ΠΑΡΑΔΟΤΕΟ Π3.1. Είδος Παραδοτέου: Τεχνική Αναφορά Υπεύθυνος Φορέας: ΕΜΒΙΑ (1) Ημερομηνία: 08/10/2014. Ιστορικό Εγγράφου

Transcript

1 ΕΥΡΩΠΑΪΚΗ# ΕΝΩΣΗ#ΕΥΡΩΠΑΪΚΟ# Υπουργείο Παιδείας και Θρησκευμάτων, Πολιτισμού και Αθλητισμού Ε.#Π.#Ανταγωνιστικότητα#και#Επιχειρηματικότητα#(ΕΠΑΝ#ΙΙ),#ΠΕΠ#Μακεδονίας# #Θράκης,#ΠΕΠ#Κρήτης#και#Νήσων#Αιγαίου,#ΠΕΠ# Θεσσαλίας# #Στερεάς#Ελλάδας# #Ηπείρου,#ΠΕΠ#Αττικής ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΟΣ ΒΟΗΘΟΣ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗΣ ELECTRONIC MOLECULAR DIAGNOSTICS ASSISTANT ΠΑΡΑΔΟΤΕΟ Π3.1 Γενετικές Συνιστώσες της ΔΠΑ και Εξαγωγή Φαινοτυπικών (επίπεδα ανταπόκρισης στο λίθιο) Γονιδιακών/ Γονοτυπικών Συσχετίσεων Μοριακοί Βιοδείκτες για τη ΔΠΑ Είδος Παραδοτέου: Τεχνική Αναφορά Υπεύθυνος Φορέας: ΕΜΒΙΑ (1) Ημερομηνία: 08/10/2014 Ιστορικό Εγγράφου Έκδοση Ημερομηνία Κατάσταση Προετοιμασία Διανομή* - Ονομ./Επώνυμο, (#Φορέα) - Θ. Κατσίλα, (1) /07/2014 Προσχέδιο Γ. Ποταμιάς, (3) Γ. Πατρινός, (1) K Θ. Κατσίλα, (1) /09/ η έκδοση Γ. Πατρινός, (1) K Τελική 08/10/2014 Τελικό Γ. Πατρινός, (1) EE * Κ: Κοινοπραξία έργου, EE: ΕΥΔΕ- ΕΤΑΚ, Δ: Δημόσιο έγγραφο (ελεύθερο, π.χ., Web- Site έργου)

2 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Σήμερα, η ανάπτυξη της μετα- γενωμικής καθιστά σαφή την ανάγκη κατανόησης της γενετικής βάσης των ασθενειών, προκειμένου να σχεδιαστεί η βέλτιστη θεραπευτική προσέγγιση. Ωστόσο, η μετάβαση από την παρούσα «βασισμένη σε αποδείξεις» ιατρική στη «βασισμένη στη γενωμική» ιατρική δεν μπορεί παρά να λάβει χώρα, μόνο, όταν και αν η γενωμική πληροφορία είναι ακριβής και εξατομικευμένη ή αφορά μικρούς πληθυσμούς ασθενών. Η «βασισμένη στη γενωμική» ιατρική εξαρτάται έντονα από την μεταφραστική έρευνα, τη μετάφραση και μετάβαση της νέας πληροφορίας από το ερευνητικό εργαστήριο στην κλινική πράξη. Για αυτό, απαιτείται η σωστή διαχείριση της πληροφορίας, ώστε τα ευρήματα μαζί με την κλινική τους εφαρμογή και σημασία να αποδίδονται κατάλληλα και έγκαιρα. Αυτό, ακριβώς, είναι το όραμα του παρόντος έργου, δημιουργώντας μια πλατφόρμα κλινικο- γενωμικής πληροφορίας, όπου τέθηκαν ως κλινικοί πυλώνες δύο νευρολογικές ασθένειες, η διπολική διαταραχή (ΔΠΑ) και η αμυοτροφική πλευρική σκλήρυνση (ΑΜΣ). Σε αυτό το παραδοτέο, εστιάζουμε στη ΔΠΑ, παρουσιάζοντας τις γενετικές συνιστώσες της νόσου και τη συσχέτισή τους με τα επίπεδα απόκρισης στο λίθιο. Ως εκ τούτου, προσδιορίζονται οι γονιδιακές/ γονοτυπικές φαινοτυπικές συσχετίσεις, στη βάση των οποίων επιλέγονται οι μοριακοί βιοδείκτες για τη νόσο. EXECUTIVE SUMMARY Today, with the raise of post- genomics, it becomes evident that there is a great need to understand the genetic basis of disease towards the design of the ultimate therapeutic approach. Nevertheless, the transition from the evidence- based medicine to the genomic- based medicine will not be accomplished, if genomic information does not become more accurate and individualized or narrowed down to small patient popoulation groups. Genomic medicine depends to a great extent on translational research; the translation and transition of the new genomic information from the research laboratory to