Κυτταρογενετική διερεύνηση

Transcript

1 Κυτταρογενετική διερεύνηση

2 Κυτταρογενετική ανάλυση Ανάλυση χρωμοσωμάτων με ζώνες(εναλασσόμενες σκούρες και ανοικτόχρωμες ζώνες) Στόχος: διάκριση φυσιολογικών και παθολογικών χρωμοσωμάτων/καρυοτύ πων.

3 Aριθμητικές και Δομικές ανωμαλίες. -Χρωμοσωμικές ανακατατάξεις (μεταθέσεις, ελλείμματα, διπλασιασμοί)μεγέθους >5-7Mb. -Αδυναμία αναγνώρισης μικρότερου μεγέθους ανακατατάξεων και ανωμαλιών -Αδυναμία αναγνώρισης όλων των χρωμοσωμάτων που συμμετέχουν σε σύνθετες ανακατατάξεις

4

5 -Περιφερικό αίμα (Τλεμφοκύτταρα)+ ηπαρίνη - Mιτογόνο (Φυτοαιμαγλουτινίνη): φυτική πρωτεΐνη που διεγείρει τα λεμφοκύτταρα προς διαίρεση -72h 37oC -Κολχικίνη* -υπότονο διάλυμα-> διόγκωση και λύση των κυττάρων -μονιμοποίηση *Προσδένεται ισχυρά στην ελεύθερη τουμπουλίνη και εμποδίζει τον πολυμερισμό της σε μικροσωληνίσκους Εξαφανίζεται γρήγορα η μιτωτική άτρακτος, σταματά το κύτταρο στη μετάφαση

6 Μικροσωληνίσκοι Υπομονάδες τουμπουλίνης η καθεμιά από τις οποίες είναι διμερές που αποτελείται από 2 παρόμοιες σφαιρικές πρωτεΐνες: α, β Ζωντανό κύτταρο: μείγμα από μικροσωληνίσκους + ελεύθερες μονάδες τουμπουλίνης

7 Φθορίζουσα in situ υβριδοποίηση FISH Technique Fluorescent In Situ Hybridization HD Animation 1 vs1o&nohtml5=false

8 Γνωστή αλληλουχία (ως λίγες kb) -Απουσία/παρουσία αλληλουχίας -ανάλυση και μεσοφασικών πυρήνων (interphase FISH)

9 Ανιχνευτές (probes)

10 Aνιχνευτής ειδικός για γονίδιο

11 Κεντρομεριδιακός και τελομεριδιακός ανιχνευτής

12 Μοριακή χρώση/fish-painting Criduchat probe WholeChromosomeProbe8

13 Πολυχρωματικές μέθοδοι Spectral karyotyping V1iW9UCelg&nohtml5=False

14 Πολυχρωματικές μέθοδοι.m-fish (multicolor FISH)/SpectralKaryotyping Mίγμα ανιχνευτών όλων των χρωμοσωμάτων με 24 χρώματα (ηλεκτρονική επεξεργασία-ψευδοχρωματικά) Μικροσκόπιο εξοπλισμένο με ειδικά φίλτρα Ειδικό λογισμικό

15 SKY/ MFISH

16 Δυνατότητες- αδυναμίες Εικόνα ολόκληρου του γονιδιώματος Μεταθέσεις άγνωστα χρωμοσώματα, μικρά χρωμοσώματα-δεικτες Σύνθετες ανακατατάξεις Δεν μπορούν να προσδιοριστούν τα σημεία θραύσης, χαμηλή ευαισθησία (ενδοχρωμοσωμικά ελείμματα, διπλασιασμοί, αναστροφές)

