ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ

Transcript

1 ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ Α ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΗ ΟΥΡΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΛΑ ΚΟ ΝΟΣΟΚΟΜΕΙΟ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Κ. Α. ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΙΔΗΣ ΚΛΙΝΙΚΗ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΤΗΣ ΚΑΛΛΙΚΡΕΪΝΗΣ 13 (KLK13) ΣΤΟΝ ΚΑΡΚΙΝΟ ΤΗΣ ΟΥΡΟΔΟΧΟΥ ΚΥΣΤΗΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ Ι. ΤΟΚΑΣ ΧΕΙΡΟΥΡΓΟΣ ΟΥΡΟΛΟΓΟΣ, FEBU ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΑΘΗΝΑ

2 ια η α μ και η αδ ρφή μ η και η ρ φ ρ η ύζ μ Ε α λ α και α αιδι μ Μαρ α και Ιω α 2

3 3

4 Ο ΟΡΚΟΣ ΤΟΥ ΙΠΠΟΚΡΑΤΟΥΣ ΜΕΤΑΦΡΑΣΗ: ΟΡΚΙΖΟΜΑΙ ΕΙΣ ΤΟΝ ΑΠΟΛΛΩΝΑ ΤΟΝ ΙΑΤΡΟ ΚΑΙ ΕΙΣ ΤΟΝ ΑΣΚΛΗΠΙΟ ΚΑΙ ΕΙΣ ΤΗΝ ΥΓΕΙΑ ΚΑΙ ΕΙΣ ΤΗΝ ΠΑΝΑΚΕΙΑ ΚΑΙ ΕΙΣ ΟΛΟΥΣ ΤΟΥΣ ΘΕΟΥΣ ΚΑΙ ΤΙΣ ΘΕΕΣ, ΕΠΙΚΑΛΟΥΜΕΝΟΣ ΑΥΤΟΥΣ ΩΣ ΜΑΡΤΥΡΕΣ, ΟΤΙ ΘΑ ΤΗΡΗΣΩ ΚΑΤΑ ΤΗ ΔΥΝΑΜΗ ΚΑΙ ΤΗΝ ΚΡΙΣΗ ΜΟΥ ΑΥΤΟΝ ΤΟΝ ΟΡΚΟ ΚΑΙ ΑΥΤΟ ΕΔΩ ΤΟ ΣΥΜΒΟΛΑΙΟ ΜΟΥ. ΘΑ ΘΕΩΡΩ ΕΚΕΙΝΟΝ Ο ΟΠΟΙΟΣ ΜΕ ΔΙΔΑΞΕ ΤΗΝ ΤΕΧΝΗ ΑΥΤΗ ΙΣΟ ΠΡΟΣ ΤΟΥΣ ΓΟΝΕΙΣ ΜΟΥ ΚΑΙ ΘΑ ΜΟΙΡΑΣΤΩ ΜΑΖΙ ΤΟΥ ΤΑ ΥΠΑΡΧΟΝΤΑ ΜΟΥ ΚΑΙ ΘΑ ΤΟΝ ΒΟΗΘΩ ΟΤΑΝ ΕΥΡΙΣΚΕΤΑΙ ΣΕ ΟΙΚΟΝΟΜΙΚΗ ΑΝΑΓΚΗ. ΘΑ ΘΕΩΡΩ ΤΟΥΣ ΑΠΟΓΟΝΟΥΣ ΤΟΥ ΩΣ ΑΔΕΛΦΟΥΣ ΜΟΥ ΚΑΙ ΘΑ ΤΟΥΣ ΔΙΔΑΣΚΩ ΤΗΝ ΤΕΧΝΗ ΑΥΤΗ, ΕΑΝ ΕΠΙΘΥΜΟΥΝ ΝΑ ΤΗ ΜΑΘΟΥΝ, ΧΩΡΙΣ ΑΜΟΙΒΗ ΚΑΙ ΣΥΜΒΟΛΑΙΟ. ΘΑ ΜΕΤΑΔΩΣΩ ΜΕ ΠΑΡΑΓΓΕΛΙΕΣ, ΟΔΗΓΙΕΣ ΚΑΙ ΣΥΜΒΟΥΛΕΣ ΟΛΕΣ ΤΙΣ ΠΟΛΟΙΠΕΣ ΓΝΩΣΕΙΣ ΚΑΙ ΕΙΣ ΤΑ ΠΑΙΔΙΑ ΜΟΥ ΚΑΙ ΕΙΣ ΤΑ ΠΑΙΔΙΑ ΤΟΥ ΔΙΔΑΣΚΑΛΟΥ ΜΟΥ ΚΑΙ ΕΙΣ ΤΟΥΣ ΜΑΘΗΤΕΣ ΟΙ ΟΠΟΙΟΙ ΕΧΟΥΝ ΟΡΚΙΣΤΕΙ ΟΤΙ ΘΑ ΤΗΡΟΥΝ ΤΟΥΣ ΙΑΤΡΙΚΟΥΣ ΚΑΝΟΝΕΣ ΚΑΙ ΕΧΟΥΝ ΣΥΜΦΩΝΗΣΕΙ ΕΓΓΡΑΦΩΣ, ΕΙΣ ΟΥΔΕΝΑ ΔΕ ΑΛΛΟΝ. ΘΑ ΘΕΡΑΠΕΥΩ ΤΟΥΣ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΚΑΤΑ ΤΗ ΔΥΝΑΜΗ ΚΑΙ ΤΗΝ ΚΡΙΣΗ ΜΟΥ, ΧΩΡΙΣ ΠΟΤΕ ΕΚΟΥΣΙΩΣ ΝΑ ΤΟΥΣ ΒΛΑΨΩ Η ΝΑ ΤΟΥΣ ΑΔΙΚΗΣΩ. ΔΕ ΘΑ ΧΟΡΗΓΗΣΩ ΘΑΝΑΤΗΦΟΡΟ ΦΑΡΜΑΚΟ ΣΕ ΚΑΝΕΝΑΝ, ΟΥΤΕ ΚΑΙ ΕΑΝ ΜΟΥ ΖΗΤΗΘΕΙ ΚΑΙ ΟΥΤΕ ΘΑ ΔΩΣΩ ΤΕΤΟΙΑ ΣΥΜΒΟΥΛΗ. ΕΠΙΣΗΣ ΔΕ ΘΑ ΔΩΣΩ ΣΕ ΓΥΝΑΙΚΑ ΦΑΡΜΑΚΟ ΓΙΑ ΝΑ ΑΠΟΒΑΛΕΙ. ΘΑ ΔΙΑΤΗΡΗΣΩ ΤΟ ΒΙΟ ΜΟΥ ΚΑΙ ΤΗΝ ΤΕΧΝΗ ΜΟΥ ΚΑΤΑ ΤΡΟΠΟ ΑΓΝΟ ΚΑΙ ΣΥΜΦΩΝΟ ΠΡΟΣ ΤΟΝ ΘΕΙΟ ΝΟΜΟ. ΔΕ ΘΑ ΧΕΙΡΟΥΡΓΗΣΩ ΟΥΤΕ ΤΟΥΣ ΠΑΣΧΟΝΤΑΣ ΑΠΟ ΛΙΘΙΑΣΙΝ, ΑΛΛΑ ΘΑ ΕΚΧΩΡΗΣΩ ΤΗΝ ΠΡΑΞΗ ΑΥΤΗ ΣΤΟΥΣ ΕΙΔΙΚΟΥΣ. ΣΕ ΟΣΕΣ ΔΕ ΟΙΚΙΕΣ ΕΙΣΕΛΘΩ, ΘΑ ΕΙΣΕΛΘΩ ΓΙΑ ΩΦΕΛΕΙΑ ΤΩΝ ΠΑΣΧΟΝΤΩΝ, ΑΠΕΧΟΝΤΑΣ ΑΠΟ ΚΑΘΕ ΕΚΟΥΣΙΑ ΑΔΙΚΙΑ ΚΑΙ ΑΛΛΗ ΖΗΜΙΑ ΚΑΙ ΚΑΘΕ ΓΕΝΕΤΗΣΙΑ ΠΡΑΞΗ ΕΠΙ ΓΥΝΑΙΚΕΙΩΝ ΚΑΙ ΑΝΔΡΙΚΩΝ 4