the clinic. Thus, proper information management is of paramount importance, so that findings accompanied by their clinical relevance and applicability are appropriately and timely delivered. This is the exact vision of this proposal via the creation of a platform of clinico- genomic information, where two neurological diseases bipolar disorder (BD) and amyolateral sclerosis (ALS) are considered as its clinical benchmarks. Herein, we focus on BD and present the genetic basis of the disease as well as its correlation to lithium response. Therefore, a genetic phenotypic correlation is established, resulting in the selection of molecular biomarkers of lithium response in BD. 1 /12

3 ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ 1. Εισαγωγικά Στοιχεία Οι Γενετικές Συνιστώσες της Διπολική Διαταραχής (ΔΠΑ) Απόκριση στο Λίθιο Η Γενετική Βάση της Απόκρισης στο Λίθιο Γονιδιακές - Φαινοτυπικές Συσχετίσεις Μοριακοί Βιοδείκτες για τη ΔΠΑ η Προσέγγιση η Προσέγγιση... 8 Αναφορές /12

4 1. Εισαγωγικά Στοιχεία Σήμερα, η ανάπτυξη της μετα- γενωμικής καθιστά σαφή την ανάγκη κατανόησης της γενετικής βάσης των ασθενειών, προκειμένου να σχεδιαστεί η βέλτιστη θεραπευτική προσέγγιση. Ωστόσο, η μετάβαση από την παρούσα «βασισμένη σε αποδείξεις» ιατρική στη «βασισμένη στη γενωμική» ιατρική δεν μπορεί παρά να λάβει χώρα, μόνο, όταν και αν η γενωμική πληροφορία είναι ακριβής και εξατομικευμένη ή αφορά μικρούς πληθυσμούς ασθενών. Η «βασισμένη στη γενωμική» ιατρική εξαρτάται έντονα από την μεταφραστική έρευνα, τη μετάφραση και μετάβαση της νέας πληροφορίας από το ερευνητικό εργαστήριο στην κλινική πράξη. Είναι γνωστό πως πολλά υποσχόμενες ανακαλύψεις στη βασική και κλινική επιστήμη «χάνονται στη μετάφραση» [1, 2]. Συνεπώς, η ορθή διαχείριση της μεταφραστικής έρευνας είναι ζωτικής σημασίας, έτσι, ώστε τα σχετικά ευρήματα - σε συνδυασμό με την κλινική σημασία και εφαρμογή τους να αποδίδονται κατάλληλα και έγκαιρα [3]. Η μετάφραση των ευρημάτων της έρευνας σε κλινικές εφαρμογές δεν αποτελεί εύκολο έργο. Πράγματι, οι δυσκολίες στη λήψη ιατρικών αποφάσεων στην καθημερινή πρακτική είναι σε μεγάλο βαθμό αποτυχίες συνδυασμού της γνώσης. Μάλιστα, σε ένα τόσο σημασιολογικά ετερογενές περιβάλλον, οι σχετικές διαδικασίες λήψης ιατρικών αποφάσεων γίνονται πιο απαιτητικές, αναφορικά με την περιοχή αναφοράς τους. Ενδεικτικό παράδειγμα αποτελούν τα κλινικά προφίλ με πληθυσμιακό προσανατολισμό κατά τη διάρκεια της ζωής ενός ατόμου, τα οποία και εμπλουτίζονται με γονιδιωματικές/ γενετικές πληροφορίες, αποσκοπώντας σε αξιόπιστες σχέσεις γονοτύπου - φαινοτύπου και βιοδείκτες ευαισθησίας. Προσπαθώντας να ικανοποιήσει τις προαναφερθείσες δυσκολίες και ελλείψεις και να ανταποκριθεί στην πρόκληση της γονιδιωματικής ιατρικής, το παρόν έργο ακολουθεί ένα συμπαγή σχεδιασμό έρευνας και ανάπτυξης, αποσκοπώντας στην παράδοση επικυρωμένων φαρμακογονιδιωματικών στόχων, στην ανάπτυξη μιας ολοκληρωμένης πλατφόρμας διαχείρισης δεδομένων και τέλος, σε ένα περιβάλλον ανακάλυψης γνώσης. Το όραμα του έργου αφορά στη διευκόλυνση της λήψης αποφάσεων στην κλινική, καθιστώντας δυνατή την εξατομικευμένη διαγνωστική ή/ και ιατρική, βελτιώνοντας