Effect of temperature, ph and water activity on biofilm formation by Salmonella Enteritidis

Transcript

1 Effect of temperature, ph and water activity on biofilm formation by Salmonella Enteritidis Giaouris 1 E., Chorianopoulos 1 N., Koutsoumanis 2, K. and Nychas 1 G-J. E Laboratory of Food Microbiology and Biotechnology, Department of Food Science and Technology, Agricultural University of Athens, Iera Odos, Athens 8, E- mail:gjn@aua.gr Abstract An assay was developed for the detection and quantification of Salmonella Enteritidis biofilm cells on stainless steel surfaces. To achieve this, a modified microbiological technique used so far for biofilm studying ( bead vortexing method ), as well as a fast method based on conductivity measurements were used. The ability of microorganism to generate biofilm on the stainless surfaces was studied, at three temperatures ( o C, 20 o C and o C), four ph values (4.,., 6. and.4) and four water activity values a w (0.%, 1.%,.% and 10.% NaCl). Maximum numbers of adherent bacteria per square centimeter were reached in six days at 20 o C (10 6 cfu/cm 2 ). At 20 o C, biofilm formation at the th day of incubation was found to be independent of the ph value. In addition the high concentration of sodium chloride (10.% NaCl, a w 0.4) clearly inhibited the adherence of cells to the coupons. At the optimum conditions, biofilm formation was progressively strengthened and it was found that vortexing was unable to remove completely the biofilm generated on such conditions. These cells that remained attached on the metal surfaces even after vortexing were detected via their metabolic activity, using the RABIT apparatus. As a result, the newly developed technique constitutes a simple, fast, reliable and improved method to study biofilms, at different environmental conditions, without destroying their structure. Keywords: biofilms, conductance measurements, Salmonella, stainless steel, Επίδραση της θερµοκρασίας, του ph και της ενεργότητας νερού στο σχηµατισµό βιο-υµενίου από το παθογόνο βακτήριο Salmonella Enteritidis Γκιαούρης 1 Ε., Χωριανόπουλος 1 Ν., Κουτσουµανής 2 Κ., & Νυχάς 1 Γ-Ι.Ε 1 Γεωπονικό Πανεπιστήµιο Αθήνας, Τµήµα Επιστήµης & Τεχνολογίας Τροφίµων, Εργαστήριο Μικροβιολογίας & Βιοτεχνολογίας Τροφίµων,Ιερά Οδός, Αθήνα 8, τηλ gjn@ua.gr 2 Αριστοτέλειο Πανεπιστήµιο Θεσσαλονίκης, Τµήµα Γεωπονίας, Τοµέας Επιστήµης και Τεχνολογίας Τροφίµων, Εργ. Μικροβιολογίας και Υγιεινής Τροφίµων, Θεσσαλονίκη, 4124, τηλ.: , φαξ: , e- mail: kkoutsou@agro.auth.gr Περίληψη Αναπτύχθηκε µέθοδος για την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισµό κυττάρων βιουµενίου Salmonella Enteritidis που σχηµατίζεται πάνω σε επιφάνειες ανοξείδωτου χάλυβα. Προκειµένου να επιτευχθεί αυτό, τροποποιηµένη µικροβιολογική τεχνική που χρησιµοποιείται µέχρι στιγµής στην έρευνα των βιο-υµενίων («στροβιλισµός µε σφαιρίδια»), αλλά παράλληλα και µια «γρήγορη» µέθοδος που στηρίζονταν σε µετρήσεις αγωγιµότητας, χρησιµοποιήθηκαν. Μελετήθηκε η ικανότητα της σαλµονέλας να σχηµατίσει βιο-υµένιο πάνω στις επιφάνειες, σε τρεις θερµοκρασίες ( ο C, 20 o C και o C), τέσσερις τιµές ph (4.,., 6. και.4) και τέσσερις τιµές ενεργότητας νερού a w (0.%, 1.%,.% και 10.