ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΞΕΛΙΞΗΣ ΤΗΣ ΗΠΑΤΙΚΗΣ ΙΝΩΣΗΣ ΑΣΘΕΝΩΝ ΜΕ ΧΡΟΝΙΑ ΗΠΑΤΙΤΙΔΑ Β, ΥΠΟ ΤΗΝ ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΑΝΤΙΙΚΗΣ ΑΓΩΓΗΣ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ Δ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Α. ΓΑΡΥΦΑΛΛΟΣ ΠΑΝΕΠ. ΕΤΟΣ Αριθμ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΞΕΛΙΞΗΣ ΤΗΣ ΗΠΑΤΙΚΗΣ ΙΝΩΣΗΣ ΑΣΘΕΝΩΝ ΜΕ ΧΡΟΝΙΑ ΗΠΑΤΙΤΙΔΑ Β, ΥΠΟ ΤΗΝ ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΑΝΤΙΙΚΗΣ ΑΓΩΓΗΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ ΠΑΠΑΧΡΥΣΟΣ ΕΙΔΙΚΟΣ ΠΑΘΟΛΟΓΟΣ ΕΙΔΙΚΕΥΟΜΕΝΟΣ ΓΑΣΤΡΕΝΤΕΡΟΛΟΓΙΑΣ-ΗΠΑΤΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ

2 Η ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ 1. Ακριβιάδης Ευάγγελος (επιβλέπων) / ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ 2. Γουλής Ιωάννης / ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ 3. Χυτήρογλου Πρόδρομος / ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Η ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ 1. Ακριβιάδης Ευάγγελος (επιβλέπων) / ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ 2. Αντωνιάδης Νικόλαος / ΕΠΙΚ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ 3. Γερμανίδης Γεώργιος / ΕΠΙΚ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ 4. Γουλής Ιωάννης / ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ 5. Σινάκος Εμμανουήλ / ΕΠΙΚ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ 6. Τζιούφα-Ασημακοπούλου Βαλεντίνη / ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ 7. Χυτήρογλου Πρόδρομος / ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ «Η έγκριση της διδακτορικής διατριβής υπό της Ιατρικής Σχολής του Α.Π.Θ. δεν υποδηλοί αποδοχή των γνωμών του συγγραφέως» Νόμος 5343/32, άρθρο 202, παρ. 2 και ν. 1268/82 άρθρο 50 2

3 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΡΟΕΔΡΟΣ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΑΛΕΞΑΝΔΡΟΣ-ΑΝΑΣΤΑΣΙΟΣ ΓΑΡΥΦΑΛΛΟΣ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ ΤΟΜΕΑ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΚΑΡΑΓΙΑΝΝΗΣ ΑΣΤΕΡΙΟΣ 3

4 4

5 Στη σύζυγο μου Γιώτα και τον υιό μου Δημήτρη 5

6 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η λοίμωξη από τον ιό της ηπατίτιδας Β (HBV) αποτελεί ένα από τα μείζονα προβλήματα υγείας παγκοσμίως. Υπολογίζεται ότι περίπου 400 εκατομμύρια πάσχουν από χρόνια ηπατίτιδα Β (ΧΗΒ) με δυνητικές επιπλοκές όπως η ανάπτυξη κίρρωσης του ήπατος ή ηπατοκυτταρικού καρκινώματος. Συνολικά άτομα πεθαίνουν ετησίως από επιπλοκές σχετιζόμενες με τον ιό HBV. Η ηπατική ίνωση είναι αποτέλεσμα της επουλωτικής ικανότητας του ήπατος, ως αντίδρασης στη χρόνια φλεγμονή από οποιαδήποτε αιτία. Η χρόνια φλεγμονή μέσω διάφορων παθοφυσιολογικών μηχανισμών οδηγεί στην εναπόθεση συνδετικού ιστού στο ηπατικό παρέγχυμα. Το τελικό αποτέλεσμα της προόδου της ινώσεως του ήπατος είναι η ανάπτυξη κίρρωσης, πυλαίας υπέρτασης καθώς και ηπατοκυτταρικού καρκινώματος. Η κατανόηση των παθοφυσιολογικών μηχανισμών που συμβάλλουν στην ηπατική ίνωση οδήγησε στη διαπίστωση ότι η διαδικασία της ινώσεως είναι μία δυναμική διεργασία με αμφίδρομη πορεία. Το γεγονός αυτό επιτρέπει τη θεωρητική υπόθεση ότι η άρση του γενουσιουργού αιτίου της ηπατικής νόσου καθώς και η έγκαιρη αναγνώριση των ασθενών με προχωρημένη μεν ηπατική ίνωση (με επεμβατικές ή μη μεθόδους), χωρίς ωστόσο εμφάνιση κλινικών συμπτωμάτων (άρση της αντιρρόπησης της κιρρώσεως), είναι δυνατό να συμβάλλει στη μείωση του ποσοστού των ασθενών που θα εξελιχθούν σε ανάπτυξη τελικού σταδίου της ηπατικής νόσου και σε ανάγκη μεταμόσχευσης του ήπατος. Τα τελευταία έτη με την παρουσία των αντιικών σκευασμάτων μπορούμε να καταστείλουμε πλήρως τον ιικό αναδιπλασιασμό. Σκοπός της παρούσας διατριβής είναι να αναδείξει ότι η καταστολή του αναδιπλασιασμού του ιού της ηπατίτιδας Β, υπό 6

7 την επίδραση αντιικής αγωγής, ακόμη και σε ασθενείς με προχωρημένη ίνωση ή κίρρωση, επιδρά ανασταλτικά στην εξέλιξη της ίνωσης και μάλιστα κινητοποιεί τη διαδικασία της υποστροφής αυτής στο ήπαρ. Στο σημείο αυτό θα ήθελα να ευχαριστήσω ιδιαιτέρως τον καθηγητή Παθολογίας-Ηπατολογίας και επιβλέποντα της διατριβής κ. Ακριβιάδη για την ευκαιρία που μου έδωσε να ασχοληθώ με ένα τόσο ενδιαφέρον θέμα καθώς επίσης για την κριτική, την καθοδήγηση και τις πολύτιμες υποδείξεις που μου έκανε κατά τη διάρκεια συγγραφής της διατριβής. Ευχαριστώ τον καθηγητή Παθολογικής Ανατομικής κ. Χυτήρογλου για τη βοήθεια του κατά την ιστολογική ανάλυση των αποτελεσμάτων καθώς επίσης για την αμέριστη συμπαράσταση που μου έδειξε κατά τη διάρκεια της διατριβής. Ευχαριστώ το μέλος της τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής αναπληρωτή καθηγητή κ. Γουλή για τις ουσιαστικές και εποικοδομητικές παρατηρήσεις του. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω ιδιαιτέρως τον επίκουρο καθηγητή κ. Σινάκο για την ουσιαστική βοήθεια του κατά τη διάρκεια της συγγραφής της παρούσης διατριβής. Κλείνοντας ευχαριστώ ολόψυχα τη σύζυγο μου Γιώτα για την ολόπλευρη και αμέριστη συμπαράστασή της. 7

8 Κατάλογος Ακρωνυμίων (Abbreviations) ADV: Adefovir Dipivoxil AIH: Αυτοάνοση Ηπατίτιδα ALD: Αλκοολική Νόσος Ήπατος ALP: Αλκαλική Φωσφατάση ALT: Alanine Aminotransferase anti-hbc: Hepatitis B core Antibody AST: Aspartate Aminotransferase AUC: Area Under the Curve cccdna: covalently closed circular DNA CTLs: Cytotoxic T cell DHBV: Duck Hepatitis B Virus DNA: Deoxyribonucleic Acid EASL: European Association for the Study of the Liver ECM: Extracellular Matrix EDA: Extra Domain-A EMT: Epithelial-Mesenchymal Transition ET-1: Ενδοθηλίνη-1 ETA&B: Endothelin Receptor Type A & B ETV: Entecavir GSH: Glutathione GSHV: Ground Squirrel Hepatitis Virus HAI: Histology Activity Index HBeAg: Hepatitis B e Antigen HBIG: Hepatitis B Immunoglobulin HBsAg: Hepatitis B Surface Antigen HBV: Hepatitis B Virus HBV-DNA: Hepatitis B Virus Deoxyribonucleic Acid HCC: Hepatocellular Carcinoma HCV: Hepatitis C Virus HDV: Hepatitis D Virus HIV: Human Immunodeficiency Virus HLA: Human Leukocyte Antigen HSCs: Hepatic Stellate Cells IFN: Interferon IGF-1: Insulin-like Growth Factor I IL: Interleukin INR: International Normalized Ratio LAM: lamivudine LdT: Telbivudine MCP-1: Μονοκυτταρική Χημειοτακτική Πρωτεΐνη 1 MEIA: Microparticle Enzyme Immunoassay MHC-II: Major Histocompatibility Complex-II MMPs: Metalloproteinases MT-MMPs: Membrane Type MMPs NA: Νουκλεοσ(τ)ιδικά Ανάλογα 8

9 NADPH: Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate NAFLD: Non Alcoholic Fatty Liver Disease NASH: Μη Αλκοολική Στεατοηπατίτιδα NAT: Nucleic Amplification Technology NF-κΒ: Nuclear Factor κβ NGFR: Nerve Growth Factor Receptor NK: Natural Killers PBC: Πρωτοπαθής Χολική Κίρρωση PCR: Polymerase Chain Reaction PDGF: Platelet-Derived Growth Factor pegifnα: Πεγκυλιωμένη ιντερφερόνη-α PT: Χρόνος Προθρομβίνης RAS: Σύστημα Ρενίνης Αγγειοτενσίνης RNA: Ribonucleic Acid ROI: Reactive Oxygen Intermediate ROS: Reactive Oxygen Species TDF: Tenofovir Disoproxil fumarate TGF-β1: Transforming Growth Factor β1 TIMPs: Tissue Inhibitors of Metalloproteinases TNF: Tumour Necrosis Factor WHV: Woodchuck Hepatitis Virus Α.Π.Θ.: Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης α-sma: alpha-smooth Muscle Actin ΑΤ1: Angiotensin Receptor Type 1 γ-gt: γάμμα γλουταμυλτρανσφεράση Η2Ο2: Υπεροξείδιο του Οξυγόνου ΚΕΕΛΠΝΟ: Κέντρο Ελέγχου και Πρόληψης Νοσημάτων ΝΦΔ: Νεκροφλεγμονώδης Δραστηριότητα Ο2 - : Ανιόν του υπεροξειδίου ΧΗΒ: Χρόνια Ηπατίτιδα Β 9

10 10

11 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 13 o ΜΕΡΟΣ Α : ΗΠΑΤΙΤΙΔΑ Β 19 o ΜΕΡΟΣ Β : ΙΝΩΣΗ ΤΟΥ ΗΠΑΤΟΣ 67 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 103 o Α) ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ 106 o Β) ΥΛΙΚΟ ΜΕΘΟΔΟΣ 108 o Γ) ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ 121 o Δ) ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 122 o Ε) ΣΥΖΗΤΗΣΗ 139 o ΣΤ) ΠΕΡΙΛΗΨΗ 150 o Ζ) SUMMARY 152 o Η) ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ 155 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

12 12

13 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 13

14 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΜΕΡΟΣ Α : ΗΠΑΤΙΤΙΔΑ Β Ιστορική Αναδρομή Επιδημιολογία Τρόποι μετάδοσης του ιού Ιολογία 25 α) Δομή ιού 25 β) Γονιδίωμα ιού 26 γ) Αντιγόνα ιού 27 δ) Γονότυποι του HBV 28 ε) Κύκλος του ιού 29 στ) Μεταλλάξεις του γονιδιώματος του ιού Ανοσοπαθογένεια του HBV 32 α) Οξεία λοίμωξη 32 β) Χρόνια λοίμωξη 33 Φάση ανοσολογικής ανοχής 34 Φάση ανοσολογικής κάθαρσης 35 Φάση ανενεργού φορέα 35 Φάση επανενεργοποίησης του ιού 36 14

15 Λανθάνουσα HBV λοίμωξη Φυσική πορεία λοίμωξης Οξεία Ηπατίτιδα Β 38 Κλινική εικόνα 38 Διάγνωση Χρόνια Ηπατίτιδα Β 41 α) Κλινική εικόνα 41 β) Εξωηπατικές εκδηλώσεις 42 γ) Διάγνωση 43 Ορολογικοί δείκτες 43 Ιστολογική εικόνα 44 δ) Θεραπεία Εκτίμηση της κατάστασης του ήπατος Ενδείξεις θεραπείας Θεραπευτικοί στόχοι Σημεία ολοκληρώσεως της θεραπείας Ορισμοί ανταπόκρισης Φαρμακευτικές επιλογές Ιντερφερόνη Νουκλεοσιδικά Νουκλεοτιδικά ανάλογα (ΝΑ) Αντίσταση στα ΝΑ 57 15

16 8. Θεραπευτική προσέγγιση Αποτυχία θεραπείας Μη ανταπόκριση Μερική ιολογική ανταπόκριση Ιολογική διαφυγή Ανοσοπροφύλαξη 63 α) Ενεργητική 63 β) Παθητική 66 ΜΕΡΟΣ Β : ΙΝΩΣΗ ΤΟΥ ΗΠΑΤΟΣ Εισαγωγή Φυσική εξέλιξη και παράγοντες κινδύνου 68 α) Χρόνια ηπατίτιδα C 70 β) Χρόνια ηπατίτιδα B 70 γ) Αλκοολική νόσος του ήπατος 70 δ) Μη αλκοολική στεατοηπατίτιδα Παθογένεια 71 α) Μηχανισμοί βλάβης του ήπατος Φλεγμονή Απόπτωση Ο ρόλος του οξειδωτικού stress στην ίνωση του ήπατος 76 16

17 β) Εξωκυττάρια ουσία (ECM) Μεταλλοπρωτεϊνάσες Φυσιολογικό ήπαρ Ινωτικό ήπαρ 80 γ) Κύτταρα που διαδραματίζουν ρόλο στην ίνωση του ήπατος Αστεροειδή κύτταρα Mυοϊνοβλάστες Ρόλος υπολοίπων ηπατικών κυττάρων Επιθηλιακή Μεσεγχυματική μετατροπή 90 δ) Το σύστημα της ρενίνης αγγειοτενσίνης στην παθογένεια της ίνωσης του ήπατος 91 ε) Ανοσοποιητικό σύστημα και ίνωση 92 στ) Γενετικοί πολυμορφισμοί που επηρεάζουν την ίνωση Παθοφυσιολογία υποστροφής του σταδίου της ηπατικής ίνωσης 95 17

18 18

19 ΜΕΡΟΣ Α ΗΠΑΤΙΤΙΔΑ Β 19

20 1. ΙΣΤΟΡΙΚΗ ΑΝΑΔΡΟΜΗ Η ηπατίτιδα ως νόσημα είναι γνωστή από πολύ παλιά. Aπό το 1552 π.χ. ο Talmud ο Βαβυλώνιος αναφέρεται στις «φλεγμονές» του ήπατος. Ο επιδημικός χαρακτήρας των ηπατιτίδων έχει καταδειχθεί κατά τη διάρκεια των παγκοσμίων πολέμων. Και φτάνουμε στο 2 ο ήμισυ του 20 ου αιώνα όπου συμβαίνουν οι «επαναστατικές» ορολογικές εξελίξεις προσδιορισμοί για τις ιογενείς ηπατίτιδες. Το 1945 για πρώτη φορά γίνεται προσπάθεια κατηγοριοποίησης της ηπατίτιδας σε ηπατίτιδα Α και Β από τον Mac Callum (1). Το 1965 οι Blumberg et al. από το Fox Cancer Institute της Φιλαδέλφειας των ΗΠΑ ανακάλυψαν ένα αντίσωμα σε δύο πολυμεταγγιζόμενους ασθενείς με αιμορροφιλία το οποίο αντιδρούσε με ένα αντιγόνο που υπήρχε στον ορό ενός ιθαγενούς (αβορίγινα) της Αυστραλίας (2). Αργότερα το ίδιο αντιγόνο βρέθηκε σε ασθενείς που νοσούσαν από ηπατίτιδα. Εξαιτίας του γεγονότος ότι πρωτοανακαλύφθηκε σε αβορίγινες της Αυστραλίας το αντιγόνο αυτό ονομάστηκε αυστραλιανό. Σήμερα είναι γνωστό ότι το αυστραλιανό αντιγόνο αποτελεί το επιφανειακό αντιγόνο του ιού της ηπατίτιδας Β (Hepatitis B Surface Antigen, HBsAg). Το 1976 ο Blumberg τιμήθηκε για την ανακάλυψη αυτή με το βραβείο Nobel. Στο μεταξύ, έρευνες με ηλεκτρονική και ανοσοηλεκτρονική μικροσκόπηση ορών θετικών σε αυστραλιανό αντιγόνο επέτρεψαν το 1970 την αναγνώριση από τον R. S. Dane και τους συνεργάτες του σωματιδίων μεγέθους 42nm, που έκτοτε φέρουν το όνομα του (σωματίδια Dane, Dane particles). Τα σωματίδια αυτά αποτελούν αυτόν καθ αυτόν τον ιό της ηπατίτιδας Β (3). 20

21 2. ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΑ Η λοίμωξη με τον ιό της ηπατίτιδας Β (Hepatitis B Virus, HBV) αποτελεί ένα από τα μείζονα προβλήματα υγείας παγκοσμίως. Υπολογίζεται ότι πάνω από 2 δισεκατομμύρια άνθρωποι έχουν μολυνθεί με τον HBV, και 400 εκατομμύρια πάσχουν από χρόνια ηπατίτιδα Β (ΧΗΒ). Είναι σαφές ότι η ΧΗΒ συνεχίζει να αποτελεί σημαντικό παράγοντα θνητότητας και νοσηρότητας στις μέρες μας (4). Το εύρος και η φυσική ιστορία της νόσου ποικίλλουν, από ανενεργό φορέα με χαμηλό ιικό φορτίο έως προοδευτική χρόνια ηπατίτιδα που μπορεί να εξελιχθεί σε κίρρωση του ήπατος ή ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (Hepatocellular Carcinoma, HCC). Ως αποτέλεσμα, η ηπατίτιδα Β παγκοσμίως είναι υπεύθυνη για πάνω από ένα εκατομμύριο θανάτους ετησίως και για το 5-10% των μεταμοσχεύσεων ήπατος (5, 6). Τέλος, υπολογίζεται ότι το 15-20% των ασθενών με περιγεννητική HBV λοίμωξη θα πεθάνουν από ηπατική νόσο σχετιζόμενη με τον HBV (7). Εξαιτίας της παγκόσμιας σημασίας της ευαισθητοποίησης για τις ιογενείς ηπατίτιδες ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας έχει θεσμοθετήσει την 28 η Ιουνίου ως Παγκόσμια Ημέρα Ηπατίτιδας. Ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας έχει κατηγοριοποιήσει τις χώρες, ανάλογα με τον επιπολασμό της ΧΗΒ, σε τρεις ομάδες: υψηλού >8%, μέτριου 2-8% και χαμηλού <2% επιπολασμού. Στις περιοχές με υψηλή ενδημικότητα περιλαμβάνονται χώρες της Νοτιοανατολικής Ασίας, Ωκεανίας (εκτός από Αυστραλία, Νέα Ζηλανδία), υποσαχάριας Αφρικής, Αμαζονίου, Μέσης Ανατολής, Κεντρικής Ασίας και κάποιες περιοχές της Ανατολικής Ευρώπης. Σε αυτές τις περιοχές το 70-90% των ασθενών έχουν υποστεί λοίμωξη πριν από την ηλικία των 40 ετών και ο επιπολασμός της ΧΗΒ μπορεί να κυμαίνεται από 8 έως 20% (8). 21

22 Η Ελλάδα κατατάσσεται στις χώρες με μέτριο επιπολασμό της ΧΗΒ. Η είσοδος του προγράμματος εμβολιασμού έναντι της ηπατίτιδας Β το 1998 μείωσε την οροθετικότητα του HBsAg από 5,4% σε 2,58% (9). Ωστόσο, λόγω της εισόδου στη χώρα μεταναστών, ιδίως από περιοχές της Μέσης Ανατολής αλλά και αυτών που προέρχονται από χώρες της πρώην ΕΣΣΔ (ομάδες με υψηλή επίπτωση του HBsAg), προκαλεί μεταβολή στην επιδημιολογία της ηπατίτιδας Β και φαίνεται ότι η ΧΗΒ θα εξακολουθήσει να αποτελεί μείζον πρόβλημα υγείας όχι μόνο για την Ελλάδα αλλά και για την υπόλοιπη Ευρώπη (10). Σύμφωνα με πρόσφατα στοιχεία κατά τη χρονική περίοδο δηλώθηκαν στο Κέντρο Ελέγχου και Πρόληψης Νοσημάτων (ΚΕΕΛΠΝΟ) συνολικά 1970 κρούσματα οξείας ηπατίτιδας Β, με διακύμανση από 35 έως 284 ανά έτος και επίπτωση 1,28 ανά πληθυσμού (Εικόνα 1). Όσον αφορά την κατανομή κατά ηλικία, παρατηρείται μείωση της επίπτωσης διαχρονικά, ιδιαίτερα στην ηλικιακή ομάδα 0-14 με μέση δηλούμενη επίπτωση της οξείας ηπατίτιδας Β 2,24 ανά πληθυσμού για το έτος 1998, με σταδιακή μείωση και μηδενική επίπτωση το έτος Είναι προφανές ότι οι ευνοϊκές αυτές μεταβολές σχετίζονται με την ένταξη του εμβολίου έναντι της ηπατίτιδας Β στο Εθνικό Πρόγραμμα Εμβολιασμού το 1998 (Εικόνα 2) (11). 22

23 Εικόνα 1: Επίπτωση της Ηπατίτιδας Β και C στην Ελλάδα. Πηγή: ΚΕΕΛΠΝΟ Εικόνα 2: Οξεία Ηπατίτιδα Β: Επίπτωση / Ηλικιακή Ομάδα. Πηγή: ΚΕΕΛΠΝΟ 23

24 3. ΤΡΟΠΟΙ ΜΕΤΑΔΟΣΗΣ ΤΟΥ ΙΟΥ Ο ιός είναι εξαιρετικά μολυσματικός και μεταδίδεται μέσω του αίματος και των σωματικών υγρών. Τα επίπεδα του ιού στο αίμα είναι πολύ υψηλότερα, 100 έως 1000 φορές, σε σύγκριση με τις άλλες εκκρίσεις του σώματος. Έχει αποδειχθεί ότι το σπέρμα και ο σίελος είναι μολυσματικά. Στα ούρα, τις κολπικές εκκρίσεις, το μητρικό γάλα και τα δάκρυα, έχει ανιχνευθεί ο ιός, ωστόσο η μολυσματικότητα των υγρών αυτών δεν έχει τεκμηριωθεί. Η σεξουαλική μετάδοση είναι ιδιαίτερα υψηλή κυρίως μεταξύ ομοφυλοφίλων ανδρών. Σε ενδημικές περιοχές η διασπορά της ηπατίτιδας Β γίνεται κυρίως με περιγεννητική ή ενδοοικογενειακή μετάδοση. Ενδιαφέρουσα παρατήρηση είναι ότι στην Ασία η μετάδοση γίνεται από τη μητέρα στο νεογνό κατά την περιγεννητική περίοδο ενώ στην Αφρική ο ιός μεταδίδεται κατά την παιδική ηλικία (12, 13). Στις δυτικές χώρες ο ιός μεταδίδεται κυρίως μέσω της ενδοφλέβιας χορήγησης ναρκωτικών ουσιών ή από την αύξηση του αριθμού των τουριστών που ταξιδεύουν σε χώρες με υψηλό επιπολασμό του ιού (σεξουαλικός τουρισμός) (14)(15). Η μετάγγιση αίματος στις μέρες μας είναι σπάνιο αίτιο λοίμωξης από τον HBV λόγω του ορολογικού ελέγχου του προς μετάγγιση αίματος όχι μόνο για το HBsAg αλλά επίσης και για το Hepatitis B core antibody (anti-hbc), με αποτέλεσμα ο κίνδυνος μετάδοσης του HBV να εκτιμάται ότι υφίσταται μόνο σε 1 στις μονάδες αίματος (16). Ο επιπλέον έλεγχος των νουκλεϊκών οξέων του ιού (Nucleic Amplification Technology, ΝΑΤ) μπορεί να συμβάλει στην ανίχνευση μίας ακόμη μικρής ομάδας αιμοδοτών με αυξημένο κίνδυνο μετάδοσης του HBV, αλλά η μέθοδος αυτή δεν έχει αποδειχθεί ακόμα ως οικονομικά αποδοτική (17). 24

25 Η μετάδοση από τη μητέρα στο έμβρυο συσχετίζεται με την παρουσία του HBeAg και το ύψος του ιικού φορτίου (Hepatitis B Virus Deoxyribonucleic Acid, HBV-DNA) στη μητέρα. Η καισαρική τομή δεν έχει αποδειχθεί ότι μειώνει τον κίνδυνο περιγεννητικής μετάδοσης του ιού. Τα νεογνά από οροθετικές μητέρες μπορούν να θηλάσουν, εφόσον πρώτα εμβολιαστούν. Η πιθανότητα μετάδοσης του ιού κατά τη διάρκεια αμνιοπαρακέντησης είναι χαμηλή (18, 19). Τέλος υπάρχει ο ενδονοσοκομειακός κίνδυνος μετάδοσης του ιού, είτε από ασθενή σε ασθενή είτε από το νοσοκομειακό προσωπικό στον ασθενή. Η εισαγωγή του προγράμματος εμβολιασμού έχει μειώσει τον κίνδυνο μόλυνσης του νοσοκομειακού προσωπικού (20). 4. ΙΟΛΟΓΙΑ α) Δομή του ιού Ο HBV είναι ένας ηπατοτρόπος DNA ιός που ανήκει στην οικογένεια των hepadnaviruses μαζί με τον Duck Hepatitis B Virus (DHBV), τον Ground Squirrel Hepatitis Virus (GSHV) και τον Woodchuck Hepatitis Virus (WHV). Ο HBV (γνωστός και ως σωματίδιο του Dane, εικόνα 3) έχει μέγεθος 42nm και αποτελείται από το επιφανειακό αντιγόνο HBsAg και το πυρηνοκαψίδιο το οποίο περιέχει ένα μικρό γονιδίωμα DNA και την DNA πολυμεράση. Το πυρηνοκαψίδιο εκφράζει το αντιγόνο του πυρήνα HBcAg και το αντιγόνο HBeAg (21). 25

26 Εικόνα 3: Ιός της ηπατίτιδας Β μαζί με τα μικρά σφαιρικά και κυλινδρικά σωματίδια όπως φαίνονται σχηματικά καθώς και στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Πηγή: Τροποποιημένο από Gerlich WH et al. Medical virology of hepatitis B: how it began and where we are now. Virol J (21). β) Γονιδίωμα του ιού Το γονιδίωμα του ιού είναι κυκλικό DNA, μερικώς δίκλωνο και έχει περίπου 3200 διπλές βάσεις οι οποίες κωδικοποιούν 4 αλληλεπικαλυπτόμενα γονίδια (Εικόνα 4) (21). 26

27 γ) Αντιγόνα του ιού Το γονίδιο S (επιφανειακό) κωδικοποιεί τις πρωτεΐνες επιφανείας HBsAg. Οι pre-s1 και pre-s2 περιοχές κατά μήκος του S γονιδίου κωδικοποιούν τις μεγάλες και μεσαίες επιφανειακές πρωτεΐνες, οι οποίες ίσως διαδραματίζουν κάποιον ρόλο στην αναγνώριση του ιού από τους υποδοχείς των ηπατοκυττάρων. Το γονίδιο C (πυρήνα) κωδικοποιεί τις πρωτεΐνες του πυρηνοκαψιδίου Hepatitis B core Antigen (HBcAg) και Hepatits B e Antigen (HBeAg). Το γονίδιο P (πολυμεράση) κωδικοποιεί την DNA πολυμεράση/ανάστροφη τρανσκριπτάση του ιού. Το γονίδιο Χ κωδικοποιεί την HBxAg πρωτεΐνη, η οποία πιθανώς διαδραματίζει κάποιο ρόλο στην ενεργοποίηση της μεταγραφής του DNA και ίσως στην ηπατική καρκινογένεση συνδεόμενη με το p53 γονίδιο. (21). Ενώ και οι τρεις επιφανειακές πρωτεΐνες (μεγάλες, μεσαίες και μικρές) εκφράζονται στα σωματίδια του Dane, μόνο οι μικρές επιφανειακές πρωτεΐνες βρίσκονται σε σωματίδια του ιού που περιέχουν γονιδιακό υλικό. Τα μικρά σφαιρικά και κυλινδρικά σωματίδια, τα οποία προέρχονται από το περίβλημα και κυκλοφορούν στο αίμα, έχουν μόνο αντιγονικές ιδιότητες (Εικόνα 4). (21) 27

28 Εικόνα 4. Το γονιδίωμα του HBV. Πηγή: Τροποποιημένο από Gerlich WH et al. Medical virology of hepatitis B: how it began and where we are now. Virol J (21). δ) Γονότυποι του HBV Ο HBV ταξινομείται σε 8 γονότυπους A-H ανάλογα με την ποικιλότητα των νουκλεοσιδικών βάσεων στο γονιδίωμα του ιού (>8%) (21). Υπάρχει συγκεκριμένη γεωγραφική κατανομή των υποτύπων του ιού (22). Στην Ελλάδα επικρατεί κυρίως ο γονότυπος D (98%), με τους υποτύπους D/ayw2 (73%) και D/ayw3 (27%). Τέλος ο υπότυπος Α/adw υπολογίζεται οτί υπάρχει στο 1% των ασθενών (23). Αρκετοί ερευνητές προσπάθησαν να διερευνήσουν πιθανές κλινικές συσχετίσεις μεταξύ του γονοτύπου του HBV και της φυσικής πορείας της νόσου ή της πιθανότητας ανταπόκρισης στη θεραπεία. Οι περισσότερες μελέτες έδειξαν ότι ο γονότυπος Β συσχετίζεται με αυτόματη ορομετατροπή του HBeAg σε νεότερη ηλικία, ηπιότερη φλεγμονώδη δραστηριότητα στο ήπαρ και μικρότερη πρόοδο της νόσου σε κίρρωση του ήπατος. Οι ασθενείς με γονότυπο Β δεν έχουν πολλές εξάρσεις του ιού και μετά την ορομετατροπή του e 28

