Διαγνωστικοί έλεγχοι (diagnostic testing) Διάγνωση/ επιβεβαίωση κλινικής υποψίας γενετικής διαταραχής

Transcript

1 Διαγνωστικοί έλεγχοι (diagnostic testing) Διάγνωση/ επιβεβαίωση κλινικής υποψίας γενετικής διαταραχής

2 Προεμφυτευτικός έλεγχος Preimplantation Genetic Diagnosis (PGD) O54

3 Προγεννητικός έλεγχος

4 Έλεγχος φορέων

5 Εικόνα ολόκληρου του γονιδιώματος (διακριτική ικανότητα διαφορετική ανάλογα με την τεχνική) Γενετικές εξετάσεις Στοχευμένη ανάλυση

6 Γενετικοί έλεγχοι

7 Καρυότυπος(συμβατικός ή κλασσικός) Έλεγχος ολόκληρου του γονιδιώματος Διακριτική ικανότητα: μικρή(>5-10mb)*

8 Kυτταρογενετικός έλεγχος Καρυότυπος Χρωμοσώματα ( αριθμός, δομη) Πότε; -υποψία συνδρόμου -αποβολές ή στειροτητα -νεογνό με πολλαπλές ανωμαλίες, ή αμφίβολα γενν. όργανα -άτομο με νευροαναπτυξιακές διαταραχές

9 Πώς γίνεται; Δειγμα αίματος από τον πάσχοντα Ανάλυση των χρωμοσωμάτων (καρυότυπος)

10 Σύνθετες ανακατατάξεις Σπάνιες δομικές ανωμαλίες που χαρακτηρίζονται από > 3 σημεία θραύσης σε δύο, τρία ή περισσότερα χρωμοσώματα. Μεταθέσεις, αναστροφές, ελλείμματα, διπλασιασμούς ή/και ενθέσεις.

11 Μοριακός έλεγχος Ανάλυση DNA ασθενούς με γενετικό νόσημα Μυική δυστροφία Duchenne Γονίδιο: DMD Κλινική εικόνα (+) Πως γίνεται; Με δείγμα αίματος από τον πάσχοντα Ανάλυση του γονιδίου DMD Αναγνώριση της υπεύθυνης μετάλλαξης

12 Τι προσφέρουν; Έλεγχος και ενημέρωση της οικογένειας. Υπάρχει κίνδυνος για τα υπόλοιπα μέλη; Απόκτησης παθολογικών παιδιών; Προγεννητικός έλεγχος Προεμφυτευτικός έλεγχος Προγνωση

13 Μεταβολικός έλεγχος-βιοχημικά τεστ Ανάλυση των επιπέδων πρωτεΐνης (προϊόντος γονιδίου) Π.χ. Ανιχνευτικά προγράμματα νεογνών (neonatal screening)

14 Ανιχνευτικό πρόγραμμα νεογνών (neonatal screening) για γενετικές, μεταβολικές, ορμονικές ή λειτουργικές διαταραχές τις πρώτες ημέρες πριν την εκδήλωση κλινικών συμπτωμάτων. αν δεν γίνει έγκαιρη διάγνωση μπορεί να οδηγήσουν σε κλινικά προβλήματα. ανάλυσης στο αίμα της κατάλληλης για το ελεγχόμενο νόσημα ουσίας. ο έλεγχος αυτός δεν είναι διαγνωστικός, αλλά μπορεί να εντοπίσει τα νεογνά που έχουν μεγάλη πιθανότητα να πάσχουν και τα οποία πρέπει να διερευνηθούν.

15 Φαινυλκετονουρια (PKU) ανεπάρκεια ή ελλειψη του ενζύμου υδροξυλάση της φαινυλαλανίνης, που μετατρέπει τη φαινυλαλανίνη σε τυροσίνη, και έχει ως αποτέλεσμα τη συσσώρευση της φαινυλαλανίνης που ασκεί τοξική δράση, ιδίως στον εγκέφαλο. Me ειδική δίαιτα ελεύθερη φαινυλαλανίνης, προλαμβάνονται όλες οι εκδηλώσεις της νόσου Συχνότητα 1/20,000 νεογνά Μέτρηση φαινυλαλανίνης στο αίμα του νεογνού

16 Ανάλυση μια σταγόνας αίματος (spot blood test) και την ανίχνευση αυξημένων επιπέδων ενός ενζύμου (IRT - Immunoreactive Trypsinogen) που παράγεται στο πάγκρεας και φυσιολογικά βρίσκεται σε πολύ μικρές ποσότητες. Υψηλές τιμές IRT μπορεί να σημαίνουν ΚΙ και τότε συστήνεται ανάλυση DNA για ανίχνευση μεταλλάξεων Κυστική ίνωση Σύγχρονη Κλινική Γενετική (A.Read-D.Donnai)

