Gens VIII (Lewin) Μοριακή Βιολογία του Γονιδίου (Watson et al.)

Transcript

1 Gens VIII (Lewin) Κεφάλαιο 5 (εκτός 14) Κεφάλαιο 6 (1-15, 18-19) Κεφάλαιο 7 (1-5, 8-10, 14) Κεφάλαιο 9 (1-4, 6-15, 17, 20-22) Κεφάλαιο 24 (19, 21) Κεφάλαιο 10 (1-20) Κεφάλαιο 11 (3-5) Μοριακή Βιολογία του Γονιδίου (Watson et al.) Κεφάλαιο 15 Κεφάλαιο 14 Κεφάλαιο 12 Κεφάλαιο 16

2 ΕΙΣΑΓΩΓΗ

3 Μήκος Μάζα Όγκος 1 m 1 mm = 10-3 m 1 μm = 10-6 m 1 nm = 10-9 m 1 o A = m 1 g 1 mg = 10-3 g 1 μg (γ) = 10-6 g 1 ng = 10-9 g 1 pg = g 1 L 1 ml = 10-3 L 1 μl (λ) = 10-6 L 1 nl = 10-9 L 1 pl = L 1 pm = m 1 Da = 1,66 x g 1fL = L 1 kda = 10 3 Da Δεσμός C-C = 1.5 o A, Πάχος DNA = 20 o A, Μήκος περιστροφής DNA = 34 o A Ριβόσωμα ~ 20nm, Μιτοχόνδριο/Βακτήριο ~ 1-2 μm/3 fl, Πυρήνας ~ 10 μm, Ζωικό κύτταρο ~ μm, Νευρώνας ~ έως 1 m, DNA ανθρώπου = ~1 m = ~0.3 pg, 1 bp ~ 660 Da, 1 αμινοξύ ~ 110 Da

4 Ισχυροί Χημικοί δεσμοί Ομοιοπολικός δεσμός Ετεροπολικός δεσμός

5 Ασθενείς Χημικοί δεσμοί Δεσμός Η Δεσμός Van der Waals Υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις

6 Ισχύς χημικών δεσμών Δεσμοί Μήκος ( o Α) Ισχύς στο νερό (kcal/mole) Ομοιοπολικός ~1.5 ~90 Ετεροπολικός ή Ιοντικός ~2.5 ~3 Δεσμός υδρογόνου Δεσμός Van der Waals ~3 ~1 ~3.5 ~0.1

7 Ασθενείς δεσμοί μεταξύ μακρομορίων

8 Νουκλεοτίδια

9 Ορολογία Βάσεις Νουκλεοσί δια Νουκλεοτίδια Αδενίνη (Α) Αδενοσίνη (δεοξυ) Μονοφωσφορική Αδενοσίνη (damp) Γουανίνη (G) Γουανοσίνη (δεοξυ) Μονοφωσφορική Γουανοσίνη (dgmp) Κυτοσίνη (C) Κυτιδίνη (δεοξυ) Μονοφωσφορική Κυτιδίνη (dcmp) Θυμίνη (T) Θυμιδίνη (δεοξυ) Μονοφωσφορική Θυμιδίνη (dtmp) Ουρακίλη (U) Ουριδίνη (δεοξυ) Μονοφωσφορική ουριδίνη (dump)

10 Ποια μακρομόρια βρίσκονται σε μεγαλύτερη αφθονία στο κύτταρο?

11 Βακτήρια Πρωτεΐνες: ~60%, RNA: ~20%, mrna: ~ 2-1%, DNA: ~ 1,5%

12 Γιατί τα κύτταρα έχουν διαφορετική μορφή και λειτουργίες?

13 Διαφορετικοί τύποι κυττάρων

14 [κυτταρικές δομές, κατάλυση, ρύθμιση, ανοσοαπόκριση, μεταφορά, κίνηση] κυτταρικός τύπος Εικόνα 5.2 Αντιγραφή (Διαιώνιση/ Εξέλιξη της πληροφορίας) rrna (Μετάφραση) trna (Μετάφραση) srna (κατάλυση-ρύθμιση) mrna (Μεταφορά της πληροφορίας) Πρωτεΐνη (Εκτέλεση της πληροφορίας)

15 Κ Ε Φ Α Λ Α Ι Ο 5: Το αγγελιοφόρο RNA Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

16 Από πόσες περιοχές αποτελείται ένα mrna? Σε τι διαφέρουν τα προκαρυωτικά Από τα ευκαρυωτικά mrna?

17 mrna Κωδική περιοχή Διακιστρονική περιοχή 1-40 bp

18 Ευκαρυωτικό mrna

19 Μέσος αριθμός εσωνίων ανά γονίδιο Εικόνα13-2

20 Εικόνα 2.15, 16 Τα εξόνια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες συνήθως είναι μικρά. Το μήκος των ιντρονίων μπορεί να κυμαίνεται από πολύ μικρό έως πολύ μεγάλο.

21 Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004 Εικόνα 3.21 Τα γονίδια (ιντρόνια και εξόνια) καταλαμβάνουν ~25% του ανθρώπινου γονιδιώματος, αλλά οι κωδικές αλληλουχίες (εξόνια) είναι μόνο ένα ελάχιστο κλάσμα (~1%) αυτού του ποσοστού.

22 Λειτουργίες των 5 UTR 3 UTR Ρυθμιστικοί μεταφραστικοί παράγοντες Πρωτεΐνες και mirnas 5 UTR 1.Σταθερότητα του mrna 2.Έναρξη της μετάφρασης 3.Ρύθμιση της μετάφρασης (E) (Επαγωγή ή καταστολή της μετάφρασης) 3 UTR 1. Σταθερότητα του mrna 2. Σχηματισμός Poly(A) ουράς (E) 3. Εντοπισμός του mrna (E) 4. Ρύθμιση της μετάφρασης (E) (Kαταστολή της μετάφρασης)

23 Εικόνα 5.13 Επισκόπηση: Το mrna μεταγράφεται, μεταφράζεται και αποικοδομείται ταυτόχρονα στα βακτήρια. Μεταγραφή:~40 Nt/sec Μετάφραση:~15 αα/sec t 1/2 ~ 2 min

24 Εικόνα 5.17 Επισκόπηση: Η έκφραση του mrna σε ζωικά κύτταρα απαιτεί μεταγραφή, τροποποίηση, επεξεργασία, πυρηνο-κυτταροπλασματική μεταφορά και μετάφραση. CAP ~40 Nt/sec Εσ-1 Εσ-2 Ζυμομύκητες: t1/2~ 1-60 min Ανώτεροι: t1/2 ~ 1-24 h ~2 αα/sec

25 Μεταφραστική ρύθμιση στα ευκαρυωττικά Α Α Α Α Α Α Β Β Β Β Β Β Β Β Β Β Β Β Β Β Β Β Β Β Β Β Β Β Β Β

26 Καλύπτρα 3 5 δεσμός P δεσμός P-P-P γ 3 β α 5 P-P-P

27 Εικόνα 5.18 Η καλύπτρα ασφαλίζει το 5 άκρο του mrna και μπορεί να μεθυλιωθεί σε αρκετές θέσεις. (Α) CH α β α (πολυκύτταροι) 6 Α Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004 (Ανώτεροι: CH3 σε (Α) ανά ~1000 Nt) Ορισμένοι πολυκύτταροι

28 Λειτουργίες της καλύπτρας Μεταφορά μέσω πυρηνικών πόρων Προστασία του mrna από 5 εξωνουκλεάσες Έναρξη της μετάφρασης (πρόσδεση μεταφραστικών παραγόντων) Απομάκρυνση του 1 ου (5 ) εσωνίου

29 Δημιουργία του 3 άκρου Εικόνα 5.17 σινιάλο Poly(A) Εσ-2 Εσ-1 Εκτός mrna των ιστονών