29 αντιγόνου παραμένουν σε ύφεση. Η πιθανότητα ηπατοκυτταρικού καρκινώματος (HCC) είναι λιγότερο συχνή στο γονότυπο Β (24). Οι ασθενείς με γονότυπο Α έχουν μεγαλύτερες πιθανότητες για κάθαρση του HBsAg (25). Στη θεραπεία με ιντερφερόνη (IFN) οι ασθενείς με γονότυπο C έχουν περισσότερες πιθανότητες ορομετατροπής του αντιγόνου e σε σχέση με τους ασθενείς με γονότυπο D. Στην οξεία ηπατίτιδα Β έχει βρεθεί ότι οι ασθενείς με γονότυπο D έχουν πιο επιπλεγμένη νόσο και μεγαλύτερες πιθανότητες να οδηγηθούν σε οξεία ηπατική ανεπάρκεια (26). ε) Κύκλος του ιού Ο κύκλος αναπαραγωγής του ιού ξεκινάει με την πρόσδεση του HBV σε υποδοχείς των ηπατοκυττάρων και διαμέσου αυτών το μολυσματικό τμήμα του ιού διεισδύει, με το μηχανισμό της ενδοκυττάρωσης, στο κυτταρόπλασμα των ηπατοκυττάρων. Μετά την πρόσδεση, τη διείσδυση και την είσοδο του ιού στο ηπατοκύτταρο το γονιδίωμα του ιού (το οποίο αποτελείται από μία ατελή θετική έλικα DNA) μεταφέρεται στον πυρήνα του ηπατοκυττάρου. Εκεί γίνεται η διόρθωση της ατελούς θετικής DNA έλικας και το κενό του γονιδιώματος καλύπτεται. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα τη δημιουργία μίας πλήρους δίκλωνης κυκλικής έλικας DNA (covalently closed circular DNA, cccdna). Το cccdna μπορεί με αυτόν τον τρόπο να ενσωματωθεί στο γονιδίωμα του ηπατοκυττάρου. Η έλικα αυτή χρησιμεύει ως πρότυπο για τη μεταγραφή του RNA που κωδικοποιεί τις πρωτεΐνες επιφανείας όπως επίσης και το μεγαλύτερο μέρος του προγενωμικού RNA. Το προγενωμικό RNA λειτουργεί ως πρότυπο για τη μεταγραφή των γονιδίων της πολυμεράσης του ιού και της πυρηνικής 29

30 πρωτεΐνης. Τελικά το προγενωμικό RNA ενσωματώνεται στα πρόωρα πυρηνοκαψίδια μέσα στο ηπατοκύτταρο. Στο εσωτερικό των πρόωρων πυρηνοκαψιδίων, με τη βοήθεια της ανάστροφης τρανσκριπτάσης, δημιουργείται από το προγενωμικό RNA η πρώτη αρνητική μονόκλωνη έλικα DNA. Ακολουθεί η απομάκρυνση του προγενωμικού RNA και η δημιουργία της θετικής έλικας DNA. Η διαδικασία αυτή είναι συνήθως ατελής, με αποτέλεσμα να εκκρίνονται σωματίδια με μερικώς δίκλωνη έλικα DNA. Έπειτα ο ιός απελευθερώνεται από το ηπατοκύτταρο διαμέσου της κυτταρικής του μεμβράνης (27). (Εικόνα 5) Εικόνα 5: Κύκλος αναπαραγωγής του HBV. Πηγή: Τροποποιημένο από Dienstag JL et al. Hepatitis B virus infection. The New England Journal of Medicine (27) 30

31 στ) Μεταλλάξεις του γονιδιώματος του ιού Το γονίδιο του HBV παράγεται από το πρoγενωμικό RNA μέσω της ανάστροφης τρανσκριπτάσης. Η ανάστροφη τρανσκριπτάση δεν έχει τη δυνατότητα ελέγχου του γονιδιώματος με αποτέλεσμα να υπάρχει μεγάλη πιθανότητα δημιουργίας λάθους-μετάλλαξης στο τελικό γονιδίωμα. Οι μεταλλάξεις στις προπυρηνικές περιοχές και στην περιοχή του βασικού πυρηνικού προωθητή (precore and core promoter regions) είναι οι πιο συχνές. Η προπυρηνική πρωτεΐνη είναι υπεύθυνη για τη δημιουργία του αντιγόνου e (21). Η πιο συχνή προπυρηνική μετάλλαξη είναι μία σημειακή μετάλλαξη στο νουκλεοτίδιο 1896 του HBV γονιδιώματος (G1896A) (28). Η μετάλλαξη αυτή οδηγεί σε πρόωρο κωδόνιο τερματισμού. Συνήθως ανευρίσκεται συχνότερα στο γονότυπο D και σε μικρότερο βαθμό στους γονοτύπους B,C και E, ενώ πολύ σπάνια στους γονοτύπους A, F και H. Η πιο συχνή μετάλλαξη του πυρηνικού προωθητή αφορά μία διπλή μετάλλαξη, A1762T και G1764A, η οποία μειώνει την παραγωγή του e αντιγόνου. Η μετάλλαξη αυτή ανευρίσκεται σε όλους του γονότυπους, αλλά πιο συχνά στο γονότυπο C. Υπάρχουν μελέτες που ανέδειξαν αυξημένο κίνδυνο HCC σε ασθενείς που είχαν προσβληθεί από HBV με τη συγκεκριμένη μετάλλαξη (29). 31

32 5. ΑΝΟΣΟΠΑΘΟΓΕΝΕΙΑ ΤΟΥ HBV α) Οξεία λοίμωξη Ο HBV δεν είναι απευθείας κυτταροτοξικός και η σοβαρότητα της ηπατικής νόσου σχετίζεται με την ένταση της ανοσολογικής απάντησης του οργανισμού έναντι του ιού. Ενώ για την κάθαρση του ιού απαιτείται και η κυτταρική αλλά και η χυμική ανοσία, η κυτταρική ανοσία είναι αυτή που διαδραματίζει το σημαντικότερο ρόλο στην παθογένεια της HBV λοίμωξης. Η ανοσολογική απάντηση έναντι του HBV περιλαμβάνει αρχικά μία άμεση, μη ειδική απάντηση από φυσικά κυτταροκτόνα κύτταρα (Natural Killers, NK) και ιντερφερόνη (interferon, IFN) και μία δεύτερη πιο ειδική με αντισώματα έναντι των ιικών αντιγόνων από Human Leukocyte Antigen II (HLA II) Cluster of Differentiation 4 + (CD4+) λεμφοκύτταρα και HLA I CD8+ κυτταροτοξικά λεμφοκύτταρα (Cytotoxic T cell, CTLs). Η έναρξη της αντιγονοειδικής Τ κυτταρικής απάντησης λαμβάνει χώρα στα όργανα του λεμφικού ιστού μέσω μίας διαδικασίας που έχει ως αποτέλεσμα την ωρίμανση και διαφοροποίηση ειδικών Τ κυττάρων έναντι ιικών επιτόπων και τη μετανάστευση αυτών στο ηπατικό παρέγχυμα (30). Κατά τη διάρκεια της οξείας λοίμωξης, τα περισσότερα HBV-DNA μόρια καθαρίζονται από το ήπαρ μέσω των κυτοκινών που παράγονται αρχικά από κύτταρα του μη ειδικού ανοσιακού συστήματος και αργότερα από ειδικά για τον HBV, CD8+ λεμφοκύτταρα. Η κυτταρική ανοσιακή απάντηση, η οποία είναι κυρίως Th1 απάντηση, είναι αρκετή για τον αυτοπεριορισμό της λοίμωξης επειδή η απάντηση είναι έντονη και ειδική (31). Τα CD8+ CTLs είναι αυτά που καθορίζουν την ένταση της νόσου στο ήπαρ, διότι το αποτέλεσμά τους είναι η απόπτωση των μολυσμένων 32

33 ηπατοκυττάρων. Για να αναγνωρίσουν τα ηπατοκύτταρα θα πρέπει αυτά να εκφράζουν ιικούς επιτόπους στην επιφάνειά τους. Η αναγνώριση από τα περιοριστικά Major Histocompatibility Complex-II (MHC-II) CD4+ Thλεμφοκύτταρα απαιτεί επίσης κατάλληλη παρουσίαση των ιικών πεπτιδίων στα MHC-II μόρια. Τα CD4+ κύτταρα παράγουν κυτοκίνες που επάγουν την ωρίμανση των Β-λευκοκυττάρων σε κύτταρα που παράγουν αντισώματα (31). β) Χρόνια λοίμωξη Στη χρόνια ηπατίτιδα Β επικρατεί μία αδύναμη, HBV ειδική, Τ κυτταρική ανοσολογική απάντηση περιορισμένου εύρους. Στη ΧΗΒ η πλειοψηφία των μονοκυττάρων που ανευρίσκονται στις φλεγμονώδεις διηθήσεις στο ήπαρ είναι μη αντιγονοειδικά (31). Η πορεία της ΧΗΒ είναι αρκετά περίπλοκη. Τρεις φάσεις έχουν αναγνωριστεί (32): (Εικόνα 6) Η φάση της ανοσολογικής ανοχής, όπου υπάρχουν υψηλοί τίτλοι HBV- DNA και φυσιολογικά επίπεδα της τρανσαμινάσης της αλανίνης (Alanine Aminotransferase, ALT). Η φάση αυτή συσχετίζεται με ελάχιστη ηπατική νόσο. Η φάση της ανοσολογικής κάθαρσης, όπου επικρατούν αυξημένες τιμές HBV-DNA>2000 IU/ml και αυξημένη ALT καθώς και έντονη φλεγμονώδης δραστηριότητα στο ηπατικό παρέγχυμα. Η φάση του ανενεργού φορέα με επίπεδα HBV-DNA < 2000 IU/ml και φυσιολογική τιμή της ALT. Στη φάση αυτή η φλεγμονώδης δραστηριότητα στο ηπατικό παρέγχυμα είναι ελάχιστη. 33

34 Εικόνα 6: Φυσική πορεία της ΧΗΒ Πηγή: Τροποποιημένo από McMahon BJ et al. The natural history of chronic hepatitis B virus infection. Hepatology, 2009 (32). Φάση ανοσολογικής ανοχής Ασθενείς που μολύνθηκαν κατά την περιγεννητική περίοδο ή την πρώτη παιδική ηλικία εμφανίζουν αρχικά τη φάση ανοχής έναντι του ιού. Παρά την παρουσία στον ορό υψηλών επιπέδων HBV-DNA, στο ηπατικό παρέγχυμα παρατηρείται ελάχιστη φλεγμονώδης δραστηριότητα. Αυτό είναι αποτέλεσμα της ανοσολογικής ανοχής που υπάρχει έναντι του αντιγόνου e και προέρχεται από τα Th2 κύτταρα. Η φάση αυτή μπορεί να διαρκέσει από λίγα έτη έως περισσότερο από 30 χρόνια (33). 34

35 Φάση ανοσολογικής κάθαρσης Η αρχική φάση περιλαμβάνει τη μετάπτωση από την Th2 επαγόμενη ανοσοανοχή σε κατάσταση ενεργοποίησης των Th1 κυττάρων, τα οποία με τη σειρά τους αναγνωρίζουν επιτόπους του ιού στα ηπατοκύτταρα. Με τον μηχανισμό αυτό προκαλείται η ανοσιακού τύπου ηπατοκυτταρική βλάβη/φλεγμονή. Τα κύρια μόρια που εκκρίνονται σε αυτή τη φάση είναι η ιντερλευκίνη 2 (Interleukin-2, IL-2), IFN και ο tumour necrosis factor (TNF). Η ειδική κυτταρική απάντηση των Τ κυττάρων έναντι του αντιγόνου c, χαρακτηρίζεται από επαγωγή των CTL κυττάρων, ηπατοκυτταρική βλάβη και αναστολή του πολλαπλασιασμού του ιού. (34) Τα μεταλλαγμένα στελέχη του ιού αρχίζουν να αυξάνονται κατά τη διάρκεια της έξαρσης της ανοσολογικής απάντησης, διότι έχουν καλύτερη ικανότητα να αποφεύγουν την ανοσολογική κάθαρση. Αυτό υποδηλώνει ότι οι πρωτεΐνες του πυρηνοκαψιδίου είναι ο κύριος στόχος της ανοσολογικής απάντησης κατά τη διάρκεια της χρόνιας λοίμωξης. (32) Φάση ανενεργού φορέα Σημαντικό γεγονός στην πορεία της νόσου αποτελεί η ορομετατροπή του HBeAg. Αυτό ακολουθείται από σημαντική μείωση της αναπαραγωγής του ιού και ιστολογική ύφεση της φλεγμονώδους δραστηριότητας. Μετά την ορομετατροπή, οι περισσότεροι ασθενείς παραμένουν αρνητικοί για το HBeAg και θετικοί για το αντίσωμα anti-hbe. Τα επίπεδα της ALT σε αυτή τη φάση είναι φυσιολογικά, ενώ οι τίτλοι του ιού HBV-DNA < 2000 IU/ml (32). Σε αυτή τη φάση σε ορισμένους ασθενείς μπορεί να παρατηρηθεί κάθαρση του HBsAg. Στις Δυτικές χώρες όπου η ηπατίτιδα Β μεταδίδεται κυρίως κατά την ενήλικη ζωή, η 35

36 ετήσια κάθαρση του HBsAg κυμαίνεται περίπου στο 1-2%. Στις χώρες όπου ενδημεί ο ιός και η μετάδοση είναι κυρίως περιγεννητική, το ποσοστό ετήσιας κάθαρσης είναι περίπου 0,05-0,8% (35, 36). Φάση επανεργοποίησης του ιού Θεωρείται ότι η ορομετατροπή του e αντιγόνου συνοδεύεται από διακοπή του πολλαπλασιασμού του ιού και ύφεση της ηπατικής νόσου. Όμως οι ασθενείς με αρνητικό HBeAg έχουν αναγνωρισθεί ως σημαντική μορφή της ΧΗΒ. Αυτό οφείλεται κυρίως στις μεταλλάξεις του γονιδιώματος του ιού. Η μείωση του κυκλοφορούντος e αντιγόνου μειώνει την ειδική Th2 κυτταρική δραστηριότητα και έχει ως αποτέλεσμα την επικράτηση των Th1 κυττάρων. Η παρουσία των μεταλλαγμένων αυτών στελεχών του ιού, ιδίως με υψηλό ιικό φορτίο, σχετίζεται με υποτροπή της ηπατικής νόσου και χειρότερη πρόγνωση (37). Σε ορισμένους ασθενείς είναι δυνατό να παρατηρηθεί αυτόματη μετατροπή HBeAg+ στην HBeAg- ΧΗΒ (32). Οι ασθενείς με HBeAg- ΧΗΒ είναι συνήθως μεγαλύτεροι σε ηλικία, εμφανίζουν χαμηλότερα επίπεδα ALT και HBV-DNA σε σχέση με του e+ και σοβαρότερες ιστολογικές αλλοιώσεις. Μετάπτωση σε κίρρωση ανά έτος παρατηρείται σε ποσοστό 2-6% στους e+ ασθενείς, ενώ στους e- ασθενείς είναι 8-10%. (32, 34, 37) Λανθάνουσα HBV λοίμωξη (Occult HBV infection) Ορίζεται ως η παρουσία HBV-DNA στον ορό, ενώ οι ορολογικοί δείκτες του HBV είναι αρνητικοί. Ωστόσο δεν θεωρείται φάση της ΧΗΒ. Πιθανώς αποτελεί μακροχρόνια εξέλιξη μετά την αποδρομή της οξείας ηπατίτιδας Β. 36

37 Οι συνέπειες της λανθάνουσας λοίμωξης δεν έχουν πλήρως αναγνωριστεί. Υπάρχουν ενδείξεις ότι μπορεί να αποτελεί πηγή μόλυνσης σε μεταγγίσεις παραγόντων αίματος ή στη μεταμόσχευση οργάνων. Στη βιβλιογραφία υπάρχουν αρκετές πλέον αναφορές επαναδραστηριοποίησης του ιού μετά από ανοσοκαταστολή ως αποτέλεσμα χορηγήσεως χημειοθεραπείας, ή ανοσοκατασταλτικών φαρμάκων, ή HIV λοίμωξης ή μετά από εκδήλωση αιματολογικών κακοήθειων (34). 6. ΦΥΣΙΚΗ ΠΟΡΕΙΑ ΛΟΙΜΩΞΗΣ Οι ασθενείς με ΧΗΒ έχουν αυξημένο κίνδυνο ανάπτυξης κίρρωσης του ήπατος, ηπατικής ανεπάρκειας και ηπατοκυτταρικού καρκίνου. Το 53% του HCC παγκοσμίως οφείλεται στην HBV λοίμωξη. Ο κίνδυνος για HCC είναι αυξημένος ακόμη και στους ασθενείς που έχουν κάθαρση του επιφανειακού αντιγόνου ή ακόμη και σε αυτούς με λανθάνουσα ηπατίτιδα Β (34). Οι παράγοντες προόδου της ηπατικής νόσου ή της ανάπτυξης του HCC είναι οι ακόλουθοι (32): 1. Δημογραφικοί α) Ανδρικό φύλο β) Ηλικία 2. Κοινωνικοί και περιβαλλοντικοί α) Χρήση αλκοόλης β) Μη αλκοολική λιπώδης νόσος του ήπατος (Non Alcoholic Fatty Liver Disease, NAFLD) γ) Έκθεση στην αφλατοξίνη 37

38 3. Ιολογικοί α) Γονότυπος HBV β) Επίπεδα HBV-DNA γ) Συλλοίμωξη με HIV, HCV και HDV Τα τελευταία χρόνια αρκετές μελέτες ανέδειξαν τη σχέση μεταξύ των επιπέδων του HBV-DNA και της ανάπτυξης HCC και κίρρωσης (38-40). Επίπεδα του ιού άνω των 10 4 ή 10 5 IU/ml συσχετίζονται με υψηλότερο κίνδυνο. Σημαντικός ακόμη παράγοντας είναι η ηλικία. Σε διάφορες μελέτες έχει βρεθεί ότι η μέση ηλικίας ανάπτυξης κίρρωσης του ήπατος σε ασθενείς με υψηλό ιικό φορτίο είναι πάνω από τα 40 έτη (33). 7. ΟΞΕΙΑ ΗΠΑΤΙΤΙΔΑ Β Ο χρόνος επώασης της οξείας λοίμωξης κυμαίνεται από μερικές εβδομάδες έως 6 μήνες. Μόνο το 30% των ασθενών αναπτύσσουν ίκτερο (41). Η νόσος συνήθως είναι πιο σοβαρή σε ασθενείς που έχουν κάποια άλλη υποκείμενη ηπατίτιδα ή ηπατική νόσο. Κλινική Εικόνα Η νόσος ξεκινάει με γενικά συμπτώματα στο 10-20% ασθενών (πυρετός, αρθραλγία/αρθρίτιδα, δερματικά εξανθήματα). Τα συμπτώματα αυτά οφείλονται στα κυκλοφορόντα συμπλέγματα HBsAg/antiHBs που ενεργοποιούν το συμπλήρωμα και εναποτίθενται στις ενθέσεις των αρθρώσεων καθώς και στο τοίχωμα των υποδόριων αγγείων (42). Τα 38

39 συμπτώματα αυτά εμφανίζονται πριν από τις ενδείξεις ηπατοκυτταρικής νόσου ή την αύξηση των αμινοτρανσφερασών. Ο ίκτερος ακολουθεί, συνήθως μετά την αύξηση των ηπατικών ενζύμων. Τα συμπτώματα εξαφανίζονται μετά από 1-3 μήνες. Ορισμένοι ασθενείς έχουν παρατεταμένο αίσθημα κοπώσεως ακόμη και μετά τη κάθοδο της ALT στα φυσιολογικά επίπεδα. Κλινικώς μπορεί να διαπιστωθεί ηπατοσπληνομεγαλία. Γενικά τα επίπεδα της ALT και του HBsAg μειώνονται και αρνητικοποιούνται σχεδόν ταυτόχρονα και στο 80% των ασθενών το HBsAg έχει αρνητικοποιηθεί 12 εβδομάδες μετά την έναρξη της νόσου. Σε 5-10% των ασθενών το HBsAg αρνητικοποιείται πολύ πρόωρα, με αποτέλεσμα να μην ανευρίσκεται κατά την αρχική προσέλευση του ασθενούς (32). Η παρουσία του αντιγόνου επιφανείας μετά από 6 μήνες υποδηλώνει τη μετάβαση στο στάδιο του φορέα, με πολύ μικρή πιθανότητα αρνητικοποίησής του τους επόμενους 6-12 μήνες. Κεραυνοβόλος ηπατίτιδα εμφανίζεται σε λιγότερο από το 1% των ασθενών. Η νόσος εξελίσσεται γρήγορα μέσα σε 4-8 εβδομάδες από την έναρξη των συμπτωμάτων και μπορεί να οδηγήσει στην ανάπτυξη ηπατικής εγκεφαλοπάθειας, πολυοργανικής ανεπάρκειας και νεφρικής δυσλειτουργίας. Η θνητότητα, χωρίς μεταμόσχευση του ήπατος είναι ιδιαιτέρως υψηλή (>80%) (43). Διάγνωση Το HBsAg εμφανίζεται στον ορό 2-10 εβδομάδες μετά την έκθεση στον ιό. Σε αυτοπεριοριζόμενη νόσο είναι συνήθως μη ανιχνεύσιμο έπειτα από

40 μήνες. Η παρουσία μετά τους 6 μήνες υποδηλώνει τη μετάβαση στη χρόνια μορφή της νόσου. Η εξαφάνιση του HBsAg ακολουθείται μετά από κάποιες εβδομάδες από την εμφάνιση του αντίστοιχου αντισώματος antihbs. Στους περισσότερους ασθενείς το αντίσωμα παραμένει εφόρου ζωής παρέχοντας μακροχρόνια ανοσία έναντι του ιού. Ανάμεσα στην αρνητικοποίηση του αντιγόνου και την εμφάνιση του αντισώματος παρεμβάλλεται περίοδος ολίγων εβδομάδων, κατά την οποία και τα δύο είναι αρνητικά (περίοδος του παραθύρου window period). Κατά την περίοδο αυτή η νόσος διαγιγνώσκεται από την παρουσία IgM αντισωμάτων έναντι του πυρηνικού αντιγόνου c. Τα IgM anti-hbc αντισώματα παραμένουν θετικά για 4-6 μήνες και έπειτα μετατρέπονται σε IgG anti-hbc αντισώματα. (44) Τα επίπεδα των αμινοτρανσφερασών κυμαίνονταi μεταξύ IU/ml, με επικράτηση της ALT έναντι της AST. Ασθενείς με ικτερική ηπατίτιδα αυξάνουν τη χολερυθρίνη αμέσως μετά την αύξηση των τρανσαμινασών. Το ύψος της ALT δεν συσχετίζεται με την πρόγνωση, για την οποία σημαντικότερο ρόλο ασκεί η παράταση του χρόνου προθρομβίνης. Περισσότεροι από το 90-95% των ασθενών εμφανίζουν αυτόματη βελτίωση χωρίς θεραπεία. Ασθενείς με κεραυνοβόλο ή σοβαρή ηπατίτιδα θα πρέπει να προετοιμαστούν για πιθανή μεταμόσχευση ήπατος. Αυτοί οι ασθενείς ίσως επωφεληθούν από τη χορήγηση νουκλεοτ(σ)ιδικού αναλόγου (ΝΑ). Ως φάρμακα πρώτης επιλογής θεωρούνται η εντεκαβίρη και η τενοφοβίρη. Η διάρκεια τη θεραπείας δεν έχει καθοριστεί, αλλά θα πρέπει να παραταθεί τουλάχιστον επί 3 μήνες μετά την ορομετατροπή του επιφανειακού 40

41 αντιγόνου ή επί 12 μήνες μετά την ορομετατροπή του e αντιγόνου χωρίς απώλεια του HBsAg (45). 8. ΧΡΟΝΙΑ ΗΠΑΤΙΤΙΔΑ Β α) Κλινική Εικόνα Το ιστορικό οξείας νόσου (οξείας ηπατίτιδας) συνήθως δεν υπάρχει στους ασθενείς με ΧΗΒ. Όταν υπάρχουν συμπτώματα, αυτά μπορεί να είναι μη ειδικά όπως π.χ. κόπωση, μειωμένη όρεξη και κακουχία. Πιθανώς μπορεί να υπάρχει πόνος στο δεξιό υποχόνδριο, αλλά συνήθως είναι χαμηλής έντασης. Οι περισσότεροι ασθενείς είναι ασυμπτωματικοί, ακόμη και κατά τη διάρκεια έξαρσης του ιού. Οι πρώτες εκδηλώσεις της νόσου μπορεί να είναι τα συμπτώματα κίρρωσης ή ηπατικής ανεπάρκειας. Οι βιοχημικοί δείκτες μπορεί να είναι τελείως φυσιολογικοί κατά τη διάρκεια της ανενεργού φάσεως της νόσου. Στη φάση της ανοσολογικής κάθαρσης οι περισσότεροι ασθενείς εμφανίζουν ήπια-μέτρια αύξηση των αμινοτρανσφερασών. Κατά τη διάρκεια εξάρσεων του ιού τα επίπεδα της ALT μπορεί να είναι μέχρι και πάνω από 1000 IU/l και η κλινική εικόνα και οι βιοχημικές και ορολογικές εξετάσεις ενίοτε είναι αδύνατο να καθορίσουν κατά πόσο πρόκειται για παρόξυνση χρονίας ή για οξεία νόσο (συμπεριλαμβανομένου ακόμα και θετικού IgM antihbc). 41

42 β) Εξωηπατικές εκδηλώσεις Εξωηπατικές εκδηλώσεις παρατηρούνται τόσο κατά την οξεία όσο και τη χρόνια μορφή της νόσου. Η αντιική θεραπεία πιθανώς να είναι αποτελεσματική σε παρατεταμένες εξωηπατικές εκδηλώσεις. Οι πιο συχνές εξωηπατικές εκδηλώσεις περιγράφονται στον πίνακα 1. (46) ΕΞΩΗΠΑΤΙΚΕΣ ΕΚΔΗΛΩΣΕΙΣ ΟΞΕΙΑΣ HBV ΛΟΙΜΩΞΗΣ Σύνδρομο ορονοσίας Δερματικές Βλατιδώδες εξάνθημα, κνίδωση, πορφυρικό εκδηλώσεις εξάνθημα Βλατιδώδης ακροδερματίτιδα της παιδικής ηλικίας Εκδηλώσεις από τις αρθρώσεις (σύνδρομο Gianotti-Crosti) Πολυαρθραλγία,πολυαρθρίτιδα, τενοντοθυλακίτιδα ΕΞΩΗΠΑΤΙΚΕΣ ΕΚΔΗΛΩΣΕΙΣ ΧΡΟΝΙΑΣ HBV ΛΟΙΜΩΞΗΣ Νεφρικές εκδηλώσεις Μεμβρανώδης & μεμβρανοϋπερπλαστική σπειραματονεφρίτιδα Οζώδης πολυαρτηρίτιδα Δερματικές εκδηλώσεις Πορφυρικό εξάνθημα, κνίδωση, βλατιδώδες εξάνθημα Σπάνιες* Νευρολογικές Σύνδρομο Guillain-Barre, περιφερική μονονευροπάθεια, πολλαπλή μονονευρίτιδα Μυοπάθειες Πολυμυοσίτιδα, δερματομυοσίτιδα, μυοκαρδίτιδα Δερματικές Ομαλός λειχήνας, γαγγραινώδες πυόδερμα, οζώδες ερύθημα, σύνδρομο όμοιο με δερματομυοσίτιδα, δερματική πορφυρία Ρευματολογικές Ρευματοειδής αρθρίτιδα, ρευματική πολυμυαλγία, συστηματικός ερυθηματώδης λύκος, ιδιοπαθής μεικτή κρυοσφαιριναιμία (τύπος ΙΙ, ΙΙΙ) Αιματολογικές Απλαστική αναιμία Πίνακας 1: Εξωηπατικές εκδηλώσεις ηπατίτιδας Β *Οι σπάνιες εξωηπατικές εκδηλώσεις της HBV λοίμωξης βασίζονται σε περιορισμένες αναφορές περιστατικών στη βιβλιογραφία 42

43 γ) Διάγνωση Ορολογικοί δείκτες Το HBV-DNA στην ενεργό νόσο είναι θετικό. Το HBsAg είναι επίσης θετικό. Το anti-hbs ανευρίσκεται θετικό σε ποσοστό 10-25%, ταυτόχρονα με το HBsAg σε ασθενείς με ΧΗΒ. Ο μηχανισμός που ευθύνεται για την παράδοξη αυτή ορολογική εικόνα είναι ότι δημιουργούνται αντισώματα έναντι μικρότερων σωματιδίων του ιού. Το IgG αντίσωμα έναντι του πυρηνικού αντιγόνου (IgGanti-HBc) είναι θετικό στη χρόνια νόσο, ενώ στις εξάρσεις του ιού μπορεί να ανευρεθεί ακόμη και το IgM αντίσωμα (IgM-anti-HBc). Η παρουσία του HBeAg και του αντισώματός του antihbe, εξαρτάται από τη φάση της ιογένους λοιμώξεως ή από παρουσία πιθανών προπυρηνικών μεταλλάξεων. Η παρουσία του e αντιγόνου υποδηλώνει μεγαλύτερη μολυσματικότητα και υψηλά επίπεδα ιικού αναδιπλασιασμού. (34) (Πίνακα 2) 43

44 Φάση ALT HBsAg HBeAg antihb e HBV DNA (IU/ml) Ανοσολογικής ανοχής Συνήθως φυσιολογική >>2000 Ανοσολογικής Αυξημένη >>2000 κάθαρσης Ανενεργού φορέα Συνήθως φυσιολογική, >2000 μπορεί να HBeAg αρνητικής ΧΗΒ εμφανίζει εξάρσεις Περιοδικές εξάρσεις >2000 <2000 Λανθάνουσας Φυσιολογική <2000 λοίμωξης Πίνακας 2: Ορολογικοί δείκτες στη ΧΗΒ(32) Ιστολογική εικόνα Η ιστολογική εικόνα της ΧΗΒ χαρακτηρίζεται από αλλοιώσεις στα πυλαία διαστήματα και τα λόβια. Συγκεκριμένα, παρατηρείται φλεγμονώδης διήθηση των πυλαίων διαστημάτων που αποτελείται κυρίως από λεμφοκύτταρα και πλασματοκύτταρα, η οποία σε αρκετές περιπτώσεις καταστρέφει με τη μορφή διαβρωτικής νέκρωσης την αφοριστική πλάκα (νεώτερος όρος: interface hepatitis). Στα λόβια παρατηρούνται μικρές εστίες νεκροφλεγμονώδους 44

