ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΑΝΟΙΚΤΑ ΑΚΑΔΗΜΑΪΚΑ ΜΑΘΗΜΑΤΑ. Βιοχημεία ΙΙ. ΣΥΝΘΕΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Διδάσκοντες: Καθ. Δ. Τσουκάτος, Αναπλ. Καθ. Α.-Ε.

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΑΝΟΙΚΤΑ ΑΚΑΔΗΜΑΪΚΑ ΜΑΘΗΜΑΤΑ Βιοχημεία ΙΙ ΣΥΝΘΕΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Διδάσκοντες: Καθ. Δ. Τσουκάτος, Αναπλ. Καθ. Α.-Ε. Κούκκου

2 Άδειες Χρήσης Το παρόν εκπαιδευτικό υλικό υπόκειται σε άδειες χρήσης Creative Commons. Για εκπαιδευτικό υλικό, όπως εικόνες, που υπόκειται σε άλλου τύπου άδειας χρήσης, η άδεια χρήσης αναφέρεται ρητώς.

3 ΣΥΝΘΕΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ-5 η αγγλική έκδοση, Ελληνική μετάφραση Κεφ. 5, σελ και Κεφ. 29, όλο Σύνθεση πρωτεϊνών = Μετάφραση - από τη «γλώσσα» των 4 γραμμάτων των νουκλεϊνικών οξέων μετατροπή στη «γλώσσα» 20 γραμμάτων των πρωτεϊνών Σύνθεση πρωτεϊνών = Εξαιρετικά σημαντική διεργασία σύνθεσης των πλέον λειτουργικών μορίων της σύγχρονης ζωής Σύνθεση πρωτεϊνών = Η πλέον πολύπλοκη βιοχημική διεργασία που εμπλέκει την αλληλεπίδραση δεκάδων μορίων νουκλεϊκών οξέων και εκατοντάδων πρωτεϊνών Σύνθεση πρωτεϊνών: Πραγματοποιείται στα ριβοσώματα κολοσσιαία ριβονουκλεο-πρωτεϊνικά σύμπλοκα, σύγχρονα ριβοένζυμα κατάλοιπα του κόσμου του RNA Σύνθεση πρωτεϊνών: Συντονισμένη δράση ριβοσωμάτων, μεταφορικών RNA, αγελιαφόρου RNA και πρωτεϊνών ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ, ΤΟΜΟΣ ΙΙ-ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΕΣ ΕΚΔΟΣΕΙΣ ΚΡΗΤΗΣ

4 Νουκλεϊκά οξέα: 4 βάσεις Ο Γενετικός Κώδικας Πρωτεΐνες: 20 αμινοξέα Γενετικός Κώδικας = Η σχέση μεταξύ της αλληλουχίας των βάσεων του DNA (ή στο RNA που μεταγράφεται) και της αλληλουχίας των αμινοξέων των πρωτεϊνών Η μονάδα του Γενετικού Κώδικα: Τρεις διαδοχικές βάσεις επί ενός νουκλεϊκού οξέος αντιστοιχούν με ένα αμινοξύ του πρωτεϊνικού μορίου Θεωρητικός υπολογισμός καθορισμού της μονάδας του Γενετικού Κώδικα Ο αριθμός των διαφορετικών μι-άδων που μπορούν να σχηματιστούν (επομένως και ο αριθμός των διαφορετικών αμινοξέων που αντιστοιχούν σε αυτές) από τις ν(=4) διαφορετικές βάσεις σε μια προσανατολισμένη σειρά μ το πλήθος από αυτές, δίδεται από τη μαθηματική σχέση της συνδυαστικής ανάλυσης που μας παρέχει τον αριθμό των επαναληπτικών διατάξεων (δ) των ν βάσεων ανά μ (δ=ν μ ), με δ 20 (20 διαφορετικά αμινοξέα) μι-άδα Σύνολο επαναληπτικών διατάξεων Συμπέρασμα 1 βάση 4 1 αμινοξέα = 4 δεν αρκούν 2 βάσεις 4 2 αμινοξέα = 16 δεν αρκούν 3 βάσεις 4 3 αμινοξέα = 64 υπεραρκετοί 4 βάσεις 4 4 αμινοξέα = 256 υπερβολικοί ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ (3η, 5η έκδοση), ΤΟΜΟΣ Ι-ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΕΣ ΕΚΔΟΣΕΙΣ ΚΡΗΤΗΣ

5 Η ανακάλυψη του Γενετικού Κώδικα Η απόδειξη (επιβεβαίωση) της αντιστοίχησης τριών νουκλεοτιδίων με ένα αμινοξύ χρησιμοποιώντας συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια Η ανακάλυψη της Marianne Grunberg-Manago (1955): Η πολυνουκλεοτιδική φωσφορυλάση ένζυμο που συνδέει ριβονουκλεοτίδια (κατά τρόπο τυχαίο) χωρίς εκμαγείο in vitro Η ιστορική σύνθεση poly-uuu από τον Marshal N. Nirenberg Χρήση του poly-uuu ως εκμαγείο σε in vitro πρωτεϊνοσύνθεση: Poly-UUU poly-phe : ανακάλυψη της αντιστοιχίας νουκλεοτιδικής αλληλουχίας και αλληλουχίας αμινοξέων ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ (3η έκδοση), ΤΟΜΟΣ I-ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΕΣ ΕΚΔΟΣΕΙΣ ΚΡΗΤΗΣ

6 Η ανακάλυψη του Γενετικού Κώδικα Άλλα πολυ-νουκλεοτίδια poly-aaa poly-lys poly-ccc poly-pro (πολυμερή ενός νουκλεοτιδίου) poly-uc poly-ser-leu (επιβεβαίωση τριπλέτας) poly-ac(acacac) poly-thr-his (επιβεβαίωση τριπλέτας) (συμπολυμερή δύο νουκλεοτιδίων) poly-caa poly-gln, ή poly-asn, ή poly-thr (συμπολυμερή τριών νουκλεοτιδίων) (επιβεβαίωση τριπλέτας) ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ (3η έκδοση), ΤΟΜΟΣ I-ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΕΣ ΕΚΔΟΣΕΙΣ ΚΡΗΤΗΣ

