ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟ ΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΚΑΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ

Transcript

1 ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟ ΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΚΑΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Ρόλος των RGS πρωτεϊνών στην κυτταρική σηµατοδότηση των G πρωτεϊνών Μαυρογονάτου Ελένη Υπεύθυνη: Ηρώ Γεωργούση Αθήνα, 2006

2 Εισαγωγή Η µεταγωγή σηµάτων είναι µια βασική βιολογική διεργασία κατά την οποία οι αλλαγές στην εξωκυτταρική πληροφορία µετατρέπονται σε αλλαγές στις ενδοκυτταρικές λειτουργίες. Ρυθµίζει ένα τεράστιο εύρος κυτταρικών δραστηριοτήτων, από την απελευθέρωση νευροδιαβιβαστών και ορµονών, τον έλεγχο της ροής ιόντων διαµέσου της µεµβράνης και την ενεργοποίηση ή καταστολή της µεταγραφής γονιδίων, ως και τον κυτταρικό πολλαπλασιασµό, τη διαφοροποίηση, την επιβίωση ή τον κυτταρικό θάνατο. Η διακυτταρική επικοινωνία είναι ένα από τα κυριότερα χαρακτηριστικά των πολυκύτταρων οργανισµών. Βασίζεται στην ύπαρξη διαβιβαστών που απελευθερώνονται από το ένα κύτταρο και προκαλούν την απόκριση των άλλων µετά από αναγνώριση από εξειδικευµένους υποδοχείς. Εκτός από τους ενδοκυτταρικούς υποδοχείς που συχνά λειτουργούν ως ρυθµιστές της µεταγραφής, έχουν ταυτοποιηθεί πολλοί υποδοχείς της κυτταρικής επιφάνειας οι οποίοι µπορούν να ταξινοµηθούν σε τρεις οµάδες. Η πρώτη οµάδα περιλαµβάνει τα κανάλια ιόντων (που ενεργοποιούνται από προσδέτες), των οποίων η ελεγχόµενη διαπερατότητα εξασφαλίζει τη γρήγορη παραγωγή κυτταρικών αποκρίσεων. Η δεύτερη οµάδα αποτελείται από τις συνδεδεµένες µε τη µεµβράνη κινάσες τυροσίνης που, µετά από τη δέσµευση του προσδέτη, φωσφορυλιώνουν πρωτεΐνες-κλειδιά που σχετίζονται µε τη ρύθµιση του κυτταρικού πολλαπλασιασµού και τη διαφοροποίηση. Η τελευταία οµάδα περιλαµβάνει τους υποδοχείς που συζεύγνυνται µε G πρωτεΐνες (G-protein coupled receptors, GPCRs), οι οποίοι προκαλούν ενδοκυτταρικές αποκρίσεις µέσω σηµατοδότησης που απαιτεί τη συµµετοχή πρωτεϊνών που δεσµεύουν GTP (GTP-binding proteins, G-proteins) και άλλων µεµβρανοσυνδεόµενων και ενδοκυτταρικών πρωτεϊνών. Το κύριο χαρακτηριστικό του τελευταίου συστήµατος είναι η πολυπλοκότητά του, απόρροια της ποικιλίας ρυθµιστικών µηχανισµών που ελέγχουν τη φύση, το µέγεθος και τη διάρκεια των κυτταρικών αποκρίσεων. Μόλις πρόσφατα άρχισαν να δίνονται απαντήσεις σε κάποια από τα βασικά ερωτήµατα σχετικά µε τη µοριακή λειτουργία αυτής της τάξης των υποδοχέων. Πώς, για παράδειγµα, οι ορµόνες, οι νευροδιαβιβαστές και άλλα σηµατοδοτικά µόρια που διαφέρουν τόσο πολύ στη χηµική τους δοµή µπορούν να ενεργοποιήσουν υποδοχείς µε παρόµοια τριτοταγή δοµή και ποια είναι η φύση των αλλαγών που παρατηρούνται κατά τη δέσµευση του αγωνιστή στον υποδοχέα, την ενεργοποίηση του τελευταίου 1

3 και την επακόλουθη µετάδοση του σήµατος στην G πρωτεΐνη και στα άλλα σηµατοδοτικά µονοπάτια. Υποδοχείς που συζεύγνυνται µε G πρωτεΐνες (GPCRs) Οι GPCRs αποτελούν τη µεγαλύτερη οικογένεια µορίων της κυτταρικής επιφάνειας που εµπλέκονται στη µετάδοση σηµάτων. Μετά την κλωνοποίηση των πρώτων υποδοχέων πριν από περίπου µια δεκαετία (Kolakowski, 1994), έχουν βρεθεί πάνω από χίλιοι υποδοχείς για αισθητικά (οσµές, φως, κτλ) και χηµικά ερεθίσµατα (κατεχολαµίνες, αµινοξέα, πεπτίδια ακόµα και ιόντα) µε κοινές δοµικές και βιοχηµικές ιδιότητες. Σχεδόν το 1-5% της συνολικής κυτταρικής πρωτεΐνης αντιστοιχεί στους GPCRs και όλα µαζί τα γονίδιά τους εκπροσωπούν πάνω από το 1% του συνολικού γονιδιώµατος των θηλαστικών. Εποµένως, αποτελούν έναν από τους κύριους στόχους φαρµάκων που απευθύνονται ιδιαίτερα στο κεντρικό νευρικό σύστηµα. Οι GPCRs αναφέρονται επίσης ως υποδοχείς µε επτά διαµεµβρανικά τµήµατα λόγω της υψηλά συντηρηµένης δοµής τους (Muller, 2000). Όλα τα µέλη αυτής της οικογένειας αποτελούνται από µια πολυπεπτιδική αλυσίδα µε επτά υδρόφοβες περιοχές ίδιου µήκους που χωρίζονται από υδρόφιλες θηλειές ποικίλων µεγεθών. Λόγω της οµολογίας τους µε τη βακτηριοροδοψίνη και τη ροδοψίνη, των οποίων οι δοµές έχουν λυθεί κρυσταλλογραφικά (Henderson et al., 1990; Okada et al., 2000), είναι πλέον γνωστό ότι αυτοί οι υποδοχείς χαρακτηρίζονται από την παρουσία επτά α-ελίκων που διασχίζουν την πλασµατική µεµβράνη και που χωρίζονται από ενδοκυτταρικές και εξωκυτταρικές θηλειές (επταελικοειδείς υποδοχείς). Το αµινοτελικό άκρο εκτίθεται στο εξωκυτταρικό περιβάλλον, ενώ το καρβοξυτελικό άκρο είναι ενδοκυτταρικό. Οι οµολογίες στην αλληλουχία µεταξύ διαφορετικών GPCRs περιορίζονται γενικά στις διαµεµβρανικές περιοχές. Η περιοχή αναγνώρισης του προσδέτη περιλαµβάνει τις εξωκυτταρικές περιοχές του υποδοχέα (τόσο το αµινοτελικό άκρο όσο και τις εξωκυτταρικές θηλειές) και την τσέπη που σχηµατίζεται κατά τη συγκρότηση των επτά διαµεµβρανικών ελίκων. Η αλληλεπίδραση του υποδοχέα µε τις G πρωτεΐνες γίνεται µέσω των ενδοκυτταρικών περιοχών (τόσο του καρβοξυτελικού άκρου όσο και των ενδοκυτταρικών θηλειών) (Wess, 1997; Wess, 1998). Οι GPCRs των θηλαστικών έχουν ταξινοµηθεί σε τρεις διαφορετικές οικογένειες µε βάση τη δοµή τους και τις οµοιότητες στην αλληλουχία (Εικ. 1). Η 2

4 οικογένεια Οικογένεια Α. Υποδοχείς τύπου ροδοψίνης/ υποδοχείς που µοιάζουν µε το β 2 αδρενεργικό υποδοχέα Υποδοχείς για βιογενείς αµίνες (αδρενεργικός, σεροτονίνης, ντοπαµίνης, µουσκαρινικός, ισταµίνης) Υποδοχείς CCK, ενδοθηλίνης, ταχυκίνης, νευροπεπτιδίου Y, TRH, νευροτενσίνης, βοµβεσίνης, αυξητικών ορµονών των εκκριµαταγωγών και οψινών σπονδυλωτών Υποδοχείς οψινών ασπονδύλων Υποδοχείς αδενοσίνης, κανναβινοειδούς, µελανοκορτίνης και οσφρητικοί υποδοχείς Υποδοχείς χηµοκινών, fmlp, C5A, GnRH, εικοσανοειδών, λευκοτριενίου, FSH, LH, TSH, νουκλεοτιδίων, οπιοειδών, οξυτοκίνης, βασοπρεσίνης, σωµατοστατίνης και ενεργοποιούµενοι από πρωτεάσες υποδοχείς Υποδοχείς µελατονίνης Οικογένεια Β. Υποδοχείς που µοιάζουν µε τον υποδοχέα γλουκαγόνου/ VIP/ καλσιτονίνης Υποδοχείς καλσιτονίνης, CGRP και CRF Υποδοχείς PTH και PTHrP Υποδοχείς γλουκαγόνου, GIP, GHRH, PACAP, VIP και σεκρετίνης Υποδοχείς λατροτοξίνης Οικογένεια C. Υποδοχείς µεταβολοτρόπων νευροδιαβιβαστών και ασβεστίου Υποδοχείς γλουταµικού Υποδοχείς GABA Υποδοχείς ασβεστίου Υνιορρυνικοί υποδοχείς φεροµονών Υποδοχείς γεύσης Εικόνα 1: Οι GPCRs διαιρούνται σε τρεις µεγάλες οικογένειες µε βάση τη δοµή τους: την οικογένεια Α, την οικογένεια Β και την οικογένεια C. 3

