, Καθηγήτρια, Τομέας Κλινικών Εργαστηρίων, Τμήμα Ιατρικής, Σχολή Επιστημών Υγείας, Πανεπιστημίου Πατρών 2

3 Στην Οικογένεια μου 3

4 Πρόλογος Η παρούσα διδακτορική διατριβή εκπονήθηκε στο εργαστήριο Φαρμακολογίας του τμήματος Ιατρικής του Πανεπιστημίου Πατρών κατά την περίοδο στα πλαίσια του Μεταπτυχιακού Προγράμματος Σπουδών «Βασικές Ιατρικές Επιστήμες». Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από την Επιτροπή Ερευνών Πανεπιστημίου Πατρών μέσω του προγράμματος European Community's Seventh Framework Programme [FP7/ ] grant agreements PIRG02-GA και PIRG02-GA και του προγράμματος «Κ. Καραθεοδωρής» research grants C571 και D155. Επίσης, η εργασία αυτή αποτελεί μέρος των δραστηριοτήτων του Ερευνητικού Δικτύου MetSNet του Πανεπιστημίου Πατρών. Πρόκειται για μια μελέτη του ρόλου των λιπιδίων και των λιποπρωτεϊνών στην εμφάνιση μεταβολικών διαταραχών και συγκεκριμένα της παχυσαρκίας, του διαβήτη τύπου ΙΙ και της μη αλκοολικής λιπώδους νόσου. Αρχικά θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τον επιβλέποντα καθηγητή μου, κ. Κυριάκο Κυπραίο για την άριστη συνεργασία που είχαμε όλα αυτά τα χρόνια, για την συνεχή επιστημονική του επίβλεψη κατά τη διάρκεια της εκπόνησης και της συγγραφής αυτής της εργασίας. Επίσης, τον ευχαριστώ για τις πολύτιμες συμβουλές και υποδείξεις του, σχετικά με την πραγματοποίηση των πειραμάτων καθώς και για την ευγενική του στάση απέναντι μου. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον επίκουρο καθηγητή, κ. Διονύση Παπαχρήστου για την άψογη συνεργασία μας και τον πολύτιμο χρόνο που αφιέρωσε κατά την εκπόνηση των ιστολογικών αναλύσεων καθώς και για τις καίριες συμβουλές. Επίπλεον, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον κ. Peter Voshol για τις ιδέες που μας έδωσε σχετικά με την συγκεκριμένη εργασία κατά την διάρκεια του ταξιδιού του στην Ελλάδα. Θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά την καθηγήτρια, κ. Φωτεινή Παληογιάννη για την διάθεση του εργαστηρίου της αλλά και του απαραίτητου εξοπλισμού για την πραγματοποίηση της RT-PCR, καθώς επίσης και για την συμμετοχή της στην επταμελή μου επιτροπή. 4

5 Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω τις καθηγήτριες, Γεωργία Βουκελάτου, Βασιλική Γκρέκα-Σπηλιώτη και Βενετσάνα Κυριαζοπούλου για την τιμή που μου έκαναν να συμμετάσχουν ως μέλη στην επταμελή μου επιτροπή και για τις γόνιμες παρατηρήσεις τους. Επιπλέον, θα ήθελα να ευχαριστήσω όλα τα παιδιά από τα εργαστήρια της Ανατομίας, της Βιολογικής χημείας, της Μικροβιολογίας και της Φαρμακολογίας για την πολύτιμη βοήθεια τους. Ιδιαίτερα θα ήθελα να ευχαριστήσω την Εύα Τριανταφυλλίδου για την συμμετοχή της στο κομμάτι των ιστολογικών αναλύσεων και την Κασσιανή Λιοπέτα για την βοήθεια της στην διεκπεραίωση της RT-PCR και για τις συμβουλές στο συγγραφικό μέρος του πειράματος αυτού. Ευχαριστώ, όλα τα παιδιά του εργαστηρίου, την Άντζελα, την Εύα, την Έρη, τη Λίλια, τη Σταθιάννα και τον Διογένη για την βοήθεια τους, για το ευχάριστο κλίμα, την άψογη συνεργασία μας και τις ωραίες στιγμές που περάσαμε εντός και εκτός του εργαστηρίου. Ευχαριστώ πάρα πολύ την οικογένεια μου για την αγάπη τους καθώς και για την οικονομική, ηθική και ψυχολογική στήριξη που μου προσφέρουν απλόχερα καθ όλη την διάρκεια των σπουδών μου. Τους ευχαριστώ που είναι πάντα δίπλα μου. 5