7 Τα χαρακτηριστικά του Γενετικού Κώδικα 1. Τρία νουκλεοτίδια στη σειρά κωδικεύουν ένα αμινοξύ - το κωδίκιο, ή κωδικόνιο 2. Τα κωδίκια διαβάζονται στη σειρά χωρίς επικαλύψεις και κόμματα. 3. Ο κώδικας είναι εκφυλισμένος (61 κωδίκια για 20 αμινοξέα) 4. Ο κώδικας έχει σημείο έναρξης (κωδίκιο AUG, ή GUG) 5. Ο κώδικας έχει τερματισμό (κωδίκια UAA,UAG, UGA) 6. Ο κώδικας είναι (σχεδόν) παγκόσμιος ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ, ΤΟΜΟΣ Ι-ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΕΣ ΕΚΔΟΣΕΙΣ ΚΡΗΤΗΣ

8 Ο Γενετικός Κώδικας ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ, ΤΟΜΟΣ I-ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΕΣ ΕΚΔΟΣΕΙΣ ΚΡΗΤΗΣ

9 Ο εκφυλισμός του γενετικού κώδικα Εκφυλισμός = Η κωδίκευση ορισμένων αμινοξέων από περισσότερα του ενός κωδίκια 61 κωδίκια -> 20 αμινοξέα, 3 κωδίκια -> κανένα αμινοξύ Κωδίκια ίδιου αμινοξέος = συνώνυμα (π.χ. CAU, CAC -> Lys) Συνώνυμα: συνήθως οι δύο πρώτες βάσεις είναι ίδιες Βιολογική σημασία εκφυλισμού: ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ, ΤΟΜΟΣ Ι-ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΕΣ ΕΚΔΟΣΕΙΣ ΚΡΗΤΗΣ

10 Η βιολογική σημασία του εκφυλισμού Ελαχιστοποιεί τα βλαβερά αποτελέσματα των μεταλλάξεων Αν ο Γενετικός Κώδικας δεν ήταν εκφυλισμένος θα υπήρχαν 44 κωδίκια τερματισμού. Μεταλλάξεις θα οδηγούσαν σε μεγαλύτερη συχνότητα κωδικίων τερματισμού Ο εκφυλισμός επιτρέπει στην αλληλουχία των βάσεων του DNA να διαφέρει χωρίς να αλλάζουν τα αμινοξέα που κωδικεύονται από το DNA ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ, ΤΟΜΟΣ I-ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΕΣ ΕΚΔΟΣΕΙΣ ΚΡΗΤΗΣ

11 Ο γενετικός κώδικας είναι σχεδόν καθολικός Ο Γενετικός Κώδικας είναι ίδιος για όλα τα χρωμοσωμικά Γονιδιώματα, εκτός ορισμένες εξαιρέσεις σε μιτοχονδριακά γονιδιόματα και χρωμοσώματα βλεφαριδωτών πρωτοζώων Ο Γενετικός Κώδικας παρέμεινε αναλλοίωτος για δις χρόνια, επειδή μια μετάλλαξη που τροποποιεί την ανάγνωση του mrna θα άλλαζε την αλληλουχία των περισσότερων πρωτεϊνών προς επιβλαβείς Αποκλείσεις δείχνουν απλούστερο κώδικα ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ, ΤΟΜΟΣ I-ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΕΣ ΕΚΔΟΣΕΙΣ ΚΡΗΤΗΣ

12 Τα περισσότερα ευκαρυωτικά γονίδια είναι μωσαϊκά από ιντρόνια και εξόνια Το γονίδιο της αιμοσφαιρίνης β διακόπτεται από δύο παρεμβαλλόμενες αλληλουχίες (ιντρόνια) Στα βακτήρια οι πολυπεπτιδικές αλυσίδες κωδικεύονται από συνεχείς σειρές τριπλετών βάσεων Στα ευκαρυωτικά τα γονίδια είναι ασυνεχή Υβρίδιο προκαρυωτικού mrna με DNA, Υβρίδιο ευκαρυωτικού mrna με DNA ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ, ΤΟΜΟΣ I-ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΕΣ ΕΚΔΟΣΕΙΣ ΚΡΗΤΗΣ

13 Η επεξεργασία (μάτισμα) ευκαρυωτικού RNA δίδει ώριμο RNA (mrna) Από το πρωτογενές μεταγράφημα (RNA) απομακρύνονται μη μεταφράσιμες περιοχές (ιντρόνια) και οι κωδικεύουσες περιοχές (εξόνια) επανασυνδέονται Απομάκρυνση και επανασύνδεση γίνονται από ένα ενζυμικό σύμπολοκο διάσπασης και επανασύνδεσης (συγκρότημα πρωτεϊνών και μικρών μορίων RNA) ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ, ΤΟΜΟΣ I-ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΕΣ ΕΚΔΟΣΕΙΣ ΚΡΗΤΗΣ

14 Ομόφωνες αλληλουχίες για το μάτισμα των προδρόμων μορίων mrna Το σύμπολοκο διάσπασης και επανασύνδεσης αναγνωρίζει επί του νεοσυντιθέμενου RNA σήματα που καθορίζουν τη θέση ματίσματος Τα ιντρόνια αρχίζουν σχεδόν πάντοτε με GU και τελειώνουν με AG, του οποίου προηγείται αλληλουχία πλούσια σε πυριμιδίνες Αυτή η ομόφωνη αλληλουχία είναι μέρος του σήματος για μάτισμα ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ, ΤΟΜΟΣ I-ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΕΣ ΕΚΔΟΣΕΙΣ ΚΡΗΤΗΣ