30 Σχηματισμός Poly(A) ουράς σινιάλο Poly(A) Ενδονουκλεάση (CF) Nt PABP

31 10-30 Nt Εικόνα Το σύμπλοκο επεξεργασίας του 3 άκρου περιλαμβάνει αρκετές ενζυμικές ενεργότητες. Οι παράγοντες CPSF και CstF αποτελούνται από αρκετές υπομονάδες. Τα άλλα συστατικά είναι μονομερή. Η συνολική μάζα του συμπλόκου ξεπερνάει τα 900 kd. PAP Nt Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

32 Λειτουργίες Poly(Α) ουράς (PABs) Μεταφορά μέσω πυρηνικών πόρων Προστασία του mrna από 3 εξωνουκλεάσες Έναρξη της μετάφρασης Ρύθμιση της μετάφρασης

33 Εικόνα 5.19 Το πολυ(α) + RNA μπορεί να διαχωριστεί από τα άλλα RNA με κλασμάτωση σε στήλη σεφαρόζης-ολιγο(dt). Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

34 Εικόνα 5.20 Η αποικοδόμηση του βακτηριακού mrna είναι μια διαδικασία δύο σταδίων. Οι ενδονουκλεολυτικές διασπάσεις προχωρούν από το 5 προς το 3 άκρο, πίσω από τα ριβοσώματα. Τα κομμάτια που απελευθερώνονται αποικοδομούνται από εξωνουκλεάσες που κινούνται από το 3 προς το 5 άκρο. 5 3 αποικοδόμηση κατά κανόνα 3 5 Eλικάση Αποικοδομόσωμα 3 5 αποικοδόμηση Η PAP των προκαρυωτικών προσθέτει ~10-40 Α στο 3 άκρο σε ορισμένα RNA. Σήμα αποικο-δόμησης από το 3 άκρο. Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

35 Εικόνα 5.21 Οι τροποποιήσεις των άκρων του mrna το προστατεύουν από την αποικοδόμηση. Εσωτερικές αλληλουχίες μπορεί να ενεργοποιήσουν τα συστήματα αποικοδόμησης. Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

36 Fig

37 Αποικοδόμηση 5 3 στους ζυμομύκητες Η αποαδενυλίωση επιτρέπει την αφαίρεση της καλύπτρας, γεγονός που οδηγεί στην εξωνουκλεολυτική διάσπαση του 5 άκρου. STOP 4E cap 1-2 Nt Αποαδενυλάση (εξωνουκλεάση) Ccr4 Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

38 Αποικοδόμηση 3 5 στους ζυμομύκητες Κωδική περιοχή Εικόνα 5.25 Η αποαδενυλίωση μπορεί να προκαλέσει άμεσα την ενδονουκλεολυτική διάσπαση και την εξωνουκλεολυτική αποικοδόμηση από το 3 άκρο. Ειδικές πολυα 3 εξωνουκλεάσες Ειδικές ενδοριβονουκλεάσες Εξώσωμα (~9 εξωνουκλεάσες) Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004 Ανώριμα πρόδρομα RΝΑ

39 Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004 Κωδική περιοχή AU rich element Εικόνα 5.22 Ρυθμιστικές πρωτεΐνες: Μια αλληλουχία ARE στην 3 μη μεταφραζόμενη περιοχή προκαλεί την αποικοδόμηση του mrna.

40 Εικόνα 5.23 Υποδοχέας της τρανσφερίνης του σιδήρου. Μια αλληλουχία IRE στην 3 UTR ελέγχει τη σταθερότητα του mrna. IRE Fe Τρανσφερίνη Υποδοχέας Φεριτίνη

41 Μεταφορά του mrna Figure 13-2 Μεταφορά mrna

42 Εικόνα 5.28 Τα RNA μεταφέρονται μέσω μεμβρανών σε μια ποικιλία συστημάτων Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

43 Μεταφορά του mrna στο κυτταρόπλασμα Εικ α) Με ειδική μεταφορά σε συγκεκριμένη θέση β) Με γενική αποικοδόμηση εκτός της συγκεκριμένης θέσης γ) Με ελεύθερη διάχυση και παγίδευση σε συγκεκριμένη θέση

44 Έμβρυο Δροσόφιλας

45 Τα ευκαρυωτικά γονίδια ρυθμίζονται σε πολλά επίπεδα Chromatin

46 Κ Ε Φ Α Λ Α Ι Α 6-7: Μετάφραση Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

47 Εικόνα 5.12 ριβοσώματα ~ (25%) Πρωτεϊνοσύνθεση: ~90% ATP

48 Ποια μακρομόρια και οργανίδια συμμετέχουν στη μετάφραση?

49 Εικόνα 5.1 Οι τρεις τύποι του RNA που είναι απαραίτητοι για τη γονιδιακή έκφραση σε όλα τα συστήματα είναι το mrna (φέρει την κωδική αλληλουχία), το trna (παρέχει το αμινοξύ που αντιστοιχεί σε κάθε κωδικόνιο) και το rrna (ένα μείζον συστατικό του ριβοσώματος που παρέχει το περιβάλλον για την πρωτεϊνοσύνθεση). Μεταφραστικοί παράγοντες Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

50 20 nm Μονάδες Svedberg Εικόνα 5.8 Το ριβόσωμα αποτελείται από δύο υπομονάδες.

51 Εικόνα 6.2 Τα ριβοσώματα είναι μεγάλα ριβονουκλεοπρωτεϊνικά σωμάτια που περιέχουν περισσότερο RNA από πρωτεΐνη και αποσυνδέονται σε μεγάλες και μικρές υπομονάδες. Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

52 Τι είναι τα πολυσώματα (πολυριβοσώματα) και από τι αποτελούνται

53 5 3 Εικόνα 5.9 Ένα πολυριβόσωμα αποτελείται από ένα mrna που μεταφράζεται ταυτόχρονα από πολλά ριβοσώματα, τα οποία κινούνται στην κατεύθυνση 5 3. Κάθε ριβόσωμα περιέχει δύο μόρια trna: το ένα φέρει την αρτιγενή πρωτεΐνη και το άλλο φέρει το επόμενο αμινοξύ που πρόκειται να προστεθεί. Προκαριωτικά > 10, Ευκαρυωτικά ~ 8 Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

54 Εικόνα 5.10 Η πρωτεϊνοσύνθεση λαμβάνει χώρα στα πολυσώματα. Η φωτογραφία είναι ευγενική προσφορά του Alex Rich. Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

55 Εικόνα 5.14 Οι μεταγραφικές μονάδες μπορούν να γίνουν ορατές στα βακτήρια. Η φωτογραφία είναι ευγενική προσφορά του Oscar Miller. Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

56 Ποια είναι η λειτουργία του trna

57 2 3 Εικόνα 5.3 Ένα trna έχει τη διττή ιδιότητα ενός προσαρμοστή, ο οποίος αναγνωρίζει τόσο το αμινοξύ όσο και το κωδικόνιο. Η 3 αδενοσίνη είναι ομοιοπολικά συνδεδεμένη με ένα αμινοξύ. Το αντικωδικόνιο δημιουργεί ζεύγη βάσεων με το κωδικόνιο στο mrna. Προσαρμοστής: Διαμεσολαβιτικό μόριο μεταξύ ενός αμινοξέος και ενός κωδικονίου Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

58 Εικόνα 5.4 Η διάταξη σε σχήμα τριφυλλιού του trna έχει σταθερές και ημισταθερές βάσεις και μια συντηρημένη ομάδα αλληλεπιδράσεων μεταξύ ζευγών βάσεων Nt D: Διυδροουριδίνη D D T:Ριβοθυμιδίνη Ψ:Ψευδοουριδίνη Επιπλέον ζεύγη: G-U, G-Ψ, A-Ψ Στέλεχος Βρόχος Βραχίονας αντικωδικονίου 3-21 Nt Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

59 Εικόνα 7.7 Και οι τέσσερις βάσεις μπορούν να τροποποιηθούν στο trna. Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις

60 Εικόνα 5.6, 7 Βραχίονας δέκτης Βραχίονας Δέκτης

61 Κ Ε Φ Α Λ Α Ι Ο 7 Γενετικός κώδικας Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

62 Εικόνα 7.1 Όλες οι τριπλέτες-κωδικόνια έχουν νόημα: 61 αντιστοιχούν σε αμινοξέα και 3 προκαλούν τερματισμό (STOP). α. 61 κωδικόνια + 3 λήξης β. Κοινός εκτός ορισμένων πρωτόζωων και μιτοχονδρίων γ. Συνώνυμα κωδικόνια δ. Εκφυλισμός στην 3 η βάση ε. Σε 2 συνώνυμα κωδικόνια η 3η βάση είναι Pur ή Pyr

63 ATG-ACA-GAT--//----TAC-AGA-TTA-CAG-ATT-ACA-GGA-TAG

64 Αλληλουχία mrna Αλληλουχία πρωτεΐνης Ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης

65 Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004 Εικόνα 7.2 Το πλήθος των κωδικονίων για κάθε αμινοξύ δεν αντιστοιχεί στη συχνότητα εμφάνισης του αμινοξέος στις πρωτεΐνες.

