ΤΕΙ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ. ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ «Αρχιμηδης ΙΙΙ-Ενίσχυση Ερευνητικών Ομάδων στο ΤΕΙ Λάρισας»

Transcript

1 ΤΕΙ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ «Αρχιμηδης ΙΙΙ-Ενίσχυση Ερευνητικών Ομάδων στο ΤΕΙ Λάρισας» ΥΠΟΕΡΓΟ 4 «ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΧΡΗΣΗΣ ΑΠΟΣΤΑΓΜΑΤΩΝ ΕΠΙΛΕΓΜΕΝΩΝ ΦΥΤΩΝ ΡΙΓΑΝΗΣ ΣΤΗ ΔΙΑΤΡΟΦΗ ΨΑΡΙΩΝ ΜΕ ΣΤΟΧΟ ΤΗ ΜΕΙΩΣΗ ΤΟΥ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΟΥ ΦΟΡΤΙΟΥ ΤΗΣ ΤΡΟΦΗΣ ΤΟΥΣ (ΖΩΟΠΛΑΓΚΤΟΝ)» Επιστημονικός Υπεύθυνος: Αναστασόπουλος Ηλίας Πακέτο εργασίας: Π.Ε.4.3 «IN VITRO ΚΑΙ IN VIVO ΔΟΚΙΜΕΣ ΔΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΑΠΟΣΤΑΓΜΑΤΩΝ ΑΙΘΕΡΙΩΝ ΕΛΑΙΩΝ ΕΠΙΛΕΓΜΕΝΩΝ ΚΛΩΝΩΝ ΡΙΓΑΝΗΣ, ΕΝΑΝΤΙ ΠΑΘΟΓΟΝΩΝ ΖΩΟΠΛΑΚΤΟΝ.» Παραδοτέο Αποτελέσματα in vitro και in vivo δοκιμών δραστικότητας αποσταγμάτων αιθερίων ελαιών, επιλεγμένων κλώνων ρίγανης. 1

2 ΠΕ3 «IN VITRO ΚΑΙ IN VIVO ΔΟΚΙΜΕΣ ΔΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΑΠΟΣΤΑΓΜΑΤΩΝ ΑΙΘΕΡΙΩΝ ΕΛΑΙΩΝ ΕΠΙΛΕΓΜΕΝΩΝ ΚΛΩΝΩΝ ΡΙΓΑΝΗΣ, ΕΝΑΝΤΙ ΠΑΘΟΓΟΝΩΝ ΖΩΟΠΛΑΚΤΟΝ.» ΠΑΡΑΔΟΤΕΟ 3.1. Αποτελέσματα in vitro και in vivo δοκιμών δραστικότητας αποσταγμάτων αιθερίων ελαιών, επιλεγμένων κλώνων ρίγανης. ΔΙΑΡΚΕΙΑ ΥΠΟΛΟΠΟΙΗΣΗΣ ΠΑΚΕΤΟΥ ΕΡΓΑΣΙΑΣ: 1/4/ /12/2014. ΠΑΡΑΔΟΤΕΟ 3.1 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ IN VITRO ΚΑΙ IN VIVO ΔΟΚΙΜΩΝ ΔΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΑΠΟΣΤΑΓΜΑΤΩΝ ΑΙΘΕΡΙΩΝ ΕΛΑΙΩΝ, ΕΠΙΛΕΓΜΕΝΩΝ ΚΛΩΝΩΝ ΡΙΓΑΝΗΣ. Η παρούσα έρευνα έλαβε χώρα στις εγκαταστάσεις του Ινστιτούτου Υδατοκαλλιεργειών του Ελληνικού Κέντρου Θαλάσσιων Ερευνών (ΕΛ.ΚΕ.Θ.Ε) Κρήτης. Για την διεξαγωγή της παρούσας μελέτης η πειραματική διαδικασία χωρίστηκε σε δύο μέρη: α) στον προσδιορισμό της αντιβακτηριακής δράσης αιθέριων ελαίων ρίγανης και μαντζουράνας, (in vitro πειράματα) και β) στην απολύμανση τροχόζωων B. plicatilis και αυγών τσιπούρας S. aurata (in vivo πειράματα). Α. Πειράματα in vitro Βακτηριακά στελέχη Για τον έλεγχο της αντιβακτηριακής δράσης χρησιμοποιήθηκαν πέντε βακτηριακά στελέχη της ομάδας Vibrio. Τα βακτηριακά στελέχη ήταν τα ακόλουθα: α) Listonella (Vibrio) anguillarum CECT 522, β) Vibrio splendidus DMC-1, γ) V. harveyi, δ) EKKO-6 (V. alginolyticus) και ε) ART-3 (Vibrio sp.). Τα τρία τελευταία στελέχη απομονώθηκαν στις εγκαταστάσεις του Ινστιτούτου Υδατοκαλλιεργειών. Υποστρώματα Στην έρευνα μας χρησιμοποιήθηκαν ως υποστρώματα τα TSBS (υγρό θρεπτικό μέσο), TCBS (εκλεκτικό για Vibrio υπόστρωμα) και TSAS (αντανακλά το συνολικό αριθμό καλλιεργήσιμων βακτηρίων). Τα υποστρώματα αυτά παρασκευάζονται ως εξής: 2

3 TSBS Tryptone Soy Broth (U.S.P) LAB Συστατικό Ποσότητα gr Tryptone Soy Broth 30 Sodium Chloride 20 TSAS - Tryptic Soy Agar Συστατικό Ποσότητα gr Tryptone Soy Broth 30 Άγαρ (Fluka, Spain) 15 Sodium Chloride 20 Τα παραπάνω συστατικά διαλύθηκαν σε 1 l απιονισμένου νερού που είχε υποστεί διήθηση (Whatman GF/C) και έπειτα ακολουθούσε βρασμός. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε αποστείρωση στους 125 ο C για 20 λεπτά. Με το πέρας των 20 λεπτών χρησιμοποιούνταν στα τριβλία Petri. TCBS Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose Agar (Merck, Germany) (No: ) Συστατικό Ποσότητα gr Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose 88 Σε 1 l απιονισμένου νερού μετά από διήθηση (Whatman GF/C) διαλυόταν το παραπάνω συστατικό και ακολουθούσε βρασμός. Το παραπάνω υπόστρωμα δεν αποστειρωνόταν και η χρήση του γινόταν αμέσως μετά την παρασκευή του, στα τριβλία Petri. Πειραματική Διαδικασία Προσδιορισμός ανάπτυξης Τα βακτηριακά στελέχη είχαν αποθηκευτεί σε πλαστικά μικροσφαιρίδια (Microbank ) της εταιρίας Pro-Lab Diagnostics στους -80 ο C. Ο προσδιορισμός της ανάπτυξης των βακτηριακών στελεχών έγινε με εμβολιασμό σε υγρό θρεπτικό μέσο TSBS σε όγκο των 5 ml. Οι καλλιέργειες επωάστηκαν για 24 ώρες σε συνθήκες δωματίου (20-22 o C), με τη βοήθεια έκκεντρου αναδευτήρα (Heidolph Inkubator), και 3

4 ταχύτητα ανάδευσης 120 στροφές min -1. Ακολούθησε μια διαδικασία 8 διαδοχικών δεκαδικών αραιώσεων (1:10-1:10 8 ) στις καλλιέργειες των βακτηριακών στελεχών. Το μέσο αραίωσης αποτελούνταν από 80% θαλασσινό νερό και 20% απιονισμένο νερό, το οποίο είχε υποστεί διήθηση (Whatman GF/C-47mm) και αποστείρωση. Σε πλαστικά τριβλία Petri των 90 mm που περιείχαν στερεό θρεπτικό μέσο TSAS απλώθηκαν 50 μl από τις αραιώσεις (1:10 5-1:10 8 ). Η παραπάνω διαδικασία πραγματοποιήθηκε δύο φορές. Με βάση τον αριθμό των αποικιών, υπολογίστηκε το CFU (Colony Forming Unit) ml -1, δηλαδή, ο αριθμός των αποικιών που σχηματίζονται ανά μονάδα όγκου του κάθε στελέχους, χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο: CFU ml -1 = Αριθμός Αποικιών 20 Συντελεστή Αραίωσης (ΙΙ) Οι αποικίες μετρήθηκαν στα τριβλία Petri για μια εβδομάδα μέχρι να ολοκληρωθεί η ανάπτυξη τους. Επίδραση αντιβακτηριακής δράσης των αιθέριων ελαίων στα βακτηριακά στελέχη Κάθε βακτηριακó στέλεχος εμβολιάστηκε σε υγρό θρεπτικό μέσο TSBS (5 ml) για 24 ώρες, σε θερμοκρασία δωματίου (22 o C), σε έκκεντρο αναδευτήρα και ταχύτητα ανάδευσης 120 στροφές min -1. Οι καλλιέργειες αραιώθηκαν 1:10 με μέσο αραίωσης 80% θαλασσινό νερό και 20% απιονισμένο νερό μετά από διήθηση και αποστείρωση. Κατόπιν 50 μl από τα αραιωμένα δείγματα απλώθηκαν σε τριβλία Petri με στερεό θρεπτικό μέσο TSAS. Ποσότητα 2 μl από κάθε δείγμα αιθέριου ελαίου (βλέπε προηγούμενο Π.Ε.2) τοποθετήθηκε σε χάρτινα δισκία, διαμέτρου 3 mm (Whatman, Schleicher and Schuel), στο κέντρο της επιφάνειας των τριβλίων. Ταυτόχρονα, προσδιορίστηκε τόσο η ανασταλτική δράση τριών ουσιών, οι οποίες εμπεριέχονται στα συστατικά των αιθέριων ελαίων ρίγανης και μαντζουράνας σε μεγάλη αναλογία, όσο και η ανασταλτική δράση του διαλύτη διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO, minimum 99,5%, GC, Sigma). Οι πρότυπες ουσίες που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: θυμόλη, καρβακρόλη (98%, Sigma Aldrich) και γ- τερπινένιο (98,5%, GC, Fluka). Χάρτινα δισκία με ποσότητα 2 μl από τα παραπάνω δείγματα ουσιών τοποθετήθηκαν στο κέντρο της επιφάνειας των τριβλίων. Κρίθηκε σκόπιμο να μελετηθεί και η ουσία 0/129 (2,4-διάμινο-6,7-διισοπρόπυλοπτεριδίνη) (150 μg/δισκίο) που έχει επιλεκτική ανασταλτική δράση ενάντια στα βακτήρια της 4