17 Μοριακή κυτταρογενετική-πολυχρωματικές ζώνες(multicolor banding FISH (mband FISH) Χρησιμοποιεί ειδικά για κάθε χρ. Περιοχή μίγματα μοριακών χρώσεων (paints) προερχόμενα από μικροανατομία (microdissection) που αλληλεπικαλύπτονται μερικά και έχουν σημανθεί με διαφορετικά φθοριοχρώματα ή συνδυασμούς φθοριοχρωμάτων. Κάθε ειδική για την περιοχή βιβλιοθήκη δημιουργείται από 8-10 χρωμοσωμικά θραύσματα. Διαφορετικοί αριθμοί βιβλιοθηκών δημιουργούνται ανάλογα με το μέγεθος του χρωμοσώματος ( π.χ.2 για τα χρ. 21, 22, Υ και 8 για το 1) ). Η ακριβής χρωμοσωμική θέσηείναι γνωστή και έχει ελεγχθεί διότι οι ανιχνευτές αυτοί DNA σημαίνονται με φθοριοχρώματα και υβριδοποιούνται (FISH)με φυσιολογικές μεταφάσεις.

18 Μικροσυστοιχιες DNA Microarray - All About Molecular Biology

19

20

21 CGH Συγκριτική υβριδοποίηση γονιδιωμάτων (ComparativeGenomicHybridisation) Array-CGH +Tαυτοποίηση άγνωστης προέλευσης γενετικού υλικού π.χ. μη ισοζυγισμένες, σύνθετες ανακατατάξεις, μικρά χρωμοσώματα δείκτες. -Απαιτούνται μεταφάσεις -Δεν μπορεί να αναγνωρίσει ισοζυγισμένες ανακατατάξεις. Comparison of conventional CGH and array-cgh +Ανευπλοειδίες, ελλείμματα, διπλασιασμοί - Δεν απαιτούνται μεταφάσεις -ισοζυγισμένες χρωμοσωμικές ανακατατάξεις (μεταθέσεις, αναστροφές), πολυπλοειδίες, αιτία του κλινικού προβλήματος (ή φυσιολογικές πολυμορφικές

22

23 acgh detects partial tetrasomy of 12p in blood from Pallister Killian syndrome cases without invasive skin biopsy American Journal of Medical Genetics Part A Volume 149A, Issue 5, pages , 7 APR 2009 DOI: /ajmg.a

24 acgh detects partial tetrasomy of 12p in blood from Pallister Killian syndrome cases without invasive skin biopsy American Journal of Medical Genetics Part A Volume 149A, Issue 5, pages , 7 APR 2009 DOI: /ajmg.a

25 Δυνατότητες-αδυναμίες acgh μέθοδος μεγάλης ευαισθησίας (>100 φορές από την ανάλυση στο μικροσκόπιο) (αντικειμενική και ποσοτική ανίχνευση ελλειμμάτων και διπλασιασμών που συνδέονται με το κλινικό πρόβλημα. Δεν μπορεί να ανιχνεύσει ισοζυγισμένες ανακατατάξεις ( μεταθέσεις ή ενθέσεις), χαμηλό μωσαϊκισμό και πολυπλοειδία. acgh μπορεί να αναγνωρίσει αλλαγές του αριθμού αντιγράφων, πολυμορφικά (και μη παθολογικά) ελλείμματα και διπλασιασμούς του γονιδιώματος Copy Number Variation (CNVs).

26 Αλληλούχιση (sequencing) Mε την αλληλούχιση «διαβάζουμε» κάθε γράμμα του DNA και βρίσκουμε αλλαγές που μποούμε να χαρακτηρήσουμε μεταλλάξεις(mutations) ή πολυμορφισμούς (variations) που μπορεί να οδηγήσουν σε νόσημα ή να επηρεάσουν τον κίνδυνο εμφάνισης νοσήματος.

