ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7. Σύνθεση και επεξεργασία του RNA. Ευάγγελος Κωλέττας

Transcript

1 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7 Σύνθεση και επεξεργασία του RNA Ευάγγελος Κωλέττας Αναπληρωτής Καθηγητής Μοριακής Κυτταρικής Βιολογίας Εργαστήριο Γενικής Βιολογίας, Τμήμα Ιατρικής Σχολή Επιστημών Υγείας, Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων και Συμβεβλημένο Μέλος ΔΕΠ Τμήμα Βιοϊατρικών Ερευνών Ινστιτούτο Μοριακής Βιολογίας & Βιοτεχνολογίας Ίδρυμα Τεχνολογίας & Έρευνας (ΒΕ-ΙΜΒΒ/ΙΤΕ), Ιωάννινα Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2011 Το κύτταρο-μια Μοριακή Προσέγγιση 1

2 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΣΤΗ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ 2

3 Το κεντρικό δόγμα δηλώνει ότι η πληροφορία μπορεί να διαιωνίζεται ή να μεταφέρεται από το ένα είδος νουκλεϊκού οξέος στο άλλο, αλλά η ροή της πληροφορίας προς την πρωτεΐνη είναι μονής κατεύθυνσης. 3

4 DNA και RNA: Τα νουκλεοσίδια (σάκχαρο+βάση) σχηματίζονται από την ένωση μιας αζωτούχου βάσης (A, T, C. G) με τη πεντόζη δεσοξυριβόζη στο DNA, ενώ στο RNA tα νουκλεοσίδια σχηματίζονται από την ένωση μιας αζωτούχου βάσης (A, T, C,U) με τη πεντόζη ριβόζη. Σε κάθε νουκλεοσίδιο η αζωτούχος βάση συνδέεται με τον 1' άνθρακα της πεντόζης. Στις πουρίνες το 9 άτομο (N) ενώνεται με το 1' άνθρακα της πεντόζης Στις πυριμιδίνες το 1 άτομο (N) ενώνεται με το 1' άνθρακα της πεντόζης. Τα νουκλεοτίδια σχηματίζονται με την ένωση του νουκλεοσιδίου στον 5' άνθρακα της πεντόζης με φωσφορικό οξύ 4

5 Το πρώτο στάδιο της έκφρασης ενός γονιδίου, η μεταγραφή του DNA σε RNA, αποτελεί το αρχικό επίπεδο όπου ρυθμίζεται η γονιδιακή έκφραση τόσο στα προκαρυωτικά όσο και στα ευκαρυωτικά κύτταρα. Τα RNA των ευκαρυωτικών κυττάρων τροποποιούνται με διάφορους τρόπους π.χ., αφαιρούνται τα ιντρόνια με το μάτισμα προκειμένου το πρωτογενές μετάγραφο να αποκτήσει τη λειτουργική του μορφή, και τροποποιούνται τα 5 και 3 άκρα. Τα διάφορα είδη του RNΑ έχουν συγκεκριμένο ρόλο στα κύτταρα: 1. Αγγελιαφόρα RNA (mrna): λειτουργούν ως μήτρες για τη σύνθεση πρωτεϊνών 2. Ριβοσωμικά RNA (rrna) και Μεταφορικά RNA (trna): συμμετέχουν στη μετάφραση του mrna. 3. Ορισμένα μικρά RNA συμμετέχουν: - στη ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων - στο μάτισμα του mrna - στην ωρίμανση του rrna και - στη διαλογή των πρωτεϊνών στους ευκαρυώτες. Π.χ. Μικρά μη κωδικά μόρια RNA (mirna) - ρυθμιστές της έκφρασης των γονιδίων στα ευκαρυωτικά κύτταρα. Το τελικό στάδιο της έκφρασης των γονιδίων, η μετάφραση του mrna σε πρωτεΐνη. 5

6 Ένα γονίδιο κωδικοποιεί ένα RNA το οποίο μπορεί να κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη. Το γονίδιο μπορεί να εκτείνεται πέρα από τα όρια της αλληλουχίας που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη. 6

7 Η λειτουργία της RNA πολυμεράσης είναι να μεταγράφει μια αλυσίδα δίκλωνου DNA σε RNA. Η μεταγραφή δημιουργεί ένα RNA το οποίο είναι συμπληρωματικό με την αλυσίδαμήτρα του DNA και έχει την ίδια αλληλουχία με την κωδική αλληλουχία του DNA. Η μετάφραση ερμηνεύει κάθε τριπλέτα βάσεων σε ένα αμινοξύ. Τρεις στροφές της δίκλωνης έλικας του DNA περιέχουν 30 bp, οι οποίες κωδικοποιούν 10 αμινοξέα. 7

8 Η σύνθεση του RNA από το DNA. Οι δύο αλυσίδες του DNA ξετυλίγονται και η μία χρησιμοποιείται ως μήτρα για τη σύνθεση μιας συμπληρωματικής αλυσίδας RNA. Η σύνθεση του RNA γίνεται στην κατεύθυνση 5 προς 3. 8

9 Μια μεταγραφική μονάδα μεταγράφεται σε ένα ενιαίο RNA. Στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς η μεταγραφή διαχωρίζεται από τη μετάφραση η μεταγραφή γίνεται στον πυρήνα, ενώ η μετάφραση στο κυτταρόπλασμα. 9

10 Μεταγραφή ονομάζεται η διαδικασία σύνθεσης του RNA, την οποία καταλύει το ένζυμο RNA πολυμεράση χρησιμοποιώντας ως μήτρα το DNA. Η σύνθεση του RNA, όπως σχεδόν όλες οι βιολογικές αντιδράσεις/διεργασίες πολυμερισμού πραγματοποιείται σε 3 στάδια: έναρξη, επιμήκυνση και τερματισμός. Η RNA πολυμεράση στη διεργασία αυτή έχει πολλαπλές λειτουργίες: 1. Αναζητά στο DNA θέσεις έναρξης, που ονομάζονται επίσης θέσεις προαγωγέων (υποκινητών) ή απλώς προαγωγείς (υποκινητές). Π.χ., το DNA της E. coli έχει ~2000 θέσεις υποκινητών στο γονιδίωμά της μεγέθους 4,8x106 bp. Επειδή οι αλληλουχίες αυτές βρίσκονται στο ίδιο μόριο DNA με τα μεταγραφόμενα γονίδια, ονομάζονται στοιχεία με δράση cis. 2. Ξετυλίγει ένα μικρό τμήμα δίκλωνου ελικοειδούς DNA για να δημιουργήσει ένα μονόκλωνο εκμαγείο DNA από το οποίο παίρνει οδηγίες. Σε αντίθεση προς τη σύνθεση του DNA, η σύνθεση του RNA μπορεί να αρχίσει de novo, χωρίς να χρειάζεται εκκινητής. 3. Επιλέγει το σωστό τριφωσφορικό ριβονουκλεοσίδιο και καταλύει τον σχηματισμό ενός φωσφοδιεστερικού δεσμού. Η διεργασία αυτή επαναλαμβάνεται πολλές φορές καθώς το ένζυμο μετακινείται προς τη μία κατεύθυνση κατά μήκος του εκμαγείου DNA. Η RNA πολυμεράση είναι ένα εντελώς επεξεργαστικό ένζυμο δηλαδή, ένα μεταγράφημα συντίθεται από την αρχή μέχρι το τέλος από ένα μόνο μόριο RNA πολυμεράσης. 4. Ανιχνεύει σήματα τερματισμού τα οποία προσδιορίζουν το πού τελειώνει ένα μεταγράφημα. 5. Αλληλεπιδρά με ενεργοποιητικές και κατασταλτικές πρωτεΐνες, οι οποίες προσαρμόζουν την ταχύτητα της έναρξης μεταγραφής για πολύ μεγάλο και δυναμικό εύρος. Οι πρωτεΐνες αυτές, οι οποίες παίζουν έναν πιο σημαντικό ρόλο στα ευκαρυωτικά παρά στα προκαρυωτικά, ονομάζονται παράγοντες μεταγραφής ή στοιχεία με δράση trans. Η γονιδιακή έκφραση ελέγχεται κυρίως στο επίπεδο της μεταγραφής. Η θεμελιώδης αντίδραση της σύνθεσης του RNA είναι ο σχηματισμός ενός φωσφοδιεστερικού δεσμού μεταξύ του τελευταίου και του εισερχόμενου νουκλεοτιδίου. 10

11 Η ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ ΣΤΟΥΣ ΠΡΟΚΑΡΥΩΤΙΚΟΥΣ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥΣ 11

12 RNA πολυμεράση (RNA Pol) και Μεταγραφή: - Κύριο ένζυμο για τη σύνθεση του RNΑ - Καταλύει τον πολυμερισμό 5'-τριφωσφορικών ριβονουκλεοσιδίων (ΝΤΡ, Nucleoside Triphosphates), με τη σειρά που υπαγορεύεται από ένα μόριο DNA το οποίο χρησιμοποιείται ως μήτρα. - Η RNA πολυμεράση, όπως και η DNA πολυμεράση, καταλύει την επιμήκυνση των αλυσίδων RNA με κατεύθυνση 5' προς 3'. - Αντίθετα με DNA πολυμεράση, η RNA πολυμεράση δε χρειάζεται έναν προϋπάρχοντα εκκινητή για έναρξη σύνθεσης του RNΑ - Η μεταγραφή αρχίζει de novo από ειδικές περιοχές στην αρχή των γονιδίων, με τον σχηματισμό φωσφοδιεστερικού δεσμού ανάμεσα στα δύο πρώτα ΝΤΡ του υπό σύνθεση μορίου RNΑ. Η διαδικασία της έναρξης είναι ιδιαίτερα σημαντική, επειδή αποτελεί βασικό στάδιο για τη ρύθμιση της μεταγραφής. ΕΙΚΟΝΑ 7.1: Η RNA πολυμεράση (RNA polymerase) της E. coli. Το πλήρες ένζυμο ή ολοένζυμο αποτελείται από 6 υπομονάδες: 2α, 1β, 1β, 1ω και 1σ. Η υπομονάδα σ συνδέεται πιο χαλαρά και έτσι μπορεί να αποσπαστεί σχετικά εύκολα από τις υπόλοιπες υπομονάδες, που συνιστούν τη λεγόμενη κεντρική πολυμεράση, α2ββ ω (core polymerase). 12