% NaCl). Για κάθε τιµή επέµβασης πραγµατοποιήθηκαν τέσσερις δειγµατοληψίες (4 η, η, 6 η και η ηµέρα). Τα αποτελέσµατα της παρούσας µελέτης υποδεικνύουν πως οι άριστες συνθήκες σχηµατισµού βιο-υµενίου Salmonella Enteritidis πάνω σε ανοξείδωτες µεταλλικές επιφάνειες είναι στους 20 ο C την 6 η ηµέρα επώασης (10 6 cfu/cm 2 ). Στους 20 ο C, ο σχηµατισµός του βιο-υµενίου την η ηµέρα επώασης διαπιστώθηκε να είναι ανεξάρτητος του ph. Επιπλέον η υψηλή συγκέντρωση χλωριούχου νατρίου (10.% NaCl, a w 0.4) εµπόδισε την προσκόλληση των κυττάρων στις επιφάνειες. Από τις µετρήσεις αγωγιµότητας βρέθηκε πως στις

2 βέλτιστες συνθήκες, το βιο-υµένιο που σχηµατίζεται πάνω στις ανοξείδωτες επιφάνειες σταδιακά ισχυροποιείται και γι αυτό ο στροβιλισµός µε τα σφαιρίδια καθίσταται αναποτελεσµατικός στην ολοκληρωτική αφαίρεση του βιο-υµενίου που παράγεται υπό τέτοιες συνθήκες. Τα κύτταρα αυτά, που παρέµειναν προσκολληµένα πάνω στις ανοξείδωτες επιφάνειες ακόµη και µετά το στροβιλισµό, ανιχνεύθηκαν µέσω της µεταβολικής τους δραστηριότητας, χρησιµοποιώντας το όργανο RABIT. Η νέα προτεινόµενη τεχνική αποτελεί µια απλή, γρήγορη, αξιόπιστη και βελτιωµένη µέθοδος µελέτης των βιο-υµενίων, υπό την επίδραση διαφόρων περιβαλλοντικών συνθηκών, χωρίς να καταστρέφεται η δοµή τους. Λέξεις ευρετηρίασης: Βιο-υµένια, µετρήσεις αγωγιµότητας, σαλµονέλα, ανοξείδωτος χάλυβας. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Τα βιο-υµένια αποτελούν αντικείµενο ιδιαίτερου ενδιαφέροντος στα πλαίσια της υγιεινής των τροφίµων (Carpentier, 1). Με τον όρο βιο-υµένιο εννοούµε µια µικροβιακή κοινότητα που βρίσκεται προσκολληµένη σε µια επιφάνεια και συχνά εγκλείεται σε στρώµα εξωκυτταρικών πολυσακχαριτών. Ο σχηµατισµός βιο-υµενίου είναι ένα φυσικό φαινόµενο και συµβαίνει σχεδόν οπουδήποτε υπάρχουν µικροοργανισµοί και επιφάνειες (Elvers and Lappin-Scott, 2000). Τα βιο-υµένια µπορούν να σχηµατιστούν σε οποιαδήποτε επιφάνεια στη βιοµηχανία τροφίµων, αν δεν υπάρχει κατάλληλο πρόγραµµα καθαρισµού και εξυγίανσης (Ganesh-Kumar and Anand, 18). Μεταξύ των πιο µιασµένων επιφανειών περιλαµβάνονται τα πατώµατα, οι σωληνώσεις, οι πάγκοι και οι ταινίες µεταφοράς. Λιγότερο µιασµένες επιφάνειες είναι οι τοίχοι και οι οροφές (Gilbert et al., 200). Έχει δειχτεί πως τα βακτήρια στα βιο-υµένια παρουσιάζουν αυξηµένη αντίσταση σε αντιµικροβιακούς παράγοντες σε σχέση µε πλαγκτονικά βακτήρια ( planktonic bacteria ) (Gilbert et al., 2002, Gilbert et al., 2001). Τα βιο-υµένια ενδέχεται να περιέχουν αλλοιογόνους και παθογόνους µικροοργανισµούς που επηρεάζουν την ποιότητα και την υγιεινή των τροφίµων, µειώνοντας τη διάρκεια ζωής των προϊόντων και αυξάνοντας την πιθανότητα πρόκλησης τροφικών δηλητηριάσεων. Υπερβολική συσσώρευση βιουµενίων σε επιφάνειες µεµβρανών («βιο-εναπόθεση», biofouling ), επιφάνειες ανταλλαγής θερµότητας και αποθηκευτικές δεξαµενές είναι υπεύθυνη για µειωµένη αποτελεσµατικότητα στη µεταφορά θερµότητας, µείωση της δυναµικότητας της γραµµής παραγωγής, αύξηση της καταναλισκόµενης ενέργειας, αύξηση του κόστους για καθαρισµό και γενικότερα υποβάθµιση της ποιότητας των προϊόντων. Επιπλέον τα βιο-υµένια µπορούν να προκαλέσουν διάβρωση των επιφανειών (Carpentier and Cerf, 1, Jessen and Lammert, 1). Ο ανοξείδωτος χάλυβας χρησιµοποιείται σήµερα ευρέως στη βιοµηχανία τροφίµων, επειδή είναι χηµικά και φυσικά σταθερός, εύκολος στον καθαρισµό και παρουσιάζει µεγάλη