5 οικογένεια Α (υποδοχείς τύπου ροδοψίνης και υποδοχείς που µοιάζουν µε το β 2 αδρενεργικό υποδοχέα) είναι η µεγαλύτερη και καλύτερα µελετηµένη. Με βάση τη φυλογενετική τους σχέση, οι υποδοχείς της οικογένειας Α διακρίνονται σε έξι µεγάλες υποοµάδες (Kolakowski, 1994). Η οµολογία ανάµεσα στα µέλη της είναι µικρή και περιορίζεται σε ένα µικρό αριθµό υψηλά συντηρηµένων καταλοίπων, πράγµα που υποδηλώνει ότι τα συγκεκριµένα αµινοξέα παίζουν πολύ σηµαντικό ρόλο είτε στη δοµή είτε στη λειτουργία των υποδοχέων. Το µοναδικό κατάλοιπο που είναι συντηρηµένο σχεδόν σε όλους τους υποδοχείς της οικογένειας Α είναι η αργινίνη στο µοτίβο Asp-Arg-Tyr (DRY) της κυτταροπλασµατικής πλευράς του τρίτου διαµεµβρανικού τµήµατος. Η παραπάνω οικογένεια περιλαµβάνει πολλούς υποδοχείς για κλασικούς νευροδιαβιβαστές και µια µεγάλη ποικιλία πεπτιδίων και νευροπεπτιδίων, την πλειονότητα των υποδοχέων για την αίσθηση των οσµών, τη ροδοψίνη καθώς και υποδοχείς κυτταρικής επιφάνειας για κάποιους ιούς. Η οικογένεια Β (υποδοχείς σεκρετίνης και γλουκαγόνου) αποτελείται από περίπου 20 διαφορετικούς υποδοχείς ορµονών και πεπτιδίων (π.χ. καλσιτονίνη, γλουκαγόνο, παραθυρεοειδική ορµόνη, σεκρετίνη και διουρητική ορµόνη). Εκτός από τη δισουλφιδική γέφυρα που συνδέει τη δεύτερη και την τρίτη εξωκυτταρική θηλειά, οι υποδοχείς της οικογένειας Β δεν περιέχουν κανένα από τα δοµικά χαρακτηριστικά των υποδοχέων της οικογένειας Α (Kolakowski, 1994). Το µοτίβο DRY απουσιάζει από τους υποδοχείς της οικογένειας Β και οι προλίνες που είναι συντηρηµένες ανάµεσα στους υποδοχείς αυτής της οικογένειας είναι διαφορετικές από αυτές που είναι συντηρηµένες ανάµεσα στους υποδοχείς της οικογένειας Α. Το κύριο χαρακτηριστικό των µελών της οικογένειας Β είναι το µεγάλο µήκος (~100 αµινοξέα) του εξωκυτταρικού αµινοτελικού άκρου που περιέχει πολλές κυστεΐνες οι οποίες σχηµατίζουν ένα δίκτυο από δισουλφιδικές γέφυρες (Ulrich et al., 1998). Στην οικογένεια C (που περιγράφηκε σχετικά πρόσφατα και αναφέρεται συχνά ως οικογένεια των υποδοχέων του γλουταµικού) ανήκουν οι GPCRs για τα αµινοξέα γλουταµικό και γ-αµινοβουτυρικό οξύ (GABA) και για το ιόν του ασβεστίου. Τα µέλη αυτής της οικογένειας χαρακτηρίζονται από ένα εξαιρετικά µεγάλο αµινοτελικό άκρο ( αµινοξέα) και εκτός από τις δύο κυστεΐνες που φτιάχνουν τη δισουλφιδική γέφυρα ανάµεσα στη δεύτερη και τρίτη εξωκυτταρική θηλειά δεν έχουν άλλα κοινά αµινοξέα µε τους υποδοχείς των οικογενειών Α και Β. Στην παραπάνω ταξινόµηση πρέπει να προστεθούν οι οικογένειες D (υποδοχείς STE2) και Ε (υποδοχείς STE3) που περιλαµβάνουν τους υποδοχείς φεροµονών της ζύµης, καθώς 4

6 και η οικογένεια F που αποτελείται από µια µικρή αλλά µοναδική υποοικογένεια GPCRs (αυτή των τεσσάρων διαφορετικών υποδοχέων camp του Dictyostelium discoideum) (Kolakowski, 1994). G πρωτεΐνες Οι GPCRs πήραν το όνοµά τους από την ικανότητά τους να στρατολογούν και να ρυθµίζουν την ενεργότητα των ενδοκυτταρικών ετεροτριµερών G πρωτεϊνών. Παρόλο που κάποιες µελέτες αποκάλυψαν την ύπαρξη σηµατοδοτικών µονοπατιών των GPCRs ανεξάρτητων από τις G πρωτεΐνες (Bockaert and Pin, 1999; Hur and Kim, 2002), ένα κοινό βιοχηµικό γνώρισµα αυτών των υποδοχέων είναι η αλληλεπίδρασή τους µε G πρωτεΐνες και η ενεργοποίηση σηµατοδοτικών καταρρακτών µέσω των τελευταίων. Οι GPCRs δρουν πάνω στις ετεροτριµερείς G πρωτεΐνες σαν παράγοντες ανταλλαγής νουκλεοτιδίων γουανίνης (guanine-nucleotide exchange factors, GEFs). Η δέσµευση αγωνιστών αλλάζει τη διαµόρφωση συγκεκριµένων περιοχών στην τσέπη των επτά διαµεµβρανικών ελίκων, η οποία µε τη σειρά της προκαλεί αλλαγές στη διαµόρφωση των ενδοκυτταρικών περιοχών του υποδοχέα. Αυτές οι αλλαγές έχουν σαν αποτέλεσµα την πρόσδεση των ετεροτριµερών G πρωτεϊνών στον υποδοχέα. Οι ετεροτριµερείς G πρωτεΐνες αποτελούνται από µια α υποµονάδα (Gα) και ένα βγ σύµπλοκο (Gβγ) και διαθέτουν µια περιοχή στην α υποµονάδα τους που µοιάζει µε την πρωτεΐνη Ras (Ras-like domain) και µπορεί να δεσµεύσει τα νουκλεοτίδια γουανίνης GDP ή GTP (Hamm, 1998). Μπορούν να δράσουν ως µοριακοί διακόπτες, δηλαδή η ενεργοποίηση του υποδοχέα επάγει την ανταλλαγή ενός µορίου GDP από ένα µόριο GTP στην ενεργή θέση της α υποµονάδας. Η δέσµευση του GTP προκαλεί την αποσύνδεση του ετεροτριµερούς συµπλόκου και τόσο η συζευγµένη µε GTP α υποµονάδα όσο και το απελευθερωµένο βγ σύµπλοκο είναι διαθέσιµα να αλληλεπιδράσουν µε ενδοκυτταρικά ή µεµβρανικά µόρια-τελεστές (ένζυµα ή κανάλια ιόντων). Κυτταρικά σηµατοδοτικά µονοπάτια που ξεκινούν από την α υποµονάδα και το ελεύθερο βγ διµερές είναι αυτά που ενεργοποιούν ή αναστέλλουν την αδενυλική κυκλάση, αυτά που ενεργοποιούν τις φωσφολιπάσες, καθώς και αυτά που ρυθµίζουν την ενεργότητα καναλιών ιόντων καλίου και ασβεστίου (Hamm, 1998). Η ενδογενής ενεργότητα GTPάσης της α υποµονάδας υδρολύει το GTP σε GDP επαναφέροντάς την στην αρχική της ανενεργή διαµόρφωση και αυξάνοντας τη συγγένειά της για το σύµπλοκο 5

7 βγ. Όπως αναφέρθηκε, µε κάποιες εξαιρέσεις, οι περιοχές που φαίνεται να είναι υπεύθυνες για τη δέσµευση των G πρωτεϊνών είναι η δεύτερη και τρίτη ενδοκυτταρική θηλειά και το καρβοξυτελικό άκρο του υποδοχέα. Η πολυπλοκότητα και η εξειδίκευση της σηµατοδότησης µέσω GPCRs οφείλεται σε ένα βαθµό στην ύπαρξη ενός µεγάλου αριθµού υποµονάδων G πρωτεϊνών (Hildebrandt, 1997). Μέχρι σήµερα έχουν ταυτοποιηθεί τουλάχιστον 23 α υποµονάδες που προέρχονται από 17 διαφορετικά γονίδια και έχουν ταξινοµηθεί σε τέσσερις οικογένειες (Gα i/o, Gα s, Gα q/11 και Gα 12 ) και τουλάχιστον 6 και 12 διαφορετικές β και γ υποµονάδες, αντίστοιχα (Vanderbeld and Kelly, 2000) (Πίνακας 1). Παρόλο που όλοι οι συνδυασµοί των παραπάνω υποµονάδων δεν απαντώνται απαραίτητα στη φύση, ο θεωρητικός αριθµός διαφορετικών ετεροτριµερών G πρωτεϊνών είναι πολύ µεγάλος και αυτό πιθανά συνεισφέρει στην ποικιλία και εκλεκτικότητα των ενδοκυτταρικών σηµάτων που παράγονται από τους GPCRs. Συγκρινόµενος µε την ποικιλία των υποδοχέων και των G πρωτεϊνών, ο αριθµός των µορίων-τελεστών (ένζυµα και δίαυλοι ιόντων) είναι µάλλον περιορισµένος και σε ορισµένες περιπτώσεις G πρωτεΐνες που σχετίζονται µεταξύ τους (π.χ. G i-1, G i-2 και G i-3 ) συνδέονται µε τον ίδιο ενδοκυτταρικό τελεστή (αδενυλική κυκλάση). Είναι επίσης πιθανό ένας υποδοχέας να αλληλεπιδρά ανεξάρτητα µε πολλές G πρωτεΐνες ανεξάτηπι Πίνακας 1: Οι υποµονάδες των G πρωτεϊνών και τα µόρια-τελεστές τους Υποµονάδα Οικογένεια Κύριοι υποτύποι Μόριο-τελεστής α α s Gα s, Gα o1f Αδενυλική κυκλάση α i/o Gα i-1, Gα i-2, Gα i-3 Αδενυλική κυκλάση Gα oa, Gα ob Κανάλια K + Gα t1, Gα t2 Κανάλια Ca 2+ Gα z Φωσφοδιεστεράση του κυκλικού GMP α q11 Gα q, Gα 11, Gα 14, Φωσφολιπάση C Gα 15, Gα 16 α 12 Gα 12, Gα 13 ; β β 1-5 (6;) ιαφορετικά σύµπλοκα από β και γ υποµονάδες Αδενυλική κυκλάση / Φωσφολιπάσες Κινάση της 3- φωσφατιδυλινοσιτόλης γ γ 1-11 (12;) Πρωτεϊνική κινάση C Πρωτεϊνική κινάση D Κινάσες των GPCRs Κανάλια Ca 2+, K + (και Na + ) 6