13 Υψηλής ανάλυσης μελέτες της δομής της βακτηριακής RNA πολυμεράσης έδειξαν ότι οι υπομονάδες β και β' σχηματίζουν μια δομή με σχήμα δαγκάνας καβουριού που «γραπώνει» τη μήτρα DNA. Το ενεργό κέντρο της RNA πολυμεράσης εντοπίζεται σε έναν εσωτερικό δίαυλο που σχηματίζεται μεταξύ των υπομονάδων β και β' και χωράει περίπου 20 ζεύγη βάσεων DNA. (είναι η τρίτη μεγαλύτερη υπομονάδα της RNAP) υπομονάδες α (rpoa) * υπομονάδες ω (rpoz) (είναι η μικρότερη υπομονάδα και σταθεροποιεί την RNAP στους υποκινητές) υπομονάδα β (rpob) (είναι η δεύτερη μεγαλύτερη υπομονάδα και περιέχει μέρος του ενεργού κέντρου της RNAP) υπομονάδα β (rpoc) (είναι η μεγαλύτερη υπομονάδα και περιέχει μέρος του ενεργού κέντρου της RNAP) ΕΙΚΟΝΑ 7.5: Δομή της βακτηριακής RNA πολυμεράσης. Οι υπομονάδες α της πολυμεράσης απεικονίζονται με σκούρο πράσινο και ανοιχτό πράσινο χρώμα. Με μπλε χρώμα απεικονίζεται η υπομονάδα β, με ροζ χρώμα η υπομονάδα β και με κίτρινο χρώμα η υπομονάδα ω. 13

14 Η κεντρική RNA πολυμεράση μπορεί να καταλύσει τον πολυμερισμό των ΝΤΡ στο RNΑ, που αποδεικνύει ότι η υπομονάδα σ δεν είναι απαραίτητη για τη βασική καταλυτική ενεργότητα του ενζύμου. Ωστόσο, απουσία της σ, η κεντρική πολυμεράση δεν προσδένεται με ειδικότητα, όπως συμβαίνει φυσιολογικά στις αλληλουχίες του DNA που σηματοδοτούν την έναρξη της μεταγραφής. Επομένως, η υπομονάδα σ είναι απαραίτητη για την αναγνώριση των σωστών περιοχών έναρξης της μεταγραφής - κρίσιμο στοιχείο της μεταγραφής, επειδή η σύνθεση ενός RNΑ, προκειμένου να είναι λειτουργικό, πρέπει να ξεκινάει από την αρχή του αντίστοιχου γονιδίου. Οι RNA πολυμεράσες των ευβακτηρίων αποτελούνται από 4 είδη υπομονάδων: οι α, β και β έχουν σχετικά σταθερά μεγέθη σε διάφορα είδη βακτηρίων, ενώ η σ ποικίλλει σε μεγαλύτερο βαθμό. 14

15 Τα περισσότερα βακτήρια, διαθέτουν αρκετές υπομονάδες σ, καθεμία από τις οποίες κατευθύνει την RNA πολυμεράση σε διαφορετικές περιοχές έναρξης της μεταγραφής (δηλ. σε διαφορετικά γονίδια). Τα βακτήρια, χρησιμοποιώντας εναλλακτικές υπομονάδες σ κάτω από διαφορετικές (περιβαλλοντικές) συνθήκες (π.χ. ανάλογα με τη διαθεσιμότητα των θρεπτικών συστατικών, θερμοκρασία), ενεργοποιούν διαφορετικές ομάδες γονιδίων τους. Εκτός από τον σ70, η E. coli έχει αρκετούς παράγοντες σ που επάγονται σε συγκεκριμένες περιβαλλοντικές συνθήκες. Ο εκθέτης στο όνομα του παράγοντα υποδηλώνει τη μάζα του. Περίοδος ασιτίας & στατική φάση αύξησης Υψηλές θερμοκρασίες >370C Πάρα πολύ υψηλές θερμοκρασίες 15

16 σ70(rpod) ή σa (The housekeeping σ factor): Ο παράγοντας σ βασικών λειτουργιών (κύριος παράγοντας σ) εμπλέκεται στη μεταγραφή των περισσοτέρων γονιδίων στα βακτηριακά κύτταρα που πολλαπλασιάζονται και αυξάνονται, έτσι ώστε να διατηρούνται ενεργά τα απαραίτητα γονίδια και οι μεταβολικές πορείες. Τα γονίδια που αναγνωρίζονται από το σ70 περιέχουν στους υποκινητές τους τις συγκαταβατικές αλληλουχίες (στοιχεία -10 και -35). σ38(rpos) (Starvation/stationary phase σ factor): Παράγοντας σ που εμπλέκεται στη μεταγραφή γονιδίων σε περίοδο ασιτίας και κατά την στατική φάση αύξησης. σ32 (RpoH) (The heat shock sigma factor): Επάγεται όταν τα βακτήρια εκτίθενται σε υψηλές θερμοκρασίες (>370C). Ως αποτέλεσμα της επαγωγής της έκφρασης του, ο σ32 δεσμεύεται στην κεντρική πολυμεράση, η οποία με τη σειρά της μεταγράφει γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες του θερμικού στρες (heat shock proteins), που θα βοηθήσουν τα βακτήρια να επιβιώσουν σε υψηλότερες θερμοκρασίες. Μερικές απ αυτές τις πρωτεΐνες που επάγονται από την ενεργοποίηση του σ32 είναι πρωτεΐνεςσυνοδοί (chaperones), πρωτεάσες και ένζυμα επιδιόρθωσης του DNA. σ24 (RpoE) ή σε (The extracytoplasmic/extreme heat stress sigma factor): Ο παράγοντας σ24 επάγεται στο κυτταρόπλασμα όταν τα βακτήρια εκτίθενται σε πάρα πολύ υψηλές θερμοκρασίες. σ54 (RpoN) (The nitrogen-limitation sigma factor): Επάγεται όταν υπάρχει έλλειψη αζώτου, και συμβάλλει στη μεταγραφή γονιδίων που εμπλέκονται στο μεταβολισμό του αζώτου. σ28 (RpoF) (The flagellar σ factor): Συμβάλλει στη μεταγραφή μαστιγιακών γονιδίων. 16

17 Η περιοχή του DNA όπου προσδένεται η RNA πολυμεράση για να αρχίσει τη μεταγραφή ενός γονιδίου ονομάζεται υποκινητής (promoter). Η περιοχή που βρίσκεται ανοδικά (προς το 5') της θέσης έναρξης της μεταγραφής περιέχει 2 μικρής έκτασης τμήματα με κοινή αλληλουχία σε πολλά γονίδια. Πρόκειται για 2 εξανουκλεοτίδια, που ονομάζονται στοιχεία -10 και -35. Η ονομασία τους υποδηλώνει τη θέση τους σε σχέση με το σημείο έναρξης της μεταγραφής, το οποίο ορίζεται ως +1. Η πρότυπη αλληλουχία του στοιχείου -10 είναι TATAAT, ενώ του στοιχείου -35 είναι TTGACA. Όμως, σε διαφορετικούς υποκινητές, οι αλληλουχίες των στοιχείων -10 και -35 δεν είναι πανομοιότυπες, είναι όμως αρκετά όμοιες bp 5-9 bp ΕΙΚΟΝΑ 7.2: Οι χαρακτηριστικές αλληλουχίες των υποκινητών της E. coli. Οι υποκινητές της E. coli φέρουν δύο χαρακτηριστικές αλληλουχίες οι οποίες βρίσκονται 10 και 35 ζεύγη βάσεων ανοδικά από τη θέση έναρξης της μεταγραφής (+1). Οι πρότυπες αλληλουχίες που υποδεικνύονται εδώ αντιστοιχούν στα νουκλεοτίδια που συναντώνται συχνότερα σε κάθε θέση με βάση τη σύγκριση των αντίστοιχων αλληλουχιών από διαφορετικούς υποκινητές. 17

18 Πειραματικά δεδομένα υποστηρίζουν τον λειτουργικό ρόλο των στοιχείων -10 και -35 των υποκινητών: 1.Τα γονίδια των οποίων οι υποκινητές διαφέρουν σημαντικά από τις πρότυπες αλληλουχίες μεταγράφονται λιγότερο αποτελεσματικά από αυτά με υποκινητές που εμφανίζουν μεγαλύτερη ομολογία προς τις πρότυπες αλληλουχίες. Οι υποκινητές διαφέρουν σημαντικά ως προς τη δραστικότητά τους. Γονίδια με ισχυρούς υποκινητές μεταγράφονται πολύ συχνά κάθε 2'' στην E. coli. Αντιθέτως, γονίδια με πολύ ασθενείς υποκινητές μεταγράφονται μία φορά κάθε ~10'. Οι περιοχές -10 και -35 των περισσότερων ισχυρών υποκινητές έχουν αλληλουχίες που αντιστοιχούν αρκετά στις συγκαταβατικές (ομόφωνες) αλληλουχίες, ενώ οι ασθενείς υποκινητές τείνουν να φέρουν πολλές αντικαταστάσεις βάσεων στις θέσεις αυτές. 2. Η εισαγωγή μεταλλάξεων στις πρότυπες αλληλουχίες -35 και -10 επηρεάζει σημαντικά τη λειτουργία του υποκινητή. Η μετάλλαξη ακόμη και μίας βάσης είτε στην 10 ή στην -35 αλληλουχία μπορεί να μειώσει τη δραστικότητα του υποκινητή. 3. Η απόσταση μεταξύ των συντηρημένων αυτών αλληλουχιών είναι επίσης σημαντική. Ένας διαχωρισμός τους σε έκταση 17 νουκλεοτιδίων είναι ο βέλτιστος. Επομένως, η αποτελεσματικότητα ή η ισχύς μιας αλληλουχίας υποκινητές χρησιμεύει στη ρύθμιση της μεταγραφής. Ρυθμιστικές πρωτεΐνες οι οποίες δεσμεύονται σε ειδικές αλληλουχίες κοντά σε θέσεις υποκινητές και οι οποίες αλληλεπιδρούν με την RNA πολυμεράση επηρεάζουν επίσης σημαντικά τη συχνότητα μεταγραφής πολλών γονιδίων. 4. Η σύνδεση της RNA Pol στις περιοχές αυτές των υποκινητών διαπιστώθηκε με πειράματα ιχνηλάτησης του DNA (DNA footprinting), που χρησιμοποιείται για τον εντοπισμό των περιοχών πρόσδεσης πρωτεϊνών στο DNA 18