5 ομάδας Vibrio και χρησιμοποιήθηκε σαν θετική ομάδα ελέγχου. Μια ακόμα παράμετρος που συμπεριλήφθηκε για τον έλεγχο της αντιβακτηριακής δράσης ήταν η ομάδα αρνητικού ελέγχου (μάρτυρας), που τοποθετήθηκε ένα δισκίο δίχως το αιθέριο έλαιο στα τριβλία Petri. Η παραπάνω διαδικασία πραγματοποιήθηκε σε αποστειρωμένες συνθήκες και τα τριβλία Petri αποθηκεύτηκαν στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου (20-22 o C). Η αναστολή ανάπτυξης των βακτηριακών στελεχών με την χρήση των αιθέριων ελαίων πραγματοποιήθηκε με δυο επαναλήψεις, για κάθε χειρισμό. Η επίδραση των αιθέριων ελαίων στα βακτηριακά στελέχη έγινε εμφανής στα τριβλία Petri με την ανάδειξη μιας κυκλικής περιοχής αναστολής. Στο σημείο εκείνο παρατηρήθηκε η ανασταλτική δράση των αιθέριων ελαίων σε σύγκριση με την ανάπτυξη των βακτηριακών στελεχών. Αυτό επιβεβαιώθηκε έπειτα από την μέτρηση ακτίνας της κυκλικής περιοχής αναστολής στα τριβλία Petri δύο ημέρες αργότερα. Η ανάπτυξη της επίδρασης των ελαίων στα βακτήρια παρατηρήθηκε για μια εβδομάδα. Η φωτογραφική μηχανή που χρησιμοποιήθηκε για την λήψη των φωτογραφιών είναι μοντέλου (μ-mini Olympus, 5.0 mega pixel) και έγινε με παράλληλη χρήση τεχνητού φωτισμού. Β. Πειράματα in vivo Υλικά Στο Ινστιτούτο Υδατοκαλλιεργειών (ΕΛ.ΚΕ.Θ.Ε), καλλιεργείται το τροχόζωο Brachionus sp. το οποίο επιλέχθηκε για τα in vivo πειράματα που αφορούν την απολύμανση των τροχόζωων με τα αιθέρια έλαια της ρίγανης και της μαντζουράνας. Πειραματική Διαδικασία Επίδραση αιθέριων ελαίων στην πληθυσμιακή πυκνότητα των τροχόζωων α Προκαταρκτικά Πειράματα Η επίδραση των αιθέριων ελαίων στα τροχόζωα διερευνήθηκε αρχικός σε προκαταρτικά πειράματα σε συγκεντρώσεις των 10 και 20 ppm. Τα αιθέρια έλαια που, χρησιμοποιήθηκαν ήταν τα ακόλουθα δείγματα: oil 0, oil 2, oil 3, oil 5, oil 6, oil 7, oil 8, oil 9. Στη συγκέντρωση των 10 ppm δοκιμάστηκαν τα παραπάνω έλαια, ενώ για την συγκέντρωση των 20 ppm χρησιμοποιήθηκαν τα αιθέρια έλαια oil 0, oil 3 και 5

6 oil 8. Κάθε ένα από τα αιθέρια έλαια διαλύθηκε σε διαλύτη DMSO σε συγκέντρωση 1 ppt. Εν συνεχεία προστέθηκε η ανάλογη ποσότητα αυτού του ενδιάμεσου διαλύματος στα πειραματικά διαλύματα σε αραιωμένο θαλασσινό νερό (25 ppt) ώστε να επιτευχθεί η τελική συγκέντρωση των 10 και 20 ppm. Παράλληλα, υπήρξαν και δύο χειρισμοί κατά τους οποίους τα τροχόζωα εκτράφηκαν σε αραιωμένο θαλασσινό νερό (25 ppt) μάρτυρα και σε DMSO (1 ppt). Τα τροχόζωα (50 άτομα ml -1 ) επωάστηκαν σε falcon (χωρητικότητας 50 ml) σε όγκο 30 ml, και τοποθετήθηκαν σε έκκεντρο αναδευτήρα, με ταχύτητα ανάδευσης 120 στροφές min -1 για 24 ώρες. Το μέσο εκτροφής των τροχόζωων ήταν αραιωμένο θαλασσινό νερό (25 ppt), το οποίο είχε υποστεί διήθηση και αποστείρωση. Η παραπάνω διαδικασία πραγματοποιήθηκε σε δυο επαναλήψεις σε κάθε χειρισμό. Ο έλεγχος της επιβίωσης των τροχόζωων ολοκληρώθηκε με την καταμέτρηση της πυκνότητας των τροχόζωων (20 σταγόνες των 50 μl), συνολικού όγκου 1 ml στο διάστημα των 24 ωρών με τη βοήθεια στερεοσκοπίου (OLYMPUS SZ40). β Κυρίως in vivo πειράματα Σύμφωνα με τα ανωτέρω πειράματα, τα τροχόζωα, παρουσίασαν καλύτερη επιβίωση σε διαλύματα των αιθερíων ελαίων oil 0, oil 3 και oil 8, σε συγκεντρώσεις των 10 και 20 ppm. Για το λόγο αυτό, επιλέχθηκαν για τα in vivo πειράματα. Τα αιθέρια έλαια αραιώθηκαν σε διαλύτη DMSO (1:1000) και εν συνέχεια προστέθηκε η ανάλογη ποσότητα ενδιάμεσου διαλύματος (1 μl, 2 μl) ώστε να επιτευχθεί η τελική συγκέντρωση των 10 και 20 ppm, αντίστοιχα. Παράλληλα, υπήρξαν δύο χειρισμοί κατά τους οποίους τα τροχόζωα επωάστηκαν σε αραιωμένο θαλασσινό νερό (25 ppt), μάρτυρα και σε DMSO (1 ppt) χωρίς την προσθήκη του αιθέριου ελαίου. Τα τροχόζωα (50 άτομα ml -1 ) επωάστηκαν σε falcon (χωρητικότητας 50 ml) σε όγκο 30 ml, και τοποθετήθηκαν σε έκκεντρο αναδευτήρα, με ταχύτητα ανάδευσης 120 στροφές min -1 για 24 ώρες. Λήφθηκαν δείγματα σε 0, 4 και 24 ώρες μετά την εκκίνηση του πειράματος για τη μέτρηση της πυκνότητας των τροχόζωων. Ο έλεγχος της επιβίωσης των τροχόζωων πραγματοποιόταν σε στερεοσκόπιο μετρώντας την πυκνότητα των τροχόζωων. 6

7 Επίδραση αιθέριων ελαίων στην κολυμβητική ταχύτητα των τροχόζωων Παράλληλα, από τις καλλιέργειες στο κυρίως πείραμα ελέγχθηκε και η ταχύτητα της κολυμβητικής ικανότητας των τροχόζωων σε στερεοσκόπιο μετρώντας την ταχύτητα τους (20 σταγόνες των 50 μl). Ο έλεγχος της ταχύτητας πραγματοποιήθηκε στη συγκέντρωση των 10 ppm στο χρονικό διάστημα ενός εικοσιτετραώρου. Οι παραπάνω χειρισμοί πραγματοποιήθηκαν σε τρεις επαναλήψεις. Η ταχύτητα υπολογίστηκε από τον ακόλουθο τύπο: Ταχύτητα Τροχόζωων ( Διάσχιση τετραγώνων min -1 ) = Διάσχιση τετραγώνων σε χιλιοστομετρικό χαρτί σε 15 sec 4 (ΙΙΙ) Επίδραση των αιθέριων ελαίων στο μικροβιακό φορτίο των τροχόζωων Για την μείωση του μικροβιακού φορτίου που φέρουν τα τροχόζωα, πραγματοποιήθηκαν μικροβιολογικές δειγματοληψίες. Χρησιμοποιήθηκαν δύο στερεά θρεπτικά μέσα: το μέσο TSAS (Tryptic Soy Agar added Salt) που αντανακλά το συνολικό αριθμό καλλιεργήσιμων βακτηρίων στο δείγμα και το θρεπτικό TCBS (Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose agar) που αποτελεί επιλεκτικό μέσο για την ανάπτυξη βακτηρίων της ομάδας Vibrio. Από τις παραπάνω καλλιέργειες των τροχόζωων λήφθηκε ένα υπο-δείγμα (10 ml), το οποίο τοποθετήθηκε σε δίχτυ μεγέθους ματιού (50 μm) και ξεπλύθηκε με 50 ml θαλασσινό νερό (25 ppt), αφού είχε υποστεί διήθηση και αποστείρωση. Εν συνεχεία τα τροχόζωα μεταφέρθηκαν σε 10 ml αποστειρωμένου και διηθημένου θαλασσινού νερού (25 ppt). Από τα παραπάνω υπο-δείγματα, 2 ml ομογενοποιήθηκαν σε γυάλινους ομογενοποιητές (Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA). Παράλληλα, κρίθηκε απαραίτητο να υπολογιστεί ο αριθμός τον τροχόζωων που ομογενοποιήθηκε. Έτσι σε κάθε δείγμα μετρήθηκε η ο αριθμός των τροχόζωων ανά μονάδα όγκου με την χρήση στερεοσκοπίου από το εκάστοτε δείγμα. Τα ομογενοποιημένα τροχόζωα μετά από διαδοχικές δεκαδικές αραιώσεις (1:10, 1:100 και 1:1000) και με μέσο αραίωσης 80% θαλασσινό νερό και 20% απιονισμένο νερό μετά από διήθηση και αποστείρωση, απλώθηκαν (50 μl) σε τριβλία Petri με δυο επαναλήψεις και στα δυο στερεά θρεπτικά μέσα, (TSAS και TCBS). Η παραπάνω διαδικασία πραγματοποιήθηκε σε αποστειρωμένες συνθήκες και τα τριβλία Petri 7