45 δραστηριότητας και αποπτωτικά σωμάτια. Σε περιπτώσεις έντονης ηπατίτιδας παρατηρείται συρρέουσα και γεφυροποιός νέκρωση (47). Χαρακτηριστικό γνώρισμα της λοίμωξης από τον HBV αποτελεί η παρουσία ηπατοκυττάρων με τη μορφή της θολής υάλου (ground-glass hepatocytes), το φαινόμενο αυτό οφείλεται σε συσσώρευση HBsAg στο ενδοπλασματικό δίκτυο. Ηπατοκύτταρα θολής υάλου μπορεί να ανευρεθούν και σε ανενεργούς φορείς της νόσου αλλά βρίσκονται σε ποσοστό <5% του συνόλου των ηπατοκυττάρων. Όταν παρατηρούνται σε μεγαλύτερο ποσοστό, υποδηλώνεται ενεργός πολλαπλασιασμός του ιού (47, 48). Άλλο χαρακτηριστικό γνώρισμα που παρατηρείται στα ηπατοκύτταρα με ενεργό πολλαπλασιασμό του ιού είναι τα ηπατοκύτταρα με αμμώδεις πυρήνες (sanded nuclei), οι οποίοι οφείλονται στη συγκέντρωση HBcAg. Σημειωτέο ότι αυτά τα δύο αντιγόνα μπορούν να ανιχνευθούν σε ιστολογικές τομές με τη μέθοδο της ανοσοϊστοχημείας. Μετά από επιτυχημένη θεραπεία το HBcAg συνήθως εξαφανίζεται. Η παραμονή του HBcAg στο ηπατικό παρέγχυμα υποδηλώνει τη παρουσία ενσωματωμένου cccdna στον πυρήνα των ηπατοκυττάρων (48). Με την πάροδο του χρόνου η νεκροφλεγμονώδης δραστηριότητα οδηγεί στην ανάπτυξη ίνωσης, η οποία αντιπροσωπεύει την ουλοποίηση του παρεγχύματος και οφείλεται στην ενεργοποίηση των ηπατικών αστεροειδών κυττάρων (τα οποία μετατρέπονται σε μυοϊνοβλάστες) και των ινοβλαστών των πυλαίων διαστημάτων (βλ. κεφάλαιο ηπατικής ίνωσης). Η ίνωση μπορεί να οδηγήσει σε σχηματισμό ινωδών διαφραγματίων που εκτείνονται από πυλαία διατήματα προς άλλα πυλαία διαστήματα ή ενδολόβιες θέσεις και διαταράσσουν την παρεγχυματική αρχιτεκτονική. Συνεπώς η απώλεια 45

46 ηπατοκυττάρων, η ίνωση και η αναγεννητική δραστηριότητα μπορούν τελικά να οδηγήσουν στην κίρρωση. δ) Θεραπεία Η ανάπτυξη του παρόντος εδαφίου γίνεται σύμφωνα με τις τελευταίες κατευθυντήριες οδηγίες του European Association for the Study of the Liver (EASL), όπως δημοσιεύτηκαν το 2012 στο περιοδικό Journal of Hepatology (49) καθώς και με τις Ελληνικές Κατευθυντήριες Οδηγίες Θεραπευτικής Παρέμβασης σε ασθενείς με λοίμωξη από τον ιό της ηπατίτιδας Β, όπως δημοσιεύθηκαν τον Δεκέμβριο του 2012 από το Κέντρο Ελέγχου & Πρόληψης Νοσημάτων (ΚΕΕΛΠΝΟ) (50). Σημαντικό προληπτικό μέτρο είναι ο έλεγχος των πρώτου βαθμού συγγενών καθώς και των σεξουαλικών συντρόφων του ασθενούς, για την παρουσία των ιολογικών δεικτών του ιού (HBsAg, anti-hbs, anti-hbc). Εάν βρεθούν αρνητικοί, θα πρέπει να εμβολιαστούν έναντι του HBV. 1. Εκτίμηση της κατάστασης του ήπατος Το πρώτο βήμα πριν από την έναρξη θεραπείας είναι η εκτίμηση της σοβαρότητας της ηπατικής νόσου. Θα πρέπει να ελεγχθούν οι βιοχημικοί δείκτες, συμπεριλαμβανομένων των αμινοτρανσφερασών (ALT & AST), γgt, αλκαλική φωσφατάσης, χολερυθρίνης, αλβουμίνης, χρόνου προθρομβίνης καθώς και της γενικής αίματος. Απαραίτητη είναι και η διενέργεια υπερηχογραφήματος του ήπατος και του σπληνός. Συνήθως η ALT είναι μεγαλύτερη από την AST, ωστόσο εάν η νόσος προχωρήσει σε κίρρωση του ήπατος, μπορεί να ανευρεθεί και ανεστραμμένος λόγος των AST/ALT, χαμηλά 46

47 λευκώματα, παράταση του χρόνου προθρομβίνης και χαμηλός αριθμός αιμοπεταλίων. Επιπλέον θα πρέπει να προσδιορισθούν στον ορό τα επίπεδα του κυκλοφορούντους HBV με τη μέθοδο αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR). Η ποσότητα του HBV-DNA εκφράζεται τα τελευταία χρόνια σε IU/ml. Ακόμη θα πρέπει να αποκλειστούν άλλες συνυπάρχουσες λοιμώξεις ή επιλοιμώξεις (HDV, HCV, HIV). Εάν ο ασθενείς δεν έχει αντισώματα για τον ιό της ηπατίτιδας Α, τότε θα πρέπει να εμβολιαστεί. Η βιοψία ήπατος είναι χρήσιμη για να καθοριστεί ο βαθμός της νεκροφλεγμονώδους δραστηριότητας καθώς και της ίνωσης στο ηπατικό παρέγχυμα. Η βιοψία επιπλέον είναι χρήσιμη για τη διάγνωση τυχόν συνυπάρχουσων ηπατικών παθήσεων, όπως στεατώσεως - στεατοηπατίτιδας, αλκοολικής νόσου ή μεταβολικών νοσημάτων του ήπατος καθώς και αυτοανόσων νοσημάτων του ήπατος. 2. Ενδείξεις θεραπείας Οι ενδείξεις για έναρξη της αντιικής θεραπείας δεν διαφέρουν κατ ουσίαν μεταξύ των HBeAg θετικών και των HBeAg αρνητικών ασθενών. Τα κύρια κριτήρια είναι τρία: τα επίπεδα του HBV-DNA, τα επίπεδα της ALT καθώς και η βαρύτητα της ηπατικής νόσου (ιστολογική εικόνα). Ασθενείς υποψήφιοι για αντιική θεραπεία είναι αυτοί που εμφανίζουν επίπεδα του HBV-DNA μεγαλύτερα από 2000 IU/ml, της ALT υψηλότερα από τα ανώτερα φυσιολογικά όρια και παρουσιάζουν μέτρια σοβαρή νεκροφλεγμονώδη δραστηριότητα ή/και τουλάχιστον μετρίου βαθμού ίνωση στη βιοψία ήπατος. Στις ενδείξεις για θεραπεία πρέπει να λαμβάνεται υπόψιν η 47

48 ηλικία του ασθενούς, οι συνυπάρχουσες νόσοι, το οικογενειακό ιστορικό HCC ή κίρρωσης του ήπατος καθώς και οι εξωηπατικές εκδηλώσεις. Ασθενείς στη φάση ανοσολογικής ανοχής με φυσιολογική ALT και χωρίς σημεία ηπατικής νόσου ή οικογενειακό ιστορικό HCC, δεν χρειάζεται να υποβληθούν σε βιοψία ήπατος εάν είναι νεότεροι των 30 ετών. Υπάρχει ωστόσο ένδειξη για τακτική παρακολούθηση κάθε 3-6 μήνες. HBeAg αρνητικοί ασθενείς με φυσιολογική ALT και επίπεδα HBV-DNA μεταξύ IU/ml, χωρίς σημεία ηπατικής νόσου δεν χρειάζονται άμεσα βιοψία ήπατος, αλλά παρακολούθηση της ALT κάθε 3 μήνες και του ιικού φορτίου κάθε 6-12 μήνες για τουλάχιστον 3 έτη. Πιθανώς οι μη επεμβατικές μέθοδοι εκτίμησης της ίνωσης του ήπατος να είναι χρήσιμοι στην ομάδα αυτή των ασθενών. Ασθενείς με υψηλό ιικό φορτίο και τιμή ALT δύο φορές πάνω από το ανώτερο φυσιολογικό όριο, μπορούν να ξεκινήσουν θεραπεία χωρίς να είναι απαραίτητη η ηπατική βιοψία, καθώς επίσης και όλοι οι ασθενείς με αντιρροπούμενη κίρρωση του ήπατος και ενεργό ιαιμία, ακόμη και αν η τιμή της ALT είναι εντός των φυσιολογικών ορίων. Σε μη αντιρροπούμενη κίρρωση και ανιχνεύσιμη ιαιμία, η αντιική θεραπεία πρέπει να ξεκινήσει άμεσα διότι ο έλεγχος του ιικού πολλαπλασιασμού μπορεί να βελτιώσει την κλινική εικόνα. Ωστόσο αυτή η ομάδα ασθενών θα πρέπει να αξιολογείται ίσως εξαρχής για πιθανή μεταμόσχευση του ήπατος. 3. Θεραπευτικοί στόχοι Στόχοι της θεραπείας είναι η επίτευξη καταστολής του ιικού αναδιπλασιασμού και η ύφεση της ηπατοκυτταρικής νόσου, δηλαδή η πρόληψη 48

49 κίρρωσης του ήπατος, ηπατικής ανεπάρκειας καθώς και ηπατοκυτταρικού καρκίνου. Δυστυχώς η ΧΗΒ είναι δύσκολο να ιαθεί εντελώς, λόγω της ενσωματώσεως γονιδιακού υλικού του ιού (cccdna) στον πυρήνα και στο γονιδίωμα του ηπατοκυττάρου. Αυτό πιθανώς εξηγεί και τις αυτόματες ή προκλητές αναζωπυρώσεις του ιού. Επιπλέον το γονιδίωμα του HBV αλληλοεπιδρά με το γονιδίωμα του ηπατοκυττάρου και πιθανώς ευνοεί την ογκογένεση, ακόμα και όταν ο ιικός αναδιπλασιασμός είναι χαμηλός (51). 4. Σημεία ολοκληρώσεως της θεραπείας Η θεραπεία θα πρέπει να οδηγήσει σε ιολογική, βιοχημική και ιστολογική ύφεση. Ιδανικός στόχος θα ήταν η κάθαρση του HBsAg. Πιο ρεαλιστικός στόχος ωστόσο είναι η επαγωγή και διατήρηση της ιολογικής ύφεσης. Στους HBeAg θετικούς καθώς και στους HBeAg αρνητικούς ασθενείς, ιδανικός στόχος είναι η μείωση των επιπέδων του HBsAg ή ακόμη και η ορομετατροπή σε anti-hbs, που υποδηλώνει πλήρη και οριστική ύφεση της νόσου. Δεύτερος στόχος στους HBeAg αρνητικούς ασθενείς είναι η επίτευξη ιολογικής και βιοχημικής ύφεσης. Στους HBeAg θετικούς ασθενείς, στόχος πρέπει να είναι η ορομετατροπή του e αντιγόνου ή η ιολογική ύφεση. 5. Ορισμοί ανταπόκρισης Η ανταπόκριση διακρίνεται σε βιοχημική, ορολογική, ιολογική και ιστολογική. Όλες αυτές οι συνιστώσες θα πρέπει να επανεκτιμώνται ανά τακτά χρονικά διαστήματα κατά τη διάρκεια της θεραπείας. 49

50 Βιοχημική ανταπόκριση: Ορίζεται ως η κάθοδος της ALT εντός των φυσιολογικών επιπέδων. Επειδή η χρόνια HBV λοίμωξη συχνά εμφανίζει εξάρσεις, θα πρέπει να επιβεβαιωθεί με επανεξέταση ανά 3 μήνες για ένα χρόνο. Εάν σε αυτό το χρόνο ανευρεθεί μία παθολογική τιμή της ALT, τότε τα επίπεδα της θα πρέπει να επανεκτιμώνται για επιπλέον δύο έτη. Ορολογική ανταπόκριση: Ορίζεται ως η απώλεια του επιφανειακού αντιγόνου καθώς και η ανάπτυξη του αντίστοιχου αντισώματος, ενώ για το e αντιγόνο ορίζεται ως η αρνητικοποίησή του ταυτόχρονα με την ανάπτυξη anti-hbe. Ιολογική ανταπόκριση: Σε ασθενείς που χρησιμοποιούν ιντερφερόνη ως θεραπεία, στόχος είναι η μείωση του HBV-DNA σε τιμή μικρότερη από 2000 IU/ml. Συνήθως αξιολογείται κάθε 6 μήνες έως την ολοκλήρωση της θεραπείας και ακολούθως 6 και 12 μήνες μετά το πέρας αυτής. Ως παρατεταμένη ιολογική ανταπόκριση ορίζεται η παρουσία HBV-DNA < 2000 IU/ml στους 12 μήνες μετά το πέρας της θεραπείας. Σε ασθενείς που χρησιμοποιούν νουκλεοσ(τ)ιδικά ανάλογα (ΝΑ), πρωταρχικός στόχος είναι η μείωση του HBV-DNA κατά μία λογαριθμική κλίμακα μέσα στο πρώτο τρίμηνο της θεραπείας. Ως ιολογική ανταπόκριση ορίζεται η πτώση του ιικού φορτίου κάτω από τα όρια ανιχνευσιμότητας και αξιολογείται περιοδικά κατά τη διάρκεια της θεραπείας. Ως ιολογική διαφυγή ορίζεται η αύξηση των επιπέδων του HBV-DNA κατά τουλάχιστον 1 λογάριθμο κατά τη διάρκεια της θεραπείας και συνήθως συνυπάρχει με βιοχημική έξαρση (αύξηση της ALT). Οι κύριες αιτίες για ιολογική διαφυγή είναι η μη συμμόρφωση στη θεραπεία ή η ανάπτυξη αντοχής στο ΝΑ. 50

51 Αντίσταση σε ένα ΝΑ προκαλείται από επιλογή υποτύπων του ιού, οι οποίοι έχουν μειωμένη ευαισθησία στο χορηγούμενο ΝΑ. Η αντίσταση μπορεί να οδηγήσει σε πρωτοπαθή μη ανταπόκριση στο ΝΑ ή σε ιολογική έξαρση. Η διακοπή χορήγησης των ΝΑ δεν είναι συνήθης πρακτική. Εάν η αντιική θεραπεία με ΝΑ διακοπεί, θα πρέπει να ελέγχονται τα επίπεδα του ιικού φορτίου τουλάχιστον για 12 μήνες μετά την ολοκλήρωση της θεραπείας. Ιστολογική ανταπόκριση: Ορίζεται ως η μείωση της νεκροφλεγμονώδους δραστηριότητας κατά τουλάχιστον 2 μονάδες στο HAI (Histology Activity Index) σύστημα, χωρίς επιδείνωση του σταδίου της νόσου (ίνωσης), σε σύγκριση με το στάδιο πριν από την έναρξη της θεραπείας. Πλήρης ύφεση: Ορίζεται ως η παρατεταμένη ιολογική ανταπόκριση, ταυτόχρονα με την ορομετατροπή του επιφανειακού αντιγόνου. 6. Φαρμακευτικές επιλογές Τα φάρμακα που είναι εγκεκριμένα για τη θεραπεία της ΧΗΒ είναι η ιντερφερόνη-α, η πεγκυλιωμένη ιντερφερόνη-α καθώς και 6 νουκλεοτ(σ)ιδικά ανάλογα (λαμιβουδίνη, τελμπιβουδίνη, εμτρισιταβίνη, εντεκαβίρη, αδεφοβίρη και τενοφοβίρη). Η εμτρισιταβίνη καθώς και η πεγκυλιωμένη ιντερφερόνη-β δεν είναι εγκεκριμένες σε όλες τις χώρες τις Ευρωπαϊκής Ένωσης και για τον λόγο αυτό δεν περιλαμβάνονται στην ακόλουθη παρουσίαση. 1. Ιντερφερόνη-α (IFNα) Πεγκυλιωμένη ιντερφερόνη-α (pegifnα) Η ιντερφερόνη ασκεί αντιική αλλά και ανοσοτροποιητική δράση και ήταν το πρώτο φάρμακο που εγκρίθηκε για τη θεραπεία της ΧΗΒ. Η pegifnα 51

52 χορηγείται μία φορά την εβδομάδα, ενώ η IFNα χορηγείται ημερησίως ή τρεις φορές την εβδομάδα. HBeAg+ ασθενείς: Ένα έτος θεραπείας με pegifnα οδηγεί σε ορομετατροπή του HBeAg στο 30% των ασθενών, 24 εβδομάδες μετά την ολοκλήρωση της θεραπείας. Ο συνδυασμός με λαμιβουδίνη οδηγεί σε μεγαλύτερη μείωση του ιικού φορτίου, αλλά δεν επηρεάζει την ορομετατροπή του e αντιγόνου ή το επίπεδο του HBV-DNA μετά το πέρας της θεραπείας (52, 53). Σε απώτερη παρακολούθηση 3,5 ετών μετά την ολοκλήρωση της θεραπείας αναφέρεται ορομετατροπή του επιφανειακού αντιγόνου σε 11% των ασθενών, ποσοστό που ήταν υψηλότερο σε ασθενείς με γονότυπο Α (28% vs 3%). HBeAg- ασθενείς: Ένα έτος θεραπείας με pegifna οδηγεί σε μη ανιχνεύσιμο HBV-DNA και φυσιολογική ALT στο 15% των ασθενών 24 εβδομάδες μετά την ολοκλήρωση της θεραπείας. Η προσθήκη λαμιβουδίνης οδηγεί σε μεγαλύτερη μείωση του επιπέδου του ιικού φορτίου, αλλά δεν βελτιώνει την παρατεταμένη ιολογική ανταπόκριση. Ορομετατροπή του επιφανειακού αντιγόνου, 3 έτη μετά την ολοκλήρωση της θεραπείας, αναφέρθηκε στο 8,7% των ασθενών (54, 55). Πρόγνωση της ανταπόκρισης: Στους HBeAg+ ασθενείς ο σημαντικότερος παράγοντας πρόγνωσης της ορομετατροπής του e αντιγόνου είναι τα αυξημένα επίπεδα ALT πριν από την έναρξη της θεραπείας. Άλλοι παράγοντες που επιδρούν θετικά είναι η αυξημένη νεκροφλεγμονώδης δραστηριότητα στο ηπατικό παρέγχυμα, το χαμηλό ιικό φορτίο καθώς και οι γονότυποι Α & Β. Υπάρχουν ενδείξεις ότι η πτώση των επιπέδων του HBeAg καθώς και του HBsAg τις πρώτες εβδομάδες θεραπείας μπορούν να 52

53 προβλέψουν την παρατεταμένη ιολογική ανταπόκριση (56). Στους HBeAgασθενείς ορισμένες μελέτες έδειξαν ότι η μείωση του HBsAg κατά τη διάρκεια της θεραπείας, μπορεί να προβλέψει την παρατεταμένη ιολογική ανταπόκριση (57, 58). Σε όλους τους ασθενείς, η μείωση του HBV-DNA<20000 IU/ml την εβδομάδα 12 της θεραπείας συσχετίζεται με 50% πιθανότητα ορομετατροπής του e αντιγόνου (HBeAg+) ή παρατεταμένης ιολογικής ανταπόκρισης σε HBeAg αρνητικούς ασθενείς (59). Παρενέργειες: Η πιο συχνή παρενέργεια της ιντερφερόνης είναι το αρχικό αίσθημα κακουχίας (συμπτώματα όμοια με ιογενή λοίμωξη). Μπορεί να συνυπάρχει ανορεξία, απώλεια βάρους, τριχόπτωση, συναισθηματική αποσταθεροποίηση, καταστολή του μυελού των οστών ή επιδείνωση συνυπάρχουσας αυτοάνοσης νόσου. Η θεραπεία με ιντερφερόνη-α αντενδείκνυται σε ασθενείς με μη αντιρροπούμενη κίρρωση του ήπατος λόγω κινδύνου εμφανίσεως λοιμώξεως ή/και επιδείνωσης της ηπατικής λειτουργίας. Αντενδείκνυται επίσης σε οξεία ηπατική ανεπάρκεια, σε σοβαρές εξάρσεις της HBV λοίμωξης καθώς και σε ασθενείς που χρειάζονται αντιική προφύλαξη πριν από ανοσοθεραπεία ή χημειοθεραπεία. Δοσολογία: Πίνακας Νουκλεοσιδικά Νουκλεοτιδικά Ανάλογα (ΝΑ) Διακρίνονται σε τρεις κατηγορίες: L-nucleosides [lamivudine (LAM), telbivudine (LdT)], acyclic nucleoside phosphonates [adefovir dipivoxil (ADV), tenofovir disoproxil fumarate (TDF)] και deoxyguanosine analogues [entecavir (ETV)]. Όλα τα ΝΑ δρουν κυρίως αναστέλλοντας την ανάστροφη τρανσκριπτάση, που μετατρέπει το πρoγενομικό RNA σε DNA. Δεν έχουν 53

54 άμεση δράση πάνω στο cccdna. Μετά τη διακοπή της θεραπείας συνήθως παρατηρείται έξαρση του πολλαπλασιασμού του ιού. Μακροχρόνια χρήση τους συσχετίζεται με ανάπτυξη ιικής αντοχής. Η επιλογή του ΝΑ πρέπει να βασίζεται στην αντιική του ικανότητα καθώς και στη πιθανότητα ανάπτυξης αντιικής αντοχής. HBeAg+ ασθενείς: Ένα έτος θεραπείας με ΝΑ οδηγεί σε μεγάλο ποσοστό σε μη ανιχνεύσιμο HBV-DNA καθώς και σε ιστολογική βελτίωση. Ορομετατροπή του HBeAg επιτυγχάνεται στο 12-22% των ασθενών ενώ κάθαρση του επιφανειακού αντιγόνου παρατηρείται σε πολύ χαμηλό ποσοστό (0-3%). Η καταστολή του ιικού πολλαπλασιασμού δεν είναι μόνιμη, εκτός από τους ασθενείς στους οποίους επιτεύχθηκε ορομετατροπή του HBeAg, και υποτροπιάζει μετά το τέλος της θεραπείας. Σε ασθενείς που επιτεύχθηκε ορομετατροπή του HBeAg, αυτή διατηρείται σε ποσοστό μεταξύ 50-80%. Η παράταση της θεραπείας 12 μήνες μετά την ορομετατροπή μειώνει την πιθανότητα υποτροπής. Η παράταση της θεραπείας με ΝΑ πάνω από 1 έτος, οδηγεί σε αυξημένη πιθανότητα ορομετατροπής του e αντιγόνου και προσεγγίζει ποσοστά 40-50% μετά από 5 έτη θεραπείας (60-63). HBeAg- ασθενείς: Ένα έτος θεραπείας με ΝΑ οδηγεί σε αρνητικοποίηση του HBV-DNA σε μεγάλο ποσοστό των ασθενών, καθώς και σε ιστολογική βελτίωση. Κάθαρση του επιφανειακού αντιγόνου επιτυγχάνεται σε ποσοστό μικρότερο του 1%. Ο ιικός πολλαπλασιασμός υποτροπιάζει μετά τη διακοπή της θεραπείας. Η παράταση της θεραπείας για 5 έτη οδηγεί σε διατήρηση της καταστολής του ιικού πολλαπλασιασμού, αλλά το ποσοστό κάθαρσης του HBsAg παραμένει χαμηλό (0-5%) (63-65). 54

55 Πρόγνωση της ανταπόκρισης: Η αυξημένη τιμή της ALT πριν από την έναρξη της θεραπείας είναι ο ισχυρότερος παράγοντας πρόγνωσης στους HBeAg+ ασθενείς. Το χαμηλό ιικό φορτίο καθώς και η έντονη νεκροφλεγμονώδης δραστηριότητα στη βιοψία ήπατος αποτελούν επίσης ευνοϊκούς προγνωστικούς παράγοντες (60-63, 66). Η πτώση των επιπέδων του HBsAg, πιθανώς συσχετίζεται με αυξημένη πιθανότητα για απώλεια του HBeAg και του HBsAg (67). Παρενέργειες: Τα ΝΑ είναι συνήθως καλά ανεκτά, ωστόσο δυνητικά μπορεί να επάγουν μιτοχονδριακή τοξικότητα. Η κλεβουδίνη έχει αποσυρθεί λόγω μιτοχονδριακής τοξικότητας και μυοπάθειας. Επίσης έχουν αναφερθεί περιστατικά γαλακτικής οξέωσης σε ασθενείς υπό θεραπεία με εντεκαβίρη. Η αδεφοβίρη και η τενοφοβίρη είναι δυνητικώς νεφροτοξικά φάρμακα με αύξηση της κρεατινίνης στο 3% των ασθενών μετά από 5 έτη θεραπείας. Επίσης μπορούν να προκαλέσουν σωληναριακή δυσλειτουργία στο νεφρώνα, έως και σύνδρομο Fanconi. Η τελμπιβουδίνη συσχετίζεται με μυοπάθεια και περιφερική νευροπάθεια. Ο κίνδυνος περιφερικής νευροπάθειας είναι πολύ αυξημένος σε ασθενείς που λαμβάνουν θεραπεία συνδυασμού με τελμπιβουδίνη και pegifnα. Δοσολογία: Λαμβάνονται από του στόματος, μία φορά ημερησίως. Πίνακας 3. 55

56 PegIFN 2α PegIFN 2b LAM LdT ETV ADV TDF Δοσολογία 180μg* 100μg* 100mg** 600mg** 0,5mg** 10mg** 245mg** Ορομετατροπή του HBeAg (%) HBV-DNA < IU/ml (%) Φυσιολογική ALT (%) Κάθαρση HBsAg (%) του , Πίνακας 3α: Αποτελέσματα και δοσολογία των φαρμακευτικών επιλογών για τη HBeAg+ ΧΗΒ μετά από 1 έτος θεραπείας (49). *ανα εβδομάδα, **ημερησίως PegIFN2α LAM LdT ETV ADV TDF Δοσολογία 180μg* 100mg** 600mg** 0,5mg** 10mg** 245mg** HBV-DNA < IU/ml (%) Φυσιολογική ALT (%) Κάθαρση HBsAg (%) του Πίνακας 3β: Αποτελέσματα και δοσολογία των φαρμακευτικών επιλογών για τη HBeAg- ΧΗΒ μετά από 1 έτος θεραπείας (49). *ανα εβδομάδα, **ημερησίως 56

57 7. Αντίσταση στα ΝΑ Βασικός περιορισμός στη μακροχρόνια χρήση των ΝΑ είναι η πιθανή ανάπτυξη αντοχής στο φάρμακο. Η πρώτη ένδειξη ανάπτυξης ιικής αντοχής είναι η ιολογική έξαρση που ορίζεται ως η αύξηση κατά μίας λογαριθμικής κλίμακας του ιικού φορτίου από το ναδίρ, ή η επανεμφάνιση του HBV-DNA όταν αυτό είχε γίνει μη ανιχνεύσιμο. Τα επίπεδα του HBV-DNA έχουν την τάση αρχικά να κινούνται σε χαμηλά επίπεδα, διότι τα περισσότερα μεταλλαγμένα στελέχη του ιού έχουν χαμηλή ικανότητα αναπαραγωγής, αλλά με την πάροδο του χρόνου επανακτούν αυτήν την ικανότητα και προοδευτικά τα επίπεδα του ιικού φορτίου αυξάνουν. Η ιολογική έξαρση μπορεί να συνοδεύεται και από βιοχημική έξαρση με αύξηση της ALT. Για την πρόωρη αναγνώριση του ανωτέρου φαινομένου συστήνεται ο περιοδικός έλεγχος του ιικού φορτίου. Ιολογική έξαρση είναι δυνατό να προκληθεί όχι μόνο από ανάπτυξη ιικής αντοχής, αλλά και από τη μη συμμόρφωση του ασθενούς στη θεραπεία. Μετά την αναγνώριση ιολογικής έξαρσης, συστήνεται ο έλεγχος της συμμόρφωσης του ασθενούς και ο επανέλεγχος του HBV-DNA μετά από 1-3 μήνες. Ο έλεγχος του τύπου της μετάλλαξης του ιού θα οδηγήσει στην κατάλληλη επιλογή του επόμενου αντιικού φαρμάκου, ιδίως σε ασθενείς που ανέπτυξαν αντοχή σε πάνω από ένα ΝΑ. Στον πίνακα 4 φαίνονται οι κύριες μεταλλάξεις του ιού, καθώς και η αντίσταση στα ΝΑ. 57

58 LAM LdT ETV ADV TDF Wild-type S S S S S M204V R S I I S M204I R R I I S L180M+M204V R R I I S A181T/V I S S R S N236T S S S R I L180M+M204V/I±I169T±V173L±M250V R R R S S L180M+M204V/I±T184G±S202I/G R R R S S Πίνακας 4: Διασταυρούμενη αντίσταση στα ΝΑ στις πιο συχνές μεταλλάξεις του HBV (68). Η ανάπτυξη αντίστασης στα ΝΑ κυμαίνεται από 0-25% κατά το πρώτο έτος και από 1-70% στην πενταετία. Στον πίνακα 5 φαίνεται το ποσοστό ανάπτυξης αντίστασης στα ΝΑ στην 5ετία (69). 58

59 Έτη θεραπείας Χωρίς προηγούμενη θεραπεία με ΝΑ LAM LdT na na na ADV ETV TDF Με αντίσταση στη LAM ADV 5 20 na na na ETV Πίνακας 5: Ποσοστό εμφάνισης αντιικής αντοχής στα ΝΑ (69, 70) na: not available, μη διαθέσιμα στοιχεία 8. Θεραπευτική προσέγγιση Σήμερα υπάρχουν δύο διαφορετικές θεραπευτικές στρατηγικές για τη ΧΗΒ: η θεραπεία πεπερασμένης διάρκειας με pegifna και η μακροχρόνια θεραπεία με ΝΑ. Τα κύρια θεωρητικά πλεονεκτήματα της ιντερφερόνης είναι η απουσία αντίστασης και η πιθανή της ανοσοτροποιητική της δράση η οποία μπορεί να επιτύχει κάθαρση του HBsAg. Οι συχνές ανεπιθύμητες ενέργειες καθώς και η υποδόρια χορήγησή της είναι τα βασικά της μειονεκτήματα. Η εντεκαβίρη και η τενοφοβίρη είναι ισχυροί αναστολείς του ιικού αναδιπλασιασμού με μειωμένη πιθανότητα ανάπτυξης ιικής αντοχής. Για τον λόγο αυτό πρέπει να επιλέγονται ως πρώτης γραμμής ΝΑ. Τα υπόλοιπα ΝΑ μπορούν να χρησιμοποιηθούν όταν τα δύο προαναφερθέντα είναι μη διαθέσιμα ή ακατάλληλα. 59

60 Η θεραπεία πεπερασμένης διάρκειας με ιντερφερόνη πρέπει να διαρκεί 48 εβδομάδες στους HBeAg+ ασθενείς για να έχουν μεγαλύτερη πιθανότητα ορομετατροπής του e αντιγόνου. Στους HBeAg- ασθενείς μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την επίτευξη μακροχρόνιας ιολογικής ύφεσης. Θεραπεία πεπερασμένης διάρκειας με ΝΑ μπορεί να χρησιμοποιηθεί μόνο στους HBeAg+ ασθενείς μέχρι να επιτύχουν ορομετατροπή του HBeAg. Η θεραπεία θα πρέπει να συνεχίζεται για 12 τουλάχιστον μήνες μετά την αρνητικοποίηση του e αντιγόνου. Μακροχρόνια θεραπεία με ΝΑ προτείνεται σε ασθενείς που δεν κατάφεραν να επιτύχουν ορομετατροπή του HBeAg καθώς και στους HBeAgασθενείς. Η στρατηγική αυτή προτείνεται επίσης σε ασθενείς με κίρρωση του ήπατος, ανεξάρτητα με την παρουσία ή όχι του e αντιγόνου ή την ορομετατροπή αυτού. Τα πλεονεκτήματα και τα μειονεκτήματα των δύο ανωτέρω θεραπευτικών στρατηγικών αναφέρονται στον πίνακα 6. 60