17 Τι προσφέρει ο έλεγχος; Mε ειδική δίαιτα ελεύθερη φαινυλαλανίνης, προλαμβάνονται όλες οι εκδηλώσεις της νόσου Έλεγχος της οικογένειας-συμβουλευτική (1:70 άτομα είναι φορέας

18

19 Δυνατότητες FISH Μικροελλείμματα- < 5Mb (Φυσιολογικός καρυότυπος) Έλεγχος γνωστής περιοχής ( kb) Μεσοφασικοί πυρήνες Μεταθέσεις- σύνθετες ανακατατάξεις? Σημεία θραύσης

20 Νέες/νεότερες εξετάσεις/τεστ

21 Καρυότυπος

22 jpg ΚΟΨDiagnosticul Prenatal QF-PCR la Jurnal TV ( ).mp4

23 acgh

24

25 Διερεύνηση γενετικού νοσήματος Α. Νόσημα γνωστό Β. Νόσημα άγνωστο

26 Kλινική εικόνα: Τρισωμία 21

27 Προγεννητικά

28 QF-PCR- ταχεία ανίχνευση ανευπλοειδιών Στοχευμένη ανάλυσησυγκεκριμένες περιοχές Αριθμητικές ανωμαλίες (χρ.13, 18, 21, Χ, Υ) Αδυναμίες:δομική χρωμοσωμική ανωμαλία (1-2%), χαμηλό ποσοστό μωσαϊκισμού. Συνήθως σε συνδυασμό με καρυότυπο.

29 jpg

30 QF-PCR

31

32 FISH Interphase FISH on uncultured amniocytes using an 18p specific probe RP11-324G2 (spectrum red) shows: (A) two red signals in a cell with disomy 18; (B) four red signals in a cell with a supernumerary isochromosome 18p.

33 Fig. 4 Interphase FISH analysis on uncultured urinary cells using an 18p11.32-specific probe RP11-324G2 (spectrum red) and an 18q23-specific probe RP11-154H12 (spectrum green) shows: (A) two red signals and two green signals in a cell with disomy 18; (B) f... Chih-Ping Chen, Tsang-Ming Ko, Yi-Ning Su, Schu-Rern Chern, Jun-Wei Su, Yu-Ting Chen, Dai-Dyi Town, Waysee... Prenatal diagnosis of mosaic tetrasomy 18p Journal of Obstetrics and Gynecology Volume 51, Issue

34

35 18p

36 Φυσιολογικός καρυότυπος??

37 acgh

38 Μεταγεννητικά

39 Νεογέννητο. Ίδιος φαινότυπος - Αποτέλεσμα καρυοτύπου ίδιο?

40 47,ΧΥ,+21

41 46,ΧΥ, +21,der(21;21)(q10;q10) 46,XY,+21,rob(21;21)(q10;q10)

42 46,ΧΥ, +21,der(14;21)(q10;q10) 46,XY,+21,rob(14;21)(q10;q10)

43 Φαινότυπος τρισωμίας 21 Καρυότυπος: 46,ΧΥ???????

44 FISH

45 Mωσαϊκισμός

46 acgh (+21)

47 Μωσαϊκισμός mos46,χχ/47,χχ,+21 Genetics in Medicine (2010) 12, 85 92

48 Kαρυότυπος Διακριτική ικανότητα >5-7Mb Έχουμε εικόνα ολόκληρου του γονιδιώματος (46 χρωμοσώματα)

49 Nor mal 2

50 Aνακαταταξη

51

52 Chromosome 2 normal derivative 2 7 Chromosome Chromosome 7 7 5

53 Aνδρας 32 ε για έλεγχο γονιμότητας

54

55 XX male

56 SRY / κεντρομερίδιο Χ

57 Πολυχρωματικές μέθοδοι-mcb- multicolor banding and spectral karyotyping

58 Πολυχρωματικές μέθοδοι.m-fish (multicolor FISH)/SpectralKarYotyping Mίγμα ανιχνευτών όλων των χρωμοσωμάτων με 24 χρώματα (ηλεκτρονική επεξεργασίαψευδοχρωματικά) Μικροσκόπιο εξοπλισμένο με ειδικά φίλτρα Ειδικό λογισμικό Μέθοδος ανάλυσης ολόκληρου του γονιδιώματος