6 Περίληψη Στην παρούσα εργασία, μελετήσαμε την συνεισφορά των μεταβολικών μονοπατιών της HDL και των χυλομικρών/vldl στην εμφάνιση της παχυσαρκίας, στις διαταραχές του μεταβολισμού της γλυκόζης, στην εναπόθεση των τριγλυκεριδίων στο ήπαρ και στην ανάπτυξη της διατροφικά επαγόμενης μη αλκοολικής λιπώδους νόσου του ήπατος (NAFLD). Έτσι, επιλέξαμε να εστιάσουμε στην μελέτη των απολιποπρωτεϊνών Α-Ι (apoa-i) και Ε (apoe) και του ενζύμου λεκιθινο-χοληστερολική ακυλοτρανσφεράση (LCAT). Η apoa-i αποτελεί το κύριο συστατικό των υψηλής πυκνότητας λιποπρωτεϊνών (HDL) και είναι υπεύθυνη για την σύνθεση τους, η LCAT εστεροποιεί την ελεύθερη χοληστερόλη των λιποπρωτεϊνών του πλάσματος και ευθύνεται για το σχηματισμό των ώριμων σωματιδίων HDL και η apoe συμμετέχει στον καταβολισμό των υπολειμμάτων των χυλομικρών, των πολύ χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεϊνών (VLDL) και των χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεϊνών (LDL) από την κυκλοφορία καθώς και στην de novo βιογένεση της HDL. Προκειμένου να μελετηθεί ο ρόλος αυτών των μορίων στις παραπάνω μεταβολικές διαταραχές, μελετήσαμε πειραματικά μοντέλα ποντικών με έλλειψη στα γονίδια αυτά. Συγκεκριμένα, ομάδες ποντικών με έλλειψη στο γονίδιο που κωδικοποιεί την apoa-i (apoa-i -/- ), την LCAT (LCAT -/- ), την apoe (apoe -/- ) αλλά και μια ομάδα ποντικών που εκφράζουν το πλήρες γονιδίωμα (C57BL/6) τέθηκαν σε δίαιτα πλούσια σε λιπαρά (δίαιτα δυτικού τύπου) για 24 εβδομάδες και πραγματοποιήθηκαν ιστολογικές, βιοχημικές και κινητικές αναλύσεις. Στα apoa-i -/- ποντίκια παρατηρήθηκε αύξηση του σωματικού βάρους, έντονη συσσώρευση τριγλυκεριδίων στο ήπαρ, διαταραγμένη ιστολογική εικόνα του ήπατος και ανάπτυξη διατροφικά επαγόμενης NAFLD όπως, επίσης, παρουσίασαν ανοχή στη γλυκόζη και αντίσταση στην ινσουλίνη. Επιπλέον, η ποσοτικοποίηση του mrna των γονιδίων FASN, DGAT-1 και PPAR-γ απέκλεισε την de novo σύνθεση των λιπαρών οξέων και των τριγλυκεριδίων σαν πιθανή αιτία της εμφάνισης της νόσου στα apoa-i -/- ποντίκια. Παρόμοια το μεταβολικό προφίλ δεν ανέδειξε σημαντικές διαφορές στην ενεργειακή δαπάνη μεταξύ των apoa-i -/- και των C57BL/6 ποντικών. Επίσης, παρατηρήθηκε ενισχυμένη εντερική απορρόφηση, ταχύτερη κάθαρση των μεταγευματικών τριγλυκεριδίων 6

7 από την κυκλοφορία και μειωμένη ταχύτητα ηπατικής έκκρισης των πολύ χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεϊνών (VLDL) σε σχέση με την ομάδα ελέγχου. Γονιδιακή μεταφορά της apoa-imilano μέσω αδενοϊού σε apoa-i -/- ποντίκια που έλαβαν δίαιτα δυτικού τύπου για 12 εβδομάδες, είχε ως αποτέλεσμα την μείωση της συγκέντρωσης των ηπατικών τριγλυκεριδίων και την βελτίωση της ιστολογικής εικόνας και αρχιτεκτονικής του ήπατος. Τα ποντίκια αυτά λόγω της έλλειψης της apoa-i δεν συνθέτουν HDL, επομένως η απουσία της HDL σε συνδυασμό με δίαιτα πλούσια σε λιπαρά οδηγεί στην εμφάνιση παχυσαρκίας, διαταραχών στο μεταβολισμό της γλυκόζης και NAFLD. Για να αξιολογήσουμε τη συνεισφορά της ποιότητας της HDL στην εμφάνιση των παραπάνω διαταραχών, μελετήσαμε LCAT -/- ποντίκια που διαθέτουν ανώριμη δισκοειδή HDL. Όπως και στα ποντίκια που δεν εκφράζουν την apoa-i, έτσι και σε αυτή την ομάδα παρατηρήθηκε σημαντική διατροφικά επαγόμενη εναπόθεση τριγλυκεριδίων στο ήπαρ και διαταραγμένη ιστολογική εικόνα και αρχιτεκτονική του ήπατος. Αντιθέτως στα ποντίκια αυτά παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση του σωματικού βάρους σε σχέση με την ομάδα ελέγχου. Επιπλέον, τα LCAT -/- ποντίκια δεν παρουσίασαν διαταραχές στο μεταβολισμό της γλυκόζης ενώ οι κινητικές αναλύσεις έδειξαν ότι η απουσία της LCAT σχετίζεται με αυξημένη εντερική απορρόφηση των διατροφικών λιπιδίων, ταχύτερη κάθαρση των μεταγευματικών τριγλυκεριδίων και μειωμένη ταχύτητα ηπατικής έκκρισης των VLDL σε σχέση με τα C57BL/6 ποντίκια. Γονιδιακή μεταφορά της LCAT μέσω αδενοϊού σε LCAT -/- ποντίκια που έλαβαν δίαιτα δυτικού τύπου για 12 εβδομάδες, είχε ως αποτέλεσμα την σημαντική μείωση της συγκέντρωσης των ηπατικών τριγλυκεριδίων και την βελτίωση της ιστολογικής εικόνας και αρχιτεκτονικής του ήπατος. Τα μέχρι τώρα δεδομένα μας λοιπόν υποδεικνύουν πως το μεταβολικό μονοπάτι της HDL είναι κεντρικός ρυθμιστής διαδικασιών σχετιζόμενων με την εναπόθεση διατροφικών τριγλυκεριδίων στο ήπαρ και την εμφάνιση NAFLD. Επιπλέον, τα αποτελέσματα μας υποστηρίζουν πως η συνύπαρξη μειωμένης και πιθανόν δυσλειτουργικής HDL μαζί με NAFLD σε ασθενείς με μεταβολικό σύνδρομο δεν είναι μια απλή σύμπτωση αλλά υποδηλώνει μία ισχυρή μηχανιστική συσχέτιση ανάμεσα στις δύο αυτές καταστάσεις. 7

