Η πολυπλοκότητα των σταδίων στα µονοπάτια µεταγωγής σήµατος έχουν δύο σηµαντικά οφέλη: 1. Ενίσχυση του αρχικού σήµατος 2. Εξειδίκευση της απόκρισης

Transcript

1 Η πολυπλοκότητα των σταδίων στα µονοπάτια µεταγωγής σήµατος έχουν δύο σηµαντικά οφέλη: 1. Ενίσχυση του αρχικού σήµατος 2. Εξειδίκευση της απόκρισης ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ ΑΝΑΜΕΤΑ ΟΤΕΣ RELAY PRTEINS Second messenger H µεταβίβαση σήµατος µέσα στα κύτταρα βασίζεται σε ένα αριθµό πρωτεϊνών που λειτουργούν ως αναµεταδότες Ο τυπικόςµηχανισµός µε τον οποίο µεταβιβάζεται η πληροφορία είναι φωσφορυλίωση πρωτεϊνικών κινασών Light activation of rod photoreceptor cell and the amplification obtained in the signalling cascade Οι πρωτεϊνες αναµεταδότες είναι κινάσες πρωτεϊνών και καταλύουν τη φωσφορυλίωση δύο αµινοξέων, θρεονίνη και σερίνη, στα υποστρώµατα τους τα οποία είναι οι επόµενες πρωτεϊνες αναµεταδότες στο µονοπάτι. Scaffolding proteins: Eνας τύπος µεγάλων πρωτεϊνών αναµεταδοτών στις οποίες είναι ταυτόχρονα δεσµευµένες άλλες πρωτεϊνες αναµεταδότες για να τις κρατήσουν σε µια συγκεκριµένη θέση Adaptor proteins Bifurcation proteins Amplifier proteins Transducer proteins Integrator proteins Anchoring proteins Modulator proteins Messenger proteins

2 Η πολυπλοκότητα των σταδίων στα µονοπάτια µεταγωγής σήµατος έχουν δύο σηµαντικά οφέλη: 1. Ενίσχυση του αρχικού σήµατος 2. Εξειδίκευση της απόκρισης Η τελική κυτταρική απόκριση καθορίζεται από τα ειδικά µόρια υποδοχέων και τις πρωτεϊνες «αναµεταδότες» µέσα στο κυτταρόπλασµα Οι υποδοχείς καθορίζουν ποιά γονίδια θα εκφραστούν σε ένα κυτταρικό τύπο και αν το σήµα πυροδοτήσει ενεργοποίηση ή παρεµπόδιση µιας λειτουργίας ΚΑΤΗΓΟΡΙΕΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΑΠΟΚΡΙΣΗΣ Ενα σήµα µπορεί να προσδεθεί σε ένα υποδοχέα που πυροδοτεί ένα µονοπάτι που καταλήγει σε µία απόκριση Ενα σήµα µπορεί να προσδεθεί σε ένα υποδοχέα που ξεκινά ένα µονοπάτι που διακλαδίζεται σε πολλά τα οποία οδηγούν σε πολλές αποκρίσεις ύο διαφορετικά σήµατα µπορούν να ενεργοποιήσουν µονοπάτια που αλληλεπιδρούν το ένα µε το άλλο, είτε ενισχύοντας ή αναστέλλοντας µία απόκριση ΙΑΦΟΡΕΤΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΑΠΟΚΡΙΝΟΝΤΑΙ ΜΕ ΙΑΦΟΡΕΤΙΚΟΥΣ ΤΡΟΠΟΥΣ ΣΤΟ Ι ΙΟ ΧΗΜΙΚΟ ΣΗΜΑ Η ακετυλχολίνη διεγείρει στη συστολή των σκελετικών µυικών κυττάρων, αλλά ελαττώνει τη συστολή των καρδιακών µυικών κυττάρων Το ίδιο σήµα µπορεί να ενεργοποιήσει διαφορετικές αποκρίσεις σε διαφορετικά κύτταρα µε πρόσδεση σε διαφορετικούς υποδοχείς καθένας από τους οποίους ενεργοποιεί διαφορετικά δευτερογενή µηνύµατα και µονοπάτια Η διαφοροποίηση στην απόκριση οφείλεται : 1. Είτε οι υποδοχείς του σήµατος είναι διαφορετικοί σε διαφορους τύπους κυττάρων, ή 2. Στην «εσωτερική µηχανή» µε την οποία είναι συζευγµένος ο υποδοχέας SIGNAL INTEGRATIN H κατάλληλη απόκριση ενός κυττάρου καθορίζεται συνήθως από πολλά σήµατα παρά από ένα Η ενσωµάτωση της πληροφορίας από διαφορετικά σήµατα εξαρτάται από τις integrator proteins ΕΞΕΙ ΙΚΕΥΣΗ ΚΑΙ ΕΝΙΣΧΥΣΗ ΤΗΣ ΑΠΟΚΡΙΣΗΣ ΜΕΣΩ ΜΗΝΥΜΑΤΟΦΟΡΩΝ ΣΥΜΠΛΟΚΩΝ Scaffold proteins αλληλεπιδρούν µε άλλες µηνυµατοφόρες πρωτεϊνες και οργανώνουν µηνυµατοφόρα σύµπλοκα: ακρίβεια, ταχύτητα, αποτελεσµατικότητα κυτταρικής απόκρισης