61 pegifn NA Πλεονεκτήματα Πεπερασμένη διάρκεια Ισχυρή αντιική δράση Απουσία αντοχής Καλώς ανεκτή θεραπεία Υψηλότερη πιθανότητα Χορήγηση από του anti-hbe και anti-hbs στόματος ορομετατροπής με 12 μήνες θεραπείας Μειονεκτήματα Μέτρια αντιική δράση Μακροχρόνια χορήγηση Δύσκολα ανεκτή θεραπεία Κίνδυνος ανάπτυξης Ανεπιθύμητες ενέργειες αντοχής Υποδόρια χορήγηση Άγνωστη μακροχρόνια ασφάλεια Πίνακας 6: Κύρια πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα της θεραπείας με pegifnα και ΝΑ (49) 9. Αποτυχία θεραπείας Είναι σημαντική η διάκριση των ασθενών που απέτυχαν στη θεραπεία σε μη ανταποκριθέντες, σε ασθενείς με μερική ιολογική ανταπόκριση και σε ασθενείς με ιολογική διαφυγή. 1. Μη ανταπόκριση: Σπάνια παρατηρείται σε ασθενείς οι οποίοι λαμβάνουν εντεκαβίρη ή τενοφοβίρη. Ασθενείς που δεν ανταποκρίνονται σε ΝΑ θα πρέπει να ελέγχονται για συμμόρφωση στη θεραπεία. Σε ασθενείς με πλήρη συμμόρφωση και μη ανταπόκριση στα ΝΑ, θα πρέπει να ελέγχεται ο γονότυπος του HBV καθώς και η πιθανή παρουσία μεταλλάξεων. Μη ανταπόκριση παρατηρείται συχνότερα στη θεραπεία με αδεφοβίρη (10-20%) λόγω μη ισχυρής αντιικής δράσης του εν λόγω ΝΑ. 2. Μερική ιολογική ανταπόκριση: Μπορεί να συμβεί με όλα τα ΝΑ. Σημαντικό ρόλο παίζει ο έλεγχος της συμμόρφωσης του ασθενούς. Σε ασθενείς που 61

62 λαμβάνουν LAM ή LdT και μερική ιολογική ανταπόκριση την εβδομάδα 24 ή σε ασθενείς υπό θεραπεία με ADV και μερική ιολογική ανταπόκριση την εβδομάδα 48, συνιστάται αλλαγή του αντιικού σε ισχυρότερο παράγοντα (ETV, TDF), κατά προτίμηση χωρίς διασταυρούμενη αντίσταση. Η αντιμετώπιση της μερικής ιολογικής ανταπόκρισης σε ασθενείς που λαμβάνουν ETV ή TDF δεν είναι πλήρως καθορισμένη. Συνιστάται έλεγχος του HBV-DNA την εβδομάδα 48 και επίσης η παρακολούθηση της κινητικής του ιού. Ασθενείς με πτώση του HBV- DNA μπορούν να συνεχίσουν με το ίδιο ΝΑ. Ορισμένοι ειδικοί συνιστούν την προσθήκη δεύτερου ΝΑ για την πρόληψη ανάπτυξης ιικής αντίστασης στη μακροχρόνια θεραπεία και κυρίως στις περιπτώσεις κατά τις οποίες τα επίπεδα του ιικού φορτίου δεν μειώνονται παρά τη σωστή συμμόρφωση του ασθενούς. 3. Ιολογική διαφυγή: Η ιολογική διαφυγή σε ασθενείς με σωστή συμμόρφωση στη θεραπεία, συσχετίζεται με την ανάπτυξη ιικής αντοχής. Απαραίτητος είναι ο έλεγχος για τυχόν μεταλλάξεις του ιού, ωστόσο αυτό δεν είναι απαραίτητο σε ασθενείς που έχουν λάβει μονοθεραπεία με LAM ή LdT. Σε θεραπεία με ETV ή TDF η πιθανότητα ανάπτυξης αντοχής είναι 1,5% και 0% αντίστοιχα, και για τον λόγο αυτό σε πρώτη φάση θα πρέπει να ελέγχεται η συμμόρφωση του ασθενούς. Ο κίνδυνος ανάπτυξης αντοχής συσχετίζεται με υψηλά επίπεδα HBV- DNA πριν από την έναρξη της θεραπείας, μικρή μείωση του ιικού φορτίου κατά τη διάρκεια της θεραπείας και μη βέλτιστη θεραπεία με ΝΑ. Σε περίπτωση ανάπτυξης αντοχής θα πρέπει να εφαρμόζεται το συντομότερο δυνατό θεραπεία διασώσεως με το πιο αποτελεσματικό αντιικό που δεν εμφανίζει διασταυρούμενη αντίσταση με το προηγούμενο ΝΑ, για να περιοριστεί ο 62

63 κίνδυνος ανάπτυξης αντοχής σε πολλαπλά ΝΑ. Η στρατηγική επιλογής του ΝΑ σε περίπτωση ανάπτυξης αντοχής είναι η ακόλουθη (49): Αντίσταση στη LAM: μετάβαση σε TDF (προσθήκη ADV στη LAM, εάν η TDF δεν είναι διαθέσιμη). Αντίσταση στην ADV: εάν ο ασθενής δεν έχει δοκιμάσει άλλο ΝΑ, τότε αλλαγή σε ETV ή TDF (προτιμάται η ETV σε ασθενείς με υψηλή ιαιμία). Εάν ο ασθενής είχε προηγούμενη θεραπεία με LAM, τότε αλλαγή σε TDF. Αντίσταση στη LdT: μετάβαση σε TDF (προσθήκη ADV στην LdT, εάν η TDF δεν είναι διαθέσιμη). Αντίσταση στην ETV: μετάβαση σε TDF (προσθήκη ADV στην ETV, εάν η TDF δεν είναι διαθέσιμη). Αντίσταση στη TDF: δεν έχει ανιχνευθεί έως σήμερα και για τον λόγο αυτό δεν υπάρχει προηγούμενη εμπειρία. Η αλλαγή σε ETV θεωρείται λογική εάν ο ασθενής δεν έχει προηγούμενη θεραπεία με LAM, ενώ η προσθήκη ETV με συνέχιση της TDF σε ασθενείς οι οποίοι έλαβαν προηγουμένως LAM. 9. ΑΝΟΣΟΠΡΟΦΥΛΑΞΗ α) Ενεργητική Έχουν παραχθεί δύο είδη εμβολίων έναντι του HBV, ένα από ορό φορέων και ένα ανασυνδυασμένο εμβόλιο. Τα εμβόλια από ορό φορέων έχουν αντικατασταθεί πλέον από τα ανασυνδυασμένα λόγω της υποψίας μετάδοσης άλλων μολυσματικών νόσων ταυτόχρονα με τον εμβολιασμό. Το εμβόλιο είναι επίσης διαθέσιμο μαζί με αυτό της ηπατίτιδας Α (Twinrix) καθώς και μαζί με 63

64 αυτό της διφθερίτιδας, του τετάνου και του κοκκύτη (DTP3), με ή χωρίς του αιμόφιλου της γρίπης τύπου β. Οι συνδυασμοί αυτοί έχουν αποδειχθεί το ίδιο αποτελεσματικοί. Οι ενδείξεις του εμβολίου είναι οι ακόλουθες: Όλα τα νεογνά (σε νεογνά από οροθετικές μητέρες πρέπει να χορηγείται ανοσοσφαιρίνη HBIG κατά τη γέννηση). Όλα τα παιδιά και οι έφηβοι που δεν εμβολιάστηκαν κατά τη γέννηση. Ενήλικες υψηλού κινδύνου: o Εργαζόμενοι στα επαγγέλματα υγείας o Ομοφυλόφιλοι άνδρες o Άτομα με πολλαπλούς σεξουαλικούς συντρόφους o Χρήστες ενδοφλεβίων ναρκωτικών ουσιών o Ασθενείς που υποβάλλονται σε αιμοκάθαρση o Ασθενείς εσώκλειστοι σε ίδρυμα o Εργαζόμενοι δημόσιας υγείας o Σεξουαλικοί σύντροφοι και συγγενείς ατόμων με ΧΗΒ Προτείνεται πριν από τον εμβολιασμό ο έλεγχος των δεικτών του HBV για να ταυτοποιηθούν τα άτομα που έχουν εκτεθεί στο παρελθόν στον HBV και δεν χρειάζονται περαιτέρω εμβολιασμό. Ο εμβολιασμός γίνεται ενδομυϊκώς σε τρεις δόσεις σε χρόνο 0, μετά 1 μήνα και μετά από 6 μήνες. Οι ασθενείς που υποβάλλονται σε αιμοκάθαρση χρειάζονται υψηλότερες δόσεις. Ανοσοπροφύλαξη επιτυγχάνεται σε ποσοστό 90-95% μετά τον εμβολιασμό. Σχεδόν το 50% των ασθενών έχουν προστατευτικά αντισώματα μετά από 20 έτη και το 80% απαντά ικανοποιητικά σε αναμνηστική δόση του εμβολίου (71). Το εμβόλιο είναι πολύ ασφαλές και μπορεί να χορηγηθεί κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης (72). Η πιο συχνή ανεπιθύμητη ενέργεια είναι 64

65 ευαισθησία στο σημείο της έγχυσης. Σπάνια μπορεί να προκληθεί πυρετός, κακουχία, πονοκέφαλος, αρθραλγίες και μυαλγίες. Έλεγχος των επιπέδων των αντισωμάτων μετά από εμβολιασμό δεν συστήνεται παρά μόνο σε εργαζόμενους σε επαγγέλματα υγείας, ασθενείς που υποβάλλονται σε αιμοκάθαρση και άτομα που εμφανίζουν αυξημένο κίνδυνο έκθεσης στον ιό. Ο έλεγχος γίνεται 1-2 μήνες μετά την ολοκλήρωση του εμβολιασμού. Στα νεογνά από οροθετικές μητέρες γίνεται στην ηλικία των 9-15 μηνών. Στους αιμοκαθαιρόμενους ασθενείς, ο έλεγχος είναι ετήσιος. Αίτια μη απάντησης στο εμβόλιο είναι η ηλικία > 40 ετών, η παχυσαρκία, το κάπνισμα, συγκεκριμένοι υπότυποι του HLA, συνυπάρχουσες παθήσεις (διαβήτης, κίρρωση του ήπατος, νεφρική ανεπάρκεια, καταστάσεις ανοσοκαταστολής), μη ανιχνεύσιμη ΧΗΒ καθώς και τεχνικοί λόγοι που αφορούν τη συντήρηση του εμβολίου και τον τρόπο χορήγησης. Σε ποσοστό 50-75% των μη ανταποκριθέντων παρατηρείται ικανοποιητική απάντηση στη δεύτερη χορήγηση του εμβολίου. (71) Τέλος, μεταλλάξεις στην επιφανειακή πρωτεΐνη του ιού (G145R) μπορεί να είναι η αιτία που ορισμένα νεογνά μολύνθηκαν από τον HBV παρά τη χορήγηση εμβολίου. Η μετάλλαξη αυτή μειώνει τη σύνδεση του HBsAg από το anti-hbs με αποτέλεσμα το αντιγόνο πιθανώς να διαφεύγει την ανοσολογική αναγνώριση. Ευτυχώς η συγκεκριμένη μετάλλαξη έχει πολύ χαμηλή επίπτωση και δεν επηρεάζει την αποτελεσματικότητα του προγράμματος εμβολιασμού (73). 65

66 β) Παθητική Η ανοσοσφαιρίνη έναντι της ηπατίτιδας Β, είναι μία υπεράνοση γ- σφαιρίνη με πολύ υψηλό τίτλο αντισωμάτων έναντι του HBsAg. Ιστορικά ήταν η πρώτη θεραπεία που δοκιμάσθηκε από το 1987 έως το 1990 για την αντιμετώπιση της υποτροπής της λοίμωξης μετά από μεταμόσχευση ήπατος σε HBsAg θετικούς λήπτες μοσχεύματος, πριν ανακαλυφθεί η λαμιβουδίνη. Είναι αποτελεσματική όταν δοθεί μέσα σε ώρες από την έκθεση στον HBV. Το εμβόλιο θα πρέπει να χορηγείται πάντα μαζί με την ανοσοσφαιρίνη. Η ανοσοσφαιρίνη χορηγείται σε ασθενείς που είχαν σεξουαλική επαφή με άτομα με οξεία ηπατίτιδα Β, νεογνά από μητέρες με ΧΗΒ και σε νύγματα π.χ. από βελόνη μολυσμένη από αίμα HBsAg θετικού ασθενούς. Η HBIG χορηγείται επίσης για να προστατεύσει την επαναλοίμωξη από τον ιό μετά από μεταμόσχευση ήπατος για σχετιζόμενη από τον HBV ηπατική νόσο. Όλοι οι HBV-DNA θετικοί ασθενείς θα πρέπει να λαμβάνουν υψηλότερες δόσεις HBIG, έτσι ώστε τα επίπεδα των antihbs να διατηρούνται πάνω από 500 IU/l (74). 66

67 ΜΕΡΟΣ Β ΙΝΩΣΗ ΤΟΥ ΗΠΑΤΟΣ 67

68 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η ηπατική ίνωση είναι η απάντηση των επουλωτικών μηχανισμών του ήπατος σε τραυματισμό. Σχεδόν οποιοδήποτε ηπατικό νόσημα σχετίζεται με φλεγμονή ή καταστροφή της ακεραιότητας του ηπατοκυττάρου ή του επιθηλίου των χοληφόρων μπορεί να οδηγήσει σε ίνωση. Απαραίτητη προϋπόθεση αποτελεί η χρονιότητα δράσης του τραυματικού αιτίου (μήνες, χρόνια) για να καταλήξει η διεργασία αυτή σε σχηματισμό ουλώδους ιστού. Η ινοποιητική διαδικασία δεν είναι μοναδική για το ηπατικό παρέγχυμα, αλλά λαμβάνει χώρα και σε άλλους ιστούς, όπως ο πνευμονικός, ο καρδιακός, ο μυελός των οστών κ.ά.. Τις τελευταίες τρεις δεκαετίες έχει γίνει εντατική προσπάθεια για την κατανόηση των κυτταρικών και μοριακών μηχανισμών που αποτελούν τη βάση για την εξέλιξη της ηπατικής ίνωσης. Η ηπατική ίνωση είναι αποτέλεσμα της επουλωτικής ικανότητας του ήπατος, ως αντίδρασης στη χρόνια φλεγμονή από οποιαδήποτε αιτία. Η χρόνια φλεγμονή μέσω διάφορων παθοφυσιολογικών μηχανισμών οδηγεί στην εναπόθεση συνδετικού ιστού στο ηπατικό παρέγχυμα. Το τελικό αποτέλεσμα της προόδου της ινώσεως του ήπατος είναι η ανάπτυξη κίρρωσης, πυλαίας υπέρτασης καθώς και ηπατοκυτταρικού καρκινώματος. 2. ΦΥΣΙΚΗ ΕΞΕΛΙΞΗ ΚΑΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΚΙΝΔΥΝΟΥ Η ηπατική ίνωση είναι το αποτέλεσμα σχεδόν όλων των χρόνιων νοσημάτων του ήπατος. Στη μεγάλη πλειοψηφία των ασθενών η ίνωση του ήπατος οφείλεται στις χρόνιες ηπατίτιδες ή στην στεατοηπατίτιδα που συσχετίζεται με το αλκοόλ ή το μεταβολικό σύνδρομο (75). Άλλα αίτια που μπορεί να οδηγήσουν σε ίνωση του ηπατικού παρεγχύματος είναι: αυτοάνοσα 68

69 νοσήματα και χολοστατικά νοσήματα του ήπατος, παρασιτώσεις (σχιστοσωμίαση), νεογνικά ηπατικά νοσήματα, μεταβολικά νοσήματα (Wilson, αιμοχρωμάτωση), χρόνια φλεγμονώδη νοσήματα (σαρκοείδωση), φάρμακα (μεθοτρεξάτη, βιταμίνη Α), βότανα, αγγειακές διαταραχές (συγγενείς και επίκτητες) καθώς και η δεξιά καρδιακή ανεπάρκεια. Η απαρχή της ινώσεως στο ήπαρ είναι συνήθως ασυμπτωματική, ωστόσο με την πρόοδο της ινωτικής διεργασίας και την ανάπτυξη κιρρώσεως, σχετίζεται με αυξημένη νοσηρότητα αλλά και θνητότητα. Στους περισσότερους ασθενείς η πρόοδος της ίνωσης σε κίρρωση, συμβαίνει μετά από διάστημα ετών. Οι ασθενείς με κίρρωση μπορούν να παραμείνουν ασυμπτωματικοί χωρίς να αναπτύξουν τις επιπλοκές της ηπατικής ανεπάρκειας (ασκίτης, ηπατονεφρικό σύνδρομο, ηπατική εγκεφαλοπάθεια, αιμορραγία από κιρσούς του οισοφάγου) για αρκετά χρόνια (αντιρροπούμενη κίρρωση). H άρση της αντιρρόπησης συνοδεύεται από αυξημένη νοσηρότητα και θνητότητα και η μεταμόσχευση του ήπατος αποτελεί στις περισσότερες περιπτώσεις τη μοναδική αποτελεσματική θεραπεία (76). Η κίρρωση αποτελεί επίσης παράγοντα κινδύνου για την ανάπτυξη ηπατοκυτταρικού καρκινώματος (51). Σε ορισμένες περιπτώσεις η πρόοδος της ίνωσης σε κίρρωση μπορεί να συμβεί μέσα σε διάστημα λίγων ετών, όπως σε ασθενείς με επαναλαμβανόμενα επεισόδια αλκοολικής ηπατίτιδας, συχνές εξάρσεις των ιογενών ηπατιτίδων, παρατεταμένη χολόσταση, κ.α. Η φυσική πορεία της ίνωσης επηρεάζεται από περιβαλλοντικούς αλλά και από γενετικούς παράγοντες (76). Οι γενετικοί παράγοντες θα αναλυθούν σε ξεχωριστή υποκατηγορία αυτού του κεφαλαίου. 69

70 α) Χρόνια ηπατίτιδα C Η πορεία της χρόνιας ηπατίτιδας C (ΧΗC) ποικίλλει, από δεκαετίες με ιαιμία και ελάχιστη ίνωση, έως γρήγορη πρόοδο σε κίρρωση μέσα σε έτη. Οι παράγοντες που διαδραματίζουν το σημαντικότερο ρόλο στην πρόοδο της ίνωσης στην ΧΗC είναι κυρίως παράγοντες του ξενιστή και όχι του ίδιου του ιού. Οι κυριότεροι από αυτούς είναι: η μεγάλη ηλικία του ασθενούς κατά τη μετάδοση του ιού, η συνυπάρχουσα ηπατική νόσος από ΧΗΒ, η κατάχρηση αλκοόλης (>50g/ημέρα), το ανδρικό φύλο, ο αυξημένος δείκτης μάζας σώματος που συσχετίζεται με ηπατική στεάτωση, η ανοσοκαταστολή (HIV, ανοσοκατασταλτική θεραπεία) και τέλος η συσσώρευση σιδήρου στον οργανισμό (75). β) Χρόνια ηπατίτιδα Β Η φυσική εξέλιξη της ίνωσης στην ΧΗΒ καθώς και οι παράγοντες που επιδρούν σε αυτή, αναλύθηκαν στο πρώτο μέρος της παρούσας διατριβής. γ) Αλκοολική νόσος του ήπατος Η συνέχιση της κατάχρησης αλκοόλης, αποτελεί τον πρώτο και σημαντικότερο παράγοντα για την εξέλιξη της ίνωσης. Επιπλέον δύο παράγοντες που επιδρούν στην πορεία της ίνωσης είναι ο αυξημένος δείκτης μάζας σώματος και η αυξημένη γλυκόζη αίματος (κίνδυνος συνύπαρξης στεατοηπατίτιδας) (77). Παθολογοανατομικώς, η παρουσία περικεντρικής ίνωσης (κεντρική υαλινική ίνωση) αυξάνει τον κίνδυνο ανάπτυξης κίρρωσης, κυρίως εάν συνδυαστεί με συνέχιση της χρήσης αιθανόλης (78). 70

71 δ) Μη αλκοολική στεατοηπατίτιδα Η παρουσία φλεγμονής στο ηπατικό παρέγχυμα επιδρά στην πρόγνωση της ίνωσης. Ασθενείς χωρίς φλεγμονή, φαίνεται να έχουν καλοήθη πορεία της νόσου, ενώ οι ασθενείς που έχουν αναπτύξει στεατοηπατίτιδα έχουν συνήθως κακή πρόγνωση με το 19% αυτών να οδηγείται σε κίρρωση μετά από 9 έτη (79). Η παρουσία παχυσαρκίας με δείκτη μάζας σώματος μεγαλύτερο από 28 συσχετίζεται με σοβαρότερη ίνωση και κίνδυνο ανάπτυξης κίρρωσης. Άλλοι παράγοντες που επιδρούν αρνητικά στην πορεία της ίνωσης είναι: ALT>2x, AST/ALT>1, η ηλικία του ασθενή, τα αυξημένα τριγλυκερίδια, η αντίσταση στην ινσουλίνη ή η ανάπτυξη διαβήτη καθώς και η παρουσία υπέρτασης (75). 3. ΠΑΘΟΓΕΝΕΙΑ Ως ίνωση του ήπατος ορίζεται η εναπόθεση ουλώδους ιστού στο ήπαρ, η οποία είναι αποτέλεσμα παρατεταμένης νεκροφλεγμονώδους δραστηριότητας από λοιμώδη, τοξικά κ.α. αίτια. Αρχικά παρατηρείται μία φλεγμονώδης φάση με χημειοταξία των λεμφοκυττάρων και ενεργοποίηση των κυττάρων του Kuppfer. Το κύριο γεγονός είναι η ενεργοποίηση των ηπατικών αστεροειδών κυττάρων και η μετάπτωσή τους από την ήρεμη μορφή σε ενεργοποιημένους ηπατικούς μυοϊνοβλάστες. Η ενεργοποίηση των ηπατικών αστεροειδών κυττάρων περιλαμβάνει δύο φάσεις: την έναρξη και τη διαιώνιση. Στη φάση της έναρξης τα ηπατικά αστεροειδή κύτταρα μεταμορφώνονται σε εκκριτικά κύτταρα (εκκρίνουν χυμοκίνες, αυξητικούς παράγοντες κ.α.). Η φάση της διαιώνισης περιλαμβάνει τον πολλαπλασιασμό των ηπατικών αστεροειδών κυττάρων, τη χημειοταξία άλλων ηπατικών αστεροειδών κυττάρων καθώς και 71

72 λευκοκυττάρων, τη μετατροπή αυτών από κύτταρα που αποθηκεύουν βιταμίνη Α σε κύτταρα με αυξημένη συσταλτότητα και τελικά στην καταστροφή της φυσιολογικής εξωκυττάριας ουσίας και την έκκριση ινιδίων κολλαγόνου (75, 76). Σημαντικό ρόλο στην ίνωση του ήπατος παίζει η εναπόθεση εξωκυττάριων ουσιών. Οι εξωκυττάριες ουσίες που εναποτίθενται περιλαμβάνουν διάφορους τύπους κολλαγόνου, πρωτεογλυκανών, δομικών πρωτεϊνών και υαλουρονικού οξέος. Η εναπόθεση αυτών στο χώρο του Disse (περικολποειδική ίνωση), δηλαδή μεταξύ της κολποειδικής επιφάνειας των ηπατοκυττάρων και του ενδοθηλίου των κολποειδών τριχοειδών, οδηγεί σταδιακά σε εγκλωβισμό των ηπατοκυττάρων από την περιβάλλουσα ουσία που επηρεάζει όχι μόνο την αιματική ροή μέσα στο ήπαρ, αλλά και τη βιοσυνθετική ικανότητα των ηπατοκυττάρων (80). Κεντρικό ρόλο στη δημιουργία της ινώσεως διαδραματίζουν οι μεταλλοπρωτεϊνάσες (Metalloproteinases MMPs) καθώς και οι αναστολείς αυτών (ιστικοί αναστολείς των εξωκυττάριων πρωτεϊνών / tissue inhibitors of metalloproteinases TIMPs). Στην ηπατική ίνωση παρατηρείται ελάττωση των μεταλλοπρωτεϊνασών και αύξηση των TIMPs με αποτέλεσμα να υπάρχει θετικό ισοζύγιο στην εναπόθεση εξωκυττάριας ουσίας (81, 82). Νεότερα δεδομένα αναδεικνύουν τον ρόλο της επιθηλιακήςμεσεγχυματικής μετατροπής (Epithelial-Mesenchymal Transition, ΕΜΤ) στην ίνωση του ήπατος. Η ΕΜΤ διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην παθοφυσιολογία της ίνωσης άλλων οργάνων και ιδίως του νεφρού. Επανεισάγεται κατ αυτόν τον τρόπο η αντίληψη ότι στην ηπατική ίνωση δεν παίζουν ρόλο μόνο τα ενεργοποιημένα ηπατικά αστροκύτταρα, αλλά και άλλα κύτταρα, είτε ηπατικά 72

73 (π.χ. πυλαίοι μυοϊνοβλάστες) είτε εξωηπατικά (κύτταρα προερχόμενα από τον μυελό των οστών και κυκλοφορόντα ινοκύτταρα). Η ΕΜΤ χαρακτηρίζεται από απώλεια της κυτταρικής σύνδεσης, καταστολή της έκφρασης της Ε-καντχερίνης και αυξημένη κυτταρική κινητικότητα. Υπάρχουν τρεις μορφές ΕΜΤ, αλλά μόνο μία από αυτές οδηγεί σε ίνωση. Σημαντικό ρόλο, τέλος, για την ΕΜΤ διαδραματίζει το κυτταρικό μικροπεριβάλλον καθώς και τα αυξημένα επίπεδα αυξητικών παραγόντων και κυτταροκινών που προέρχονται από τη χρόνια αντίδραση επούλωσης (83). α) Μηχανισμοί βλάβης του ήπατος 1. Φλεγμονή Η φλεγμονώδης διαδικασία στο ήπαρ χαρακτηρίζεται από μετανάστευση φλεγμονωδών κυττάρων σε περιοχές που έχουν προσβληθεί από κάποιον βλαπτικό παράγοντα. Η παρουσία ή απουσία φλεγμονής στο ήπαρ προσδιορίζεται από την ιστολογική εξέταση του ήπατος. Ενώ η πλειοψηφία των χρόνιων νοσημάτων του ήπατος συσχετίζονται με φλεγμονώδη διαδικασία, υπάρχουν ορισμένες (π.χ. αιμοχρωμάτωση) που δεν έχουν έντονη ιστολογική φλεγμονή. Η μετανάστευση των φλεγμονωδών κυττάρων επάγεται από χυμοκίνες καθώς και από τη σύνδεση των μορίων επαφής των φλεγμονωδών κυττάρων με τα ενδοθηλιακά κύτταρα ή με τα ηπατικά αστεροειδή κύτταρα. Υπάρχουν δεδομένα που αποδεικνύουν ότι η απελευθέρωση κυτοκινών σχετιζομένων με το τραύμα ή τη φλεγμονή, επισυμβαίνει ακόμη και χωρίς την παρουσία κυττάρων της φλεγμονής (84). Τα φλεγμονώδη κύτταρα ανήκουν στη φυσική ανοσία (ΝΚ, μακροφάγα) καθώς και στην επίκτητη (Τ και Β κύτταρα) και είναι υπεύθυνα για την ανάπτυξη 73

74 της φλεγμονής στο ήπαρ καθώς και της ινωδογένεσης. Τα φλεγμονώδη κύτταρα ασκούν τόσο προστατευτική (απομόνωση παθογόνων, ρύθμιση της φλεγμονώδους απάντησης) όσο και βλαπτική δράση (ηπατοκυτταρική νέκρωση, προσέλκυση και ενεργοποίηση μυοϊνοβλαστών) (85). Η νέκρωση των ηπατοκυττάρων είναι αποτέλεσμα της διάδρασης των παθολογικών ηπατοκυττάρων με τα φλεγμονώδη κύτταρα. Μαζί με τα κύτταρα Kupffer και τα ηπατικά αστεροειδή κύτταρα επάγουν τη φλεγμονή. Τοπικοί ιστικοί παράγοντες από τα παθολογικά ηπατοκύτταρα και από την αποδομημένη εξωκυττάρια ουσία διεγείρουν την έκφραση χημειοτακτικών κυτοκινών και χυμοκινών και ενισχύουν ακόμη περισσότερο τη φλεγμονώδη απάντηση. Τα κύτταρα Kupffer είναι κύριοι ρυθμιστές της φλεγμονώδους απάντησης. Ο κύριος τρόπος μετάδοσης και έκφρασης των περισσότερων μεσολαβητών της φλεγμονής, είναι μέσω του πυρηνικού παράγοντα κβ (NFκΒ) (84, 85). 2. Απόπτωση Η απόπτωση ή προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος είναι κοινό χαρακτηριστικό στη χρόνια ηπατική νόσο, ιδίως η απόπτωση των ηπατοκυττάρων. Η απόπτωση οδηγεί στη δημιουργία αποπτωτικών σωματιδίων που απομακρύνονται μέσω της φαγοκυττάρωσης. Παρ όλο που η απόπτωση καθ εαυτή είναι μη φλεγμονώδης διαδικασία, αποτελεί ένα από τα πιο ισχυρά ερεθίσματα που επάγουν τη φλεγμονή (προφλεγμονώδης δράση). Επίσης προάγει την ίνωση. Τα κύτταρα του Kupffer μετά τη φαγοκυττάρωση των αποπτωτικών σωματιδίων εκκρίνουν τον παράγοντα TNF-α καθώς και υποδοχείς θανάτου. Τέλος, η φαγοκυττάρωση αυτών από τα ηπατικά 74

75 αστεροειδή κύτταρα ενεργοποιεί την ινωτική διαδικασία με την παραγωγή οξειδωτικού stress καθώς και την επαγωγή του TGF-β1 (αυξητικός παράγοντας μετασχηματισμού, Transforming Growth Factor) και της έκφρασης του κολλαγόνου τύπου Ι (85). Η απόπτωση επιτελείται μέσω δύο οδών: α) εξωγενής οδός μέσω της ενεργοποίησης υποδοχέων θανάτου και β) ενδοκυττάρια ή βασιζόμενη σε κυτταρικά οργανίδια οδός. Η ρύθμιση της εξωγενούς οδούς επιτελείται από διάφορους υποδοχείς (Fas-R, TNF-R1, TRAIL-R1 & R2), ενώ η ενδοκυττάρια οδός μπορεί να ενεργοποιηθεί από διάφορα κυτταρικά οργανίδια (λυσοσωμάτια, ενδοπλασματικό δίκτυο, πυρηνική βλάβη του DNA, μιτοχόνδρια), με σημαντικότερο ρόλο να ασκεί η δυσλειτουργία των μιτοχονδρίων (85, 86). Απόπτωση μπορεί να επιτελεσθεί ακόμη και στα ηπατικά αστεροειδή κύτταρα, όταν αυτά είναι στην ενεργοποιημένη τους μορφή (μυοϊνοβλάστες). Η απόπτωση των ηπατικών αστεροειδών κυττάρων βασίζεται σε μία ισορροπία σημάτων απόπτωσης και επιβίωσης. Τα αποπτωτικά ερεθίσματα μεταβιβάζονται κυρίως μέσω των υποδοχέων Fas και TRAIL-R2. Τα ερεθίσματα επιβίωσης είναι λιγότερο μελετημένα. Κυρίως ευνοούν τη συσσώρευση εξωκυττάριας ουσίας, καθώς επίσης αναστέλλουν την αποδόμηση αυτής (86). Υπάρχει σαφής συσχέτιση μεταξύ απόπτωσης και φλεγμονής. Η μη ελεγχόμενη απόπτωση που παρατηρείται σε παθολογικές καταστάσεις διαταράσσει τη δομή και αρχιτεκτονική των ηπατοκυττάρων. Όταν η απόπτωση υπερβεί τη δυνατότητα των μακροφάγων να απομακρύνουν τα αποπτωτικά σωματίδια, τα ανωτέρω υφίστανται λύση και απελευθερώνουν το περιεχόμενό 75