59 Πότε; Μεταθέσεις άγνωστα χρωμοσώματα, μικρά χρωμοσώματα-δεικτες Σύνθετες ανακατατάξεις

60

61 Fig. 1. (A) A composite karyotype showing all chromosomes displayed in mband. (B F) Chromosomes 16 of the case described. In all chromosome pairs and in the schemes in E the normal chromosome is shown on the left side, and the aberrant chromosome on the right side. (B) GTG-banded chromosomes 16; (C) mbanded chromosomes 16 at high resolution level (850 bands); (D) mbanded chromosomes 16 at reduced resolution ( 200 bands); (E) ISCN ideogram and mband ideogram. Square brackets indicate breakpoints on the normal chromosome. The resulting fragments are sequentially numbered next to the normal ideogram (left) and rearranged according to the observation made by the mband analysis resulting in an aberrant ideogram (right). Inv indicates an inversion of the respective fragment as compared to its original orientation. (F) Signal pattern of the BAC-probes (localization shown below) of the two probe sets hybridized to chromosome 16.

62 Αποτελέσματα- πολυχρωματικών ζωνών Μulticolor banding (MCB) and spectral karyotyping(wcp, BAC FISH ) Τ. Liehr group. Jena University Hospital, Friedrich Schiller University, Institute of Human Genetics, Jena, Germany

63 9p

64

65

66 Τεχνικές βασισμένες σε μικροσυστοιχίες

67 CGH - array 46,ΧΥ,del(18)(q21.2)

68

69

70 Παθολογικό άτομο (cri-du-chat) με φυσιολογικό καρυότυπο

71

72 Complex rearrangements characterized by a combination of chromosome analysis and chromosomal microarray analysis (CMA). (a) In case 9, a deletion in the long arm of one chromosome 17 was detected by G-banded chromosome analysis. CMA revealed no copy number change for chromosome 17 but a copy number loss of ~2.382 Mb in chromosome 2 at band 2q31.1. Retrospective examination of the chromosome analysis showed an insertion (ins) of the 17q genomic material into the short arm of one chromosome 2. In addition, in the same chromosome 2, there is a pericentric inversion between 2p12 and 2q31.1. The deletion detected by CMA is at or near the inversion breakpoint. (b) In case 10, an insertion of a portion of the long arm of one chromosome 2 into the short arm of one chromosome 6 was detected by G-banded chromosome analysis. In addition, there is an apparently balanced reciprocal translocation between chromosomes 12 and 18. CMA revealed two copy number losses on chromosome 2 separated by an ~11.3 Mb copy-neutral segment. The copy number loss on 2q24 is located at or near one insertion breakpoint. In addition, CMA detected a copy number loss of ~ Mb in the long arm of chromosome 6. No copy number changes were detected in chromosomes 12 or 18 in this version 8 array. The abnormal chromosomes are indicated by arrows.

73 Chromosome analysis facilitated the detection of mosaicism and chromosomal structural rearrangements. (a c) Chromosomal microarray analysis (CMA) showed a similar gain in copy number for all probes specific for chromosome 18 in three separate samples. However, chromosome analysis revealed a different finding for each case. (a) Trisomy 18 with no mosaicism detected by chromosome analysis. (b) Mosaicism with a trisomy 18 cell line in 80% of cells whereas the remaining 20% of cells are normal 46,XX. (c) Mosaicism for two abnormal cell lines. One cell line had trisomy 18 in 91% of cells and the other cell line had an isochromosome 18 consisting of two copies of the short arm of chromosome 18 in 9% of cells. (d,e) Examples of chromosomal structural rearrangements associated with interstitial copy number changes. (d) An interstitial copy number gain of ~ Mb was detected by CMA. G-banded chromosome analysis showed that the duplicated segment involving chromosome bands 9q12q22.31 was inserted into the distal long arm of chromosome 9 at band 9q33. The abnormal chromosomes are indicated by arrows. (e) Two interstitial copy number losses were detected by CMA; one was ~0.416 Mb in chromosome 1p and the other was ~5.678 Mb in chromosome 10p. G-banded chromosome analysis showed that the copy number loss in 1p was adjacent to the breakpoint of a translocation between the short arm of one chromosome 1 and the long arm of one chromosome 3. In contrast, the deletion in 10p is a simple deletion.

