ΠΑΡΑΔΟΤΕΟ Π3.3. Είδος Παραδοτέου: Τεχνική Αναφορά Υπεύθυνος Φορέας: ΠΔΕ (2) Ημερομηνία: 11/05/2015. Ιστορικό Εγγράφου

Μέγεθος: px

Εμφάνιση ξεκινά από τη σελίδα:

Download "ΠΑΡΑΔΟΤΕΟ Π3.3. Είδος Παραδοτέου: Τεχνική Αναφορά Υπεύθυνος Φορέας: ΠΔΕ (2) Ημερομηνία: 11/05/2015. Ιστορικό Εγγράφου"

Νέμεσις Μπουκουβαλαίοι
7 χρόνια πριν
Προβολές:

1 ΕΥΡΩΠΑΪΚΗ# ΕΝΩΣΗ#ΕΥΡΩΠΑΪΚΟ# Υπουργείο Παιδείας και Θρησκευμάτων, Πολιτισμού και Αθλητισμού Ε.#Π.#Ανταγωνιστικότητα#και#Επιχειρηματικότητα#(ΕΠΑΝ#ΙΙ),#ΠΕΠ#Μακεδονίας# #Θράκης,#ΠΕΠ#Κρήτης#και#Νήσων#Αιγαίου,#ΠΕΠ# Θεσσαλίας# #Στερεάς#Ελλάδας# #Ηπείρου,#ΠΕΠ#Αττικής ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΟΣ ΒΟΗΘΟΣ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗΣ ELECTRONIC MOLECULAR DIAGNOSTICS ASSISTANT ΠΑΡΑΔΟΤΕΟ Π3.3 Ποσοτική PCR: Επικύρωση ενδεικτικών βιοδεικτών για ΔΠΑ/ΑΜΣ Είδος Παραδοτέου: Τεχνική Αναφορά Υπεύθυνος Φορέας: ΠΔΕ (2) Ημερομηνία: 11/05/2015 Ιστορικό Εγγράφου Έκδοση Ημερομηνία Κατάσταση /09/2014 Προσχέδιο /03/ η έκδοση Τελική 11/05/2015 Τελικό Προετοιμασία - Ονομ./Επώνυμο, (#Φορέα) - Γ. Πατριαρχέας, (2) Γ. Πατρινός (1) Γ. Πατριαρχέας, (2) Γ. Πατρινός (1) Γ. Πατριαρχέας, (2) Γ. Πατρινός (1) * Κ: Κοινοπραξία έργου, EE: ΕΥΔΕ- ΕΤΑΚ, Δ: Δημόσιο έγγραφο (ελεύθερο, π.χ., Web- Site έργου) Διανομή* K K EE

2 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Σήμερα, η ανάπτυξη της μετα- γενωμικής καθιστά σαφή την ανάγκη κατανόησης της γενετικής βάσης των ασθενειών, προκειμένου να σχεδιαστεί η βέλτιστη θεραπευτική προσέγγιση. Ωστόσο, η μετάβαση από την παρούσα «βασισμένη σε αποδείξεις» ιατρική στη «βασισμένη στη γενωμική» ιατρική δεν μπορεί παρά να λάβει χώρα, μόνο, όταν και αν η γενωμική πληροφορία είναι ακριβής και εξατομικευμένη ή αφορά μικρούς πληθυσμούς ασθενών. Η «βασισμένη στη γενωμική» ιατρική εξαρτάται έντονα από την μεταφραστική έρευνα, τη μετάφραση και μετάβαση της νέας πληροφορίας από το ερευνητικό εργαστήριο στην κλινική πράξη. Για αυτό, απαιτείται η σωστή διαχείριση της πληροφορίας, ώστε τα ευρήματα μαζί με την κλινική τους εφαρμογή και σημασία να αποδίδονται κατάλληλα και έγκαιρα. Αυτό, ακριβώς, είναι το όραμα του παρόντος έργου, δημιουργώντας μια πλατφόρμα κλινικο- γενωμικής πληροφορίας, όπου τέθηκαν ως κλινικοί πυλώνες δύο νευρολογικές ασθένειες, η ΔΠΑ και η ΑΜΣ. Σε αυτό το παραδοτέο, παρουσιάζουμε ενδεικτικούς διαγνωστικούς και προγνωστικούς (υποψήφιους) βιοδείκτες, τόσο για τη ΔΠΑ, όσο και για την ΑΜΣ, κατόπιν επικύρωσης αυτών. EXECUTIVE SUMMARY Today, with the raise of post- genomics, it becomes evident that there is a great need to understand the genetic basis of disease towards the design of the ultimate therapeutic approach. Nevertheless, the transition from the evidence- based medicine to the genomic- based medicine will not be accomplished, if genomic information does not become more accurate and individualized or narrowed down to small patient popoulation groups. Genomic medicine depends to a great extent on translational research; the translation and transition of the new genomic information from the research laboratory to the clinic. Thus, proper information management is of paramount importance, so that findings accompanied by their clinical relevance and applicability are appropriately and timely delivered. This is the exact vision of this proposal via the creation of a platform of clinico- genomic information, where two neurological diseases BD and ALS are considered as its clinical benchmarks. Herein, we will present the diagnostic and prognostic (candidate) biomarkers for both BD and ALS, following their validation. 1 /9 Παραδοτέο Π3.3