15 Σύνθεση πρωτεϊνών: η μετάφραση νουκλεοτιδικών αλληλουχιών σε αλληλουχίες αμινοξέων Ο μηχανισμός μετάφρασης είναι σχεδόν ίδιος σε όλα τα βασίλεια του έμβιου κόσμου άρα εμφανίστηκε εξελικτικά πολύ ενωρίς Προσανατολισμός σύνθεσης πρωτεϊνών: από αμινο- προς καρβοξυ-άκρο Τα αμινοξέα φθάνουν στην αυξανόμενη αλυσίδα ενεργοποιημένα, μεταφερόμενα από το trna: Αμινοακυλο-tRNA προκύπτουν από την ένωση της COO - ενός αμινοξέος με την 3 -ΟΗ ενός trna. H αντίδραση καταλύεται από τις αμινοακυλο-trna συνθετάσες εξειδικευμένα ένζυμα για κάθε αμινοξύ και απαιτούν ΑΤΡ

16 H συχνότητα λάθους της μετάφρασης Σύνθεση RNA: μεταγραφή- αντιγραφή μιας σελίδας λέξη προς λέξη. αλλαγή νοήματος πολύ μικρή μικρό λάθος Σύνθεση πρωτεϊνών: μετάφραση μιας σελίδας σε άλλη γλώσσα πολύπλοκη διαδικασία πολλά βήματα πολλά εμπλεκόμενα μόρια πολλά λάθη Αντικρουόμενες απαιτήσεις: - ακριβής βιοσυνθετική διεργασία - γρήγορη βιοσυνθετική διεργασία Γρήγορη; Γρήγορη!!! Ακριβής; ταχύτητα σύνθεσης: 40 αμινοξέα/sec Αν λάβουμε υπ όψη τον αριθμό των εμπλεκόμενων μορίων και τον βαθμό πολυπλοκότητας Υπολογισμός συχνότητας λάθους

17 Πόσο ακριβής πρέπει να είναι η σύνθεση πρωτεϊνών Η πιθανότητα (p) σχηματισμού ενός πρωτεϊνικού μορίου χωρίς λάθη εξαρτάται από τον αριθμό των αμινοξέων (n) και την συχνότητα εισαγωγής λάθους (ε): p = (1 ε) n ε < 10-4, Έχει επιλεγεί από την εξέλιξη Μείωση συχνότητας λάθους με μείωση της ταχύτητας σύνθεσης Όχι ανεκτή ακόμα και για μικρές πρωτεΐνες

18 O ρόλος του μεταφορικού RNA (trna) στην πρωτεϊνοσύνθεση Η ακρίβεια της σύνθεσης πρωτεϊνών εξαρτάται από τη σωστή αναγνώριση των κωδικίων του mrna. Ο Γενετικός Κώδικας συνδέει κάθε αμινοξύ με ένα κωδίκιο. Τα αμινοξέα δεν μπορούν από μόνα τους να αναγνωρίσουν τα αντίστοιχα κωδίκια. Τον ρόλο της αναγνώρισης των κωδικίων αναλαμβάνουν μόρια trna Τα trna λειτουργούν ως προσαρμοστές: δεσμεύουν αμινοξέα και τα μεταφέρουν στον τόπο σύνθεσης πρωτεϊνών αναγνωρίζοντας κωδίκια μέσω ζευγαρώματος βάσεων. Η αλληλουχία βάσεων του πρώτου trna (R. Holley, 1965), αλανυλο-trna ζυμομηκύτων. mg: μεθυλογουανοσίνη, UH 2 : διυδροουριδίνη, ψ: ψευδοουριδίνη, Ι: ινοσίνη

19 Τα κοινά δομικά χαρακτηριστικά των μορίων trna 1. Αποτελούνται από μονόκλωνες αλυσίδες μήκους ριβονουκλεοτιδίων 2. Περιέχουν 7 15 ασυνήθιστες βάσεις (προκύπτουν από μετα-μεταγραφικές τροποποιήσεις). Οι μεθυλιώσεις εμποδίζουν το ζευγάρωμα των βάσεων και προσδίδουν υδροφοβικότητα 3. Σχηματίζουν 4 δίκλωνες περιοχές, 3-4 εσωτερικές θηλιές και 3 - μονόκλωνο ΟΗ άκρο 4. Το 5-άκρο Ρ, συνήθως είναι pg 5. Το αμινοξύ συνδέεται με το 3 -ΟΗ της μονόκλωνης CCA 6. Το αντικωδίκιο βρίσκεται σε ειδική θηλιά κοντά στο κέντρο της αλληλουχίας

20 Η κοινή τριδιάστατη δομή των μορίων trna Τριδιάστατη δομή: Οι Α. Rich και A. Klug (1974), προσδιόρισαν τη δομή του Phe-tRNA της ζύμης, με ακτίνες Χ, και έχει σχήμα γράμματος Γ με 4 δίκλωνες έλικες μορφής Α, Οι βάσεις των εσωτερικών θηλιών αλληλεπιδρούν με άλλες μέσω δ. Η. Η περιοχή 3 -CCA βρίσκεται στο ένα άκρο και η θηλιά του αντικωδικίου στο άλλο.

21 Οι αμινοακυλο-trna συνθετάσες «διαβάζουν» τον Γενετικό Κώδικα Η κρισιμότητα της σύνδεσης αμινοξέος με ένα trna: 1. Σύνδεση αμινοξέος με ειδικό trna επιβεβαιώνει τον Γενετικό Κώδκα 2. Ο σχηματισμός πεπτιδικού δεσμού μεταξύ ελευθέρων αμινοξέων δεν ευνοείται θερμοδυναμικά Απαιτείται ενεργοποίηση του αμινοξέος Τα ενεργοποιημένα ενδιάμεσα της σύνθεσης πρωτεϊνών είναι εστέρες αμινοξέων: η καρβοξυλομάδα του αμινοξέος είναι συνδεδεμένη με την 2 - ή 3 -ΟΗ της ριβόζης του 3 -άκρου ενός trna Αμινοακυλο-tRNA

22 Η σύνδεση των αμινοξέων με μόρια trna Ενεργοποίηση αμινοξέων: καταλύεται από τις αμινοακυλο-trna συνθετάσες 1 ο βήμα: σχηματισμός αμινοακυλο-αδενυλικού από αμινοξύ + ΑΤΡ μικτός ανυδρίτης: COO - ομάδα αμινοξέος συνδεδεμένη με φωσφορική ομάδα του ΑΜΡ