8 Προκειμένου να μελετηθεί ο ρόλος του μεταβολικού μονοπατιού των χυλομικρών, μελετήσαμε ποντίκια με έλλειψη στην apoe τα οποία καταβολίζουν βραδέως τα διατροφικά λιπίδια. Τα apoe -/- ποντίκια αντιστάθηκαν στην παχυσαρκία και στην εμφάνιση της διατροφικά επαγόμενης NAFLD σε σχέση με τα C57BL/6 ποντίκια. Επίσης, δεν παρουσίασαν διαταραχές στο μεταβολισμό της γλυκόζης και οι κινητικές αναλύσεις έδειξαν ότι είχαν βραδύτερη κάθαρση των μεταγευματικών τριγλυκεριδίων από την κυκλοφορία του αίματος. Θέλοντας να ερευνήσουμε και το ρόλο του υποδοχέα της LDL, πραγματοποιήθηκε μια σειρά ανάλογων πειραμάτων σε LDLr -/- ποντίκια που έλαβαν δίαιτα δυτικού τύπου για 24 εβδομάδες. Τα LDLr -/- ποντίκια είχαν σημαντική συσσώρευση τριγλυκεριδίων στο ήπαρ και NAFLD προτείνοντας ότι η ηπατική συσσώρευση τριγλυκεριδίων μέσω της apoe είναι μια διαδικασία ανεξάρτητη από τον LDLr. Τα ευρήματα μας προτείνουν ένα νέο ρόλο κλειδί για την apoe ως ένας περιφερικός συντελεστής στην ομοιόσταση των ηπατικών λιπιδίων και στην ανάπτυξη της διατροφικά επαγόμενης NAFLD. Επιπλέον, δείχνουν ότι οι διαταραχές στο μεταβολικό μονοπάτι των χυλομικρών σχετίζονται άμεσα με την εμφάνιση της NAFLD. Συμπερασματικά, το μεταβολικό σύστημα λιπιδίων και λιποπρωτεϊνών φέρεται να κατέχει κεντρικό ρόλο στην εναπόθεση ηπατικών τριγλυκεριδίων και στην εμφάνιση της NAFLD. 8

9 Abstract In the present study, we investigated the contribution of HDL and the clylomicron/vldl pathways in the development of obesity, glucose metabolism and diet-induced non alcoholic fatty liver disease (NAFLD). Thus, we chose to study apolipoproteins A-I (apoa-i) and E (apoe), as well as the enzyme lecithin:cholesterol acyltransferase (LCAT). ApoA-I is the main protein of high density lipoprotein (HDL) and is responsible for it s synthesis, LCAT esterifies the free cholesterol of plasma lipoproteins and forms mature particles of HDL and apoe participates in the catabolism of chylomicrons, very low density lipoproteins (VLDL) and low density lipoproteins (LDL) and also participates in the de novo biogenesis of HDL. In an attempt to study the role of all these particles in the development of diet-induced NAFLD, apoa-i deficient, LCAT deficient, apoe deficient and control C57BL/6 mice were fed western-type diet (17.3% protein, 48.5% carbohydrate, 21.2% fat, 0.2% cholesterol, 4.5Kcal/g) for 24 weeks and their sensitivity towards NAFLD was assessed by histological and biochemical methods. ApoA-I deficient (apoa-i -/- ) mice showed increased body weight, increased diet-induced hepatic triglyceride deposition and disturbed hepatic histology while they exhibited reduced glucose tolerance and insulin sensitivity. Quantification of FASN, DGAT-1, and PPARγ mrna expression suggested that the increased hepatic triglyceride content of the apoa-i -/- mice was not due to de novo synthesis of triglycerides. Similarly, metabolic profiling did not reveal differences in the energy expenditure between the two mouse groups. However, apoa-i -/- mice exhibited enhanced intestinal absorption of dietary triglycerides, accelerated clearance of postprandial triglycerides, and a reduced rate of hepatic VLDL triglyceride secretion. In agreement with these findings, adenovirusmediated gene transfer of apoa-imilano in apoa-i -/- mice fed western-type diet for 12 weeks resulted in a significant reduction in hepatic triglyceride content and an improvement of hepatic histology and architecture. In order to evaluate the contribution of HDL quality in the development of the metabolic disturbances described above, we studied LCAT -/- mice which have immature discoidal HDL circulating in the plasma. Similarly to apoa-i -/- mice, in 9