8 αποθηκεύτηκαν στο σκοτάδι, σε θερμοκρασία δωματίου (20-22 o C). Ο έλεγχος για τον πληθυσμό των βακτηρίων (αποικίες) διαπιστώθηκε στα τριβλία Petri. Πραγματοποιήθηκε η καταμέτρηση των αποικιών, σε τρεις μετρήσεις για τον εκάστοτε χειρισμό, στο διάστημα μιας εβδομάδας. Με βάση τον αριθμό των αποικιών υπολογίστηκε το CFU του κάθε στελέχους. Απολύμανση αυγών Υλικά Πραγματοποιήθηκαν in vivo πειράματα κατά τα οποία ελέγχθηκε η απολύμανση των αυγών τσιπούρας (S. aurata). Τα αυγά λήφθηκαν από τις εγκαταστάσεις του ΕΛ.ΚΕ.Θ.Ε Κρήτης, με τη χρήση αιθέριων ελαίων. Πειραματική διαδικασία Επίδραση των αιθέριων ελαίων στο μικροβιακό φορτίο των αυγών Για την υλοποίηση αυτού του πειράματος, χρησιμοποιήθηκαν τα αιθέρια έλαια oil 0 και oil 3. Η επίδραση των αιθέριων ελαίων στα αυγά της τσιπούρας διερευνήθηκε με επώαση, στις συγκεντρώσεις 100, 200, 300 και 400 ppm για δέκα λεπτά. Τα αιθέρια έλαια αραιώθηκαν σε διαλύτη DMSO σε συγκέντρωση 1 ppt. Εν συνεχεία προστέθηκε η ανάλογη ποσότητα αυτού του ενδιάμεσου διαλύματος στα πειραματικά διαλύματα. Τα αυγά επωάστηκαν σε δοχεία όγκου 100 ml, με τελικό όγκο 30 ml. Το μέσο εκτροφής των αυγών ήταν θαλασσινό νερό (35 ppt), μετά από αποστείρωση και διήθηση, που περιλάμβανε την ανάλογη ποσότητα από την εκάστοτε συγκέντρωση του ενδιάμεσου διαλύματος. Εκτός από τους πειραματικούς χειρισμούς, υπήρξαν και δύο χειρισμοί, κατά τους οποίους τα αυγά εκτράφηκαν σε θαλασσινό νερό (35 ppt) μάρτυρα και σε DMSO (1 ppt) χωρίς την προσθήκη αιθέριων ελαίων. Πραγματοποιήθηκαν δυο επαναλήψεις για κάθε χειρισμό και όλο το πείραμα επαναλήφθηκε εις διπλούν. Όσον αφορά τις μικροβιολογικές δειγματοληψίες, χρησιμοποιήθηκε το στερεό θρεπτικό μέσο TSAS. Το θρεπτικό μέσο μετά την αποστείρωση τοποθετήθηκε σε υδατόλουτρο (NUVE bath) με σταθερή θερμοκρασία (50 ο C), ώστε να διατηρηθεί σε υγρή μορφή. 8

9 Με την πάροδο δέκα λεπτών στο κάθε πειράμα τα αυγά ξεπλύθηκαν με αποστειρωμένο και διηθημένο θαλασσινό νερό (35 ppt) και τοποθετήθηκε μια ελάχιστη ποσότητα αυγών (20 έως 50) από το εκάστοτε δείγμα σε τριβλία Petri. Ταυτόχρονα συμπληρώθηκε με περίπου 15 ml υγρό TSAS (50 ο C). Με την στερεοποίηση του θρεπτικού μέσου TSAS, τα τριβλία Petri επωάστηκαν σε, ψυχόμενο επωαστήρα T=16,5-17 ο C για επτά ημέρες. Η ανωτέρω διαδικασία πραγματοποιήθηκε σε τρία τριβλία Petri για κάθε επανάληψη. Για να διαπιστωθεί ενδεχόμενη μείωση του μικροβιακού φορτίου των αυγών, γινόταν καταγραφή των αποικιών στα τριβλία Petri. Έλεγχος εκκόλαψης αυγών τσιπούρας Για την επιβίωση και εκκόλαψη των αυγών χρησιμοποιήθηκαν πιάτα καλλιέργειας ιστού, (Tissue Culture Plate,24 Well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid), όπου σε κάθε κυλινδρική υποδοχή προστέθηκε 1 ml αποστειρωμένου διηθημένου θαλασσινού νερού (35ppt), θερμοκρασίας (Τ=16,5 ο C) με σκοπό να μην υπάρξει μεταβολή θερμοκρασίας από την δεξαμενή (αρχική προέλευση), στην πειραματική καλλιέργεια δεδομένου ότι τα αυγά είναι πολύ ευαίσθητα σε απότομες μεταβολές της θερμοκρασίας. Κάθε πιάτο καλλιέργειας ιστού είχε 24 κυλινδρικές υποδοχές όπου τοποθετηθήκαν από ένα έως δυο αυγά. Τα πιάτα διατηρήθηκαν στο ψυγείο σε θερμοκρασία (Τ=16,5 ο C). Τα αυγά εκκολάφτηκαν από την τρίτη ημέρα για όλους τους χειρισμούς. Έγινε καταμέτρηση ζωντανών αυγών, ζωντανών ιχθυονυμφών αλλά και των αντίστοιχων νεκρών αυγών και νυμφών, κατά την διάρκεια του πειράματος. Η καταμέτρηση των παραπάνω χειρισμών στα πιάτα πραγματοποιούνταν καθημερινώς για μια εβδομάδα, με την χρήση στερεοσκοπίου. Σύμφωνα με τους παραπάνω χειρισμούς, όσον αφορά την επίδραση των αιθέριων ελαίων στην συμπεριφορά απολύμανσης των αυγών, υπολογίστηκε το ποσοστό εκκόλαψης, την ημέρα που εκκολάφθηκαν τα αυγά, αλλά και το ποσοστό επιβίωσης στο τέλος του πειράματος. Η ανωτέρω διαδικασία πραγματοποιήθηκε σε αποστειρωμένες συνθήκες και πραγματοποιήθηκαν δυο επαναλήψεις για κάθε χειρισμό. 9

10 Στατιστική Ανάλυση Τα δεδομένα των in vivo πειραμάτων υποβλήθηκαν σε στατιστική επεξεργασία για τη σύγκριση των διαφόρων χειρισμών (αιθέρια έλαια, ομάδα ελέγχου, DMSO) στα δύο θρεπτικά μέσα (TSAS και TCBS). Η κανονικότητα της κατανομής και η ομοιογένεια της διακύμανσης ελέγχθηκαν αφού προηγήθηκε μετασχηματισμός των δεδομένων όπου κρίθηκε απαραίτητο. Για το λόγο αυτό, προηγήθηκε μετατροπή με λογάριθμο στα δεδομένα της απολύμανσης των αυγών. Η μονοπαραγοντική ανάλυση διακύμανσης (one-way ANOVA) εφαρμόστηκε σε όλα δεδομένα, πλην της επιβίωσης των τροχόζωων, στα οποία εφαρμόστηκε η μηπαραμετρική δοκιμασία Kruskal Wallis. Επιμέρους συγκρίσεις έγιναν με τη δοκιμασία Fischer s least significant difference (LSD). Στους πίνακες και τα γραφήματα εμφανίζονται οι αρχικές τιμές ± τυπικό σφάλμα. Οι διαφορές εξετάσθηκαν στατιστικά σε επίπεδο P<0,05 (Statgraphics Plus 5, Statistical Graphics Corp). 10

11 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Αποτελέσματα in vitro πειραμάτων Επίδραση αντιβακτηριακής δράσης των αιθέριων ελαίων στα βακτηριακά στελέχη Τα φυσικά προϊόντα από τα αιθέρια έλαια, που χρησιμοποιήθηκαν για την διεξαγωγή της παρούσας έρευνας δοκιμάστηκαν στον έλεγχο της αντιμικροβιακής δράσης. Η δράση του κάθε αιθέριου ελαίου έγινε εμφανής στα τριβλία Petri με μια κυκλική περιοχή αναστολής, όπου διαπιστώθηκε η ανασταλτική δράση των αιθέριων ελαίων έναντι των πέντε βακτηριακών στελεχών της ομάδας Vibrio. Για τους πειραματικούς σκοπούς τα δέκα δείγματα των αιθέριων ελαίων αναφέρονται με αρίθμηση από oil 0 έως oil 9 που αντιστοιχούν σε διαφορετικά δείγματα. Τα in vitro πειράματα πραγματοποιήθηκαν δυο φορές (προκαταρκτικό και κυρίως πείραμα) και τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στους παρακάτω Πίνακες Α1 και Α2. Ο προκαταρκτικός έλεγχος στις καλλιέργειες των βακτηριακών στελεχών Listonella (Vibrio) anguillarum, V. Splendidus και V. harveyi (Πίνακας Α1) έδειξε ενθαρρυντικά αποτελέσματα στα αιθέρια έλαια της ρίγανης και της μαντζουράνας. Η ανασταλτική δράση των ελαίων έναντι των βακτηριακών στελεχών παρατηρήθηκε κατά τη διάρκεια ενός εικοσιτετραώρου. Από τα δείγματα των αιθέριων ελαίων που μελετήθηκαν παρατηρήθηκε (Πίνακας Α1), ότι το oil 3 (μαντζουράνα) εμφάνισε την μέγιστη ανασταλτική δράση κατά των βακτηρίων L. anguillarum (μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα) (12,4±0,4 mm) και V. splendidus (6,5±0,5mm), ενώ η μέγιστη τιμή ανασταλτικής δράσης στο βακτηριακό στέλεχος V. harveyi παρουσιάστηκε στο oil 0 (6,0±0,0 mm). Αντιθέτως, οι ελάχιστες τιμές ανασταλτικής δράσης των βακτηριακών στελεχών V. harveyi και V. splendidus παρουσιάστηκαν στα δείγματα oil 2 (4,8±0,2 και 3,0±0,0 mm) αντίστοιχα. Το oil 2 εμφάνισε την μικρότερη τιμή στο V. splendidus που ήταν και η μικρότερη τιμή αντιβακτηριακής δράσης αιθερίου ελαίου στα βακτηριακά στελέχη, από όλα τα δείγματα. Επίσης, για το βακτηριακό στέλεχος L. anguillarum, η ελάχιστη ανασταλτική δράση που παρατηρήθηκε ήταν στο δείγμα oil 5 (9,0±1,0 mm). Στην ομάδα ελέγχου δεν διαπιστώθηκε καμία περιοχή αναστολής, επειδή το χάρτινο δισκίο που τοποθετήθηκε στο τριβλίο, δεν περιείχε αιθέριο έλαιο, παρά μόνο το βακτηριακό στέλεχος στο στερεό θρεπτικό μέσο TSAS (Πίνακας Α1), όπου παρατηρήθηκε η ανεμπόδιστη ανάπτυξη του. Επομένως, το χάρτινο δισκίο 11