19 ΕΙΚΟΝΑ 7.3: Ιχνηλάτηση του DNA. Μια αρχική ποσότητα του υπό έλεγχο τμήματος DNA με ραδιοσημασμένο το ένα του άκρο χωρίζεται στα δύο. Το ένα δείγμα επωάζεται με την πρωτεΐνη (π.χ. RNA Pol) που αναγνωρίζει μια συγκεκριμένη αλληλουχία του τμήματος DNA και προσδένεται σε αυτή. Κατόπιν, τα 2 δείγματα υφίστανται μερική πέψη με DNάση, ώστε κάθε μόριο να κόβεται κατά μέσο όρο σε μία θέση. Στο δείγμα που έχει επωαστεί με την πρωτεΐνη, η περιοχή του DNA στην οποία αυτή συνδέεται προστατεύεται από τη δράση της DNάσης και δεν κόβεται. Στη συνέχεια, τα σύμπλοκα DNA-πρωτεΐνης υφίστανται αποδιάταξη και τα μεγέθη των ραδιοσημασμένων μορίων που έχουν προκύψει από την πέψη με την DNάση προσδιορίζονται με ηλεκτροφόρηση των 2 δειγμάτων σε πήκτωμα ακρυλαμιδίου. Στο δείγμα που επωάστηκε με την πρωτεΐνη απουσιάζουν τα κομμάτια του DNA που προκύπτουν από πέψη με την DNάση στην περιοχή πρόσδεσης της πρωτεΐνης. 19

20 Τα πειράματα κατέδειξαν ότι η RNA πολυμεράση (RNA Pol) προσδένεται σε μια περιοχή των γονιδίων μήκους ~60 bp, που εκτείνεται από τη θέση -40 έως τη θέση +20 (δηλ. από 40 nt ανοδικά μέχρι 20 nt καθοδικά της θέσης έναρξης της μεταγραφής). Η υπομονάδα σ προσδένεται ειδικά στις αλληλουχίες και των 2 περιοχών -35 και -10, υποδηλώνοντας τη σημασία των στοιχείων αυτών στη λειτουργία του υποκινητή. Μερικοί υποκινητές της Ε. coli διαθέτουν μια τρίτη αλληλουχία, που βρίσκεται ανοδικά του στοιχείου -35 και λειτουργεί ως ειδική περιοχή πρόσδεσης για την υπομονάδα α της RNA Pol. 20

21 ΕΙΚΟΝΑ 7.4: Η μεταγραφή στην E. coli. Η RNA Pol αρχικά προσδένεται χωρίς ειδικότητα στο DNA και μετακινείται κατά μήκος του μορίου μέχρι η υπομονάδα σ να προσδεθεί στα στοιχεία -35 και 10, σχηματίζοντας το λεγόμενο κλειστό σύμπλοκο υποκινητή. Κατόπιν, η πολυμεράση ξετυλίγει βάσεις του DNA γύρω από τη θέση έναρξης της μεταγραφής (-12 ως +2) οπότε σχηματίζεται το λεγόμενο ανοικτό σύμπλοκο υποκινητή, στο οποίο η μία αλυσίδα του μονόκλωνου πλέον DNA λειτουργεί ως μήτρα για τη μεταγραφή, και ξεκινάει ο πολυμερισμός ελεύθερων ΝΤΡ. Η μεταγραφή ξεκινά με τη σύνδεση μέσω φωσφοδιεστερικού δεσμού 2 ελεύθερων ΝΤΡ. Μετά την προσθήκη 10 nt, η υπομονάδα σ αποδεσμεύεται από την κεντρική πολυμεράση, που αρχίζει να κινείται καθοδικά σε σχέση με τον υποκινητή επιμηκύνοντας το υπό σύνθεση μόριο RNA. Έτσι ξετυλίγει την περιοχή που βρίσκεται μπροστά της και τυλίγει ξανά την περιοχή που βρίσκεται πίσω της. Η σύνθεση του RNA συνεχίζεται μέχρι η RNA Pol να συναντήσει ένα σήμα τερματισμού, οπότε το RNA αποδεσμεύεται από την RNA Pol η οποία αποσυνδέεται από τη μήτρα DNA. 21

22 Η RNA Pol ξετυλίγει ~17 βάσεις του εκμαγείου DNA. Η RNAP χωρίς τον παράγοντα σ (κεντρική πολυμεράση) μπορεί να αρχίσει τη μεταγραφή (σύνθεση RNA) από τα άκρα του DNA, εγκοπές, κενά διαστήματα, και από περιοχές μονόκλωνου DNA. H επιμήκυνση πραγματοποιείται στις φυσαλίδες μεταγραφής που μετακινούνται κατά μήκος του εκμαγείου DNA: Σχηματική αναπαράσταση της φυσαλίδας μεταγραφής κατά την επιμήκυνση ενός μεταγραφήματος RNA. Το δίκλωνο DNA ξετυλίγεται στο πρόσθιο άκρο της RNA πολυμεράσης και ξανατυλίγεται στο οπίσθιο. Το υβρίδιο RNA-DNA περιστρέφεται κατά την επιμήκυνση. 22

23 Υπάρχουν δύο εναλλακτικοί μηχανισμοί τερματισμού της μεταγραφής στην Ε. Coli Ο απλούστερος και πιο κοινός τύπος σήματος τερματισμού αποτελείται από μια ανάστροφα επαναλαμβανόμενη, πλούσια σε GC αλληλουχία που ακολουθείται από ~7 νουκλεοτίδια αδενίνης (Α) στην αλυσίδα-μήτρα. Η παρουσία καταλοίπων (Α) καθοδικά των ανάστροφων επαναλήψεων θεωρείται ότι διευκολύνει τον διαχωρισμό του RNA από τη μήτρα του, επειδή μεταξύ A-U αναπτύσσονται 2 μόνο δεσμοί-η αντί των τριών που αναπτύσσονται μεταξύ G-C. Εναλλακτικά, η μεταγραφή ορισμένων γονιδίων σταματά από πρωτεΐνες τερματισμού Rho που προσδένονται στο RNA. Η πρόσδεση των Rho γίνεται σε τμήματα (>60 νουκλεοτίδια) μονόκλωνου RNA. Επειδή τα βακτηριακά mrna συνδέονται με τα ριβοσώματα και μεταφράζονται ενώ ακόμα εξελίσσεται η μεταγραφή τους, τέτοια μεγάλα μονόκλωνα τμήματα υπάρχουν μόνο στην 3' μη μεταφραζόμενη περιοχή των mrna. Άρα: Rho-ανεξάρτητος και Rho-εξαρτώμενος μηχανισμός τερματισμού της μεταγραφής 23

24 * Παλινδρομική αλληλουχία πλούσια σε GC που ακολουθείται από μια αλληλουχία πλούσια σε ζεύγη AT. Το μεταγράφημα του RNA αυτής της παλινδρομικής αλληλουχίας του DNA είναι αυτοσυμπληρωματικό. Επομένως, οι βάσεις του ζευγαρώνουν σχηματίζοντας μια δομή φουρκέτας με ένα βραχίονα και μια θηλιά, μια δομή που ευνοείται από την υψηλή περιεκτικότητα καταλοίπων G & C. Τα ζεύγη GC είναι πιο σταθερά από τα ζεύγη AT λόγω του επιπλέον δεσμού υδρογόνου που περιέχουν. Αυτή η σταθερή δομή φουρκέτας ακολουθείται από μια αλληλουχία 4 ή περισσότερων καταλοίπων U, που είναι επίσης κρίσιμα για τον τερματισμό. Το μεταγράφημα του RNA τελειώνει μέσα ή λίγο μετά από αυτά τα κατάλοιπα. ΕΙΚΟΝΑ 7.6: Τερματισμός της μεταγραφής. Ο τερματισμός της μεταγραφής σηματοδοτείται από μια ανάστροφα επαναλαμβανόμενη αλληλουχία πλούσια σε GC, η οποία ακολουθείται από ~7 νουκλεοτίδια αδενίνης (Α) στην αλυσίδα-μήτρα. Η μεταγραφή της ανάστροφης επανάληψης οδηγεί στον σχηματισμό μιας δομής στελέχους-βρόχου στο μόριο του RNA, που αποσταθεροποιεί τη 24 σύνδεση του μεταγράφου με τη μήτρα DNA προκαλώντας την απελευθέρωσή του.