10 the LCAT -/- group we observed increased diet-induced hepatic triglyceride deposition and impaired hepatic histology and architecture. In contrast hoewever, these mice gained significantly more body weight, compared to the control group though they did not develop disturbances in their plasma glucose metabolism. Mechanistic analyses indicated that LCAT deficiency was associated with enhanced intestinal absorption of dietary triglycerides, accelerated clearance of postprandial triglycerides, and a reduced rate of hepatic very low density lipoprotein triglyceride secretion. No statistical difference in the average daily food consumption between mouse strains was observed. Adenovirusmediated gene transfer of LCAT in LCAT -/- mice that were fed western-type diet for 12 weeks resulted in a significant reduction in hepatic triglyceride content and a great improvement of hepatic histology and architecture. Taken together, these data suggested that HDL metabolic pathway is a central modulator of processes associated with diet-induced hepatic lipid deposition and NAFLD development. Furthermore, our results sypport that the the coexistence of reduced and possibly dysfunctional HDL with NAFLD in patients with metabolic syndrome is not a mere coincidence, rather indicates a strong mechanistic link between these two conditions. In order to study the role of the chylomicron metabolic pathway, we employed apoe-deficient mice, which show a very slow catabolism of dietary lipids. Our data indicate that the apoe -/- mice are resistant to obesity and to dietinduced NAFLD compared to control C57BL/6 mice and they don t reveal disturbances in the glucose metabolism. In an attempt to identify the molecular basis for this phenomenon biochemical and kinetic analyses revealed that apoe -/- mice displayed a significantly delayed post-prandial triglyceride clearance from their plasma. In contrast to apoe -/- mice, LDLr -/- mice fed western-type diet for 24 weeks developed significant accumulation of hepatic triglycerides and NAFLD suggesting that the apoe-mediated hepatic triglyceride accumulation in mice is independent of the LDLr. Our findings suggest a new role of apoe as key peripheral contributor to hepatic lipid homeostasis and the development of dietinduced NAFLD. Furthermore, they show that the disturbances in the metabolic pathway of chylomicron are related, directly, with the development of NAFLD. 10

11 Overall, our findings reinforce our initial hypothesis that the transport of dietary lipids from the intestine to the liver plays a central role to the deposition of triglycerides in the liver and the development of NAFLD. 11

12 Περιεχόμενα Πρόλογος... 4 Περίληψη... 6 Abstract... 9 Ευρετήριο συντμήσεων Εισαγωγή Μεταβολικό σύνδρομο Ορισμοί και κριτήρια του μεταβολικού συνδρόμου Επιπολασμός του μεταβολικού συνδρόμου Παθογένεια του μεταβολικού συνδρόμου Αντιμετώπιση του μεταβολικού συνδρόμου Μη αλκοολική λιπώδης νόσος του ήπατος Επιπολασμός της μη αλκοολικής λιπώδους νόσου του ήπατος Παθογένεια της μη αλκοολικής λιπώδους νόσου του ήπατος Διάγνωση της μη αλκοολικής λιπώδους νόσου του ήπατος Θεραπεία της μη αλκοολικής λιπώδους νόσου του ήπατος Παχυσαρκία Ανθρωπομετρία για την διάγνωση της παχυσαρκίας Τα αίτια της παχυσαρκίας Θεραπεία της παχυσαρκίας Σύστημα λιπιδίων-λιποπρωτεΐνες Χυλομικρά Πολύ χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (VLDL) Ενδιάμεσης πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (IDL) Χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (LDL) Υψηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (HDL) Λιποπρωτεΐνη Lp(a) Σύστημα λιπιδίων- Μεταβολικά μονοπάτια λιποπρωτεϊνών Το Μεταβολικό μονοπάτι των χυλομικρών Tο μεταβολικό μονοπάτι των VLDL-IDL-LDL Το μεταβολικό μονοπάτι των HDL Σύστημα λιπιδίων-απολιποπρωτεΐνες Απολιποπρωτεΐνη Α-Ι (apoa-ι) Ο ρόλος της apoa-i Οι μεταλλάξεις της apoa-i Η απολιποπρωτεΐνη Ε (apoe) O ρόλος της apoe Οι μεταλλάξεις της apoe Σύστημα λιπιδίων-ένζυμα Λεκιθινο-χοληστερολική ακυλοτρανσφεράση (LCAT) Ρόλος της LCAT Οι μεταλλάξεις της LCAT Λιποπρωτεϊνική λιπάση (LpL) Ρόλος της LpL Οι μεταλλάξεις της LpL Σύστημα λιπιδίων-υποδοχείς Υποδοχέας των χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεϊνών (LDLr) LDL receptor-related protein-1 (LRP-1) Σκοπός