23 Η σύνδεση των αμινοξέων με μόρια trna 2 ο βήμα: μεταφορά αμινοακυλικής ομάδας του αμινοακυλο-αμρ σε ένα ειδικό trna για σχηματισμό αμινοακυλο-trna Αμινοακυλο-ΑΜΡ + trna άθροισμα αντιδράσεων: αμινοξύ + ΑΤΡ + trna αμινοακυλο-trna + AMP αμινοακυλο-trna + ΑΜΡ + PP i ΔG ο αντίδρασης 0, γιατί η ελεύθερη ενέργεια υδρόλυσης εστερικού δεσμού του αμινοακυλο-trna είναι παρόμοια με αυτή από την υδρόλυση ΑΤΡ σε ΑΜΡ και PP i. Η αντίδραση ωθείται από υδρόλυση ΡΡ i Άρα: αμινοξύ + ΑΤΡ + trna + Η 2 Ο αμινοακυλο-trna +ΑΜΡ + 2Ρ i Δύο Ρ δεσμοί υψηλής ενέργειας καταναλώνονται για τη σύνθεση ενός αμινοακυλο-trna.

24 Οι καταλυτικές ιδιότητες των αμινοακυλο-trna συνθετασών Τα δύο βήματα ενεργοποίησης αμινοξέων και σύνδεσης με το αντίστοιχο trna καταλύονται από την ίδια αμινοακυλο-trna συνθετάση Το ενδιάμεσο αμινοακυλο-αμρ δεν αποσυνδέεται από το ένζυμο Είναι ένα σταθερό μεταβατικό ενδιάμεσο Για κάθε αμινοξύ υπάρχει μια ειδική αμινοακυλο-trna συνθετάση Η συχνότητα σύνδεσης λάθους αμινοξέος είναι της τάξεως Η μεγάλη αυτή εξειδίκευση οφείλεται στην ειδική αναγνώριση του συγκεκριμένου αμινοξέος από τη συνθετάση Η εξειδίκευση των συνθετασών μπορεί να διακρίνει ακόμα και μεταξύ παρόμοιων αμινοξέων

25 Μηχανισμός εξειδίκευσης αναγνώρισης αμινοξέων της θρεονυλο-trna συνθετάσης Η διάκριση της θρεονίνης αντί της βαλίνης οφείλεται στην ύπαρξη μιας - ΟΗ έναντι μιας -CH 3 αντίστοιχα στην πλευρική αλυσίδα των αμινοξέων Η θέση δέσμευσης αμινοξέος του ενζύμου περιέχει ένα ιόν Zn το οποίο σχηματίζει σύμπλοκο συναρμογής μόνο με τη θρεονίνη μέσω της NH 2 και της πλευρικής ΟΗ της θρεονίνης -CH 3 Η COO - της Thr είναι σε θέση που να μπορεί να συνδεθεί με την α-ρ ομάδα του ΑΤΡ -ΟΗ -ΝΗ 2 Η διάκριση της σερίνης πιο δύσκολη Εισαγωγή Ser με συχνότητα

26 Οι αμινοακυλο-trna συνθετάσες διαθέτουν διορθωτική ικανότητα Επώαση αμινοακυλο-trna που είχαν συνδεθεί ομοιοπολικά με το λάθος αμινοξύ (π.χ. Ser-tRNA Thr ) και συνθετάσης για το σωστό αμινοξύ (π.χ. θρεονυλο-trna συνθετάσης), είχε ως αποτέλεσμα ταχύτατη υδρόλυση του λάθους αμινοξέος. Ser-tRNA Thr Thr-tRNA Thr Θρεονυλο-tRNA συνθετάση Ser + trna Thr Thr-tRNA Thr Η θρεονυλο-trna συνθετάση περιέχει ένα επιπλέον κέντρο υδρόλυσης του Ser-tRNA Thr και όχι του Thr-tRNA Thr. Κέντρο διόρθωσης, διορθώνει τα λάθη και αυξάνει την ακρίβεια με συχνότητα λάθους μικρότερη από 10-4.

27 Το κέντρο διόρθωσης της θρεονυλο-trna συνθετάσης Το κέντρο διόρθωσης απέχει > 20 Å από το κέντρο ενεργοποίησης Το κέντρο διόρθωσης δέχεται Ser αλλά όχι Thr, επειδή δεν χωρά λόγω της επιπλέον CH 3 H Tyr-tRNA συνθετάση δεν διαθέτει διορθωτική ικανότητα γιατί διακρίνει Tyr έναντι Phe με μεγάλη ακρίβεια Οι περισσότερες συνθετάσες περιέχουν διορθωτικά κέντρα που λειτουργούν ως «διπλά κόσκινα» Το κέντρο ακυλίωσης αποκλείει μεγαλύτερα αμινοξέα, ενώ το κέντρο διόρθωσης αποκλείει μικρότερα Το αμινο-ακυλιωμένο άκρο -CCA του trna μπορεί να παλινδρομεί μεταξύ των δύο κέντρων: Διόρθωση χωρίς αποσύνδεση

28 Οι συνθετάσες αναγνωρίζουν τους βραχίωνες υποδοχής και τις θηλιές αντικωδικίων των trna Η «μετάφραση» πραγματοποιείται ουσιαστικά στο καθοριστικό βήμα της επιλογής από τις συνθετάσες των σωστών trna. Οι αμινοακυλο-trna συνθετάσες είναι τα μόνα ένζυμα στον έμβιο κόσμο που γνωρίζουν τον γενετικό κώδικα Ακρίβεια σύνθεσης: - αναγνώριση σωστών trna - σύνδεση σωστών αμινοξέων Οι αμινοακυλο-trna συνθετάσες αναγνωρίζουν τη θηλιά του αντικωδικίου, αλλά και άλλα δομικά χαρακτηριστικά των trna