3 ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ 1. ΑΜΣ - Μεθοδολογία Ανάλυσης και Επικύρωσης ΔΠΑ - Μεθοδολογία Ανάλυσης και Επικύρωσης /9 Παραδοτέο Π3.3

4 1. ΑΜΣ - Μεθοδολογία Ανάλυσης και Επικύρωσης Στα πλαίσια του παρόντος έργου η μεθοδολογία ανάλυσης/ επικύρωσης των ενδεικτικών βιοδεικτών για τις ΑΜΣ/ΔΠΑ αφορά στην εφαρμογή μεθοδολογιών PCR. Ο σχεδιασμός των εκκινητών έγινε με τη βοήθεια του προγράμματος Primer3 (v ) (Koressaar and Remm 2007) ( Αρχικά, εντοπίζεται η ακριβής θέση των υπό μελέτη παραλλαγών μέσω της βάσης δεδομένων Ensembl ( όπου δίδεται και μέρος της αλληλουχίας που περιβάλλει τον εκάστοτε πολυμορφισμό. Ο σχεδιασμός των εκκινητών έγινε έτσι, ώστε το προϊόν της PCR να περικλείει τον πολυμορφισμό περίπου στο κέντρο του. Επίσης, μέσω του Primer3 ελέγχονται βασικές παράμετροι, όπως η θερμοκρασία τήξης (Tm) των εκκινητών και η ποσοστιαία σύστασή τους σε βάσεις γουανίνης και κυτοσίνης (GC content). Συγκεκριμένα, δίδεται η δυνατότητα ελέγχου των ακόλουθων παραμέτρων: οι Tm των εκκινητών θα πρέπει να είναι παρόμοιες και μεταξύ ο C, το μήκος τους μεταξύ νουκλεοτίδια, ενώ η περιεκτικότητα σε GC να κυμαίνεται μεταξύ %. Επιπλέον, είναι απαραίτητο να ελεγχθεί ο κάθε εκκινητής ως προς το αν εμφανίζει συμπληρωματικότητα, είτε με τον εαυτό του (self- complementarity) ή με τον άλλο εκκινητή, με αποτέλεσμα να σχηματίζονται διμερή εκκινητών (primer dimers). Η προϋπόθεση αυτή εξετάστηκε μέσω του προγράμματος DNAMAN ή εναλλακτικά του DINAMELT two- state melting (hybridization), το οποίο εντοπίζεται στον σύνδεσμο ( state- melting). Για τη χρήση του DINAMELT two- state melting (hybridization) εργαλείου, πληκτρολογώντας το σύμβολο «;», μπορούμε να διαχωρίσουμε τα ολιγονουκλεοτίδια μεταξύ τους και με αυτόν τον τρόπο να εισάγουμε περισσότερες από δύο αλληλουχίες εκκινητών προς σύγκριση. Επίσης, υπάρχει η δυνατότητα ρύθμισης των παραμέτρων ενέργειας (energy rules), έτσι ώστε να αφορούν DNA ολιγονουκλεοτίδια, περίπου στη θερμοκρασία υβριδοποίησης των εκκινητών (~60 ο C), με συγκέντρωση Na + ίση προς 50mM και τέλος, συγκέντρωση ολιγονουκλεοτιδίων (strand concentration), η οποία αφορά τη συγκέντρωση των εκκινητών στον τελικό όγκο της αντίδρασης PCR (πλην εξαιρέσεων ορίζεται στα 2 μμ). Μια ακόμη παράμετρος που διερευνάται είναι η ειδικότητα των εκκινητών ως προς το ανθρώπινο γονιδίωμα. Για το λόγο αυτό, χρησιμοποιήθηκε ο αλγόριθμος BLAST (Basic Local Alignment Tool) του Ensembl, όπου εξετάζουμε αν οι εκκινητές που σχεδιάστηκαν, είναι ειδικοί και συμπληρωματικοί με μικρό αριθμό αλληλουχιών στο ανθρώπινο γονιδίωμα, για την αποφυγή παραπροϊόντων στην PCR. Τέλος, με τη βοήθεια του DINAMELT two- state melting (folding) βλέπουμε τις δευτεροταγείς δομές του pcr προϊόντος στον ακριβή σύνδεσμο ( state- folding). Στον τελευταίο έλεγχο ανασταλτικός παράγοντα της επιλογής των εκκινητών αποτελεί η δημιουργία βρόγχου στην περιοχή των εκκινητών και επιπλέον προτιμάμε προϊόντα με τιμές της διαφορά στην ελεύθερης ενέργεια Gibbs (ΔG) μεταξύ - 1 και +1. Σε συνέχεια των παραδοτέων Π2.1 και Π3.2 και αναφορικά με την ΑΜΣ, εστιάσαμε στον rs του γονιδίου FTO. Οι εκκινητές που επιλέχθηκαν είναι οι: ACACTGTTTCTACACTTGCAGAA(F) και GGCCTTAACAAAGCAGGTGAAA(R). 3 /9 Παραδοτέο Π3.3