8 της ίδιας τάξης (Albert and Robillard, 2002). Ανάµεσα στις G πρωτεΐνες της ίδιας τάξης, ο υποτύπος που εµπλέκεται στη µεταγωγή του σήµατος από τον υποδοχέα στον τελεστή εξαρτάται από τη διαθεσιµότητα G πρωτεϊνών γύρω από τον υποδοχέα και µπορεί να διαφέρει έτσι από το ένα κύτταρο στο άλλο (Milligan, 1996; Neubig, 1994). Μηχανισµοί ρύθµισης της σηµατοδότησης µέσω GPCRs και ανακάλυψη των RGS πρωτεΐνών Η διάρκεια του σήµατος που παράγεται από τους GPCRs ελέγχεται από το χρονικό διάστηµα κατά το οποίο η α υποµονάδα της G πρωτεΐνης βρίσκεται στη µορφή που δεσµεύει GTP. Όλες οι Gα υποµονάδες µπορούν να υδρολύσουν το GTP, αλλά ο ρυθµός αυτής της αυτό-απενεργοποίησης είναι συχνά πολύ πιο αργός από το γρήγορο κλείσιµο του σήµατος που παρατηρείται στην πραγµατικότητα στα φυσιολογικά συστήµατα. Αποµονωµένες Gα υποµονάδες σε διάλυµα έχουν πολύ µικρή ενεργότητα GTPάσης µε ενδογενή ρυθµό υδρόλυσης του GTP από 0.1 ως 0.3 Pi/mol Gα/min για τις περισσότερες Gα υποµονάδες (Gilman, 1987). Απουσία υποδοχέα, η ταχύτητα της υδρόλυσης του GTP περιορίζεται µόνο από το ρυθµό απελευθέρωσης του GDP από την α υποµονάδα µετά την υδρόλυση. Η δέσµευση του αγωνιστή στον υποδοχέα διεγείρει την απελευθέρωση του GDP από την Gα, αφήνοντας κενή την τσέπη που δεσµεύει νουκλεοτίδια γουανίνης ώστε να δεσµεύσει γρήγορα το ενδοκυτταρικό GTP που βρίσκεται σε περίσσεια. Έτσι, µε τη χρήση ανασυγκροτηµένων συστηµάτων που περιέχουν υποδοχείς και µε την παρουσία αγωνιστών, οι παρατηρούµενοι ρυθµοί υδρόλυσης του GTP από την Gα, ενισχύονται κατά δέκα φορές ή και περισσότερο (Gilman, 1987; Wilkie, 2000). Επιπλέον, αν τα πειράµατα γίνουν σε ένα κυτταρικό σύστηµα, τότε ο ρυθµός απενεργοποίησης για πολλές αποκρίσεις που ελέγχονται από τις G πρωτεΐνες, είναι ακόµα πιο γρήγορος ( φορές) από αυτόν που προβλέπεται µε βάση τους ρυθµούς υδρόλυσης του GTP που παρατηρούνται όταν χρησιµοποιούνται καθαρισµένα συστατικά. Ένα χαρακτηριστικό παράδειγµα είναι ο αργός ρυθµός υδρόλυσης του GTP (1-2 ανά λεπτό) από αποµονωµένες Gα υποµονάδες τρανσδουσίνης σε σύγκριση µε τη γρήγορη επαναφορά (~200 ms) των φωτοϋποδοχέων των ραβδίων του αµφιβληστροειδούς µετά από ένα φωτεινό ερέθισµα (Arshavsky and Pugh, 1998). Παρόµοιες διαφορές ανάµεσα στα in vivo και 7

9 in vitro δεδοµένα παρατηρήθηκαν στους ρυθµούς απενεργοποίησης των καναλιών καλίου και ασβεστίου που ελέγχονται, επίσης, από G πρωτεΐνες (Zerangue and Jan, 1998). Τα σηµατοδοτικά µονοπάτια των GPCRs εµπλέκονται σε αποκρίσεις στα εξωκυτταρικά ερεθίσµατα και χρειάζονται πολύ αυστηρή ρύθµιση. Η κυριότερη ρύθµιση πραγµατοποιείται στο επίπεδο του υποδοχέα και της ετεροτριµερούς G πρωτεΐνης. Ο πιο γνωστός ρυθµιστικός µηχανισµός στο επίπεδο του υποδοχέα είναι η εξαρτώµενη από τον αγωνιστή αποσύνδεση του β αδρενεργικού υποδοχέα από τη G πρωτεΐνη µε την οποία συνδέεται, µέσω φωσφορυλίωσης του υποδοχέα από τις κινάσες των GPCRs (G protein-coupled receptor kinases, GRKs), δέσµευση µορίων αρρεστίνης, επακόλουθη αποφωσφορυλίωση του υποδοχέα στα ενδοσώµατα και ανακύκλωση στην πλασµατική µεµβράνη (Krupnick and Benovic, 1998). Στο επίπεδο της G πρωτεΐνης ρυθµιστικό ρόλο έχει δειχτεί ότι παίζει η φωσφορυλίωση της Gz και η ακετυλίωση της Gs (Fields and Casey, 1995; Wedegaertner and Bourne, 1994) υποµονάδας, ενώ η µυριστιλίωση και η αντιστρεπτή παλµιτιλίωση αλλάζουν τη συγγένεια των G πρωτεϊνών για τις µεµβράνες (Mumby, 1997; Wedegaertner, 1998). Μεταγραφικός έλεγχος κάποιων G πρωτεϊνών έχει αναφερθεί αλλά όσον αφορά στο επίπεδο της πρωτεΐνης, οι G πρωτεΐνες είναι γενικά πολύ σταθερά µόρια µε µεγάλους χρόνους ηµιζωής (Milligan, 1993). Κανένας από τους παραπάνω ρυθµιστικούς µηχανισµούς δεν µπορεί να εξηγήσει το γρήγορο κλείσιµο του σήµατος των G πρωτεϊνών µε ικανοποίηση. Η πρόσφατη ανακάλυψη (Berman et al., 1996b; Koelle and Horvitz, 1996; Siderovski et al., 1996) µιας νέας οικογένειας πρωτεϊνών, που ονοµάστηκαν ρυθµιστές της σηµατοδότησης των G πρωτεϊνών (regulators of G- protein signaling) ή RGS πρωτεΐνες έδωσε εξήγηση σ αυτό το χρονικό παράδοξο: το γρήγορο κλείσιµο του σήµατος µπορεί να επιτευχθεί επιταχύνοντας την επαναφορά των G πρωτεϊνών στην ανενεργή τους κατάσταση και αυτός ακριβώς είναι ένας από τους µηχανισµούς δράσης των RGS πρωτεϊνών (Εικ. 2). Η ικανότητα των κυττάρων να ρυθµίζουν αρνητικά τη σηµατοδότηση τόσο στο επίπεδο του υποδοχέα όσο και στο επίπεδο της G πρωτεΐνης µπορεί να φαίνεται πλεονάζουσα, στην πραγµατικότητα όµως οι RGS πρωτεΐνες και οι GRKs παίζουν διακριτούς ρόλους στον τερµατισµό του σήµατος. Οι GRKs εµποδίζουν την πρόσδεση άλλων αγωνιστών στους υποδοχείς, ενώ οι RGS πρωτεΐνες µειώνουν τη διάρκεια των σηµάτων που έχουν ήδη παραχθεί απενεργοποιώντας τις G πρωτεΐνες. 8

10 Η ανακάλυψη του κεντρικού ρόλου των RGS πρωτεϊνών στον τερµατισµό της σηµατοδότησης µέσω G πρωτεϊνών έγινε για πρώτη φορά στη ζύµη Saccharomyces cerevisiae. Το γονίδιο sst2 της ζύµης ταυτοποιήθηκε πριν από περίπου δύο δεκαετίες, µετά από τη µελέτη µεταλλαγών που οδηγούσαν στη δηµιουργία ατόµων ανίκανων να ξεπεράσουν την παροδική αναστολή του κυτταρικού κύκλου στη φάση G1 (µια δια Εικόνα 2: Οι ρυθµιστές της σηµατοδότησης των G πρωτεϊνών (RGS πρωτεΐνες) ρυθµίζουν αρνητικά τη σηµατοδότηση που ξεκινά από τον υποδοχέα. Στην κατάσταση ηρεµίας (κέντρο), οι υποδοχείς για τους νευροδιαβιβαστές και τις ορµόνες δεν καταλαµβάνονται από κάποιο αγωνιστή και οι G πρωτεΐνες βρίσκονται µε τη µορφή ετεροτριµερούς αβγ µε GDP συνδεδεµένο στην Gα υποµονάδα. Η δέσµευση του αγωνιστή (π.χ. ορµόνη, Η) στον υποδοχέα (επάνω) έχει σαν αποτέλεσµα την ανταλλαγή του GDP από GTP και την απελευθέρωση του συµπλόκου βγ. Τα ενεργά σύµπλοκα Gα-GTP και Gβγ είναι ελεύθερα να ρυθµίσουν την ενεργότητα µορίωντελεστών όπως κανάλια ιόντων ή ένζυµα τα οποία µετατρέπουν τα υποστρώµατα (S) σε προϊόντα (P) που δρουν σαν δεύτερα µηνύµατα. Η σηµατοδότηση τερµατίζεται ως αποτέλεσµα της ενδογενούς ενεργότητας GTPάσης της Gα. Οι περισσότερες RGS πρωτεΐνες δεσµεύονται στο ενεργοποιηµένο σύµπλοκο Gα-GTP (κάτω) και επιταχύνουν σε µεγάλο βαθµό την ενδογενή ενεργότητα GTPάσης της Gα. Η υδρόλυση του GTP από την Gα τερµατίζει τις αλληλεπιδράσεις µεταξύ Gα και τελεστή και προάγει την επανασύνδεση του συµπλόκου Gα-GDP µε το σύµπλοκο Gβγ. διαµεσολαβούµενη από G πρωτεΐνη απόκριση στη φεροµόνη του ζευγαρώµατος) (Chan and Otte, 1982). Ένα παρόµοιο γονίδιο (flba) που ρυθµίζει αρνητικά τη σηµατοδότηση των G πρωτεϊνών βρέθηκε στον Aspergillus nidulans (Lee and Adams, 1994), ενώ σε κάποια συστήµατα θηλαστικών ταυτοποιήθηκε το γονίδιο GOS8 (το οποίο ρυθµίζεται θετικά σε διεγερµένα µονοκύτταρα) (Siderovski et al., 9