5 ΣΩΜΑΤΩΝ, ΕΛΕΥΘΕΡΩΝ Η ΔΟΥΛΩΝ. ΟΣΑ ΔΕ ΔΩ Η ΑΚΟΥΣΩ ΚΑΤΑ ΤΗΝ ΑΣΚΗΣΗ ΤΟΥ ΕΠΑΓΓΕΛΜΑΤΟΣ ΜΟΥ Η ΚΑΙ ΕΚΤΟΣ, ΓΙΑ ΤΗ ΖΩΗ ΤΩΝ ΑΝΘΡΩΠΩΝ, ΤΑ ΟΠΟΙΑ ΔΕΝ ΠΡΕΠΕΙ ΠΟΤΕ ΝΑ ΚΟΙΝΟΠΟΙΗΘΟΥΝ, ΘΑ ΚΡΑΤΗΣΩ ΜΥΣΤΙΚΑ, ΘΕΩΡΩΝΤΑΣ ΟΤΙ ΑΥΤΑ ΕΙΝΑΙ ΑΠΟΡΡΗΤΑ. ΟΣΟ ΛΟΙΠΟΝ ΘΑ ΤΗΡΩ ΤΟΝ ΟΡΚΟ ΜΟΥ ΑΥΤΟΝ ΚΑΙ ΔΕ ΘΑ ΤΟΝ ΠΑΡΑΒΑΙΝΩ, ΕΙΘΕ ΝΑ ΑΠΟΛΑΥΩ ΚΑΙ ΤΗΣ ΖΩΗΣ ΚΑΙ ΤΗΣ ΤΕΧΝΗΣ, ΕΚΤΙΜΩΜΕΝΟΣ ΕΣΑΕΙ ΑΠΟ ΟΛΟΥΣ ΤΟΥΣ ΑΝΘΡΩΠΟΥΣ. ΕΑΝ ΟΜΩΣ ΤΟΝ ΠΑΡΑΒΩ ΚΑΙ ΓΙΝΩ ΕΠΙΟΡΚΟΣ, ΝΑ ΥΠΟΣΤΩ ΤΑ ΑΝΤΙΘΕΤΑ ΑΠΟ ΑΥΤΑ. 5

6 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ...11 σελ. ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1. ΟΥΡΟΔΟΧΟΣ ΚΥΣΤΗ Ανατομία Ιστολογία Παθολογοανατομία Φυσιολογικό Ουροθήλιο Επιθηλιακή υπερπλασία και μεταπλασία Ουροθηλιακή δυσπλασία ΚΑΡΚΙΝΟΣ ΟΥΡΟΔΟΧΟΥ ΚΥΣΤΗΣ Επιδημιολογικά στοιχεία Παράγοντες κινδύνου Παθολογοανατομία Ουροθηλιακό καρκίνωμα (UCC) Ταξινόμηση Διαφοροποίηση (Grading) Καρκίνωμα Πλακώδους Επιθηλίου (SCC) Αδενοκαρκίνωμα Πρωτογενές αδενοκαρκίνωμα ουροδόχου κύστης Καρκίνωμα του ουραχού Μεταστατικό Αδενοκαρκίνωμα Χαρακτηριστικά και τρόποι διασποράς του ουροθηλιακού καρκινώματος Πολυεστιακότητα Τρόποι διασποράς

7 Άμεση επέκταση Μεταστατική διασπορά Εμφύτευση (Implantation) Διάγνωση του καρκίνου της κύστης Ιστορικό του ασθενούς Κλινική εξέταση Απεικόνιση Ενδοφλέβιος ουρογραφία και υπολογιστική τομογραφία Υπερηχογράφημα Σταδιοποίηση MIBC Τοπική σταδιοποίηση του MIBC Απεικόνιση λεμφαδένων στο MIBC Μη λεμφαδενικές απομακρυσμένες μεταστάσεις Κυτταρολογική εξέταση των ούρων Κυστεοσκόπηση Διουρηθρική εκτομή (TURBΤ) των όγκων σταδίου Ta, T Βιοψίες της κύστης και της προστατικής μοίρας της ουρήθρας Επαναληπτική διουρηθρική εκτομή (Re-TURBΤ) Πρόβλεψη υποτροπής και εξέλιξης μη μυοδιηθητικών όγκων ΒΙΟΜΟΡΙΑΚΟΙ ΔΕΙΚΤΕΣ ΣΤΟΝ ΚΑΡΚΙΝΟ ΤΗΣ ΚΥΣΤΗΣ Μοριακοί δείκτες που ανιχνεύονται στα ούρα Πρακτική εφαρμογή της κυτταρολογικής εξέτασης των ούρων και των μοριακών δεικτών Μαζικός έλεγχος (Screening) του πληθυσμού με υψηλό κίνδυνο για καρκίνο της κύστης Έλεγχος των ασθενών με συμπτώματα ενδεικτικά για καρκίνο της κύστης (πρώτη διάγνωση) Διευκόλυνση της παρακολούθησης των NMIBC

8 4. ΟΙ ΙΣΤΙΚΕΣ ΚΑΛΛΙΚΡΕΪΝΕΣ (KLKs) Ρόλος των ιστικών καλλικρεϊνών σε φυσιολογικές λειτουργίες του οργανισμού Ρόλος των ιστικών καλλικρεϊνών σε διάφορες παθήσεις Ρόλος των ιστικών καλλικρεϊνών στην καρκινική ανάπτυξη Οι ιστικες καλλικρεΐνες ως βιομοριακοί καρκινικοί δείκτες Ιστικές καλλικρεΐνες ως βιομοριακοί δείκτες του καρκίνου της κύστης Η καλλικρεΐνη 13 (KLK13 ή KLK-L4) ως καρκινικός δείκτης ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1. ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΣ Βιολογικό υλικό Απομόνωση RNA Ομογενοποίηση ιστών Απαιτούμενα Υλικά Μέθοδος Εκτίμηση της συγκέντρωσης του ολικού RNA Μέθοδος Εκτίμηση της ποιότητας του ολικού RNA Φασματοφωτομετρική ανάλυση Ηλεκτροφόρηση του διαλύματος RNA σε πήκτωμα αγαρόζης Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης αντίστροφης μεταγραφής (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction / RT-PCR) Αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής (Reverse Transcriptase Reaction) Απαιτούμενα Υλικά Μέθοδος