66 In vitro μετάφραση mrna + ribosomes Poly-U Poly-Phe Poly-C Poly-Pro Poly-A Poly-Lys

67

68 Rib + 3Nt + (trna + συνθετάσες + αα) Rib-3Nt-tRNA~αα Rib + 3Nt + (trna + συνθετάσες + αα) + αα* Rib-3Nt- trna~αα? + AUC AUC + AUC

69 Πόσα διαφορετικά trna χρειάζονται? Ο αριθμός των trna > του αριθμού των αμινοξέων 20 ομάδες ισοδεκτικών (ομότυπων) trna [trna1-cys, trna2-cys] Τα ομότυπα trna προσδένουν το ίδιο αα και προσδένονται σε συνώνυμα κωδικόνια Ο αριθμός των trna < του αριθμού των κωδικονίων (E. coli:45) Το ίδιο trna (αντικωδικόνιο) προσδένεται σε περισσότερα από ένα συνώνυμα κωδικόνια

70 Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004 Υπόθεση ταλάντευσης: Η ταλάντευση στο ζευγάρωμα βάσεων επιτρέπει το σχηματισμό ζευγών G-U μεταξύ της τρίτης βάσης του κωδικονίου και της πρώτης βάσης του αντικωδικονίου.

71 Εικόνα 7.5 Το ζευγάρωμα κωδικονίου-αντικωδικονίου περιλαμβάνει ταλάντευση στην τρίτη θέση. I A, U, C Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

72 Εικόνα 7.7 Και οι τέσσερις βάσεις μπορούν να τροποποιηθούν στο trna. Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

73 Εικόνα 7.8 Η ινοσίνη μπορεί να σχηματίσει ζεύγη με οποιαδήποτε από τις U, C και A. Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

74 G G G G U U C G G G G U U U U Ελάχιστο=31 trna I G G G C U C U U G G G G U U U U 1 η βάση αντικωδικονίου Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

75 Κ Ε Φ Α Λ Α Ι Α 6-7: Μετάφραση Προεναρκτήριες Αντιδράσεις (Προ-εναρκτήριες αντιδράσεις)

76 Εικόνα 6.7 Η πρωτεϊνοσύνθεση διακρίνεται σε τρία στάδια. ~30-35 aa P A Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

77 2 3 A Εικόνα 5.3 Ένα trna έχει τη διττή ιδιότητα ενός προσαρμοστή, ο οποίος αναγνωρίζει τόσο το αμινοξύ όσο και το κωδικόνιο. Η 3 αδενοσίνη είναι ομοιοπολικά συνδεδεμένη με ένα αμινοξύ. Το αντικωδικόνιο δημιουργεί ζεύγη βάσεων με το κωδικόνιο στο mrna. Αμινοάκυλο trna συνθετάσες 1 συνθετάση/αα/ομάδα ομότυπων trna Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

78 Προ-εναρκτήριεςαντιδράσεις Fig ~ ~ ~ ~ 2 - ή Χρησιμοποιείτε για τον πεπτιδικό δεσμό ~ αα~trna

79 Προ-εναρκτήριες αντιδράσεις Εικόνα 7.13 Μια αμινοακυλο-trna συνθετάση φορτώνει το trna με ένα αμινοξύ.

80 Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004 Εικόνα 7.14 Μια αμινοακυλο-trna συνθετάση φέρει τρεις ή τέσσερις περιοχές με διαφορετικές λειτουργίες. Οι πολυμερείς συνθετάσες διαθέτουν και μία επικράτεια ολιγομερισμού.

81 επιλογέας C N C A N Εικόνα 7.16 H trna συνθετάση τάξης Ι έρχεται σε επαφή με το trna στη μικρή αύλακα του στελέχους-δέκτη και στο αντικωδικόνιο. Κέντρο σύνθεσης Επιλογέας (ομότυπα) (1 δεσμός Η) (1 ή 2 δεσμοί Η)

82 Εικόνα 6.8 Στα διάφορα στάδια της πρωτεϊνοσύνθεσης, η συχνότητα λάθους είναι < από Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

83 ? Κινητικός έλεγχος ? P1 + m1 P1 + m2 P1-m1 (ΔG1= -15 Kcal/mol) P1-m2 (ΔG2 = -10 Kcal/mol) ΔG2-ΔG1 = -10-(-15) = 5 Kcal/mol (~ 1 δεσμός Η) P1-m1 P1-m2 = ~ 10 5

84 Κινητικός έλεγχος-ii Κινητικός έλεγχος-i Εικόνα 7.18 Η αναγνώριση του σωστού trna από τις συνθετάσες ελέγχεται σε δύο στάδια. Πρώτον, το ένζυμο έχει μεγαλύτερη συγγένεια για τα ομότυπα trna. Δεύτερον, η αμινοακυλίωση ενός λανθασμένου trna γίνεται με πολύ αργό ρυθμό.

85 Πρόσδεση αα στις συνθετάσες Tyr~tRNA συνθετάση 5 Kcal/mol Phe Tyr Trp Etyr-Tyr Etyr-Phe = ~ 105

86 EIle ~2 Kcal/mol E Ile + Ile( 3 H)/Val( 14 C) E Ile -Ile (3H) E Ile -Val (14C) = ~ 225 Λάθος = ~ 1/225 E Ile + Ile( 3 H)/Val( 14 C) + trna Ile E Ile -Ile (3H) E Ile -Val (14C) = ~ Λάθος = ~ 1/60.000

87 Ile Val Κινητικός έλεγχος Λάθη =1/225 Εικόνα 7.19 Ο διορθωτικός έλεγχος απαιτεί την πρόσδεση του ομότυπου trna στη συνθετάση που έχει δεσμεύσει λανθασμένο αμινοξύ και γίνεται είτε μέσω μιας αλλαγής στη διαμόρφωση που προκαλεί την υδρόλυση του αμινοακυλο- AMP είτε μέσω της μεταφοράς του αμινοξέος στο trna η οποία ακολουθείται από υδρόλυση. Χημικός διορθωτικός έλεγχος Λάθη=1/6000

88 Συνθετάση ισολευκίνης Εικόνα 7.21 Η Ile-tRNA συνθετάση έχει δύο ενεργά κέντρα. Τα αμινοξέα που είναι μεγαλύτερα από την Ile δεν μπορούν να ενεργοποιηθούν, επειδή δε χωρούν στο κέντρο σύνθεσης. Τα αμινοξέα που είναι μικρότερα από την Ile αποβάλλονται, διότι μπορούν να εισέλθουν στη θέση διόρθωσης. αα αα trnaile Ile Ile Ile~tRNAIle trnaval Val+tRNAIle Val Val Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

89 Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004 Εικόνα 5.5 Το νόημα του trna καθορίζεται από το αντικωδικόνιό του και όχι από το αμινοξύ του.