5 Αναφορικά με την PCR που εφαρμόστηκε: με θερμοκρασία υβριδοποίησης ίση προς 58 C (εικόνα 1). Το γονίδιο GADPH χρησιμοποιήθηκε ως γονίδιο αναφοράς (εικόνα 2). Εικόνα 1. Ενδεικτικά αποτελέσματα για τον rs /9 Παραδοτέο Π3.3

6 Εικόνα 2. Ενδεικτικά αποτελέσματα για το GADPH Η ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης πιστοποιεί την αξιοπιστία των ευρημάτων (εικόνα 3). Εικόνα 3. Ενδεικτικά αποτελέσματα για τον rs και το GADPH ΕΠΑΝ ΙΙ- ΣΠ- - emodia 5 /9 Παραδοτέο Π3.3

7 O rs εξακριβώθηκε και μετά από αλληλούχηση κατά Sanger (τα προϊόντα καθαρίστηκαν με χρήση του ενζύμου ExoSAP IT) (εικόνα 4). Εικόνα 4. Ενδεικτικά αποτελέσματα για τον rs /9 Παραδοτέο Π3.3

8 2. ΔΠΑ - Μεθοδολογία Ανάλυσης και Επικύρωσης Με βάση τα παραδοτέα 2.1 και 3.1, εστιάσαμε στο γονίδιο ACCN1 και συγκεκριμένα, τον rs Η απόφασή μας αυτή βασιστηκε στη συσχέτιση του γονοτύπου G/G με την απόκριση στο λίθιο. Στα πλαίσια του παρόντος έργου, χρησιμοποιήθηκαν δεδομένα από μελέτη σε πληθυσμό ασθενών με ΔΠΑ στη Σαρδηνία (τουλάχιστον τέσσερις γενεές), παρέχοντάς μας την πρόσβαση σε 52 δείγματα DNA (άσχετων ατόμων, με ΔΠΑ διάγνωση). Η απόκριση στο λίθιο βασίζεται σε κλίμακα, σύμφωνα με την οποία το μηδέν «0» υποδηλώνει «καμία απόκριση» στη θεραπεία, ενώ το δέκα «10» υποδηλώνει την «πλήρη απόκριση» στη θεραπεία με λίθιο. Η ομάδα ελέγχου αποτελείται από περισσότερα από 100 υγιή άτομα. Τα κρίτηρια εισόδου στη μελέτη ήταν: Τουλάχιστον 12μηνη συνεχής χορήγηση λιθίου Παρουσία τουλάχιστον ενός επεισοδίου πριν τη χορήγηση της θεραπείας Ικανοποιητικά κλινικά δεδομένα προς γραφική αποτύπωση της ασθένειας κατά τη θεραπεία (σε συμφωνία με τις οδηγίες του National Institute of Mental Health Retrospective Life Chart) Επίπεδα λιθίου στο αίμα εντός του θεραπευτικού εύρους (0,5-1 meq/l) Κατά τη διάρκεια της θεραπείας, πραγματοποιήθηκε καταγραφή ρουτίνας των ειπέδων του λιθίου στο αίμα, ώστε να αξιολογείται η υπακοή του ασθενούς και να προσδιορίζεται το βέλτιστο επίπεδο απόκρισης για κάθε ασθενή. Αυτή