3 Η εξέλιξη πολύπλοκων δικτύων µεταγωγής σήµατος διευκολύνθηκε µε δηµιουργία πρωτεϊνών που φέρουν διαφορετικές domains (modular proteins) Μεταγωγή σήµατος από το σύµπλοκο ορµόνης-υποδοχέα στην αδενυλική κυκλάση Η αδενυλική κυκλάση αλληλεπιδρά µε τοσύµπλοκο ορµόνηςυποδοχέα µέσω µιαςτρίτηςπρωτεϊνης: G-protein: GTP-binding regulatory protein ιεγερτική πρωτεϊνη G (Gs: stimulatory G protein): H G πρωτεϊνη που ενεργοποιεί την αδενυλική κυκλάση G-proteins - εσµεύουν και υδρολύουν GTP Ετεροτριµερείς περιφερικές µεµβρανικές πρωτεϊνες α (~45 kda), β (35 kda) και γ (8 kda) υποµονάδες; a δεσµεύει GTP εσµεύονται σε µεµβρανικούς υποδοχείς Μοριακοί διακόπτες Ανταλλαγή και υδρόλυση GTP/GDP για µεταβίβαση σήµατος από µεµβρανικούς υποδοχείς σε ενδοκυττάριους στόχους Μικρές (~21 kd) Π.χ. ras, rac, rho 2002 Lee Bardwell οµή G πρωτεϊνών ΗλειτουργίατωνG πρωτεϊνών υπαγορεύεται από τη δοµή τους: Η Gs αποτελείται από 3 πολυπεπτίδια: Η αυποµονάδα (Gsa) δεσµεύει και υδρολύει GTP (GTPάση) Ενδογενής µηχανισµός ρύθµισης β γ ι βκαιγυποµονάδες σχηµατίζουν ένα ισχυρό σύµπλοκο (Gβγ) που αγκυροβολεί την Gs στην κυτοπλασµική πλευρά της κυτταρικής µεµβράνης Λιπιδιακές τροποποιήσεις των υποµονάδων: Η α-υποµονάδα περιέχει µια palmitoyl και µια myristoyl οµάδα. Η γ-υποµονάδα περιέχει µία geranylgeranyl isoprenoid οµάδα Πρόσθετες µεµβρανικές πρωτεϊνες µπορεί να συµµετέχουν στη δέσµευση της G πρωτεϊνης στη µεµβράνη. FF GEF (ligand-bound receptor) β γ α α β γ GEF: Guanine Nucleotide Exchange Factor GAP: GTPase Activating Proteins GAP (RGS) N 2002 Lee Bardwell

4 Οι περισσότερες G- πρωτεϊνες εξαρτώνται από βοηθητικές πρωτεϊνες : GAPs, GTPase Activating Proteins, προωθούν υδρόλυση GTP. GDP GTP protein-gtp (active) GEF GAP Ga µιας ετεροτριµερούς πρωτεϊνης G έχει ενδογενή ικανότητα υδρόλυσης GTP. Οµως, RGS proteins (Regulators of G protein signaling), οι οποίες είναι αρνητικοί ρυθµιστές των G πρωτεϊνών, λειτουργούν ως GAPs για να διεγείρουν την υδρόλυση GTP από G α. P i protein-gdp (inactive) GDP GTP protein-gtp (active) GEF GAP GEFs, Guanine Nucleotide Exchange Factors, προωθούν την ανταλλαγή GDP/GTP. Ο ενεργοποιηµένος υποδοχέας (GPCR) δρα ως GEF για µια ετεροτριµερή πρωτεϊνη G. P i protein-gdp (inactive) The G- Proteins Activation The G- Proteins Signalling Inactivation Modified from Figure 15-15, Page 494 from: Essential Cell Biology by Alberts et al. 1997, Garland Publishing Inc. New York, NY Activity of βγ subunits Enzymes activated by G-proteins catalyze the synthesis of second messengers Activation of K + channels