25 Ο παράγοντας Rho (ρ) είναι μια απαραίτητη πρωτεΐνη στα βακτήρια E. coli, όπου λειτουργεί ως παράγοντας τερματισμού της μεταγραφής. Ο παράγοντας Rho είναι μια εξαμερής πρωτεΐνη πανομοιότυπων υπομονάδων που σχηματίζουν δακτύλιο με ΜΒ 275 στα βακτήρια E. coli, ο οποίος έχει ενεργότητα ATPάσης και ελικάσης. Οι αλληλουχίες τερματισμού που αναγνωρίζονται από τον παράγοντα Rho είναι πλούσιες σε κυτοσίνες (C), όπως θέσεις ruta και rutb. 25

26 Καταστολείς και αρνητικός έλεγχος της μεταγραφής Η μεταγραφή ρυθμίζεται στα στάδια της έναρξης και της επιμήκυνσης, αλλά η μεταγραφική ρύθμιση στα βακτήρια συμβαίνει κυρίως στο στάδιο της έναρξης. Οι πρώτες μελέτες της γονιδιακής ρύθμισης στην Ε. coli έγιναν από τον Francois Jacob και τον Jacques Monod (1950). Nobel Prize in Physiology or Medicine 1965: François Jacob, André Lwoff and Jacques Monod "for their discoveries concerning genetic control of enzyme and virus synthesis". ΕΙΚΟΝΑ 7.7: Μεταβολισμός της λακτόζης. Η β-γαλακτοζιδάση καταλύει την υδρόλυση της λακτόζης σε γλυκόζη και γαλακτόζη. Η λακτόζη επάγει τη σύνθεση ενζύμων που συμμετέχουν στον μεταβολισμό της. Εκτός από τη β-γαλακτοζιδάση που υδρολύει τη λακτόζη σε γαλακτόζη και γλυκόζη, στην αξιοποίηση της λακτόζης συμμετέχουν τα προϊόντα δύο ακόμα στενά συνδεδεμένων γονιδίων: της περμεάσης της λακτόζης, που μεταφέρει τη λακτόζη μέσα στο κύτταρο, και της τρανσακετυλάσης, η οποία θεωρείται ότι απενεργοποιεί τους τοξικούς θειογαλακτοζίτες που μεταφέρονται στο κύτταρο μαζί με τη λακτόζη από την περμεάση. 26

27 Τα γονίδια που κωδικοποιούν τη β-γαλακτοζιδάση (z), την περμεάση (y) και την τρανσακετυλάση (a) εκφράζονται ως μια μονάδα, που ονομάζεται οπερόνιο lac (Lac operon). Οι Jacob και Monod, μελετώντας μεταλλάγματα που αδυνατούν να ρυθμίσουν την έκφραση αυτών των γονιδίων, εντόπισαν 2 διαφορετικούς γενετικούς τόπους: τους χειριστή ο (operator) και καταστολέα i, (inhibitor) που ελέγχουν την έκφραση του οπερονίου. Ο χειριστής είναι ένα τμήμα DNA 20 bp που βρίσκεται πριν από τη θέση έναρξης της μεταγραφής του οπερονίου. Το γονίδιο i, που βρίσκεται σε κάποια άλλη περιοχή του γονιδιώματος, κωδικοποιεί μια (κατασταλτική) πρωτεΐνη που ρυθμίζει τη μεταγραφή του οπερονίου μέσω της πρόσδεσης της στον χειριστή. Τα μεταλλάγματα που αποτυγχάνουν να συνθέσουν λειτουργικό προϊόν του γονιδίου i εκφράζουν το οπερόνιο ιδιοστατικά (ανεξαρτήτως συνθηκών), δηλ. ακόμα και όταν δεν υπάρχει διαθέσιμη λακτόζη. Αυτό αποδεικνύει ότι το φυσιολογικό προϊόν του γονιδίου i είναι ένας καταστολέας (repressor), που αναστέλλει τη μεταγραφή όταν προσδένεται στον γενετικό τόπο ο. Η προσθήκη λακτόζης οδηγεί στην επαγωγή του οπερονίου, γιατί η λακτόζη προσδένεται στον καταστολέα και δεν του επιτρέπει να προσδεθεί στο DNA του χειριστή. (Πειράματα ιχνηλάτησης του DNA). 27

28 * ΕΙΚΟΝΑ 7.8: Αρνητική ρύθμιση του οπερονίου lac. Το γονίδιο i κωδικοποιεί έναν καταστολέα ο οποίος, όταν δεν υπάρχει λακτόζη (επάνω τμήμα της εικόνας), προσδένεται στον χειριστή (ο) και εμποδίζει την RNA πολυμεράση να μεταγράψει τα τρία δομικά γονίδια του οπερονίου (z: βγαλακτοζιδάση, y: περμεάση και a: τρανσακετυλάση). Όταν υπάρχει λακτόζη (κάτω τμήμα της εικόνας), αυτή προσδένεται στον καταστολέα και τον εμποδίζει να προσδεθεί στον χειριστή, με αποτέλεσμα την επαγωγή της έκφρασης του οπερονίου. P = υποκινητής, Pol = RNA πολυμεράση. 28

29 Από τη μελέτη του οπερονίου της λακτόζης προκύπτει μια κεντρική αρχή σχετικά με τη γονιδιακή ρύθμιση που ισχύει τόσο στα προκαρυωτικά όσο και στα ευκαρυωτικά κύτταρα: Ο έλεγχος της μεταγραφής επιτυγχάνεται μέσω της αλληλεπίδρασης ρυθμιστικών πρωτεϊνών με ειδικές ρυθμιστικές αλληλουχίες του DNA. Οι ρυθμιστικές αλληλουχίες του DNA, όπως ο χειριστής, ονομάζονται cisδραστικά ρυθμιστικά στοιχεία (cis-acting control elements), επειδή επηρεάζουν την έκφραση συνδεδεμένων γονιδίων που βρίσκονται στο ίδιο μόριο DNA με αυτές. Οι ρυθμιστικές πρωτεΐνες, όπως ο καταστολέας, ονομάζονται trans-δραστικοί παράγοντες (trans-acting factors), επειδή μπορούν να επηρεάζουν την έκφραση γονιδίων που βρίσκονται σε διαφορετικά χρωμοσώματα του κυττάρου. Το οπερόνιο lac αποτελεί παράδειγμα αρνητικού ελέγχου, καθώς η πρόσδεση του καταστολέα εμποδίζει τη μεταγραφή. Αυτό ωστόσο δεν αποτελεί το μοναδικό δυνατό σενάριο. Πολλοί trans-δραστικοί παράγοντες λειτουργούν ως ενεργοποιητές και όχι ως αναστολείς της μεταγραφής. 29

30 Το καλύτερο παράδειγμα θετικού ελέγχου στην Ε. coli αφορά την επίδραση της γλυκόζης στην έκφραση γονιδίων που κωδικοποιούν ένζυμα του καταβολισμού (άλλων σακχάρων (όπως της λακτόζης). Τα σάκχαρα αυτά αποτελούν εναλλακτικές πηγές άνθρακα και ενέργειας. Επειδή όμως η γλυκόζη αποτελεί την προτιμώμενη από το κύτταρο πηγή άνθρακα και ενέργειας, όταν είναι διαθέσιμη δε συντίθενται τα ένζυμα που συμμετέχουν στον καταβολισμό άλλων σακχάρων. Αν η Ε. coli αναπτύσσεται σε θρεπτικό μέσο που περιέχει και γλυκόζη και λακτόζη, δεν επάγεται το οπερόνιο lac και τα βακτήρια χρησιμοποιούν μόνο τη γλυκόζη. Επομένως, η παρουσία της γλυκόζης εμποδίζει την επαγωγή του οπερονίου lac ακόμα και παρουσία του επαγωγέα του (της λακτόζης). Αυτό ονομάζεται καταβολική καταστολή, και επιτυγχάνεται με τη βοήθεια ενός συστήματος θετικού ελέγχου, που συνδέεται με το ενδοκυτταρικό επίπεδο του κυκλικού AMP (camp, cyclic AMP). 30

31 ΕΙΚΟΝΑ 7.9: Θετική ρύθμιση του οπερονίου lac από τη γλυκόζη. Όταν τα επίπεδα γλυκόζης είναι μειωμένα, ενεργοποιείται η αδενυλική κυκλάση, που μετατρέπει το ATP σε camp. Το camp προσδένεται στον ενεργοποιητή καταβολικών γονιδίων (CAP) και διεγείρει την πρόσδεση του σε ρυθμιστικές αλληλουχίες διαφόρων οπερονίων. Τα οπερόνια που ενεργοποιούνται από τον CAP κωδικοποιούν ένζυμα του μεταβολισμού άλλων, πέραν της γλυκόζης, εναλλακτικών σακχάρων, για παράδειγμα της λακτόζης. Η πρωτεΐνη CAP διευκολύνει την πρόσδεση της RNA πολυμεράσης στον υποκινητή μέσω αλληλεπιδράσεων που αναπτύσσει με την υπομονάδα α του ενζύμου. Όταν τα επίπεδα της γλυκόζης είναι χαμηλά και κατά συνέπεια τα επίπεδα του camp υψηλά, η CAP μπορεί να προσδεθεί στο οπερόνιο lac περίπου 60 βάσεις ανοδικά της θέσης έναρξης της μεταγραφής. Κατόπιν, η CAP αλληλεπιδρά με την υπομονάδα α της RNA πολυμεράσης και ενεργοποιεί τη μεταγραφή διευκολύνοντας την πρόσδεση του ενζύμου στον υποκινητή. 31

32 Η ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ ΣΤΟΥΣ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΟΥΣ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥΣ 32

33 Η μεταγραφή βασίζεται στους ίδιους θεμελιώδεις μηχανισμούς σε όλα τα κύτταρα Είναι πιο πολύπλοκη στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς απ' ότι στα βακτήρια. Αυτό οφείλεται σε 3 διαφορές ανάμεσα τους: 1. Ενώ στα βακτήρια όλα τα γονίδια μεταγράφονται από μια κεντρική RNA πολυμεράση, τα ευκαρυωτικά κύτταρα διαθέτουν διαφορετικές RNA πολυμεράσες που μεταγράφουν διαφορετικά είδη γονιδίων. 2. Οι ευκαρυωτικές RNA πολυμεράσες πρέπει να αλληλεπιδράσουν με ποικίλες άλλες πρωτεΐνες στο πλαίσιο της έναρξης και της ρύθμισης της μεταγραφής. 3. Σε αντίθεση με το προκαρυωτικά, το ευκαρυωτικά DNA είναι οργανωμένο σε χρωματίνη και σε μεγάλο βαθμό η μεταγραφική ενεργότητα των ευκαρυωτικών γονιδίων ρυθμίζεται στο επίπεδο της δομής της χρωματίνης τους. Η αυξημένη πολυπλοκότητα της ευκαρυωτικής μεταγραφής προσφέρει επιπλέον δυνατότητες ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης, γεγονός που διευκολύνει τη δημιουργία πολλών διαφορετικών κυτταρικών τύπων με χαρακτηριστικά πρότυπα γονιδιακής έκφρασης στους πολυκύτταρους οργανισμούς. 33