90 ΕΝΑΡΞΗ ΤΗΣ ΜΕΤΑΦΡΑΣΗΣ

91 ΕΝΑΡΞΗ ΤΗΣ ΜΕΤΑΦΡΑΣΗΣ

92 ΕΝΑΡΞΗ ΤΗΣ ΜΕΤΑΦΡΑΣΗΣ

93 Προκαρυωτικά AUG AUG AUG Ευκαρυωτικά

94 ΕΝΑΡΞΗ Fig Παράγοντες έναρξης IF1, IF2, IF3

95 Εικόνα 6.11 Η έναρξη απαιτεί υπομονάδες 30S, που φέρουν τον IF-3. ~20% P A μέσω του IF-2-G fmet GTP P Εναρκτήριο -2 A P A

96 Πως η μικρή ρβοσωματικά υπομονάδα αναγνωρίζει τη σωστή θέση πρόσδεσης στο mrna?

97 Εικόνα 6.16 Οι θέσεις πρόσδεσης του ριβοσώματος στο mrna μπορούν να απομονωθούν από σύμπλοκα έναρξης. Οι θέσεις πρόσδεσης περιλαμβάνουν μια ανοδική αλληλουχία Shine-Dalgarno και ένα κωδικόνιο έναρξης. 16S RNA Nt AGGAGGNNN UCCUCCNNN 3 8 Nt IF3? 16S RNA 5 AGGAGGNNN mrna 5 ---AGGAGG-----AUG UCCUCCNNN 3 P

98 (fmet-trna f ) Εικόνα 6.12 Το N-φορμυλο-μεθειονυλο-tRNA (fmet-trna f ) έναρξης δημιουργείται με φορμυλίωση του μεθειονυλο-trna, χρησιμοποιώντας ως συμπαράγοντα το φορμυλο-τετραϋδροφολικό οξύ. Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

99 IF-2 Εικόνα 6.14 Το fmet-trna f μπορεί να χρησιμοποιηθεί αποκλειστικά για την έναρξη από τις υπομονάδες 30S, ενώ τα άλλα αμινοακυλo-trna (αα-trna) μπορούν να χρησιμοποιηθούν κατά την επιμήκυνση από τα ριβοσώματα 70S. 5 & μη εισαγωγή στη θέση Α G U A -met G U G -val G U U -leu 5 Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

100 Εικόνα 6.13 Το fmet-trna f έχει μοναδικά χαρακτηριστικά, τα οποία το διακρίνουν ως το εναρκτήριο trna. GTP GTP P A Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

101 Μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις

102 Εικόνα 6.17 Η έναρξη πραγματοποιείται ανεξάρτητα σε κάθε κιστρόνιο ενός πολυκιστρονικού mrna. Όταν η διακιστρονική περιοχή είναι μακρύτερη από το εύρος του ριβοσώματος, η αποσύνδεση κατά τον τερματισμό ακολουθείται από ανεξάρτητη επανέναρξη στο επόμενο κιστρόνιο. Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

103 Εξάρτηση Fig RBS 2

104 Έναρξη στα ευκαρυωτικά Εικόνα 6.18 NNNPuNNAUGG

105 Επαναλαμβανόμενες ενάρξεις Fig Παράγοντες ρύθμισης Παράγοντες ρύθμισης

106 Εναρκτήριο trna P

107 Fig Έναρξη στα ευκαρυωτικά

108 α Έναρξη στα ευκαρυωτικά β 5Β- GTP

109 AUG Εικόνα 6.18 Η μικρή υπομονάδα των ευκαρυωτικών ριβοσωμάτων μεταναστεύει από το 5 άκρο του mrna στη θέση πρόσδεσης του ριβοσώματος, η οποία περιλαμβάνει ένα κωδικόνιο έναρξης AUG. Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

110 Έναρξη σε εσωτερικές θέσεις (IRES) Εικόνα S 5 5 1Α 1 3 IRES cap

111 ΕΠΙΜΗΚΥΝΣΗ ΤΗΣ ΜΕΤΑΦΡΑΣΗΣ

112 Επιμήκυνση στα προκαρυωτικά Παράγοντες επιμήκυνσης Tu, Ts, G Tu Tu G

113 P A fmet 5% των πρωτεϊνών μόρια/κύτταρο A Κιρομμυκίνη Εικόνα 6.25 Ο EF-Tu- GTP τοποθετεί το αμινοακυλο-trna στο ριβόσωμα και στη συνέχεια αποδεσμεύεται ως EF- Tu-GDP. Ο EF-Ts απαιτείται για την αντικατάσταση του GDP από το GTP. Η αντίδραση καταναλώνει GTP και απελευθερώνει GDP. Το μόνο αμινοακυλοtrna που δεν μπορεί να αναγνωριστεί από τον EF-Tu-GTP είναι το fmet-trnaf και έτσι αποτρέπεται η ενσωμάτωσή του σε εσωτερικά κωδικόνια AUG ή GUG. Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

114 Fig. 1 (πλαίσιο 14-4) Tu-GDP Tu-GTP

115 Tu-GTP Tu-GDP

116 Λάθη: Σωστό Λάθος

117 ΘέσηTu Εικόνα 7.27 Πρόσδεση του σωστού αα~trna στη μικρή ριβοσωματική υπομονάδα Αλληλεπίδραση trna-mrna με16s rrna Δημιουργία σταθερού συμπλόκου Αλλαγή στην στερεοδιαμόρφωση του ριβοσώματος Yδρόλυση του GTP Απομάκρυνση του Tu-GDP Μεταφορά ολόκληρου του αα~trna στην σωστή θέση. Tu-GTPαα~tRΝΑ Σταθερό σύμπλοκο ασταθές σύμπλοκο

118 Fig Σταθερό σύμπλοκο ασταθές σύμπλοκο

119 mrna trna mrna Εικόνα 6.47 Το ζευγάρωμα κωδικονίουαντικωδικονίου προάγει την αλληλεπίδραση του mrna με τις αδενίνες του 16S rrna, ενώ στην περίπτωση της αντιπαράθεσης μη συμπληρωματικών κωδικονίων-αντικωδικονίων το mrna δεν μπορεί να αλληλεπιδράσει με τις αδενίνες αυτές trna 5 16S rrna (3 η ) (1 η )

120 Πεπτιδικός δεσμός Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

121 Εικόνα 6.26 Ο σχηματισμός του πεπτιδικού δεσμού γίνεται με την αντίδραση μεταξύ του πολυπεπτιδίου του πεπτιδυλο-trna στη θέση P και του αμινοξέος του αμινοακυλοtrna στη θέση Α. Πεπτίδυλο-μεταφοράση-23S rrna Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

122 Εικόνα 6.27 Η πουρομυκίνη μιμείται το αμινοακυλο-trna, επειδή μοιάζει με ένα αρωματικό αμινοξύ συνδεδεμένο σε μια ένωση σακχάρου-βάσης. Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

123 Μετατόπιση του p~trna G GTP pi Εικόνα 6.28 Το βακτηριακό ριβόσωμα έχει τρεις θέσεις πρόσδεσης του trna. E G GDP Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004 P A

124 P A III G GTP pi Εικόνα 6.29 Τα μοντέλα για τη μετατόπιση περιλαμβάνουν δύο στάδια. Κατά το σχηματισμό του πεπτιδικού δεσμού, αρχικά μετατοπίζεται το αμινοάκυλο άκρο του trna από τη θέση Α στη θέση P. Στη συνέχεια, μετατοπίζεται το άκρο του αντικωδικονίου του trna στη θέση P. P A G-GDP P A III G-GDP A P III

125 Εικόνα 6.30 Η πρόσδεση των παραγόντων EF-Tu και EF-G γίνεται εναλλάξ, καθώς τα ριβοσώματα δέχονται καινούρια αμινοακυλοtrna, σχηματίζουν πεπτιδικούς δεσμούς και μετατοπίζονται. 1 ATP και 2 GTP/πεπτιδικό δεσμό Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

126 Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004 Εικόνα 6.31 Η δομή του τριμερούς συμπλόκου αμινοακυλο-trna EF-Tu GTP (αριστερά) μοιάζει με τη δομή του EF-G (δεξιά). Οι δομικά συντηρημένες επικράτειες του EF-Tu και του EF-G επισημαίνονται με κόκκινο και πράσινο, ενώ το trna και η επικράτεια του EF-G, που μοιάζει με αυτό, επισημαίνονται με μοβ. Η φωτογραφία είναι ευγενική προσφορά του Poul Nissen.