αντίσταση στη διάβρωση (Hood and Zottola, 1). Παρόλα αυτά σε χώρους επεξεργασίας τροφίµων επικρατούν συχνά συνθήκες που ευνοούν το σχηµατισµό βιο-υµενίων. Μια καλύτερη κατανόηση των βιο-υµενίων θα προσφέρει χρήσιµες δυνατότητες στην πρόληψη του σχηµατισµού τους. Η σαλµονέλα είναι ένα από τα πιο σηµαντικά παθογόνα βακτήρια και αποτελεί το συχνότερο αίτιο τροφιµογενών λοιµώξεων, µε συχνότητα, η οποία τα τελευταία χρόνια αυξάνεται συνεχώς (Cox et al., 1). Μελέτες που έχουν πραγµατοποιηθεί έως τώρα έχουν δείξει ότι βακτήρια του γένους Salmonella είναι ικανά να προσκολλούνται και να σχηµατίζουν βιο-υµένια σε διάφορες επιφάνειες (π.χ. πλαστικό, γυαλί, τσιµέντο κ.τ.λ.) (Bonafonte et al., 2000, Joseph et al., 2001). ιάφορες εργαστηριακές τεχνικές έχουν αναπτυχθεί για την αποµάκρυνση και την απαρίθµηση κυττάρων βιο-υµενίων, κυρίως σε αντιµικροβιακές µελέτες. Στις τεχνικές αυτές περιλαµβάνονται αποµάκρυνση κυττάρων µε βαµβακοφόρους στυλεούς ( swabbing ) (Joseph et al., 2001), υπέρηχους ( sonication ) (Leriche and

3 Carpentier, 2000), επιφανειακό ξύσιµο ( surface scraping ) (Jeong and Frank, 14), ανάδευση µε σφαιρίδια ( shaking with beads ), στροβιλισµός ( vortexing ) (Norwood and Gilmour, 1) και καλλιέργεια των ανακτώµενων κυττάρων σε θρεπτικά υλικά ( agar plating ) (Jackson et al., 2001, Lindsay and von Holy, 1). Η βιο-φωτοβολία ( bioluminescence ) (Dhir and Dodd, 1) και η οπτική απορρόφηση ( microtiter plate test ) (Pitts et al., 200, Stepanovic et al., 200) έχουν επίσης χρησιµοποιηθεί. Στις τεχνικές µικροσκόπησης περιλαµβάνονται κυρίως η παρατήρηση των κυττάρων µε ηλεκτρονικό µικροσκόπιο σάρωσης ( scanning electron microscopy ) και η µικροσκοπία φθορισµού προσπίπτουσας ακτινοβολίας ( epifluorescent microscopy ) (Austin et al., 18, Gibson et al., 1, Jones and Bradshaw, 16, Rossoni and Gaylarde, 2000, Wirtanen et al., 16). Εντούτοις, όσον αφορά τη δειγµατοληψία και την απαρίθµηση βακτηρίων Salmonella Enteritidis από επιφάνειες ανοξείδωτου χάλυβα, πολύ λίγες πρακτικές πληροφορίες υπάρχουν. Οι τεχνικές απαρίθµησης κυττάρων βιο-υµενίων µε αποµάκρυνση των κυττάρων από τις επιφάνειες µε βαµβακοφόρους στυλεούς, υπέρηχους, στροβιλισµό κ.τ.λ. και καλλιέργεια των ανακτωµένων κυττάρων σε στερεά θρεπτικά υλικά εξαρτώνται κατά πολύ από την αποτελεσµατικότητα των διαδικασιών αποµάκρυνσης. Επίσης, οι τεχνικές αυτές πολλές φορές τραυµατίζουν τα κύτταρα, καθιστώντας τα µη-καλλιεργήσιµα σε εργαστηριακά θρεπτικά µέσα. Οι µετρήσεις αγωγιµότητας ξεπερνούν αυτό το πρόβληµα, παρέχοντας έναν απλό, γρήγορο και αξιόπιστο τρόπο µελέτης των βιο-υµενίων, χωρίς να καταστρέφεται η δοµή τους (Flint et al., 1, Holah et al., 10, Johnston and Jones, 16). Μέθοδοι που βασίζονται σε µετρήσεις αγωγιµότητας ( conductance methods ) επιτρέπουν την γρήγορη ανίχνευση και ποσοτικό προσδιορισµό των βακτηρίων σε βιο-υµένια χωρίς να καταστρέφουν τη βιο-υµενική δοµή, δίνοντας ορθά αποτελέσµατα σε σύντοµο χρόνο. Αυτό είναι ιδιαίτερα σηµαντικό, γιατί όταν τα βακτήρια αποµακρύνονται από τις επιφάνειες δεν παρουσιάζουν τις ίδιες ιδιότητες µε αυτές που είχαν όταν ήταν σε επαφή µε µια επιφάνεια. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν να προσδιορίσει την επίδραση της θερµοκρασίας, του ph και της ενεργότητας νερού στο σχηµατισµό βιο-υµενίου από τη Salmonella Enteritidis σε επιφάνειες ανοξείδωτου χάλυβα και να συσχετίσει τις µικροβιολογικές µετρήσεις µε µετρήσεις µεταβολής της αγωγιµότητας µε το όργανο RABIT, αναπτύσσοντας έτσι µια εύκολη, γρήγορη και βελτιωµένη τεχνική στην έρευνα της φυσιολογίας των βιο-υµενίων και του τρόπου σχηµατισµού τους. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ Βακτηριακό στέλεχος και χρησιµοποιούµενη επιφάνεια Ο µικροοργανισµός που χρησιµοποιήθηκε για την ανάπτυξη του βιο-υµενίου ήταν το στέλεχος Salmonella enterica serovar Enteritidis PT4 και χρησιµοποιήθηκαν ανοξείδωτες µεταλλικές επιφάνειες διαστάσεων 2.cm/0.8cm/0.1cm. Ανάπτυξη βιο-υµενίου Σε δοκιµαστικούς σωλήνες µεταφέρθηκαν,ml ζωµού Βrain Ηeart και στον καθένα εµβαπτίστηκαν κάθετα οι µεταλλικές επιφάνειες. Μετά από αποστείρωση στους 121 ο C για 1 λεπτά έγινε ο εµβολιασµός των θρεπτικών ζωµών µε βακτηριακό εναιώρηµα 18 ωρών, έτσι ώστε ο πληθυσµός της Salmonella Enteritidis στο ζωµό BH να είναι 10 8 cfu/ml. Οι δοκιµαστικοί σωλήνες µε τις περιεχόµενες εντός αυτών µεταλλικές επιφάνειες επωάστηκαν για ηµέρες σε θερµοκρασίες ( ο C, 20 o C και o C) έτσι ώστε σχηµατισµός βιο-υµενίου στις µεταλλικές επιφάνειες να συµβεί. Προκειµένου να µελετηθεί η επίδραση του ph στο σχηµατισµό βιο-υµενίου οι δοκιµαστικοί σωλήνες επωάστηκαν στους 20 ο C. Εξετάστηκαν οι τιµές ph 4.,.,

4 6. και.4, οι οποίες ρυθµίστηκαν µε προσθήκη διαλύµατος 1Ν υδροχλωρίου. Η επίδραση της ενεργότητας νερού (a w ) στο σχηµατισµό βιο-υµενίου µελετήθηκε µε επώαση στους 20 ο C και σε τιµή ph.4. Η ρύθµιση της τιµής ενεργότητας του νερού έγινε µε προσθήκη χλωριούχου νατρίου. Οι συγκεντρώσεις NaCl που χρησιµοποιήθηκαν ήταν 0.%, 1.%,.% και 10.%. Για κάθε τιµή επέµβασης πραγµατοποιήθηκαν τέσσερις δειγµατοληψίες (4 η, η, 6 η και η ηµέρα). Αποκόλληση βιο-υµενίου Για την αποµάκρυνση των κυττάρων από τις επιφάνειες χρησιµοποιήθηκε η «µέθοδος του στροβιλισµού µε σφαιρίδια» ( bead vortexing method ) (Norwood and Gimour, 1, Lindsay and von Holy, 1, Οh and Marshall, 1), µετά από κάποιες τροποποιήσεις. Μετά την επώαση οι µεταλλικές επιφάνειες εξήχθησαν από τους δοκιµαστικούς σωλήνες και εκπλύθηκαν δύο φορές µε 10ml αποστειρωµένου διαλύµατος ringer για την αποµάκρυνση των ασθενώς προσκολληµένων κυττάρων. Μεταξύ των δύο εκπλύσεων οι µεταλλικές επιφάνειες τοποθετήθηκαν για λεπτά να στεγνώσουν µέσα σε αποστειρωµένους άδειους δοκιµαστικούς σωλήνες. Έπειτα από τη δεύτερη έκπλυση και ένα δεύτερο στέγνωµα κάθε µεταλλική επιφάνεια εισήχθηκε σε δοκιµαστικό σωλήνα που περιείχε ml ringer και από 10 µεταλλικά σφαιρίδια διαµέτρου 1,mm. Μετά την παρέλευση 10 λεπτών οι δοκιµαστικοί σωλήνες (µε το ringer, τα σφαιρίδια και τις µεταλλικές επιφάνειες) στροβιλίστηκαν για 1 λεπτό ο καθένας σε αναδευτήρα στροβιλισµού ( vortex ) προκειµένου να αποκολληθεί το βιο-υµένιο. Απαρίθµηση κυττάρων βιο-υµενίου Η απαρίθµηση του µικροβιακού φορτίου έγινε µε την «τεχνική της επιφανειακής εξάπλωσης» ( spread plate technique ) και απαρίθµησης των σχηµατιζόµενων αποικιών ( colony count ). Αυτή συνίστατο στην εξάπλωση 100µl βακτηριακού εναιωρήµατος, από το κάθε δοκιµαστικό σωλήνα πριν το στροβιλισµό, σε τρυβλία Tryptone Soy Agar µετά από διαδικασία διαδοχικών αραιώσεων. Αυτός ο όγκος περιείχε βακτήρια που αποκολλήθηκαν από τις επιφάνειες κατά την παρέλευση των 10 λεπτών. Ακολούθησε επώαση των