29 Κρυσταλλογραφικές μελέτες συμπλόκων συνθετασών και αντίστοιχων trna Σύμπλοκο θρεονυλο-trna + συνθετάση Σύμπλοκο γλουταμινυλο-trna + συνθετάση Και στις δύο περιπτώσεις οι βάσεις του αντικωδικίου (ιδιαίτερα η δεύτερη και τρίτη) σχηματίζουν δεσμούς υδρογόνου με το ένζυμο

30 Ομάδες αμινοακυλο-trna συνθετασών Μία τουλάχιστον συνθετάση για κάθε αμινοξύ Δύο ομάδες συνθετασών, κάθε μία για 10 αμινοξέα

31 Η στερεοειδική αναγνώριση των αμινοακυλο-trna συνθετασών Αναγνωρίζουν διαφορετικές όψεις του μορίου trna. Φαίνονται οι διαφορετικές διατάξεις του βραχίωνα CCA του trna

32 Διαφορές μεταξύ των ομάδων αμινοακυλο-trna συνθετασών Ομάδα Ι ακυλιώνουν 2 -ΟΗ Ομάδα ΙΙ ακυλιώνουν 3 -ΟΗ δεσμεύουν ΑΤΡ με διαφορετική στερεοδιάταξη συνήθως μονομερή συνήθως διμερή Το κέντρο ενεργοποίησης το κέντρο ενεργοποίησης περιέχει μια πτυχή περιέχει κυρίως β- Rossmann πτυχωτές επιφάνειες

33 Ο ρόλος των αμινοξέων μετά τη σύνδεσή τους με το αντίστοιχο trna Τα αμινοξέα διατάσσονται σύμφωνα με τη σειρά των κωδικίων μέσω αλληλεπιδράσεων κάθε κωδικίου με το αντικωδίκιο ενός ειδικού φορτισμένου trna. Τα αμινοξέα δεν αποτελούν σήματα αναγνώρισης μετά τη σύνδεσή τους με trna. Απόδειξη με χημική τροποποίηση αμινοξέων μετά τη σύνδεσή τους σε trna Το Ala-tRNA Cys μεταφέρει την Ala σε θέσεις κωδικίων Cys (UGU) και όχι σε θέσεις κωδικίων Ala (GCN)

34 Μερικά trna αναγνωρίζουν περισσότερα από ένα κωδίκια λόγω «ταλάντευσης» Κανόνες που διέπουν την αναγνώριση ενός κωδικίου από το αντικωδίκιο ενός trna η υπόθεση «wobble» των Watson-Crick Κάθε βάση του κωδικίου σχηματίζει δεσμούς υδρογόνου με κάθε βάση του αντικωδικίου -3 -Χ -Y -Ζ -5 - αντικωδίκιο -5 -Χ Υ Z -5 - κωδίκιο Άρα ένα trna για κάθε κωδίκιο; Μερικά μόρια trna μπορούν να αναγνωρίζουν περισσότερα από ένα κωδίκια π.χ. το Ala-tRNA ζυμομυκήτων αναγνωρίζει GCU, GCC, GCA και τα τρία είναι κωδίκια αλανίνης (οι δύο πρώτες βάσεις ίδιες, η αναγνώριση της τρίτης λιγότερο ειδική)

35 Η υπόθεση «wobble» Ο F. Crick υπέθεσε ότι τα στερεοχημικά κριτήρια θα μπορούσαν να είναι λιγότερο αυστηρά για το ζευγάρωμα κωδικίου-αντικωδικίου στην Τρίτη βάση του κωδικίου από ότι στις δύο άλλες. Αυτό θα μπορούσε να συμβαίνει, όπως υποδηλώνεται με το πρότυπο του εκφυλισμού του γενετικού κώδικα Σήμερα η υπόθεση αυτή είναι πλήρως αποδεκτή το αντικωδίκιο του Ala-tRNA είναι IGC και αναγνωρίζει τα κωδίκια GCU, GCC και GCA Η 1 η βάση του αντικωδικίου ζευγαρώνει με την 3 η βάση του κωδικίου

36 Γενικεύσεις για τις αλληλεπιδράσεις κωδικίου-αντικωδικίου 1. Οι δύο πρώτες βάσεις ενός κωδικίου ζευγαρώνουν με τον συνήθη τρόπο με τις βάσεις της 3 ης και 2 ης θέση του αντικωδικίου αντίστοιχα. Άρα κωδίκια που διαφέρουν στις δύο πρώτες βάσεις αναγνωρίζονται από διαφορετικά trna 2. Το πόσα κωδίκια αναγνωρίζει ένα μόριο trna εξαρτάται από την 1 η βάση του αντικωδικίου: C ή A ένα κωδίκιο, U ή G δύο κωδίκια και Ι τρία κωδίκια Επομένως, μέρος του εκφυλισμού του Γ.Κ. προκύπτει από την ανακρίβεια ζευγαρώματος της 3 ης βάσης του κωδικίου με την 1 η του αντικωδικίου Το ζευγάρωμα «wobble» είναι ανεκτό στην 3 η θέση του κωδικίου και όχι στις δύο πρώτες. Δύο βάσεις Α1492,3 στο 16S rrna της 30S υπομονάδας σχηματίζουν δεσμούς υδρογόνου με την πλευρά της μικρής αύλακας του δίκλωνου τμήματος κωδικίου-αντικωδικίου, ώστε να ελέγχουν την ύπαρξη ζευγών βάσεων στις δύο πρώτες θέσεις του κωδικίου. Ο μηχανισμός αυτός εξασφαλίζει την πιστότητα της αλληλεπίδρασης κωδικίου-αντικωδικίου (όπως η DNA πολ.κατά την αντιγραφή) και δείχνει τον ενεργό ρόλο των ριβοσωμάτων σ αυτή

37 Η δομή των ριβοσωμάτων Ριβοσώματα: μοριακές μηχανές που συντονίζουν τη συνεργασία των φορτισμένων trna, mrna και πρωτεϊνών 30 S 50 S 70 S Ένα κύτταρο E. coli περιέχει περίπου ριβοσώματα το 1/4 της συνολικής κυτταρικής του μάζας.