34 ΠΙΝΑΚΑΣ 7.1: Κατηγορίες γονιδίων που μεταγράφονται από τις ευκαρυωτικές RNA πολυμεράσες. *Μερικά μικρά πυρηνικά RNA (small nuclear; snrna) και μικρά κυτταροπλασματικά (small cytoplasmic; scrna μεταγράφονται από την RNA Pol II, ενώ άλλα μεταγράφονται από την RNA Pol IIΙ. **Οι μιτοχονδριακές και χλωροπλαστικές RNA πολυμεράσες μοιάζουν με τα αντίστοιχα βακτηριακά ένζυμα 34

35 Οι τρεις RNA πολυμεράσες του πυρήνα των ευκαρυωτικών κυττάρων είναι σύνθετα ένζυμα, που αποτελούνται από υπομονάδες. Αν και αναγνωρίζουν διαφορετικούς υποκινητές και μεταγράφουν διαφορετικά είδη γονιδίων, μοιράζονται αρκετά κοινά χαρακτηριστικά τόσο μεταξύ τους όσο και με τις βακτηριακές RNA πολυμεράσες. Συγκεκριμένα, περιέχουν 9 συντηρημένες υπομονάδες, 5 από τις οποίες είναι όμοιες με τις υπομονάδες α, β, β' και ω της βακτηριακής RNA πολυμεράσης. Η δομή της RNA πολυμεράσης II του σακχαρομύκητα μοιάζει ιδιαίτερα με αυτή του βακτηριακού ενζύμου γεγονός που υποδεικνύει ότι ο βασικός μηχανισμός λειτουργίας όλων των πολυμερασών είναι εξελικτικά συντηρημένος. ΕΙΚΟΝΑ 7.10: Δομή της RNA πολυμεράσης ΙΙ του σακχαρομύκητα. Οι διαφορετικές υπομονάδες απεικονίζονται με διαφορετικά χρώματα (Kramer P.D., et al., Science 292: 1863.) 35

36 Γενικοί μεταγραφικοί παράγοντες και έναρξη της μεταγραφής από την RNA πολυμεράση II Η RNA πολυμεράση II είναι υπεύθυνη για τη σύνθεση του mrna των γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες. Αρχικές μελέτες του ενζύμου κατέδειξαν ότι συμπεριφέρεται διαφορετικά από την προκαρυωτική RNA Pol. Η προκαρυωτική RNA Pol μπορεί να μεταγράψει in vitro τις αλληλουχίες ενός μορίου DNA που βρίσκονται καθοδικά από κάποιον υποκινητή τον οποίο αναγνωρίζει. Δεν ισχύει όμως το ίδιο για την ευκαρυωτική RNΑ Pol, καθώς αρχίζει τη μεταγραφή μόνο αν προστεθούν στην αντίδραση επιπλέον πρωτεΐνες (Robert Roeder, 1979). Επομένως, η μεταγραφή στα ευκαρυωτικά συστήματα χρειάζεται παράγοντες έναρξης, που (σε αντίθεση με τους βακτηριακούς παράγοντες σ) δεν αποτελούν συστατικά της πολυμεράσης. Μεταγενέστερα, με βιοχημική κλασμάτωση πυρηνικών εκχυλισμάτων, εντοπίστηκε μια σειρά από πρωτεΐνες που ονομάστηκαν μεταγραφικοί παράγοντες (transcription factors) και είναι απαραίτητες για την έναρξη της μεταγραφής από την RNA Pol II. Οι γενικοί μεταγραφικοί παράγοντες συμμετέχουν στη μεταγραφή από όλους τους υποκινητές της RNA Pol II και συνεπώς αποτελούν στοιχεία του βασικού μηχανισμού της μεταγραφής από το ένζυμο αυτό. Επιπρόσθετα, ειδικοί μεταγραφικοί παράγοντες προσδένονται ο καθένας σε ρυθμιστικές αλληλουχίες συγκεκριμένων γονιδίων και ελέγχουν την έκφραση τους. Έχει υπολογιστεί ότι περίπου το 10% των γονιδίων του ανθρώπινου γονιδιώματος κωδικοποιεί μεταγραφικούς παράγοντες, γεγονός ενδεικτικό της σημασίας αυτών των πρωτεϊνών. 36

37 Γενικοί μεταγραφικοί παράγοντες και έναρξη της μεταγραφής από την RNA πολυμεράση II Οι υποκινητές των γονιδίων που μεταγράφονται από την πολυμεράση II περιέχουν αρκετά διαφορετικά ρυθμιστικά στοιχεία γύρω από τη θέση έναρξης της μεταγραφής. Το πρώτο που εντοπίστηκε ήταν μια αλληλουχία παρόμοια με το ΤΑΤΑΑ, νουκλεοτίδια ανοδικά της θέσης έναρξης της μεταγραφής, που ονομάζεται πλαίσιο TATA (TATA box), που μοιάζει με το στοιχείο -10 των βακτηριακών υποκινητών. Αρχικά θεωρήθηκε ότι χαρακτηρίζει όλους τους υποκινητές των γονιδίων που μεταγράφονται από την RNA Pol II, αλλά μελέτες σε επίπεδο γονιδιώματος κατέδειξαν ότι πλαίσιο TATA υπάρχει μόνο στο 10-20% των υποκινητών της RNA Pol II. Άλλες ρυθμιστικές αλληλουχίες των υποκινητών των γονιδίων που μεταγράφονται από την RNΑ Pol II είναι ο εναρκτής (Inr, initiator), που περιβάλλει τη θέση έναρξης της μεταγραφής, το στοιχείο αναγνώρισης του TFIIB (BRE), που βρίσκεται ανοδικά της θέσης έναρξης της μεταγραφής, καθώς και αρκετά στοιχεία που βρίσκονται καθοδικά της θέσης έναρξης της μεταγραφής (DPE, DCE και ΜΤΕ). Οι υποκινητές διαφορετικών γονιδίων περιέχουν ποικίλους συνδυασμούς αυτών των στοιχείων, τα οποία συμμετέχουν από κοινού στην πρόσδεση των γενικών μεταγραφικών παραγόντων. Τουλάχιστον 5 γενικοί TF απαιτούνται για την έναρξη της μεταγραφής από την RNA Pol II σε in vitro συστήματα. Το πρώτο βήμα για τον σχηματισμό του μεταγραφικού συμπλόκου είναι η πρόσδεση στον υποκινητή ενός γενικού TF, του TFIID. Ο TFIID αποτελείται από πολλές υπομονάδες, συμπεριλαμβανομένης της πρωτεΐνης πρόσδεσης στο TATA (ΤΒΡ, TATA-Binding Protein) και άλλων 14 πολυπεπτιδίων, που ονομάζονται παράγοντες που συνδέονται με την ΤΒΡ (TAF, TBP-Associated Factors). Η ΤΒΡ προσδένεται στο πλαίσιο TATA, ενώ οι TAF προσδένονται στα στοιχεία Inr, DPE, DPC και ΜΤΕ. Η πρόσδεση του TFIID ακολουθείται από τη στρατολόγηση ενός δεύτερου γενικού TF, του TFIIB, που αλληλεπιδρά με την ΤΒΡ αλλά και με το στοιχείο BRE. Στη συνέχεια, ο TFIIB λειτουργεί ως γέφυρα για την RNA Pol II, η οποία, αφού προηγουμένως προσδεθεί σε έναν τρίτο γενικό TF, του TFIIF, προσδένεται στο σύμπλοκο TBP-TFIIB. Μετά την πρόσδεση της RNA Pol II στον υποκινητή, η πρόσδεση δύο ακόμα γενικών TF, του TFIIE και του TFIIH, ολοκληρώνει τον σχηματισμό του προεναρκτήριου συμπλόκου (preinitiation complex). 37

38 Γενικοί μεταγραφικοί παράγοντες και έναρξη της μεταγραφής από την RNA πολυμεράση II ΕΙΚΟΝΑ 7.11: Ο σχηματισμός in vitro του προεναρκτήριου συμπλόκου της RNA πολυμεράσης ΙΙ. Οι υποκινητές της RNA πολυμεράσης ΙΙ περιλαμβάνουν διάφορες ρυθμιστικές αλληλουχίες, όπως το πλαίσιο ΤΑΤΑ (με πρότυπη αλληλουχία TATAA) νουκλεοτίδια ανοδικά της θέσης έναρξης της μεταγραφής, το στοιχείο αναγνώρισης του TFIIB (BRE) 35 νουκλεοτίδια ανοδικά της θέσης έναρξης της μεταγραφής, τον εναρκτή (Inr), που περιβάλλει τη θέση έναρξης της μεταγραφής, καθώς και διάφορα στοιχεία τα οποία βρίσκονται καθοδικά της θέσης έναρξης της μεταγραφής (τα DCE, MTE και DPE). Ο σχηματισμός του μεταγραφικού συμπλόκου ξεκινά με την πρόσδεση του μεταγραφικού παράγοντα TFIID. Μια υπομονάδα του TFIID, η πρωτεΐνη πρόσδεσης στο ΤΑΤΑ (TBP), προσδένεται στο πλαίσιο ΤΑΤΑ. Άλλες υπομονάδες του TFIID, οι παράγοντες που συνδέονται με την TBP (TAF), προσδένονται στον εναρκτή, καθώς και στα στοιχεία που βρίσκονται καθοδικά της θέσης έναρξης της μεταγραφής. Κατόπιν, στρατολογείται ο TFIIB (B), ο οποίος προσδένεται στην TBP και στο στοιχείο BRE. Ακολουθεί η πρόσδεση της πολυμεράσης η οποία βρίσκεται ήδη συνδεδεμένη με τον TFIIF (F). Ο σχηματισμός του προεναρκτήριου συμπλόκου ολοκληρώνεται με την προσθήκη του TFIIE (E) και του TFIIH (H). 38