127 ΛΗΞΗ ΤΗΣ ΜΕΤΑΦΡΑΣΗΣ

128 Εικόνα 6.32 Η μοριακή μίμηση καθιστά δυνατή την πρόσδεση του συμπλόκου EF-Tu trna, του παράγοντα μετατόπισης EF-G και των παραγόντων αποδέσμευσης RF1/2-RF3 στην ίδια ριβοσωμική θέση. RF1: UAA/UAG RF2: UAA/UGA RF3: UAA/UAG/UGA erf1: UAA/UAG/UGA Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

129 Παράγοντες αποδέσμευσης/trna Gly-Gly-Gln Πεπτιδικό αντικωδικόνιο

130 Εικόνα 6.34 Η πεπτιδυλομεταφορά και ο τερματισμός είναι ανάλογες αντιδράσεις, στις οποίες μία βάση στο κέντρο της πεπτιδυλο-μεταφοράσης πυροδοτεί μία αντίδραση μετεστεροποίησης, προσβάλλοντας ένα δεσμό N-H ή O-H και διευκολύνοντας το άτομο N ή Ο να προσβάλλει το δεσμό στο trna. + RF Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

131 RF1/RF2 RF3 IF-3 IF-3 G GTP GDP + G Εικόνα 6.35 Ο παράγοντας αποδέσμευσης (RF) τερματίζει την πρωτεϊνοσύνθεση αποδεσμεύοντας την πρωτεϊνική αλυσίδα. Ο παράγοντας ανακύκλωσης του ριβοσώματος (RRF) αποδεσμεύει το τελευταίο trna και ο EF-G αποδεσμεύει τον RRF, προκαλώντας την αποσύνδεση των ριβοσωμικών υπομονάδων. RRF : Απομάκρυνση RF3 G-GTP: Απομάκρυνση RRF υδρόλυση GTP χωρισμός υπομονάδων Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

132 ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ ΜΕΤΑΦΡΑΣΗΣ

133 mrna αιμοσφαιρίνης Ρύθμιση στην έναρξη elf-2

134 Ρύθμιση μετά την έναρξη (5 UTR) Fe Τρανσφερίνη Υποδοχέας Φεριτίνη

135 Ρύθμιση μετά την έναρξη (3 UTR) Εικόνα 5.23 IRE Fe Τρανσφερίνη Υποδοχέας Φεριτίνη

136 Ρύθμιση από mirnas (5 UTR)

137 Ρύθμιση από mirnas (3 UTR) mrna degradation

138 A premature translation termination codons (PTC)

139 Ρύθμιση στην poly(a) ουρά Oocyte Early embryo Kinase CPE cytoplasmic polyadenylation element

140 Κ Ε Φ Α Λ Α Ι Ο 9: Η μεταγραφή Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

141 Κ Ε Φ Α Λ Α Ι Ο 9: Η μεταγραφή Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

142 K M Ευκαρυωτικοί οργανισμοί Προκαρυωτικοί οργανισμοί, DNA ιοί και RNA ρετροϊοί Εικόνα 9.1 Η λειτουργία της RNA πολυμεράσης είναι να μεταγράφει μια αλυσίδα δίκλωνου DNA σε RNA. Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

143 Σύνθεση mrna στους ιούς Μεταγραφή Μεταγραφή

144 Ορολογία 5 3 Μεταγραφική μονάδα Πρωτογενές μετάγραφο Κ Μ Εικόνα 9.2 Μια μεταγραφική μονάδα μεταγράφεται σε ένα ενιαίο RNA. Ώριμο RNA (mrna) Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

145 Ποια είναι τα υποστρώματα της RNA Πολυμεράσης?

146 Εικόνα 9.3 Οι αλυσίδες DNA διαχωρίζονται για να σχηματίσουν μια μεταγραφική θηλιά. Το RNA συντίθεται με το ζευγάρωμα συμπληρωματικών βάσεων με μία από τις αλυσίδες του DNA. Τριφωσφοριβονουκλεοτίδια A, U, G, C Συχνότητα λαθών = 10-6 Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

147 P-P-P Κατεύθυνση μεταγραφής 5 3 γ β α P-P-P 3 Ι Η 2 3 δεόξυ-τριφωσφορική αδενοσύνη 3 5

148 Κάθε γονίδιο μεταγράφεται από την μία μόνο αλυσίδα DNA 5 Κ Κ Μ 3 3 Μ Μ Κ 5 5 Κ Κ Μ 3 3 Μ Μ Κ 5

149 Υποκινητές Fig Y +1 Y

150 Βακτηριακή RNA Πολυμεράση 465 kda 16 bp DNA ~9 bp

151 RNA Πολυμεράσες Εικόνα 9.9 Η θέση δέκα υπομονάδων της RNA πολυμεράσης έχει χαρτογραφηθεί στην κρυσταλλική δομή. Τα χρώματα των υπομονάδων είναι τα ίδια με αυτά των κρυσταλλικών δομών στις Εικόνες που ακολουθούν. Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

152 RNA Πολ. E. coli RNA Πολ. σακχαρομύκητα

153 Μεταγραφή στους προκαρυωτικούς οργανισμούς

154 Εικόνα 9.16 Οι RNA πολυμεράσες των ευβακτηρίων αποτελούνται από τέσσερα είδη υπομονάδων: οι α, β και β έχουν σχετικά σταθερά μεγέθη σε διάφορα είδη βακτηρίων, ενώ η σ ποικίλλει σε μεγαλύτερο βαθμό. Κεντρικό ένζυμο (ΚΕ) ω Συναρμολόγηση Και σταθεροποίηση Του ενζύμου Ολοένζυμο (ΟΕ) = ΚΕ + σ 40 Nt/sec Συχνότητα λαθών = 10-6

155 Λειτουργίες του Ολοενζύμου και του ΚΕ της RNA πολ. Εικόνα 9.5, 9.6 σ ΟΕ σ ΚΕ ~9 bp

156 Λειτουργίες ΟΕ και ΚΕ Εικόνα 9.19 σ Ατελής σύνθεση -60 ~9Nt 5

157 Μοντέλα διακοπτόμενης έναρξης +10 Μοντέλο κάμπιας +10 Μοντέλο πτύχωσης +10

158 Σ-9.17 Μη ειδική πρόσδεση K Εικόνα 9.17 Οι υπομονάδες β και β δημιουργούν επαφές τόσο με τη μήτρα όσο και με την κωδική αλυσίδα του DNA, κυρίως στην περιοχή της μεταγραφικής θηλιάς και πιο καθοδικά από αυτή. Οι επαφές με το RNA εντοπίζονται κυρίως στη μεταγραφική θηλιά. Συνήθως, καθοδικά δεν υπάρχει RNA και οι επαφές με αυτό γίνονται μόνο σε ειδικές περιπτώσεις στην κάθοδο, όταν το ένζυμο οπισθοδρομεί. M Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

159 DNA + Pol DNA + Pol DNA-Pol t 1/2 [DNA-Pol] KB = (Μ [DNA] [Pol] -1 ) k = DNA-Pol / t

160 ΚΒ= 10 5 t 1/2 =60 min ΚΒ= 10 1 t 1/2 =~1 sec ΚΒ= t 1/2 > hr ΚΒ= έναρξη/30 min ΚΒ= έναρξη/1 sec (1.800X) Εικόνα 9.22

161 Υποστάδια της έναρξης Αναγνώριση Συχνότητα ενάρξεων< 1 έναρξη/sec Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

162 Εικόνα 9.22 ~Όλα τα ένζυμα είναι προσδεμένα στο DNA (~1500 OE και 3500 KE) 1/2 θέσεις χαλαρής πρόσδεσης 1/2 θέσεις ειδικής πρόσδεσης

163 Εικόνα 9.23 Η κινητική σταθερά πρόσδεσης της RNA πολυμεράσης στους υποκινητές είναι γρηγορότερη από την τυχαία διάχυση.