74 Next generation paired-end sequencing (PES), MPSmate-pair sequencing : χαρτογράφηση σε επίπεδο νουκλεοτιδίου

75 Αλληλούχιση (sequencing) Mε την αλληλούχιση «διαβάζουμε» κάθε γράμμα του DNA και βρίσκουμε αλλαγές που μποούμε να χαρακτηρήσουμε μεταλλάξεις(mutations) ή πολυμορφισμούς (variations) που μπορεί να οδηγήσουν σε νόσημα ή να επηρεάσουν τον κίνδυνο εμφάνισης νοσήματος.

76 NGS-PES(next generation paired-end Πολλοί τύποι ανακατατάξεων μπορούν να μελετηθούν. Βασίζεται στη σύγχρονη ανάλυση 2 μικρών αλληλουχιών (matepairs) που συγκρίνονται(aligned) με συγκεκριμένο/γνωστό γονιδίωμα Ακολουθεί σύγκριση με αλληλουχία αναφοράς. Εκτός από την πληροφορία της αλληλούχισης το «διάβασμα» και από τις δύο πλευρές δίνει πληροφορίες για τη θέση/περιοχή της ανακατάταξης. Βιοπληροφορικά εργαλεία sequencing )

77 NGS-PES(next generation paired-end ανάλυση σε επίπεδο νουκλεοτιδίου αναγνωρίζονται άμεσα γονίδια που έχουν διακοπεί στα σημεία θραύσης χαρακτηρίζονται δομικές ανακατατάξεις π.χ. μικρά ελλείμματα ή αναστροφές που συχνά δεν ανιχνεύονται με άλλες τεχνικές sequencing ) cancerpreventionresearch.aacrjournals.org

78 BP regions identified by MPS in the UCSC Human Genome Browser Mar (NCBI37/hg19) Assembly window. BPs are shown by red arrows. a) 2p22.1-2p16.2. b) 5p15.2-5p14.2. a b

79 ΣΧΑ 2, 5, 7 με 11 Σ.Θ. chr2 2p22.1 2p a 2b 2c 2d chr5 5p15.2 5p15.1 5p14.3 5p a 5b 5c 5d 5e 5f 5g chr7 7p21.2 7q31.1 7a 7b 7c 6

80 Χιμαιρικά γονίδια Eξώνια 1-2 του Α + εξώνια του Β.

81 Συνδυασμένη μελέτη όλων των διαθέσιμων μεθόδων ΜPS συμπληρώνει G-banding, FISH και -οδηγεί στον χαρακτηρισμό της ΣΧΑ στο επίπεδο του νουκλεοτιδίου- -διόρθωση της ακριβούς θέσης Σ.Θ. -αποκάλυψη νέων Σ.Θ.

82 Αλληλούχιση ολόκληρου του γονιδιώματος (Whole genome sequencing)

83 -85% των μεταλλάξεων που έχουν συσχετισθεί με γενετικές ασθένειες Exome sequencing

84

85 Genomics, proteomics and Bioinformatics,vol 12, issue 5, 2014,

86 Διαφορες DNA/ άτομο 4 εκ. πολυμορφισμοί DNA ( variants) / άτομο SNPs Πολυ-νουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί Μικρές ενθεσεις/ελλειμματα(indels) Αλλαγες αριθμού αλληλουχιων(copy number variants) (CNVs) Αναστροφές (Inversions) Μεταθέσεις (Translocations)

87 SNPs

88 Πολυμορφισμοί (>1 νουκλεοτιδιο) Indels insertionsdeletions(κάθε ποικιλομορφία DNA που αφορά ένθεση ή ελλειμμα βάσεων. CNVs copy number variants= πολυμορφικές, μη παθολογικές αλλαγές στον αριθμό αντιγράφων συγκεκριμένων περιοχών DNA. Κυτταρογενετικοί πολυμορφισμοί (Aναστροφές, μεταθέσεις,ανευπλοειδίες

89 Ανθρώπινο γονιδίωμα Αναγνώριση συχνών πολυμορφισμών σε 270 ατομα από 4 διαφορετικούς πληθυσμούς (ΗΠΑ Utah- β/βδ Ευρώπη,, Κινέζοι Han, Beijing, Ιαπωνες/Τοκιο, Νιγηρία Yoruba Αλληλούχιση ολόκληρου του γονιδιώματος και περιγραφή ποικιλομορφίας σε >1000 ατομα από διαφορετικούς πληθυσμούς Αλληλούχιση (Sanger) στοχευμένη Αποτύπωση (γονότυποι) ολόκληρου του γονιδιώματος Genome-wide genotyping (GWAS) Αλληλούχιση εξονιων (Exome sequencing) Αλληλούχιση Γονιδιωμάτων Genome sequencing )