5 ΕΝΙΣΧΥΣΗ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΑΠΟΚΡΙΣΗΣ Η ενίσχυση του σήµατος είναι απαραίτητη γιατί τα ορµονικά ερεθίσµατα είναι ασθενή Η συγκέντρωση πολλών ορµονών στο αίµα είναι10-10 Μ Ηενίσχυσηπεριλαµβάνει τρία στάδια: 1. Κάθε σύµπλοκο ορµόνηςυποδοχέα καταλύει το σχηµατισµό πολλών Ga-GTP 2. Mία ενεργοποιηµένη αδενυλική κυκλάση σχηµατίζει πολλά µόρια camp 3. Kάθε πρωτεϊνική κινάση, ενεργοποιηµένη από camp, µπορεί να αλλάξει τη δραστικότητα πολλών µορίων ικογένεια G πρωτεϊνών Η πρωτεϊνη Gs είναι µέλος µιας οικογένειας G πρωτεϊνών Μέλη της οικογένειας έχουν διαφορετική επίδραση Π.χ. Η αδενυλική κυκλάση αναστέλεται από µια διαφορετική πρωτεϊνη G: Giα : inhibitory G protein Ανασταλτική πρωτεϊνη G Οι υποµονάδες β και γ είναι όµοιες όπως και στην Gs H υποµονάδα α διαφέρει (Gia) β-αδρενεργικός υποδοχέας διεγείρει την αδενυλική κυκλάση µέσω Gsα πρωτεϊνης (επινεφρίνη, γλυκαγόνη, βασοπρεσσίνη, και άλλες ορµόνες της υπόφυσης (π.χ Ωχρινοτρόπος ορµόνη) και των επινεφριδίων α 2 -αδρενεργικός υποδοχέας αναστέλλει την αδενυλική κυκλάση µέσω Giα πρωτεϊνης (νορεπινεφρίνη, αγγειοτενσίνη) Τι κάνουν οι τριµερείς πρωτεϊνες G? Ενεργοποίηση ενζύµων: Eνεργοποίηση αδενυλικής κυκλάσης (Gs) Eνεργοποίηση φωσφολιπάσης C-β (Gq) Αναστολή ενζύµων: Αναστολή αδενυλικής κυκλάσης (Gi), Ενεργοποίηση ή απενεργοποίηση καναλιών ιόντων -αντίληψη του φωτός στον αµφιβληστροειδή χιτώνα (Gt, Μεταγωγίνη-transducin) -αίσθηση της όσφρησης στους οσφρητικούς νευρώνες (Golf) Αλλες πρωτεϊνες G ενεργοποιούν µονοµερείς GTPάσες για να ρυθµίσουν ενδοκυττάριες διαδικασίες

6 G-Protein- Activated Enzymes Eτερογένεια G α υποµονάδων C. elegans: 20 Gα, 2 Gβ και2 Gγ Θηλαστικά: 16 Gα, 6 Gβ και12 Gγ Η ετερογένεια των Gα υποµονάδων δηµιουργείται µε alternative splicing των Gα mrnas Gs Gi Go Gq Gt Adrenergic (epinephrine) Muscarinic (acetylcholine) GABA-b PTH Rhodopsin Adenylate cyclase on Adenylate cyclase off Adenylate cyclase off PLC-β on PDE6 on Calcium channel open Potassium channel open Calcium channel closed Mηχανισµός δράσης των υποµονάδων Κοινά δοµικά και λειτουργικά χαρακτηριστικά των G πρωτεϊνών Οι υποµονάδες Gα και Gβγ συµµετέχουν στη µεταγωγή σήµατος µέσω: -αλληλεπίδρασης µε downstream effectors ή -ανεξάρτητης δράσης των υποµονάδων ή -συνεργιστικής δράσηςή -ανταγωνιστικής δράσης Π.χ. ΚΑΡ ΙΑ Ο β-αδρενεργικός υποδοχέας ενεργοποιεί την αποσυσχέτιση Gsα και Gβγ Και οι δύο υποµονάδες δεσµεύονται σε downstream effectors : Η Gsα ενεργοποεί αδενυλική κυκλάση και παραγωγή camp H Gβγ συµµετέχει στην απενεργοποίηση του υποδοχέα µε δέσµευση στην β-ark (β-adrenergic receptor kinase), την κινάση που φωσφορυλιώνει και εµποδίζει τον υποδοχέα να ανταλλαξει GDP, τερµατίζοντας έτσι το σήµα 1. Αποτελούν ενδιάµεσα ενεργοποιηµένων υποδοχέων 2. Είναι ετεροτριµερείς (α, β, γ υποµονάδες). 3. Αλληλοµετατρέπονται µεταξύ µιας ενεργούς µορφής (GTP) και µιας ανενεργούς (GDP) 4. Ενεργοποιούνται συνεχώς από ανάλογα του GTP που δεν υδρολύονται: - GTPγS S P P - - P - CH 2 H H H H N N H H N NH NH 2 GTPγS Inhibitory Gα PDB 1GIA 5. Ολες σχεδόν ριβοζυλιώνονται από ADP µε δράση της τοξίνης της χολέρας ή του κοκκύτη 6. Ενεργοποιούνται από υποδοχείς που είναι ενδοµεµβρανικές πρωτεϊνες µε έναµοτίβο επτά ελίκων