38 Οι υπομονάδες των ριβοσωμάτων Ριβόσωμα: Μία μικρή υπομονάδα 30 S + μία μεγάλη υπομονάδα 50 S 30 S: 21 πρωτεΐνες (S1-S21) + 16 S RNA (S20 = L26) 50 S: 34 πρωτεΐνες (L1-L34) + 23S + 5S RNA (2 x L7, 2 x L12) Οι υπομονάδες μπορούν να ανασυσταθούν από τα συστατικά τους ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ, (3η, 5η έκδοση), ΤΟΜΟΣ IΙ-ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΕΣ ΕΚΔΟΣΕΙΣ ΚΡΗΤΗΣ

39 Οι ριβοσωμικές υπομονάδες μπορούν να ανασυσταθούν από τα συστατικά τους (Masayasu Nomura, 1968) δυνατότητα αυθόρμητου σχηματισμού

40 Τα ριβοσωματικά RNA Τα ριβοσωματικά RNA διαδραματίζουν σημαντικό λειτουργικό ρόλο στην πρωτεϊνοσύνθεση Το 16 S RNA της 30 S υπομονάδας και το 23 S RNA της 50 S υπομονάδας κατέχουν καταλυτικό ρόλο Το ριβόσωμα αποτελούνταν αρχικά μόνο από RNA Οι πρωτεΐνες προστέθηκαν αργότερα κατά την εξέλιξη, Μοριακή Βιολογία του γονιδίου, Εκδόσεις Utopia

41 Η κατεύθυνση της σύνθεσης πρωτεϊνών Πολυμερισμός αμινοξέων: -ΝΗ + 2 COO - άκρο (απόδειξη με σύνθεση αιμοσφαιρίνης υπό την παρουσία 3 Η λευκίνης) Μετάφραση επί του mrna: από το 5 -Ρ - προς το 3 -ΟΗ 5 -Α-Α-Α-(Α-Α-Α-) n Α-Α-C-3 + Η 3 Ν-Lys-(Lys) n -Asn-COO - To mrna στα προκαρυωτικά μπορεί να μεταφράζεται καθώς συντίθεται Πολυ(ριβο)σώματα: ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ, (3η, 5η έκδοση), ΤΟΜΟΣ IΙ-ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΕΣ ΕΚΔΟΣΕΙΣ ΚΡΗΤΗΣ

42 Το σήμα έναρξης της μετάφρασης H σύνθεση πρωτεϊνών αρχίζει σε προκαθορισμένα σημεία επί του mrna, περίπου 25 νουκλεοτίδια μακριά από το 5 -Ρ άκρο Πολυκιστρονικά μηνύματα φέρουν περισσότερες από μία θέσεις έναρξης. Το εναρκτήριο κωδίκιο είναι το AUG (σπανιότερα το GUG) Ανοδικά του AUG (η GUG) συναντάται μια περιοχή πλούσια σε πουρίνες (αλληλουχία Shine-Dalgarno, αποδείχθηκε μετά από επίδραση συμπλόκου έναρξης με ριβονουκλεάση) Η περιοχή αυτή αναγνωρίζεται από το 16 S rrna

43 Αλληλεπιδράσεις αναγνώρισης περιοχής έναρξης της πρωτεϊνοσύνθεσης 3 -άκρο του ριβοσωμικού RNA 16 S Δύο σχέσεις συμπληρωματικότητας αναγνωρίζουν την έναρξη 1. Ζευγάρωμα βάσεων του mrna με το 3 -ΟΗ του 16S rrna 2. Ζευγάρωμα του κωδικίου έναρξης του mrna με το αντικωδίκιο του εναρκτήριου trna (ποιο είναι αυτό;) ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ, (3η, 5η έκδοση), ΤΟΜΟΣ IΙ-ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΕΣ ΕΚΔΟΣΕΙΣ ΚΡΗΤΗΣ,

44 Η σύνθεση πρωτεϊνών στα βακτήρια αρχίζει με φορμυλο-μεθειονυλο-trna AUG: εναρκτήριο κωδίκιο, όμως AUG υπάρχουν και εντός του μηνύματος. Πώς διακρίνεται το εναρκτήριο AUG έναντι των υπολοίπων; Οι βακτηριακές πρωτεΐνες στο N-άκρο τους φέρουν Ν-φορμυλομεθειονίνη Ένα ειδικό trna μεταφέρει fmet (το trna f ) Ένα διαφορετικό trna μεταφέρει met (trna m ) Η μεθειονίνη συνδέεται και με τα δύο αυτά trna με τη δράση της ίδιας συνθετάσης (μεθειονυλο-trna συνθετάση) Το ένζυμο τρανσφορμυλάση φορμυλιώνει μόνο την met που είναι συνδεδεμένη σε trna f

45 H βιοχημική πορεία φορμυλίωσης της ενεργοποιημένης μεθειονίνης Η τρανσφορμυλάση αναγνωρίζει μόνο trna f που φέρει μεθειονίνη Ο δότης φορμυλομάδας είναι το Ν 10 -τετραϋδροφυλλικό οξύ. Η ελεύθερη μεθειονίνη ή το trna m δεν είναι υποστρώματα της τρανσφορμυλάσης Η φορμυλομάδα ( COH) είναι το χημικό σήμα αναγνώρισης του εναρκτήριου αa-trna από τον παράγοντα έναρξης IF2* * Schmitt et al. (1996). Review - Biochimie, 78:

46 Ο σχηματισμός του συμπλόκου έναρξης Ειδικοί πρωτεϊνικοί παράγοντες (IF1, IF2 και IF3) αναγνωρίζουν την 30S υπομονάδα, το fmet-trna f και την 50S υπομονάδα, για σχηματισμό του συμπλόκου έναρξης 70S. Σύμπλοκο 30S+ΙF1+IF3 IF2+GTP συνδέεται με fmet-trna f και στη συνέχεια με mrna και 30S-ΙF1 (σύμπλοκο έναρξης 30S) Υδρόλυση GTP πραγματοποιείται με την είσοδο της 50S σύμπλοκο 70S (αποφεύγεται σχηματισμός μη λειτουργικού 70S)