9 1.3.2 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction / PCR) Ημιποσοτική RT-PCR (Semi-quantitative RT-PCR) Απαιτούμενα Υλικά Αντίδραση PCR για το γονίδιο της φωσφοριβοζυλοτρανσφεράσης 1 της υποξανθίνης, HPRT1 (hypoxanthine phosphoribosyl-transferase 1) Αντίδραση PCR για το γονίδιο της καλλικρεΐνης 13, KLK13 (kallikreinrelated peptidase13) Ανίχνευση και ανάλυση των προϊόντων της συμβατικής RT-PCR αντίδρασης Ανίχνευση και ανάλυση των προϊόντων της ημιποσοτικής RT-PCR (Semi-quantitative RT-PCR) Απαιτούμενα Υλικά Μέθοδος Ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (Quantitative Real-Time PCR/qPCR) Αντίδραση της ποσοτικής PCR πραγματικού χόνου Απαιτούμενα Υλικά Αντίδραση ποσοτικής πραγματικού χρόνου για το γονίδιο της φωσφοριβοζυλοτρανσφεράσης 1 της υποξανθίνης, HPRT1 (hypoxanthine phosphoribosyl-transferase 1) Αντίδραση ποσοτικής PCR πραγματικού χρόνου για το γονίδιο της καλλικρεΐνης 13, KLK13 (kallikrein-related peptidase 13) Ανίχνευση, ανάλυση και ποσοτικός προσδιορισμός των προϊόντων της ποσοτικής αντίδρασης PCR πραγματικού χρόνου (Quantitative Real-Time PCR) Στατιστική ανάλυση ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Σύγκριση των αριθμών της έκφρασης της KLK13 στους καρκινικούς ιστούς σε σχέση με τους παρακείμενους φυσιολογικούς ιστούς Βαθμοί έκφρασης της KLK13 στους καρκινικούς ιστούς αλλά και στους παρακείμενους φυσιολογικούς ιστούς, ανάλογα με το στάδιο της νόσου

10 2.3 Βαθμοί έκφρασης της KLK13 στους καρκινικούς ιστούς, ανάλογα με το βαθμό διαφοροποίησης (grade), σε σχέση με τους παρακείμενους φυσιολογικούς ιστούς Έκφραση της KLK13 και καμπύλες επιβίωσης των ασθενών Ασθενείς με NMIBC Ασθενείς με MIBC ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ SUMMARY ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

11 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Ο καρκίνος της ουροδόχου κύστης αποτελεί την πιο συχνή κακοήθεια του ουροποιητικού συστήματος. Η διάγνωση και ο επανέλεχος πραγματοποιούνται με τη χρήση της κυστεοσκόπησης, η οποία είναι μια επεμβατική πράξη. Κρίνεται λοιπόν απαραίτητη η εύρεση μη επεμβατικών τεχνικών που να μπορούν να βοηθήσουν τον κλινικό ουρολόγο ή και να αντικαταστήσουν την κυστεοσκόπηση στην καθημερινή κλινική πράξη. Στο σημείο αυτό μπορούν να αποδειχθούν ιδιαίτερα χρήσιμοι οι μοριακοί δείκτες. Έτσι, στις μέρες μας, παρουσιάζεται μια έντονη ερευνητική δραστηριότητα στην ανακάλυψη τέτοιων δεικτών, στην εφαρμογή τους ως διαγνωστικά όπλα, αλλά και τη χρήση τους ως προγνωστικούς δείκτες για τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Ωστόσο, κανένας δείκτης δεν έχει καταφέρει, μέχρι σήμερα, να περάσει από το εργαστήριο στην αναγνώριση, μέσα από κατευθυντήριες οδηγίες, και, πολύ περισσότερο, στην εφαρμογή του στην καθημερινή κλινική πράξη. Η γονιδιακή οικογένεια των ιστικών καλλικρεϊνών του ανθρώπου (KLK) είναι μια υποοικογένεια των πρωτεασών σερίνης. Πολλές κατηγορίες νεοπλασιών παρουσιάζουν απορρύθμιση κάποιου από τα KLK γονίδια, τόσο σε επίπεδο μεταγραφής όσο και σε επίπεδο μετάφρασης. Επιπλέον, πολλές μορφές καρκίνου παρουσιάζουν παθολογική έκκριση διαφόρων καλλικρεϊνικών ουσιών, γεγονός που τις καθιστά πρότυπους καρκινικούς βιο-δείκτες για τη διάγνωση, παρακολούθηση, και πρόγνωση των ασθενών. Ειδικά για τον καρκίνο της κύστης, έχει παρατηρηθεί υπερέκφραση των γονιδίων KLK5, -6, -8, -9 στα καρκινικά κύτταρα, καθώς επίσης και στους μυοδιηθητικούς όγκους (pt2-pt ) σε σχέση με τους μη μυοδιηθητικούς (pta & pt1). Η συγκεκριμένη μελέτη, ωστόσο, αποτελεί τη μοναδική που σχετίζεται με την ανάλυση της έκφρασης κάποιας KLK στον καρκίνο της κύστης, που συνοδεύεται από περαιτέρω κλινική αξιολόγηση και παρακολούθηση των ασθενών. Η Καλλικρεΐνη 13 (KLK13) συμμετέχει σε ένα μεγάλο αριθμό φυσιολογικών λειτουργιών του οργανισμού. Η έκφραση της αποτελεί καλό προγνωστικό δείκτη στον καρκίνο του στήθους, των ωοθηκών, και του στομάχου, και κακό προγνωστικό δείκτη στον καρκίνο του πνεύμονος. Η διαγνωστική και προγνωστική της αξία στον καρκίνο της κύστης δεν έχει ακόμη αξιολογηθεί. 11