76 τους προκαλώντας ιστική βλάβη και εκλύοντας φλεγμονώδη απάντηση. Η ενεργοποίηση των υποδοχέων που συνδέονται με την απόπτωση, οδηγεί με τη σειρά της σε απελευθέρωση προφλεγμονωδών χυμοκινών. Τελικά, η φαγοκυττάρωση των αποπτωτικών σωματιδίων από τα κύτταρα Kupffer οδηγεί στην έκφραση υποδοχέων θανάτου στα τελευταία και στην περαιτέρω συνέχιση της αποπτωτικής διαδικασίας. Όλα τα ανωτέρω, έχουν ως αποτέλεσμα την έκλυση χυμοκινών καθώς και τη δημιουργία οξειδωτικού stress και προάγουν την ενεργοποίηση των ηπατικών αστεροειδών κυττάρων και την μετατροπή αυτών σε μυοϊνοβλάστες. Επίσης η φαγοκυττάρωση των αποπτωτικών σωματιδίων από τα ίδια τα ηπατικά αστεροειδή κύτταρα ενεργοποιεί την έκφραση του TGF-β και επάγει την παραγωγή κολλαγόνου τύπου Ι (86). 3. Ο ρόλος του οξειδωτικού stress στην ίνωση του ήπατος Ο όρος οξειδωτικό stress αναφέρεται στην προκαλούμενη οξειδωτική βλάβη που δημιουργείται σε βιολογικά μακρομόρια (νουκλεϊκά οξέα, πρωτεΐνες, λιπίδια και υδατάνθρακες). Δημιουργείται όταν η οξειδωτική βλάβη υπερβαίνει τους κυτταρικούς αντιοξειδωτικούς μηχανισμούς. Οι μείζονες οξειδωτικές ουσίες (ενεργοί μεσολαβητές οξυγόνου Reactive Oxygen Intermediate, ROI) είναι το υπεροξείδιο του υδρογόνου (Η2Ο2) και το ανιόν του υπεροξειδίου (Ο2 - ). Το φυσιολογικό ήπαρ είναι εφοδιασμένο με ενζυμικούς αλλά και μη ενζυμικούς αντιοξειδωτικούς μηχανισμούς (κυρίως η γλουταθειόνη Glutathione, GSH και η α-τοκοφερόλη). Οι ανωτέρω προστατευτικοί μηχανισμοί ανευρίσκονται ελαττωμένοι στη χρόνια ηπατική νόσο (87). Το οξειδωτικό stress διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην προαγωγή της ηπατικής βλάβης και στην έναρξη της ηπατικής ινογένεσης. Αυξημένα ROI και 76

77 οξειδωτική βλάβη πρωτεϊνών και DNA ανευρίσκονται στο ήπαρ των ασθενών με χρόνια ηπατική βλάβη. Οι οξειδωτικές ουσίες (Ο2 -, H2O2, OH, RO, ROO, ONOO - ) προέρχονται κυρίως από τη διαρροή των τραυματισμένων μιτοχονδρίων των ηπατοκυττάρων, από ενεργοποιημένα φλεγμονώδη κύτταρα καθώς και από προϊόντα του κυτοχρώματος P450 (ιδίως του CYP2E1). Η συσσώρευση των ROS (Reactive Oxygen Species) σταδιακά ξεπερνά την αντιοξειδωτική ικανότητα του ήπατος. Η οξειδωτική βλάβη των λιπιδίων, των πρωτεϊνών και των νουκλεϊκών οξέων επάγει τη νέκρωση και απόπτωση των ηπατοκυττάρων, ενεργοποιεί την φλεγμονώδη απάντηση και αρχίζει τη διαδικασία της ίνωσης (85). Διάφορα ενζυματικά συστήματα συντελούν στη δημιουργία ελευθέρων ριζών οξυγόνου (ROS), συμπεριλαμβανομένων της ενδοθηλιακής ΝΟ συνθετάσης, του κυτοχρώματος P450 (CYP2E1) και της NADPH oξειδάσης (Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate). Οι ελεύθερες ρίζες οξυγόνου που προέρχονται από τα τραυματισμένα ηπατοκύτταρα διαμέσου του κυτοχρώματος P450 μπορούν να επάγουν φαινοτυπική ενεργοποίηση, πολλαπλασιασμό και αυξημένη σύνθεση κολλαγόνου στα ηπατικά αστεροειδή κύτταρα. Το σύστημα της NADPH οξειδάσης έχει αναγνωριστεί ως κρίσιμος μεσολαβητής της ηπατικής ίνωσης. Ιδίως η φαγοκυτταρική μορφή της NADPH οξειδάσης που εκκρίνεται από τα κύτταρα του Kupffer πιθανολογείται ότι έμμεσα ενεργοποιεί τα ηπατικά αστεροειδή κύτταρα και συμπράττει στη διαδικασία της ηπατικής ίνωσης (88). 77

78 β) Εξωκυττάρια ουσία (ECM) 1. Μεταλλοπρωτεϊνάσες Η διατήρηση της εξωκυττάριας ουσίας στο ήπαρ οφείλεται στην αρμονική ισορροπία μεταξύ πρωτεϊνασών και των αναστολέων αυτών. Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες (MMPs) είναι μία οικογένεια ενδοπεπτιδασών συνδεδεμένων με ψευδάργυρο και είναι υπεύθυνες για την αποδόμηση της εξωκυττάριας ουσίας. Αυτό που τις διακρίνει από τις υπόλοιπες πρωτεϊνάσες είναι ότι το μόριο τους αποτελείται από δύο περιοχές: ένα προπεπτίδιο και μία καταλυτική περιοχή. Το προπεπτίδιο βρίσκεται συνήθως στο N-άκρο και αποτελείται από περίπου 80 αμινοξέα. Η καταλυτική περιοχή αποτελείται από αμινοξέα και περιέχει ιόν ψευδαργύρου. Οι περισσότερες MMPs εκκρίνονται στο εξωκυττάριο περιβάλλον, ενώ ορισμένες είναι συνδεδεμένες στη μεμβράνη (Membrane Type MMPs, MT-MMPs). Η ειδικότητά τους για το υπόστρωμα καθορίζεται από το C-τελικό άκρο του μορίου τους (89). Οι περισσότερες από τις MMPs απουσιάζουν από τους υγιείς ιστούς. Εκφράζονται κυρίως σε ιστούς κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης, σε χημικό ή μηχανικό τραύμα των ιστών καθώς και σε παθολογικές καταστάσεις των ιστών. (89). 2. Φυσιολογικό ήπαρ Το φυσιολογικό ήπαρ περιλαμβάνει τα ηπατοκύτταρα, το ενδοθήλιο, τα ιστικά μακροφάγα (κύτταρα του Kupffer) και τα περιαγγειακά αστεροειδή κύτταρα. Ο υποενδοθηλικός χώρος του Disse διαχωρίζει τα ηπατοκύτταρα από το κολποειδικό ενδοθήλιο και περιλαμβάνει μίας χαμηλής πυκνότητας ουσία, την εξωκυττάρια ουσία (Extracellular Matrix, ECM). Η ECM αποτελείται από ένα 78

79 δικτυωτό σχηματισμό πρωτεϊνών καθώς και τα κύτταρα που την παράγουν και δημιουργεί την ηπατική βασική μεμβράνη. Η βασική μεμβράνη αποτελείται κυρίως από κολλαγόνο τύπου IV, VI και XIV, γλυκοπρωτεΐνες και πρωτεογλυκάνες. Κύριος ρόλος της είναι να παράγει μηχανική στήριξη στα ηπατοκύτταρα και να επιτρέπει τη μεταφορά θρεπτικών ουσιών και αυξητικών παραγόντων προς αυτά. Επίσης παρέχει σήματα για τη διαφοροποίηση των περιβαλλόντων κυττάρων (75). Σε αντίθεση με τη βασική μεμβράνη, η εξωκυττάρια ουσία του διάμεσου χώρου (εντοπίζεται στην ηπατική κάψα, στους περιαγγειακούς χώρους και τις πυλαίες τριάδες), αποτελείται από ινίδια κολλαγόνου (τύπου Ι, ΙΙΙ), ινωδονεκτίνη και ουνδουλίνη. Η ECM στο φυσιολογικό ήπαρ αποτελείται κυρίως από κολλαγόνο τύπου IV, λαμινίνη και πρωτεογλυκάνες. Η διατήρηση σταθερών αναλογιών κολλαγόνου της ECM, συμβάλλει στη διατήρηση των ηπατικών αστεροειδών κυττάρων στην ήρεμή τους μορφή και αποτρέπει την ενεργοποίηση αυτών. Ακόμη και στο φυσιολογικό ηπατικό παρέγχυμα η διατήρηση της ECM δεν είναι σταθερή, αλλά μία δυναμική διαδικασία που περιλαμβάνει σύνθεση νέας ECM και αποδόμηση της προϋπάρχουσας (90). Έχει παρατηρηθεί ότι οι μεταλλοπρωτεϊνάσες (MMPs) που είναι υπεύθυνες για την αποδόμηση του φυσιολογικού ήπατικού παρεγχύματος, εκφράζονται τόσο κατά τη διάρκεια της ηπατικής βλάβης όσο και της ινωδογένεσης. Οι τρεις πιο σημαντικές από αυτές είναι η γελατινάση Α (MMP- 2), η γελατινάση Β (MMP-9) και η στρομελυσίνη (MMP-3). Προγελατινάση Α. Εκκρίνεται από τα ηπατικά αστεροειδή κύτταρα και είναι προένζυμο που ενεργοποιείται στην επιφάνεια των ηπατοκυττάρων. Δημιουργεί ένα τριμοριακό σύμπλεγμα με τη μεμβράνη τύπου 1 (MT1-MMP, 79

80 γνωστό και ως MMP-14) καθώς επίσης και με τον αναστολέα αυτής (TIMP-2). Το ανωτέρω σύμπλεγμα δημιουργεί ένα διαμεμβρανικό μόριο που διαταράσσει τη φυσιολογική σύνδεση κυττάρου-ecm και οδηγεί σε αποδόμηση του ECM. Ο κύριος επαγωγικός παράγοντας είναι η παρουσία άφθονου κολλαγόνου τύπου Ι στην ECM, το οποίο ενεργοποιεί τα αστεροειδή κύτταρα ώστε να παράγουν την προγελατινάση Α (90). Προγελατινάση Β. Εκκρίνεται από τα κύτταρα του Kupffer και κυρίως από την ενεργοποιημένη τους μορφή. Είναι επίσης προένζυμο που ενεργοποιείται από την πλασμίνη και την στρομελυσίνη (90). Προστρομελυσίνη 1. Εκκρίνεται επίσης από τα ηπατικά αστεροειδή κύτταρα, όπως και η προγελατινάση Α, με τη διαφορά ότι η παραγωγή της δεν είναι συνεχής αλλά περιοδική και κυρίως στην αρχή της διαφοροποίησης των αστεροειδών κυττάρων. Πιθανολογείται ότι διαδραματίζει κάποιο ρόλο στην αρχική φάση της φλεγμονής του ηπατικού παρεγχύματος (90). 3. Ινωτικό ήπαρ Στο ινωτικό ήπαρ υπάρχει θετικό ισοζύγιο δημιουργίας-αποδόμησης της εξωκυττάριας ουσίας (αυξημένη σύνθεση και μειωμένη αποδόμηση), με αποτέλεσμα την εναπόθεση ινιδίων κολλαγόνου στο διάμεσο χώρο. Στα προχωρημένα στάδια της ίνωσης παρατηρείται αύξηση των ινιδίων κολλαγόνου έως και 6 φορές (76). Το κολλαγόνο που κυριαρχεί είναι τύπου Ι, ΙΙΙ και IV. Αυτά τα μόρια είναι συνήθως ανθεκτικά στην αποδόμηση από τις πρωτεϊνάσες αλλά μπορούν να αποδομηθούν από τις διάμεσες κολλαγενάσες (MMP-1 και MMP-13) καθώς και από την κολλαγενάση των ουδετερόφιλων (MMP-8). Οι ενεργοποιημένες μορφές των MMPs μπορούν να ανασταλούν από 80

81 τα TIMPs, τα οποία είναι σημαντικά ρυθμιστικά μόρια στην αναδόμηση των ιστών (remodeling) (90). Όπως προαναφέρθηκε, η πρόοδος της ηπατικής ίνωσης συσχετίζεται με την αναστολή της αποδόμησης της ECM. Κατά τη διάρκεια της πρόωρης ινωδογένεσης, η φιμπρονεκτίνη και η τενασκίνη αυξάνουν στις περιοχές όπου υπάρχει νεκροφλεγμονώδης δραστηριότητα. Δημιουργείται κατ αυτόν τον τρόπο μία διαδικασία επούλωσης με εναπόθεση ινικής και μηχανισμούς όμοιους της θρομβογένεσης. Ο αρχικός αυτός ινώδης ιστός είναι προσωρινός, αλλά επηρεάζει και προσελκύει άλλα φλεγμονώδη μόρια καθώς και μόρια που παράγουν εξωκυττάρια ουσία. Κατά τη διάρκεια της επουλωτικής αυτής διαδικασίας, αρχικά δημιουργείται κολλαγόνο τύπου ΙΙΙ, το οποίο στη συνέχεια αντικαθίσταται από κολλαγόνο τύπου Ι. Το κολλαγόνο τύπου Ι αποτελεί το 60-70% του συνολικού κολλαγόνου στο κιρρωτικό ήπαρ, με εξαίρεση την αλκοολική νόσο του ήπατος όπου επικρατεί το κολλαγόνο τύπου ΙΙΙ. Επιπλέον, στα ινώδη διαφραγμάτια ανευρίσκεται επίσης κολλαγόνο τύπου IV, V και VI (84). Κύριο χαραστηριστικό στο ινωτικό ήπαρ είναι η αύξηση της έκφρασης των αναστολέων των μεταλλοπρωτεϊνασών (TIMPs) και κυρίως του TIMP-1 και του TIMP-2 (91). Ο TIMP-1 συνδέεται και αναστέλλει την κολλαγενάση, προστατεύοντας το νεοσύστατο κολλαγόνο από την αποδόμηση, καθώς επίσης αναστέλλει την απόπτωση των αστεροειδών κυττάρων. Η αύξηση του TIMP-2 έχει αποδειχθεί ότι οφείλεται στην φλεγμονή και διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στα αρχικά στάδια της ίνωσης (92). Η πρόωρη έκφραση της MMP-13 κατά τη διάρκεια της φλεγμονώδους διαδικασίας καταστρέφει τον περιβάλλοντα ιστό και επάγει την εναπόθεση νέας 81

82 ECM. Η αποδόμηση της φυσιολογικής ECM οδηγεί σε απελευθέρωση κυτοκινών, όπως του TGF-β, που μπορούν να επάγουν την ινογένεση. Ταυτόχρονα, η MMP-14, η οποία είναι μεμβρανική πρωτεϊνάση, ενεργοποιεί την MMP-13 και στη συνέχεια ακολουθεί μία διαταραχή της σύνδεσης ECMηπατικών αστεροειδών κυττάρων, δημιουργώντας ένα περιβάλλον ευνοϊκό για την μετανάστευση και τον πολλαπλασιασμό αυτών (92). Η MMP-2 (γελατινάση Α) και η MMP-14 (ΜΤ1-MMP), εκφράζονται από τα ηπατικά αστεροειδή κύτταρα μετά από τραύμα στο ηπατικό παρέγχυμα. Η ενεργοποίηση της MMP-2 γίνεται μέσω της MMP-14. Σε πειραματικά μοντέλα η παρουσία της MMP-2 δεν ανευρίσκεται όταν το ηπατικό παρέγχυμα είναι φυσιολογικό. Μετά από τεχνητή ίνωση του ήπατος με έγχυση CCl4, η έκφραση του mrna της MMP-2 αυξάνεται (93). Τέλος η MMP-2 αποτελεί έναν αυτοκρινή παράγοντα πολλαπλασιασμού και μετανάστευσης των ηπατικών αστεροειδών κυττάρων. Ενεργοποιείται από τον TGF-β καθώς και από τις ελεύθερες ρίζες οξυγόνου που υπάρχουν κατά τη διάρκεια της χρόνιας ηπατικής νόσου (94). Η MMP-3 (στρομελυσίνη-1) εκφράζεται παροδικά στα αρχικά στάδια της ενεργοποίησης των ηπατικών αστεροειδών κυττάρων και παίζει σημαντικό ρόλο στην ενεργοποίηση άλλων MMPs (90). Η MMP-9 (γελατινάση Β) παράγεται από τα κύτταρα Kupffer. Υπεύθυνες κυτοκίνες για την παραγωγή της είναι η IL-1β και ο TNF-α. Διαδραματίζει έναν από τους σημαντικότερους ρόλους στην αρχική ενεργοποίηση των ηπατικών αστεροειδών κυττάρων. (95, 96) 82

83 γ) Κύτταρα που διαδραματίζουν ρόλο στην ίνωση του ήπατος 1. Αστεροειδή κύτταρα Τα ηπατικά αστεροειδή κύτταρα (Hepatic Stellate Cells, HSCs) (γνωστά παλαιότερα και ως κύτταρα του Ito, λιποαποθηκευτικά κύτταρα, διάμεσα κύτταρα και λιποκύτταρα) ανευρίσκονται στο χώρο του Disse και περιεγράφησαν αρχικώς από τον von Kupffer το 1876 ως ηπατικά κύτταρα με αστεροειδές σχήμα. Μετά 76 έτη από την αρχική τους περιγραφή, οι Ito και Nemoto παρατήρησαν ότι τα κύτταρα αυτά είχαν την ικανότητα να λειτουργούν ως λιποαποθηκευτικά κύτταρα στα τριχοειδή του ήπατος. Η ικανότητα των HSCs να αποθηκεύουν βιταμίνη Α, οδήγησε στην περαιτέρω κατανόηση ρων λειτουργικών τους χαρακτηριστικών κατά τη δεκαετία του 80 (81). Στο φυσιολογικό ήπαρ τα HSCs αποτελούν το 1,4% της συνολικής ηπατικής μάζας και ανευρίσκονται σε αναλογία 1:20 προς τα ηπατοκύτταρα. Συνήθως ανευρίσκονται στον περικολποειδικό χώρο του Disse μεταξύ των ενδοθηλιακών κυττάρων των κολποειδών και των ηπατοκυττάρων. Η αστεροειδής τους διαμόρφωση οφείλεται στις δενδριτικές κυτταροπλασματικές τους απολήξεις. Στην ήρεμή τους φάση τα HSCs περιέχουν μεγάλα περιπυρηνικά σταγονίδια λιπιδίων, ο κύριος ρόλος των οποίων είναι η αποθήκευση της βιταμίνης Α και η ρύθμιση της ομοιόστασης του ρετινοϊκού οξέος. Ακόμη τα HSCs διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη διατήρηση σταθερών επιπέδων της βασικής μεμβράνης (κυρίως του κολλαγόνου τύπου IV και VI) στα φυσιολογικά ηπατικά κολποειδή, όπως επίσης στη ρύθμιση της ηπατικής αιματικής ροής και της πίεσης στην πυλαία φλέβα (97). 83

84 Ενεργοποίηση ηπατικών αστεροειδών κυττάρων Τα HSCs είναι τα βασικά κύτταρα που συμβάλλουν στην παραγωγή της επιπλέον εξωκυττάριας ουσίας η οποία παρατηρείται στην ηπατική ίνωση. Όταν επέλθει τραυματισμός του ήπατος από κάποια στρεσσογόνα ουσία, τότε τα HSCs υπόκεινται ενεργοποίηση ή αλλιώς μεταμορφώνονται από ήρεμα, αποθηκευτικά της βιταμίνης Α κύτταρα σε ενεργοποιημένους μυοϊνοβλάστες. Η μεταμόρφωση αυτή ακολουθείται από νέα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά, όπως αυξημένη μετανάστευση και κυτταρική σύνδεση, έκφραση της α-sma (alpha- Smooth Muscle Actin), αυξημένο πολλαπλασιασμό, παραγωγή χυμοκινών που σηματοδοτούν τη συσσώρευση φλεγμονωδών κυττάρων καθώς και άλλων HSCs, αυξημένη συσταλτότητα, απώλεια του ρετινοειδούς, αύξηση του αδρού ενδοπλασματικού δικτύου, αλλαγές στον κυτταροσκελετό και στην κυτταρική μορφολογία και τέλος ικανότητα παραγωγής ινώδους ιστού (97). Εικόνα 7, 8. α) Έναρξη Η φάση της ενεργοποίησης των HSCs ξεκινάει ως απάντηση σε συνδυασμό ερεθισμάτων από τα τραυματισμένα ηπατοκύτταρα καθώς και από γειτονικά ενδοθηλιακά κύτταρα και κύτταρα του Kupffer παραλλήλως προς ταχείες μεταβολες στη σύνθεση της εξωκυττάριας ουσίας. Τα ηπατοκύτταρα και τα κύτταρα Kupffer αποτελούν ισχυρή πηγή παραγωγής ROI. Οι ουσίες αυτές λειτουργούν ως παρακρινικά ερεθίσματα στα γειτονικά HSCs. Επιπλέον, το πάσχον ήπαρ έχει μειωμένους αντιοξειδωτικούς παράγοντες, με αποτέλεσμα να πολλαπλασιάζεται η δράση των ROIs. (96) Τα ενδοθηλιακά κύτταρα διαδραματίζουν επίσης σημαντικό ρόλο στην πρώιμη ενεργοποίηση των HSCs μέσω της παραγωγής ινονεκτίνης καθώς και του παράγοντα TGF-β1 (98). 84

85 β) Διαιώνιση Η διαιώνιση της ενεργοποίησης των ΗSCs περιλαμβάνει σειρά φαινοτυπικών αλλαγών στα HSCs οι οποίες διαμεσολαβούνται από την αυξημένη δράση των κυτοκινών. Σε αυτή τη φάση αρχίζει επίσης η αντικατάσταση της χαμηλής πυκνότητας υποενδοθηλιακής εξωκυττάριας ουσίας από ινώδεις σχηματισμούς κολλαγόνου. Η φάση της διαιώνισης διακρίνεται στα ακόλουθα στάδια: πολλαπλασιασμός, συσταλτικότητα, ινογένεση, αποδόμηση εξωκυττάριας ουσίας, χημειοταξία, απώλεια ρετινοειδούς και προφλεγμονώδης απάντηση με απελευθέρωση κυτοκινών και χημειοταξία λευκοκυττάρων (98). Ο πολλαπλασιασμός των HSCs κατά τη διάρκεια ηπατικής βλάβης διενεργείται μέσω διαφόρων αυξητικών παραγόντων (κυρίως του Platelet- Derived Growth Factor, PDGF), οι οποίοι δρουν μέσω των υποδοχέων τυροσινικής κινάσης. Η δράση του PDGF αυξάνει επίσης την είσοδο ασβεστίου στα κύτταρα και το ενδοκυττάριο ph. (99) Η συσταλτικότητα των HSCs αποτελεί έναν από τους σημαντικότερους μηχανισμούς στην αύξηση της αντίστασης στην πυλαία. Η κύρια ουσία που επιδρά στην αυξημένη συσταλτικότητα των HSCs είναι η ενδοθηλίνη-1 (ΕΤ-1), η οποία δρα αυτοκρινικά (100). Η ΕΤ-1, εκτός από την συσταλτική της δράση, έχει επίδραση και στον πολλαπλασιασμό των HSCs. Η ενδοθηλίνη δρα μέσω δύο υποδοχέων στα HSCs, του ΕΤΑ και του ΕΤΒ (Endothelin receptor Type A & B). Ο υποδοχέας A αυξάνει την ικανότητα πολλαπλασιασμού των ήρεμων HSCs, σε αντίθεση με τον Β υποδοχέα, ο οποίος οδηγεί σε αναστολή της προαναφερθείσης διαδικασίας (101). 85

86 Ο αυξητικός παράγοντας TGF-β1 είναι ένα από τα κυρίαρχα αυτοκρινικά ερεθίσματα ινογένεσης. Η απελευθέρωση και η ενεργοποίηση του TGF-β1 ελέγχεται από μία σειρά ενδοκυττάριων δεσμευτικών πρωτεϊνών, οι οποίες αλλάζουν τη βιολογική δραστηριότητα του TGF-β1 κατά τη διάρκεια της επαγωγής της ίνωσης (102). Η επαγωγή της σύνθεσης κολλαγόνου διαμεσολαβείται από μεταγραφικούς και μετα-μεταγραφικούς παράγοντες, με αποτέλεσμα να προκαλείται 20πλάσια αύξηση του mrna του κολλαγόνου Ι σε σύγκριση με την ήρεμη μορφή των HSCs (103). Οι αλλαγές στη δραστηριότητα της πρωτεάσης της εξωκυττάριας ουσίας οδηγεί στην ιστική αναδόμηση αυτής. Τα HSCs αποτελούν κύρια πηγή πρωτεασών (MMP2, MMP3) υπεύθυνων για την αποδόμηση της φυσιολογικής εξωκυττάριας ουσίας. Η αποδόμηση αυτή ακολουθείται από την αντικατάστασή της με ινώδεις σχηματισμούς κολλαγόνου. Η συσσώρευση κολλαγόνου οδηγεί στην περαιτέρω ενεργοποίηση των HSCs καθώς και στην επιπλέον παραγωγή MMP2 μέσω των υποδοχέων της τυροσινικής κινάσης DDR2. Τέλος, τα ενεργοποιημένα HSCs αναστέλλουν τη δραστηριότητα των διάμεσων κολλαγενασών, με αποτέλεσμα την περαιτέρω συσσώρευση ινώδους ιστού. (104) Η μετανάστευση των ενεργοποιημένων HSCs διαμεσολαβείται από τον PDGF και τη μονοκυτταρική χημειοτακτική πρωτεΐνη 1 (MCP-1). (105) Η απώλεια του ρετινοειδούς είναι βασικό φαινόμενο κατά τη διάρκεια της ενεργοποίησης των HSCs. Μεταβολίτες του ρετινοϊκού οξέος πιθανόν να έχουν άμεση δράση στην ινογένεση μέσω της ενεργοποίησης του αδρανούς TGF-β1. (106) 86

87 Η αυξημένη παραγωγή και δραστηριότητα των κυτοκινών είναι κρίσιμη διαδικασία για τη διαιώνιση της ενεργοποίησης των HSCs. Οι περισσότερες από τις κυτοκίνες δρουν αυτοκρινικά και προέρχονται από την εξωκυττάρια ουσία. Τα HSCs, μέσω της παραγωγής χημειοτακτικών ουσιών για τα ουδετερόφιλα και τα μονοκύτταρα (MCP-1) και της επακόλουθης αύξησης των μορίων σύνδεσης, ενισχύουν περαιτέρω τη φλεγμονώδη απάντηση (85, 97, 98). Εικόνα 7: Υποενδοθηλιακές αλλαγές κατά τη διάρκεια της ενεργοποίησης των HSCs (75). (Α) Φυσιολογική αρχιτεκτονική των ηπατικών κολποειδών. Τα αστεροειδή κύτταρα (κυανό χρώμα) περιέχουν σταγονίδια βιταμίνης Α και εμφανίζουν ποδοειδείς απολήξεις που περιβάλλουν το τριχοειδές. (Β) Κατά τη διάρκεια της ηπατοκυτταρικής βλάβης, τα HSCs πολλαπλασιάζονται και περιβάλλονται από ινώδη ιστό, με αποτέλεσμα απώλεια των μικρολαχνών των ηπατοκυττάρων και στο απόφραξη των οπών του ενδοθηλίου. Πηγή: Τροποποιημένο από Friedman SL. Liver fibrosis -- from bench to bedside. Journal of hepatology

88 Εικόνα 8: Οι φάσεις της έναρξης και της διαιώνισης της ενεργοποίησης των ηπατικών αστεροειδών κυττάρων (75). Πηγή: Τροποποιημένο από Friedman SL. Liver fibrosis -- from bench to bedside. Journal of hepatology Μυοϊνοβλάστες Οι μυοϊνοβλάστες είναι συσταλτά και εκκριτικά κύτταρα που εκφράζουν την α-smooth muscle actin (α-sma), η οποία χρησιμοποιείται στην πράξη ως δείκτης της δραστηριότητάς τους (107). Υπάρχουν τρεις προϋποθέσεις για τη διαφοροποίηση των μυοϊνοβλαστών: υψηλά επίπεδα TGF-β, παρουσία την ινονεκτίνης EDA (extra domain-a) καθώς και αυξημένη μηχανική τάση (108). Αυτοί οι παράγοντες δρουν σε ποικιλία κυττάρων με σκοπό τη μετατροπή τους σε ενεργούς μυοϊνοβλάστες (π.χ. ινοβλάστες, λεία μυικά κύτταρα). 88

89 Στο ηπατικό παρέγχυμα υπάρχουν πληθυσμοί μυοϊνοβλαστών θετικοί για την α-sma, οι οποίοι αποτελούν ξεχωριστή κατηγορία σε σχέση με τα ηπατικά αστεροειδή κύτταρα. Οι πλειοψηφία μάλιστα των μυοϊνοβλαστών στις ινωτικές περιοχές δεν εκφράζουν δεσμίνη, υποδηλώνοντας ότι προέρχονται από πυλαία μεσεγχυματικά κύτταρα παρά από HSC (109). Οι πυλαίοι μυοϊνοβλαστες με τη σειρά τους εκκρίνουν μεγάλη ποικιλία πρωτεϊνών της εξωκυττάριας ουσίας. Εκτός από τους πυλαίους μυοϊνοβλάστες, υπάρχουν και αρκετές άλλες κυτταρικές ομάδες οι οποίες μπορούν να μετατραπούν σε ενεργούς μυοϊνοβλάστες, όπως οι ινοβλάστες της κάψας του Glisson, λεία μυικά κύτταρα των αγγείων καθώς και η δεύτερη κυτταρική στιβάδα γύρω από τις κεντρικές φλέβες. Το εκκριτικό προφίλ αυτών των μυοϊνοβλαστών καθώς και η συσχέτισή τους με συγκεκριμένους αιτιολογικούς παράγοντες, δεν έχει μελετηθεί ακόμη (110). Εκτός από τους ινοβλάστες που προέρχονται από το ηπατικό παρέγχυμα, υπάρχουν μελέτες που υποδηλώνουν ότι ακόμη και τα κυκλοφορούντα κύτταρα από τον μυελό των οστών μπορούν να επιδράσουν σημαντικά στη διαδικασία της ινογένεσης (111). 3. Ρόλος υπολοίπων ηπατικών κυττάρων Τα κύτταρα του Kupffer εκκρίνουν ποικιλία φλεγμονωδών μεσολαβητών, ελεύθερες ρίζες, κυτοκίνες οι οποίες προάγουν την ίνωση, καθώς και πρωτεϊνάσες της εξωκυττάριας ουσίας, οι οποίες μεταβάλλουν την δομή της κατά τη διάρκεια της πρώιμης φάσης της ηπατικής βλάβης και διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην ενεργοποίηση των HSC (112). 89