11 1994) και µια νέα πρωτεΐνη που δεσµεύει ενεργοποιηµένη Gα i3, η οποία ονοµάστηκε G alpha interacting protein (GAIP ή αργότερα RGS-GAIP) (De Vries et al., 1995). Το γονίδιο egl-10 του νηµατώδους σκώληκα Caenorhabditis elegans ταυτοποιήθηκε µετά από µελέτες στις οποίες απώλεια του συγκεκριµένου γονιδίου από µεταλλαγή είχε ως αποτέλεσµα τη µειωµένη συστροφή του σώµατος και τη γέννηση ελαττωµένου αριθµού αυγών, συµπεριφορές που αναστέλλονται από το νευροδιαβιβαστή σεροτονίνη (Koelle and Horvitz, 1996). Η παρατήρηση ότι η υπερέκφραση της Egl-10 πρωτεΐνης µπορούσε να διεγείρει φαινόµενα που παρατηρούνταν µετά από απώλεια έκφρασης της Gα ο υποµονάδας (GOA-1) οδήγησε στο συµπέρασµα ότι η Egl-10 αναστέλλει τη σηµατοδότηση της σεροτονίνης ανταγωνιζόµενη την ενεργοποίηση της GOA-1 από τον υποδοχέα της σεροτονίνης (Koelle and Horvitz, 1996). Η ανάλυση της αµινοξικής ακολουθίας αρχικά των Egl- 10 και Sst2 πρωτεϊνών αποκάλυψε µια κοινή περιοχή ~120 αµινοξέων που είχε επίσης παρατηρηθεί σε πρωτεΐνες θηλαστικών µε άγνωστες ως τότε βιοχηµικές λειτουργίες (όπως για παράδειγµα η πρωτεΐνη G0S8 που τώρα είναι γνωστή ως RGS2) (Koelle and Horvitz, 1996; Siderovski et al., 1996). Η έκφραση της RGS2 στη ζύµη ανέστειλε πλήρως τη διακοπή του κυτταρικού κύκλου που επάγεται από τη φεροµόνη (Siderovski et al., 1996) και οδήγησε στην ιδέα ότι η οµοιότητα στην αλληλουχία των Sst2 και Egl-10 ήταν υπεύθυνη για την αναστολή της σηµατοδότησης µέσω της G πρωτεΐνης στο επίπεδο της α υποµονάδας. Έχουν βρεθεί πλέον αρκετές πρωτεΐνες στα θηλαστικά µε τη συντηρηµένη περιοχή που εµφανίζεται στις Egl-10, Sst2, FlbA και GOS8. H περιοχή αυτή των ~120 αµινοξέων ονοµάστηκε RGS περιοχή ή RGS box και αποτελεί το χαρακτηριστικό γνώρισµα της παραπάνω οικογένειας πρωτεϊνών. Η GOS8, όπως αναφέρθηκε, µετονοµάστηκε αργότερα σε RGS2 και η RGS7 αναγνωρίστηκε ως η οµόλογη της Egl-10 στα θηλαστικά. Η RGS4 µπορούσε να υποκαταστήσει την Sst2 και να αναστείλει την απόκριση στη φεροµόνη της ζύµης, υποδεικνύοντας ότι η λειτουργία των RGS πρωτεϊνών είναι συντηρηµένη ανάµεσα στα είδη (Druey et al., 1996). Το RGS box είναι τώρα γνωστό ότι δεσµεύεται απευθείας στη συνδεδεµένη µε GTP α υποµονάδα για να επιταχύνει δραµατικά το ρυθµό υδρόλυσης του GTP και κατά συνέπεια το ρυθµό απενεργοποίησής της (Berman et al., 1996b). Έτσι οι RGS πρωτεΐνες είναι γνωστές ως πρωτεΐνες που επιταχύνουν την ενεργότητα GTPάσης (GTPase-accelerating proteins, GAPs) των α υποµονάδων των G πρωτεϊνών. Οι περισσότερες RGS πρωτεΐνες έχει δειχθεί ότι δρουν ως GAPs στις α i και α q 10

12 υποµονάδες, ενώ δεν έχει δειχθεί ακόµα ενεργότητα GAP απέναντι στις α s παρά την άµεση αλληλεπίδραση που έχει βρεθεί τελευταία µεταξύ των RGS πρωτεϊνών και των α s υποµονάδων (Roy et al., 2006). Η δοµή του συµπλόκου RGS4 πρωτεΐνης-α i υποµονάδας (Εικ. 3), όπως καθορίστηκε µετά από µελέτες µε περίθλαση ακτίνων Χ (Tesmer et al., 1997), αποκάλυψε το µοριακό µηχανισµό της επιτάχυνσης της ενεργότητας GTPάσης: το RGS box έρχεται σε επαφή µε τις τρεις περιοχές διακόπτες (switch regions) της α υποµονάδας και σταθεροποιεί τη διαµόρφωση της µεταβατικής κατάστασης µεταξύ της συνδεδεµένης µε GTP και της συνδεδεµένης µε GDP µορφής. Ο καθορισµός της κρυσταλλικής δοµής της RGS4 σε σύµπλοκο µε το - Gα i1 -GDP-AlF 4 (ένα σταθερό σύµπλοκο που µιµείται το σύµπλοκο Gα-GTP) αποκάλυψε ότι το RGS box σχηµατίζει µια δέσµη από εννιά α-έλικες που έρχεται σε επαφή µε την Gα i1 σε τρεις διαφορετικές θέσεις (Tesmer et al., 1997). ύο κατάλοιπα στην επιφάνεια της Gα i1 (Thr182 και Gly183) φαίνονται να παίζουν σηµαντικό ρόλο στις αλληλεπιδράσεις υψηλής συγγένειας µεταξύ Gα και RGS, παρόλο που και άλλα κατάλοιπα είναι επίσης σηµαντικά (Tesmer et al., 1997). Η θρεονίνη στη θέση 182 της Gα i1 είναι συντηρηµένη ανάµεσα στα µέλη των οικογενειών Gα i και Gα q, αλλά όχι στις Gα s και Gα 12 και αυτό παρέχει µια δοµική εξήγηση για την εµφανή προτίµηση των RGS για δέσµευση στις G i ή G q. Εικόνα 3: Το σύµπλοκο RGS4-Gα i1. Το RGS box αποτελείται από τέσσερα τµήµατα: τµήµα 1 (κόκκινο), τµήµα 2 (χρυσό), τµήµα 3 (πράσινο) και τµήµα 4 (µπλε). Η περιοχή που µοιάζει µε τη Ras (Ras-like domain) της Gα i1 είναι βαµµένη µε σκούρο γκρι, ενώ η περιοχή της α-έλικας µε ανοιχτό γκρι. Οι τρεις περιοχές-διακόπτες (switch regions) της Gα i1 φαίνονται µε κόκκινο χρώµα. Το GDP-Mg2+ είναι δεσµευµένο στην ενεργή θέση της Gα i1. Το AlF 4 - παραλείπεται από το σχήµα για λόγους ευκολίας. 11

13 Έχει βρεθεί πια ένας µεγάλος αριθµός από γνωστές πρωτεΐνες που περιέχουν RGS box στα θηλαστικά. Κάποιες, όπως η RGS2 και η RGS4, δεν περιέχουν πολλά παραπάνω στοιχεία από το RGS box. Άλλες είναι πολύ µεγαλύτερες µε επιπρόσθετα µοτίβα για αλληλεπίδραση µε πρωτεΐνες, που υποδηλώνουν την ύπαρξη επιπλέον ρόλων στην κυτταρική σηµατοδότηση από την ενεργότητα GAP (Siderovski et al., 1999a; Siderovski et al., 1999b). Μέχρι πρόσφατα, ήταν γενικά αποδεκτό ότι οι ορµόνες και οι νευροδιαβιβαστές χρησιµοποιούν έναν GPCR, µια G πρωτεΐνη και έναν τελεστή για τη µετάδοση των σηµάτων από την πλασµατική µεµβράνη. Τώρα πια, οι RGS πρωτεΐνες φαίνεται να αποτελούν το τέταρτο συστατικό αυτού του µοντέλου. οµή και ταξινόµηση των RGS πρωτεϊνών Η ολοκλήρωση του προγράµµατος χαρτογράφησης του ανθρώπινου γονιδιώµατος (human genome project) επιβεβαίωσε την ύπαρξη πάνω από 30 διαφορετικών πρωτεϊνών που περιέχουν µια RGS περιοχή ή µια περιοχή που να µοιάζει µε τo RGS box (RGS-like domain, RL). Βασιζόµενες στις οµοιότητες της αµινοξικής ακολουθίας µέσα στην RGS περιοχή, δύο ξεχωριστές ερευνητικές οµάδες ταξινόµησαν τις RGS πρωτεΐνες σε εννιά υποοικογένειες (Ross and Wilkie, 2000; Zheng et al., 1999) (Εικ. 4). Αυτή η οµαδοποίηση αποκαλύπτει επίσης τη συνολική δοµή και τις οµοιότητες στις λειτουργίες µεταξύ των πρωτεϊνών της ίδιας υποοικογένειας. Σύµφωνα µε τη µία ταξινόµηση οι υποοικογένειες ονοµάστηκαν αυθαίρετα A-Η και υποοικογένεια της D-AKAP2 (Zheng et al., 1999), ενώ σύµφωνα µε την άλλη (Ross and Wilkie, 2000) τα ονόµατα των υποοικογενειών προέρχονται από την RGS πρωτεΐνη που ήταν το πρωτότυπο µέλος τους (π.χ. το όνοµα της RZ υποοικογένειας προέρχεται από την RGSZ). Γενικά υπάρχει συµφωνία ανάµεσα στις δύο κατατάξεις µε εξαίρεση την RGS10, που στη µία περίπτωση δεν κατατάσσεται σε καµιά υποοικογένεια (Zheng et al., 1999), ενώ στην άλλη κατατάσσεται στην υποοικογένεια R12 µε βάση τις οµοιότητές της στην RGS περιοχή µε τα υπόλοιπα µέλη (Ross and Wilkie, 2000). Οι εννιά υποοικογένειες είναι οι εξής: η A ή RZ (πήρε το όνοµά της από την RGSZ), η B ή R4 (πήρε το όνοµά της από την RGS4), η C ή R7 (πήρε το όνοµά της από την RGS7), η D ή R12 (πήρε το όνοµά της από την RGS12), η E ή RA (µε πρωτότυπο µέλος την Αξίνη), η F ή GEF, η G ή GRK, η H ή SNX και η υποοικογένεια της D-AKAP2. Τα µέλη των υποοικογενειών RZ και R4, µε δύο 12