27 Αλληλούχιση (Sequencing): Τμήμα DNA(δίκλωνο, συγκεκριμένη κατεύθυνση, 5 και 3 άκρο). Όταν συντίθεται DNA οι δύο αλυσίδες διαχωρίζονται και νέες βάσεις προστίθενται στο 3 (κατεύθυνση σύνθεσης 5-3 ). Για να ξεκινήσει η σύνθεση DNA απαιτείται ένα μικρό τμήμα DNA, (εκκινητής- primer). Οι εκκινητές σχεδιάζονται έτσι ώστε να μπορούν να συνδεθούν με DNAστόχο και να ξεκινήσει η σύνθεση DNA. Αλληλούχιση DNA (sequencing - Fredrick Sanger method. Βραβείο Nobel 1980.

28 Οι 2 αλυσίδες δ.dna iδιαχωρίζονται και ένας εκκινητής σημασμένος συνδέεται με DNA (A); 4 αντιδράσεις για τη σύνθεση νέου DNA, καθεμιά έχει τα 4 dntps και μικρή ποσότητα ddntps (B); Έτσι κατά τη σύνθεση DNA, ενσωματώνεται κάθε φορά στην τελική θέση ένα ddntp (C); DNA και από τις 4 αντιδράσεις διαχωρίζεται σε πηκτή σε τέσσερις στήλες και δίνει ένα πρότυπο (D); Α αλληλουχία διαβάζεται από κάτω προς τα πάνω και είναι η αντίθετη βάση που αναγνωρίζεται.. Οταν γίνεται ενίσχυση DNA προστίθενται νέα dntps στην νέα αλυσίδα. Μέθοδος Sanger: χρησιμοποεί χημικά ανάλογα των 4 νουκλεοτιδίων ( ddα, ddt, ddc, ddt) and τα οποία λείπει το 3 -ΟΗ της δεοξυριβόζης (εκτος από το ΟΗ που λείπει φυσιολογικά στο DNA). Εαν αυτά τα ddntps ενσωματωθούν σε μια αλυσίδα DNA που συντίθεται, εμποδίζουν την πολυμεράση DNA να προσθέσει την επόμενη συμπληρωματική βάση όπως αυτή καθορίζεται από το αρχικό εκμαγείο και τερματίζεται η επιμήκυνση της αλυσίδας. Μετά από πολλούς κύκλους ενίσχυσης έχουμε όλα τα πιθανά μήκη DNA που διαχωρίζονται με βάση το μέγεθος σε ηλεκτροφόρηση. Kάθε ddntp εκπέμπει διαφορετικού μ.κ. φθοριόχρωμα και μπορεί να αναγνωριστεί. Η αντίδραση εξασφαλίζει ένα φθορίζον ddntp σε κάθε θέση στην αλυσίδα DNA ( υπάρχει αλυσίδα κάθε πιθανού μεγέθους DNA) και κάθε νουκλεοτίδιο της αλυσίδας μπορεί να αναγνωριστεί. Τελικό αποτέλεσμα: μετά απο επεξεργασία των δεδομένων παίρνουμε έγχρωμο γράφημα της αλληλουχίας.

29 Αλληλούχιση με ραδιενεργεια- με φθορίζουσες κορυφές (peaks)

30 NGS Genes 2014, 5(4), ; uks&nohtml5=false Ion Torrent next-gen sequencing technology

31 Schematic workflow of deep sequencing. Schematic workflow of deep sequencing. RNA or genomic DNA is extracted from various sources including blood, saliva, tissue and forensic specimens. DNA or RNA reverse-transcribed to complementary DNA (cdna) is physically fragmented at random locations or enzymatically cut at specific sites. Small synthetic DNAs are added to the ends of the fragments ( adapter ligation ), which are subsequently clonally amplified by polymerase chain reaction (PCR), if not sequenced directly by single-molecule sequencing. Individual DNA fragments are spatially separated, including by use of oil water emulsions, and in several procedures the fragments are immobilized by attachment to microbeads or slides. Finally, the fragments are sequenced in massively parallel fashion. CINP 2014 D. Goldman, and K. Domschke Int J Neuropsychopharmacol 2014;17:

32 Exome sequencing DNA ~20,000 γονίδια, 23 ζευγάρια (46 χρωμοσώματα). Γονιδίωμα Αλληλούχιση. Αλληλούχιση λειτουργικών περιοχών (exome sequencing - ~ 1% του γονιδιώματος) Ambry Genetics: What is Exome Sequencing? Clinical exome sequencing explained (0.50)

33

34

35

36 NGS-PES(next generation paired-end Πολλοί τύποι ανακατατάξεων μπορούν να μελετηθούν. Βασίζεται στη σύγχρονη ανάλυση 2 μικρών αλληλουχιών (matepairs) που συγκρίνονται(aligned) με συγκεκριμένο/γνωστό γονιδίωμα Ακολουθεί σύγκριση με αλληλουχία αναφοράς. Εκτός από την πληροφορία της αλληλούχισης το «διάβασμα» και από τις δύο πλευρές δίνει πληροφορίες για τη θέση/περιοχή της ανακατάταξης. Βιοπληροφορικά εργαλεία sequencing )

37 NGS-PES(next generation paired-end ανάλυση σε επίπεδο νουκλεοτιδίου αναγνωρίζονται άμεσα γονίδια που έχουν διακοπεί στα σημεία θραύσης χαρακτηρίζονται δομικές ανακατατάξεις π.χ. μικρά ελλείμματα ή αναστροφές που συχνά δεν ανιχνεύονται με άλλες τεχνικές sequencing ) cancerpreventionresearch.aacrjournals.org

38

39 Δυσκολίες Συχνά είναι δύσκολο να αναγνωριστούν (συγκριθούν) -ΣΘ που βρίσκονται σε μη γνωστή περιοχή (gap) -ΣΘ που βρίσκονται σε περιοχή επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών και τμηματικών διπλασιασμών Nazaryan L, Tommerup N. Wilhelm Johannsen Centre for Functional Genome Research, Institute of Cellular and Molecular Medicine, Faculty of Health Science, University of Copenhagen, Copenhagen, Denmark

40

41 Moριακός/βιοπληροφορικός χαρακτηρισμός των ΣΘ Σχεδιασμός εκκινητών, γoν. αλληλουχίες εκατέρωθεν των ΣΘ όπως αυτά υποδείχτηκαν από την ανάλυση MP (The UCSC Genome browser ) Άλλα βιοπληροφορικά εργαλεία( ώστε να μην σχεδιαστούν εκκινητές μέσα σε επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες, DIALIGN (ευρετικές μέθοδοι πολλαπλής στοίχισης ακολουθιών), Multalin (σύγκριση και στοίχιση αλληλουχιών)

42 BP regions identified by MPS in the UCSC Human Genome Browser Mar (NCBI37/hg19) Assembly window. BPs are shown by red arrows. a) 2p22.1-2p16.2. b) 5p15.2-5p14.2. a b

43 ΣΧΑ 2, 5, 7 με 11 Σ.Θ. chr2 2p22.1 2p a 2b 2c 2d chr5 5p15.2 5p15.1 5p14.3 5p a 5b 5c 5d 5e 5f 5g chr7 7p21.2 7q31.1 7a 7b 7c 6

44 Συνδυασμένη μελέτη όλων των διαθέσιμων μεθόδων ΜPS συμπληρώνει G-banding, FISH και -οδηγεί στον χαρακτηρισμό της ΣΧΑ στο επίπεδο του νουκλεοτιδίου- -διόρθωση της ακριβούς θέσης Σ.Θ. -αποκάλυψη νέων Σ.Θ.

45 Fusion gene Eξώνια 1-2 του Α + εξώνια του Β.

46 Μη φυσιολογικός φαινότυπος μπορεί Ανισορροπία δοσοεξαρτώμενων γονιδίων Δημιουργία γονιδίου σύντηξης που οδηγεί σε αύξηση λειτουργίας (gain-of-function) ή/και Διακοπή cisρυθμιστικής περιοχής από σημείο/α θραύσης να οφείλεται σε