13 Υλικά και Μέθοδοι Πειραματόζωα- Χειρισμοί και πειραματικές διαδικασίες Λήψη αίματος από την ουρά ποντικών Μέτρηση σωματικού βάρους των ποντικών Μέτρησης ημερήσιας κατανάλωσης τροφής των ποντικών Χορήγηση ελαιολάδου δια του στόματος και μέτρηση της μεταγευματικής κινητικής των τριγλυκεριδίων (Oral Gavage) Μέτρηση της ταχύτητας ηπατικής έκκρισης VLDL τριγλυκεριδίων Μέτρηση της ταχύτητας ολικής (εντερικής και ηπατικής) παροχής τριγλυκεριδίων στο αίμα και υπολογισμός της εντερικής έκκρισης τριγλυκεριδίων Δοκιμασία Ανοχής Γλυκόζης Δοκιμασία Αντίστασης στην Ινσουλίνη Έμμεσες θερμιδομετρικές μελέτες Επιμόλυνση ποντικών με αδενοϊούς Θυσίες και λήψη ιστών από τα ποντίκια Βιοχημικές αναλύσεις στο πλάσμα του αίματος και σε ιστούς των ποντικών Προσδιορισμός επιπέδων τριγλυκεριδίων στο πλάσμα των ποντικών Προσδιορισμός επιπέδων ολικής χοληστερόλης στο πλάσμα των ποντικών Προσδιορισμός των επιπέδων των ελεύθερων λιπαρών οξέων στο πλάσμα των ποντικών Κλασματοποίηση λιποπρωτεϊνών του πλάσματος με υπερφυγοκέντρηση διαβαθμισμένης πυκνότητας Διαπίδυση στα κλάσματα του πλάσματος Προσδιορισμός επιπέδων τριγλυκεριδίων και ολικής χοληστερόλης στα κλάσματα Προσδιορισμός επιπέδων ηπατικών τριγλυκεριδίων και ολικής χοληστερόλης Αναλύσεις σύστασης σώματος των ποντικών Ανάλυση απολιποπρωτεϊνών με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE Electrophoresis) Ανοσοαποτύπωση κατά Western (Western blotting) Απομόνωση RNA από τον ηπατικό ιστό των ποντικών Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (Real Time PCR) Ιστολογικές αναλύσεις του ηπατικού και λιπώδους ιστού των ποντικών Χρώση του ηπατικού ιστού με Αιματοξυλίνη/Ηωσίνη (H&E) Χρώση του ηπατικού ιστού με ρετικουλίνη Χρώση του ηπατικού ιστού με Oil Red O Ανοσοϊστοχημεία Κυτταροκαλλιέργειες Απόψυξη κυττάρων Τρυψινοποίηση και ανακαλλιέργεια κυττάρων Ψύξη κυττάρων Ανάπτυξη ανασυνδυασμένων αδενοϊών Καλλιέργεια τριπλών φλασκών Επιμόλυνση τριπλών φλασκών με τους αδενοϊούς Συλλογή των μολυσμένων με τους ιούς κυττάρων ΗΕΚ Καθαρισμός των αδενοϊών

14 7. Τιτλοδότηση αδενοϊών Τιτλοδότηση αδενοϊών με καταμέτρηση πλακών Τιτλοδότηση αδενοϊών με φασματοφωτομέτρηση Στατιστικές αναλύσεις Αποτελέσματα Η απολιποπρωτεΐνη Α-Ι ρυθμίζει διαδικασίες που σχετίζονται με την διατροφικά επαγόμενη μη αλκοολική λιπώδη νόσο του ήπατος σε ποντίκια Ιστολογικές και βιοχημικές αναλύσεις του ήπατος ποντικών Μετρήσεις σωματικού βάρους, σωματικού λίπους και λιπιδίων του πλάσματος των ποντικών Έκφραση λιπογενετικών γονιδίων και έμμεση θερμιδομετρική ανάλυση Δοκιμασία ανοχής στη γλυκόζη και ευαισθησίας στην ινσουλίνη Μέτρηση ταχύτητας έκκρισης ηπατικών τριγλυκεριδίων στα apoa-i -/- και στα C57BL/6 ποντίκια Μέτρηση ταχύτητας εντερικής έκκρισης στα apoa-i -/- και στα C57BL/6 ποντίκια Κινητική κάθαρση μεταγευματικών τριγλυκεριδίων στα apoa-i -/- και C57BL/6 ποντίκια Χορήγηση αδενοϊού που εκφράζει την apoa-i σε αρσενικά ποντίκια apoa-i - /- που τράφηκαν με δίαιτα δυτικού τύπου για δώδεκα εβδομάδες Συζήτηση αποτελεσμάτων Η λεκιθινο-χοληστερολική ακυλοτρανσφεράση ρυθμίζει την διατροφικά επαγόμενη ηπατική εναπόθεση των τριγλυκεριδίων σε ποντίκια Ιστολογικές και βιοχημικές αναλύσεις του ήπατος ποντικών Μετρήσεις σωματικού βάρους και λιπιδίων του πλάσματος των ποντικών- Έμμεση θερμιδομετρική ανάλυση Δοκιμασίες ανοχής στη γλυκόζη και ευαισθησίας στην ινσουλίνη Ταχύτητα Έκκρισης Ηπατικών Τριγλυκεριδίων στα LCAT-/- και στα C57BL/6 ποντίκια Ταχύτητα Εντερικής Έκκρισης τριγλυκεριδίων σε LCAT -/- και C57BL/6 ποντίκια Κινητική κάθαρση μεταγευματικών τριγλυκεριδίων σε αρσενικά LCAT -/- και C57BL/6 ποντίκια Χορήγηση αδενοϊού που εκφράζει την LCAT σε αρσενικά ποντίκια LCAT -/- που τράφηκαν με δίαιτα δυτικού τύπου για δώδεκα εβδομάδες Συζήτηση αποτελεσμάτων Η απουσία της απολιποπρωτεΐνης Ε έχει ένα προστατευτικό ρόλο στην διατροφικά επαγόμενη μη αλκοολική λιπώδη νόσο του ήπατος στα ποντίκια Ιστολογικές και βιοχημικές αναλύσεις του ήπατος ποντικών Μετρήσεις σωματικού βάρους και ανάλυση σύστασης σώματος ποντικών σε δίαιτα δυτικού τύπου για 24 εβδομάδες Μετρήσεις λιπιδίων του πλάσματος και ημερήσιας κατανάλωσης τροφής Δοκιμασία ανοχής στη γλυκόζη και ευαισθησίας στην ινσουλίνη Ταχύτητα ηπατικής και εντερικής απορρόφησης των τριγλυκεριδίων στα ποντίκια Κινητική κάθαρσης μεταγευματικών τριγλυκεριδίων από την κυκλοφορία των ποντικών Ιστολογικές και βιοχημικές αναλύσεις στο ήπαρ ποντικών με έλλειψη στον υποδοχέα της LDL (LDLr -/- ) Συζήτηση αποτελεσμάτων