14 εξαιρέσεις (την RGS3 και την RET-RGS1) είναι πρωτεΐνες µικρού µοριακού βάρους (20-30 kda) µε µικρές αµινοτελικές και καρβοξυτελικές περιοχές να περιβάλλουν την RGS περιοχή. Αντίθετα, τα µέλη των υπόλοιπων υποοικογενειών, µε εξαίρεση την RGS10, είναι πολύ µεγαλύτερες πρωτεΐνες (πάνω από 160 kda) µε µεγάλα αµινο- και καρβοξυτελικά άκρα που κωδικοποιούν για περιοχές και µοτίβα που δεσµεύουν άλλες πρωτεΐνες. Αν εξαιρέσουµε την RGS περιοχή, οι RGS πρωτεΐνες διαφέρουν σε µεγάλο βαθµό στο µέγεθος και την αµινοξική ακολουθία και περιέχουν µεγάλη ποικιλία δοµικών περιοχών και µοτίβων. Όπως αναφέρθηκε, τα µέλη των υποοικογενειών A/RZ και B/R4 είναι απλές πρωτεΐνες µε λίγα στοιχεία πέρα από την RGS περιοχή, ενώ τα µέλη των υποοικογενειών C/R7, D/R12, E/RA, F/GEF, G/GRK και Η/SNX έχουν επιπλέον περιοχές χαρακτηριστικές της κάθε υποοικογένειας. Η RGS19, γνωστή και ως GAIP, µέλος της υποοικογένειας A/RZ, έχει µια περιοχή πλούσια σε κυστεΐνες στο αµινοτελικό της άκρο που παλµιτιλιώνεται αντιστρεπτά (De Vries et al., 1996) και µια καρβοξυτελική περιοχή που δεσµεύει PDZ µοτίβα (De Vries et al., 1998). Η σύνδεση αυτής της περιοχής µε το PDZ µοτίβο της πρωτεΐνης-ικριώµατος GIPC επάγει την αλληλεπίδραση της RGS19 µε τον D2 ντοπαµινεργικό υποδοχέα και πιθανά µε άλλους υποδοχείς που διαθέτουν τέτοια µοτίβα (Jeanneteau et al., 2004b). Η RGS4, µέλος της υποοικογένειας B/R4, διαθέτει µια αµινοτελική αµφίπολη έλικα σηµαντική για τον εντοπισµό της στη µεµβράνη και τις αλληλεπιδράσεις της µε τους υποδοχείς (Zeng et al., 1998). Όλα τα µέλη της C/R7 υποοικογένειας (RGS6, RGS7, RGS9, RGS11) περιέχουν µια περιοχή DEP (Dishevelled, Egl-10, Pleckstrin), µε άγνωστη λειτουργία (Sondek and Siderovski, 2001), ίσως απαραίτητη για τη στόχευση στη µεµβράνη, που ονοµάζεται R7 οµολογία ή R7H περιοχή, και µια περιοχή GGL (G protein gamma subunit-like) για την ειδική σύνδεσή της µε τις Gβ 5 ισοµορφές (Snow et al., 1998b). Το µέλος της οικογένειας D/R12, RGS12, περιέχει ένα PDZ (PSD95, Dig και Z0-1/2) µοτίβο που µπορεί να δεσµεύσει τα καρβοξυτελικά άκρα των GPCRs in vitro (Snow et al., 1998a), ένα µοτίβο που δεσµεύει φωσφοτυροσίνες (phosphotyrosine-binding, PTB) που τη στρατολογεί στη φωσφορυλιωµένη α1β υποµονάδα των καναλιών ασβεστίου N-τύπου (Schiff et al., 2000), RBD (Rap1/2-binding domain) µοτίβα διαταγµένα στη σειρά, µε άγνωστη λειτουργία, και ένα GoLoco µοτίβο που ασκεί ανασταλτική δράση στην αποσύνδεση των νουκλεοτιδίων γουανίνης των δεσµευµένων µε GDP Gα i υποµονάδων (Kimple et al., 2001). Τα µέλη της οικογένειας E/RA (Αξίνη, Κοντακτίνη) περιέχουν µια GSK3β 13

15 (glycogen synthase kinase 3β-binding domain) περιοχή, µια θέση που δεσµεύει β- κατενίνη (Cat), µια οµόλογη περιοχή της πρωτεϊνικής φωσφατάσης 2Α (PP2A) και µια περιοχή διµερισµού (DIX). Οι πρωτεΐνες RhoGEF περιέχουν περιοχές DH (Dbl homology) και PH (Pleckstrin homology), οι GRKs περιέχουν µια καταλυτική περιοχή µε ενεργότητα κινάσης Ser/Thr, ενώ η RGS-PX1 (επίσης γνωστή ως SNX13) περιέχει προβλεπόµενες διαµεµβρανικές περιοχές στο αµινοτελικό της άκρο και ένα RGS box ειδικό για την Gα s µεταξύ των PX (phosphatidylinositol-binding) και PXA (PX-associated) µοτίβων (Zheng et al., 2001). Η ένατη υποοικογένεια αποτελείται από ένα µοναδικό µέλος, την D-AKAP2 (dual-specificity A-kinase anchoring protein 2), µε δύο RGS περιοχές (Wang et al., 2001), από τις οποίες καµία δεν έχει δειχθεί να δρα πάνω σε Gα υποµονάδες ή να δεσµεύει άλλες πρωτεΐνεςστόχους. Αυτά τα δοµικά χαρακτηριστικά (που είναι ιδιαίτερα για κάθε υποοικογένεια) δίνουν τη δυνατότητα στις RGS πρωτεΐνες να αλληλεπιδράσουν µε έναν µεγάλο κατάλογο άλλων πρωτεϊνών που συµµετέχουν στη σηµατοδότηση των RGS, στην υποκυτταρική τους στόχευση και στη ρύθµιση των λειτουργιών τους. Εικόνα 4: οµική οργάνωση και αντιπροσωπευτικά µέλη των εννιά υποοικογενειών των RGS πρωτεϊνών. Τα ποσοστά της οµοιότητας της αµινοξικής ακολουθίας του RGS box της RGS4 (που αυθαίρετα έχει οριστεί ως 100%) µε τα RGS boxes των υπόλοιπων RGS πρωτεϊνών υπολογίστηκαν µε το πρόγραµµα GAP του Wisconsin GCG Package και αναγράφονται κάτω από τα αντίστοιχα RGS boxes. Από τη συστοίχιση RGS περιοχών διαφορετικών RGS πρωτεϊνών των θηλαστικών, προκύπτει ότι οι περισσότερες RGS περιοχές (RGS1-16, GAIP, RGSZ1, RET-RGS) σχετίζονται στενά εµφανίζοντας µια οµοιότητα περίπου 35-55%, ενώ οι 14

16 RGS περιοχές της Αξίνης, της D-AKAP2, της Κοντακτίνης, της p115rhogef και της PDZRhoGEF σχετίζονται λιγότερο µε τις άλλες εµφανίζοντας µόνο 10-30% οµοιότητα. Στην Sst2 πρωτεΐνη του Saccharomyces και στην FlbA πρωτεΐνη του Aspergillus, οι RGS περιοχές διακόπτονται και διαιρούνται σε τµήµατα, κάτι που όµως δεν προκαλεί δραµατικές αλλαγές στην τρισδιάστατη δοµή τους (Tesmer et al., 1997). Ανάλυση του γονιδιώµατος του C. elegans αποκάλυψε ότι έχει 12 πρωτεΐνες που περιέχουν RGS περιοχές (Bargmann, 1998). Μια από αυτές περιέχει δύο RGS περιοχές. Στη Drosophila έχουν ταυτοποιηθεί τέσσερις πρωτεΐνες µε RGS περιοχές -η drgs7 (Elmore et al., 1998), η Loco (Granderath et al., 1999), η d-αξίνη (Hamada et al., 1999) και η drhogef2 (Barrett et al., 1997). Οι λειτουργικοί ρόλοι των περισσότερων RGS πρωτεϊνών των ασπονδύλων παραµένουν άγνωστοι. Μια ενδιαφέρουσα παρατήρηση είναι ότι η αµινοτελική περιοχή των περισσοτέρων GRKs εµφανίζει σηµαντική οµοιότητα στην ακολουθία (πάνω από 30%) µε την RGS περιοχή (Siderovski et al., 1996). Η λειτουργία αυτής της περιοχής στις GRKs διερευνάται. Οι µικρότερες RGS πρωτεΐνες (κυρίως των υποοικογενειών A/RZ και B/R4) παίζουν σχεδόν αποκλειστικά το ρόλο αρνητικών ρυθµιστών στη σηµατοδότηση των G πρωτεϊνών. Παρ όλα αυτά, οι λειτουργίες αυτών των πρωτεϊνών ελέγχονται στενά ώστε τελικά να διαµορφώνουν και όχι µόνο να αναστέλλουν τη σηµατοδότηση των G πρωτεϊνών. Αντίθετα, τα µέλη των οικογενειών που περιλαµβάνουν τις µεγαλύτερες RGS πρωτεΐνες είναι πολυλειτουργικές πρωτεΐνες µε την ικανότητα να δεσµεύουν όχι µόνο τις G πρωτεΐνες, αλλά και άλλες σηµατοδοτικές πρωτεΐνες. Μ αυτό τον τρόπο, αυτές οι πολύπλοκες RGS πρωτεΐνες ολοκληρώνουν τη σηµατοδότηση των G πρωτεϊνών, πιθανά ως νέα µόρια-τελεστές ή πρωτεΐνεςικριώµατα. οµή των γονιδίων των RGS πρωτεϊνών και εντοπισµός τους στα χρωµοσώµατα Παρόλο που το RGS box βρέθηκε πρώτα στην Sst2 πρωτεΐνη της ζύµης, δεν έχει ξεκαθαριστεί πώς προήλθαν µε απόκλιση ή διπλασιασµό από αυτό τον κοινό πρόγονο οι πάνω από 30 γνωστές σήµερα RGS πρωτεΐνες των θηλαστικών. Η δοµή των γονιδίων µόνο πέντε RGS πρωτεϊνών των θηλαστικών έχει περιγραφεί µέχρι τώρα (RGS2, RGS3, RGS9, RGS16 και Αξίνη). Το µέγεθος των γονιδίων ποικίλλει 15