90 Τα ηπατοκύτταρα είναι οι κύριοι στόχοι των περισσοτέρων τοξικών παραγόντων που επιδρούν στο ήπαρ. Μετά την επίδραση του τοξικού παράγοντα, εκκρίνουν ελεύθερες ρίζες οξυγόνου, φλεγμονώδεις και προϊνωτικούς μεσολαβητές και τα αποπτωτικά τους σωμάτια ελκύουν φλεγμονώδη κύτταρα και ενεργοποιούν τα HSC (85). Τα κολποειδικά ενδοθηλιακά κύτταρα του ήπατος ενεργούν καθοριστικά στην ενεργοποίηση των HSC μέσω της παραγωγής της κυτταρικής ινονεκτίνης στα πρώιμα στάδια της ίνωσης. Επίσης συνθέτουν κολλαγόνο τύπου IV και λαμινίνη. Τέλος, μέσω της ενδοθηλίνης 1 (ET-1) που παράγουν, διεγείρουν τη συσταλτότητα των HSC και ρυθμίζουν την αντίσταση της ροής του αίματος διαμέσου των ηπατικών κολποειδών (85). Τέλος, τα επιθηλιακά κύτταρα των χολαγγείων παίζουν σημαντικό ρόλο στην ίνωση του ήπατος από χολοστατικές παθήσεις, όπως η πρωτοπαθής χολική κίρρωση και η πρωτοπαθής σκληρυντική χολαγγειίτιδα, μέσω της παραγωγής προϊνωτικών κυτοκινών (TGF-β1, PDGF-BB) (85). 4. Επιθηλιακή Μεσεγχυματική μετατροπή Ως επιθηλιακή-μεσεγχυματική μετατροπή (ΕΜΤ) ορίζεται η διαδικασία κατά την οποία παρατηρούνται προγραμματισμένη απώλεια των κυτταρικών συνδέσεων/συνάψεων, καταστολή της έκφρασης της Ε-καδχερίνης και αυξημένη κυτταρική κινητικότητα. Ο όρος μετατροπή επιλέχθηκε για να τονίσει τη δυνατότητα αναστροφής της ανωτέρω διαδικασίας (113). Η ΕΜΤ είναι απαραίτητη για διάφορες αναπτυξιακές δραστηριότητες, περιλαμβανομένης της δημιουργίας του μεσοδέρματος και του νευρικού σωλήνα. Επίσης, έχει συσχετισθεί με την ανάπτυξη νεοπλασμάτων και των μεταστάσεων αυτών, 90

91 καθώς επίσης με τη χρόνια φλεγμονή και ίνωση. Η ΕΜΤ είχε μελετηθεί αρχικώς στη διαδικασία ίνωσης άλλων οργάνων και ιδίως του νεφρού (83). Η ΕΜΤ έχει ταξινομηθεί σε τρεις τύπους: Ο πρώτος σχετίζεται με την ανάπτυξη των οργάνων και του εμβρύου. Ο δεύτερος τύπος ΕΜΤ αποτελεί μέρος της διαδικασίας επούλωσης μετά από τραύμα και κινητοποίηση ινοβλαστών. Τέλος, ο τελευταίος τύπος ΕΜΤ σχετίζεται με νεοπλασματικές εξεργασίες και προάγεται από γενετικές και επιγενετικές μεταλλαγές (114). Στη διαδικασία της ηπατικής ινώσεως υπάρχουν ενδείξεις ότι ενεργοποιείται μία ΕΜΤ τύπου 2. Μία πρωτοπαθής βλάβη των ηπατοκυττάρων οδηγεί σε μεταβολή του μικροπεριβάλλοντος και μεταβολικό επαναπρογραμματισμό των κυττάρων, προκειμένου να αυξήσουν τη δυνατότητα επιβίωσής τους (αυξημένη αερόβια γλυκόλυση, ενεργοποίηση των αντιοξειδωτικών γονιδίων, ενεργοποίηση σημάτων επιβίωσης). Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την απώλεια πολικότητας των κυττάρων, τη μείωση των συνδέσεων μεταξύ αυτών και την αποδόμηση της βασικής μεμβράνης. Τελικό αποτέλεσμα είναι η απώλεια του αρχικού φαινοτύπου του επιθηλίου και η μετατροπή του σε πιο ανθεκτική μορφή (83). δ) Το σύστημα της ρενίνης αγγειοτενσίνης στην παθογένεια της ίνωσης του ήπατος Αρκετές ομάδες ερευνητών μελέτησαν την έκφραση κλασικών παραγόντων του συστήματος ρενίνης αγγειοτενσίνης (RAS) στο ηπατικό παρέγχυμα. Αυτό το ηπατικό σύστημα RAS έχει πληθώρα επιδράσεων στην κυτταρική ανάπτυξη, απόπτωση, ορμονική έκφραση, καθώς και στη προφλεγμονώδη ή προϊνωτική δράση. Έχει επίσης παρατηρηθεί, ότι η 91

92 δραστηριότητα της ρενίνης πλάσματος καθώς και τα επίπεδα αλδοστερόνης είναι αυξημένα στην ηπατική κίρρωση, ιδίως σε ασθενείς με ηπατονεφρικό σύνδρομο. Εκτός από την επίδραση στην αγγειοσύσπαση, η ενεργοποίηση των υποδοχέων ΑΤ1 (Angiotensin receptor Type 1) από την αγγειοτενσίνη II επάγει τη σύσπαση και τον πολλαπλασιασμό των HSC. Η επίδραση της αγγειοτενσίνης ΙΙ στην συσταλτότητα των HSC μπορεί να συγκριθεί μόνο με την ενδοθηλίνη 2. Επίσης, τα ίδια τα ενεργοποιημένα HSC μπορούν να παράγουν αγγειοτενσίνη ΙΙ και έτσι οδηγούν σε επιμέρους αύξηση της λειτουργίας του συστήματος RAS, με τελικό αποτέλεσμα την αύξηση του οξειδωτικού stress, την προσέλκυση φλεγμονωδών κυττάρων και την ανάπτυξη ινώσεως ( ). Τα τελευταία έτη έχουν γίνει μελέτες που ανέδειξαν το ρόλο της θεραπευτικής χρήσης διαφόρων αναστολέων του συστήματος RAS στην εξέλιξη της ηπατικής ίνωσης. Σύμφωνα με μία πρόσφατη μετα-ανάλυση της τρέχουσας βιβλιογραφίας, ανευρέθηκαν 4 μελέτες με συνολικά 210 ασθενείς που αναδεικνύουν τη δυνατότητα υποστροφής του σταδίου της ίνωσης μετά από αναστολή του συστήματος ρενίνης-αγγειοτενσίνης. Σύμφωνα με τη συγκεκριμένη μελέτη, η κατηγορία αυτή των φαρμάκων είναι καλά ανεκτή στους ηπατοπαθείς ασθενείς. Ωστόσο, χρειάζονται περισσότερες τυχαιοποιημένες διπλές τυφλές μελέτες για να μπορέσουν να επιβεβαιώσουν τα ανωτέρω αποτελέσματα (118). ε) Ανοσοποιητικό σύστημα και ίνωση Bασικό χαρακτηριστικό της χρόνιας ηπατικής νόσου είναι η παρουσία παρατεταμένης φλεγμονώδους διαδικασίας στις περιοχές της ίνωσης και της 92

93 αναδόμησης της στρωματικής ουσίας. Τα μακροφάγα, όπως προαναφέρθηκε, διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην έναρξη της διαδικασίας της ινώσεως αλλά και στην αποδόμηση αυτής. Επίσης, τα ίδια τα ηπατικά αστεροειδή κύτταρα μπορούν να δράσουν ως αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα, παρουσιάζοντας αντιγόνα σε MHC-1 και MHC-2 Τ κύτταρα καθώς και σε CD1 NK κύτταρα. Με το μηχανισμό αυτό προκαλείται μία αμφίδρομη επικοινωνία μεταξύ ενεργοποιημένων HSC, ινοβλαστών και των Τ κυττάρων, η οποία με τη σειρά της οδηγεί σε φαύλο κύκλο επαγωγής της φλεγμονώδους δραστηριότητας (119). στ) Γενετικοί πολυμορφισμοί που επηρεάζουν την ίνωση Την τελευταία δεκαετία έχουν μελετηθεί διάφοροι γενετικοί πολυμορφισμοί που θα μπορούσαν να επηρεάσουν την πρόοδο της ηπατικής ινώσεως. Η θεωρία της γενετικής επιρροής μπορεί να εξηγήσει τις διαφορές που παρατηρούνται στην πρόοδο και εξέλιξη της ηπατικής ινώσεως σε άτομα στα οποία επιδρούν παρόμοιοι περιβαλλοντικοί παράγοντες. Στον πίνακα 7 φαίνονται ορισμένοι από τους επιβεβαιωμένους γενετικούς παράγοντες που επιδρούν στις διάφορες ηπατικές παθήσεις (120). 93

94 Γονίδιο Λειτουργία Αποτέλεσμα στην ίνωση Ηπατική νόσος* ΙL-10 Αντιφλεγμονώδης Αύξηση ALD TGF-β1 Προϊνωτική Αύξηση HCV IL-1β Προφλεγμονώδης Αύξηση ALD/PBC Υποδοχέας IL-1 Προφλεγμονώδης Αύξηση ALD/PBC Αγγειοτενσινογόνο Προϊνωτική Αύξηση HCV ADH Μεταβολισμός Αντικρουόμενα ALD αιθανόλης δεδομένα ALDH Μεταβολισμός Αντικρουόμενα ALD αιθανόλης δεδομένα CYP2E1 Μεταβολισμός Αντικρουόμενα ALD αιθανόλης δεδομένα Απλότυποι HLA-II Ανοσιακή απάντηση Ποικίλο HCV/PBC/AIH TNF-α Προφλεγμονώδης Αύξηση HCV/PBC/ALD Μικροσωμιακή Μεταβολισμός Αύξηση HCV υδροξυλάση φαρμάκων HFE Απορρόφηση σιδήρου Αντικρουόμενα HCV/NASH δεδομένα CD14 Υποδοχέας LPS Αύξηση ALD CTLA-4 Ανοσιακή απάντηση Αύξηση ALD MnSOD Αντιοξειδωτική Αύξηση ALD TAP2 Ανοσιακή απάντηση Αύξηση ALD ApoE Είσοδος ιού στο κύτταρο Αύξηση HCV Πίνακας 7. Γενετικοί πολυμορφισμοί που επηρεάζουν την εξέλιξη της ηπατικής ινώσεως (120). * ALD: Αλκοολική Νόσος Ήπατος, HCV: Ηπατίτιδα C, PBC: Πρωτοπαθής Χολική Κίρρωση, AIH: Αυτοάνοση Ηπατίτιδα, NASH: Μη Αλκοολική Στεατοηπατίτιδα 94

95 4. ΠΑΘΟΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΥΠΟΣΤΡΟΦΗΣ ΤΟΥ ΣΤΑΔΙΟΥ ΤΗΣ ΗΠΑΤΙΚΗΣ ΙΝΩΣΗΣ Η ηπατική ίνωση ήταν αναγνωρισμένη, σχεδόν σε ολόκληρη την ιστορία της ηπατολογίας, ως μία μονόδρομη και μη αναστρέψιμη διαδικασία. Παρά το καθιερωμένο δόγμα, υπήρχαν και ερευνητές όπως οι Perez-Tamayo το 1979 που προέβλεψαν τη δυνατότητα αναστροφής της ηπατικής ινώσεως μέσω της αυξημένης δραστηριότητας των κολλαγενασών στην αποδόμηση των μορίων της εξωκυττάριας ουσίας (121). Οι πρώτοι ερευνητές που παρατήρησαν πειραματικά τη δυνατότητα υποστροφής του σταδίου της ηπατικής ινώσεως ήταν οι Cameron και Karunarate το 1936 (122), οι οποίοι μετά τη χορήγηση CCl4 προκάλεσαν κίρρωση του ήπατος σε επίμυες. Οι ανωτέρω ερευνητές παρατήρησαν ότι η άρση της χορήγησης CCl4 οδηγούσε σε βελτίωση της αρχιτεκτονικής του ηπατικού παρεγχύματος. Την πρώτη αυτή παρατήρηση επιβεβαίωσαν 20 έτη αργότερα το 1957 οι Jacques και Mc Adams (123), οι οποίοι παρατήρησαν υποστροφή του σταδίου της ίνωσης του ήπατος σε επίμυες με χολική κίρρωση μετά από άρση της απολίνωσης του χοληδόχου πόρου. Κατά τη διάρκεια της ηπατικής βλάβης τα ηπατικά αστεροειδή κύτταρα ενεργοποιούνται και ασκούν την ινωτική τους δράση, όπως ήδη προαναφέρθηκε σε προηγούμενα εδάφια. Μετά την αποδρομή του αιτιολογικού παράγοντα, τα ηπατικά αστεροειδή κύτταρα αποπίπτουν και η ενεργοποίηση των αναστολέων των μεταλλοπρωτεϊνασών TIMP ελαττώνεται, επιτρέποντας στις μεταλλοπρωτεϊνάσες MMPs να αυξήσουν την ινολυτική τους δραστηριότητα, μία διαδικασία που ονομάζεται ιστική αναδόμηση (remodeling). (124) 95

96 Απόπτωση των αστεροειδών κυττάρων συμβαίνει και στο φυσιολογικό ηπατικό παρέγχυμα. Κατά τη διάρκεια του ηπατικού τραύματος η απόπτωση αναστέλλεται από διάφορους χυμικούς παράγοντες και στοιχεία της εξωκυττάριας ουσίας. Επιπλέον, τα μεταμορφωμένα αστεροειδή κύτταρα εκφράζουν υποδοχείς Fas στην επιφάνειά τους και πιθανολογείται ότι η απόπτωση διαμεσολαβείται από ενεργοποιημένα για το Fas σύνδεσμο αντισώματα. Ένας ακόμη υποδοχέας θανάτου που εκφράζεται στα ηπατικά αστεροειδή κύτταρα είναι ο υποδοχέας των νευροτροφινών (nerve growth factor receptor, NGFR), ο οποίος όταν είναι ενεργοποιημένος επάγει την αποπτωτική διαδικασία. Για να επιτευχθεί η απόπτωση του αστεροειδούς κυττάρου, πρέπει τα σήματα θανάτου να υπερτερούν σε σχέση με τους παράγοντες επιβίωσης. Έχει ανευρεθεί ότι οι IGF-I (Insulin-like Growth Factor) και TNF-α επάγουν την επιβίωση του αστεροειδούς κυττάρου μέσω του PI 3- K/c-Akt καθώς και του NF-kB μονοπατιού, αντιστοίχως (βλ. Εικόνα 9) (75, 125). Σημαντικό ρόλο στη μείωση της ηπατικής ίνωσης παίζουν τα μονοκύτταρα/μακροφάγα. Τα μακροφάγα του ήπατος προέρχονται από τα κύτταρα Kupffer καθώς και από κυκλοφορούντα κύτταρα προερχόμενα από το μυελό των οστών. Η αναστολή της χημειοτακτικής πρωτεΐνης των μονοκυττάρων οδηγεί σε μειωμένα επίπεδα ηπατικής φλεγμονής μετά από οξεία βλάβη, καθώς επίσης και σε μείωση της ίνωσης και του αριθμού των μυοϊνοβλαστών μετά από ηπατική βλάβη με CCl4. Συνοπτικά μπορεί να αναφερθεί, ότι ο ρόλος των μακροφάγων στην ηπατική ίνωση είναι διττός. Κατά το στάδιο της προόδου της ηπατικής ινώσεως, τα μακροφάγα παράγουν ουσίες που επάγουν τη δραστηριότητα των ηπατικών αστεροειδών κυττάρων (TGF-β, PDGF), οδηγώντας έτσι στη δημιουργία μυοϊνοβλαστών. Κατά τη φάση της 96

97 αποδόμησης της ίνωσης του ήπατος, τα μακροφάγα επάγουν τα σήματα απόπτωσης των αστεροειδών κυττάρων (μέσω έκφρασης των οδών θανάτου / TRAIL ligand) και ασκούν άμεση δράση στην αποδόμηση της εξωκυττάριας ουσίας με την επαγωγή της δράσης των μεταλλοπρωτεϊνών (MMP-13) (125). Εικόνα 9: Λειτουργίες, χαρακτηριστικά & φαινότυποι των ηπατικών αστεροειδών κυττάρων στο φυσιολογικό καθώς και στο ινωτικό ήπαρ. Καθώς η ηπατική βλάβη αποδράμει, τα ενεργοποιημένα αστεροειδή κύτταρα περιορίζονται με τρεις τρόπους: απόπτωση, διαδικασία γήρανσης ή μετατροπή τους σε ανενεργό μορφή. Τα γηρασμένα αστεροειδή κύτταρα καθαρίζονται μέσω επαγόμενου από τα ΝΚ κύτταρα κυτταρικό θάνατο, ενώ τα ανενεργά αστεροειδή κύτταρα παραμένουν ως «φύλακες» για να αντιδράσουν σε μελλοντική ηπατική βλάβη (126). Πηγή: Τροποποιημένο από Lee YA et al. Pathobiology of liver fibrosis: a translational success story. Gut Όπως προαναφέρθηκε, σημαντικό ρόλο στην υποστροφή της ίνωσης διαδραματίζουν οι μεταλλοπρωτεϊνάσες με τους αναστολείς αυτών. Έχει 97

98 παρατηρηθεί ότι η έκφραση του MMP-13 είναι σημαντικά αυξημένη στη φάση της μείωσης της ηπατικής ίνωσης. Κύτταρα θετικά για το MMP-13 παρατηρήθηκαν μεταξύ των ινωδών διαφραγμάτων που παρουσιάζουν υποστροφή. Άλλες μελέτες έδειξαν αύξηση του MMP-2 την ημέρα 3 και 7 μετά από την άρση δράσεως του CCl4. Τέλος το επίπεδο του TIMP-1 mrna αυξάνεται κατά την αρχική φάση χορήγησης του CCl4 και σταδιακά μειώνεται και παραμένει σε χαμηλά επίπεδα κατά τη φάση υποστροφής της ίνωσης του ήπατος (124). Στην εικόνα 10 φαίνεται σχηματικά η γονιδιακή έκφραση των μεταλλοπρωτεϊνασών κατά τη φάση επαγωγής αλλά και τη φάση υποστροφής της ηπατικής ίνωσης. Εικόνα 10. Γονιδιακή έκφραση των επιπέδων των MMPs και των TIMPs στη φάση επαγωγής της ηπατικής ίνωσης (αριστερά) καθώς και στη φάση υποστροφής αυτής (δεξιά) (124). Πηγή: Τροποποιημένο από Okazaki I et al. Reversibility of hepatic fibrosis: from the first report of collagenase in the liver to the possibility of gene therapy for recovery. The Keio journal of medicine

99 Τέλος, σημαντικές μελέτες για τους παθοφυσιολογικούς μηχανισμούς στην υποστροφή της ίνωσης πραγματοποιήθηκαν και στο Α.Π.Θ. από τον κ. Γερμανίδη και συνεργάτες. Συγκεκριμένα παρατηρήθηκε καταστολή του FoxP3 καθώς και των κυτοκινών IL-10 και TGF-β σε ασθενείς με καταστολή του ιικού φορτίου του HBV σε σχέση με ασθενείς που εμφάνιζαν ενεργό νόσο. Τελικό αποτέλεσμα ήταν η μείωση ειδικών Τ-ρυθμιστικών κυττάρων (FoxP3+Treg) καθώς και των κυτταροτοξικών Τ-κυττάρων (CTL) (127). Εικόνα 11. Η ίδια ομάδα ερευνητών ανέδειξε επιπλέον το ρόλο του TGF-β στη διαδικασία της ίνωσης. Η έκφραση του TGF-β είναι αυξημένη σε ασθενείς με ενεργό ΧΗΒ, ενώ η αναστολή αυτής μέσω της ενίσχυσης του SMAD7 παρατηρήθηκε κατά τη φάση υποστροφής της ίνωσης μετά από παρατεταμένη θεραπεία (128) (Εικόνα 12). 99

100 Εικόνα 11. Ανοσοκατασταλτικοί μηχανισμοί στην ενεργό ΧΗΒ καθώς και η υποστροφή αυτών. Στην ενεργό ΧΗΒ, η έκφραση των FAS-L και PD-L1 είναι αυξημένη, ενώ παρατηρείται καταστολή του TRAIL. (i) HBsAg-ειδικά CTL εκκρίνουν κυτοκίνες (IL-2 & IFN-γ) που ενισχύουν την απόπτωση των ηπατοκυττάρων τα οποία εκκρίνουν το HBsAg. (ii) Η απόπτωση καθώς και η έκκριση προφλεγμονωδών κυτοκινών επάγει τη χρόνια φλεγμονή καθώς και την έκκριση φλεγμονωδών παραγόντων. Το HBsAg εκλύεται από τα ηπατοκύτταρα που έχουν υποστεί απόπτωση. (iii) Ο πληθυσμός των Treg κυττάρων αυξάνεται, με αποτέλεσμα τη μη ειδική καταστολή των CTL. (iv) Τα κυκλοφορούντα Treg κύτταρα μαζί με τα NK και τα MDSX κύτταρα μεταναστεύουν προς το πεδίο της φλεγμονής συμβάλλοντας σε ειδικές για τον HBV ανοσιακές απαντήσεις. (v) Τα CTL έχουν έναν ανεργικό φαινότυπο που χαρακτηρίζεται από ενίσχυση της έκφρασης του PD-1. (vi) Τα εκφράζοντα το HBsAg APC κύτταρα επάγουν τη γέννεση ειδικών για τον HBV Treg κυττάρων και επιλεκτικά καταστέλλουν τα ειδικά για τον HBV CTL. (vii) Τα κυκλοφορούντα HBV-ειδικά Treg και HBsAg-APC είναι ικανά να επάγουν ανοχή για το HBsAg, η οποία καθυστερεί την κάθαρση του HBV. Κατά τη φάση της ιολογικής καταστολής, παρατηρείται καταστολή της έκφρασης του FAS-L και του PD-L1, ενώ η έκφραση του TRAIL είναι ενισχυμένη. Τα CD4+FoxP3- Τ κύτταρα μπορεί να παραμείνουν ή να ενισχυθούν κατά τη φάση αποδρομής της φλεγμονής. (129) Πηγή: Τροποποιημένο από Chaudhary B, Elkord E. Downregulation of immunosuppressive environment in patients with chronic HBV hepatitis on maintained remission. Front Immunol

101 Εικόνα 12. Ο TGF-β αυξάνει την έκφραση των πρωτεϊνών της εξωκυττάριας ουσίας (ECM), περιλαμβανομένου του κολλαγόνου και των ιντεγκρινών. O TGF-β προσδένεται στον υποδοχέα TGFβRII, ο οποίος ενεργοποιεί με τη σειρά του τους SMAD2 και SMAD3 μεταβιβαστές. Ο ενεργοποιημένος SMAD2 ή SMAD3 σχηματίζει ετεροδιμερή με τον SMAD4 και μετατοπίζεται στον πυρήνα όπου επάγει την έκφραση των γονιδίων της ECM. Η παρατεταμένη έκφραση αυτών των γονιδίων από τον TGFβ στα ενεργοποιημένα ηπατικά αστεροειδή κύτταρα καθώς και στους μυοϊνοβλάστες οδηγεί στη συσσώρευση κολλαγόνου και στην πρόοδο της ηπατικής ίνωσης, όπως παρατηρήθηκε σε ασθενείς με ενεργό ΧΗΒ χωρίς θεραπεία. Αυτή η διαδικασία μπορεί να ανασταλεί μέσω της αυξημένης έκφρασης του SMAD7, όπως διαπιστώθηκε στους ασθενείς με ΧΗΒ υπό μακροχρόνια καταστολή του ιικού φορτίου με αντιική αγωγή καθώς και σε ασθενείς με λιπώδη νόσο του ήπατος, παρά την αυξημένη έκφραση του TGFβ και των ενδοκυτταρίων μεσολαβητών αυτού. (128) Πηγή: Τροποποιημένο από Argentou N, Germanidis G, Hytiroglou P, Apostolou E, Vassiliadis T, Patsiaoura K, et al. TGF-beta signaling is activated in patients with chronic HBV infection and repressed by SMAD7 overexpression after successful antiviral treatment. Inflamm Res

102 102

103 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 103

104 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Α) ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ 106 Β) ΥΛΙΚΟ ΜΕΘΟΔΟΣ ΕΠΙΛΟΓΗ ΑΣΘΕΝΩΝ ΚΡΙΤΗΡΙΑ ΕΙΣΟΔΟΥ ΚΡΙΤΗΡΙΑ ΑΠΟΚΛΕΙΣΜΟΥ ΠΛΗΘΥΣΜΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ ΜΕΤΡΗΣΕΙΣ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΤΩΝ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ 110 ΒΙΟΧΗΜΙΚΟΣ & ΟΡΟΛΟΓΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ 110 ΑΠΕΙΚΟΝΙΣΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ 113 ΙΣΤΟΛΟΓΙΚΗ ΕΙΚΟΝΑ 115 Γ) ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ 121 Δ) ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΠΛΗΘΥΣΜΟΥ ΜΕΛΕΤΗΣ ΙΣΤΟΛΟΓΙΚΗ ΑΠΑΝΤΗΣΗ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΜΕ ΠΡΟΧΩΡΗΜΕΝΟ ΣΤΑΔΙΟ ΙΝΩΣΗΣ

105 4. ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΜΕ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΑΝΤΙΣΤΑΣΗΣ ΣΤΗΝ ΑΝΤΙΙΚΗ ΑΓΩΓΗ ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ ΠΟΥ ΣΥΣΧΕΤΙΖΟΝΤΑΙ ΜΕ ΤΗ ΒΕΛΤΙΩΣΗ ΤΟΥ ΣΤΑΔΙΟΥ ΤΗΣ ΙΝΩΣΗΣ 137 Ε) ΣΥΖΗΤΗΣΗ 139 ΣΤ) ΠΕΡΙΛΗΨΗ 150 Ζ) SUMMARY 152 Η) ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ 155 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

106 Α) ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ Τα νεότερα, ισχυρά αντιικά φάρμακα έναντι του ιού της ηπατίτιδας Β έχει επιτρέψει στην πλειοψηφία των ασθενών με χρόνια ηπατίτιδα Β (ΧΗΒ) να επιτύχουν ιολογική και βιοχημική ύφεση. Όσοι ασθενείς με ΧΗΒ έχουν ένδειξη για θεραπεία λαμβάνουν αντιική θεραπεία είτε με νουκλεοτιδικά και νουκλεοσιδικά ανάλογα, είτε με πεγκυλιωμένη ιντερφερόνη-α. Ωστόσο, η επίδραση της αντιικής αγωγής στην εξέλιξη της ίνωσης του ήπατος και ιδίως στην υποστροφή αυτής με την πάροδο του χρόνου δεν είναι ακόμα αρκετά μελετημένη. Σε πειραματικό επίπεδο (απολίνωση χοληδόχου πόρου σε επίμυες) (123), καθώς επίσης και στις μελέτες έγκρισης των σύγχρονων αντιικών φαρμάκων (130), φαίνεται ότι ο έλεγχος του ιικού φορτίου οδηγεί σε αναστολή της εξέλιξης της ίνωσης του ήπατος ή ακόμη και σε υποστροφή αυτής. Η κύρια υπόθεση της παρούσας διατριβής είναι ότι η καταστολή του πολλαπλασιασμού του ιού της ηπατίτιδας Β, υπό την επίδραση αντιικής αγωγής, ακόμη και σε ασθενείς με προχωρημένη ίνωση ή κίρρωση, επιδρά ανασταλτικά στην εξέλιξη της ίνωσης και μάλιστα κινητοποιεί τη διαδικασία της υποστροφής αυτής στο ήπαρ. Συγκεκριμένα, επιχειρείται να μελετηθούν συστηματικά δύο ιδιαίτερα σημαντικές, από κλινικής απόψεως, υποθέσεις: α) Μείωση του κινδύνου αναπτύξεως κιρρώσεως σε ασθενείς με έντονη ίνωση εφόσον επιτευχθεί εμμένουσα ανταπόκριση στην αντιική θεραπεία. β) Υποστροφή της ίνωσης ακόμη και σε προχωρημένα στάδια της νόσου. 106

107 Με την υπόθεση αυτή επιχειρείται να καταρριφθεί η καθιερωμένη, ωστόσο ξεπερασμένη πλέον από τις πρόσφατες θεραπευτικές εξελίξεις, αντίληψη ότι η ίνωση του ήπατος είναι μία μη αναστρέψιμη διαδικασία. 107

108 Β) ΥΛΙΚΟ ΜΕΘΟΔΟΣ Η υλοποίηση της μελέτης ακολούθησε τις εξής φάσεις: Φάση 1: Επιλογή ασθενών, διαμόρφωση κριτηρίων ένταξης Φάση 2: Συλλογή ιστολογικού υλικού (βιοψία ήπατος) πριν και μετά από τη θεραπεία Φάση 3: Σύγκριση των βιοψιών ήπατος από τον ίδιο παθολογοανατόμο (Π.Χ.) Φάση 4: Συλλογή και επεξεργασία των δεδομένων της έρευνας Ανάλυση Αποτελέσματα Φάση 5: Συμπεράσματα Β1. Επιλογή Ασθενών Ο πληθυσμός στόχος της μελέτης προέρχεται από τους ασθενείς που παρακολουθούνται στα εξωτερικά ηπατολογικά ιατρεία της Δ Παθολογικής Κλινικής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης. Αναλύθηκαν τα ιστολογικά αποτελέσματα ασθενών που υποβλήθηκαν σε βιοψία ήπατος μεταξύ του Ιανουαρίου 1998 και του Δεκεμβρίου Οι ασθενείς που εντάχθηκαν στην μελέτη πληρούσαν τα ακόλουθα κριτήρια: Β2. Κριτήρια Εισόδου Ασθενείς άνδρες ή γυναίκες άνω των 16 ετών. Θετικό HBsAg στον ορό (η μελέτη περιλαμβάνει HBeAg θετικούς και αρνητικούς ασθενείς). Αντιική θεραπεία εναντίον της χρόνιας ηπατίτιδας Β ανεξαρτήτως μορφής [νουκλεοτ(σ)ιδικά ανάλογα, ιντερφερόνη]. 108