12 δίχως την προσθήκη αιθέριων ελαιών δεν παρουσίασε ανασταλτική δράση. Αυτό επιβεβαιώνει ότι η ανασταλτική δράση οφείλεται στην παρουσία των αιθέριων ελαίων ρίγανης και μαντζουράνας. Πίνακας Α1. Η ακτίνα της περιοχής αναστολής στα τριβλία Petri (mm) (μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα) στα αιθέρια έλαια ρίγανης και μαντζουράνας ενάντια στα βακτηριακά στελέχη του γένους Vibrio (n=2) Φυσικά Προϊόντα Αιθέρια έλαια Βακτηριακά Στελέχη L. anguillarum V. splendidus V. harveyi Μάρτυρας 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 oil 0 10,5±0,5 5,5±0,5 6,0±0,0 oil 1 9,5 ± 0,5 5,4±0,6 5,5±0,5 oil 2 10,0±0,0 3,0±0,0 4,8±0,2 oil 3 12,4±0,4 6,5±0,5 5,2±0,2 oil 4 10,2±0,2 5,5±0,5 5,7±0,1 oil 5 9,0±1,0 5,2±0,2 5,0±0,4 oil 6 9,5±0,5 4,6±0,0 5,0±0,6 oil 7 9,3±0,3 4,7±0,3 5,6±0,4 oil 8 oil 9 11,4±0,0 4,5±0,1 5,7±0,3 10,0±0,0 6,0±0,0 5,8±0,2 Ακολούθως, παρουσιάζονται τα αποτελέσματα της ανασταλτικής δράσης των αιθέριων ελαίων που εμφάνισαν αντιβακτηριακή δράση στα βακτηριακά στελέχη L. anguillarum, V. splendidus, EKKO-6 (V. alginolyticus) και ART-3 (Vibrio sp.) (κυρίως πείραμα). Όπως και στο προηγούμενο πείραμα, μετρήθηκε η ακτίνα δράσης των ελαίων στα τριβλία Petri και τα αποτελέσματα τους, παρουσιάζονται στον Πίνακα Α2. Επιπλέον, μια βασική παράμετρος που λήφθηκε υπόψη και παρουσιάζεται στον παρακάτω πίνακα ήταν ο έλεγχος της δράσης των πρότυπων ουσιών, θυμόλης, καρβακρόλης και γ-τερπινενίου καθώς και της ουσίας 0/129 που έχει επιλεκτική ανασταλτική δράση ενάντια στα βακτήρια της ομάδας Vibrio. Τέλος παρατηρήθηκαν, οι ομάδες ελέγχου και η ομάδα DMSO ως προς την ανασταλτική δράση των βακτηριακών στελεχών. Η ανασταλτική δράση των ελαίων στα βακτηριακά στελέχη έδειξε θετικά αποτελέσματα ως προς την αντιβακτηριακή τους δράση. Κάθε βακτηριακό στέλεχος 12

13 δρα διαφορετικά ως προς τα αιθέρια έλαια, ανάλογα με την πυκνότητα του κάθε βακτηρίου (Πίνακας Α3). Τα βακτηριακά στελέχη L. anguillarum και ART-3 (Vibrio sp.) παρουσίασαν την μέγιστη ανασταλτική δράση στο δείγμα του αιθέριου ελαίου oil 0 (μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα) με τιμές 14,1±0,1 και 14,5±0,5 mm αντίστοιχα. Παρομοίως, τα βακτηριακά στελέχη V. splendidus και EKKO-6 (V. alginolyticus) είχαν την μέγιστη ανασταλτική δράση (14,3±0,1 και 13,6±0,6 mm αντίστοιχα) στο δείγμα oil 8. Ωστόσο, οι ελάχιστες τιμές που μετρήθηκαν στα δείγματα των αιθέριων ελαίων για το L. anguillarum ήταν στο oil 6 (9,1±0,7), για το V. splendidus το oil 5 (8,8±0,6), στο EKKO-6 (V. alginolyticus) το oil 3 (7,8±0,2) και τέλος για το ART-3 (Vibrio sp.). Η μικρότερη αντιβακτηριακή δράση παρατηρήθηκε στο oil 7 (7,6±0,2). Παράλληλα, εξίσου σημαντικά αποτελέσματα παρουσίασαν και οι πειραματικοί χειρισμοί των πρότυπων ουσιών. Οι φαινολικές ουσίες θυμόλη και καρβακρόλη παρουσίασαν μεγαλύτερη αντιβακτηριακή δράση σε σχέση με τα μείγματα των ουσιών των αιθέριων ελαίων, ενώ το γ-τερπινένιο συγκριτικά με τις φαινολικές ουσίες παρουσίασε μικρότερη ανασταλτική δράση στα βακτηριακά στελέχη. Στην παρούσα μελέτη αποδείχθηκε πως η καρβακρόλη είχε πιο ενεργή δράση από τις άλλες ουσίες, αφού παρουσίασε κατά μέσο όρο τιμές (15,2±0,2 mm) σε όλα τα βακτηριακά στελέχη που χρησιμοποιήθηκαν και η ανασταλτική δράση που σχηματίστηκε στο τριβλίο Petri υπερκάλυπτε σχεδόν όλη την επιφάνεια του τριβλίου. Επίσης, τα αιθέρια έλαια από τα φυτά της ρίγανης (oil 0-2 και oil 4-9) και της μαντζουράνας (oil 3) είχαν τη μέγιστη αντιμικροβιακή δράση συγκριτικά με την θετική ομάδα ελέγχου 0/129 (7,5±0,4 mm) και στα τέσσερα βακτηριακά στελέχη. Η ομάδα ελέγχου και η ομάδα DMSO δεν παρουσίασαν ανασταλτική δράση ενάντια στα βακτηριακά στελέχη επειδή το χάρτινο δισκίο που τοποθετήθηκε στο τριβλίο δεν περιείχε αιθέριο έλαιο και παρατηρήθηκε μόνο η ανάπτυξη του κάθε βακτηριακού 13

14 Πίνακα Α2. Η ακτίνα της περιοχής αναστολής στα τριβλία Petri (mm) (μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα) στα αιθέρια έλαια ρίγανης και μαντζουράνας ενάντια στα βακτηριακά στελέχη της ομάδας Vibrio (n=2) Αιθέρια Έλαια & Πρότυπες Ουσίες Βακτηριακά Στελέχη L. anguillarum V. splendidus ΕΚΚΟ-6 V. alginolyticus ART-3 (Vibrio sp.) % Φαινολικά Συστατικά Αιθέριων Ελαίων % Θυμόλη % Καρβακρόλη Μάρτυρας 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 - - DMSO 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 - - oil 0 14,1±0,1 13,8±0,2 9,8±0,2 14,5±0,5 72,43 7,19 oil 1 11,5±0,7 7,30±0,7 8,8±0,0 12,6±0,4 9,58 79,36 oil 2 13,9±0,3 10,1±0,5 11,5±0,5 9,9±0,1 9,11 85,52 oil 3 11,5±0,5 9,2±0,2 7,8±0,2 8,9±0,7 11,03 63,24 oil 4 10,7±0,3 10,8±0,4 7,9±0,7 10,1±0,1 6,30 73,83 oil 5 10,7±0,3 8,8±0,6 8,6±0,4 10,2±0,2 67,43 9,10 oil 6 9,1±0,7 10,8±0,0 8,6±0,6 9,8±0,4 56,26 8,87 oil 7 9,2±0,4 12,6±0,6 8,6±0,2 7,6±0,2 34,62 46,65 oil 8 13,8±0,2 14,3±0,1 13,6±0,6 11,1±0,1 20,21 66,18 oil 9 13,1±0,7 14,0±0,0 9,2±0,4 13,5±0,5 55,30 10,45 Θυμόλη 12,5±0,5 12,8±0,4 12,0±0,0 12,6±0,4 - - καρβακρόλη 15,2±0,2 15,6±0,0 14,7±0,3 15,3±0,3 - - γ-τερπινένιο 8,3±0,7 9,6±0,6 5,2±0,0 5,4±0, /129 8,1±0,1 8,0±0,2 6,5±0,5 7,4±0,