17 πολύ ξεκινώντας από τα 4Kb (RGS16) και φτάνοντας µέχρι τα 56 Kb (Αξίνη), αντικατοπτρίζοντας το µέγεθος της πρωτεΐνης και τον αριθµό των εξωνίων. Τα ανοικτά πλαίσια ανάγνωσης των µικρών RGS πρωτεϊνών (RGS2, RGS3 και RGS16) κωδικοποιούνται από πέντε εξώνια. Το RGS box των RGS2, RGS3, RGS9 και RGS16 κωδικοποιείται από τρία εξώνια και οι θέσεις των δύο εσωνίων µέσα στο RGS box είναι συντηρηµένες στις RGS2, RGS3 και RGS16, πράγµα που υποδηλώνει την ύπαρξη ενός κοινού γονιδίου-προγόνου (Chatterjee et al., 1997). Σε αντίθεση µε άλλες RGS πρωτεΐνες, στο γονίδιο της Αξίνης όλο το RGS box, που βρίσκεται στο αµινοτελικό άκρο, κωδικοποιείται από το εξώνιο 2 (Zeng et al., 1997). Τα όρια εσωνίων / εξωνίων του RGS box του γονιδίου του C. elegans egl-10 δεν συµπίπτουν µε αυτά των µικρών RGS πρωτεϊνών των θηλαστικών (Chatterjee et al., 1997; Koelle and Horvitz, 1996). Η µελέτη της δοµής των γονιδίων διευκολύνει την ταξινόµηση των RGS πρωτεϊνών στις υποοικογένειες και τον καθορισµό των θέσεων εναλλακτικού µατίσµατος. Η χαρτογράφηση των γονιδίων τους στα χρωµοσώµατα µπορεί να δώσει πληροφορίες για την πιθανή εµπλοκή των RGS πρωτεϊνών σε γενετικές ασθένειες. Τουλάχιστον επτά RGS γονίδια έχουν χαρτογραφηθεί στο χρωµόσωµα 1 µε αναλύσεις FISH (fluoerescent in situ hybridization analyses). Το γονίδιο της RGS9 έχει χαρτογραφηθεί στην ίδια θέση πάνω στο χρωµόσωµα 17 (q23-24) µε το γονίδιο της µελαγχρωµατικής αµφιβληστροειδίτιδας, πράγµα που υποδηλώνει µια πιθανή συµµετοχή αυτής της πρωτεΐνης στην παραπάνω εκφυλιστική ασθένεια του αµφιβληστροειδούς (Granneman et al., 1998). Το γονίδιο της RGS6 βρίσκεται στο χρωµόσωµα 14q24.3, µια περιοχή που είναι γνωστό ότι περιέχει ένα γονίδιο υπεύθυνο για τη νόσο του Alzheimer (Seki et al., 1999). Τα mrnas των RGS πρωτεϊνών παρουσιάζουν διαφορική έκφραση στους ιστούς και υπάρχουν µορφές που προκύπτουν από εναλλακτικό µάτισµα Τα mrnas των RGS πρωτεϊνών έχουν βρεθεί σε όλους τους ιστούς και όλα τα κύτταρα µε αναλύσεις in situ υβριδισµού και Northern. Τουλάχιστον εννιά διαφορετικά RGS mrnas εκφράζονται στην υπόφυση (Chen et al., 1997) και σε συγκεκριµένες περιοχές του εγκεφάλου (Gold et al., 1997). Τα mrnas κάποιων RGS πρωτεϊνών, όπως των RGS3 και RGS5, εµφανίζουν ευρεία κατανοµή στους ιστούς υποδηλώνοντας µια πιο γενική λειτουργία (De Vries et al., 1995; Druey et al., 1996), 16

18 ενώ αυτά κάποιων άλλων, όπως των RET-RGS1 (αµφιβληστροειδής), RGS8 (εγκέφαλος) και RGS1 (λεµφοκύτταρα) φαίνεται να παίζουν πιο εξειδικευµένους ρόλους, αφού βρίσκονται σε συγκεκριµένους ιστούς (Faurobert and Hurley, 1997; Saitoh et al., 1997; Wang et al., 1998). Η ύπαρξη εναλλακτικά µατισµένων µορφών των RGS πρωτεϊνών ανακαλύφθηκε όταν ανιχνεύτηκαν δύο µεγάλα µετάγραφα διαφορετικού µεγέθους για την RGS3 (Druey et al., 1996) και από τότε παρατηρήθηκε σε πολλές RGS πρωτεΐνες, όπως η RGS12 και η RGS9. Η RGS9 έχει βρεθεί σε δύο ισοµορφές που προκύπτουν από εναλλακτικό µάτισµα και διαφέρουν στις καρβοξυτελικές τους αλληλουχίες: την RGS9-1 του αµφιβληστροειδή και την RGS9-2 του ραβδωτού σώµατος του εγκεφάλου (Granneman et al., 1998). Είναι προφανές ότι το εναλλακτικό µάτισµα αυξάνει ακόµα περισσότερο τις πιθανότητες αλληλεπίδρασης των RGS πρωτεϊνών στα µονοπάτια σηµατοδότησης των GPCRs και τις λειτουργικές τους δράσεις. Μετα-µεταφραστικές τροποποιήσεις Οι µετα-µεταφραστικές τροποποιήσεις των σηµατοδοτικών πρωτεϊνών παίζουν ρόλο στον κυτταρικό τους εντοπισµό, στη σταθερότητά τους και στη διαµόρφωσή τους στο χώρο. Η παλµιτιλίωση (σε κατάλοιπα κυστεΐνης του αµινοτελικού άκρου) και η µυριστιλίωση (σε κατάλοιπα γλυκίνης του αµινοτελικού άκρου) είναι δύο τέτοιες τροποποιήσεις που έχει αναφερθεί ότι παίζουν ρόλο στη συγγένεια των G πρωτεϊνών για τις µεµβράνες και στη µετατόπισή τους από το κυτταρόπλασµα στην πλασµατική µεµβράνη (Degtyarev et al., 1994). Παρόµοια, οι µετα-µεταφραστικές τροποποιήσεις των RGS πρωτεϊνών µπορούν να επηρεάσουν τη λειτουργία τους. Οι GAIP (De Vries et al., 1996), RGSZ1 (Wang et al., 1998) και RET-RGS1 (Faurobert and Hurley, 1997) έχουν ένα µοτίβο από µια σειρά καταλοίπων κυστεΐνης στο αµινοτελικό τους άκρο. Αυτό το µοτίβο παλµιτιλιώνεται και είναι υπεύθυνο για την προσκόλληση των πρωτεϊνών που το διαθέτουν στην µεµβράνη (Gundersen et al., 1994). Η παλµιτιλιωµένη GAIP ανιχνεύεται µόνο σε µεµβρανικά κλάσµατα (De Vries et al., 1996), αλλά η απευθείας συσχέτιση του µοτίβου των κυστεϊνών καθώς και της ίδιας της παλµιτιλίωσης µε τη µεµβρανική προσκόλληση, αν και πιθανή, δεν έχει ακόµα αποδειχτεί. Είναι ενδιαφέρον ότι η RGS4, η οποία δεν διαθέτει µοτίβο µε 17

19 κυστεΐνες, µπορεί επίσης να παλµιτιλιωθεί, αλλά σ αυτή την περίπτωση η παλµιτιλίωση δεν απαιτείται για την µετατόπιση της RGS4 από το κυτοσόλιο στην πλασµατική µεµβράνη. Αντίθετα, ολόκληρο το αµινοτελικό άκρο φαίνεται να είναι απαραίτητο για τη µετατόπιση στην πλασµατική µεµβράνη (Srinivasa et al., 1998). Παρόµοια είναι τα πράγµατα και µε την RGS16, που περιέχει τις ίδιες συντηρηµένες θέσεις παλµιτιλίωσης µε τις RGS4 και RGS5. Η σύνδεσή της µε τη µεµβράνη και η ενεργότητα GAP δεν αλλάζουν όταν η RGS16 δεν µπορεί να παλµιτιλιωθεί, όµως η αρνητική της δράση στην G i (επίπεδα camp) και στη G q (ενεργότητα MAP κινασών) ελαττώνεται in vivo (Beadling et al., 1999). Επικρατεί η άποψη ότι η παλµιτιλίωση είναι σηµαντική για το συν-εντοπισµό των RGS και G πρωτεϊνών στις ίδιες µεµβράνες και στις ίδιες περιοχές της µεµβράνης ή ότι παίζει ρόλο στη συγγένεια της µιας πρωτεΐνης για την άλλη. Πολλές RGS πρωτεΐνες περιέχουν πιθανές θέσεις µυριστιλίωσης στα αµινοτελικά τους άκρα, αλλά η λειτουργία της µυριστιλίωσης, συµπεριλαµβανοµένου και του ρόλου της στην προσκόλληση των RGS πρωτεϊνών στη µεµβράνη, δεν έχει ακόµα διερευνηθεί. Πολλά από τα συστατικά του σηµατοδοτικού µονοπατιού των GPCRs υφίστανται φωσφορυλίωση, συµπεριλαµβανοµένων των υποδοχέων (Premont et al., 1995), των α και β υποµονάδων των G πρωτεϊνών (Neer, 1995) και των µορίωντελεστών (Nishida and Gotoh, 1993). Τώρα πια υπάρχουν ενδείξεις ότι φωσφορυλίωση µπορούν να υφίστανται και οι RGS πρωτεΐνες. Πολλές RGS πρωτεΐνες περιέχουν συντηρηµένες θέσεις πιθανής φωσφορυλίωσης για την κινάση της καζεΐνης ΙΙ και για την πρωτεϊνική κινάση C στις RGS περιοχές, καθώς και µη συντηρηµένες θέσεις έξω από τις RGS περιοχές. Πρόσφατα δείχθηκε ότι η GAIP έχει τη δυνατότητα να φωσφορυλιώνεται και ότι µόνο το µεµβρανο-συνδεόµενο κλάσµα της είναι φωσφορυλιωµένο (Fischer et al., 2000). Αυτό υποδηλώνει ότι η σύνδεση της GAIP µε τη µεµβράνη ρυθµίζεται σε κάποιο βαθµό και από τη φωσφορυλίωση. Ο ρόλος της φωσφορυλίωσης των RGS πρωτεϊνών δεν έχει ακόµα συνδεθεί µε τη λειτουργία τους, όµως φαίνεται να είναι σηµαντικός για τη ρύθµιση της δράση τους στη σηµατοδότηση και τον εντοπισµό των G πρωτεϊνών. 18