την ποιότητα ζωής του ασθενούς και μειώνοντας τα κόστη στην υγεία. Δύο είναι οι κλινικοί πυλώνες, στα πλαίσια του έργου: η αμυοτρφική πλευρική σκλήρυνση (ΑΜΣ) και η διπολική διαταραχή (ΔΠΑ). Σε αυτό το παραδοτέο, εστιάζουμε στη ΔΠΑ, παρουσιάζοντας τις γενετικές συνιστώσες της νόσου και τη συσχέτισή τους με τα επίπεδα απόκρισης στο λίθιο. Ως εκ τούτου, προσδιορίζονται οι γονιδιακές/ γονοτυπικές φαινοτυπικές συσχετίσεις, στη βάση των οποίων επιλέγονται οι μοριακοί βιοδείκτες για τη νόσο. 3 /12

5 2. Οι Γενετικές Συνιστώσες της Διπολικής Διαταραχής (ΔΠΑ) Η διπολική διαταραχή (ΔΠΑ) ή μανιοκατάθλιψη είναι μια σοβαρή εξουθενωτική, χρόνια ψυχιατρική κατάσταση, η οποία συνοδεύεται από εναλλασσόμενα μανιακά και καταθλιπτικά επεισόδια. Γενετικά επιδημιολογικά δεδομένα που προέρχονται από μελέτες σε οικογένειες, διδύμους και υιοθεσίες υποδεικνύουν υψηλή κληρονομικότητα για τη νόσο [4]. Μελέτες σύνδεσης και συσχέτισης έχουν επίσης αποκαλύψει πολλές πιθανές θέσεις ευαισθησίας στη ΔΠΑ, καθώς και υποψήφια γονίδια, αλλά καμία και κανένα δεν έχει περαιτέρω επικυρωθεί [4-6]. Παρόμοια με τις άλλες πολύπλοκες γενετικές ασθένειες, μέρος της απούσας κληρονομικότητας της ΔΠΑ θα μπορούσε να εξηγηθεί από σπάνιες γενετικές παραλλαγές (με συχνότητα αλληλομόρφων [MAF] < 0,01), ενδεχομένως με μεγαλύτερο μέγεθος επίδρασης [7]. Μια άλλη εξήγηση για τα πολλά ασαφή ευρήματα κατά τη διερεύνηση των γενετικών παραγόντων με καθοριστικό ρόλο στη ΔΠΑ θα μπορούσε να αφορά στον υψηλό βαθμό κλινικής ετερογένειας που παρουσιάζει αυτή η ψυχιατρική ασθένεια. Σε αυτό το πλαίσιο, η χρήση των υποφαινοτύπων όπως η απόκριση στο λίθιο δύναται να αυξήσει τη φαινοτυπική (και ενδεχομένως, τη γενετική) ομοιογένεια, διευκολύνοντας την ταυτοποίηση των σχετικών γενετικών παραλλαγών [8]. 3. Απόκριση στο Λίθιο Το λίθιο είναι ένας σταθεροποιητής διάθεσης και αποτελεί τη θεραπεία επιλογής για τους ασθενείς με ΔΠΑ [9]. Ωστόσο, δεν αποκρίνονται όλοι οι ασθενείς αποτελεσματικά σε αυτή τη θεραπεία [6, 9]. Κλινικά στοιχεία υποδεικνύουν ότι το 80% των ασθενών με μακροχρόνια χορήγηση λιθίου εμφανίζουν τουλάχιστον μερική απάντηση στο λίθιο, με το 30% αυτών των ασθενών να παρουσιάζουν μια άριστη απάντηση με πλήρη ύφεση των συμπτωμάτων [10]. Οι μηχανισμοί που είναι υπεύθυνοι για την κλινική αποτελεσματικότητα του λιθίου παραμένουν ασαφείς, αλλά αρκετά δεδομένα υποδεικνύουν πλέον ότι αυτό το ιόν εμπλέκεται στη ρύθμιση της σηματοδότησης νευροδιαβιβαστών, πιθανόν μέσω της αλληλεπίδρασης με το μονοπάτι της ινοσιτόλης [11], και την άμεση και έμμεση αναστολή της GSK3- β, ενός σημαντικού μορίου των ενδοκυτταρικών καταρρακτών σηματοδότησης [12]. Η ρύθμιση αυτών των μορίων/ διαδικασιών από το λίθιο οδηγεί εν τέλει στη ρύθμιση ενός πλήθους διαδικασιών που εμπλέκονται στην απόπτωση και την νευρογένεση [13] Η Γενετική Βάση της Απόκρισης στο Λίθιο Η απόκριση στο λίθιο έχει αποδειχθεί πως είναι οικογενής [14] και συνδέεται με ένα οικογενειακό ιστορικό της ΔΠΑ [15], υποδηλώνοντας ότι οι γενετικοί παράγοντες διαδραματίζουν βασικό ρόλο, επηρεάζοντας τη δράση του λιθίου και κατά συνέπεια, την απόκριση των ασθενών στη θεραπεία. Επιπλέον, κλινικές παρατηρήσεις δείχνουν ότι οι ασθενείς που αποκρίνονται στο λίθιο διαφαίνεται να ανήκουν σε μια ξεχωριστή ομάδα ασθενών, που αντιπροσωπεύει 4 /12