164 Εικόνα 9.24 Η RNA πολυμεράση προσδένεται πολύ γρήγορα σε τυχαίες αλληλουχίες DNA και θα μπορούσε να βρει έναν υποκινητή με άμεση μετατόπιση από μία προσδεδεμένη αλληλουχία DNA σε άλλη. Αργή 4Χ10 6 Γρήγορη bp Y Y 4x10 6 bp/~1500 OE= bp 1 OE/2.600 bp Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

165 Εικόνα 9.29 Η μέθοδος της ιχνηλάτησης προσδιορίζει τις θέσεις πρόσδεσης πρωτεϊνών στο DNA βάσει της προστασίας που παρέχουν ενάντια στη δημιουργία εγκοπών. T4 πολυνουκλεοτιδική κινάση ~50 bp ~80 bp Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

166 Υποκινητές προκαρυωτικών γονιδίων A,G,T (μείωση της μεταγραφής) A (αύξηση της μεταγραφής) TTGACA bp TATAAT 5-9 bp % Pu Αντιπροσωπευτικές αλληλουχίες

167 12 bp ειδικό σήμα (4 12 = ~17X10 6 ) Σ-9.27 TTGACA TATAAT Pu (Ιδανικός υποκινητής) Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

168 Εικόνα 9.19 Η RNA πολυμεράση διέρχεται από αρκετά στάδια πριν τη φάση επιμήκυνσης. Ένα κλειστό δυαδικό σύμπλοκο μετατρέπεται σε μια ανοικτή μορφή και μετά σε ένα τριαδικό σύμπλοκο. Μεταλλάξεις (-35) [αναγνώριση και πρόσδεση] Μεταλλάξεις (-10) [τήξη] Μεταλλάξεις (+1/+30) [χρόνος εκκαθάρισης] Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

169 K M Θέσεις αναγνώρισης Θέσεις πρόσδεσης

170 Πρόσδεση RNA πολ. στους υποκινητές Εικόνα 12.7 β β.2.4 (Α+Τ)n -50

171 Πρόσδεση RNA πολ. στους υποκινητές

172 Εικόνα Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

173 Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004 Εικόνα 9.37

174 ΚΕ Εικόνα 9.38 Το Ν-τελικό άκρο του σίγμα εμποδίζει τις επικράτειες πρόσδεσης στο DNA να προσδεθούν σε αυτό. Όταν σχηματίζεται ένα ανοικτό σύμπλοκο, το Ν-τελικό άκρο μετακινείται 20 Ǻ μακριά και οι δύο επικράτειες πρόσδεσης στο DNA απομακρύνονται η μία από την άλλη κατά 15 Ǻ. Πρόσδεση στο ΚΕ μετατόπιση της Ν-τελικής περιοχής κατά 20 Α ο πρόσδεση στο -35 κουτί και ακολούθως στο -10 κουτί αποδιάταξη του DNA εκτόπιση της Ν-τελικής περιοχής και εισαγωγή της περιοχής +1 του DNA στο ενεργό κέντρο του ενζύμου Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

175 Πρόσδεση του παράγοντα σ στους υποκινητές 2.4 A T T A A 2.3 T Κ Μεταγραφή Μ

176 Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004 Εικόνα 9.35

177 Εικόνα 9.31 H μεταγραφή δημιουργεί θετικά υπερελικωμένο DNA μπροστά από την RNA πολυμεράση και αρνητικά υπερελικωμένο DNA πίσω απ αυτήν.

178 Εικόνα 9.21 Χημικός διορθωτικός έλεγχος Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

179 Εγγενής τερματισμός Εικόνα GCAATCCCGAAACAGTTCGGTAGTAGTTAGAGCCGATAACGGTTTCGGGATTTTTTT CGTTAGGGCTTTGTCAAGCCATC ATCAATCTCGGCTATTGCCAAAGCCCTAAAAAAA--5 Βρόχος (6-12 Nt) Φουρκέτα Στέλεχος (7-20 bp) Παύση της RNA Pol ~1sec

180 Εικόνα 9.46 Οι αλληλουχίες DNA που απαιτούνται για τον τερματισμό εντοπίζονται πριν την αλληλουχία τερματισμού. Ίσως είναι αναγκαίος ο σχηματισμός μιας φουρκέτας στο RNA. Τερματιστής

181 Εικόνα 9.48 Ένας Rho-εξαρτώμενος τερματιστής έχει αλληλουχία πλούσια σε C και φτωχή σε G, και εντοπίζεται πριν από την ακριβή θέση (ή θέσεις) τερματισμού. Η αλληλουχία παρουσιάζεται με τη μορφή του RNA. Αντιπροσωπεύει το 3 άκρο του RNA Nt Rut Rut

182 Εικόνα 9.49 Ο παράγοντας Rho «καταδιώκει» την RNA πολυμεράση κατά μήκος του RNA και μπορεί να προκαλέσει τερματισμό όταν προλάβει το στάσιμο ένζυμο σε μια Rho-εξαρτώμενη αλληλουχία τερματισμού. Rut β Κωδικόνιο Λήξης ATP ADP Ο ρ έχει RNA-εξαρτώμενη ενεργότητα ATPάσης και ATP-εξαρτώμενη ενεργότητα ελικάσης. ATP ADP

183 * * X Εικόνα 9.50: Φαινόμενο πολικότητος.

184 Ασθενείς τερματιστές Εικόνα 9.54 Ασθενής Τερματικοί

185 Εικόνα Τα οπερόνια rrn στο βακτήριο E. coli περιέχουν γονίδια που κωδικοποιούν τόσο για rrna όσο και για trna. Το ακριβές μήκος των μεταγράφων εξαρτάται από τους υποκινητές (P) και τις αλληλουχίες τερματισμού (t) που χρησιμοποιούνται. Κάθε προϊόν RNA πρέπει να απελευθερωθεί από το μετάγραφο με αποκοπή στα δύο του άκρα. RNAαση ΙΙΙ

186 Πέψη Σ RΝάσης a ΙΙΙ 23S και 16S rrnas Ένδονουκλεάσες Εξοωνουκλεάσες

187 Τύπος ΙΙ Εικόνα 7.6 α Τύπος Ι CCA RNAάση D β γ CCA 3 δ ε

188 Ρύθμιση της μεταγραφής στους προκαρυωτικούς οργανισμούς

189 Εικόνα 10.1 Trans-ρυθμιστικοί παράγοντες (Μεταγραφικοί παράγοντες) [Καταστολείς (-) (αρνητικός έλεγχος)] [Ενεργοποιητές (+) (θετικός έλεγχος) Cis-ρυθμιστικά στοιχεία (σε φυσική σύνδεση με το γονίδιο στόχο). Αλληλουχίες στις οποίες προσδένονται οι μεταγραφικοί παράγοντες Μικρομόρια που προσδένονται στους μεταγραφικούς παράγοντες και επάγουν τη μεταγραφή (επαγωγείς) ή καταστέλουν τη μεταγραφή (συγκαταστολείς) Γονίδιο στόχος Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

190 Εικόνα 10.2 Στον αρνητικό έλεγχο, ένας trans-δραστικός καταστολέας προσδένεται στο cisδραστικό χειριστή και σταματά τη μεταγραφή. Αρνητική ρύθμιση (Καταστολείς) Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

191 Εικόνα 10.3 Στο θετικό έλεγχο, οι trans-δραστικοί παράγοντες πρέπει να προσδεθούν στις cis-δραστικές θέσεις προκειμένου η RNA πολυμεράση να αρχίσει τη μεταγραφή από τον υποκινητή. Θετική ρύθμιση (Ενεργοποιητές) Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

192 Αρνητική ρύθμιση Καταστολέας lac

193 Απέκκριση Οπερόνιο λακτόζης

194 Εικόνα 10.4 Το οπερόνιο lac καταλαμβάνει ~6.000 bp DNA. Το γονίδιο laci (αριστερά) έχει το δικό του υποκινητή (P) και τερματιστή. Το άκρο του laci βρίσκεται ακριβώς πριν τον υποκινητή των δομικών γονιδίων. Ο χειριστής (O) καταλαμβάνει τα πρώτα 26 bp της μεταγραφικής μονάδας. Το γονίδιο lacz ξεκινά από τη βάση +39. Μετά από αυτό ακολουθούν τα γονίδια lacυ και laca. Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

195 38 kda (10 μόρια/κύτταρο, ΚΒ=2x10 13 ) X Εικόνα 10.7 Ο καταστολέας διατηρεί το οπερόνιο lac στην ανενεργή κατάσταση μέσω της πρόσδεσής του στο χειριστή. Ο καταστολέας απεικονίζεται ως μια σειρά από συνδεδεμένες επικράτειες, όπως προέκυψαν από την ανάλυση της κρυσταλλικής δομής του. Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

196 Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004 Χ Εικόνα 10.8 Η προσθήκη του επαγωγέα μετατρέπει τον καταστολέα στην ανενεργή μορφή του, που δεν μπορεί να προσδεθεί στο χειριστή. Αυτό επιτρέπει στην RNA πολυμεράση να αρχίσει τη μεταγραφή.