12 Σκοπός της προοπτικής αυτής μελέτης είναι η κλινική αξιολόγηση της έκφρασης του γονιδίου της KLK13 στον καρκίνο της ουροδόχου κύστεως, με στόχο την περαιτέρω χρήση της ως διαγνωστικό και προγνωστικό δείκτη. Ιστοτεμάχια ουροδόχου κύστεως ελήφθησαν από την περιοχή του όγκου και παρακείμενη αυτού μακροσκοπικά φυσιολογική περιοχή από 158 ασθενείς με καρκίνο της κύστης. Η λήψη των ιστοτεμαχιδίων έγινε με τη χρήση ψυχρής βιοψίας κατά τη διάρκεια διουρηθρικής εκτομής μορφώματος κύστης ή ριζικής κυστεκτομής. Έγινε ιστολογική ταυτοποίηση όλων των δειγμάτων. Απομονώθηκε το ολικό RNA και έπειτα πραγματοποιήθηκε η αντίστροφη μεταγραφή αυτού σε cdna. Η ποσοτική ανάλυση της έκφρασης της KLK13 πραγματοποιήθηκε μέσω της ανάπτυξης Real- Time PCR μεθοδολογίας με την χρήση του φθορισμογόνου SYBR-Green I και την χρήση της μεθόδου σχετικής ποσοτικοποίησης 2-ΔΔCT. Ακολούθως, παραγματοποιήθηκε η παρακολούθηση των ασθενών, με σκοπό την κλινική αξιολόγηση της KLK13 και τη συσχέτιση της έκφρασης αυτής με την υποτροπή, την εξέλιξη της νόσου, αλλά και την επιβίωση των ασθενών. Το κύριο τμήμα της εργασίας πραγματοποιήθηκε κατά τη διάρκεια της ειδίκευσης μου στην Ά Πανεπιστημιακή Κλινική του Νοσοκομείου Αθηνών Λαϊκό», και σε συνεργασία με τον Τομέα Βιοχημείας και Μοριακής Βιολογίας του Εθνικού Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών και το Παθολογοανατομικό Εργαστήριο του Πανεπιστημίου Αθηνών. Το υλικό μας προέρχεται από την Α Πανεπιστημιακή Ουρολογική Κλινική του Νοσοκομείου Αθηνών Λαϊκό», αφορά δε το διάστημα Η ολοκλήρωση της εργασίας αυτής είναι αποτέλεσμα συνεργασίας πολλών ατόμων, χωρίς την πολύτιμη βοήθεια των οποίων δε θα ήταν δυνατή. Ως εκ τούτου, θα ήθελα να αναφερθώ ειδικά σε εκείνους που με συγκίνησαν με τη συμπεριφορά και το έργο τους, όντας πάντα δίπλα μου ως οικογένεια ακόμα και κατά τη διάρκεια της παραμονής μου στο εξωτερικό, δάσκαλοι, συνεργάτες και φίλοι και δίνοντας μου κουράγιο και κίνητρο, έτσι ώστε να μπορέσω να ολοκληρώσω το δύσκολο αυτό έργο. Θα ήθελα να εκφράσω τις θερμές μου ευχαριστίες στον Καθηγητή κ. Κ.Α. Κωνσταντινίδη που, με υπομονή, ήταν κοντά μου σε όλη τη διάρκεια της εκπαίδευσής μου, συμβάλλοντας καθοριστικά και αποφασιστικά στην επιστημονική 12

13 μου πρόοδο, οργανώνοντας και επιβλέποντας παράλληλα την εκπόνηση της παρούσας διατριβής. Οι πολύτιμες συμβουλές, κρίσεις και παρατηρήσεις του συνέβαλλαν ουσιαστικά στην ολοκλήρωση της εργασίας αυτής. Τον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Κ. Στραβοδήμο, για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε δίνοντας μου την ευκαιρία να εκπονήσω την παρούσα εργασία. Η βοήθειά του στη επίλυση των προβλημάτων που παρουσιάστηκαν μέχρι την ολοκλήρωση της μελέτης αυτής υπήρξε καθοριστική. Ιδιαίτερα σημαντική, επίσης υπήρξε η συνεισφορά, η αμέριστη συμπαράστασή του, το ειλικρινές ενδιαφέρον, η παρότρυνση και η εμπειρία του προκειμένου να περαιωθεί η λεπτή διαδικασία της συγγραφής, καθώς και η ολοκλήρωση της διατριβής. Νιώθω την ειλικρινή ανάγκη να τον ευχαριστήσω ολόψυχα για την αδιάκοπη παρουσία του καθόλη την πορεία της προσπάθειας αυτής. Θέλω επίσης να εκφράσω τις ευχαριστίες μου στον Επίκουρο Καθηγητή κ. Χ Αλαμανή που, ως μέλος της τριμελούς επιτροπής, με επέβλεπε και με συμβούλευε πάντα με θερμό ενδιαφέρον. Η βοήθεια, η συμπαράσταση και οι εύστοχες παρατηρήσεις του, ήταν ανεκτίμητες. Ευχαριστώ θερμά τον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Α. Σκορίλα ο οποίος ηγήγηθηκε της μοριακής ανάλυσης των δειγμάτων, διαθέτοντας προθυμότατα τις εύστοχες συμβουλές του και την επιστημονική του καθοδήγηση. Ο ρόλος του ήταν τόσο επιστημονικός, όσο φιλικός και ηθικός. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω ιδιαίτερα όλους τους συναδέλφους του Παθολογοανατομικού Εργαστηρίου του Πανεπιστημίου Αθηνών οι οποίοι ανέλαβαν την παθολογοανατομική αξιολόγηση όλων των δειγμάτων. Χωρίς την αποφασιστική συμβολή τους η έκβαση της διατριβής θα ήταν αβέβαιη. Ευχαριστώ επίσης όλους τους ειδικευμένους και ειδικευόμενους συναδέλφους στην 1η Πανεπιστημιακή Ουρολογική Κλινική για τη βοήθειά τους στη συλλογή των δειγμάτων και την παροχή κλινικών πληροφοριών, αλλά και τους ασθενείς της Κλινικής που συμμετείχαν στη μελέτη για την κατανόηση και την υπομονή τους. 13

14 Θα ήταν για μένα μεγάλο το κενό που θα ένιωθα αν δεν ευχαριστούσα το φίλο και συνεργάτη, Βιολόγο Μ. Αυγέρη για την ουσιαστική και άριστη πολύχρονη συνεργασία μας και τη βοήθειά του στην ολοκλήρωση αυτής της εργασίας. Η παρουσία του ήταν, σε όλη τη διάρκεια, η εγγύηση που είχα για τη σίγουρη επιτυχία του έργου. Εύχομαι η συνεργασία μας να συνεχιστεί και σε μελλοντικές μελέτες. Τέλος, θέλω να ευχαριστήσω και να αφιερώσω το παρόν σύγγραμμα στα παιδιά μου και τη σύζυγο μου για την αγάπη, την ηθική συμπαράσταση και την αμέριστη υπομονή που επέδειξαν, αλλά και να εκφράσω την ευγνωμοσύνη μου στους γονείς μου, οι κόποι και το όραμα των οποίων με οδήγησαν ως εδώ. 14