6 τον πυρήνα - φαινότυπο της ΔΠΑ [16]. Αρκετές μελέτες έχουν αποπειραθεί να διελευκάνουν τη γενετική βάση της απόκρισης στο λίθιο, αξιολογώντας τη σύνδεση μεταξύ των γονιδίων που κωδικοποιούν για πιθανούς μοριακούς στόχους του λιθίου (ενδεικτικά: υποδοχέας ντοπαμίνης D3, μεταφορέας σεροτονίνης, υποδοχέας σεροτονίνης 2Α, 2C και 1Α, φωσφολιπάση Cγ1, GSK3β, PDZ και επικράτεια 5 του LIM) και τη θετική απόκριση στη θεραπεία. Τα αποτελέσματα, αν και δεν κατάφεραν να επικυρωθούν, εμφανίζουν ενδιαφέρον και χρήζουν περαιτέρω διερεύνησης [17-18]. Πρόσφατα, δύο κλινικές δοκιμές απόκρισης στο λίθιο, μία αναδρομική και μια προοπτική, εστίασαν σε ασθενείς με ΔΠΑ που αποκρίνονται στο λίθιο και σε ασθενείς με ΔΠΑ και μηδενική απόκριση. Και οι δύο μελέτες έδειξαν μια θετική συσχέτιση μεταξύ της απόκρισης του λιθίου και ενός σημειακού μονονουκλεοτιδικού πολυμορφισμού (SNP) στο γονίδιο NTRK2. Η πρωτεΐνη NTRK2 έχει βρεθεί πως εμπλέκεται στις βραχυπρόθεσμες συναπτικές λειτουργίες, αλλά και στη μακροπρόθεσμη ενδυνάμωση των συνάψεων του εγκεφάλου [19-20]. Παρά το πλήθος των μελετών που έχουν λάβει χώρα, σήμερα είναι ακόμη ασαφές ποια γονίδια και ποια χρωμοσώματα συμμετέχουν στην παθογένεια της ΔΠΑ. Η εν λόγω ασάφεια ενισχύεται από το σύνολο των γονιδιακών θέσεων ευαισθησίας στη νόσο ή/ και των υποψήφιων γονιδίων που εντούτοις αποτυγχάνει να επικυρωθεί. Εξίσου σημαντικά, οι μελέτες που εστιάζουν στην απόκριση στο λίθιο, διερευνώντας τη γενετική της βάση, δεν έχουν καταλήξει σε συμφωνία. Τα παραπάνω, σε συνδυασμό με την αποτυχία των προσεγγίσεων αναζήτησης υποψήφιων γονιδίων, μας υπέδειξαν ως προσέγγιση επιλογής την πραγματοποίηση μελετών γενετικής συσχέτισης σε γονιδιωματική κλίμακα. 4. Γονιδιακές Φαινοτυπικές Συσχετίσεις Αποσκοπώντας στην εξαγωγή γονιδιακών φαινοτυπικών συσχετίσεων προς αναζήτηση φαρμακογονιδιωματικών βιοδεικτών απόκρισης στο λίθιο, στα πλαίσια του παρόντος έργου, διενεργήσαμε μια μελέτη γενετικής συσχέτισης σε γονιδιωματική κλίμακα, της οποίας τα ευρήματα επικυρώθηκαν στη συνέχεια με εκτενή γονοτύπηση. Πιο συγκεκριμένα, χρησιμοποιήθηκαν δεδομένα από μελέτη σε πληθυσμό ασθενών με ΔΠΑ στη Σαρδηνία (τουλάχιστον τέσσερις γενεές), παρέχοντάς μας την πρόσβαση σε 52 δείγματα DNA (άσχετων ατόμων, με ΔΠΑ διάγνωση). Η απόκριση στο λίθιο βασίστηκε σε κλίμακα, σύμφωνα με την οποία το μηδέν «0» υποδηλώνει «καμία απόκριση» στη θεραπεία, ενώ το δέκα «10» υποδηλώνει την «πλήρη απόκριση» στη θεραπεία με λίθιο. Η ομάδα ελέγχου αποτελείται από περισσότερα από 100 υγιή άτομα. Τα κρίτηρια εισόδου στη μελέτη ήταν:! Τουλάχιστον 12μηνη συνεχής χορήγηση λιθίου! Παρουσία τουλάχιστον ενός επεισοδίου πριν τη χορήγηση της θεραπείας! Ικανοποιητικά κλινικά δεδομένα προς γραφική αποτύπωση της ασθένειας κατά τη θεραπεία (σε συμφωνία με τις οδηγίες του National Institute of Mental Health Retrospective Life Chart)! Επίπεδα λιθίου στο αίμα εντός του θεραπευτικού εύρους (0,5-1 meq/l) 5 /12