15 Συμπεράσματα Βιβλιογραφία

16 Ευρετήριο συντμήσεων ABCA1 ATP-binding cassette transporter A1 ABCA1 -/- Ανεπάρκεια στον ABCA1 ACAT AκυλοCoA:χοληστερολακυλοτρανσφεράση ACS Acyl-CoA συνθετάση Ad Αδενοϊός (Adenovirus) AdapoA-IMilano Αδενοϊός που εκφράζει την apoa-imilano AdLCAT Αδενοϊός που εκφράζει την LCAT AHA American Heart Association ALT Alanine transaminase Apo Απολιποπρωτεΐνη (Apolipoprotein) ΑpoA-I Απολιποπρωτεΐνη A-I ΑpoA-I -/- Ανεπάρκεια στην απολιποπρωτεΐνη A-I ApoB-48 Απολιποπρωτεΐνη B-48 ApoB-100 Απολιποπρωτεΐνη B-100 ApoC Απολιποπρωτεΐνη C ApoE Απολιποπρωτεΐνη Ε ApoE -/- Ανεπάρκεια στην απολιποπρωτεΐνη Ε APS Υπερθειϊκό Αμμώνιο (Ammonium Persulfate) Arg Αργινίνη (Arginine) AST Aspartate transaminase ATP Τριφωσφορική Αδενοσίνη (Adenosine Triphosphate) ΒΜΙ Body Mass Index BSA Αλβουμίνη Ορού Βοδιού (Bovine Serum Albumin) CE Εστέρες χοληστερόλης (Cholesteryl Esters) CE Εστεράση της χοληστερόλης CETP Πρωτεΐνη Μεταφοράς Εστέρων Χοληστερόλης (Cholesteryl Ester Transfer Protein) CO Οξειδάση της χοληστερόλης CoA Συνένζυμο A Cys Κυστεΐνη (Cystein) DAP Φωσφορική διυδρόξυακετόνη ddh2o Δισαπεσταγμένο Νερό (double distilled water) DGAT Diglyceride acyltransferase EDTA Αιθυλενο-διαμινο-τετρα-οξικό οξύ (Ethylene-diamino-tetraacetic acid) EGIR Ευρωπαϊκή Ομάδα για την Μελέτη της Αντίστασης στην Ινσουλίνη EL Ενδοθηλιακή Λιπάση (Endothelial Lipase) 16