15 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟ 15

16 1. ΟΥΡΟΔΟΧΟΣ ΚΥΣΤΗ 1.1 Ανατομία Η ουροδόχος κύστη αποτελεί όργανο του κατώτερου ουροποιητικού συστήματος και χρησιμεύει στην αποθήκευση, αλλά και την αποβολή των ούρων με την κένωση της. Κατά την πλήρωσή της, αποκτά ωοειδές σχήμα και έχει χωρητικότητα περίπου 500cc, ενώ κατά την κένωσή της έχει τετραεδρικό σχήμα. Τα ανατομικά της στοιχεία είναι η άνω επιφάνεια με την κορυφή στο σημείο του ουραχού, δύο πλάγιες επιφάνειες, και η οπίσθια επιφάνεια που περιλαμβάνει και τον κυστικό αυχένα στο κατώτερο σημείο. Ο ουραχός καθηλώνει την ουροδόχο κύστη στο πρόσθιο κοιλιακό τοίχωμα. Στο σημείο σύνδεσης του ουραχού με την κύστη υπάρχει σχετική ένδεια μυικού ιστού, προδιαθέτοντας στο σχηματισμό εκκολπωμάτων. Ο ουραχός αποτελείται από επιμήκεις λείες μυικές δεσμίδες οι οποίες προέρχονται από το τοίχωμα της ουροδόχου κύστης. Κοντά στον ομφαλό, γίνεται ινώδης και συνήθως συμφύεται σε μια από τις εξαλειμμένες ομφαλικές αρτηρίες. Συνήθως παραμένει ένας αυλός, κατά τη διάρκεια της ζωής, ο οποίος καλύπτεται από επιθήλιο και σπάνια μπορεί να δημιουργήσει επιθετικά αδενοκαρκινώματα [1]. Η ανώτερη επιφάνεια της ουροδόχου κύστης καλύπτεται από περιτόναιο. Έμπροσθεν, το περιτόναιο ανακάμπτει προς το πρόσθιο κοιλιακό τοίχωμα. Οπισθίως, στους άνδρες, περνά στο ύψος των σπερματοδόχων κύστεων και ενώνεται με το περιτόναιο του προσθίου τοιχώματος του ορθού σχηματίζοντας το ορθοκυστικό διάστημα. Στις γυναίκες, το περιτόναιο στην άνω επιφάνεια της ουροδόχου κύστης ανακάμπτει προς την άνω επιφάνεια της μήτρας σχηματίζοντας το κυστεομητρικό κόλπωμα και ακολούθως συνεχίζει οπισθίως πάνω από τη μήτρα σχηματίζοντας το ευθυκυστικό κόλπωμα. Στην πρόσθια, κατώτερη, δεξιά, και αριστερή πλάγια επιφάνεια, περιβάλλεται από περικυστικό λίπος και χαλαρό συνδετικό ιστό. Η βάση της ουροδόχου κύστης σχετίζεται με τις σπερματοδόχες κύστεις, τις σπερματικές ληκύθους, και τους 16

17 τελικούς ουρητήρες. Ο αυχένας βρίσκεται 3-4 cm πίσω από τη μεσότητα της ηβικής σύμφυσης. Η θέση του σταθεροποιείται από τις πυελικές περιτονίες και από τη συνέχειά του με τον προστάτη αδένα. 1.2 Ιστολογία - Παθολογοανατομία Φυσιολογικό Ουροθήλιο Το φυσιολογικό ουροθήλιο αποτελείται από 3 7 σειρές κυττάρων μεταβατικού επιθηλίου. Υπάρχει ένα βασικό στρώμα κυττάρων, πάνω στο οποίο βρίσκονται ένα ή περισσότερα στρώματα ενδιάμεσων κυττάρων. Το πιο επιφανειακό στρώμα αποτελείται από μεγάλα, επίπεδα, (umbrella like) κύτταρα, που περιβάλλονται από μια μη συμμετρική μεμβράνη. Κάτω από το ουροθήλιο βρίσκεται μια στιβάδα συνδετικού ιστου, το χόριο (lamina propria), εντός της οποίας βρίσκονται διεσπαρμένες λείες μυικές ίνες που σχηματίζουν την υποβλεννογόνια μυική στιβάδα (muscularis mucosa) Επιθηλιακή υπερπλασία και μεταπλασία Η ιθηλιακή ρ λα α αποτελεί την αύξηση του αριθμού των κυτταρικών σειρών, χωρίς ανωμαλίες της αρχιτεκτονικής τους ή πυρηνικές ανωμαλίες. Η μ α λα α του ουροθηλίου είναι η διαφοροποίηση της εμφάνισης του, από μεταβατικό επιθήλιο, συνήθως σε επιδερμοειδές (πλακώδης μεταπλασία), ή αδενικό (αδενωματώδης μεταπλασία). Η πλακώδης μεταπλασία με απουσία κυτταρικής ατυπίας ή έντονης κερατινοποίησης αποτελεί καλοήθη κατάσταση. Οι φωλ έ Von Brunn είναι νησίδια φυσιολογικά εμφανιζόμενου ουροθηλίου που βρίσκονται στο χόριο. Η κ ική κ ι χαρακτηρίζεται από φωλεές του Von Brunn με εοσινοφιλική διαφοροποίηση στο κέντρο των νησιδίων. Η αδ ική κ ι είναι παρόμοια με την κυστική κυστίτιδα, αλλά τα κύτταρα στο κέντρο των φωλεών χρακτηρίζονται από αδενική μεταπλασία. Η κατάσταση αυτή μπορεί να θεωρηθεί πρόδρομος αδενοκαρκινώματος [2] Ουροθηλιακή δυσπλασία Η η ρ λα α είναι παρόμοια με την επιθηλιακή υπερπλασία, με τη διαφορά 17

18 ότι υπάρχουν και ανωμαλίες στον πυρήνα των κυττάρων και διαταραχές των ουροθηλιακών κυττάρων [3]. Η δ λα α του ουροθηλίου περιλαμβάνει επιθηλιακές μεταβολές, ενδιάμεσες μεταξύ του φυσιολογικού επιθηλίου και του καρκινώματος in situ. Τα δυσπλαστικά κύτταρα έχουν μεγάλους, στρογγυλούς, χαραγμένους, και με παθολογική πολικότητα πυρήνες. Το δυσπλαστικό επιθήλιο δεν επιδεικνύει αύξηση των κυτταρικών σειρών ή αυξηση των μιτώσεων [4]. Το α ρ φ θήλωμα είναι μια καλοήθης υπερπλαστική διαταραχή που σχετίζεται με την χρόνια φλεγμονή του ουροθηλίου και το υποκυστικό κώλυμα. Θηλωματώδεις προσεκβολές εισέρχονται στο χόριο, αντί για τον αυλό της κύστης. Η βλάβη συνήθως επικαλύπτεται με με ένα φυσιολογικό στρώμα επιθηλίου. Επειδή η επιθηλιακή επίστρωση αποτελείται από φυσιολογικά κύτταρα, τα ανάστροφα θηλώματα εμφανίζονται στην κυστεοσκόπηση ως υπερυψωμένα οζίδια και όχι ως θηλωματώδεις όγκοι. Τα ανάστροφα θηλώματα μπορεί να περιέχουν περιοχές κυστικής κυστίτιδος ή πλακώδους μεταπλασίας. Έχουν περιγραφεί στη βιβλιογραφία σπάνιες περιπτώσεις κακοήθους εξαλλαγής [5]. Το φρ έ αδέ ωμα είναι μια σπάνια βλάβη που ιστολογικά μοιάζει με πρωτόγονα αθροιστικά σωληνάρια των νεφρών. Αποτελεί μια μεταπλαστική αντίδραση του ουροθηλίου στο τραύμα, τη λοίμωξη, ή την ακτινοθεραπεία και συνοδεύεται συνήθως από δυσουρικά ενοχλήματα. Το οίδημα και η φλεγμονώδης διήθηση των κυτάρων είναι ιδιαίτερα συχνά, αλλά χωρίς να συνοδεύονται από πυρηνική ατυπία ή μιτωτική δραστηριότητα [6]. Το μ φρικό αδέ καρκ ωμα είναι μια κακοήθης βλάβη, αντίστοιχη με το νεφρογενές αδένωμα [7]. Η λ κ λακ α της ουροδόχου κύστης χαρακτηρίζεται από μια πλακώδη μεταπλασία με έντονη κερατινοποίηση, ακάνθωση, κυτταρική ατυπία, και δυσπλασία. Πιστεύεται ότι αποτελεί αντίδραση του φυσιολογικού ουροθηλίου σε επιβλαβή ερεθίσματα και γενικά θεωρείται ως μια προκαρκινική βλάβη που δύναται να εξελιχθεί σε πλακώδες καρκίνωμα στο 20% των ασθενών. Το ψ δ ρκωμα είναι μια εξαιρετικά σπάνια βλάβη που μοιάζει με σαρκωματώδη βλάβη της ουροδόχου κύστης. Χαρακτηρίζεται από αντιδραστικό πολλαπλασιασμό 18