7 Κατά τη διάρκεια της θεραπείας, πραγματοποιήθηκε καταγραφή ρουτίνας των επιπέδων του λιθίου στο αίμα, ώστε να αξιολογείται η υπακοή του ασθενούς και να προσδιορίζεται το βέλτιστο επίπεδο απόκρισης για κάθε ασθενή. Αυτή η προσέγγιση επέτρεψε τον σχεδιασμό εξατομικευμένης δόσης. Στην περίπτωση της μερικής/ μη απόκρισης κατά το χαμηλότερο όριο του θεραπευτικού εύρους, αυξήσαμε τη δόση του λιθίου μέχρι και το υψηλότερο όριο του εν λόγω εύρους, πριν την κατάταξη ενός ασθενή στους «μη αποκρινόμενους». Οι περίοδοι κατά τις οποίες οι ασθενείς ελάμβαναν και άλλους σταθεροποιητές διάθεσης αποκλείστηκαν από την παρούσα μελέτη. Για την ποσοτικοποίηση της συσχέτισης γονοτύπου φαινοτύπου, ακολουθήσαμε τρεις διαφορετικές αναλυτικές προσεγγίσεις, αναφορικά με την κλίμακα απόκρισης:! Επιλογή των ασθενών στα δύο ακραία άκρα της κλίμακας απόκρισης στο λίθιο, ώστε να αυξηθεί η φαινοτυπική και γενετική ποικιλομορφία ανάμεσα στις δύο ομάδες! Διχοτόμηση του φαινοτύπου απόκρισης, με την εφαρμογή της τιμής «7» ως «πλήρης απόκριση» ή υψηλότερα, σε ένα μεγαλύτερο δείγμα ασθενών, αντιπροσωπεύοντας τη συνολική ποικιλομορφία που χαρακτηρίζει τον φαινότυπο της απόκρισης στο λίθιο! Έλεγχος των διαφορών στο μέσο συνολικό σκορ απόκρισης, κατόπιν κανονικοποίησης (ΤS), ανάμεσα στους γονότυπους των SNPs, εφαρμόζοντας μια προσέγγιση ποσοτικού γνωρίσματος Στα πλαίσια της εν λόγω μελέτης γενετικής συσχέτισης σε γονιδιωματική κλίμακα, η γονοτυπική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση των μικροσυστοιχιών Affymetrix GeneChip SNP 6.0, εφαρμόζοντας τα πρωτόκολλα ανάλυσης, κατά τις οδηγίες του κατασκευαστή (Affymetrix Inc, CA, USA). Εν συνεχεία, ακολουθήθηκαν δύο προσεγγίσεις ανάλυσης των δεδομένων, οι οποίες και παρατίθενται ακολούθως. 5. Μοριακοί Βιοδείκτες για τη ΔΠΑ η Προσέγγιση Στα πλαίσια της εν λόγω προσέγγισης, δημιουργήσαμε μια λίστα με SNPs, σύμφωνα με τα ακόλουθα κριτήρια: (i) MAF > 0,01, (ii) genotype call rate > 0,97 και (iii) τιμή p για την ισορροπία Hardy- Weinberg > (PLINK v2.05, Haploview v4.2). Οι SNPs που δεν επιβίωσαν των εν λόγω κριτηρίων ( από τους ) αποκλείστηκαν από την περαιτέρω ανάλυση. Επίσης, τα δεδομένα μας ελέγχθηκαν για πιθανή πληθυσμιακή διαστρωμάτωση. Συνολικά, 50 SNPs φάνηκαν να συσχετίζονται με την απόκριση στο λίθιο, έχοντας μη διορθωμένες τιμές p στο εύρος τιμών Οι εν λόγω SNPs διερευνήθηκαν περαιτέρω και εν τέλει, επιλέχθηκαν εκείνοι οι SNPs, οι οποίοι (i) είχαν τιμή p μικρότερη του 10-5, (ii) στη βάση του πιο κοντινού γονιδίου, της σχέσης του με τη ΔΠΑ και τη θέση του SNP υπό μελέτη σε αυτό το γονίδιο (προτεραιότητα δόθηκε στους ιντρονικούς και εξωνικούς πολυμορφισμούς) και τέλος, (iii) απορρίπτοντας τους πολυμορφισμούς σε ανισορροπία σύνδεσης (D =1, r 2 >0,98). Οι πολυμορφισμοί που επιβίωσαν και των ανωτέρω κριτηρίων 6 /12