τρυβλίων στους ο C για 24 ώρες και στη συνέχεια έγινε απαρίθµηση των αποικιών που σχηµατίστηκαν στο εµβολιασµένο στερεό θρεπτικό υπόστρωµα (µέτρηση Α). Τα βακτηριακά κύτταρα που αποµακρύνθηκαν από το βιο-υµένιο µε το στροβιλισµό απαριθµήθηκαν επίσης µέσω της ίδιας διαδικασίας (µέτρηση Β). Η διαφορά των δύο µετρήσεων (cfu/ml ΜΕΤΡΗΣΗΣ Β cfu/ml ΜΕΤΡΗΣΗΣ Α ) αντιστοιχούσε στο σχηµατιζόµενο βιο-υµένιο πάνω στις ανοξείδωτες επιφάνειες, το οποίο εκφράστηκε σε «µονάδες σχηµατιζόµενων αποικιών» ανά cm 2 επιφάνειας (cfu/cm 2 ). Μετρήσεις αγωγιµότητας Το όργανο RABIT (Rapid Automated Bacterial Impedance Technique) χρησιµοποιήθηκε για τον ποσοτικό προσδιορισµό του σχηµατιζόµενου βιο-υµενίου, µέσω µετρήσεων αγωγιµότητας. Το όργανο είναι ικανό να ανιχνεύει αλλαγές στην ηλεκτρική αγωγιµότητα θρεπτικού µέσου που προκαλούνται από το µεταβολισµό των µικροοργανισµών και δίνει το χρόνο που απαιτείται ( detection time ), µέχρι να ανιχνευθεί κάποια σηµαντική αλλαγή στην αγωγιµότητα. Η µεταβολική δραστηριότητα των κυττάρων του βιο-υµενίου που παρέµειναν πάνω στις µεταλλικές επιφάνειες µετά τις εκπλύσεις µε το ringer και πριν το στροβιλισµό µε τα σφαιρίδια µελετήθηκε (µέτρηση Γ). Τα δυνατά προσκολληµένα κύτταρα που παρέµειναν πάνω στις επιφάνειες ακόµη και µετά το στροβιλισµό ανιχνεύτηκαν επίσης µέσω της µεταβολικής τους δραστηριότητας (µέτρηση ). Οι µετρήσεις αγωγιµότητας Γ και πραγµατοποιήθηκαν τοποθετώντας τις µεταλλικές επιφάνειες µέσα στα «σωληνάρια» του RABIT που περιείχαν 4.ml θρεπτικού ζωµού

5 ΒΗ. Τα «σωληνάρια» µε τις ανοξείδωτες επιφάνειες επωάστηκαν στο RABIT, στους 0 ο C, για τη λήψη του «χρόνου ανίχνευσης». ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Α B Γ Log 10 (cfu/cm 2 ) ΣΧΗΜΑ 1. Α: Πορεία σχηµατισµού βιο-υµενίου συναρτήσει των ηµερών επώασης, Β: Σχέση µεταξύ των «χρόνων ανίχνευσης» και των ηµερών επώασης, µετά τις δύο εκπλύσεις, Γ: Σχέση µεταξύ των «χρόνων ανίχνευσης» και των ηµερών επώασης, µετά τo στροβιλισµό µε τα σφαιρίδια, (ph.4 και 0.%NaCl), ( o C, 20 o C, o C). Α Β Γ Log 10 (cfu/cm 2 ) ΣΧΗΜΑ 2. Α: Πορεία σχηµατισµού βιο-υµενίου συναρτήσει των ηµερών επώασης, Β: Σχέση µεταξύ των «χρόνων ανίχνευσης» και των ηµερών επώασης, µετά τις δύο εκπλύσεις, Γ: Σχέση µεταξύ των «χρόνων ανίχνευσης» και των ηµερών επώασης, µετά τo στροβιλισµό µε τα σφαιρίδια, (20 o C και 0.%NaCl), ( ph 4., ph., ph 6., xph.4). Α Β Γ Log 10 (cfu/cm 2 ) ΧΡΟΝΟΙ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ 1 ΣΧΗΜΑ. Α: Πορεία σχηµατισµού βιο-υµενίου συναρτήσει των ηµερών επώασης, Β: Σχέση µεταξύ των «χρόνων ανίχνευσης» και των ηµερών επώασης, µετά τις δύο εκπλύσεις, Γ: Σχέση µεταξύ των «χρόνων ανίχνευσης» και των ηµερών επώασης, µετά τo στροβιλισµό µε τα σφαιρίδια, (20 o C και ph.4), ( 0.%, 1.%,.%, x10.% NaCl). Tα αποτελέσµατα της παρούσης µελέτης έδειξαν πως η Salmonella Enteritidis σχηµατίζει τη µέγιστη ποσότητα βιο-υµενίου πάνω στις µεταλλικές επιφάνειες την 6 η ηµέρα επώασης, υπό βέλτιστες συνθήκες (10 6 cfu/cm 2 ). Ο σχηµατισµός βιο-υµενίου ευνοείτε στους 20 ο C, σε ph και στις υψηλότερες τιµές ενεργότητας ύδατος (0.%-1.% NaCl). Στους 20 ο C, ο σχηµατισµός του βιο-υµενίου την η ηµέρα επώασης διαπιστώθηκε να είναι ανεξάρτητος του ph. Κατασταλτική ήταν η υψηλή συγκέντρωση χλωριούχου νατρίου (10.% NaCl, a w 0.4) στη δυνατότητα προσκόλλησης των κυττάρων στις επιφάνειες. Από τις µετρήσεις αγωγιµότητας