η προσέγγιση επέτρεψε τον σχεδιασμό εξατομικευμένης δόσης. Στην περίπτωση της μερικής/ μη απόκρισης κατά το χαμηλότερο όριο του θεραπευτικού εύρους, αυξήσαμε τη δόση του λιθίου μέχρι και το υψηλότερο όριο του εν λόγω εύρους, πριν την κατάταξη ενός ασθενή στους «μη αποκρινόμενους». Οι περίοδοι κατά τις οποίες οι ασθενείς ελάμβαναν και άλλους σταθεροποιητές διάθεσης αποκλείστηκαν από την παρούσα μελέτη. Για την ποσοτικοποίηση της συσχέτισης γονοτύπου φαινοτύπου, ακολουθήσαμε τρεις διαφορετικές αναλυτικές προσεγγίσεις, αναφορικά με την κλίμακα απόκρισης: Επιλογή των ασθενών στα δύο ακραία άκρα της κλίμακας απόκρισης στο λίθιο, ώστε να αυξηθεί η φαινοτυπική και γενετική ποικιλομορφία ανάμεσα στις δύο ομάδες Διχοτόμηση του φαινοτύπου απόκρισης, με την εφαρμογή της τιμής «7» ως «πλήρης απόκριση» ή υψηλότερα, σε ένα μεγαλύτερο δείγμα ασθενών, αντιπροσωπεύοντας τη συνολική ποικιλομορφία που χαρακτηρίζει τον φαινότυπο της απόκρισης στο λίθιο Έλεγχος των διαφορών στο μέσο συνολικό σκορ απόκρισης, κατόπιν κανονικοποίησης (ΤS), ανάμεσα στους γονότυπους των SNPs, εφαρμόζοντας μια προσέγγιση ποσοτικού γνωρίσματος Ο rs επιβεβαιώθηκε και με την εφαρμογή μεθοδολογίας PCR, με γονίδιο αναφοράς το GADPH (εικόνες 5 και 6). 7 /9 Παραδοτέο Π3.3

9 Εικόνα 5. Ενδεικτικά αποτελέσματα για τον rs Εικόνα 6. Ενδεικτικά αποτελέσματα για το GADPH Στην εικόνα 7, αποδίδεται ενδεικτική απεικόνιση πηκτώματος αγαρόζης. 8 /9 Παραδοτέο Π3.3

10 Εικόνα 7. Ενδεικτικά αποτελέσματα για τον rs /9 Παραδοτέο Π3.3

Σχετικά έγγραφα

ΠΑΡΑΔΟΤΕΟ Π1.2. Είδος Παραδοτέου: Τεχνική Αναφορά Υπεύθυνος Φορέας: DYNACOMP A.E. (4) Ημερομηνία: 10/02/2014. Ιστορικό Εγγράφου

ΠΑΡΑΔΟΤΕΟ Π1.2. Είδος Παραδοτέου: Τεχνική Αναφορά Υπεύθυνος Φορέας: DYNACOMP A.E. (4) Ημερομηνία: 10/02/2014. Ιστορικό Εγγράφου ΕΥΡΩΠΑΪΚΗ# ΕΝΩΣΗ#ΕΥΡΩΠΑΪΚΟ# Υπουργείο Παιδείας και Θρησκευμάτων, Πολιτισμού και Αθλητισμού Ε.#Π.#Ανταγωνιστικότητα#και#Επιχειρηματικότητα#(ΕΠΑΝ#ΙΙ),#ΠΕΠ#Μακεδονίας# #Θράκης,#ΠΕΠ#Κρήτης#και#Νήσων#Αιγαίου,#ΠΕΠ#