197 Εικόνα 10.6 Η προσθήκη επαγωγέα προκαλεί τη γρήγορη επαγωγή του mrna του οπερονίου lac και ακολουθείται από τη σύνθεση των ενζύμων, μετά από μια σύντομη φάση υστέρησης. Η απομάκρυνση του επαγωγέα ακολουθείται από γρήγορη παύση της σύνθεσης.

198 (Cis-επικρατείς) Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004 Εικόνα 10.9 Οι μεταλλάξεις του χειριστή είναι ιδιοστατικές, επειδή ο χειριστής καθίσταται ανίκανος να προσδέσει την πρωτεΐνη-καταστολέα. Αυτό επιτρέπει στην RNA πολυμεράση να έχει απεριόριστη πρόσβαση στον υποκινητή. Οι μεταλλάξεις Oc είναι cis-δραστικές, επειδή επηρεάζουν μόνο τα συνεχόμενα συνδεδεμένα δομικά γονίδια.

199 Χ laci - (Transυποτελείς) ή δεν παράγουν καταστολέα Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004 Εικόνα Οι μεταλλάξεις που απενεργοποιούν το γονίδιο laci προκαλούν την ιδιοστατική έκφραση του οπερονίου, επειδή η μεταλλαγμένη πρωτεΐνη του καταστολέα δεν μπορεί να προσδεθεί στο χειριστή.

200 Μόνιμη καταστολή (Επαγωγέας) laci S (Trans- Επικρατής) Χ ή δεν παράγουν καταστολέα Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

201 Εικόνα 10.5 Ο καταστολέας και η RNA πολυμεράση προσδένονται σε αλληλοεπικαλυπτόμενες θέσεις, γύρω από το σημείο έναρξης της μεταγραφής του οπερονίου lac. Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

202 Συνεχείς και ανεστραμμένες επαναλήψεις Εικόνα Ο χειριστής lac έχει συμμετρική αλληλουχία. Η αλληλουχία αριθμείται σε σχέση με το σημείο έναρξης της μεταγραφής στο +1. Τα ροζ βέλη αριστερά και δεξιά δείχνουν τις δύο ανεστραμμένες επαναλήψεις. Με πράσινο φόντο εμφανίζονται οι ταυτόσημες θέσεις των δύο ανεστραμμένων επαναλήψεων. Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

203 Κ Μ Εικόνα Οι βάσεις που έρχονται σε επαφή με τον καταστολέα μπορεί να ταυτοποιηθούν με ομοιοπολική διασύνδεση ή με πειράματα που δείχνουν αν η χημική μετατροπή τους αποτρέπει την πρόσδεση. Έτσι, αναγνωρίστηκαν θέσεις και στις δύο αλυσίδες του DNA, που εκτείνονται από το +1 έως το +23. Ιδιοστατικές μεταλλάξεις συμβαίνουν σε 8 θέσεις του χειριστή, ανάμεσα στο +5 και στο +17. Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

204 Εικόνα Ο επαγωγέας προσδένεται στον ελεύθερο καταστολέα, ώστε να διαταράξει μια ισορροπία (αριστερά), ή προσδένεται άμεσα στον καταστολέα που βρίσκεται προσδεδεμένος στο χειριστή (δεξιά); Ταχεία επαγωγή t1/2>15 min t1/2<1 min

205 Και τα 10 μόρια του καταστολέα είναι προσδεμένα στο DNA Εικόνα Ο καταστολέας Lac προσδένεται ισχυρά και με ειδικό τρόπο στο χειριστή του, αλλά απελευθερώνεται από τον επαγωγέα. Όλες οι σταθερές ισορροπίας δίνονται σε M -1. Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

206 Βασικά επίπεδα Εικόνα Σχεδόν όλη η ποσότητα του καταστολέα ενός κυττάρου βρίσκεται δεσμευμένη στο DNA. 96% Επαγόμενα επίπεδα Κατάληψη του χειριστή 3% Ταχεία καταστολή Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

207 Εικόνα Η δομή ενός μονομερούς του καταστολέα Lac αποκαλύπτει αρκετές ανεξάρτητες επικράτειες. Η φωτογραφία είναι ευγενική προσφορά του Mitchell Lewis. Κεφαλή Διμερή και τετραμερή ολιγομερισμού Τετραμερή Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

208 Μοτίβο HTH Φερμουάρ λευκίνης

209 Εικόνα Το τετραμερές του καταστολέα αποτελείται από δύο διμερή. 1 Ομοδιμερισμός Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

210 Εικόνα Αν και τα δύο διμερή σε ένα τετραμερές καταστολέα προσδεθούν στο DNA, τότε το DNA ανάμεσα στις δύο θέσεις πρόσδεσης σχηματίζει ένα βρόχο. Ο2-80 Ο Ο1 O3

211 -35 Εικόνα Όταν ένας τετραμερής καταστολέας προσδένεται σε δύο χειριστές, η έκταση του DNA ανάμεσά τους εξωθείται στη δημιουργία ενός σφιχτού βρόχου. Η μπλε δομή στο κέντρο του βρόχου του DNA αντιπροσωπεύει την πρωτεΐνη CAP (CRP), άλλη μια ρυθμιστική πρωτεΐνη που προσδένεται στην περιοχή. Η φωτογραφία είναι ευγενική προσφορά του Mitchell Lewis. ΤΑΤΑ

212 Ρύθμιση της μεταγραφής στους προκαρυωτικούς οργανισμούς

213 Εικόνα 10.1 Trans-ρυθμιστικοί παράγοντες (Μεταγραφικοί παράγοντες) [Καταστολείς (-) (αρνητικός έλεγχος)] [Ενεργοποιητές (+) (θετικός έλεγχος) Cis-ρυθμιστικά στοιχεία (σε φυσική σύνδεση με το γονίδιο στόχο). Αλληλουχίες στις οποίες προσδένονται οι μεταγραφικοί παράγοντες Μικρομόρια που προσδένονται στους μεταγραφικούς παράγοντες και επάγουν τη μεταγραφή (επαγωγείς) ή καταστέλουν τη μεταγραφή (συγκαταστολείς) Γονίδιο στόχος Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

214 Εικόνα 10.2 Στον αρνητικό έλεγχο, ένας trans-δραστικός καταστολέας προσδένεται στο cisδραστικό χειριστή και σταματά τη μεταγραφή. Αρνητική ρύθμιση (Καταστολείς) Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

215 Εικόνα 10.3 Στο θετικό έλεγχο, οι trans-δραστικοί παράγοντες πρέπει να προσδεθούν στις cis-δραστικές θέσεις προκειμένου η RNA πολυμεράση να αρχίσει τη μεταγραφή από τον υποκινητή. Θετική ρύθμιση (Ενεργοποιητές) Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

216 Αρνητική ρύθμιση Καταστολέας lac

217 Απέκκριση Οπερόνιο λακτόζης

218 Εικόνα 10.4 Το οπερόνιο lac καταλαμβάνει ~6.000 bp DNA. Το γονίδιο laci (αριστερά) έχει το δικό του υποκινητή (P) και τερματιστή. Το άκρο του laci βρίσκεται ακριβώς πριν τον υποκινητή των δομικών γονιδίων. Ο χειριστής (O) καταλαμβάνει τα πρώτα 26 bp της μεταγραφικής μονάδας. Το γονίδιο lacz ξεκινά από τη βάση +39. Μετά από αυτό ακολουθούν τα γονίδια lacυ και laca. Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

219 38 kda (10 μόρια/κύτταρο, ΚΒ=2x10 13 ) X Εικόνα 10.7 Ο καταστολέας διατηρεί το οπερόνιο lac στην ανενεργή κατάσταση μέσω της πρόσδεσής του στο χειριστή. Ο καταστολέας απεικονίζεται ως μια σειρά από συνδεδεμένες επικράτειες, όπως προέκυψαν από την ανάλυση της κρυσταλλικής δομής του. Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

220 Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004 Χ Εικόνα 10.8 Η προσθήκη του επαγωγέα μετατρέπει τον καταστολέα στην ανενεργή μορφή του, που δεν μπορεί να προσδεθεί στο χειριστή. Αυτό επιτρέπει στην RNA πολυμεράση να αρχίσει τη μεταγραφή.