17 ELISA ESPA FASN FBS FED FLD GFP GK GPIHBP1 GPO GTT G-1-P HDL HIHS HL ΗΝΕ H&E Ανοσοπροσροφητική Ανάλυση Στερεάς Φάσης Με Σύνδεση Ενζύ μου (Enzyme Linked Immunoabsorbent Assay ) Νατριικη Ν-αιθυλο-Ν-(3-θειοπροπυλο)-m-ανισιδίνη Συνθάση των λιπαρών οξέων Βόειος Εμβρυικός Ορός (Fetal Bovine Serum) Fish-eye disease Familial LCAT deficiency Πράσινη Φθορίζουσα Πρωτεΐνη (Green Fluorescent Protein) Κινάση της γλυκερόλης Glycosylphosphatidylinositol-anchored high density lipoprotein binding protein 1 Οξειδάση της φωσφορικής γλυκερόλης Δοκιμασία ανοχής στη γλυκόζη 1-φωσφορική γλυκερόλη Λιποπρωτεΐνη Υψηλής Πυκνότητας (High Density Lipoprotein) Θερμικά Απενεργοποιημένος Ορός Αλόγου (Heat Inactivated Horse Serum) Ηπατική Λιπάση (Hepatic Lipase) 4-υδροξυνονάλη Χρώση αιματοξυλίνης-ηωσίνης IDF International Diabetes Federation IDL Λιποπρωτεΐνη Ενδιάμεσης Πυκνότητας (Intermediate Density Lipoprotein) IL-6 Iντερλευκίνη 6 IRS IST kda LCAT LCAT -/- LDL LDLr LDLr -/- LpL LRP-1 MDA MEHA MTP NAFLD NASH Σύνδρομο αντίστασης στην ινσουλίνη Δοκιμασία ευαισθησίας στην ινσουλίνη kilodalton, μονάδα μέτρησης μεγέθους πρωτεϊνών Λεκιθινο-Χοληστερολική Ακυλοτρανσφεράση (Lecithin- Cholesterol Acyltransferase) Ανεπάρκεια στην LCAT Λιποπρωτεΐνη Χαμηλής Πυκνότητας (Low Density Lipoprotein) Υποδοχέας της Xαμηλής Πυκνότητας Λιποπρωτεΐνης (LDL Receptor) Ανεπάρκεια στον LDLr Λιποπρωτεϊνική Λιπάση (Lipoprotein Lipase) LDL receptor-related protein Mαλονυλοδιαλδεΰδη 3-Methyl-N-Ethyl-N-(E-Hydroxyethyl)-Aniline Πρωτεΐνη Μικροσωμιακής Μεταφοράς (Microsomal Transfer Protein) Non-alcoholic fatty liver disease Non-alcoholic steatohepatitis 17

18 NCEP, ATP III NEFA NHLBI PBS PL POD PON PPARs PPi SDS SR-BI SRE rpm RT-PCR TEMED TGF-β ΤΜΒ Εθνικό Πρόγραμμα Αντιμετώπισης και Εκπαίδευσης Δυσλιπιδαιμιών Ενηλίκων των Η.Π.Α. (NCEP, Adult Treatment Panel III) Μη εστεροποιημένα λιπαρά οξέα National Heart, Lung, and Blood Institute Φωσφορικό Ρυθμιστικό Διάλυμα Άλατος (Phosphate Buffer Saline) Φωσφολιπίδια (Phospholipids) Υπεροξειδάση Παραοξονάση (Paraoxonase) Peroxisome-Proliferator-Activated receptors Πυροφωσφορικό οξύ Δωδέκυλοθειϊκό Νάτριο (Sodium Dodecyl Sulfate) Υποδοχέας Εκκαθαριστής Τάξης Β, Τύπου 1 (Scavenger Receptor, Class B, Type 1) Sterol regulatory element Στροφές ανά λεπτό (rounds per minute) Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου Τετρα-μεθυλο-αιθυλενο-διαμίνη (N,N,N,N Τetra-methyl-ethylene-diamine) Transforming Growth Factor β Τετρα-μεθυλο-βενζιδίνη (3,3,5,5 -Tetra-methyl-benzidine) TNFa Παράγοντας Νέκρωσης Όγκων-α (Tumor Necrosis Factor a) TRLs Λιποπρωτεΐνες Πλούσιες σε Τριγλυκερίδια (Triglyceride-rich lipoproteins) VLDL Λιποπρωτεΐνη Πολύ Χαμηλής Πυκνότητας (Very Low Density Lipoprotein) VLDLr Υποδοχέας Λιποπρωτεϊνών Πολύ Χαμηλής Πυκνότητας (Very Low Density Lipoprotein receptor) wt Αγρίου τύπου (wild type) γ-gt ΔΑΠ ΔΜΣ ΚΝΣ ΠΟΥ ΣΑΠ 4-AAP γ-γλουταμινική τρανσπεπτιδάση Διαστολική Αρτηριακή Πίεση Δείκτης μάζας σώματος Κεντρικό νευρικό σύστημα Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας Συστολική Αρτηριακή Πίεση 4-αμινοαντιπυρίνη 18