20 Μοριακοί µηχανισµοί δράσης των RGS πρωτεϊνών Υπάρχουν τρεις γνωστοί µηχανισµοί µέσω των οποίων δρουν οι RGS πρωτεΐνες in vivo. Ως αρνητικοί ρυθµιστές, οι RGS πρωτεΐνες µπορούν να επηρεάσουν τη δράση της Gα αναστέλλοντας την απελευθέρωση του GDP και εµποδίζοντας τη δέσµευση του GTP ή περιορίζοντας τη διάρκεια κατά την οποία το GTP παραµένει δεσµευµένο στην Gα υποµονάδα µε τη δράση GAP που διαθέτουν. Βιοχηµικές και δοµικές µελέτες έχουν δείξει ότι όλες οι RGS πρωτεΐνες που εξετάστηκαν δρουν σαν GAPs και διεγείρουν σε µεγάλο βαθµό ( φορές) την ενεργότητα GTPάσης των Gα υποµονάδων-στόχων τους (Watson et al., 1996). Τέτοια πειράµατα έγιναν in vitro µε τη χρήση ανασυνδυασµένων πρωτεϊνών (Berman et al., 1996b; Faurobert and Hurley, 1997) ή συµπλόκων υποδοχέων/g πρωτεϊνών/τελεστών που ανασυστάθηκαν σε φωσφολιπιδικά κυστίδια (Hepler et al., 1997). Η δράση GAP των RGS πρωτεϊνών είναι ευαίσθητη σε µια ποικιλία παραγόντων, για παράδειγµα κατιόντα όπως νάτριο, κάλιο και µαγνήσιο (Wang et al., 1997) και φωσφολιπίδια όπως 3,4,5-τριφωσφορική φωσφατιδυλινοσιτόλη (PIP 3 ) (Ishii et al., 2002) και φωσφατιδυλσερίνη (Tu et al., 2001). Επιπλέον, οι µετα-µεταφραστικές τροποποιήσεις επηρεάζουν τόσο τον ενδοκυτταρικό εντοπισµό των RGS πρωτεϊνών όσο και τις αλληλεπιδράσεις τους µε τις G πρωτεΐνες και άλλες πρωτεΐνες (Chidiac and Roy, 2003). Σε ορισµένες περιπτώσεις, η δέσµευση της RGS πρωτεΐνης στην υποµονάδα Gα µπορεί να αναστείλει µε ανταγωνιστικό τρόπο την αλληλεπίδραση µεταξύ Gα και µορίων-τελεστών, υποδηλώνοντας ότι οι RGS πρωτεΐνες µπορούν να είναι επίσης ανταγωνιστές των µορίων-τελεστών. Οι RGS πρωτεΐνες, δηλαδή, µπορούν να αποτρέψουν τη δέσµευση των G πρωτεϊνών στους τελεστές τους εµποδίζοντας τη φυσική αυτή αλληλεπίδραση (Hepler et al., 1997). Στις ζύµες και τα θηλαστικά, το σύµπλοκο Gβγ προκαλεί τη δηµιουργία καταρροϊκών σηµάτων. Η απενεργοποίηση της Gα που διεγείρεται από τις RGS πρωτεΐνες προάγει τον επανασχηµατισµό του ετεροτριµερούς και εµποδίζει τη σηµατοδότηση του Gβγ (Yan et al., 1997). Οι RGS, δηλαδή, µπορούν να αλλάξουν τον αριθµό των ελεύθερων βγ υποµονάδων που είναι διαθέσιµες να αλληλεπιδράσουν µε τους τελεστές τους ενισχύοντας τη συγγένεια των Gα υποµονάδων για το βγ διµερές µετά από την υδρόλυση του GTP. Από την άλλη, η δέσµευση της RGS στην Gα υποµονάδα αποκλείει τη δέσµευση του συµπλόκου Gβγ (Tesmer et al., 1997) και, σε κάποιες περιπτώσεις, η παρατεταµένη σύνδεση µεταξύ RGS και Gα µετά την 19

21 υδρόλυση του GTP µπορεί να καθυστερήσει την επανασύνδεση της Gα µε το Gβγ, µε αποτέλεσµα την παράταση της σηµατοδότησης του Gβγ. Η ανακάλυψη ενός RGS box στο αµινοτελικό άκρο της p115rhogef (Hart et al., 1998), ενός γνωστού GEF για τη µονοµερή G πρωτεΐνη RhoA, αποκάλυψε ακλλτης α β Εικόνα 5: Οι RGS πρωτεΐνες µπορούν να δράσουν στη σηµατοδότηση των GPCRs ως αναστολείς ή τελεστές. α. Οι RGS πρωτεΐνες έχουν δράση GAP. Η δέσµευση του αγωνιστή στον υποδοχέα του επάγει την ενεργότητα GEF του υποδοχέα, οδηγεί στην πρόσδεση GTP στην Gα υποµονάδα, αλλαγή της χωροδιάταξης συγκεκριµένων περιοχών (switch regions I, II, III) της Gα, δηµιουργία της ενεργούς α διαµόρφωσης, αποσύνδεση του ετεροτριµερούς συµπλόκου Gα-Gβγ και αλληλεπιδράσεις µε τα µόρια τελεστές. Οι RGS πρωτεΐνες επιταχύνουν το ρυθµό υδρόλυσης του GTP από την Gα και οδηγούν στον τερµατισµό της σηµατοδότησης. Η αναστολή της δέσµευσης του RGS box στο Gα-GTP σ αυτή την περίπτωση θα οδηγούσε σε παράταση του χρονικού διαστήµατος κατά το οποίο η Gα υποµονάδα βρίσκεται στην κατάσταση όπου είναι συνδεδεµένη µε GTP, ενισχύοντας την απόκριση που διεγείρεται από τον υποδοχέα µέσω αυξηµένων επιπέδων ελεύθερων Gα-GTP και Gβγ υποµονάδων. β. Οι RGS πρωτεΐνες µπορούν να έχουν θετικό ρόλο στη σηµατοδότηση των GPCRs, όπως στην περίπτωση της p115rhogef και των συγγενικών της πρωτεϊνών PDZRhoGEF και LARG. Με τη δέσµευση της ενεργοποιηµένης Gα 13, η ενεργότητα GEF της p115rhogef αυξάνεται, οδηγώντας στην ενεργοποίηση της RhoA που µε τη σειρά της οδηγεί σε ανακατατάξεις του κυτταροσκελετού και µεταγραφική ρύθµιση. Η p115rhogef επίσης απενεργοποιεί την Gα 13 εξαιτίας της ενεργότητας GAP του RGS box της, αλλά όχι πριν τη µεταγωγή του σήµατος. Σ αυτή την περίπτωση, η παρεµπόδιση της αλληλεπίδρασης µεταξύ του RGS box και της Gα από κάποια µικρά µόρια µειώνει την εξαρτώµενη από την Gα 13 ενεργοποίηση της RhoA. άλλον ένα λειτουργικό ρόλο: οι RGS πρωτεΐνες µπορούν να είναι τελεστές των Gα πρωτεϊνών (Εικ. 5). Η p115rhogef και οι δοµικά συγγενικές της πρωτεΐνες PDZRhoGEF και LARG (leukaemia-associated RhoGEF) (Kourlas et al., 2000; Reuther et al., 2001) δεσµεύονται στις ενεργοποιηµένες από τους GPCRs Gα 12 και Gα 13 µέσω των αµινοτελικών τους RGS περιοχών και αυτή η αλληλεπίδραση 20

22 ενεργοποιεί τις καρβοξυτελικές περιοχές RhoGEF που καταλύουν την ανταλλαγή του GDP από GTP στη Rho. Η ενεργή Rho (που είναι δεσµευµένη µε GTP) µπορεί τότε να προσδεθεί σε άλλες πρωτεΐνες µέσα στο κύτταρο που επηρεάζουν τη δοµή του κυτταροσκελετού και τη µεταγραφή γονιδίων. Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, οι RGS12 και RGS14 πρωτεΐνες έχουν δύο ξεχωριστές περιοχές για τη δέσµευση της Gα υποµονάδας. Σε αντίθεση µε την RGS περιοχή, το µοτίβο GoLoco δεσµεύεται εκλεκτικά σε ανενεργές Gα υποµονάδες που βρίσκονται σε διάλυµα και εµποδίζει την αποδέσµευση του GDP από τις ελεύθερες Gα υποµονάδες (Willard et al., 2004). Ο φυσιολογικός ρόλος του παραπάνω φαινοµένου δεν είναι απόλυτα σαφής, αφού µια πρόσφατη έρευνα έδειξε ότι µια µορφή της RGS14 που περιείχε το µοτίβο GoLoco αλλά όχι την RGS περιοχή (R14- RBD/GL) δεν ανέστειλε όπως προβλεπόταν την ενεργότητα GTPάσης των ενεργοποιηµένων από υποδοχέα G πρωτεϊνών (Hepler et al., 2005). Η R14-RBD/GL, όµως, προκάλεσε αύξηση της ενεργότητας GAP της RGS4. Μια πιθανή εξήγηση είναι ότι η δέσµευση της R14-RBD/GL σε µια G πρωτεΐνη ενός σηµατοδοτικού συµπλόκου αυξάνει τη συγγένεια µιας δεύτερης G πρωτεΐνης µέσα στο σηµατοδοτικό σύµπλοκο για την RGS4. Αλληλεπιδράσεις µεταξύ RGS πρωτεϊνών και GPCRs Στις περισσότερες περιπτώσεις, η επίδραση αποµονωµένων RGS πρωτεϊνών στην ενεργότητα GTPάσης των Gα υποµονάδων είναι δυνατή απουσία άλλων πρωτεϊνών. Η απόδοσή τους, όµως, δεν είναι η βέλτιστη κάτω από τέτοιες συνθήκες και οι αλληλεπιδράσεις µεταξύ RGS πρωτεϊνών και Gα υποµονάδων µπορούν να ενισχυθούν παρουσία άλλων κυτταρικών συστατικών. Για παράδειγµα, όταν µια G πρωτεΐνη ανασυσταθεί σε φωσφολιπιδικά κυστίδια µαζί µε έναν GPCR, τόσο η συγγένεια µιας RGS πρωτεΐνης για τη G πρωτεΐνη (Ingi et al., 1998) όσο και ο ρυθµός επιτάχυνσης της ενεργότητας GTPάσης (Mukhopadhyay and Ross, 1999) µπορεί να αυξηθούν. Εποµένως, οι GPCRs µπορεί να επηρεάζουν τις αλληλεπιδράσεις RGS-G πρωτεϊνών (Chidiac and Roy, 2003; Hollinger and Hepler, 2002; Wilkie, 2000) και οι RGS πρωτεΐνες µπορούν να διαµορφώνουν τη λειτουργία των υποδοχέων. Υπάρχουν ενδείξεις για την αλληλεπίδραση των GPCRs µε τα µέλη όλων των υποοικογενειών των RGS πρωτεϊνών. Οι GPCRs των θηλαστικών που έχουν 21