221 Εικόνα 10.6 Η προσθήκη επαγωγέα προκαλεί τη γρήγορη επαγωγή του mrna του οπερονίου lac και ακολουθείται από τη σύνθεση των ενζύμων, μετά από μια σύντομη φάση υστέρησης. Η απομάκρυνση του επαγωγέα ακολουθείται από γρήγορη παύση της σύνθεσης. //

222 (Cis-επικρατείς) Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004 Εικόνα 10.9 Οι μεταλλάξεις του χειριστή είναι ιδιοστατικές, επειδή ο χειριστής καθίσταται ανίκανος να προσδέσει την πρωτεΐνη-καταστολέα. Αυτό επιτρέπει στην RNA πολυμεράση να έχει απεριόριστη πρόσβαση στον υποκινητή. Οι μεταλλάξεις Oc είναι cis-δραστικές, επειδή επηρεάζουν μόνο τα συνεχόμενα συνδεδεμένα δομικά γονίδια.

223 Χ laci - (Transυποτελείς) ή δεν παράγουν καταστολέα Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004 Εικόνα Οι μεταλλάξεις που απενεργοποιούν το γονίδιο laci προκαλούν την ιδιοστατική έκφραση του οπερονίου, επειδή η μεταλλαγμένη πρωτεΐνη του καταστολέα δεν μπορεί να προσδεθεί στο χειριστή.

224 Μόνιμη καταστολή (Επαγωγέας) laci S (Trans- Επικρατής) Χ ή δεν παράγουν καταστολέα Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

225 Εικόνα 10.5 Ο καταστολέας και η RNA πολυμεράση προσδένονται σε αλληλοεπικαλυπτόμενες θέσεις, γύρω από το σημείο έναρξης της μεταγραφής του οπερονίου lac. Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

226 Συνεχείς και ανεστραμμένες επαναλήψεις Εικόνα Ο χειριστής lac έχει συμμετρική αλληλουχία. Η αλληλουχία αριθμείται σε σχέση με το σημείο έναρξης της μεταγραφής στο +1. Τα ροζ βέλη αριστερά και δεξιά δείχνουν τις δύο ανεστραμμένες επαναλήψεις. Με πράσινο φόντο εμφανίζονται οι ταυτόσημες θέσεις των δύο ανεστραμμένων επαναλήψεων. Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

227 Κ Μ Εικόνα Οι βάσεις που έρχονται σε επαφή με τον καταστολέα μπορεί να ταυτοποιηθούν με ομοιοπολική διασύνδεση ή με πειράματα που δείχνουν αν η χημική μετατροπή τους αποτρέπει την πρόσδεση. Έτσι, αναγνωρίστηκαν θέσεις και στις δύο αλυσίδες του DNA, που εκτείνονται από το +1 έως το +23. Ιδιοστατικές μεταλλάξεις συμβαίνουν σε 8 θέσεις του χειριστή, ανάμεσα στο +5 και στο +17. Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

228 Εικόνα Ο επαγωγέας προσδένεται στον ελεύθερο καταστολέα, ώστε να διαταράξει μια ισορροπία (αριστερά), ή προσδένεται άμεσα στον καταστολέα που βρίσκεται προσδεδεμένος στο χειριστή (δεξιά); Ταχεία επαγωγή t1/2>15 min t1/2<1 min

229 Και τα 10 μόρια του καταστολέα είναι προσδεμένα στο DNA Εικόνα Ο καταστολέας Lac προσδένεται ισχυρά και με ειδικό τρόπο στο χειριστή του, αλλά απελευθερώνεται από τον επαγωγέα. Όλες οι σταθερές ισορροπίας δίνονται σε M -1. Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

230 Βασικά επίπεδα Εικόνα Σχεδόν όλη η ποσότητα του καταστολέα ενός κυττάρου βρίσκεται δεσμευμένη στο DNA. 96% Επαγόμενα επίπεδα Κατάληψη του χειριστή 3% Ταχεία καταστολή Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

231 Εικόνα Η δομή ενός μονομερούς του καταστολέα Lac αποκαλύπτει αρκετές ανεξάρτητες επικράτειες. Η φωτογραφία είναι ευγενική προσφορά του Mitchell Lewis. Κεφαλή Διμερή και τετραμερή ολιγομερισμού Τετραμερή Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

232 Μοτίβο HTH Φερμουάρ λευκίνης

233 Εικόνα Το τετραμερές του καταστολέα αποτελείται από δύο διμερή. 1 Ομοδιμερισμός Genes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004

234 Εικόνα Αν και τα δύο διμερή σε ένα τετραμερές καταστολέα προσδεθούν στο DNA, τότε το DNA ανάμεσα στις δύο θέσεις πρόσδεσης σχηματίζει ένα βρόχο. Ο2-80 Ο Ο1 O3

235 Πως ο καταστολέας εμποδίζει την RNA πολυμεράση? Lac promoter+rna Pol (KB=10 7 ) πολύ μικρή συχνότητα ενάρξεων Lac promoter + RNA Pol + K, (KB= 10 9 ) μεγάλη συχνότητα ενάρξεων Ο καταστολέας αυξάνει την πρόσδεση της RNA Pol στον υποκινητή κατά δύο τάξεις μεγέθους αλλά δεν επιτρέπει τη δημιουργία του ανοιχτού συμπλόκου

236 -35 Εικόνα Όταν ένας τετραμερής καταστολέας προσδένεται σε δύο χειριστές, η έκταση του DNA ανάμεσά τους εξωθείται στη δημιουργία ενός σφιχτού βρόχου. Η μπλε δομή στο κέντρο του βρόχου του DNA αντιπροσωπεύει την πρωτεΐνη CAP (CRP), άλλη μια ρυθμιστική πρωτεΐνη που προσδένεται στην περιοχή. Η φωτογραφία είναι ευγενική προσφορά του Mitchell Lewis. ΤΑΤΑ

237 Θετική ρύθμιση Ενεργοποιητής CAP

238 Αλληλεπίδραση CAP με RNA pol μέσω των α υπομονάδων Fig Ασθενές +1 Θέση Χειριστή

239 - + Εικόνα 11.6 Η γλυκόζη, μειώνοντας τα επίπεδα του camp, εμποδίζει τη μεταγραφή των οπερονίων που εξαρτώνται από την ενεργότητα της πρωτεΐνης CRP kda (CAP) Επικράτεια ενεργοποίησης CRP: camp Receptor Protein CAP: Catabolite Activator Protein Επικράτεια πρόσδεσης H CAP ρυθμίζει ~ 100 γονίδια

240 Fig lac Ασθενές Εικόνα 11.7 H πρότυπη αλληλουχία πρόσδεσης της CRP (CAP) περιέχει το πολύ καλά συντηρημένο πενταμερές TGTGA και (μερικές φορές) και την ανάστροφή του αλληλουχία (TCANA).

241 Ενεργοποιητής CAP

242 Ρύθμιση οπερονίου από γλυκόζη minimum