39 ΕΙΚΟΝΑ 7.12: Μοντέλο του προεναρκτήριου συμπλόκου της RNA πολυμεράσης ΙΙ. Ένα μοριακό μοντέλο της RNA πολυμεράσης ΙΙ (γκρι), της TBP (πράσινο), του TFIIB (κίτρινο), του TFIIE (μοβ), του TFIIF (μπλε) και του TFIIH (καφέ) στη μορφή του συμπλόκου που συγκροτούν πάνω σε έναν υποκινητή. Στη φωτογραφία, ο προσανατολισμός του προεναρκτήριου συμπλόκου πάνω στο DNA είναι αντίστροφος από αυτόν της Εικ (Bushnell D.A., et al., Science 303: 983). 39

40 O TFIIH αποτελείται από πολλές υπομονάδες και έχει δύο σημαντικούς ρόλους: (α) Δύο υπομονάδες του είναι ελικάσες που ξετυλίγουν το DNA γύρω από την περιοχή έναρξης. Πρόκειται για τις πρωτεΐνες ΧΡΒ και XPD, που είναι απαραίτητες για την επιδιόρθωση με εκτομή νουκλεοτιδίου (nucleotide-excision repair) (β) Μια άλλη υπομονάδα του ΤFIΙΗ έχει δράση κινάσης που φωσφορυλιώνει μια αμινοξική αλληλουχία που επαναλαμβάνεται στην καρβοξυτελική επικράτεια (CTD, Carboxy-Terminal Domain) της μεγαλύτερης υπομονάδας της RNA Pol II. Η CTD της RNA Pol II περιλαμβάνει, στον άνθρωπο, 52 διαδοχικές επαναλήψεις 7 αμινοξέων με πρότυπη αλληλουχία την TyrSer-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser. Η φωσφορυλίωση από την πρωτεϊνική κινάση του ΤFIΙΗ των επαναλήψεων της CTD στη Ser της θέσης 5 της πρότυπης αλληλουχίας οδηγεί στην αποδέσμευση της RNA Pol II από το προεναρκτήριο σύμπλοκο και προκαλεί την έναρξη της μεταγραφής. Οι 5 γενικοί TFs και η RNA Pol II, που στρατολογούνται διαδοχικά πάνω στον υποκινητή, συνιστούν το ελάχιστο απαιτούμενο σύστημα για τη μεταγραφή in vitro. 40

41 Η πραγματοποίηση όμως της μεταγραφής στο κύτταρο προϋποθέτει την παρουσία επιπλέον παραγόντων. Μεταξύ αυτών περιλαμβάνεται ένα μεγάλο πρωτεϊνικό σύμπλοκο, ο διαμεσολαβητής (Mediator), που αποτελείται από >20 διαφορετικές υπομονάδες και αλληλεπιδρά τόσο με τους γενικούς μεταγραφικούς παράγοντες όσο και με την RNA Pol. Ο διαμεσολαβητής όχι μόνο ενεργοποιεί την έναρξη της μεταγραφής από τους γενικούς TFs, αλλά και διαδραματίζει κύριο ρόλο στη σύνδεση των γενικών TFs με τους ειδικούς, για κάθε γονίδι, μεταγραφικούς παράγοντες που ρυθμίζουν τη γονιδιακή έκφραση. Οι πρωτεΐνες του διαμεσολαβητή αποδεσμεύονται από την πολυμεράση μετά τη συναρμολόγηση του προεναρκτήριου συμπλόκου και τη φωσφορυλίωση της CTD της πολυμεράσης. Η φωσφορυλιωμένη CTD προσδένεται σε άλλες πρωτεΐνες που χρειάζονται για την επιμήκυνση και την ωρίμανση του mrna. 41

42 ΕΙΚΟΝΑ 7.13: Το σύμπλοκο της RNA πολυμεράσης ΙΙ με τον διαμεσολαβητή και η έναρξη της μεταγραφής. Η RNA Pol ΙΙ αλληλεπιδρά με τις πρωτεΐνες του διαμεσολαβητή, καθώς και με τους γενικούς μεταγραφικούς παράγοντες στην περιοχή του υποκινητή. Ο διαμεσολαβητής προσδένεται στη μη φωσφορυλιωμένη CTD της RNA Pol ΙΙ. Η φωσφορυλίωση της CTD έχει ως αποτέλεσμα την απελευθέρωση του διαμεσολαβητή και την έναρξη της μεταγραφής. Η φωσφορυλιωμένη CTD αλληλεπιδρά με παράγοντες επιμήκυνσης και επεξεργασίας του μεταγράφου που υποβοηθούν τη σύνθεση και επεξεργασία του mrna. 42

43 Μεταγραφή από τις RNA πολυμεράσες I και III Η RNA πολυμεράση I εστιάζεται αποκλειστικά στη μεταγραφή των 28S, 18S και 5,8S γονιδίων του ριβοσωμικού RNA, που οργανώνονται σε διαδοχικές επαναλήψεις. Από τη μεταγραφή τους προκύπτει αρχικά ένα μεγάλο πρόδρομο pre-rrna, το 45S, από το οποίο στη συνέχεια αποκόπτονται τα 28S, 18S και 5,8S rrna. Ο υποκινητής των γονιδίων του rrna εκτείνεται περίπου 150 bp ανοδικά της θέσης έναρξης της μεταγραφής και αναγνωρίζεται από δύο μεταγραφικούς παράγοντες. RNA πολυμεράση I 60S: 28S, 5,8S + 5S rrna 40S: 18S rrna ΕΙΚΟΝΑ 7.14: Τα γονίδια του ριβοσωμικού RNA. Το ριβοσωμικό DNA (rdna) μεταγράφεται σε ένα μεγάλο πρόδρομο μόριο RNA (το 45S prerrna), από το οποίο στη συνέχεια αποκόπτονται τα 28S, 18S και 5,8S rrna. 43

44 Οι μεταγραφικοί παράγοντες, που ονομάζονται ανοδικός παράγοντας πρόσδεσης (UBF, Upstream Binding Factor) και παράγοντας επιλεκτικότητας 1 (SL1, Selectivity factor 1), προσδένονται συνεργειακά στον υποκινητή και κατόπιν στρατολογούν την RNΑ πολυμεράση I, οπότε σχηματίζεται το σύμπλοκο έναρξης. Ο SL1 αποτελείται από 4 πρωτεϊνικές υπομονάδες, μία από τις οποίες είναι η ΤΒΡ (πρωτεΐνη πρόσδεσης στο ΤΑΤΑ). Καθώς ο υποκινητής των γονιδίων του ριβοσωμικού RNΑ δεν περιέχει πλαίσιο TATA, η ΤΒΡ δεν προσδένεται σε μια συγκεκριμένη αλληλουχία του υποκινητή. Η σύνδεση της επιτυγχάνεται μέσω αλληλεπιδράσεων που αναπτύσσει με τις υπομονάδες του SL1. ΕΙΚΟΝΑ 7.15: Η έναρξη της μεταγραφής του rdna. Δύο μεταγραφικοί παράγοντες, ο UBF και ο SL1, συνδέονται συνεργειακά στον υποκινητή του rdna και στρατολογούν την RNA πολυμεράση Ι, προκειμένου να σχηματιστεί το σύμπλοκο έναρξης. Μια υπομονάδα του SL1 είναι η πρωτεΐνη πρόσδεσης στο ΤΑΤΑ (TBP). 44

45 Γονίδια 5S, trna και ορισμένα μικρά RNA που συμμετέχουν στο μάτισμα και στη μεταφορά πρωτεϊνών μεταγράφονται από την RNA Pol III. ΕΙΚΟΝΑ 7.16: Η μεταγραφή από την RNA πολυμεράση ΙΙΙ. Υπάρχουν 3 τύποι υποκινητών που χρησιμοποιούν την RNA Pol ΙΙΙ. Οι υποκινητές των γονιδίων του 5S rrna και των trna βρίσκονται καθοδικά από τη θέση έναρξης της μεταγραφής (δηλ. στο εσωτερικό και όχι ανοδικά της μεταγραφόμενης αλληλουχίας). Η μεταγραφή του γονιδίου του 5S rrna αρχίζει με την πρόσδεση του TFIIIA, που ακολουθείται από την πρόσδεση του TFIIIC, του TFIIIB και της RNA Pol ΙΙΙ. Οι υποκινητές των γονιδίων των trna δε φέρουν τη θέση πρόσδεσης για τον TFIIA. Η μεταγραφή τους αρχίζει με την πρόσδεση του TFIIIC, που ακολουθείται από την πρόσδεση του TFIIIB και της πολυμεράσης. Ο υποκινητής του γονιδίου του U6 snrna βρίσκεται ανοδικά της θέσης έναρξης της μεταγραφής και φέρει ένα πλαίσιο ΤΑΤΑ, που αναγνωρίζεται από την πρωτεΐνη πρόσδεσης στο ΤΑΤΑ (TBP) που αποτελεί υπομονάδα του TFIIIB. Φέρει επίσης μια θέση πρόσδεσης ενός άλλου μεταγραφικού παράγοντα, του SNAP. Οι TFIIIB και SNAP προσδένονται συνεργειακά σε αυτόν τον υποκινητή. 45

46 ΡYΘΜΙΣΗ ΤΗΣ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗΣ ΣΤΟΥΣ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΟΥΣ ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥΣ Μια σημαντική διαφορά στη ρύθμιση της μεταγραφής ανάμεσα στους προκαρυώτες και τους ευκαρυώτες προκύπτει από το πακετάρισμα του ευκαρυωτικού DNA στη χρωματίνη, που περιορίζει τη διαθεσιμότητα του ως μήτρας για τη μεταγραφή. Έτσι, η τροποποίηση της δομής της χρωματίνης διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στον έλεγχο της μεταγραφής στα ευκαρυωτικά κύτταρα. 46