109 Ύπαρξη βιοψίας ήπατος πριν την έναρξη ή σε μικρό χρονικό διάστημα από την έναρξη της αντιικής θεραπείας (±12 εβδομάδες). Κλινική ένδειξη ή αποδοχή του ασθενούς για διενέργεια δεύτερης βιοψίας ήπατος. Β3. Κριτήρια Αποκλεισμού Συλλοίμωξη με τον ιό της ηπατίτιδας C (Hepatitis C Virus, HCV). Συλλοίμωξη με τον ιό της ηπατίτιδας δέλτα (Hepatitis D Virus, HDV). Συλλοίμωξη με τον ιό HIV (Human Immunodeficiency Virus). Άνδρες με καθημερινή χρήση 30g αιθανόλης και γυναίκες με καθημερινή χρήση 20g αιθανόλης. Συνυπάρχουσα στεατοηπατίτιδα στην βιοψία του ήπατος (εξαιρούνται οι ήπιες μορφές). Συνυπάρχουσα ηπατική νόσος που μπορεί να προκαλέσει ίνωση του ήπατος. Β4. Πληθυσμός Μελέτης Η μελέτη περιλαμβάνει ασθενείς του εξωτερικού ηπατολογικού ιατρείου της Δ Παθολογικής Κλινικής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης. Η διάρκεια παρακολούθησης ήταν από 1 έως 12 έτη. Συλλέχθηκαν στοιχεία από όσους ασθενείς προσέρχονται για πρώτη φορά αλλά και από ασθενείς που ήδη παρακολουθούνταν στα ιατρεία του τμήματος. Η μελέτη περιελάμβανε προοπτική και αναδρομική μελέτη των φακέλων των ασθενών, οι οποίοι είχαν χρόνια ηπατίτιδα Β, τεκμηριωμένη με βιοψία ήπατος και θετικούς 109

110 ορολογικούς δείκτες και ελάμβαναν αντιική θεραπεία, με σκοπό την καταγραφή των παρακάτω: 1. Την κλινική πορεία των ασθενών με χρόνια ηπατίτιδα Β ή HBV κίρρωση. 2. Την καταγραφή της αντιικής θεραπείας που ελάμβαναν στο διάστημα της παρακολούθησης. 3. Την καταγραφή παραμέτρων, όπως της συνήθους ηπατικής βιοχημείας, της έκφρασης των ορολογικών δεικτών, της ιαιμίας και της ανάπτυξης αντοχής στην αντιική θεραπεία. 4. Τον απεικονιστικό έλεγχο του ήπατος με υπερήχους, καθώς και τη μη επεμβατική εκτίμηση της ινώσεως του ηπατικού παρεγχύματος με τη μέθοδο της ελαστογραφίας (FibroScan). 5. Ιστολογική μελέτη σε βιοψίες ήπατος α) νεοεισερχομένων ασθενών με χρόνια HBV λοίμωξη ή HBV κίρρωση, β) μετά από μακροχρόνια αντιική θεραπεία. Η ιστολογική μελέτη περιλάμβανε την καταγραφή της βαθμοποίησης και σταδιοποίησης της ηπατικής νόσου, ανοσοϊστοχημικούς δείκτες για την ύπαρξη του HBsAg και του HBcAg στα ηπατοκύτταρα, καθώς και τη μέτρηση του βαθμού στεάτωσης των ηπατοκυττάρων. Β5. Μετρήσεις Αξιολόγηση των Εξεταστικών Μεθόδων ΒΙΟΧΗΜΙΚΟΣ & ΟΡΟΛΟΓΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ Από τον βιοχημικό έλεγχο του ήπατος μετρήθηκαν οι ηπατικές τρανσαμινάσες (AST, ALT), η αλκαλική φωσφατάση (ALP) και η γάμμα γλουταμυλτρανσφεράση (γ-gt). Ο εργαστηριακός έλεγχος της ηπατικής λειτουργίας έγινε με την μέτρηση της χολερυθρίνης (ολική & άμεση), του χρόνου 110

111 προθρομβίνης (PT) και του INR, τη μέτρηση της αλβουμίνης καθώς και τη μέτρηση των αιμοπεταλίων ως έμμεσο δείκτη για την ανάπτυξη πυλαίας υπερτάσεως. Για τις ανάγκες της παρούσας μελέτης, η λοίμωξη από τον ιό HBV διαγνώσθηκε με ορολογικές και ιολογικές μεθόδους. Όλοι οι ασθενείς ελέγχθηκαν πριν την έναρξη της θεραπείας για τους ακόλουθους ορολογικούς δείκτες της ηπατίτιδας Β: HBsAg, antihbs, antihbc, HBeAg και antihbe. Οι ασθενείς με θετικό HBeAg παρακολουθούνταν περιοδικα κατά τη διάρκεια της μελέτης για την επίτευξη ορομετατροπής του e αντιγόνου. Όλοι οι ασθενείς κατά τη διενέργεια της βιοψίας ελέγχου, ελέγχθηκαν για πιθανή ορομετατροπή του αντιγόνου επιφανείας. Η μέτρηση των ορολογικών δεικτών έγινε με τη χρήση της τεχνολογίας Microparticle Enzyme Immunoassay (MEIA). Η διάγνωση της ενεργού λοίμωξης καθώς και της ανταπόκρισης στη θεραπεία βασίστηκε εκτός από τις ορολογικές δοκιμασίες και στον ποσοτικό προσδιορισμό του ιικού φορτίου (HBV-DNA) στον ορό ή το πλάσμα, που είναι η πιο άμεση και αξιόπιστη μέτρηση του αναδιπλασιασμού του ιού (131). Ο ποσοτικός προσδιορισμός του ιικού φορτίου (HBV-DNA) έγινε με το Cobas Amplicor HBV test (Roche Molecular Systems). Η ευαισθησία και η αποτελεσματικότητα της μεθόδου είναι πολύ υψηλή αφού μπορεί να ανιχνεύσει μέχρι και 6 IU ανά ml. Τα κυρίως στάδια της διαδικασίας είναι (132): 1. Προετοιμασία δείγματος: Πραγματοποιείται λύση των σωματιδίων του ιού HBV μέσω επώασης σε υψηλή θερμοκρασία με πρωτεάση και χαοτροπικό ρυθμιστικό διάλυμα λύσης/δέσμευσης που απελευθερώνει τα νουκλεϊκά οξέα και προστατεύει το απελευθερωμένο HBV DNA από DNases σε πλάσμα και ορό. Σε κάθε δείγμα εισάγεται ένας γνωστός 111

112 αριθμός μορίων DNA του προτύπου ποσοτικοποίησης HBV με το αντιδραστήριο λύσης. Στη συνέχεια, προστίθεται ισοπροπανόλη στο μίγμα λύσης και ακολουθεί φυγοκέντρηση αυτού. 2. Επιλογή Στόχου: Χρησιμοποιούνται εκκινητές ενίσχυσης PCR που καθορίζουν μια αλληλουχία εντός της προπυρηνικής/πυρηνικής περιοχής υψηλής διατήρησης του γονιδιώματος HBV με βάση τις οδηγίες του κατασκευαστή. 3. Ενίσχυση Στόχου: Το μίγμα αρχικά θερμαίνεται για την αποδιάταξη του κυκλικού DNA HBV και του DNA του προτύπου ποσοτικοποίησης HBV. Καθώς το μίγμα ψύχεται, οι εκκινητές υβριδίζονται στο DNA-στόχο. Έπειτα με τη βοήθεια της Ζ05 DNA Πολυμεράσης, την παρουσία Mn 2+ και πλεονάσματος τριφωσφορικών δεοξυνουκλεοτιδίων (dntps) επεκτείνονται οι υβριδισμένοι εκκινητές και δημιουργείται ένα δίκλωνο μόριο DNA, που ονομάζεται κλώνος. Η ανωτέρω διαδικασία επαναλαμβάνεται αυτόματα για έναν καθορισμένο αριθμό κύκλων. 4. Επιλεκτική Ενίσχυση: Επιτυγχάνεται με τη χρήση του ενζύμου AmpErase (ουρακίλη-n-γλυκοζυλάση) και της τριφωσφορικής δεοξυουριδίνης (dutp). Η δεοξυουριδίνη δεν υπάρχει στο φυσικό DNA, αλλά υπάρχει πάντοτε στον κλώνο (amplicon). Η δεοξυουριδίνη καθιστά το μολυσματικό κλώνο ευαίσθητο στη διάσπαση από το ένζυμο AmpErase πριν από την ενίσχυση του DNA στόχου. 5. Ποσοτικοποίηση του HBV-DNA: Όσο υψηλότερη είναι η συγκέντρωση τίτλου HBV ενός δείγματος, τόσο συντομότερα αυξάνεται ο φθορισμός του ιχνηθέτη HBV πάνω από το αρχικό επίπεδο φθορισμού. Στη συνέχεια, με τη βοήθεια ειδικών για την παρτίδα σταθερών 112

113 βαθμονόμησης, υπολογίζεται η τιμή τίτλου για τα δείγματα και τους ορούς με βάση τις τιμές Ct του HBV DNA και του DNA του Προτύπου Ποσοτικοποίησης HBV. Η μέτρηση του HBV DNA πραγματοποιήθηκε στο Ανοσολογικό Εργαστήριο του Ιπποκράτειου Νοσοκομείου Θεσσαλονίκης. ΑΠΕΙΚΟΝΙΣΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ Στους περισσότερους ασθενείς διενεργήθηκε υπερηχογράφημα ήπατος για την ανίχνευση ακτινολογικών σημείων κιρρώσεως του ήπατος, πιθανή σπληνομεγαλία ή παρουσία ασκίτη. Κατά τη διενέργεια της βιοψίας ελέγχου, σε ορισμένους ασθενείς διενεργήθηκε επίσης εκτίμηση της ίνωσης του ήπατος με τη μη επεμβατική μέθοδο της ελαστογραφίας του ήπατος (FibroScan). Για νεοεισερχόμενους ασθενής στη μελέτη διενεργήθηκε FibroScan πριν από κάθε βιοψία. Η μέθοδος της ελαστογραφίας του ήπατος (FibroScan; Echosens, Paris, France) έχει προταθεί και αξιολογηθεί για τη μέτρηση της ηπατικής σκληρότητας (liver stiffness) (133). Η αρχή της μεθόδου συνοπτικά έχει ως εξής: ένας πομπός υπερήχων τοποθετείται παράλληλα στον άξονα του δονητή. Κατ αρχάς παράγονται δονήσεις χαμηλής έντασης και συχνότητας από τον μετατροπέα και επάγουν ένα ελαστικό κύμα διάτμησης που διαδίδεται στον υποκείμενο ιστό. Στη συνέχεια, ένας παλμικός υπέρηχος χρησιμοποιείται για την παρακολούθηση της διάδοσης του κύματος και για τη μέτρηση της ταχύτητάς του, η οποία έχει άμεση συσχέτιση με τη σκληρότητα του ιστού: όσο σκληρότερος είναι ο ιστός, τόσο γρηγορότερα μεταδίδεται το κύμα διάτμησης. Η ελαστογραφία ήπατος μετράει τη σκληρότητα του ηπατικού παρεγχύματος 113

114 σε όγκο περίπου ενός κυλίνδρου 1cm πλάτους και 4cm μήκους, 25mm έως 65mm κάτω από την επιφάνεια του δέρματος. Ο όγκος αυτός είναι τουλάχιστον 100 φορές μεγαλύτερος από το δείγμα της ηπατικής βιοψίας και κατά αυτόν το τρόπο είναι πιο αντιπροσωπευτικός (134). Η μέθοδος είναι ανώδυνη, γρήγορη (<5 λεπτά) και εύκολα εφαρμόσιμη. Τα αποτελέσματα είναι άμεσα διαθέσιμα, εκφράζονται σε kilopascals (kpa) και αντιστοιχούν στη διάμεση τιμή δέκα επικυρωμένων μετρήσεων. Το εύρος τους είναι από 2,5 έως 75 kpa. Μετρήσεις σε μη ηπατοπαθείς ανέδειξαν τιμές γύρω στα 5.5 kpa (135). Η αξιοπιστία των αποτελεσμάτων βασίζεται σε δύο σημαντικούς παράγοντες: 1) το διατεταρτημοτιακό εύρος, που αντανακλά την μεταβλητότητα των εκτιμωμένων μετρήσεων και δεν πρέπει να ξεπερνά το 30% της μέσης τιμής και 2) το «ποσοστό επιτυχίας» που είναι η αναλογία του αριθμού των επιτυχημένων μετρήσεων σε σχέση με το συνολικό αριθμό των μετρήσεων και το οποίο πρέπει να είναι τουλάχιστον 60% (136). Η χρησιμότητα της ελαστογραφίας για την διάγνωση της προχωρημένης ίνωσης είναι καλά μελετημένη και σύμφωνα με τα αποτελέσματα μετααναλύσεων, το προτεινόμενο όριο για τη διάγνωση αυτής είναι τα 7,6 kpa ( ). Σε μία πρόσφατη μελέτη της κλινικής μας επιβεβαιώθηκε η εφαρμοσιμότητα του FibroScan σε ασθενείς με χρόνια ηπατίτιδα Β και μεταξύ άλλων αποδείχθηκε ότι τιμές χαμηλότερες των 7,7 kpa μπορούν να αποκλείσουν την παρουσία κίρρωσης του ήπατος (140). Τέλος, ο Marcellin et al απέδειξαν ότι η χρησιμοποίηση του ορίου των 7,2 kpa και των 11,0 kpa μπορούν να ξεχωρίσουν επίπεδα ίνωσης F>2 (AUC: 0,81) και F=4 (AUC: 0,93), αντιστοίχως (141). 114

115 ΙΣΤΟΛΟΓΙΚΗ ΕΙΚΟΝΑ Σε όλους τους ασθενείς της μελέτης διενεργήθηκαν δύο βιοψίες ήπατος. Η πρώτη βιοψία διενεργήθηκε κατά την έναρξη της θεραπείας και η επαναληπτική μετά από παρατεταμένη αντιική αγωγή. Οι βιοψίες ήπατος διενεργήθηκαν στη Δ Παθολογική Κλινική του Α.Π.Θ. στο Ιπποκράτειο Νοσοκομείο Θεσσαλονίκης. Κατά τη διενέργειά τους ο ασθενής τοποθετείται σε ύπτια θέση με το δεξί άνω άκρο κάτω από το κεφάλι του. Με τη μέθοδο της επίκρουσης αναγνωρίζονται τα όρια του ήπατος στο δεξιό πλευρικό τόξο και ύστερα από τοπική αναισθησία με χρήση διαλύματος ξυλοκαΐνης και μικρή εγκάρσια τομή του δέρματος του μεσοπλευρίου διαστήματος λαμβάνεται ηπατικός ιστός μετά την εισαγωγή ειδικής αναρροφητικής βελόνης ηπατικής βιοψίας. Χρησιμοποιήθηκε βελόνη τύπου Hepafix διαμέτρου 17G. Οι ασθενείς παρέμειναν στην Κλινική για διάστημα πέντε ωρών κατακεκλιμένοι. Το ιστολογικό δείγμα τοποθετείται έπειτα σε πλαστικό συλλέκτη με διάλυμα φορμόλης 10% και αποστέλλεται στο Παθολογοανατομικό Εργαστήριο, όπου πραγματοποιείται επεξεργασία που καταλήγει σε έγκλειση σε κύβο παραφίνης. Η ιστολογική εξέταση των δειγμάτων διενεργήθηκε στο Παθολογοανατομικό Εργαστήριο του Α.Π.Θ. Όλες οι βιοψίες, τόσο αυτές που έγιναν πριν την έναρξη της αντιικής αγωγής, όσο και οι επαναληπτικές αξιολογήθηκαν από τον ίδιο παθολογοανατόμο (Π.Χ.). Σε τομές παραφίνης έγιναν οι παρακάτω χρώσεις: αιματοξυλίνη-ηωσίνη, τριχρωμική Masson, ανοσοϊστοχημικές χρώσεις για το αντιγόνο επιφανείας (HBsAg) και το πυρηνικό αντιγόνο (HΒcAg). Κατά την ιστολογική εξέταση του ήπατος, τόσο πριν την έναρξη όσο και μετά από τη μακροχρόνια αντιική θεραπεία, μελετήθηκε το 115

116 στάδιο της νόσου, ο βαθμός της νεκροφλεγμονώδους δραστηριότητας, η στεάτωση και η παρουσία των αντιγόνων του ιού (HΒsAg και HBcAg) στα ηπατοκύτταρα. Η βαθμολόγηση των αλλοιώσεων της χρόνιας ηπατίτιδας γίνεται με διάφορα ημιποσοτικά συστήματα. Στον πίνακα 8 υπάρχει μία συνοπτική παρουσίαση αυτών (142). Η αιτιολογία της νόσου αποτελεί το κύριο κριτήριο για τις σύγχρονες ταξινομήσεις, σύμφωνα με τις οποίες η νόσος βαθμολογείται και σταδιοποιείται. Το σύστημα βαθμολόγησης της ενεργού δραστηριότητας της φλεγμονής που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα μελέτη ήταν η κατά Ishak et al τροποποίηση του συστήματος Knodell (143) (144). Για τη βαθμολόγηση αξιολογούνται η νέκρωση και η φλεγμονή, οι οποίες εκφράζονται ως HAI (Hepatitis Activity Index), όπως φαίνεται στους πίνακες 9 και 10 (145, 146). Για τη σταδιοποίηση της νόσου χρησιμοποιήθηκε το σύστημα METAVIR, λόγω της απλότητας και της αναπαραγωγιμότητάς του. Το σύστημα METAVIR σταδιοποιεί τη χρόνια ηπατίτιδα σε 5 στάδια (πίνακας 11) (147). Η στεάτωση εκτιμήθηκε ημιποσοτικά ανάλογα με το ποσοστό των ηπατοκυττάρων που περιείχαν σταγονίδια λίπους (κλίμακα 0 έως 3). Η παρουσία του αντιγόνου επιφανείας καθώς και του πυρηνικού αντιγόνου βαθμολογήθηκαν ημιποσοτικά με βάση το ποσοστό των ηπατοκυττάρων που περιείχαν τα αντίστοιχα αντιγόνα (κλίμακα 0 έως 3). Η επιλογή για την ανίχνευση των ανωτέρω αντιγόνων στα ηπατοκύτταρα γίνεται γιατί: 1) η παρουσία του HBsAg στα ηπατοκύτταρα είναι δείκτης χρονιότητας της HBV λοίμωξης, και 2) η παρουσία του HBcAg είναι δείκτης ενεργού κυτταρικού πολλαπλασιασμού, ειδικά όταν υπάρχει πληθώρα αυτού στο κυτταρόπλασμα όσο και στον πυρήνα του ηπατοκυττάρου (145). 116

117 Σημαντικός παράγοντας για τη μείωση του σφάλματος δειγματοληψίας (sampling error) στη σταδιοποίηση της ΧΗΒ αποτελεί το μέγεθος του δείγματος. Το σφάλμα δειγματοληψίας μπορεί να υποεκτιμήσει το στάδιο της ίνωσης στο 10-30% των δειγμάτων. Οι σύγχρονες συστάσεις, για τη σταδιοποίηση της χρόνιας ιογενούς ηπατίτιδας, προτείνουν δείγμα τουλάχιστον 20mm σε μήκος και 1.4mm σε διάμετρο, το οποίο περιλαμβάνει τουλάχιστον 11 πλήρη πυλαία διαστήματα (148). Στη δική μας μελέτη είχαμε ως στόχο το δείγμα να πληρεί τα ανωτέρω κριτήρια στις περισσότερες βιοψίες ή στην περίπτωση που δεν τα πληρούσε το μήκος της βιοψίας να είναι τουλάχιστον 15mm. 117

118 Σύστημα βαθμολόγησης Knodell et al, 1981 (HAI) Στοιχεία του συστήματος Περιπυλαία φλεγμονή, με ή χωρίς γεφυροποιό νέκρωση Ενδολόβια εκφύλιση και εστιακή νέκρωση Φλεγμονώδης διήθηση πυλαίων διαστημάτων Ίνωση Scheuer, 1991 Δραστηριότητα πυλαίας/περιπυλαίας φλεγμονώδους επεξεργασίας Δραστηριότητα ενδολόβιας φλεγμονώδους επεξεργασίας Ludwig, 1993 Bianchi & Gudat, 1994 Ίνωση/κίρρωση Δραστηριότητα πυλαίας φλεγμονώδους επεξεργασίας Δραστηριότητα ενδολόβιας φλεγμονώδους επεξεργασίας Στάδιο/βαθμός ίνωσης Φλεγμονώδης διήθηση πυλαίων διαστημάτων Περιπυλαία διαβρωποιός νέκρωση Ενδολόβια εστιακή/διάχυτη νέκρωση και φλεγμονή Ίνωση/κίρρωση Ishak et al, 1995 Περιπυλαία ή περιδιαφραγματική φλεγμονώδης επεξεργασία Διάχυτη νέκρωση Εστιακή νέκρωση, απόπτωση και φλεγμονώδης διήθηση Φλεγμονώδης διήθηση πυλαίων διαστημάτων Hytiroglou et al, 1995 Ίνωση/κίρρωση Βαθμός ενεργού δραστηριότητας της φλεγμονώδους επεξεργασίας Στάδιο ίνωσης/κίρρωση Εύρος βαθμολόγησης Πίνακας 8. Σύνοψη των ημιποσοτικών συστημάτων βαθμολόγησης των αλλοιώσεων της χρόνιας ηπατίτιδας (142)

119 Ιστολογική Παράμετρος Βαθμός Περιπυλαία Ηπατίτιδα Απουσία 0 Ήπια (εστιακή, λίγα πυλαία) 1 Ήπια-Μέτρια (εστιακή περισσότερα πυλαία) 2 Μέτρια (συνεχής <50% των πυλαίων) 3 Έντονη (συνεχής >50%) 4 Συρρέουσα & Γεφυροποιός νέκρωση Απουσία 0 Εστιακή συρρέουσα νέκρωση 1 Στη ζώνη 3 σε μερικές περιοχές 2 Στη ζώνη 3 στις περισσότερες περιοχές 3 Ζώνη 3 + λίγες εστίες γεφυροποιού νέκρωσης 4 Ζώνη 3 + πολυάριθμες εστίες γεφυροποιού νέκρωσης 5 Πανλοβιακή νέκρωση 6 Εστιακή νέκρωση (λυτική ή αποπτωτική) / Εστιακή φλεγμονή* Απουσία 0 Μία εστία ανά οπτικό πεδίο (x10) 1 Δύο-τέσσερις εστίες ανά οπτικό πεδίο (x10) 2 Πέντε-δέκα εστίες ανά οπτικό πεδίο (x10) 3 Περισσότερες από δέκα εστίες ανά οπτικό πεδίο (x10) 4 Πυλαία φλεγμονή Απουσία 0 Ήπια σε μερικά ή σε όλα τα πυλαία διαστήματα 1 Μέτρια σε μερικά ή σε όλα τα πυλαία διαστήματα 2 Μέτρια/πυκνή σε όλα τα πυλαία διαστήματα 3 Πυκνή σε όλα τα πυλαία διαστήματα 4 HAI 0-18 *Δεν περιλαμβάνονται φλεγμονώδεις διηθήσεις στα ηπατικά κολποειδή. Πίνακας 9. Βαθμός Νεκροφλεγμονώδους Δραστηριότητας με βάση το τροποποιημένο HAI score (0-18) (145). 119

120 Βαθμός ΝΦΔ HAI score 1 ελάχιστη ήπια μέτρια έντονη Πίνακας 10. Απλοποιημένο σύστημα βαθμολόγησης της νεκροφλεγμονώδους δραστηριότητας (ΝΦΔ). (146) Ιστολογική περιγραφή Στάδιο Απουσία ίνωσης 0 Ίνωση πυλαίων διαστημάτων, χωρίς ινώδη 1 διαφραγμάτια Ίνωση πυλαίων διαστημάτων, με σπάνια ινώδη 2 διαφραγμάτια Ίνωση πυλαίων διαστημάτων, με άφθονα ινώδη 3 διαφραγμάτια Κίρρωση 4 Πίνακας 11. Σταδιοποίηση της χρόνιας ηπατίτιδας με βάση την κλίμακα METAVIR (147). 120

121 Γ) ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Για τη στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων της μελέτης χρησιμοποιήθηκε το πρόγραμμα SPSS (IBM SPSS Statistics, Version 21) καθώς και το πρόγραμμα Excel (Microsoft Excel:mac 2011). Περιγραφική ανάλυση που περιλάμβανε διάμεσες και μέσες τιμές, όρια και σταθερές αποκλίσεις πραγματοποιήθηκε για όλα τα συνεχή δεδομένα. Οι συγκρίσεις μεταξύ δύο ομάδων με τιμές που ακολουθούσαν την κανονική κατανομή πραγματοποιήθηκαν με το ανεξάρτητο t-test, ενώ εάν η κατανομή δεν ήταν κανονική με το Wilcoxon rank sum test. Οι συχνότητες παρουσιάζονται σαν αριθμοί και ποσοστά, και όπου ήταν κατάλληλο τα δεδομένα συγκρίθηκαν με τη χρησιμοποίηση του chi-square test (χ 2 ) ή το Fisher s exact test. Διάστημα εμπιστοσύνης (p value) <0,05 ήταν απαιτούμενο για τη στατιστική σημαντικότητα της μελέτης. Η συγγραφή της μελέτης γίνεται με τη χρήση ειδικών προγραμμάτων, τόσο για την κατασκευή της βάσης δεδομένων των βιβλιογραφικών αναφορών (EndNote X7.2), όσο και για την κατασκευή και την τροποποίηση των εικόνων (Adobe Photoshop CS6, Micrososft Powerpoint:mac 2011) που συμπεριελήφθησαν και την επεξεργασία του κειμένου (Microsoft Word:mac 2011). Τα σχήματα κατασκευάστηκαν με τη χρήση των στατιστικών προγραμμάτων IBM SPSS Statistics και Microsoft Excel:mac Τέλος, για τις εικόνες τρίτων πηγών που συμπεριελήφθησαν στη διδακτορική διατριβή αναφέρεται η πηγή τους στην αντίστοιχη βιβλιογραφία και έχει ληφθεί η σχετική άδεια χρήσης από τον εκδότη (copyrights). 121

122 Δ) ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Δ1) Χαρακτηριστικά Πληθυσμού Μελέτης Στην αρχική φάση της μελέτης καταγράφηκαν όλοι οι ασθενείς με χρόνια ηπατίτιδα Β που παρακολουθούνταν στα εξωτερικά ιατρεία της Δ Παθολογικής Κλινικής Α.Π.Θ. και είχαν υποβληθεί σε βιοψία ήπατος. Ανευρέθηκαν συνολικά 275 ασθενείς. Στους ασθενείς αυτούς καταγράφηκαν τα δημογραφικά τους χαρακτηριστικά, τυχόν συνυπάρχουσες νόσοι, η πιθανή ηλικία μετάδοσης του ιού HBV, οι ορολογικοί δείκτες του ιού, το ιικό φορτίο, οι βιοχημικοί δείκτες της ηπατικής λειτουργίας, η πιθανή οδός μετάδοσης του ιού, τα μελετόμενα στοιχεία από τη βιοψία ήπατος, η τυχόν αντιική θεραπεία που ελάμβαναν καθώς και η πιθανή ανάπτυξη αντοχής στα αντιικά φάρμακα. Από τους 275 ασθενείς οι 164 (59,6%) ήταν άρρενες. Ο μέσος όρος ηλικίας των ασθενών τη χρονική στιγμή της διενέργειας της βιοψίας ήπατος ήταν 45,5 έτη (σταθερή απόκλιση: 12,85, εύρος: 16-78). Είκοσι ασθενείς (7,3%) εμφάνιζαν HBeAg+ χρόνια ηπατίτιδα Β. Στους περισσότερους ασθενείς δεν υπήρχαν στοιχεία για πιθανό τρόπο μετάδοσης του ιού. Σε 25 ασθενείς (9,1%) πιθανολογείται κάθετη ή ενδοοικογενειακή μετάδοση του ιού. Σε δύο ασθενείς (0,7%) πιθανολογείται μετάδοση του ιού μετά από μετάγγιση αίματος. Σε 148 ασθενείς (53,8%) υπήρχαν στοιχεία σχετικά με τη λήψη ή μη θεραπείας (Πίνακας 12). Από τους 148 αυτούς ασθενείς 110 έλαβαν θεραπεία για την ηπατίτιδα Β. Η πλειοψηφία αυτών έλαβε λαμιβουδίνη ως μονοθεραπεία κατά τη διάρκεια της μελέτης. Από τους 81 ασθενείς που έλαβαν αντιική θεραπεία με λαμιβουδίνη, οι 28 (34,6%) ανέπτυξαν αντοχή σε αυτή και χρειάστηκε να προστεθεί δεύτερο αντιικό σκεύασμα. 122

123 Αντιική Θεραπεία Ν=148 (100%) Ιντερφερόνη 45 (30,4%) Πεγκυλιωμένη Ιντερφερόνη 14 (9,5%) Λαμιβουδίνη 81 (54,7%) Αδεφοβίρη 23 (15,5%) Τενοφοβίρη 15 (10,1%) Εντεκαβίρη 6 (4,1%) Χωρίς Θεραπεία 38 (25,7%) Πίνακας 12. Αντιική θεραπεία του συνόλου των ασθενών με ΧΗΒ. Από τους 110 ασθενείς οι οποίοι έλαβαν αντιική αγωγή, πραγματοποιήθηκε βιοψία ήπατος έπειτα από παρατεταμένη αντιική θεραπεία σε 55 από αυτούς. Σε έναν ασθενή ανευρέθηκε συλλοίμωξη με τον ιό της ηπατίτιδας δέλτα (HDV) και ένας ασθενής είχε ιστολογικά στοιχεία στεατοηπατίτιδας σοβαρού βαθμού. Αυτοί οι δύο ασθενείς αποκλείσθηκαν από τη μελέτη, αφήνοντας 53 ασθενείς για ανάλυση (Εικόνα 13). Εικόνα 13. Διάγραμμα ροής ασθενών στη μελέτη. 123

124 Ο πίνακας 13 περιγράφει τα κύρια δημογραφικά, βιοχημικά και ιολογικά χαρακτηριστικά των ασθενών με χρόνια HBV λοίμωξη που συμπεριελήφθησαν στη μελέτη κατά τη χρονική στιγμή της διενέργειας της 1 ης βιοψίας (βιοψία αναφοράς). Όλοι οι ασθενείς της μελέτης ήταν Καυκάσιας καταγωγής. Είκοσι εννέα ασθενείς ήταν άρρενες (54,7%). Η μέση ηλικία των ασθενών κατά τη χρονική στιγμή της διενέργειας της βιοψίας αναφοράς ήταν τα 47,2 έτη (σταθερή απόκλιση: 10,9, εύρος: 17-66). Η μεγάλη πλειοψηφία των ασθενών (50/53, 94,3%) είχαν antihbe-θετική ΧΗΒ. Σύνολο (N=53) Μέση ηλικία (έτη)* 47,2±10,9 Άρρενες, n (%) 29 (54,7%) HBeAg, n (%) 3 (5,7%) HBV-DNA, μέση τιμή (IU/ml)* 7,55x10 7 AST, (U/ml) *,** n=35 77,4±65 ALT, (U/ml) *,** n=35 114,1±122 Πίνακας 13. Χαρακτηριστικά των ασθενών κατά τη χρονική στιγμή της διενέργειας της βιοψίας αναφοράς. * Μέση τιμή ± σταθερή απόκλιση (Standard Deviation, SD) ** Ο έλεγχος έγινε ±12 εβδομάδες από τη διενέργεια της βιοψίας αναφοράς. Η μεγάλη πλειοψηφία των ασθενών είχε λάβει αρχικά λαμιβουδίνη ως αντιική αγωγή (n=45, 84,9%), ενώ 6 είχαν λάβει εντεκαβίρη, ένας τελμπιβουδίνη και ένας τενοφοβίρη. Λόγω της ανάπτυξης αντοχής στη λαμιβουδίνη, ένα νουκλεοτιδικό ανάλογο προστέθηκε σε 20 ασθενείς (37,7% επί του συνόλου των ασθενών, 44,4% επί των ασθενών που έλαβαν λαμιβουδίνη). Οι 12 από τους ασθενείς που ανέπτυξαν αντοχή στη λαμιβουδίνη έλαβαν αδεφοβίρη, ενώ οι υπόλοιποι 8 τενοφοβίρη. Είκοσι τρεις από τους 53 ασθενείς (43,4%) είχαν λάβει αρχικά αγωγή με ιντερφερόνη (απλή ή πεγκυλιωμένη) πριν την έναρξη αντιικής αγωγής με νουκλεοτ(σ)ιδικά ανάλογα (19 λαμιβουδίνη, 3 εντεκαβίρη, 1 124