47 Τα ριβοσώματα περιέχουν τρεις θέσεις δέσμευσης trna Η δομή του συμπλόκου έναρξης 70S συνδεδεμένου με τρία trna και mrna απέδειξε την ύπαρξη τριών θέσεων δέσμευσης Exit- Peptidyl- Aminoacyl- Το mrna βρίσκεται συνδεδεμένο στην 30S υπομονάδα. Τα trna γεφυρώνουν τις δύο υπομονάδες Το εναρκτήριο fmet-trna f στο σύμπλοκο 70S βρίσκεται στη θέση P

48 Επιμήκυνση - ο σχηματισμός του πρώτου πεπτιδικού δεσμού Το στάδιο της επιμήκυνσης αρχίζει με την εισαγωγή ενός αα-trna στην άδεια θέση Α του ριβοσώματος. Το κατάλληλο αα-trna που αντιστοιχεί στο κωδίκιο της θέσης Α παραδίδεται σε αυτή από ένα πρωτεϊνικό παράγοντα επιμήκυνσης. EF-Tu: πρωτεΐνη G που δεσμεύει αα-trna όταν είναι δεσμευμένη με GTP (GTP-EF-Tu) Το σύμπλοκο GTP-EF-Tu-aa-tRNA συνδέεται στην θέση Α και ο ΕF-Tu ελευθερώνεται μόνο μετά από υδρόλυση του GTP, αφού το αα-trna έχει σχηματίσει δ.η με το κωδίκιο της θέσης Α Ο χρόνος υδρόλυσης του GTP είναι σημαντικός για την πιστότητα της πρωτεϊνοσύνθεσης Σύμπλοκο πρωτεϊνικού παράγοντα επιμήκυνσης ΕF-Tu με αα-trna, προστατεύει την εστερική σύνδεση από υδρόλυση

49 Η σημασία της GTP-GDP μορφής του EF-Tu για την ακρίβεια της πρωτεϊνοσύνθεσης - Ο EF-TU απομακρύνεται από τη θέση Α δεσμευμένος με GDP μετά την υδρόλυση αφού έχει αλληλεπιδράσει σωστά κωδίκιο-αντικωδίκιο - Ο χρόνος υδρόλυσης είναι κρίσιμος για την πιστότητα της σύνθεσης Πίνακας από 3 η έκδοση Ο EF-Tu αποσυνδέεται από το GDP μετά από αλληλεπίδραση με έναν άλλο παράγοντα επιμύκυνσης, τον EF-Ts GDP-EF-Tu + Ts EF-Tu-TS + GDP EF-TU-Ts + GTP GTP-EF-Tu + Ts ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ(3 η, 5 η έκδοση), ΤΟΜΟΣ IΙ-ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΕΣ ΕΚΔΟΣΕΙΣ ΚΡΗΤΗΣ

50 Ο σχηματισμός πεπτιδικού δεσμού Μετά την κατάληψη της θέσης Α από το σωστό αμινοακυλο-trna και την υδρόλυση του GTP, η φορμυλιωμένη μεθειονίνη του εναρκτήριου trna της θέσης Ρ θα μεταφερθεί στην αμινομάδα του αμινοξέος της θέσης Α. Θέση μεταφοράς: κέντρο πεπτυδιλο-τρανσφεράσης της 50 S Η -ΝΗ 2 του αμινοξέος της θέσης Α προσβάλλει την εστερική σύνδεση μεταξύ εναρκτήριου trna και fmet. πεπτιδικός δεσμός

51 Η δραστικότητα πεπτιδυλοτρανσφεράσης οφείλεται σε ριβοένζυμο Η σύνθεση του πεπτιδικού δεσμού πραγματοποιείται σε μια περιοχή της 50 S ριβοσωμικής υπομονάδας που περιέχει μόνο RNA. Οι πλησιέστερες πρωτεΐνες ευρίσκονται 20 Å μακριά. Στη θέση αυτή μια σήραγγα χρησιμεύει για τη διέλευση και έξοδο από το ριβόσωμα της αυξανόμενης πολυπεπτιδικής αλυσίδας

52 Η φορμυλίωση του εναρκτήριου αμινοξέος προστατεύει από κυκλοποίηση Η ελεύθερη αμινομάδα του διπεπτιδίου μπορεί να προσβάλει την -C00 - του εστερικού δεσμού στο trna της θέσης Α και να σχηματίσει ένα σταθερό εξαμερή δακτύλιο τερματίζοντας τη μετάφραση. Η φορμυλίωση της ΝΗ 2 του εναρκτήριου αμινοξέος αποτρέπει αυτό το ενδεχόμενο

53 Το στάδιο της μετατόπισης Μετά το σχηματισμό του πεπτιδικού δεσμού, το trna της θέσης Α που φέρει το διπεπτίδιο μεταφέρεται στη θέση Ρ με τη δράση του παράγονται επιμήκυνσης EF-G και υδρόλυση GTP Έχει γίνει μετατόπιση κατά τρία νουκλεοτίδια

54 Ο μηχανισμός της μετατόπισης Ο EF-G (μετατοπάση) μοιάζει με σύμπλοκο EF-Tu-tRNA μηχανισμός μοριακής απομίμησης Ο EF-G-GTP δεσμεύεται στη θέση Α της 50 S Η δέσμευση προκαλεί υδρόλυση GTP και εισχώρηση της ουράς του EF-G εντός της θέσης Α της 30 S υπομονάδας Αποτέλεσμα: η μετατόπιση του πεπτιδυλο-trna στη θέση Ρ και του αποακυλιωμένου trna στην Ε Η θέση Α ελευθερώνεται με απομάκρυνση του EF-G