47 cis-δραστικές ρυθμιστικές αλληλουχίες: Υποκινητές και Ενισχυτές Με μεθόδους μεταφοράς γονιδίων ελέγχονται περιοχές κλωνοποιημένων γονιδίων που ενδέχεται να περιέχουν cis-δραστικές αλληλουχίες. Στα πειράματα αυτά δημιουργούνται κατασκευές στις οποίες οι υπό έλεγχο αλληλουχίες συνδέονται με ένα γονίδιο αναφοράς (reporter gene) που κωδικοποιεί κάποιο εύκολα ανιχνεύσιμο προϊόν, όπως η λουσιφεράση της πυγολαμπίδας. Στη λουσιφεράση οφείλεται η βιοφωταύγεια που εμφανίζει το έντομο. Με τέτοιες κατασκευές είναι δυνατόν να διαμολυνθούν τα κύτταρα μιας καλλιέργειας, οπότε η ενδεχόμενη έκφραση του γονιδίου αναφοράς υποδεικνύει την παρουσία ενός βιολογικά ενεργού στοιχείου που επάγει τη μεταγραφή. Περαιτέρω μελέτες με in vitro μεταλλαξιγένεση είναι δυνατόν να επιτρέψουν τον ακριβή προσδιορισμό συγκεκριμένων βάσεων του DNA που είναι κρίσιμες για τη λειτουργία του cis-δραστικού στοιχείου. (Βιοφωταύγεια ονομάζεται το φαινόμενο της εκπομπής φωτός κατά την επιτέλεση μιας βιολογικής αντίδρασης. Η λουσιφεράση καταλύει την οξείδωση της λουσιφερίνης, που συνοδεύεται από την εκπομπή φωτός). ΕΙΚΟΝΑ 7.17: Ταυτοποίηση ευκαρυωτικών ρυθμιστικών αλληλουχιών. Η εν δυνάμει ρυθμιστική αλληλουχία ενός κλωνοποιημένου ευκαρυωτικού γονιδίου τοποθετείται σε ένα πλασμίδιο ανοδικά κάποιου γονιδίου αναφοράς που κωδικοποιεί ένα εύκολα ανιχνεύσιμο προϊόν. Κατόπιν, με το πλασμίδιο διαμολύνεται μια καλλιέργεια ευκαρυωτικών κυττάρων. Αν η υπό έλεγχο αλληλουχία περιλαμβάνει τη θέση αναγνώρισης ενός ενεργοποιητή της μεταγραφής, θα πρέπει στα διαμολυσμένα κύτταρα να ανιχνευτεί το προϊόν του γονιδίου αναφοράς. 47

48 Τα μεταγραφόμενα γονίδια από την RNA πολυμεράση II διαθέτουν ειδικές περιοχές πρόσδεσης γενικών μεταγραφικών παραγόντων, συμπεριλαμβανομένων του πλαισίου TATA και του Inr. Άλλες cis-δραστικές αλληλουχίες λειτουργούν ως περιοχές πρόσδεσης ποικίλων ρυθμιστικών παραγόντων που ελέγχουν την έκφραση συγκεκριμένων γονιδίων. Αυτές οι cis-δραστικές ρυθμιστικές αλληλουχίες βρίσκονται συχνά, αλλά όχι πάντα, ανοδικά της θέσης έναρξης της μεταγραφής. Για παράδειγμα, δύο ρυθμιστικές αλληλουχίες παρούσες σε πολλά ευκαρυωτικά γονίδια εντοπίστηκαν κατά τη μελέτη του υποκινητή ενός γονιδίου του ιού του απλού έρπητα (HSV, Herpes Simplex Virus) το οποίο κωδικοποιεί την κινάση της θυμιδίνης. Τα δύο αυτά στοιχεία βρίσκονται σε μια περιοχή 100 bp ανοδικά της θέσης έναρξης της μεταγραφής. Οι πρότυπες αλληλουχίες τους είναι CCAAT (πλαίσιο CAAT) και GGGCGG (πλαίσιο GC). Έχουν ήδη ταυτοποιηθεί συγκεκριμένες πρωτεΐνες που προσδένονται με ειδικότητα σε αυτές τις αλληλουχίες και ενεργοποιούν τη μεταγραφή. Πλαίσιο GC Πλαίσιο CAAT Πλαίσιο GC Πλαίσιο TATA ΕΙΚΟΝΑ 7.18: Ένας ευκαρυωτικός υποκινητής. Ο υποκινητής του γονιδίου της κινάσης της θυμιδίνης του HSV φέρει ανοδικά από το πλαίσιο ΤΑΤΑ τρία στοιχεία τα οποία χρειάζονται για τη μεταγραφή του σε φυσιολογικά επίπεδα: ένα πλαίσιο CCAAT και δύο πλαίσια GC των οποίων η πρότυπη αλληλουχία είναι GGGCGG. 48

49 Σε αντίθεση με τη σχετικά απλή οργάνωση των πλαισίων CCAAT και GC του υποκινητή του γονιδίου της κινάσης της θυμιδίνης του HSV, πολλά γονίδια των θηλαστικών ελέγχονται από ρυθμιστικές αλληλουχίες που βρίσκονται αρκετά μακριά (μερικές φορές περισσότερο από 50 kb) από τη θέση έναρξης της μεταγραφής. Τέτοιες αλληλουχίες, που ονομάζονται ενισχυτές (enhancers), εντοπίστηκαν αρχικά κατά τη μελέτη του υποκινητή του ιού SV40. Για την αποτελεσματική μεταγραφή από αυτόν τον υποκινητή του ιού του SV40, εκτός από ένα πλαίσιο TATA και μια ομάδα 6 πλαισίων GC, χρειάζονται και 2 επαναλήψεις 72 ζευγών βάσεων που βρίσκονται ανοδικά και σε σχετικά μεγάλη απόσταση. Βρέθηκε ότι αυτές οι αλληλουχίες ενεργοποιούν τη μεταγραφή τόσο από αυτόν όσο και από άλλους υποκινητές. Διαπιστώθηκε απροσδόκητα ότι η δραστικότητα τους δεν εξαρτάται ούτε από την απόσταση τους από τη θέση έναρξης της μεταγραφής ούτε από τον προσανατολισμό τους σε σχέση με αυτή (Εικ. 7.20). Μπορούν να ενεργοποιήσουν τη μεταγραφή είτε τοποθετηθούν ανοδικά είτε καθοδικά σε σχέση με τον υποκινητή και ανεξάρτητα από τον προσανατολισμό τους. ΕΙΚΟΝΑ 7.19: Ο ενισχυτής του SV40. Ο ενισχυτής του ιού SV40 που είναι υπεύθυνος για την έκφραση των πρώιμων γονιδίων φέρει ένα πλαίσιο ΤΑΤΑ και έξι πλαίσια GC τα οποία βρίσκονται ανά δύο σε μία αλληλουχία που επαναλαμβάνεται τρεις φορές. Προκειμένου τα επίπεδα της μεταγραφής να είναι φυσιολογικά, χρειάζεται και η παρουσία ενός ανοδικού ενισχυτή, ο οποίος αποτελείται από δύο επαναλήψεις των 72 ζευγών βάσεων. 49

50 ΕΙΚΟΝΑ 7.20: Η λειτουργία των ενισχυτών. Χωρίς τη δράση ενός ενισχυτή, ένα γονίδιο μεταγράφεται σε χαμηλά επίπεδα (Α). Παρουσία ενός ενισχυτή, Ε για παράδειγμα, των δύο επαναλήψεων 72 ζευγών βάσεων του SV40, η μεταγραφή διεγείρεται. Ο ενισχυτής είναι ενεργός όχι μόνο όταν τοποθετείται ακριβώς ανοδικά σε σχέση με τον υποκινητή (Β), αλλά και όταν τοποθετείται αρκετές κιλοβάσεις είτε ανοδικά είτε καθοδικά της θέσης έναρξης της μεταγραφής (Γ και Δ). Επίσης, οι ενισχυτές είναι ενεργοί ανεξάρτητα από τον προσανατολισμό τους σε σχέση με τη θέση έναρξης της μεταγραφής (Ε). 50

51 Οι ενισχυτές, όπως και οι υποκινητές, λειτουργούν προσδένοντας μεταγραφικούς παράγοντες (TFs) που στη συνέχεια αλληλεπιδρούν με την RNA Pol. Αυτό επιτυγχάνεται μέσω της αναδίπλωσης του μορίου του DNA και του σχηματισμού ενός βρόγχου, με αποτέλεσμα ένας TF που βρίσκεται συνδεδεμένος σε κάποιον απομακρυσμένο ενισχυτή να μπορεί να αλληλεπιδράσει στον χώρο με το σύμπλοκο μεταγραφικών παραγόντων - RNA Pol διαμεσολαβητή, που βρίσκεται στην περιοχή του υποκινητή. ΕΙΚΟΝΑ 7.21: Απομακρυσμένοι ενισχυτές και αναδίπλωση του DNA. Οι μεταγραφικοί παράγοντες που προσδένονται σε απομακρυσμένους ενισχυτές είναι δυνατόν, μέσω της αναδίπλωσης του DNA (του σχηματισμού βρόχου), να αλληλεπιδράσουν με το σύμπλοκο RNA πολυμεράσης ΙΙ/Διαμεσολαβητή που βρίσκεται στρατολογημένο στην περιοχή του υποκινητή. Επομένως, σε επίπεδο μηχανισμού δεν υπάρχει κάποια ουσιαστική διαφορά ανάμεσα στον τρόπο λειτουργίας των μεταγραφικών παραγόντων που προσδένονται σε απομακρυσμένους ενισχυτές και αυτών που προσδένονται σε αλληλουχίες του υποκινητή. 51