125 τενοφοβίρη). Στον πίνακα 14 συνοψίζεται η αντιική αγωγή των ασθενών της παρούσας μελέτης. Αντιική Θεραπεία Ν=53 (100%) Ιντερφερόνη 23 (43,4%) Λαμιβουδίνη 45 (84,9%) Αδεφοβίρη 12 (22,6%) Τενοφοβίρη 9 (17,0%) Εντεκαβίρη 6 (11,3%) Πίνακας 14. Αντιική θεραπεία των ασθενών της μελέτης. Η βιοψία αναφοράς είχε μέσο μήκος 21,3 mm, με μέσο στάδιο ίνωσης F=2,51 (F0=1, F1=4. F2=26, F3=11, F4=11). Είκοσι δύο ασθενείς είχαν στάδιο METAVIR F3, υποδηλώνοντας προχωρημένη ίνωση ή κίρρωση. Στον πίνακα 8 περιγράφονται τα ιστολογικά χαρακτηριστικά της βιοψίας αναφοράς. Η κατανομή του βαθμού της νεκροφλεγμονώδους δραστηριότητας, του σταδίου της ινώσεως, καθώς και της έκφρασης των αντιγόνων HBsAg και HBcAg στα ηπατοκύτταρα φαίνονται στα σχήματα 2, 3, 4 και 5, αντιστοίχως. Δ2) Ιστολογική απάντηση Σε όλους τους ασθενείς, όπως προαναφέρθηκε, ελέγχθηκε το στάδιο της νόσου με δεύτερη βιοψία έπειτα από μακροχρόνια αντιική θεραπεία (βιοψία ελέγχου). Ο πίνακας 15 περιγράφει τα κύρια βιοχημικά και ιολογικά χαρακτηριστικά των ασθενών κατά τη χρονική στιγμή της διενέργειας της 2 ης βιοψίας (βιοψία ελέγχου). Η βιοψία ελέγχου είχε μέσο μήκος 29,4 mm, και μέσο στάδιο ίνωσης F=1,96 (F0=3, F1=15, F2=21, F3=9, F4=5). Η μέση χρονική απόσταση μεταξύ της βιοψίας αναφοράς και της βιοψίας ελέγχου ήταν 73,8 125

126 μήνες (6,15 έτη, σταθερή απόκλιση: 28,1). Στον πίνακα 16 περιγράφονται τα ιστολογικά χαρακτηριστικά της βιοψίας ελέγχου σε σύγκριση με την βιοψία αναφοράς. Σύνολο Ν=53 HBV-DNA, μέση τιμή (IU/ml)** 3,1x10 3 AST (U/ml) *,** n=41 27,7±30 ALT (U/ml) *,** n=41 36,5±70 FibroScan (kpa) *,** n=12 7,1±2,5 Πίνακας 15. Χαρακτηριστικά των ασθενών κατά τη χρονική στιγμή της διενέργειας της βιοψίας ελέγχου. * Μέση τιμή ± σταθερή απόκλιση (Standard Deviation, SD) ** Ο έλεγχος έγινε ±12 εβδομάδες από τη διενέργεια της βιοψίας ελέγχου. Ιστολογικά Χαρακτηριστικά Βιοψία Αναφοράς* Βιοψία Ελέγχου* p-value Μήκος βιοψίας (mm) 21,3±8,5 29,4±9, Στάδιο κατά METAVIR 2,51±0,97 1,96±1,04 <0,001 Βαθμός νεκροφλεγμονώδους 2,19±0,92 1,17±0,51 <0,001 δραστηριότητας βάσει του απλοποιημένου συστήματος βαθμολόγησης Ήπια Στεάτωση (Ν) Ανοσοϊστοχημεία για το HBsAg 2,3±1,0 2,2±0, (κλίμακα 0-3) Ανοσοϊστοχημεία για το HBcAg (κλίμακα 0-3) 0,5±0,9 0,2±0, Πίνακας 16. Ιστολογικά χαρακτηριστικά βιοψίας αναφοράς και βιοψίας ελέγχου. * Μέση τιμή ± σταθερή απόκλιση (Standard Deviation, SD) Τριάντα-επτά ασθενείς (70%) βελτίωσαν το βαθμό της νεκροφλεγμονώδους δραστηριότητας στη βιοψία ελέγχου, σε σύγκριση με τη βιοψία αναφοράς. Η μέση μείωση του τροποποιημένου HAI score ήταν 1,02±1,0. Η αλλαγή της κατανομής της ιστολογικής δραστηριότητας μεταξύ της βιοψίας ελέγχου και της βιοψίας αναφοράς φαίνεται στην εικόνα 14. Επιπλέον, 25 ασθενείς (47%) βελτίωσαν το στάδιο κατά 0,55±0,72 μονάδες. Η αλλαγή της 126

127 κατανομής του σταδίου μεταξύ της βιοψίας ελέγχου και της βιοψίας αναφοράς φαίνεται στην εικόνα 15. Για την έκφραση των αντιγόνων HBsAg και HBcAg στα ηπατοκύτταρα δεν παρατηρήθηκε ουσιώδης μεταβολή στη βιοψία ελέγχου ( 0,06±0,9 και 0,2±1,1 αντιστοίχως). Η αλλαγή της κατανομής της έκφρασης των αντιγόνων HBsAg και HBcAg στα ηπατοκύτταρα μεταξύ της βιοψίας ελέγχου και της βιοψίας αναφοράς φαίνεται στις εικόνες 16 και 17, αντιστοίχως. Σε έναν από τους 53 ασθενείς (2%) παρατηρήθηκε αύξηση του σταδίου της ίνωσης κατά METAVIR από F2 σε F3 στη βιοψία ελέγχου. Η πρώτη βιοψία είχε μήκος 27mm και η βιοψία ελέγχου είχε μήκος 29mm. Ο ασθενής είχε μη ανιχνεύσιμο HBV DNA και φυσιολογικές τρανσαμινάσες τη χρονική στιγμή της βιοψίας ελέγχου. Αξιοσημείωτο είναι ότι ο ασθενής είχε ελάχιστη νεκροφλεγμονώδη δραστηριότητα (HAI=1) στη δεύτερη βιοψία. Δύο έτη πριν τη λήψη της δεύτερης βιοψίας, ο ασθενής είχε αναπτύξει αντοχή στη λαμιβουδίνη και έλαβε θεραπεία διάσωσης με αδεφοβίρη. 127

128 Εικόνα 14. Κατανομή νεκροφλεγμονώδους δραστηριότητας στη βιοψία αναφοράς και στη βιοψία ελέγχου. 128

129 Εικόνα 15. Κατανομή του σταδίου στη βιοψία αναφοράς και στη βιοψία ελέγχου. 129

130 Εικόνα 16. Κατανομή της έκφρασης του HBsAg στα ηπατοκύτταρα στη βιοψία αναφοράς και στη βιοψία ελέγχου. 130

131 Εικόνα 17. Κατανομή της έκφρασης του HBcAg στα ηπατοκύτταρα στη βιοψία αναφοράς και στη βιοψία ελέγχου. 131

132 Δ3) Ασθενείς με προχωρημένο στάδιο ίνωσης Στη βιοψία αναφοράς ευρέθηκαν 22 ασθενείς (42%) με προχωρημένο στάδιο ίνωσης (στάδιο METAVIR F3). Δεκατρείς από αυτούς (59%) κατάφεραν να μειώσουν το στάδιο της ίνωσης κατά τουλάχιστον μία μονάδα στην κλίμακα METAVIR. Η μέση μείωση του σταδίου της ίνωσης ήταν 0,77. Η μέση μείωση του σταδίου της ίνωσης ήταν μεγαλύτερη στους ασθενείς με προχωρημένη ίνωση σε σύγκριση με τους ασθενείς με ήπιο ή μέτριο στάδιο ίνωσης (στάδιο METAVIR<F3), διαφορά η οποία είναι στα όρια της στατιστικής σημαντικότητας (-0,77 vs -0,39, p=0,055), Πίνακας 17. Στην εικόνα 18 φαίνεται η αλλαγή της κατανομής του σταδίου ίνωσης κατά METAVIR μεταξύ της βιοψίας ελέγχου και της βιοψίας αναφοράς, σε ασθενείς με προχωρημένο στάδιο ίνωσης στην πρώτη βιοψία. Στάδιο F 3 F<3 N Μέση τιμή Σταθερή απόκλιση ,77-0,39 0,813 0,615 t df p- value -1, ,055 Πίνακας 17. Στατιστική σύγκριση του βαθμού μείωσης του σταδίου της ίνωσης κατά τη κλίμακα METAVIR, σε σχέση με το αρχικό στάδιο στη βιοψία αναφοράς. Ένδεκα από τους 22 ασθενείς με προχωρημένη ίνωση (50%) είχαν στη βιοψία αναφοράς ιστολογικά επιβεβαιωμένη κίρρωση (στάδιο METAVIR=F4). Έξι από αυτούς (55%) κατάφεραν να μειώσουν το αρχικό στάδιο της ίνωσης στη βιοψία ελέγχου (4 ασθενείς σε F3, 1 σε F2 και 1 σε F1). Η εικόνα 19 δείχνει μία περίπτωση ασθενούς της μελέτης με ιστολογικά αποδεδειγμένη κίρρωση, στον οποίον επιτεύχθηκε μείωση του σταδίου σε F1 έπειτα από μακροχρόνια αντιική θεραπεία. 132

133 Εικόνα 18. Κατανομή του σταδίου σε ασθενείς με προχωρημένη ίνωση. 133

134 Εικόνα 19α Εικόνα 19β 134

135 Εικόνα 19γ Εικόνα 19δ Εικόνα 19. Αντιπροσωπευτικές περιοχές από βιοψίες ήπατος ασθενούς 51 ετών με antihbe θετική ΧΗΒ πριν την έναρξη αντιικής θεραπείας (α, β) και μετά από 8 έτη αγωγής με λαμιβουδίνη (γ, δ). Είναι προφανής η βελτίωση του σταδίου κατά METAVIR από F4 (κίρρωση) σε F1 (ελάχιστη ίνωση). (τριχρωμική Masson, x100). 135

136 Δ4) Ασθενείς με ανάπτυξη αντίστασης στην αντιική αγωγή Η μέση χρονική απόσταση μεταξύ της βιοψίας αναφοράς και της βιοψίας ελέγχου, στην κατηγορία αυτή των ασθενών, ήταν 74,4 μήνες (6,2 έτη, σταθερή απόκλιση: 29,4) και δεν διέφερε από τη χρονική απόσταση ασθενών χωρίς ανάπτυξη αντοχής (Πίνακας 18). Όλοι οι ασθενείς έλαβαν θεραπεία διάσωσης με την προσθήκη δεύτερου νουκλεοτιδικού αναλόγου. Οχτώ από 20 ασθενείς (40%), που ανέπτυξαν αντίσταση στην αντιική αγωγή, κατάφεραν να μειώσουν το στάδιο της ίνωσης στη βιοψία ελέγχου κατά τουλάχιστον μία μονάδα στην κλίμακα METAVIR. Η μέση μείωση του σταδίου της ίνωσης ήταν -0,45. Δεν παρατηρήθηκε στατιστικώς σημαντική διαφορά στη μέση μείωση του σταδίου της ίνωσης μεταξύ των ασθενών που ανέπτυξαν ή όχι αντοχή στην αντιική θεραπεία (0,45 vs 0,61, p=0,45), Πίνακας 18. Ένας από τους ασθενείς, που ανέπτυξε αντοχή στην αντιική αγωγή (5%), είχε αύξηση του σταδίου ίνωσης κατά METAVIR κατά μία μονάδα, αυξάνοντάς από F2 στη βιοψία αναφοράς σε F3 στη βιοψία ελέγχου. Αντίσταση Ν Μέση τιμή Σταθερή απόκλιση t df p-value Μεταβολή της ίνωσης NAI OXI ,45-0,61 0,759 0,704-0, ,451 Χρονική απόσταση βιοψιών NAI OXI ,35 73,42 29,355 27,835-0, ,909 Πίνακας 18. Στατιστική σύγκριση του βαθμού μείωσης του σταδίου της ίνωσης κατά τη κλίμακα METAVIR καθώς και της χρονικής απόστασης μεταξύ των δύο βιοψιών, σε σχέση με την ανάπτυξη ή όχι αντίστασης στην αντιική αγωγή. 136

137 Δ5) Εκτίμηση παραγόντων που συσχετίζονται με τη βελτίωση του σταδίου της ίνωσης Οι παράγοντες που ελέγχθηκαν για πιθανή συσχέτιση με τη βελτίωση του σταδίου της ίνωσης ήταν η χρονική απόσταση μεταξύ των δύο βιοψιών, η ηλικία των ασθενών κατά τη στιγμή της διενέργειας της βιοψίας αναφοράς, οι τιμές των αμινοτρανσαμινασών (AST, ALT) κατά τη χρονική στιγμή της διενέργειας της βιοψίας ελέγχου, το φύλο των ασθενών, η προηγούμενη θεραπεία με ιντερφερόνη, καθώς και με η τυχόν ανάπτυξη αντίστασης στην αντιική αγωγή. Η ανάλυση των ασθενών που ανέπτυξαν αντίσταση στην αντιική αγωγή περιγράφηκε σε ξεχωριστή υποενότητα των αποτελεσμάτων. Οι ασθενείς που είχαν επιτύχει υποστροφή της ίνωσης του ήπατος είχαν την τάση να έχουν λίγο μεγαλύτερο χρονικό διάστημα μεταξύ των δύο βιοψιών, χωρίς όμως να φθάνει στα επίπεδα της στατιστικώς σημαντικής διαφοράς (79 vs 69 μήνες, p=0,21). Η ηλικία των ασθενών κατά τη χρονική στιγμή της λήψης της βιοψίας αναφοράς δεν επηρέαζε την πιθανή μείωση του σταδίου της ίνωσης (47,4 vs 47,0 έτη, p=0,90). Οι ασθενείς που βελτίωσαν το στάδιο της ίνωσης είχαν επίσης την τάση να έχουν χαμηλότερες τιμές AST και ALT κατά τη χρονική στιγμή της λήψης της βιοψίας ελέγχου, χωρίς όμως και πάλι να είναι στατιστικά σημαντική η διαφορά (22 vs 33, p=0,25 και 25 vs 49, p=0,29, αντίστοιχα). Στον πίνακα 19 περιγράφονται τα αποτελέσματα των ανωτέρω στατιστικών αναλύσεων. Ο άρρενες ασθενείς είχαν την τάση να έχουν μεγαλύτερη μείωση του σταδίου της ίνωσης, χωρίς όμως η διαφορά να αγγίζει τα όρια της στατιστικής σημαντικότητας (-0,66 vs -0,42, p=0,23). Η λήψη προηγούμενης θεραπείας με ιντερφερόνη δεν επηρέαζε το μέγεθος της υποστροφής του σταδίου της ίνωσης 137

138 (-0,43 vs -0,63, p=0,33). Στον πίνακα 20 περιγράφονται τα αποτελέσματα των ανωτέρω στατιστικών αναλύσεων. Χρονική απόσταση Ηλικία AST ALT Μείωση της ίνωσης ΝΑΙ ΟΧΙ ΝΑΙ ΟΧΙ ΝΑΙ ΟΧΙ ΝΑΙ ΟΧΙ Ν Μέση τιμή Σταθερή απόκλιση ,96 69,14 47,40 47,04 22,48 33,15 25,05 48,50 25,442 30,043 10,720 11,220 7,534 41,447 15,753 98,845 t df p- value -1, ,208-0, ,905 1, ,253 1, ,290 Πίνακας 19. Σύγκριση μεταξύ της επίτευξης υποστροφής της ίνωσης με τη χρονική απόσταση των δύο βιοψιών, την ηλικία των ασθενών κατά τη στιγμή της λήψης της βιοψίας αναφοράς καθώς και με τις τιμές των AST & ALT κατά τη στιγμή της διενέργειας της βιοψίας ελέγχου. Φύλο Ιντερφερόνη Άρρεν Θήλυ Ναι Όχι Ν Μέση τιμή -0,66-0,42-0,43-0,63 Σταθερή απόκλιση 0,769 0,654 0,843 0,615 t df p- value -1, ,234-0, ,326 Πίνακας 20. Σύγκριση μεταξύ του φύλου των ασθενών, της προηγούμενης θεραπείας με ιντερφερόνη και του βαθμού μεταβολής του σταδίου της ίνωσης. 138

139 Ε) ΣΥΖΗΤΗΣΗ Στην παρούσα διατριβή καταγράφηκαν και αναλύθηκαν τα χαρακτηριστικά των ασθενών με χρόνια ηπατίτιδα Β οι οποίοι παρακολουθούνται στα τακτικά εξωτερικά ιατρεία της Δ Πανεπιστημιακής Κλινικής του Α.Π.Θ. Σε 53 από αυτούς τους ασθενείς αναλύθηκε η επίδραση της αντιικής αγωγής στην εξέλιξη της ηπατικής νόσου. Μετά από μέση περίοδο περίπου 6 ετών, παρατηρήθηκε βελτίωση στη βαθμολόγηση της νεκροφλεγμονώδους δραστηριότητας στο 70% των ασθενών και βελτίωση του σταδίου ίνωσης κατά METAVIR στο 47% των ασθενών, συμπεριλαμβάνομένου του 59% των ασθενών με προχωρημένο στάδιο ινώσεως ή με κίρρωση του ήπατος (F 3). Βελτίωση του σταδίου της νόσου, παρατηρήθηκε επίσης και σε ασθενείς οι οποίοι ανέπτυξαν αντοχή στην αντιική αγωγή, παρατήρηση που υποδηλώνει ότι υποστροφή του σταδίου της ίνωσης του ήπατος μπορεί να επιτευχθεί και σε αυτόν τον υποπληθυσμό των ασθενών με χρόνια ηπατίτιδα Β. Όπως έχει αναφερθεί στο Γενικό Μέρος της παρούσας διατριβής, η ίνωση του ήπατος αποτελεί επουλωτική διαδικασία σε πληθώρα επιβλαβών παραγόντων που μπορεί να δρουν στο ηπατικό παρέγχυμα. Εάν ο επιβλαβής παράγοντας παραμείνει ανεξέλεγκτος, η επουλωτική αυτή διαδικασία μπορεί να προχωρήσει σε οργάνωση του ινώδους ιστού και να προκαλέσει έως και κίρρωση του ηπατικού παρεγχύματος. Δυστυχώς, η πρόοδος στην ανακάλυψη αντιινωτικών παραγόντων δεν ήταν ευδόκιμη τα τελευταία έτη και η μόνη θεραπεία σε ασθενείς με ηπατική νόσο τελικού σταδίου είναι η μεταμόσχευση του ήπατος. 139

140 Η κατανόηση των παθοφυσιολογικών μηχανισμών που συμβάλλουν στην ηπατική ίνωση οδήγησε στη διαπίστωση ότι η διαδικασία της ινώσεως είναι μία δυναμική διεργασία με αμφίδρομη πορεία (121). Το γεγονός αυτό επιτρέπει τη θεωρητική υπόθεση ότι η άρση του γενουσιουργού αιτίου της ηπατικής νόσου καθώς και η έγκαιρη αναγνώριση των ασθενών με προχωρημένη μεν ηπατική ίνωση (με επεμβατικές ή μη μεθόδους), χωρίς ωστόσο εμφάνιση κλινικών συμπτωμάτων (άρση της αντιρρόπησης της κιρρώσεως), είναι δυνατό να συμβάλλει στη μείωση του ποσοστού των ασθενών που θα εξελιχθούν σε ανάπτυξη τελικού σταδίου της ηπατικής νόσου και σε ανάγκη μεταμόσχευσης του ήπατος. Όπως προαναφέρθηκε και στο Γενικό Μέρος της παρούσας διατριβής, κατά τη διαδικασία της ίνωσης όχι μόνο αυξάνεται η ποσότητα της εξωκυττάριας ουσίας αλλά μεταβάλλεται και η σύστασή της (124). Σημαντικό ρόλο στην ίνωση του ήπατος διαδραματίζει η εναπόθεση εξωκυττάριων ουσιών. Οι εξωκυττάριες ουσίες που εναποτίθενται περιλαμβάνουν διάφορους τύπους κολλαγόνου, πρωτεογλυκανών, δομικών πρωτεϊνών και υαλουρονικού οξέος. Η εναπόθεση αυτών στο χώρο του Disse (περικολποειδική ίνωση), δηλαδή μεταξύ της κολποειδικής επιφάνειας των ηπατοκυττάρων και του ενδοθηλίου των κολποειδών τριχοειδών, οδηγεί σταδιακά σε εγκλωβισμό των ηπατοκυττάρων από την περιβάλλουσα ουσία που επηρεάζει όχι μόνο την αιματική ροή στα κολποειδή του ήπατος, αλλά και τη βιοσυνθετική ικανότητα των ηπατοκυττάρων (80). Σημαντικό ρόλο στη δημιουργία της ινώσεως διαδραματίζουν οι μεταλλοπρωτεϊνάσες (metalloproteinases MMPs) καθώς και οι αναστολείς αυτών (ιστικοί αναστολείς των εξωκυττάριων πρωτεϊνών / tissue inhibitors of metalloproteinases TIMPs). Στην ηπατική ίνωση 140

141 παρατηρείται ελάττωση των μεταλλοπρωτεϊνασών και αύξηση των TIMPs με αποτέλεσμα να υπάρχει αυξημένη εναπόθεση εξωκυττάριας ουσίας (81, 82). Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες συμβάλουν στην αποδόμηση της εξωκυττάριας ουσίας μέσω δύο κυρίως μηχανισμών: 1) τη διατάραξη της φυσιολογική δομής και αναλογίας της εξωκυττάριας ουσίας και 2) τη διάσπαση της περίσσειας ινώδους ιστού με αποτέλεσμα την αποκατάσταση της φυσιολογικής αρχιτεκτονικής του ηπατικού παρεγχύματος (126). Κεντρικό ρόλο στην προαγωγή της ίνωσης διαδραματίζει επίσης η ενεργοποίηση των ηπατικών αστεροειδών κυττάρων. Κατά τη διάρκεια της ηπατικής βλάβης τα ηπατικά αστεροειδή κύτταρα ενεργοποιούνται και ασκούν την ινωτική τους δράση, όπως ήδη προαναφέρθηκε σε προηγούμενα εδάφια. Για την επίτευξη συνθηκών αποκατάστασης της αρχιτεκτονικής του ήπατος καθώς και υποστροφής της ήδη υπάρχουσας ίνωσης, είναι απαραίτητη η επάνοδος των αστεροειδών κυττάρων στην ανενεργό τους μορφή ή η θανάτωσή τους μέσω των ΝΚ κυττάρων ή μέσω του μηχανισμού της απόπτωσης (125). Μετά την αποδρομή του αιτιολογικού παράγοντα, τα ηπατικά αστεροειδή κύτταρα αποπίπτουν και η ενεργοποίηση των αναστολέων των μεταλλοπρωτεϊνασών ελαττώνεται, επιτρέποντας στις μεταλλοπρωτεϊνάσες να αυξήσουν την ινολυτική τους δραστηριότητα, διαδικασία που ονομάζεται ιστική αναδόμηση (remodeling) (124). Η πρώτη περίπτωση υποστροφής της κίρρωσης του ήπατος αναφέρθηκε το 2000 σε ασθενή με χρόνια ηπατίτιδα Β μετά από θεραπεία με νουκλεοσιδικό ανάλογο (λαμιβουδίνη). Η υποστροφή της κίρρωσης τεκμηριώθηκε με επαναληπτικές βιοψίες ήπατος (149). Την αναφορά αυτή ακολούθησαν σειρές ασθενών με χρόνια ηπατίτιδα Β στους οποίους παρατηρήθηκε υποστροφή του σταδίου της ίνωσης μετά από αντιική θεραπεία 141

142 ( ). Σημαντικά δεδομένα όσον αφορά στην υποστροφή της ίνωσης του ήπατος, προέκυψαν ακολούθως σε τυχαιοποιημένες ελεγχόμενες μελέτες που περιέλαβαν μικρό αριθμό ασθενών. Κατά τη διάρκεια μίας τριετούς μελέτης ασθενών με HBeAg- χρόνια ηπατίτιδα Β, χωρίς προηγούμενη θεραπεία με NUC, το 56% των ασθενών επέτυχε βελτίωση του ιστολογικού σταδίου της νόσου μετά από χορήγηση λαμιβουδίνης (153). Τα ιστολογικά αποτελέσματα της θεραπείας με αδεφοβίρη εκτιμήθηκαν επίσης σε δύο μελέτες. Στην πρώτη από αυτές, οι Χατζηγιάννης και συν. διαπίστωσαν ότι το 55% των ασθενών με HBeAg- ΧΗΒ (12/22) που έλαβαν θεραπεία για 4 έτη καθώς και το 71% (17/24) των ασθενών που έλαβαν θεραπεία για 5 έτη επέτυχαν βελτίωση του σταδίου της ίνωσης στην κλίμακα Ishak (154). Στη δεύτερη μελέτη, επιτεύχθηκε βελτίωση του σταδίου της ίνωσης στο 60% (9/15) των ασθενών με HBeAg+ ΧΗΒ (155). Η πρώτη μεγάλη μελέτη που αφορούσε την υποστροφή της ηπατικής ίνωσης σε ασθενείς με ΧΗΒ δημοσιεύθηκε το 2010 στο Hepatology από τους Chang, Liaw et al. και περιλάμβανε 57 ασθενείς από τις δύο μελέτες φάσης ΙΙΙ για την έγκριση της εντεκαβίρης (130). Οι ανωτέρω ασθενείς δεν είχαν λάβει προηγούμενη θεραπεία με NUC και η εξέλιξη της ίνωσης εκτιμήθηκε μετά από 6 έτη θεραπείας με εντεκαβίρη. Η μελέτη αυτή έδειξε σημαντική βελτίωση του σταδίου ίνωσης κατά Ishak στο 88% των ασθενών, με μέση μείωση του σταδίου της νόσου κατά 1,53 βαθμίδες. Η μελέτη αυτή ήταν η πρώτη που αφορούσε τα νεότερα ισχυρά αντιικά νουκλεοσιδικά ανάλογα και η πρώτη που επέτυχε πλήρη ιολογική και βιοχημική ύφεση σε όλους τους ενταχθέντες ασθενείς κατά τη διάρκεια των 6 ετών παρακολούθησής τους. Σε σύγκριση με τη δική μας μελέτη, η σειρά των ασθενών που έλαβε εντεκαβίρη περιελάμβανε άτομα με 142

143 προχωρημένη ίνωση ή κίρρωση του ήπατος σε ποσοστό μόνο 17,5% (10 από τους 57 ασθενείς), έναντι ποσοστού 42% (22 από τους 53 ασθενείς) στη σειρά του Α.Π.Θ. Η τενοφοβίρη είναι το πιο πρόσφατα εγκεκριμένο αντιικό φάρμακο για την ΧΗΒ, έχει καλύτερο προφίλ αντίστασης και είναι πολύ ισχυρότερο από την αδεφοβίρη. Η μεγαλύτερη μελέτη για το συγκεκριμένο NUC δημοσιεύθηκε από τον Marcellin et al (156) και στόχος της ήταν η εκτίμηση της ιστολογικής βελτίωσης ( 2 μονάδων νεκροφλεγμονώδους δραστηριότητας κατά Knodel χωρίς επιδείνωση του σταδίου ίνωσης) καθώς και της υποστροφής της ινώσεως ( 1 μονάδα κατά Ishak) σε μεγάλη ομάδα ασθενών που έλαβαν θεραπεία με την TFV (348 ασθενείς με διπλή βιοψία μετά από 5 έτη). Στην αρχική βιοψία 133/348 ασθενείς (38%) είχαν γεφυροποιό ίνωση ή κίρρωση του ήπατος (κλίμακα Ishak 4). Το ποσοστό αυτό βελτιώθηκε στο 28% (97/344) και τελικά στο 12% (42/348) μετά από 1 και 5 έτη αντίστοιχα. Συνολικά, υποστροφή της ινώσεως επιτεύχθηκε σε ποσοστό 51% (176/348) των ασθενών, Εικόνα 20. Θα πρέπει να επιδημανθεί ότι 96 ασθενείς είχαν ανεπτυγμένη κίρρωση του ήπατος (κλίμακα Ishak 5, 6) κατά τη βιοψία ελέγχου. Από αυτούς το 74% (71 ασθενείς) δεν είχαν σημεία κιρρώσεως στη βιοψία ελέγχου μετά από 5 έτη. 143

144 Εικόνα 20. Κατανομή της κλίμακας Ishak κατά τη βιοψία αναφοράς καθώς και μετά από 1 και 5 έτη (156). Πηγή: Τροποποιημένο από Marcellin P et al. Regression of cirrhosis during treatment with tenofovir disoproxil fumarate for chronic hepatitis B: a 5-year open-label follow-up study. Lancet Τα δικά μας αποτελέσματα συμφωνούν εν μέρει με την τρέχουσα βιβλιογραφία. Οι περισσότερες μελέτες χρησιμοποιούν την κλίμακα Ishak (αντί της κλίμακας METAVIR που χρησιμοποιείται στην παρούσα μελέτη) για τη σταδιοποίηση της νόσου και αυτό καθιστά δύσκολη την άμεση σύγκρισή των αποτελεσμάτων. Η μεγαλύτερη και σημαντικότερη μελέτη με ασθενείς προχωρημένου σταδίου ίνωσης ήταν αυτή της τενοφοβίρης. Η επίτευξη βελτίωσης του σταδίου της νόσου στο σύνολο των ασθενών ήταν 51% έναντι 47% στη δική μας ομάδα. Στους ασθενείς με προχωρημένο στάδιο νόσου, βελτίωση του σταδίου της νόσου επιτεύχθηκε στο 74% των ασθενών έναντι 59% στη δική μας ομάδα. Η διαφορά αυτή μπορεί να οφείλεται σε διάφορους παράγοντες, όπως η επιλογή διαφορετικής μονάδας σταδιοποίησης καθώς και του γεγονότος ότι η τενοφοβίρη είναι ένα αρκετά ισχυρότερο αντιικό φάρμακο 144