55 Το στάδιο του τερματισμού της σύνθεσης πρωτεϊνών Η σύνθεση ενός πρωτεϊνικού μορίου τερματίζεται όταν το 70 S συναντήσει ένα κωδίκιο τερματισμού UAA, UAG,UGA: αναγνωρίζονται από παράγοντες τερματισμού (RF) RF1: Αναγνωρίζει UAA ή UAG RF2: Αναγνωρίζει UAA ή UGA RF3: (πρωτεΐνη G) αλληλεπιδρά με RF1, RF2 και ριβοσώματα Οι πρωτεΐνες RF μεταφέρουν ένα μόριο H 2 O στο κέντρο της πεπτιδυλο-τρανσφεράσης Ευκαρυωτικός παράγοντας τερματισμού. Η αλληλουχία Gly-Gly-Gln υπάρχει και στα προκαρυωτικά στο άκρο της δομής, μεταφέρει ένα μόριο Η 2 Ο. Μοιάζει με άκρο trna

56 Ο μηχανισμός του τερματισμού Ο σχηματισμός πεπτιδικού δεσμού είναι σχετικά απλή χημική αντίδραση. Η υδρόλυσή του παρουσία ύδατος είναι πιο εύκολη. Στο κέντρο της πεπτιδυλο-τρανσφεράσης δεν υπάρχει Η 2 Ο. Η περιοχή αυτή της 50 S προστατεύει τον πεπτιδικό δεσμό από πρώιμη υδρόλυση. Οι RF μεταφέρουν Η 2 Ο προκαλώντας υδρόλυση του εστερικού δεσμού μεταξύ πεπτιδίου και trna και αποδέσμευση της πρωτεΐνης Ο RRF στα προκαρυωτικά προκαλεί αποσυναρμολόγηση του συμπλόκου με αποδέσμευση των 70 S, trna και mrna Ribosome Release Factor (RRF)

57 Συγκρίσεις μεταξύ σύνθεσης πρωτεϊνών στα προκαρυωτικά και ευκαρυωτικά Προκαρυωτικά Ευκαρυωτικά Ριβοσώματα Εναρκτήριο trna 30 S (16 S rrna) 40 S (18 S rrna) 50 S (23 S + 5 S) 60 S (28 S + 5 S + 5,8 S) fmet-trna f Met-tRNA i (ή Met-tRNA f ) Έναρξης κωδίκιο Επιμήκυνση Τερματισμός AUG ή GUG Shine-Dalgarno Πολλαπλές θέσεις IF1, IF2, IF3 mrna άμεσα διαθέσιμο EF-Tu, EF-Ts ΕF-G RF1, RF2, RF3, RRF Πάντοτε AUG 5 -κάλυμμα και σάρωση προς συνάντηση του 1 ου AUG/mRNA Πολλοί eucarioteif (eif) mrna μετά από επεξεργασία EF1a, EF1βγ EF2 erf1 erf3

58 Ο μηχανισμός έναρξης της πρωτεϊνοσύνθεσης στα ευκαρυωτικά Το κάλυμμα του 5 -άκρου του mrna αναγνωρίζεται από το 40 S με το εναρκτήριο Met-tRNA i Με τη βοήθεια του eif4e και υδρόλυση GTP Η διαδικασία σαρώματος ωθείται με τη δράση του eif4a μία ελικάση και την υδρόλυση ΑΤΡ Η αναγνώριση της θέσης έναρξης επιτυγχάνεται με το ζευγάρωμα του αντικωδικίου του trna i και του πρώτου AUG. Τότε συνδέεται και η 60 S.

59 Αντιβιοτικά που αναστέλλουν τη σύνθεση πρωτεϊνών

60 Η δράση της πουρομυκίνης Πουρομυκίνη: ανάλογο τελικού άκρου αμινοακυλο-trna Δεσμεύεται στη θέση Α ριβοσώματος και παρεμποδίζει την είσοδο αα-trna Σχηματίζει πεπτιδικό δεσμό με την αναπτυσσόμενη αλυσίδα

61 Η δράση της τοξίνης της διφθερίτιδας Διφθερίτιδα: τοξίνη του Corynebacterium diphtheriae από γονίδιο λυσιγόνου φάγου. Μερικά μg είναι θανατηφόρα Η τοξίνη με την είσοδο στο κύτταρο διασπάται σε Α 21 kd και Β 40 kd Ένα μόριο Α αρκεί να θανατώσει ένα κύτταρο Το Α καταλύει τη μεταφορά μιας ADP-ριβόζης στο διφθαμίδιο του παράγοντα μετατόπισης EF-2, ένα ασυνήθιστο αμινοξύ που σχηματίζεται μετα-μεταφραστικά με τροποποίηση μιας His διφθαμίδιο EF-2 με ADP-ριβόζη είναι ανενεργός

62 Τέλος Ενότητας

63 Χρηματοδότηση Το παρόν εκπαιδευτικό υλικό έχει αναπτυχθεί στα πλαίσια του εκπαιδευτικού έργου του διδάσκοντα. Το έργο «Ανοικτά Ακαδημαϊκά Μαθήματα στο Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων» έχει χρηματοδοτήσει μόνο τη αναδιαμόρφωση του εκπαιδευτικού υλικού. Το έργο υλοποιείται στο πλαίσιο του Επιχειρησιακού Προγράμματος «Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση» και συγχρηματοδοτείται από την Ευρωπαϊκή Ένωση (Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο) και από εθνικούς πόρους.

64 Σημειώματα

65 Σημείωμα Ιστορικού Εκδόσεων Έργου Το παρόν έργο αποτελεί την έκδοση 1.0. Έχουν προηγηθεί οι κάτωθι εκδόσεις: Έκδοση 1.0 διαθέσιμη εδώ.

66 Σημείωμα Αναφοράς Copyright Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων, Διδάσκοντες: Καθ. Δ. Τσουκάτος, Αναπλ. Καθ. Α.-Ε. Κούκκου. «Βιοχημεία ΙΙ. ΣΥΝΘΕΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ». Έκδοση: 1.0. Ιωάννινα Διαθέσιμο από τη δικτυακή διεύθυνση:

67 Σημείωμα Αδειοδότησης Το παρόν υλικό διατίθεται με τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Αναφορά Δημιουργού - Παρόμοια Διανομή, Διεθνής Έκδοση 4.0 [1] ή μεταγενέστερη. [1]