7 Μικρές G πρωτεϊνες περιλαµβάνουν: initiation & elongation factors (protein synthesis). Ras (growth factor signal cascades). Rab (vesicle targeting and fusion). ARF (forming vesicle coatomer coats). Ran (transport of proteins into & out of the nucleus). Rho (regulation of actin cytoskeleton) All GTP-binding proteins differ in conformation depending on whether GDP or GTP is present at their nucleotide binding site. Generally, GTP binding induces the active state. Ras πρωτεϊνες Συµµετέχουν σε µονοπάτια µεταγωγής σήµατος που απαιτούνται κατά την κυτταρική διαίρεση και τη διαφοροποίηση Μοριακοί διακόπτες που ενεργοποιούνται από υποδοχείς τυροσυλο-κινάσης Παρόµοιες σε λειτουργία και δοµή µε την υποµονάδα Gα εσµεύουν GTP, αλλά ΕΝ υδρολύουν GTP H ανενεργή µορφή δεσµεύει GDP, ενώ η ενεργή δεσµεύει GTP Απαιτείται η δράση GAP πρωτεϊνών (GTPase activating protein) για να γίνουν ενεργές The small G-protein molecular switch GTP Ras-GDP FF Pi GEF GAP GDP signal 1 RAS-GTP signal 2 N signal 3 Ser/thr Kinase Cascade activated by Ras and PKC GEF= GTP exchange factor GAP= GTPase activating protein ΜΕΤΑΓΩΓΗ ΣΗΜΑΤΟΣ ΚΑΙ ΚΑΡΚΙΝΟΣ Οι RAS είναι ενδοκυττάριες πρωτεϊνες που ενεργοποιούνται από υποδοχείς συζευγµένους µε ένζυµα Οι ενεργοποιηµένες RAS ξεκινούν ένα καταρράκτη αντιδράσεων που αλλάζουν ενζυµικές ενεργότητες και γονιδιακή έκφραση 30% των ανθρώπινων καρκίνων έχουν µεταλλαγές σε γονίδια RAS (ογκογονίδια)

8 H ρύθµιση της G πρωτεϊνης είναι σηµαντική για φυσιολογική λειτουργία Η τοξίνη της χολέρας (Vibrio cholerae) προκαλεί σοβαρή διάρροια που οδηγεί σε σοκ και θάνατο αν ο οργανισµός δεν αναπληρώσει τα υγρά που έχασε Cholera Toxin: Mechanism of Action Arg α GTP Nicotinic Acid H πρωτεϊνη G βρίσκεται συνεχώς σε ενεργό µορφή Η τοξίνη της χολέρας τροποποιεί οµοιοπολικά την Gs: ADP-ριβόζη µεταφέρεται από το NAD σε ένα κατάλοιπο αργινίνης της Ga, αναστέλλοντας την ικανότητα της να υδρολύει το GTP ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: ΗπρωτεϊνηG είναι συνεχώς σε ενεργή µορφή H αδενυλική κυκλάση παραµένει συνεχώς ενεργοποιηµένη Τα επίπεδα camp αυξάνονται υπερβολικά Ενεργοποίηση µεταφοράς ιόντων που οδηγεί σε απώλεια Na + και Η 2 Οπροςτοέντερο Nicotinic Acid ADP Ribose Nicotinic Acid-ADP- Ribose = NAD ADP-Ribose-N-Arg Inactive A. Cyclase ATP α GTP Active A. Cyclase camp Η τοξίνη του κοκκύτη (Bordetella pertussis) παρεµποδίζει την αναστολή της αδενυλικής κυκλάσης Η τοξίνη προκαλεί οµοιοπολική προσθήκη ADP-ριβόζης σε ένα κατάλοιπο κυστεϊνης στην ανασταλτική πρωτεϊνη G (Giα) και έτσι εµποδίζει την απενεργοποίηση της αδενυλικής κυκλάσης Υψηλά επίπεδα camp Σηµ. Η ADP-ριβοζυλίωση είναι ένας γενικός µηχανισµός ρύθµισης της ενεργότητας πολλών πρωτεϊνών σε ευκαρυωτικά και προκαρυωτικά κύτταρα