8 (Πίνακας 11) βρέθηκαν εντός ή κοντά σε γονίδια που κωδικοποιούν για υποδοχείς που συνδέονται με G- πρωτεϊνες, κανάλια ιόντων, δάχτυλα ψευδαργύρου και πρωτεϊνες- προσαρμογείς. Η πληθυσμιακή διαστρωμάτωση, τέλος, θεωρήθηκε αμελητέα. Πίνακας 1. Μοριακοί Βιοδείκτες για την ΔΠΑ - 1η προσέγγιση SNP Χρωμόσωμα Θέση.(bp) Πλησιέστερο. Γονίδιο. Απόσταση MAF Συχνότητα. Αλληλομόρφων. (Πλήρης.Απόκριση) Συχνότητα. Αλληλομόρφων. (Μη.Απόκριση) rs q ZC3H15 / T0.14 C1.00 T E/05 rs q TMCC1 Ιντρόνιο:4 G0.45 G0.78 C E/06 rs p GNPDA2 / T0.25 T0.44 C E/06 rs q TGFB1 /64306 G0.48 C0.72 G E/05 rs q RASSF4 Ιντρόνιο:4 C0.43 C0.66 A E/06 rs p OR51L G0.43 G0.62 A E/05 Τιμή.p Εξώνιο:1: (ASN/SER) G0.50 A0.70 G E/05 rs p OR52E2 rs q SCN8A Ιντρόνιο:1 G0.27 A0.46 G E/05 rs q ACCN1 Ιντρόνιο:1 G0.25 G0.44 C E/06 rs q RPL7A / G0.16 G1.00 A E/05 rs q C21orf G0.25 G0.46 C E/05 Τα πιο σημαντικά ευρήματα θεωρούνται αυτά για τον rs (ιντρόνιο 4 του γονιδίου TMCC1), τον rs ( bp καθοδικά του γονιδίου GNPDA2), τον rs (ιντρόνιο 4 του γονιδίου RASSF4) και τον rs (ιντρόνιο 1 του γονιδίου ACCN1). Το γονίδιο TMCC1 χαρτογραφείται στο χρωμόσωμα 3q22.1 και κωδικοποιεί για ένα μέλος της διαμεμβρανικής και τυλιγμένης σε σπείρα επικράτειας της family 1. Αυτή η περιοχή του χρωμοσώματος δεν έχει αναφερθεί να σχετίζεται με τη ΔΠΑ ή την απάντηση στο λίθιο σε μελέτες γενετικής συσχέτισης σε γονιδιωματική κλίμακα ή μελέτες σύνδεσης. Αν και λίγα είναι γνωστά σχετικά με το ρόλο του TMCC1, φαίνεται να έχει κάποιο ρόλο στην οικογενή προσωπική πάρεση [21]. Το γονίδιο GNPDA2 χαρτογραφείται στο χρωμόσωμα 4p12 και κωδικοποιεί για τη γλυκοζαμίνη- 6- φωσφορική απαμινάση, έχοντας έντονη συμμετοχή στην παχυσαρκία και το μεταβολικό σύνδρομο [22]. Η εν λόγω χρωμοσωμική περιοχή, εν γένει, έχει χαρακτηριστή ως τόπος για τη ΔΠΑ και τη σχιζοφρένεια [23]. Το γονίδιο RASSF4, που χαρτογραφείται στο χρωμόσωμα 10q11.21, κωδικοποιεί για ένα μέλος της οικογένειας των RAS ογκοκατασταλτικών μορίων, που ρυθμίζει κάποιες από τις λειτουργίες αναστολής της αύξησης του RAS. Το εν λόγω γονίδιο εμπλέκεται και στη διαδικασία της απόπτωσης, ενώ και η περιοχή 10q έχει συσχετιστεί με τη ΔΠΑ [24]. Το γονίδιο ACCN1, τέλος, έχει βρεθεί πως κωδικοποιεί για την πρωτείνη ASIC2, ένα μέλος της υπερ- οικογένειας των DEG/ENaC. Αυτό το κανάλι ιόντων είναι κυρίως διαπερατό σε ιόντα νατρίου και 7 /12

9 λιγότερο σε ιόντα λιθίου ή καλίου και εκφράζεται σε μεγάλο βαθμό στους νευρώνες. Τα εν λόγω κανάλια έχουν βρεθεί να συσχετίζονται με την παθοφυσιολογία του πόνου, το ισχαιμικό εγκεφαλικό επεισόδιο και τις ψυχιατρικές νόσους [25] η Προσέγγιση Για την εν λόγω προσέγγιση, λήφθηκαν υπόψην τρεις διακριτοί φαινότυποι (BPI, BPII, SAM) και δυο τύποι απόκρισης (1,0). Όσον αφορά τους φαινοτύπους, αυτοί προσδιορίστηκαν και αφορούν τη διπολική διαταραχή (BPI), τη διπολική διαταραχή με επαναλαμβανόμενα συμπτώματα κατάθλιψης (BPII) και τη διπολική διαταραχή μανιακού τύπου (SAM) [26]. Με το «1» χαρακτηρίζεται η πλήρης απόκριση στο λίθιο, ενώ με το «0» η απουσία απόκρισης. Παρόμοια με την 1η προσέγγιση, δημιουργήσαμε μια λίστα με SNPs, απορρίπτοντας εκείνους (i) με τιμή p για την ισορροπία Hardy- Weinberg < (PLINK v2.05), (ii) που απέτυχαν στο missingess test (PLINK v2.05) και (iii) με LD > 0,2. Οι SNPs που επιβίωσαν των κριτηρίων (38.704) διερευνήθηκαν περαιτέρω ( (Εικόνα 1). Σε αντίθεση με την 1η προσέγγιση, εδώ δεν έλαβε χώρα ανάλυση MAF, καθώς ο αριθμός των δειγμάτων υπήρξε μικρός. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε ανάλυση KINGSHIP για την αναζήτηση συσχετίσεων μεταξύ των δειγμάτων, η οποία δεν οδήγησε σε κάποιο εύρημα. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκαν τρεις διαδοχικές αναλύσεις, με τα ακόλουθα ζεύγη BPI- BPII, BPI- SAM, BPII- SAM και BPI- BPII- SAM. Εικόνα 1. Ανάλυση PCA ( Ένα μόνο δείγμα βρέθηκε να διαφέρει σημαντικά (ερυθρό βέλος) και αποκλείστηκε. ΕΠΑΝ ΙΙ- ΣΠ- - emodia 8 /12 Παραδοτέο Π3.1 Παραδοτέο Π3.1