19 (spindle cells) που παρουσιάζεται μερικούς μήνες μετά από χειρουργική επέμβαση ή λοίμωξη του κατώτερου ουροποιητικού συστήματος. Οι βλάβες αυτές, συχνά, λανθασμένα θεωρούνται καρκινικές και συγχέονται με λειομυοσαρκώματα [8,9]. 2. ΚΑΡΚΙΝΟΣ ΟΥΡΟΔΟΧΟΥ ΚΥΣΤΗΣ 2.1 Επιδημιολογικά στοιχεία Αποτελεί την συχνότερη κακοήθεια του ουροποιητικού συστήματος και τον έβδομο συχνότερο καρκίνο στους άνδρες αλλά και τον δέκατο έβδομο συχνότερο στις γυναίκες. Η τρέχουσα επίπτωση της νόσου παγκοσμίως είναι 9 στους 100,000 άνδρες, και 2 στις 100,000 γυναίκες [10]. Στα κράτη της Ευρωπαϊκής Ενωσης η επίπτωση ανέρχεται σε 27 στους 100, 000 άνδρες και 6 στις 100,000 γυναίκες [10]. Η επίπτωση της νόσου ποικίλλει ανάλογα με τα κράτη και τις περιοχές. Στην Ευρώπη, η υψηλότερη επίπτωση, ανάλογα με την ηλικία, παρατηρείται στην Ισπανία (41.5 στους άνδρες και 4.8 στις γυναίκες) και η χαμηλότερη στη Φινλανδία (18.1 στους άνδρες και 4.3 στις γυναίκες) [10]. Οι διάφορες μπορούν, μερικώς, να αποδοθούν στη διαφορετική μεθοδολογία και ποιότητα της συλλογής των επιδημιολογικών στοιχείων, τονίζοντας έτσι την ανάγκη για πιο επιμελείς επιδημιολογικές μελέτες [11,12]. Η παγκόσμια θνησιμότητα, ανάλογα με την ηλικία, είναι 3 στους 100,000 άνδρες έναντι 1 στις 100,000 γυναίκες., ενώ η αντίστοιχη συχνότητα στην Ευρώπη είναι 8 στους 100,000 άνδρες και 3 στις 100,000 γυναίκες [10]. Η επίπτωση του καρκίνου της κύστης έχει μειωθεί σε κάποιες περιοχές, πιθανότατα, λόγω της μειωμένης έκθεσης στους περιβαλλοντικούς παράγοντες κινδύνου, κυρίως το κάπνισμα και οι εργασιακοί παράγοντες [13]. Η θνησιμότητα έχει επίσης μειωθεί λόγω της προόδου στην αντιμετώπιση της νόσου [14]. Περίπου το 75% των ασθενών παρουσιάζουν καρκίνο που περιορίζεται στο ουροθήλιο (στάδιο Ta, CIS) ή το χόριο (στάδιο T1). Οι όγκοι αυτοί ονομάζονται μη μυοδιηθητικοί (Non Muscle-Invasive Bladder Cancer/NMIBC) και είναι πολύ πιο συχνοί λόγω των λίγων πιθανοτήτων εξέλιξης και της μακράς επιβίωσης σε πολλές περιπτώσεις. Οι ασθενείς με μυοδιηθητικούς καρκίνους (Muscle-Invasive Bladder Cancer/MIBC) παρουσιάζουν 19

20 μεγαλύτερη θνησιμότητα [12]. 2.2 Παράγοντες κινδύνου Νεώτερα στοιχεία αποδεικνύουν ότι η γενετική προδιάθεση παίζει σημαντικό ρόλο στην επίπτωση της νόσου, ειδικά σε συνδυασμό με την ευαισθησία σε διάφορους περιβαλλοντικούς παράγοντες [12,15]. Το κάπνισμα αποτελει το σημαντικότερο παράγοντα κινδύνου και ευθύνεται για το 50% των περιπτώσεων περίπου [12,16]. Ο καπνός περιέχει αρωματικές αμίνες και πολυκυκλικούς αρωματικούς υδρογονάνθρακες που αποβάλλονται από τους νεφρούς. Η επαγγελματική έκθεση σε αρωματικές αμίνες, πολυκυκλικούς αρωματικούς υδρογονάνθρακες και χλωριούχους υδρογονάνθρακες αποτελεί το δεύτερο σημαντικότερο παράγοντα κινδύνου και ευθύνεται για το 10% των περιπτώσεων περίπου. Η επαγγελματική έκθεση συμβαίνει κυρίως σε βιομηχανίες επεξεργασίας χρωμάτων, βαφών, μετάλλων και πετρελαιοειδών [12,17-19]. Η σημασία της ποσότητας πρόσληψης υγρών δεν έχει επιβεβαιωθεί, ωστόσο, η χλωρίωση του πόσιμου νερού και τα υψηλά επίπεδα τριαλομεθανών και αρσενικού αποτελούν δυνητικά καρκινογόνους παράγοντες [12, 20]. Η σχέση της βαφής μαλλιών με τον κίνδυνο της νόσου παραμένει ανακριβής. Ωστόσο, έχουν ενοχοποιηθεί κάποιες μόνιμες βαφές [21,22]. Η έκθεση στην ιονίζουσα ακτινοβολία έχει επίσης ενοχοποιηθεί για τον καρκίνο της κύστης. Επιπλέον, διάφορες φαρμακευτικές ουσίες, όπως η κυκλοφωσφαμίδη και η πιογλιταζόνη, φαίνεται ότι συνδέονται με αυξημένο κίνδυνο της νόσου [12]. Η σχιστοσωμίαση, μια χρόνια ενδεμική κυστίτιδα, που βασίζεται στην επαναλαμβανόμενη λοίμωξη ενός παράσιτου, αποτελεί αίτιο του καρκίνου της κύστης, ιδιαίτερα του καρκίνου εκ πλακώδους επιθηλίου [12]. 2.3 Παθολογοανατομία Ουροθηλιακό καρκίνωμα (UCC) Το ουροθηλιακό καρκίνωμα (Urothilial Carcinoma/UC) αποτελεί πάνω από το 90% των καρκίνων της κύστης. Διαφέρει από το φυσιολογικό ουροθήλιο έχοντας αυξημένο αριθμό επιθηλιακών στοιβάδων, θηλωματώδεις πτυχώσεις του 20