15 στελέχους στα τριβλία Petri, όπως είχε διαπιστωθεί και στα προκαταρτικά πειράματα (Πίνακας Α1). Η αντιβακτηριακή δράση των αιθέριων ελαίων που χρησιμοποιήθηκαν έδειξε να εξαρτάται από το είδος του αρωματικού φυτού. Λόγω του μεγάλου εύρους συγκεντρώσεων θυμόλης και καρβακρόλης στα δυο κύρια συστατικά των αιθέριων ελαίων και δεδομένου ότι η αντιβακτηριακή δράση είναι συνυφασμένη με αυτές τις δυο φαινολικές ουσίες, στον Πίνακα Α2 παρουσιάζονται και τα ποσοστά συμμετοχής των δειγμάτων που συμμετείχαν στα αιθέρια έλαια συμβάλλοντας στην ανασταλτική δράση των βακτηρίων. Η ανασταλτική δράση των αιθέριων ελαίων στα βακτηριακά στελέχη που χρησιμοποιήθηκαν για την διεξαγωγή των in vitro πειραμάτων παρουσιάζονται παρακάτω στην Εικόνα Α1. Λόγω του μεγάλου πληθυσμού δειγμάτων αιθέριων ελαίων που δοκιμάστηκαν στα παθογόνα βακτήρια, παρατίθεται μόνο μια φωτογραφία από το κάθε βακτηριακό στέλεχος και κάποια τυχαία δείγματα από τα αιθέρια έλαια. Πυκνότητες των βακτηριακών κυττάρων στις καλλιέργειες Ο αριθμός των αποικιών υπολογίστηκε με το CFU του κάθε στελέχους, σύμφωνα με το οποίο μπορεί να παρατηρηθεί η πυκνότητα του κάθε βακτηριακού στελέχους. Ο υπολογισμός των πυκνοτήτων ήταν απαραίτητος για την σωστή ποσότητα στα τριβλία Petri και την ανάπτυξη του κάθε βακτηρίου. Τέλος, μετρήθηκαν οι αποικίες στα τριβλία Petri της κάθε αραίωσης και τα αποτελέσματα παρουσιάζονται παρακάτω (Πίνακας Α3) Πίνακας Α3. Πληθυσμιακές πυκνότητες των βακτηριακών στελεχών (αποικίες ανά ml) στις υγρές καλλιέργειες. Παθογόνα Βακτήρια Πυκνότητες L. anguillarum 5.3 x 10 8 V.splendidus 5.6 x 10 8 EKKO x 10 8 ART-3 1,4 x

16 Εικόνα Α1: Απεικόνιση της αντιβακτηριακής ζώνης αναστολής, που παρουσίασαν τα αιθέρια έλαια στα βακτηριακά στελέχη της ομάδας Vibrio : 1) oil 9 έναντι του βακτηρίου V. anguillarum, 2) oil 8 έναντι του βακτηρίου ART-3 (Vibrio sp.),3) oil 0 έναντι του βακτηρίου ΕΚΚΟ-6 (V.alginolyticus), 4) oil 2 έναντι του βακτηρίου V. harveyi, 5) oil 2 έναντι του βακτηρίου V. splendidus, 6) η ουσία καρβακρόλη έναντι του βακτηρίου ΕΚΚΟ-6, 7) 0/129 έναντι του βακτηρίου ART-3, 8) η ουσία θυμόλη έναντι του βακτηρίου ΕΚΚΟ-6, 9) η ουσία γ- τερπινένιο έναντι του βακτηρίου ΕΚΚΟ-6, 10) το DMSO στο βακτήριο ART-3, 11) η ομάδα ελέγχου (μάρτυρας) στο βακτήριο L.anguillarum. 16

17 Β. Πειράματα in vivo Απολύμανση τροχόζωων B. plicatilis με τη χρήση αιθέριων ελαίων Αξιολόγηση των ελαίων στην πληθυσμιακή πυκνότητα των τροχόζωων Η επίδραση των αιθέριων ελαίων στα τροχόζωα (50 άτομα ml -1 ) διερευνήθηκε σε προκαταρτικά πειράματα, ώστε να ελεγχθεί η επιβίωση των τροχόζωων στις συγκεντρώσεις των 10 και 20 ppm στο χρονικό διάστημα των 24 ωρών. Ο έλεγχος της επιβίωσης των τροχόζωων παρουσίασε μεγάλο εύρος αποτελεσμάτων. Στο Διάγραμμα Β1, απεικονίζεται η πορεία των τροχόζωων που επωάστηκαν σε υδάτινο διάλυμα αιθέριων ελαίων από τα φυτά του γένους Origanum. Η επώαση των τροχόζωων με τα αιθέρια έλαια στο διάστημα ενός εικοσιτετραώρου δεν επηρέασε την επιβίωση τους. Παρατηρήθηκε στα δείγματα που είχαν επωαστεί με τα αιθέρια έλαια, ότι έδειξαν μεγαλύτερη επιβίωση σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, το DMSO (P<0,05) και το oil 3 (20 ppm). Η πληθυσμιακή πυκνότητα των τροχόζωων δεν επηρεάστηκε από την χρήση του αιθερίου ελαίου στη συγκέντρωση των 10 ppm για όλα τα δείγμα. Όμως τo δείγμα oil 3, (αιθέριο έλαιο μαντζουράνας), στη συγκέντρωση των 20 ppm έδρασε ανασταλτικά στους ζωντανούς ζωοπλαγκτονικούς οργανισμούς και παρουσίασε υψηλά ποσοστά θνησιμότητας τροχόζωων σε σχέση με τα άλλα είδη ρίγανης, ως προς την πληθυσμιακή πυκνότητα. Ο αριθμός των τροχόζωων (μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα) στο μάρτυρα ήταν 77,8±2 για τα 10 ppm και 72,8±1,5 στη συγκέντρωση των 20 ppm αρχικής πληθυσμιακής πυκνότητας. Από τους πειραματικούς χειρισμούς την μέγιστη πυκνότητα επιβίωσης τροχόζωων εμφάνισε το oil 0 (114,3±1,8) και ακολούθησαν τα δείγματα oil 3 (101,3±0) και oil 8 (106±2) για την συγκέντρωση των 10 ppm, ενώ την ελάχιστη τιμή παρουσίασε το DMSO (72,3±3,3) στα 10 ppm. Συγκρίνοντας τον πληθυσμό των τροχόζωων στα 10 ppm, παρατηρήθηκε μια ελάχιστη μείωση ως προς την πυκνότητα στην συγκέντρωση των 20 ppm. Στη συγκέντρωση των 20 ppm οι χειρισμοί των αιθέριων ελαίων έδρασαν θετικά στην επιβίωση των τροχόζωων σε σχέση με τις ομάδες ελέγχου μάρτυρα και DMSO. Παρατηρήθηκε ανάμεσα στις δυο συγκεντρώσεις, πώς η συγκέντρωση των 10 ppm ήταν πιο αποτελεσματική ως προς την επιβίωση των τροχόζωων. Στα δείγματα των αιθέριων ελαίων διαπιστώθηκε 17

18 διαφορετική επίδραση του πληθυσμού των τροχόζωων, που αυτό ίσως οφείλεται στην ύπαρξη διαφορετικών αναλόγιών των συστατικών που εμπεριέχονται στο κάθε 18

19 Επιβίωση Τροχόζώων (άτομα ml -1 ) P < 0, h fg fg cd c c b ef ef cde cde cde de cde a * cntrl DMSO oil 0 oil 2 oil 3 oil 5 oil 6 oil 7 oil 8 oil 9 Χειρισμός Διάγραμμα Β1. Επίδραση των αιθέριων ελαίων (control: μάρτυρας, DMSO, oil 0, oil 2, oil 5, oil 6, oil 9: αιθέρια έλαια ρίγανης O. vulgare subsp. hirtum, oil 7- oil 8: αιθέρια έλαια ρίγανης O. onites, oil 3 αιθέριο έλαιο μαντζουράνας), στην επιβίωση των τροχόζωων (μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα) στις συγκεντρώσεις των 10 και 20 ppm (10 ppm: άσπρο χρώμα, 20 ppm: σκιασμένο) κατά τη διάρκεια ενός εικοσιτετραώρου (n=2). Οι χειρισμοί με διαφορετικό γράμμα στον εκθέτη είναι στατιστικά σημαντικά διαφορετικοί (P < 0,01). * Στη συγκέντρωση των 20 ppm στο oil 3 παρατηρήθηκε 100% θνησιμότητα τροχόζωων, με αποτέλεσμα η επιβίωση να έχει μηδενική τιμή. 19

20 δείγμα. Από το διάγραμμα Β2, τα δείγματα oil 0, oil 3 και oil 8 των αιθέριων ελαίων είχαν την μέγιστη πληθυσμιακή πυκνότητα στην επιβίωση των τροχόζωων και έτσι χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα απολύμανσης τροχόζωων, που αναλύονται παρακάτω. Επίδραση των ελαίων στο βακτηριακó φορτίο των τροχόζωων Η επώαση των τροχόζωων στο υδάτινο διάλυμα των αιθέριων ελαίων ρίγανης και μαντζουράνας οδήγησε στη μείωση του βακτηριακού φορτίου, όπως φαίνεται στα διαγράμματα (Β2έως Β5) που παρατίθενται παρακάτω. Αυτό επιτελέστηκε με τον εμβολιασμό των ομογενοποιημένων τροχόζωων και στα δύο στερεά θρεπτικά μέσα (TSAS, TCBS). Η απολύμανση των τροχόζωων στο υδάτινο διάλυμα αιθέριων ελαίων του γένους Origanum επιτεύχθηκε στο διάστημα των τεσσάρων ωρών και συνέβαλε στη μείωση των βακτηρίων, στις συγκεντρώσεις των 10 και 20 ppm. Ο αριθμός των αποικιών ανά τροχόζωο (μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα) κατά την εκκίνηση του πειράματος ήταν 2021±318 για το TSAS και 1507±726 για το TCBS. Στο γράφημα Β2απεικονίζεται ο αριθμός των αποικιών ανά τροχόζωο (μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα) σε στερεό θρεπτικό μέσο TSAS στα 10 ppm. Παρατηρήθηκε ότι ο συνολικός αριθμός αποικιών στο TSAS ήταν στατιστικά σημαντικά χαμηλότερος (P<0,05) στις ομάδες που επωάστηκαν με την χρήση αιθέριων ελαίων στη συγκέντρωση 10 ppm, σε σχέση με την ομάδα ελέγχου. Αντίθετα, η διαφορά ως προς την ομάδα DMSO ήταν στατιστικά σημαντικά χαμηλότερη μόνο για τα έλαια oil 3 και oil 8. Το δείγμα oil 8 (O. onites) παρουσίασε την καλύτερη απολύμανση από τα δείγματα των αιθέριων ελαίων. Ο αριθμός των αποικιών στο oil 8 ήταν (549±68 CFU ml -1 ), ενώ στην ομάδα ελέγχου (1553±159 CFU ml -1 ). Όσον αφορά τα αποτελέσματα στο θρεπτικό μέσο TCBS, (Διάγραμμα Β3) που αποτελεί επιλεκτικό μέσο για την ανάπτυξη βακτηρίων της ομάδας Vibrio, παρατηρήθηκε σημαντική μείωση των βακτηρίων στα δείγματα τροχόζωων που επωάστηκαν σε διαλύματα των αιθέριων ελαίων. Η μέγιστη απολύμανση παρατηρήθηκε στον πειραματικό χειρισμό oil 8 (42±5 CFU ml -1 ). Διαπιστώθηκε ότι ο αριθμός των αποικιών ανά τροχόζωο ήταν σημαντικά χαμηλότερος (P<0,05) στις ομάδες που επωάστηκαν με τα αιθέρια έλαια στη συγκέντρωση των 10 ppm, αναφορικά με την ομάδα ελέγχου και DMSO. 20