10 Πίνακας 2. Μοριακοί Βιοδείκτες για την ΔΠΑ - 2η προσέγγιση Χρωμόσωμα Γονίδιο SNP_RS Τιμή5p 52 2 THEM18 LOC rs E706 4 ABCG2 rs E707 4 ABCG2 rs E707 8 MFHAS1 rs E706 8 rs E706 5 OTTHUMG rs E706 5 LECT2 rs E LOC rs E706 Τα ευρήματά μας, μεταξύ άλλων, υποστηρίζουν πως υπάρχει μια περιοχή στο χρωμόσωμα 4 (rs , rs ), η οποία διαφαίνεται να διαφέρει σημαντικά ανάμεσα στους BPI και BPII φαινότυπους και ως εκ τούτου, να επηρεάζει την απόκριση στο λίθιο. Παρατηρήσαμε, επίσης, πως με την προσθήκη του SAM φαινοτύπου, καταλήγουμε σε μικρότερες τιμές p, γεγονός που μας υποδεικνύει ότι ο εν λόγω φαινότυπος βρίσκεται μεταξύ των BPI και BPII. Και οι δύο SNPs, rs και rs αφορούν στο γονίδιο ABCG2 και δεν εμπεριέχονται σε καμία πρότερη μελέτη γενετικής συσχέτισης σε γονιδιωματική κλίμακα. Διερευνώντας περαιτέρω τους εν λόγω SNPs, προχωρήσαμε στη δημιουργία μιας QQ- plot, η οποία υποδεικνύει την αναμενόμενη κατανομή των στατιστικών δοκιμασιών (άξονας x) σε σχέση με τα εκατομμύρια των SNPs και σε σύγκριση με τις παρατηρούμενες τιμές (άξονας y). Έτσι, οποιαδήποτε απόκλιση από τη γραμμή Χ=Y αφορά σε μια επαναλήψιμη διαφορά ανάμεσα στις «περιπτώσεις» και τους «μάρτυρες» σε όλο το γονιδίωμα, υποστηρίζοντας βεβιασμένες τιμές. Στη δική μας ανάλυση, το σύνολο των τιμών p ταυτίζεται με την εν λόγω γραμμή, υποδεικνύοντας πως έχουμε αληθείς παραλλαγές σχετικές με τη νόσο (disease variants) (Εικόνα 2). Εμβαθύνοντας στον rs , τα ευρήματα μιας LocusZoom plot ( υπέδειξαν ένα σύνολο SNPs σε ανισορροπία σύνδεσης (Εικόνα 3). 9 /12

11 Εικόνα 2. QQ plot απεικόνιση Οι τιμές p απεικονίζονται με κυανό χρώμα. Τα δύο διακριτά ερυθρά σημεία αφορούν στους δύο υπό μελέτη SNPs. Εικόνα 3. LocusZoom plot για τον rs /12

12 Αναφορές [1] Lenfant, C Shattuck lecture: clinical research to clinical practice- lost in translation? N Eng J Med 349:868 [2] Contopouloss Ioannidis JP, Ntzami E, Ionnidis JP Translation of highly promising basic science research into clinical applications. Am J Med 114: 477 [3] Khoury MJ et al The continuum of translation research in genomic medicine: how can we accelerate the appropriate integration of human genome discoveries into health caree and disease prevention? Genetic Med 9: 665 [4] Hayden EP, Nurnberger JI Jr Molecular genetics of bipolar disorder. Genes Brain Behav. 5(1): 85 [5] Mathews CA, Reus VI Genetic linkage in bipolar disorder. CNS Spectr. 8(12): 891 [6] Kato T Molecular neurobiology of bipolar disorder: a disease of mood- stabilizing neurons? Trends Neurosci. 31(10): 495 [7] Manolio TA, Collins FS, Cox NJ et al Finding the missing heritability of complex diseases. Nature 461(7265): 747 [8] Alda M, Grof P, Rouleau GA, Turecki G, Young LT Investigating responders to lithium prophylaxis as a strategy for mapping susceptibility genes for bipolar disorder. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 29(6): 1038 [9] Carney SM, Goodwin GM Lithium a continuing story in the treatment of bipolar disorder. Acta Psychiatr. Scand. Suppl. 426: 7 [10] Garnham J, Munro A, Slaney C et al Prophylactic treatment response in bipolar disorder: results of a naturalistic observation study. J. Affect. Disord. 104(1 3): 185 [11] Quiroz JA, Gould TD, Manji HK Molecular effects of lithium. Mol. Interv. 4(5): 259 [12] Li X, Jope RS Is glycogen synthase kinase- 3 a central modulator in mood regulation? Neuropsychopharmacology 35(11): 2143 [13] Machado- Vieira R, Manji HK, Zarate CA Jr The role of lithium in the treatment of bipolar disorder: convergent evidence for neurotrophic effects as a unifying hypothesis. Bipolar Disord. 11(Suppl. 2): 92 [14] Grof P, Duffy A, Cavazzoni P et al Is response to prophylactic lithium a familial trait? J. Clin. Psychiatry 63(10): 942 [15] Grof P, Alda M, Grof E, Zvolsky P, Walsh M Lithium response and genetics of affective disorders. J. Affect. Disord. 32(2): 85 [16] Alda M, Grof P, Rouleau GA, Turecki G, Young LT Investigating responders with: lithium prophylaxis as a strategy for mapping susceptibility genes for bipolar disorder. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry 29(6): 1038 [17] Steen VM, Løvlie R, Osher Y, Belmaker RH, Berle JO, Gulbrandsen AK The polymorphic inositol polyphosphate 1- phosphatase gene as a candidate for pharmacogenetic prediction of lithium- responsive manic- depressive illness. Pharmacogenetics 8(3): 259 [18] Squassina A, Manchia M, Del Zompo M Pharmacogenomics of mood stabilizers in the treatment of bipolar disorder. Hum. Genomics Proteomics 2010: [19] Kelsoe J, Leckband S, Demodena A, McKinney R, Shekhtman T Replication of association of the NTRK2 gene with lithium response in bipolar disorder in a prospective sample. Presented at: 60th annual meeting of the American Society of Human Genetics. Washington, DC, USA, 2 6 Novemeber [20] Dmitrzak- Weglarz M, Rybakowski JK, Suwalska A et al Association studies of the 11 /12

13 BDNF and the NTRK2 gene polymorphisms with prophylactic lithium response in bipolar patients. Pharmacogenomics 9(11): 1595 [21] Kremer H, Kuyt LP, Van Den Helm B et al Localization of a gene for Moebius syndrome to chromosome 3q by linkage analysis in a Dutch family. Hum. Mol. Genet. 5(9):1367 [22] Blackwood DH, He L, Morris SW et al A locus for bipolar affective disorder on chromosome 4p. Nat. Genet. 12(4): 427 [23] Eckfeld K, Hesson L, Vos MD, Bieche I, Latif F, Clark GJ RASSF4/AD037 is a potential Ras effector/tumor suppressor of the RASSF family. Cancer Res. 64(23): 8688 [24] Ferreira MA, O Donovan MC, Meng YA et al Collaborative genome- wide association analysis supports a role for ANK3 and CACNA1C in bipolar disorder. Nat. Genet. 40(9): 1056 [25] Wemmie JA, Price MP, Welsh MJ Acid- sensing ion channels: advances, questions and therapeutic opportunities. Trends Neurosci. 29(10): 578 [26] Zandi PP et. al. (2007) Genome- wide linkage scan of 98 bipolar pedigrees and analysis of clinical covariates. Molecular Psychiatry 12: /12