21 βλεννογόνου, απώλεια της πολικότητας των κυττάρων, παθολογική ωρίμανση τους από τη βασική ως την επιφανειακή στοιβάδα, αυξημένη αναλογία πυρήνακυτταροπλάσματος, παρουσία πυρηνίων, και αυξημένο αριθμό μιτώσεων [23]. Τα ουροθηλιακά κακινώματα παρουσιάζουν μια ποικιλία στον τρόπο ανάπτυξης, όπως η θηλωματώδης, διηθητική, οζώδης, μεικτή, και επίπεδη ενδοεπιθηλιακή ανάπυξη (καρκίνωμα in situ/cis). Η διήθηση του κακίνου στα κύτταρα της υποβλεννογόνιας μυϊκής στοιβάδας (εντός της lamina propria), μπορεί να εκτιμηθεί εσφαλμένα ως διήθηση του στρώματος του εξωστήρα μυός [24,25], και αποτελεί ιδιαίτερο πρόβλημα για τις παθολογοανατομικές εκθέσεις δειγμάτων από τη διουρηθρική εκτομή όγκων κύστεως. Το ουροθήλιο έχει μεγάλο μεταπλαστικό δυναμικό, έτσι, τα ουροθηλιακά καρκινώματα μπορεί να περιέχουν ακανθώδη κύτταρα [26], πλακώδη, ή αδενωκαρκινωματώδη διαφοροποίηση. Τα στοιχεία αυτά παρουσιάζονται στο 1/3 των μυοδιηθητικών ουροθηλιακών καρκίνων, και σε κάποιες περιπτώσεις και σε μονήρεις όγκους. Το 70% των καρκίνων είναι θηλωματώδεις, 10% είναι οζώδεις, και 20% είναι μεικτοί Ταξινόμηση Σύμφωνα με το σύστημα ταξινόμησης TNM (Tumour, Node, Metastasis), η θηλωματώδης βλάβη που περιορίζεται στο βλεννογόνο ταξινομείται ως ογκος σταδίου Ta. Οι όγκοι που διηθούν το χόριο (lamina propria) έχουν στάδιο T1. Οι Ta και T1 όγκοι μπορούν να αφαιρεθούν πλήρως με τη διουρηθρική εκτομή (TUR), και συγκαταλέγονται, έτσι, στους NMIBC για θεραπευτικούς σκοπούς. Στην ίδια κατηγορία ανήκουν και οι επίπεδες, αλλά υψηλής κακοήθειας, βλάβες που περιορίζονται στο βλεννογόνο και ονομάζονται καρκινώματα in situ (CIS ή Tis). Ωστόσο, οι νεότερες τεχνικές μοριακής βιολογίας και η κλινική εμπειρία έχουν αποδείξει το υψηλό κακόηθες δυναμικό των CIS και T1 βλαβών. Ως αποτέλεσμα, οι όροι NMIBC και "επιφανειακός" καρκίνος της κύστης αποτελούν αναντίστοιχες περιγραφές των βλαβών αυτών, και, ειδικά ο δεύτερος όρος, δε θα πρέπει να χρησιμοποιείται πλέον. Οπότε χρησιμοποιείται η ορολογία NMIBC, πρέπει να συνοδεύεται από το στάδιο (stage) και το βαθμό διαφοροποίησης (grade) της βλάβης. Το έτος 2002 η ταξινόμηση κατα TNM εγκρίθηκε από την Διεθνή Ενωση κατά του Καρκίνου (Union International Contre le Cancer -UICC) και, έκτοτε έχει ευρεία αποδοχή (πίνακας 1). Το σύστημα ανανεώθηκε το 2009 χωρίς, ωστόσο, μεταβολές 21

22 για τον καρκίνο της κύστης [27]. Πίνακας 1: Ταξινόμηση ΤΝΜ 2002 των όγκων της ουροδόχου κύστης Tx: Ογκος που δε μπορεί να αξιολογηθεί T0: Απουσία ανιχνεύσιμου όγκου Tis: Ta: Καρκίνωμα in situ Όγκος θηλώδης χωρίς διήθηση της βασικής επιθηλιακής μεμβρανης T1: Όγκος που διηθεί το χόριο T2: T2a: T2b: T3: T3a: T3b: T4: T4a: T4b: Διήθηση του μυϊκού χιτώνα Διήθηση του επιπολής μυϊκού χιτώνα Διήθηση του ένα τω βάθει μυϊκού χιτώνα Διήθηση του περικυστικού λίπους Μικροσκοπική διήθηση Μακροσκοπική διήθηση Διήθηση γειτονικών οργάνων, πυελικού ή κοιλιακού τοιχώματος Διήθηση του προστάτη, της μήτρας ή του κόλπου Διήθηση πυελικού ή κοιλιακού τοιχώματος Nx: Λεμφαδένες που δε μπορούν να αξιολογηθούν N0: Απουσία λεμφαδενικών μεταστάσεων N1: Μονήρης λεμφαδένας διαμέτρου < 2 cm N2: Μονήρης λεμφαδένας διαμέτρου 2-5 cm, ή πολλαπλοί λεμφαδένες διαμέτρου < 5 cm N3: Λεμφαδένες διαμέτρου >5 cm Mx: Απομακρυσμένες μεταστάσεις που δε μπορούν να αξιολογηθούν M0: Απουσία μεταστάσεων M1: Παρουσία μεταστάσεων 22

23 Διαφοροποίηση (Grading) Πίνακας 2: Ταξινόμηση της WHO του 1973 για το βαθμό κακοήθειας Ουροθηλιακό θήλωμα Grade 1: Grade 2: Grade 3: Καλής διαφοροποίησης Μέτριας διαφοροποίησης Πτωχής διαφοροποίησης Πίνακας 3: Ταξινόμηση της WHO 2004 για το βαθμό κακοήθειας Επίπεδες βλάβες Υπερπλασία (επίπεδη βλάβη χωρίς στοιχεία ατυπίας η θηλωματώδη στοιχεία) Αντιδραστική ατυπία (επίπεδη βλάβη με στοιχεία ατυπίας) Ατυπία αγνώστου σημαντικότητας Ουροθηλιακή δυσπλασία Ουροθηλιακό Cis Θηλωματώδεις βλάβες Ουροθηλιακό θήλωμα (καλόηθης βλάβη) Θηλώδες ουροθηλιακό νεόπλασμα χαμηλού δυναμικού κακοήθειας (PUNLMP) Χαμηλού βαθμού κακοήθειας ουροθηλιακό καρκίνωμα (Low Grade) Υψηλού βαθμού κακοήθειας ουροθηλιακό καρκίνωμα (High Grade) Δεν υπάρχει ακόμα κοινώς αποδεκτό σύστημα βαθμολόγησης για την διαφοροποίηση των όγκων. Τα περισσότερα συστήματα μέχρι σήμερα βασίζονται στο βαθμό αναπλασίας των καρκινικών κυτάρων [23,28-30]. Υπάρχει έντονη συσχέτιση μεταξύ του βαθμού διαφοροποίησης και του σταδίου διήθησης του όγκου [31], αφού οι περισσότεροι καλά διαφοροποιημένοι και μέτρια διαφοροποιημένοι όγκοι είναι μη διηθητικοί ενώ οι περισσότεροι κακώς διαφοροποιημένοι είναι και μυοδιηθητικοί. Επίσης υπάρχει σημαντική συσχέτιση μεταξύ διαφοροποίησης του όγκου και πρόγνωσης του ασθενούς, ενώ ακόμα μεγαλύτερη είναι η σχέση του σταδίου διήθησης και της πρόγνωσης. 23