19 Εισαγωγή 19

20 1. Μεταβολικό σύνδρομο Το μεταβολικό σύνδρομο αποτελείται από ένα σύνολο μεταβολικών διαταραχών που εμφανίζονται ταυτόχρονα στον ίδιο ασθενή. Συγκεκριμένα, η δυσλιπιδαιμία, η αυξημένη αρτηριακή πίεση, η διαταραγμένη ανοχή γλυκόζης, η υπερινσουλιναιμία και η κεντρική παχυσαρκία αποτελούν το μεταβολικό σύνδρομο. Πρόσφατα, έχει προταθεί ότι η μη αλκοολική νόσος του λιπώδους ήπατος αποτελεί την ηπατική συνιστώσα του συνδρόμου [1]. Αυτές οι διαταραχές αποτελούν παράγοντες αυξημένου κινδύνου καρδιοαγγειακής νόσου και διαβήτη τύπου ΙΙ [2]. Ο σύγχρονος τρόπος ζωής, η πλούσια σε λιπαρά διατροφή και η έλλειψη φυσικής άσκησης οδηγούν στην αύξηση του επιπολασμού του μεταβολικού συνδρόμου. Συγκεκριμένα, ένας στους τέσσερις ενήλικες εμφανίζει μεταβολικό σύνδρομο, με το 78% των ανδρών και το 74% των γυναικών στην Ελλάδα να το αγνοούν [3;4]. Το μεταβολικό σύνδρομο όμως δεν αφορά πλέον μόνο τους ενήλικες αλλά και την παιδική ηλικία κάνοντας απαραίτητη την αντιμετώπιση του [5]. 1.1 Ορισμοί και κριτήρια του μεταβολικού συνδρόμου Το 1923, ο Kylin περιέγραψε για πρώτη φορά την συνάθροιση τριών κλινικών οντοτήτων: της υπέρτασης, της υπεργλυκαιμίας και της υπερουριχαιμίας ενώ το 1936 ο Himsworth περιέγραψε την ελαττωμένη ευαισθησία στην ινσουλίνη ορισμένων ασθενών με σακχαρώδη διαβήτη τύπου II [6]. Το 1988, ο Reaven χαρακτήρισε το μεταβολικό σύνδρομο σαν μια κατάσταση όπου η αντίσταση στην ινσουλίνη είναι η υποκείμενη μεταβολική διαταραχή που πυροδοτεί την εμφάνιση και άλλων διαταραχών όπως για παράδειγμα την υπέρταση, την υπερλιπιδαιμία και τον σακχαρώδη διαβήτη. Το σύνολο όλων αυτών των διαταραχών που μπορεί να οδηγήσουν στην εμφάνιση καρδιοαγγειακής νόσου ονομάστηκε «Σύνδρομο Χ». Επίσης, ο Reaven ανέφερε ότι και η παχυσαρκία σχετίζεται με την αντίσταση στην ινσουλίνη ή την υπερινσουλιναιμία [7]. 20

21 Στην συνέχεια, ακολούθησε μια σειρά από έρευνες που στόχο είχαν τον χαρακτηρισμό του μεταβολικού συνδρόμου καθώς και τις αιτίες που προκαλούν την εμφάνιση του. Από τις κυριότερες αιτίες που περιγράφηκαν ήταν η αντίσταση στην ινσουλίνη [7;8] και η παχυσαρκία κεντρικού τύπου [9-13]. Επίσης, και άλλοι παράγοντες όπως η έλλειψη φυσικής δραστηριότητας [10;14], το γήρας [15] και η ορμονική ανισσοροπία [16] παίζουν ρόλο στην εμφάνιση του μεταβολικού συνδρόμου. Από το 1998 μέχρι το 2009, διάφοροι οργανισμοί υγείας έχουν προτείνει διάφορους ορισμούς για το μεταβολικό σύνδρομο καθώς και τα κλινικά κριτήρια για την διάγνωση του. Συγκεκριμένα, το 1998 ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας (ΠΟΥ) όρισε το μεταβολικό σύνδρομο ως μια κατάσταση όπου ο ασθενής πάσχει από μία από τις ακόλουθες διαταραχές: 1) αντίσταση στην ινσουλίνη, 2) διαταραγμένη ανοχή στη γλυκόζη, 3) διαταραγμένη γλυκόζη νηστείας και 4) σακχαρώδη διαβήτη. Αλλά θα πρέπει να πληροί και δυο ακόμη από τα παρακάτω κριτήρια: Περιφέρεια μέσης (άντρες >0,90 m, γυναίκες >0,85 m) Δείκτης μάζας σώματος (ΔΜΣ) >30 kg/m 2 Επίπεδα τριγλυκεριδίων 150 mg/dl Χοληστερόλη υψηλής πυκνότητας (HDL-C) <35 mg/dl (άντρες) ή <39 mg/dl (γυναίκες) Πίεση 140/90 mm Hg Μικροαλβουμινουρία [17] Το 1999, η Ευρωπαϊκή Ομάδα για την Μελέτη της Αντίστασης στην Ινσουλίνη (EGIR-1999) πρότεινε το σύνδρομο να ονομαστεί «σύνδρομο αντίστασης στην ινσουλίνη (IRS)» εφόσον είναι μια κατάσταση όπου η υπερινσουλιναιμία συνδυάζεται με δυο ή περισσότερες από τις ακόλουθες διαταραχές: υπεργλυκαιμία, υπέρταση, δυσλιπιδαιμία και παχυσαρκία κεντρικού τύπου [18]. Το 2001, το Εθνικό Πρόγραμμα Αντιμετώπισης και Εκπαίδευσης Δυσλιπιδαιμιών Ενηλίκων των Η.Π.Α. (NCEP, Adult Treatment Panel III-2001) όρισε το μεταβολικό σύνδρομο ως «συνάθροιση αλληλο-συσχετιζόμενων παραγόντων κινδύνου μεταβολικής προέλευσης (μεταβολικοί παράγοντες κινδύνου) που φαίνεται να προωθούν άμεσα την ανάπτυξη της αθηρωματικής καρδιαγγειακής νόσου» και έθεσε ως απαραίτητη προϋπόθεση για την διάγνωση 21