23 αναγνωριστεί ως πραγµατικοί ή πιθανοί στόχοι των RGS πρωτεϊνών περιλαµβάνουν τον M1 (Bernstein et al., 2004) και M2 µουσκαρινικό υποδοχέα (Ingi et al., 1998), τον D2 (Jeanneteau et al., 2004b) και D3 ντοπαµινεργικό υποδοχέα (Jeanneteau et al., 2004a), τους α 1Α - (Hague et al., 2005), β 1 - (Hu et al., 2003) και β 2 -αδρενεργικούς υποδοχείς (Roy et al., 2003), τον υποδοχέα της αγγειοτενσίνης ΑΤ 1 (Roy et al., 2003), τον υποδοχέα της ιντερλευκίνης-8 Β (Snow et al., 1998a) και τους µ οπιοειδείς υποδοχείς (Garzon et al., 2004). Παρόλο που οι µηχανισµοί ποικίλλουν ανάµεσα στις υποοικογένειες των RGS πρωτεϊνών, σε όλες τις περιπτώσεις, αυτές οι αλληλεπιδράσεις µε τους GPCRs γίνονται µέσω περιοχών έξω από το συντηρηµένο RGS box και συχνά απαιτούν την παρουσία βοηθητικών πρωτεϊνών (Εικ. 6). του Γ Εικόνα 6: Αλληλεπιδράσεις µεταξύ RGS πρωτεϊνών και GPCRs. Οι RGS πρωτεΐνες σε κάποιες περιπτώσεις δεσµεύονται άµεσα στους GPCRs (A), ενώ σε άλλες η δέσµευση γίνεται έµµεσα µε τη µεσολάβηση µιας προσαρµοστικής πρωτεΐνης ή µιας πρωτεΐνης-ικριώµατος όπως η σφινοφιλίνη (Β). Οι RGS12 και RGS14 µπορούν να δεσµευτούν ταυτόχρονα σε δύο G πρωτεΐνες µέσα σ ένα σηµατοδοτικό σύµπλοκο γιατί, εκτός από την RGS περιοχή, έχουν ένα GoLoco µοτίβο που δεσµεύεται στις G πρωτεΐνες (Γ). Αλληλεπιδράσεις µεταξύ RGS πρωτεϊνών και µορίων-τελεστών Οι RGS πρωτεΐνες, λόγω της ενεργότητας GAP που διαθέτουν, µπορούν γρήγορα να απενεργοποιήσουν τις G πρωτεΐνες σταµατώντας τη σηµατοδότηση µέσω 22

24 GPCRs. Πρόσφατα δείχθηκε ότι µια RGS πρωτεΐνη µπορεί επίσης να εµποδίσει τη σηµατοδότηση G πρωτεϊνών που είναι συνέχεια ενεργοποιηµένες από ένα ανάλογο του GTP που δεν υδρολύεται (Hepler et al., 1997). Από τότε βρέθηκε ότι οι RGS πρωτεΐνες µπορούν να δεσµεύσουν µια µεγάλη ποικιλία πρωτεϊνών-τελεστών και αυτό συµβάλλει στη ρυθµιστική τους δράση στη σηµατοδότηση. Παραδείγµατα τέτοιων τελεστών είναι η αδενυλική κυκλάση, τα κανάλια καλίου GIRK (G proteingated inwardly rectifying potassium channels), η αµφιβληστροειδική γουανυλική κυκλάση, η cgmp φωσφοδιεστεράση, η φωσφολιπάση C-β και τα τασεο-ελεγχόµενα κανάλια ασβεστίου (Εικ. 7). Όπως έχει αναφερθεί και παραπάνω, οι RGS πρωτεΐνες δρουν σαν ανταγωνιστές των τελεστών, δεσµεύοντας είτε την πρωτεΐνη-τελεστή είτε την Gα υποµονάδα και εµποδίζοντας τη φυσική αλληλεπίδραση αυτών των δύο. Παρ Εικόνα 7: Αλληλεπιδράσεις µεταξύ των RGS πρωτεϊνών και των µορίων-τελεστών των G πρωτεϊνών όλα αυτά, η αλληλεπίδραση µεταξύ RGS πρωτεΐνης και τελεστή µπορεί να έχει ένα θετικό αποτέλεσµα στη σηµατοδότηση µέσω του GPCR, για παράδειγµα µε τη δηµιουργία ενός συµπλόκου ανάµεσα στην ενεργοποιηµένη G πρωτεΐνη και τον τελεστή, που έχει ως αποτέλεσµα τη γρήγορη µεταγωγή του σήµατος της ενεργοποιηµένης Gα υποµονάδας. 23

25 Ένα από τα πιο γνωστά παραδείγµατα µορίου-τελεστή που αλληλεπιδρά µε τις RGS πρωτεΐνες είναι η αδενυλική κυκλάση. Η δραστικότητα της αδενυλικής κυκλάσης διαµορφώνεται από δύο Gα υποµονάδες, την Gα s και την Gα i, που αυξάνουν και µειώνουν τα επίπεδα του camp, αντίστοιχα, ενώ κάποιοι υποτύποι του ενζύµου ρυθµίζονται από το σύµπλοκο Gβγ (Sunahara et al., 1996). Πολλές RGS πρωτεΐνες µπορούν να αναστείλουν τη δράση των Gα i στην ενεργότητα της αδενυλικής κυκλάσης σαν αποτέλεσµα της ενεργότητας GAP που διαθέτουν (Berman and Gilman, 1998). Επιπρόσθετα, ένας µεγάλος αριθµός RGS πρωτεϊνών συµπεριλαµβανοµένων των RGS2, RGS3, RGS4, RGS10 και RGS13 αναστέλλουν την ενεργοποίηση της αδενυλικής κυκλάσης που διεγείρεται από τις Gα s υποµονάδες (Chatterjee et al., 1997; Scheschonka et al., 2000). Το πιο πιθανό είναι ότι αυτή η δράση δεν οφείλεται στην ενεργότητα GAP των RGS πρωτεϊνών εφόσον (1) λίγες ή και καµία RGS πρωτεΐνη δεν έχει την ικανότητα να αυξήσει το ρυθµό υδρόλυσης του GTP από τις Gα s (Chidiac and Roy, 2003), (2) οι RGS πρωτεΐνες αναστέλλουν την ενεργοποίηση της αδενυλικής κυκλάσης που διεγείρεται από τη φορσκολίνη απουσία ενεργοποιηµένης Gα s (Sinnarajah et al., 2001) και (3) η αναστολή συµβαίνει ακόµα και όταν το GTP αντικατασταθεί από το ανάλογό του GTPγS το οποίο δεν υδρολύεται (Sinnarajah et al., 2001). Εποµένως, η αναστολή της ενεργότητας της αδενυλικής κυκλάσης µπορεί να οφείλεται σε µια άµεση αλληλεπίδραση της RGS πρωτεΐνης είτε µε την Gα s είτε µε την αδενυλική κυκλάση είτε και µε τις δύο. Η RGS2 συγκατακρηµνίζεται µε την Gα s σε κυτταρικά εκχυλίσµατα (Ko et al., 2001), δεσµεύεται στην ενεργοποιηµένη Gα s σε διάλυµα (Tseng and Zhang, 1998), ενώ οι δύο πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν σε ζωντανά κύτταρα όπως έχει δειχθεί µε BRET (bioluminescence resonance energy transfer) (Roy et al., 2006). Αυτές οι παρατηρήσεις υποδηλώνουν ότι η άµεση σύνδεση της RGS2 στην Gα s είναι τουλάχιστον σε κάποιο βαθµό υπεύθυνη για την ανασταλτική δράση της RGS2 στη συσσώρευση του camp. Από την άλλη, υπάρχουν ενδείξεις για άµεση αλληλεπίδραση µεταξύ RGS2 και αδενυλικής κυκλάσης, οπότε το συµπέρασµα που βγαίνει είναι ότι η RGS2 µειώνει την ενεργότητα της αδενυλικής κυκλάσης δεσµεύοντας τόσο την Gα s υποµονάδα όσο και το ίδιο το ένζυµο. Παρ όλα αυτά ο ακριβής µηχανισµός δεν έχει ακόµα διασαφηνιστεί πλήρως. Στους νευρώνες, τα τασεο-ελεγχόµενα κανάλια ασβεστίου παίζουν σηµαντικό ρόλο στην έκκριση νευροδιαβιβαστών και σε άλλες λειτουργίες. Η ενεργότητα των καναλιών τύπου L, P/Q, N και R αυξάνεται από την τάση και µειώνεται από σήµατα 24