21 Αριθμός αποικιών / Τροχόζωο (CFU ml -1 ) Αριθμός Αποικιών / Τροχόζωο (CFU ml- 1 ) c P < 0,05 bc ab a a Cοntrol DMSO oil 0 oil 3 oil 8 Χειρισμός Διάγραμμα Β2. Αριθμός αποικιών ανά τροχόζωο (μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα) σε στερεό θρεπτικό μέσο TSAS στη συγκέντρωση των 10 ppm (control: μάρτυρας) μετά από 4 ώρες επώασης, (n=2). Οι χειρισμοί με διαφορετικό γράμμα στον εκθέτη είναι στατιστικά σημαντικά διαφορετικοί (P < 0,05) c b P < 0, a a a Cοntrol DMSO oil 0 oil 3 oil 8 Χειρισμός Διάγραμμα Β3. Αριθμός αποικιών ανά τροχόζωο (μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα) σε στερεό θρεπτικό μέσο TCBS στη συγκέντρωση των 10ppm (control: μάρτυρας) μετά από 4 ώρες επώασης, (n=2). Οι χειρισμοί με διαφορετικό γράμμα στον εκθέτη είναι στατιστικά σημαντικά διαφορετικοί (P<0,05). Στη συγκέντρωση των 20 ppm χρησιμοποιήθηκαν μόνο δύο έλαια (oil 0 και oil 8). Το oil 3 δεν χρησιμοποιήθηκε γιατί σε προκαταρκτικά πειράματα όπως αναφέρθηκε προηγουμένως διαπιστώθηκε ότι προκαλεί αυξημένη θνησιμότητα στα τροχόζωα. Στο πείραμα αυτό παρατηρήθηκε ότι ο συνολικός αριθμός βακτηρίων στο TSAS ήταν σημαντικά χαμηλότερος (P<0,05) σε σχέση με την ομάδα ελέγχου. Αντίθετα, η διαφορά ως προς την ομάδα DMSO ήταν σημαντικά χαμηλότερη μόνο για το έλαιο oil 8, (Διάγραμμα Β4). Το δείγμα oil 8 παρουσίασε την μέγιστη απολύμανση στα τροχόζωα, με αριθμό βακτηρίων (502 ± 13 CFU ml -1 ), ενώ ο 21

22 Αριθμός Αποικιών / Τροχόζωο (CFU ml -1 ) Αριθμός Απικοιών / τροχόζωο (CFU ml-1) αριθμός των βακτηρίων στις ομάδες ελέγχου ήταν σημαντικά μεγαλύτερος ως προς τα δείγματα των αιθέριων ελαίων (1533 ± 22 CFU ml -1 ) για το μάρτυρα και (1233 ± 181 CFU ml -1 ) για το DMSO. Όσον αφορά τα αποτελέσματα στο θρεπτικό μέσο TCBS, παρατηρήθηκε ότι ο αριθμός αποικιών ανά τροχόζωο ήταν σημαντικά χαμηλότερος (P<0,05) στις ομάδες που επωάστηκαν με τα αιθέρια έλαια στη συγκέντρωση των 20 ppm, αναφορικά με την ομάδα ελέγχου και το DMSO (Διάγραμμα Β4). Το δείγμα oil 8 παρουσίασε ελάχιστες βακτηριακές αποικίες (40±8 CFU ml -1 ), στο θρεπτικό μέσω TCBS που όπως παρατηρήθηκε αποδείκτηκε η καλύτερη απολύμανση, ενώ το oil 0 είχε (86±53 CFU ml -1 ) αριθμό αποικιών c b c Control DMSO oil 0 oil 8 Χειρισμός a b P < 0,05 a Διάγραμμα Β4. Αριθμός αποικιών ανά τροχόζωο (μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα) σε στερεό θρεπτικό μέσο TSAS στη συγκέντρωση των 20ppm (control: μάρτυρας) μετά από 4 ώρες επώασης, (n=2). Οι χειρισμοί με διαφορετικό γράμμα στον εκθέτη είναι στατιστικά σημαντικά διαφορετικοί (P < 0,05) c b P < 0, a a 0 Control DMSO oil 0 oil 8 Χειρισμός Διάγραμμα Β5. Αριθμός αποικιών ανά τροχόζωο (μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα) σε στερεό θρεπτικό μέσο TCBS στη συγκέντρωση των 20 ppm (control: μάρτυρας) μετά από 4 ώρες 22

23 επώασης, (n=2). Οι χειρισμοί με διαφορετικό γράμμα στον εκθέτη είναι στατιστικά σημαντικά διαφορετικοί (P < 0,05). Από τα παραπάνω αποτελέσματα των μικροβιολογικών δειγματοληψιών αποδείχτηκε ότι τα αιθέρια έλαια των ειδών του γένους Origanum έχουν ικανοποιητική δράση κατά των βακτηρίων που φέρουν τα τροχόζωα. Η μείωση του βακτηριακού φορτίου των τροχόζωων εξαρτήθηκε από το είδος του αρωματικού φυτού. Όλα τα αιθέρια έλαια που χρησιμοποιήθηκαν ελάττωσαν τον αριθμό των Vibrio ανά τροχόζωο. Το αιθέριο έλαιο της ρίγανης (O. onites, oil 8), ήταν το ισχυρότερο στην απολύμανση των τροχόζωων. Η απολύμανση πραγματοποιήθηκε με επιτυχία στα 10 και 20 ppm, επομένως η χρήση διαλύματος αιθέριου ελαίου σε συγκέντρωση 10 ppm κρίνεται επαρκής. Επίδραση αιθέριων ελαίων στην ταχύτητα κολυμβητικής των τροχόζωων Για την εκτίμηση της φυσιολογικής κατάστασης των τροχόζωων, υπολογίστηκε η κολυμβητική τους ταχύτητα στα εμπλουτισμένα δείγματα των αιθέριων ελαίων των πειραματικών χειρισμών. Τα αποτελέσματα της κολυμβητικής ταχύτητας των τροχόζωων δεν έδειξαν σημαντικά στατιστικές διαφορές μεταξύ των χειρισμών (μάρτυρας, DMSO, oil 0, oil 3 και oil 8) στις δειγματοληψίες των 4 και 24 ωρών. Ο αριθμός των τροχόζωων (μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα) κατά την εκκίνηση του πειράματος ήταν 19,2±1,2 mm/sec. Οι τιμές των αιθέριων ελαίων και των ομάδων ελέγχου παρουσιάζονται στον Πίνακα Β1 Το oil 8 παρουσίασε την μέγιστη κολυμβητική ταχύτητα (μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα) στο διάστημα των 4 ωρών, (18,7±0,9 mm/sec) ενώ η ελάχιστη κολυμβητική ταχύτητα των τροχόζωων μετρήθηκε στο DMSO (15,7±0,9 mm/sec), ωστόσο οι διαφορές δεν ήταν σημαντικές. Παρομοίως, στο διάστημα των 24 ωρών, το oil 8 παρουσίασε την μέγιστη ταχύτητα (19,2±0,8 mm/sec), η οποία είναι ίδια με την αρχική ταχύτητα σε χρόνο 0, και την ελάχιστη το δείγμα ελέγχου, μάρτυρας (13,3±0,6 mm/sec). Συμπεραίνουμε λοιπόν πως η χρήση των αιθέριων ελαίων δεν επηρέασε την ταχύτητα της κολυμβητικής ικανότητας των τροχόζωων. 23

24 Πίνακας Β1 Ταχύτητα τροχόζωων (μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα) σε mm/sec, σε συγκέντρωσης 10 ppm (control: μάρτυρας), (n=3). Χειρισμοί 4 Ώρες 24 Ώρες Control 16,3±0,5 13,3±0,6 DMSO 15,7±0,9 15,1±0,9 oil 0 17,7±0,8 14,1±0,7 oil 3 16,7±0,8 14,7±0,6 oil 8 18,7±0,9 19,2±0,8 Επίδραση αιθέριων ελαίων στην πληθυσμιακή πυκνότητα των τροχόζωων Ολοκληρώνοντας τα in vivo πειράματα της απολύμανσης των τροχόζωων, αυτό που αξιολογήθηκε ήταν η πορεία της πυκνότητάς τους (Διάγραμμα Β6). Έτσι, λήφθηκαν δείγματα στις συγκεντρώσεις των 10 και 20 ppm στο διάστημα των τεσσάρων ωρών, που το κυρίως πείραμα είχε πραγματοποιηθεί. Να σημειώσουμε, ότι τα δείγματα που εξετάστηκαν ήταν τα (oil 0, oil 3, oil 8) στα 10 ppm και στα 20 ppm τα (oil 0 και oil 8). Ο αριθμός των τροχόζωων (50 άτομα ml -1 ) (μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα) κατά την εκκίνηση του πειράματος ήταν 267±10 άτομα ml -1. Παρατηρήθηκε ότι η επίδραση των αιθέριων ελαίων ως προς την επιβίωση των τροχόζωων ήταν στατιστικά σημαντικά μεγαλύτερη από την ομάδα ελέγχου και DMSO (P<0,05). Η ομάδα ελέγχου και το DMSO διέφεραν σημαντικά από όλους τους πειραματικούς χειρισμούς των αιθέριων ελαίων στην απολύμανση των τροχόζωων, εκτός από το oil 0 στα 20 ppm. Οι χειρισμοί oil 0 και oil 8 παρουσίασαν στατιστικά σημαντικά μεγαλύτερη επιβίωση τροχόζωων σε σύγκριση με τους άλλους χειρισμούς που είχαν επωαστεί με τα αιθέρια έλαια. Η συγκέντρωση των 10 ppm για τα δείγματα που είχαν επωαστεί με αιθέριο έλαιο στο διάστημα των τεσσάρων ωρών παρουσίασε καλύτερη συμπεριφορά επιβίωσης στα τροχόζωα (άτομα ml -1 ), σε σχέση με την συγκέντρωση των 20 ppm. 24