52 Οι ενισχυτές μπορούν να λειτουργήσουν από πολύ μεγάλες αποστάσεις, και μπορούν ακόμα να επηρεάσουν γονίδια που βρίσκονται σε διαφορετικά χρωμοσώματα. Αυτό το επιγενετικό φαινόμενο ονομάζεται διαλληλική επίδραση (transvection) και έχει μελετηθεί στην Drosophila, όπου ο ενισχυτής ενός γονιδίου μπορεί να εμφανίσει trans-δραστικότητα και να ρυθμίσει την έκφραση του αλληλομόρφου του που εδράζεται σε διαφορετικό (ομόλογο) χρωμόσωμα. Δηλαδή, οι ενισχυτές ενός αλληλόμορφου μπορούν να ενεργοποιήσουν (ή να καταστείλουν) τον υποκινητή του άλλου αλληλόμορφου στο ομόλογο χρωμόσωμα. Οι TFs που προσδένονται σε απομακρυσμένους ενισχυτές μπορούν να λειτουργήσουν με τους ίδιους μηχανισμούς όπως και οι TFs που προσδένονται στους υποκινητές. Συνεπώς, δεν υπάρχει καμία ιδιαίτερη διαφορά μεταξύ του μηχανισμού δράσης των ενισχυτών και αυτού των cis-δραστικών στοιχείων που εδράζονται κοντά στη θέση έναρξης της μεταγραφής. 52

53 Η εξειδικευμένη πρόσδεση TF σε ενισχυτές έχει καθοριστικό ρόλο στον έλεγχο της γονιδιακής έκφρασης κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης και διαφοροποίησης των ποικίλων κυτταρικών τύπων στους ανώτερους οργανισμούς, καθώς και κατά την απόκριση των κυττάρων σε ορμόνες και αυξητικούς παράγοντες. Ένα καλά μελετημένο παράδειγμα αφορά τον ενισχυτή που ελέγχει τη μεταγραφή των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών στα λεμφοκύτταρα Β. Με πειράματα μεταφοράς γονιδίων αποδείχθηκε ότι αυτή η cis-δραστική αλληλουχία είναι ενεργή μόνο στα λεμφοκύτταρα Β και όχι σε άλλους τύπους κυττάρων. Αποτελεί κεντρικό στοιχείο του μηχανισμού μέσω του οποίου εξασφαλίζεται η ιστοειδική έκφραση των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών στον κατάλληλα διαφοροποιημένο κυτταρικό τύπο, δηλαδή στα λεμφοκύτταρα Β. ΕΙΚΟΝΑ 7.22: Ο ενισχυτής της βαριάς αλυσίδας των ανοσοσφαιρινών. Ο ενισχυτής της βαριάς αλυσίδας των ανοσοσφαιρινών εκτείνεται σε περίπου 200 ζεύγη βάσεων και φέρει εννέα ρυθμιστικές αλληλουχίες (Ε, με1-5, π, μβ και OCT), οι οποίες από κοινού εξασφαλίζουν την ιστοειδική μεταγραφή στα λεμφοκύτταρα Β. 53

54 Επομένως, ένα σημαντικό χαρακτηριστικό των ενισχυτών είναι ότι συχνά περιέχουν πολλαπλά cis-δραστικά στοιχεία τα οποία προσδένουν διαφορετικές το καθένα πρωτεΐνες που ρυθμίζουν τη μεταγραφή. Αυτές οι πρωτεΐνες λειτουργούν από κοινού για να ρυθμίσουν τη γονιδιακή έκφραση. Οι περιοχές πρόσδεσης των μεταγραφικών παραγόντων στους υποκινητές και στους ενισχυτές προσδιορίζονται με δύο μεθόδους: (A) Ιχνηλάτηση του DNA που χρησιμοποιήθηκε και για τον χαρακτηρισμό της περιοχής πρόσδεσης της RNA πολυμεράσης στους προκαρυωτικούς υποκινητές. (Β) Δοκιμασία μεταβολής της ηλεκτροφορητικής Electrophoretic-Mobility Shift Assay). κινητικότητας (EMSΑ, Στην περίπτωση της EMSA, το υπό έλεγχο τμήμα DNA σημαίνεται στο ένα άκρο του με κάποιο ραδιοϊσότοπο, επωάζεται με την υπό έλεγχο πρωτεΐνη και στη συνέχεια υποβάλλεται σε ηλεκτροφόρηση σε μη αποδιατακτικό πήκτωμα ακρυλαμιδίου. Αν η πρωτεΐνη προσδεθεί στο σημασμένο DNA, μέρος αυτού δεσμεύεται σε ένα σύμπλοκο με μειωμένη, λόγω του μεγαλύτερου μεγέθους του, ηλεκτροφορητική κινητικότητα σε σχέση με το «γυμνό» DNA. Η ανίχνευση κατά την EMSA ενός τέτοιου συμπλόκου που κινείται βραδύτερα στην ηλεκτροφόρηση υποδεικνύει πως η πρωτεΐνη έχει προσδεθεί στο DNA. Με τη συνδυασμένη χρήση της ιχνηλάτησης του DNA και της EMSA χαρακτηρίστηκαν τα ρυθμιστικά στοιχεία των ενισχυτών και των υποκινητών ως εξειδικευμένες θέσεις πρόσδεσης συγκεκριμένων μεταγραφικών παραγόντων. 54

55 ΕΙΚΟΝΑ 7.23: Δοκιμασία μεταβολής της ηλεκτροφορητικής κινητικότητας. Μια ποσότητα του υπό έλεγχο τμήματος DNA ραδιοσημαίνεται και στη συνέχεια χωρίζεται στα δύο. Το ένα από τα δύο δείγματα επωάζεται με την υπό έλεγχο πρωτεΐνη. Κατόπιν, τα δύο δείγματα ηλεκτροφορούνται σε ένα πήκτωμα ακρυλαμιδίου που δεν είναι αποδιατακτικό και έτσι κατά την ηλεκτροφόρηση δε διασπώνται τα σύμπλοκα DNA-πρωτεΐνης. Η πρόσδεση της πρωτεΐνης στο DNA γίνεται αντιληπτή από την παρουσία στο δείγμα που επωάστηκε με πρωτεΐνη μιας ζώνης η οποία κινείται βραδύτερα στο πήκτωμα σε σχέση με το «γυμνό» DNA. Η βραδύτερα κινούμενη ζώνη είναι το σύμπλοκο DNA-πρωτεΐνης. Τυπικά χρησιμοποιείται μεγάλη περίσσεια του ραδιοσημασμένου τμήματος DNA, με αποτέλεσμα, ακόμα και στο δείγμα όπου προστέθηκε η πρωτεΐνη, ένα μέρος του DNA να μη σχηματίζει σύμπλοκο με αυτή και να παραμένει «γυμνό». 55

56 Οι περιοχές πρόσδεσης των περισσότερων TFs αποτελούνται από βραχείες αλληλουχίες DNA μέσου μήκους 6-10 bp, που στις περισσότερες περιπτώσεις είναι εκφυλισμένες. Αυτό σημαίνει ότι σε μία ή περισσότερες θέσεις τους είναι δυνατόν να υπάρχουν περισσότερα από ένα εναλλακτικά νουκλεοτίδια, χωρίς αυτό να επηρεάζει σημαντικά την πρόσδεση του TF. Είναι σύνηθες να συγκρίνονται όλες οι γνωστές περιοχές πρόσδεσης ενός TF και τα αποτελέσματα να αναπαρίστανται σε ένα ιστόγραμμα, που υποδεικνύει τη συχνότητα με την οποία εμφανίζεται καθεμία από τις 4 βάσεις στις διάφορες θέσεις της αλληλουχίας αναγνώρισης. Καθώς όμως οι αλληλουχίες αναγνώρισης των περισσότερων TFs είναι βραχείες και εκφυλισμένες, συναντώνται πάρα πολλές φορές στο γονιδίωμα. Ασφαλώς, μόνο ένα υποσύνολο των αλληλουχιών αυτών λειτουργούν πραγματικά ως cis-ρυθμιστικά στοιχεία στα οποία προσδένεται ο συγκεκριμένος μεταγραφικός παράγοντας in vivo. Ο εντοπισμός των αυθεντικών λειτουργικών ρυθμιστικών αλληλουχιών στο γονιδιωματικό DNA παραμένει μία από τις μεγαλύτερες προκλήσεις της βιοπληροφορικής και της βιολογίας συστημάτων. ΕΙΚΟΝΑ 7.24: Αντιπροσωπευτικά παραδείγματα περιοχών πρόσδεσης μεταγραφικών παραγόντων. Παρουσιάζονται οι περιοχές πρόσδεσης 3 μεταγραφικών παραγόντων των θηλαστικών (AP1, Myc και SRF) στη μορφή ιστογραμμάτων. Υποδεικνύεται η συχνότητα με την οποία εμφανίζεται καθεμία από τις 4 βάσεις στις διάφορες θέσεις της αλληλουχίας αναγνώρισης. 56

57 Ο πειραματικός προσδιορισμός των αυθεντικών περιοχών πρόσδεσης TFs στο κύτταρο είναι δυνατόν να πραγματοποιηθεί με τη μέθοδο της ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης (ChIP, Chromatin lmmunoprecipitation). ΕΙΚΟΝΑ 7.25: Ανοσοκατακρήμνιση χρωματίνης. Αρχικά, τα κύτταρα υφίστανται επεξεργασία με φορμαλδεΰδη, που προκαλεί την ομοιοπολική διασύνδεση των πρωτεϊνών με τις αλληλουχίες του DNA στις οποίες βρίσκονται συνδεδεμένες in vivo. Κατόπιν, απομονώνεται η χρωματίνη και εκτίθεται σε υπερήχους, προκειμένου να τεμαχιστεί σε μικρά κομμάτια μέσου μεγέθους 500 bp. Τα κομμάτια αυτά της χρωματίνης επωάζονται με ένα αντίσωμα που αναγνωρίζει έναν συγκεκριμένο TF (ή άλλη πρωτεΐνη). Όσα από αυτά προσδένονται στο αντίσωμα απομονώνονται με ανοσοκατακρήμνιση. Στη συνέχεια, οι ομοιοπολικές διασυνδέσεις που προκάλεσε η φορμαλδεΰδη διασπώνται και το απομονωμένο DNA που περιέχει τις θέσεις πρόσδεσης του υπό έλεγχο μεταγραφικού παράγοντα in vivo καθαρίζεται και αναλύεται με PCR. Με τον τρόπο αυτό μπορεί να διαπιστωθεί αν μια συγκεκριμένη γονιδιωματική περιοχή αποτελεί θέση πρόσδεσης του υπό εξέταση μεταγραφικού παράγοντα. 57