6 διαπιστώθηκε πως παραµένει βιο-υµένιο πάνω στις επιφάνειες ακόµη και µετά το στροβιλισµό τους µε τα σφαιρίδια («εναποµένον βιο-υµένιο»). Στους 20 ο C, σε ph.4 και στις υψηλότερες τιµές ενεργότητας ύδατος (0.% και 1.% NaCl), το βιο-υµένιο που σχηµατίζεται πάνω στις ανοξείδωτες επιφάνειες σταδιακά ισχυροποιείται και έτσι ο στροβιλισµός καθίσταται αναποτελεσµατικός στην ολοκληρωτική αφαίρεση των κυττάρων από την βιο-υµενική δοµή, προκειµένου να απαριθµηθούν µέσω καλλιέργειας σε στερεά θρεπτικά υλικά (TSA). Αυτό αποτελείτο από κύτταρα Salmonella Enteritidis πολύ δυνατά προσκολληµένα στις ανοξείδωτες επιφάνειες. Αυτό είναι ιδιαιτέρως σηµαντικό γιατί ακόµη και ένας µικρός αριθµός κυττάρων που έχει παραµείνει πάνω στις επιφάνειες ανοξείδωτου χάλυβα είναι ικανός να ξαναδηµιουργήσει βιο-υµένιο και αυτό µπορεί να έχει δυσµενείς συνέπειες (π.χ. επιφάνειες ανοξείδωτου χάλυβα στις βιοµηχανίες τροφίµων). Επίσης το «εναποµένον βιο-υµένιο» ενδέχεται να παρουσιάζει αυξηµένη αντίσταση σε αντιµικροβιακούς παράγοντες. Κάθε µέθοδος µετρά µια παράµετρο π.χ. η καλλιέργεια σε θρεπτικά υλικά µετρά τον σχηµατισµό βιοµάζας από τα ζωντανά κύτταρα, ενώ η αγωγιµότητα µετρά την παραγωγή ιοντικών ουσιών στο µέσο αύξησης, η οποία υποδεικνύει τη µεταβολική δραστηριότητα του παρόντα µικροοργανισµού. εδοµένου ότι ο χρόνος ανίχνευσης στο RABIT σχετίζεται άµεσα µε τη κυτταρική δραστηριότητα, η µέτρηση περιλαµβάνει κύτταρα που µπορούν να είναι µεταβολικά ενεργά αλλά µη βιώσιµα και εποµένως µη ανιχνεύσιµα µε τις συµβατικές τεχνικές καλλιέργειας. Η τεχνική του RABIT που παρουσιάστηκε σε αυτή τη µελέτη παρέχει τη δυνατότητα να αποτιµηθούν οι παράγοντες που περιλαµβάνονται στη προσκόλληση κυττάρων Salmonella Enteritidis και το σχηµατισµό βιο-υµενίου σε επιφάνειες ανοξείδωτου χάλυβα. Το RABIT µετρά το βιο-υµένιο in situ (χωρίς να καταστρέφεται η βιουµενική δοµή), ενώ η τεχνική του στροβιλισµού µε σφαιρίδια και απαρίθµησης αποικιών σε τρυβλία στηρίζεται στη διάσπαση του βιο-υµενίου προκειµένου να απελευθερωθούν τα κύτταρα για να απαριθµηθούν. Οι µετρήσεις αγωγιµότητας οδηγούν στην ανίχνευση βακτηριακών κυττάρων που δεν θα µπορούσαν να ανακτηθούν µέσω του στροβιλισµού µε τα σφαιρίδια. Αποτελούν επίσης µια πιο ευαίσθητη µέθοδο που µπορεί να ανιχνεύσει ακόµη και ένα µοναδικό βιώσιµο κύτταρο µικροοργανισµού. Σε αντίθεση µε τις κλασσικές µεθόδους, οι ταχείες δεν µετράνε κύτταρα δίνοντας απλούς αριθµούς σαν µέτρο της µικροβιακής ποιότητας του δείγµατος, αλλά καταγράφουν τον µεταβολισµό των µικροοργανισµών. Αυτή η µέτρηση της µικροβιακής δραστηριότητας παρά αυτής καθ αυτής της µέτρησης του αριθµού των κυττάρων αποτελεί και τη νέα τάση στη µικροβιολογία. Η τελευταία δεν ενδιαφέρεται πλέον για την απλή αρίθµηση µικροοργανισµών, αλλά στρέφει το ενδιαφέρον της στην εκτίµηση της µικροβιακής δραστηριότητας. Έτσι η ακρίβεια, η αξιοπιστία, η ταχύτητα, η επαναληψιµότητα, η δυνατότητα ελέγχου πολλών δειγµάτων ταυτοχρόνως, αποτελούν εκείνα τα χαρακτηριστικά που κάνουν τις ταχείες µεθόδους αναγκαίες. Τα πλεονεκτήµατα χρησιµοποίησης της µεθόδου µετρήσεων αγωγιµότητας περιλαµβάνουν επίσης τη δυνατότητα να παραχθούν αποτελέσµατα γρηγορότερα και µε µειωµένη κούραση των χειριστών έναντι άλλων τεχνικών που χρησιµοποιούνται µέχρι τώρα για τη µελέτη των βιο-υµενίων. Συνοψίζοντας µπορούµε να πούµε πως αν οι µικροοργανισµοί δεν αφαιρούνται εντελώς από τις επιφάνειες, µπορούν να οδηγήσουν στο σχηµατισµό βιο-υµενίου (Geesey, 2001). Λαµβάνοντας υπόψη την αυξανόµενη αντίσταση των βακτηριακών βιο-υµενίων στις αντιµικροβιακές επεξεργασίες, διάφορες προληπτικές στρατηγικές, όπως το υγιεινό σχεδιάγραµµα των εγκαταστάσεων και του εξοπλισµού, η κατάλληλη επιλογή των υλικών, η σωστή χρήση και εκλογή των απορρυπαντικών