25 Επιβίωση Τροχοζώων (ατομα ml -1 ) P < 0, c c b ab a a a a Cntrl DMSO oil 0 oil 3 oil 8 Χειρισμός b Διάγραμμα Β6 Επίδραση των αιθέριων ελαίων στην επιβίωση των τροχόζωων (control: μάρτυρας) (μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα) στις συγκεντρώσεις των 10 και 20 ppm (10 ppm: άσπρο χρώμα, 20 ppm: σκιασμένο) στο διάστημα των τεσσάρων ωρών (n=3). Οι χειρισμοί με διαφορετικό γράμμα στον εκθέτη είναι στατιστικά σημαντικά διαφορετικοί (P < 0,05). Απολύμανση αυγών τσιπούρας (Sparus aurata) με τη χρήση αιθέριων ελαίων Επίδραση των αιθέριων ελαίων στο βακτηριακό φορτίο των αυγών Η επώαση των αυγών της τσιπούρας στο υδάτινο διάλυμα των αιθέριων ελαίων του γένους Origanum οδήγησε στη μείωση των βακτηριακού φορτίου, όπως παρατηρείται παρακάτω (Διάγραμμα Β7). Η απολύμανση των τροχόζωων στο υδάτινο διάλυμα αιθέριων ελαίων επιτεύχθηκε στο διάστημα μόλις των 10 λεπτών συμβάλλοντας στη μείωση των βακτηρίων, όπως διαπιστώθηκε από τον εμβολιασμό των αυγών στο στερεό θρεπτικό μέσο (TSAS). Παρατηρήθηκε ότι ο αριθμός αποικιών ανά αυγό στα δείγματα που είχαν επωαστεί ήταν σημαντικά χαμηλότερος (P< 0,05) σε σχέση με την ομάδα ελέγχου (0,34±0,02) και DMSO (0,38±0,03). Οι χειρισμοί των αιθέριων ελαίων, όπως παρατηρείται και στο παρακάτω γράφημα στις συγκεντρώσεις των 100 και 300, έδειξαν τη μεγαλύτερη, μείωση του βακτηριακού φορτίου που φέρουν τα αυγά της τσιπούρας. Όμως, η συγκέντρωση των 400 ppm προκάλεσε αυξημένη τοξικότητα στους πληθυσμούς των αυγών. Αναλυτικότερα, ο αριθμός των βακτηρίων ανά αυγό τσιπούρας (μέσος όρος ± τυπική απόκλιση), στις συγκεντρώσεις των 100 ppm ήταν ιδιαίτερα ικανοποιητικός (0,03±0,01 και 0,04±0,01) για το oil 0 και oil 3 αντίστοιχα ενώ στα 300 ppm οι τιμές των βακτηριακών αποικιών ήταν (0,03±0,01) για την oil 0 και (0,02±0,01) για το oil 3. 25

26 Αριθμός Αποικιών / Αυγό Επομένως γίνεται σαφές πως η χρήση ριγανέλαιου συνέβαλε στην μείωση του μικροβιακού φορτίου που φέρουν τα αυγά. 0,45 0,40 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 b P < 0,05 b b a a a a a a a Cntrl DMSO 100 oil oil oil oil oil oil oil oil 3 Χειρισμός Διάγραμμα B7. Αριθμός αποικιών ανά αυγό τσιπούρας με την χρήση αιθέριων ελαίων ρίγανης και μαντζουράνας (μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα) στις συγκεντρώσεις τον 100, 200, 300 και 400 ppm (cntrl: μάρτυρας) (n=3). Οι χειρισμοί με διαφορετικό γράμμα στον εκθέτη είναι στατιστικά σημαντικά διαφορετικοί (P < 0,05). Έλεγχος εκκόλαψης αυγών τσιπούρας Σημαντικός παράγοντας, κατά την απολύμανση των αυγών τσιπούρας με την επώαση τους στα αιθέρια έλαια ρίγανης και μαντζουράνας, ήταν ο έλεγχος της επιβίωσης των αυγών που φέρουν μικροβιακό φορτίο και κατά συνέπεια το ποσοστό εκκόλαψης των αυγών σε νύμφες κατά την εξέλιξη του πειράματος. Τα αυγά άρχισαν να εκκολάπτονται την δεύτερη ημέρα του πειράματος. Στο Διάγραμμα Β8, παρουσιάζεται το ποσοστό εκκόλαψης των αυγών, την τρίτη ημέρα κατά την οποία είχαν εκκολαφτεί όλα τα αυγά σε νύμφες, σε όλους τους πειραματικούς χειρισμούς. Παρατηρήθηκε ότι ο αριθμός των ζωντανών νυμφών ήταν σημαντικά μεγαλύτερος από την ομάδα ελέγχου και το DMSO (P< 0,05). Η συγκέντρωση των 400 ppm στα δυο δείγματα αιθέριων ελαίων στατιστικά διαφέρει στατιστικά από τους υπόλοιπους χειρισμούς. Επομένως, γίνεται σαφές πως η συγκέντρωση των 400 ppm επηρεάζει την εκκόλαψη των νυμφών. Αξίζει να σημειώσουμε, πως οι χειρισμοί της ομάδας ελέγχου και DMSO εμφάνιζαν σημαντικά χαμηλότερες τιμές ως προς τα δείγματα των ζωντανών νυμφών που είχαν εκκολαφτεί με την χρήση αιθέριων ελαίων. Τα δείγματα oil 0, όσο και oil 3 στις συγκεντρώσεις των 200 και 300 ppm παρουσίαζαν τις μέγιστες τιμές σε ποσοστά εκκόλαψης. Τέλος, 26

27 Ποσοστό Εκκόλαψης Αυγών (%) τo δείγμα oil 3, υπερέχει σε ελάχιστο βαθμό από τους πειραματικούς χειρισμούς του oil P < 0, bc ab bc c c c c c a ab 20 0 Cntrl DMSO 100 oil oil oil oil oil oil oil oil 3 Χειρισμός Διάγραμμα Β8 Ποσοστό εκκόλαψης αυγών με επώαση σε αιθέρια έλαια ρίγανης και μαντζουράνας (μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα) την πρώτη μέρα της εκκόλαψης στις συγκεντρώσεις των 100, 200, 300 και 400 ppm. (cntrl: μάρτυρας, oil 0: ρίγανη, oil 3: μαντζουράνα) (n=2). Οι μέσοι όροι με διαφορετικό γράμμα στον εκθέτη είναι στατιστικά σημαντικά διαφορετικοί (P < 0,05). Στο Διάγραμμα Β9, απεικονίζονται τα αποτελέσματα της επιβίωσης των ζωντανών νυμφών στην τελευταία καταμέτρηση του πειράματος. Όπως είναι φυσιολογικό αναμέναμε στα αποτελέσματα μας να υπάρχει μια σταθερότητα ή έστω μια φθίνουσα κατάσταση τιμών λόγω ζωντανών οργανισμών κατά την εξέλιξη των in vivo πειραμάτων. Στο πείραμα αυτό διαπιστώθηκε ότι ο αριθμός των ζωντανών νυμφών ήταν σημαντικά χαμηλότερος (P< 0,05) στις ομάδες που επωάστηκαν με τα αιθέρια έλαια στη συγκέντρωση των 400 ppm, αλλά και στις ομάδες ελέγχου και DMSO, αναφορικά στις συγκεντρώσεις 100, 200, 300 ppm με την επώαση των αιθέριων ελαίων. Παρατηρούμε, ότι το δείγμα της ρίγανης στο συγκεκριμένο πείραμα παρουσίασε μεγαλύτερα ποσοστά ζωντανών νυμφών σε σχέση με έκεινα της μαντζουράνας. Τέλος, οι χειρισμοί των 200 και 300 ppm για το oil 0 και 100 ppm για το oil 3 είχαν τα μεγαλύτερα ποσοστά νυμφών σε αυτή την δειγματοληψία. 27

28 Ποσοστό Επιβίωσης Ζωντανών νυμφών (%) P < 0, bcd ab bcd d d a d cd bcd abc 20 0 Cntrl DMSO 100 oil oil oil oil oil oil oil oil 3 Χειρισμός Διάγραμμα Β9. Ποσοστό επιβίωσης ζωντανών νυμφών με επώαση σε αιθέρια έλαια ρίγανης και μαντζουράνας (μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα) την τελευταία μέρα της εκκόλαψης στις συγκεντρώσεις των 100, 200, 300 και 400 ppm. (cntrl: μάρτυρας, oil 0: ρίγανη, oil 3: μαντζουράνα) (n=2). Οι χειρισμοί με διαφορετικό γράμμα στον εκθέτη είναι στατιστικά σημαντικά διαφορετικοί (P < 0,05). Τέλος, παρατίθενται παρακάτω τα Διαγράμματα Β10 στα οποία φαίνεται η διακύμανση της πορείας των ζωντανών αυγών, των ζωντανών νυμφών, των νεκρών αυγών και των νεκρών νυμφών στο διάστημα των πέντε ημέρων που διήρκησε η καταμέτρηση των παραπάνω οργανισμών στους διάφορους χειρισμούς (μάρτυρας, DMSO, oil 0 και oil 3) σε συγκεντρώσεις των 100, 200, 300 και 400 ppm για την απολύμανση του μικροβιακού φορτίου των αυγών. Η πορεία των παραπάνω οργανισμών ήταν ίδια για όλους τους χειρισμούς. Κατά την πρώτη ημέρα παρατηρήθηκαν μεγάλα ποσοστά ζωντανών αυγών, τα οποία από την δεύτερη κιόλας ημέρα μειώνονται λόγω της εκκόλαψης τους, ενώ την τρίτη ημέρα παρατηρήθηκε αύξηση ποσοστού ζωντανών νυφών, γεγονός που αποδίδεται στην εκκόλαψη όλων των αυγών. Ένα ποσοστό από τα ζωντανά αυγά δεν επιβιώνει και ακολούθως ένα άλλο ποσοστό από τις εκκολαφθεíσες νύμφες πεθαίνει. Στις τελευταίες μέρες διαπιστώθηκε μείωση των ζωντανών νυμφών. Εξαίρεση των παραπάνω αποτέλεσε η συγκέντρωση των 400 ppm, όπου τα ποσοστά νεκρών αυγών στο δείγμα oil 0 είναι μεγαλύτερα σε σχέση με τα ζωντανά αυγά, οπότε η συγκέντρωση αυτή είναι θανατηφόρα για των πληθυσμό των αυγών. Ανάλογη συμπεριφορά παρατηρήθηκε και στο oil 3. Παρατηρήσαμε από τα δύο πειράματα της εκκόλαψης των αυγών, ότι το αιθέριο έλαιο δεν εμπόδισε την αναπαραγωγή των αυγών καθώς δεν παρατηρήθηκε σημαντική μείωση ποσοστών των ζωντανών νυμφών ακόμα και την τελευταία μέρα. 28

29 Αντίθετα οι ομάδες ελέγχου DMSO εμφάνιζαν σημαντικά χαμηλότερες τιμές από τα δείγματα που είχαν επωαστεί στο αιθέριο έλαιο, ενώ η συγκέντρωση των 400 ppm προκάλεσε τοξικότητα στα αυγά της τσιπούρας. 29

30 Cntrl 100 DMSO ppm oil ppm oil ppm oil ppm oil ppm oil ppm oil ppm oil ppm oil Διαγράμματα Β10. Διακύμανση πορείας επιβίωσης αυγών τσιπούρας με την χρήση αιθέριων ελαίων ρίγανης και μαντζουράνας (μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα) στις συγκεντρώσεις 100 έως 400 ppm (control: μάρτυρας), στο διάστημα μίας εβδομάδας. Ο άξονας ο Χ αντιστοιχεί 30 στις ημέρες, και ο Υ στην επιβίωση των αυγών (%). (ο: Ζωντανά αυγά, :Νεκρά αυγά, : Ζωντανές νύμφες, : Νεκρές νύμφες ) (n=2)

31 ΣΥΖΗΤΗΣΗ Επίδραση αντιβακτηριακής δράσης των αιθέριων ελαίων στα βακτηριακά στελέχη Από τα αποτελέσματα της αντιβακτηριακής δράσης των αιθέριων ελαίων στα βακτηριακά στελέχη της ομάδας Vibrio, προέκυψε ότι τα τρία είδη του γένους Origanum (O. vulgare subsp. hirtum, O. onites, O. marjorana) εμφάνισαν ανασταλτική δράση έναντι των βακτηριακών στελεχών, Listonella (Vibrio) anguillarum, V. Splendidus, V. harveyi, EKKO-6 (V. alginolyticus) και ART-3 (Vibrio sp.). Ορισμένα από αυτά τα βακτηριακά στελέχη προκαλούν σοβαρές ασθένειες σε ψάρια και ασπόνδυλα και σοβαρές απώλειες λόγω θνησιμοτήτων στον κλάδο των υδατοκαλλιεργειών. Από τα δείγματα της ρίγανης που μελετήθηκαν, το είδος O. vulgare subsp. hirtum, εμφάνισε ανασταλτική δράση στο βακτηριακό στέλεχος L. anguillarum κατά μέσο όρο σε όλα τα είδη (μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα) (12±0,4 mm). Από αυτά το αιθέριο έλαιο που ξεχώρισε ήταν το oil 0 όπου εμφάνισε την μέγιστη ανασταλτική δράση (14,1±0,1 mm) ανάμεσα στα είδη του O. vulgare subsp. hirtum. Αντίστοιχα για το είδος της ρίγανης (O. onites oil 7 και oil 8), η μέση τιμή ανασταλτικής δράσης ήταν (11,5±0,5 mm). Επίσης, το oil 3, μαντζουράνα (O. marjoranum) είχε ανασταλτική δράση (11,9±0,4 mm). Σύμφωνα με τα παραπάνω, όσον αφορά τη δράση του αιθερίου ελαίου, στο βακτηριακό στέλεχος L. anguillarum, διαπιστώθηκε ότι το είδος O. vulgare subsp. hirtum, είναι πιο δραστικό ανάμεσα στα άλλα δυο είδη των αιθέριων ελαίων. Αυτό μπορεί να αποδοθεί στο γεγονός ότι τα δείγματα περιείχαν υψηλά ποσοστά φαινολικών συστατικών, θυμόλης (6,30-72,43%) και καρβακρόλης (9,10-85,52%). Η διαφορά ανάμεσα στο εύρος των δυο κύριων συστατικών, σχετίζεται, όπως έχει αναφερθεί στην περίοδο συγκομιδής του φυτού. Ωστόσο, δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορετικότητα στις τιμές της ζώνης αναστολής που σχημάτισε το βακτηριακό στέλεχος L. anguillarum, ανάλογα με το συστατικό που υπερείχε την εκάστοτε περίοδο στο αιθέριο έλαιο. Επομένως, η συνδυαστική η δράση των δυο μονοτερπενικών φαινολικών ουσιών, σε σύγκριση με την εποχιακή διακύμανση του φυτού, συμβάλει στην αντιβακτηριακή δράση. Παρομοίως και στα άλλα δυο είδη, O. onites και O. marjorana τα κύρια συστατικά 31

32 ήταν οι φαινολικές ουσίες. Η χημική δομή των μεμονωμένων συστατικών των αιθερίων ελαίων επηρεάζει τον ακριβή τρόπο της αντιβακτηριακής τους δράσης. 1 Παράλληλα και το βακτηριακό στέλεχος V. splendidus, παρουσίασε μεγάλη κυκλική ζώνη αναστολής στα αιθέρια έλαια. Παρατηρήθηκε, πως το είδος O. onites είχε μέγιστη κατά μέσο όρο ανασταλτική δράση ενάντια στο παθογόνο (13,5±0,3 mm), σε σύγκριση με το είδος O. vulgare subsp. hirtum, που η αντιβακτηριακή δράση ήταν (10,8±0,3 mm). Τα φαινολικά συστατικά στο είδος O. onites κυμάνθηκαν σε παραπλήσια ποσοστά ανάμεσα στις δυο ουσίες. Η θυμόλη στο δείγμα oil 7 κυμάνθηκε (34,62%) και η καρβακρόλη (66,18%). Αντίστοιχα για το oil 8 η θυμόλη ήταν (20,21%) και η καρβακρόλη (66,18). Η αντιβακτηριακή δράση της μαντζουράνας για το βακτηριακό στέλεχος ήταν (9,2±0,2 mm), χαμηλότερη συγκρίνοντας τα δυο είδη ρίγανης. Μελέτες που αφορούσαν στην δράση των φαινολικών ουσιών έδειξαν ότι οι συγκεκριμένες ουσίες είναι υπεύθυνες για την πρόκληση δομικών και λειτουργικών διαταραχών στην κυτταρική μεμβράνη. 2 Έχει διαπιστωθεί πως η έκθεση σε θυμόλη και καρβακρόλη από τα αιθέρια έλαια της ρίγανης προκάλεσε αποδόμηση της εξωτερικής μεμβράνης των στελεχών E.coli και S. typhimurium. Οι μύκητες και τα Gram-θετικά βακτήρια δεν επέδειξαν τον ίδιο βαθμό αλλαγών στην μορφολογία του κυτταρικού τοιχώματος, κάτι που πιθανώς οφείλεται στην διαλυτότητα των λιποσακχαριτών της εξωτερικής μεμβράνης των Gramαρνητικών βακτηρίων στις φαινολικές ουσίες. 3 Παρόμοια, στο βακτηριακό στέλεχος ΕΚΚΟ-6, το παθογόνο σχημάτισε μικρότερες ζώνες ανασταλτικής δράσης, γεγονός που μπορεί να αποδοθεί στην ανθεκτικότητα του παθογόνου στα υπάρχοντα αιθέρια έλαια. Η αντιβακτηριακή δράση που μετρήθηκε στα τριβλία για το είδος O. onites ήταν κατά μέσο όρο για τα δείγματα (11,1±0,4 mm) και για το είδος O. vulgare subsp. hirtum (9,2±0,4 mm), ενώ η μαντζουράνα εμφάνισε ανασταλτική δράση ενάντια στο παθογόνο (7,8±0,2 mm). Στο βακτηριακό στέλεχος ART-3(Vibrio sp.), το αιθέριο έλαιο από το O. vulgare subsp. hirtum ήταν πιο δραστικό, σε σύγκριση με το Ο. onites (11,5±0,3 και 9,6±0,1 mm), αντίστοιχα. Η ανασταλτική δράση της ζώνης αναστολής στην μαντζουράνα και σε αυτό το βακτηριακό στέλεχος ήταν χαμηλότερη (8,9±0,7 mm). Παρατηρώντας όλα τα αποτελέσματα που προέκυψαν για τα βακτηριακά στελέχη που μελετήθηκαν (Πίνακας A2), η μαντζουράνα είχε την ελάχιστη ανασταλτική δράση σε σχέση με τα άλλα είδη ρίγανης. Αυτό μπορεί να αποδοθεί στη βιολογική δράση του αιθερίου ελαίου και στο αποτέλεσμα της δράσης όλων των 32