7 και απολυµαντικών µαζί µε φυσικές µεθόδους πρέπει να εφαρµοστούν για τον έλεγχο και την αποτροπή της δηµιουργίας τους (Meyer, 200). Κάθε πρόβληµα σχετικό µε τα βιο-υµένια πρέπει να αναλύεται λεπτοµερώς για να καθοριστεί η φύση του, πριν την εφαρµογή µιας αποτελεσµατικής λειτουργίας καθαρισµούς και εξυγίανσης. Καθώς η σαλµονέλα δεν µπορεί ποτέ να εξαλειφθεί τελείως, σηµαντική µείωση µπορεί να επιτευχθεί µέσω της εφαρµογής κατάλληλων στρατηγικών ελέγχου στα πλαίσια ενός καλά αναπτυγµένου συστήµατος ανάλυσης της επικινδυνότητας στα κρίσιµα σηµεία ελέγχου (HACCP) από το ξεκίνηµα της παραγωγής µέχρι την κατανάλωση. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Austin JW, Sanders C, Kay WW and Collinson SK, (18). Thin aggregative fimbriae enhance Salmonella enteritidis biofilm formation. FEMS Microbiology Letters, 162: Bonafonte MA, Solano C, Sesma B, Alvarez M, Montuenga L, Garcia-Ros D and Gamazo C, (2000). The relationship between glycogen synthesis, biofilm formation and virulence in Salmonella enteritidis. FEMS Microbiology Letters, :1-6.. Carpentier B, (1). Biofilms. In: Encyclopedia of Food Microbiology, vol. 1, p22-2. Eds. Robinson R.K., Batt C.A. and Pates P.D. by Academic Press. 4. Carpentier B and Cerf O, (1). Biofilms and their consequences, with particular reference to hygiene in the food industry. Journal of Applied Bacteriology, :4-.. Cox J, Hammack TS and Andrews WH, (1). Salmonella. In: Encyclopedia of Food Microbiology, vol., p Eds. Robinson RK, Batt CA and Pates PD by Academic Press. 6. Dhir VK and Dodd CER, (1). Susceptibility of suspended and surface-attached Salmonella enteritidis to biocides and elevated temperatures. Applied and Environmental Microbiology, 61():-18.. Elvers KT and Lappin-Scott HM, (2000). Biofilms and Biofouling. In: Encyclopedia of Microbiology, vol. 1, 2 nd edition, p Ed. Lederberg J by Academic Press. 8. Flint SH, Brooks JD and Bremer PJ, (1). Use of the Malthus conductance growth analyser to determine numbers of thermophilic streptococci on stainless steel. Journal of Applied Microbiology, 8:-.. Ganesh-Kumar C and Anand SK, (18). Significance of microbial biofilms in food industry: a review. International Journal of Food Microbiology, 42: Geesey GG, (2001). Bacterial behavior at surfaces. Current Opinion in Microbiology, 4: Gibson H, Taylor JH, Hall KE and Holah JT, (1). Effectiveness of cleaning techniques used in the food industry in terms of the removal of bacterial biofilms. Journal of Applied Microbiology, 8: Gilbert P, Allison DG and McBain AJ, (2002). Biofilms in vitro and in vivo: do singular mechanisms imply cross-resistance? Journal of Applied Microbiology, Symposium Supplement, 2:8S-0S. 1. Gilbert P, Das JR, Jones MV and Allison DG, (2001). Assessment of resistance towards biocides following the attachment of microorganisms to, and growth on, surfaces. Journal of Applied Microbiology, 1: Gilbert P, McBain AJ and Rickard AH, (200). Formation of microbial biofilm in hygienic situations: a problem of control. International Biodeterioration and Biodegradation, 1:

8 1. Holah JT, Higgs C, Robinson S, Worthington D, and Spenceley H, (10). A conductance based surface disinfection test for food hygiene. Letters in Applied Microbiology, : Hood SK and Zottola EA, (1). Adherence to stainless steel by foodborne microorganisms during growth in model food systems. International Journal of Food Microbiology, : Jackson G, Beyenal H, Rees WM and Lewandowski Z, (2001). Growing reproducible biofilms with respect to structure and viable cell counts. Journal of Microbiological Methods, 4: Jeong DK and Frank JF, (14). Growth of Listeria monocytogenes at 21 o C in biofilms with microorganisms isolated from meat and dairy environments. Lebensmittel-Wissenschaft und Technologie, 2: Jessen B and Lammert L, (200). Biofilm and disinfection in meat processing plants. International Biodeterioration and Biodegradation, 1: Johnston MD and Jones MV, (1). Disinfection tests with intact biofilms: combined use of the Modified Robbins Device with impedance detection. Journal of Microbiological Methods, 21: Jones K and Bradshaw SB, (16). Biofilm formation by the Enterobacteriaceae: a comparison between Salmonella enteritidis, Escherichia coli and a nitrogen-fixing strain of Klebsiella pneumoniae. Journal of Applied Bacteriology, 80: Joseph B, Otta SK and Karunasagar I, (2001). Biofilm formation by Salmonella spp. on food contact surfaces and their sensitivity to sanitizers. International Journal of Food Microbiology, 64: Leriche V and Carpentier B, (2000). Limitation of adhesion and growth of Listeria monocytogenes on stainless steel by Staphylococcus sciuri biofilms. Journal of Applied Microbiology, 88: Lindsay D and von Holy A, (1). Evaluation of dislodging methods for laboratory-grown bacterial biofilms. Food Microbiology, 14: Meyer B, (200). Approaches to prevention, removal and killing of biofilms. International Biodeterioration and Biodegradation, 1: Norwood DE and Gilmour A, (1). Adherence of Listeria monocytogenes strains to stainless steel coupons. Journal of Applied Microbiology, 86: Oh D and Marshall DL, (1). Monolaurin and acetic acid inactivation of Listeria monocytogenes attached to stainless steel. Journal of Food Protection, : Pitts B, Hamilton MA, Zelver N and Stewart S, (200). A microtiter-plate screening method for biofilm disinfection and removal. Journal of Microbiological Methods, 4: Rossoni EMM and Gaylarde CC, (2000). Comparison of sodium hypochlorite and peracetic acid as sanitizing agents for stainless steel food processing surfaces using epifluorescence microscopy. International Journal of Food Microbiology, 61: Stepanovic S, Cirkovic I, Mijac V and Svabic-Vlahovic M, (200). Influence of the incubation temperature, atmosphere and dynamic conditions on biofilm formation by Salmonella spp. Food Microbiology, 20: Wirtanen G, Alanko T and Mattila-Sandholm T, (16). Evaluation of epifluorescence image analysis of biofilm growth on stainless steel surfaces. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, :1-26.