24 Το καρκίνωμα in situ (Cis) μπορεί να εμφανισθεί ως μια εξέρυθρη περιοχή στο βλεννογόνο, αν και πολλές φορές δεν είναι ορατό με την κυστεοσκόπηση. Ιστολογικά αποτελεί ένα κακώς διαφοροποιημένο ουροθηλιακό καρκίνωμα που περιορίζεται εντός του ουροθηλίου. Μπορεί να είναι ασυμπτωματικό ή να συνοδεύεται από συμπτώματα όπως η συχνουρία, η επιτακτικότητα, και η δυσουρία. Το Cis συνοδεύει πάνω από το 25% των μη διηθητικών καρκίνων υψηλής κακοήθειας (high-grade) [3], και εξελίσσεται σε διηθητικό καρκίνο στο 40-83% των περιπτώσεων [32]. Επίσης συνυπάρχει στο 20-75% των διηθητικών καρκίνων. Οι καρκίνοι που προκαλούν έντονη συμπτωματολογία εξελίσσονται γρηγορότερα σε διηθητικούς. Τέλος το 20% των ασθενών που υποβάλλονται σε κυστεκτομή για διάχυτο Cis έχουν, μικροσκοπικά, μυοδιηθητικό καρκίνο ουροδόχου κύστης [33]. Το θήλωμα (grade 0) είναι μια θηλωματώδης βλάβη με λεπτό ινοαγγειακό πυρήνα που επικαλύπτεται από φυσιολογικό βλεννογόνο [34,35]. Αποτελείται από λιγότερες από 7 σειρές επιθηλιακών κυττάρων και δεν παρουσιάζει άλλες ιστολογικές ανωμαλίες. Είναι ιδιαίτερα σπάνιος όγκος που, σε αντίθεση με το ουροθηλιακό καρκίνωμα, δεν υποτροπιάζει συχνά μετά από τη διουρηθρική εκτομή του, αλλά και αν υποτροπιάσει αποτελεί καλοήθη βλάβη [35]. Πρέπει όμως να ληφθεί υπ όψιν ότι το θήλωμα συχνά συνυπάρχει με ουροθηλιακό καρκίνωμα υψηλού βαθμού κακοήθειας, γεγονός που αμφισβητεί την καλοήθεια του. Οι καλ διαφ ρ ιημέ ι ό κ ι έχουν ένα λεπτό ινοαγγειακό μίσχο με πεπαχυσμένο ουροθήλιο που αποτελείται από περισσότερες από 7 σειρές κυττάρων. Τα κύτταρα παρουσιάζουν μόνο ήπια αναπλασία και πλειομορφισμό. Η διαταραχή της κυτταρικής ωρίμανσης από τη βασική μεμβράνη στην επιφάνεια είναι ήπια, και σπάνια παρουσιάζονται μιτώσεις. Οταν περιορίζονται στο βλεννογόνο, ορίζονται ως θηλώδεις ουροθηλιακοί όγκοι χαμηλού κακόηθους δυναμικού (papillary urothelial tumors of low malignant potential - PULMP) [36]. Ομως, ακόμα και όταν δε συνοδεύονται από άλλες βλάβες, συχνά υποτροπιάζουν με υψηλότερο ιστολογικό στάδιο και βαθμό κακοήθειας [35]. Βλάβες με αυτή την εμφάνιση (grade 1 κατά WHO 1973) είναι ουροθηλιακοί καρκίνοι. Συνυπάρχουν στις ίδιες κύστεις (και συχνά ακόμα και εντός του ίδιου όγκου) με καρκίνους υψηλού βαθμού κακοήθειας [37], και μοιράζονται κοινά προγνωστικά χαρακτηριστικά με τους καρκίνους χαμηλού grade 24

25 [35,38,39]. Οι μέ ρια διαφ ρ ιημέ ι (low grade grade 2 κα WHO 1973) καρκ ι έχουν ευρύτερο ινοαγγειακό πυρήνα, μεγαλύτερη διαταραχή της ωρίμανσης των κυττάρων από τη βασική μεμβράνη στην επιφάνεια, και απώλεια της πολικότητας των κυττάρων. Η αναλογία πυρήνα-κυτταροπλάσματος είναι μεγαλύτερη, με μεγαλύτερο πυρηνικό πλειομορφισμό και παρουσία πυρηνίσκων. Οι μιτώσεις παρουσιάζονται συχνότερα. Αυτοί ονομάζονται ρ θηλιακ καρκι ώμα α χαμηλ ύ grade (WHO 2004) [36]. Οι όγκοι χαμηλή διαφ ρ η η, ή ψηλ ύ grade (WHO 2004) ή grade 3 (WHO1973) [36], αποτελούνται από κύτταρα με χαμηλή διαφοροποίηση κατά την ωρίμανση τους από τη βασική μεμβράνη στην επιφάνεια. Παρατηρείται έντονος πυρηνικός πλειομορφισμός και μεγάλη αναλογία πυρήνα κυτταροπλάσματος. Οι μιτώσεις είναι ιδιαίτερα συχνές. Οι όγκοι αυτοί παρουσιάζουν μεγάλο κίνδυνο εξέλιξης. Η συνύπαρξη δύο διαφορετικών καρκινικών τύπων δεν είναι σπάνια, όμως υποστηρίζεται ότι όλοι οι επιθηλιακοί όγκοι έχουν κοινή προέλευση στο μεταβατικό επιθήλιο. Η παρουσία αυτών των στοιχείων μεταπλασίας (πχ καρκίνωμα πλακώδους επιθηλίου και αδενοκαρκίνωμα) σε βλάβη με κύρια χαρακτηριστικά ουροθηλιακού καρκινώματος δεν αλλάζει την ταξινόμηση του όγκου ως ουροθηλιακό καρκίνωμα Καρκίνωμα Πλακώδους Επιθηλίου (SCC) Το 80% αυτών των καρκίνων σχετίζεται με τη σχιστοσωμίαση ή αλλιώς βιλλαρζίαση (S. haematobium). Οι ασθενείς που προσβάλλονται είναι, κατά μέσο όρο, χρόνια νεώτεροι από εκείνους με UC. Οι καρκίνοι μετά από βιλλαρζίαση είναι εξωφυτικές, οζώδεις, μισχωτές βλάβες, με καλή διαφοροποίηση και χαμηλό μεταστατικό δυναμικό. Το μη βιλλαρζιακό SCC προκαλείται από χρόνιο ερεθισμό που οφείλεται σε λιθίαση ουροδόχου κύστης, μόνιμους ουροκαθετήρες, χρόνιες λοιμώξεις ουροποιητικού, η εκκολπώματα ουροδόχου κύστης. Γενικά, έχει χαμηλή πρόγνωση λόγω της ιδιαίτερα προχωρημένης νόσου κατά τη διάγνωση. 25

26 2.3.3 Αδενοκαρκίνωμα Τα αδενοκαρκινώματα αποτελούν λιγότερο από το 2% των πρωτογενών καρκίνων της ουροδόχου κύστης [40,41]. Χωρίζονται σε τρεις ομάδες: (1) πρωτοπαθείς όγκοι στην κύστη, (2) όγκοι του ουραχού, και (3) μεταστατικοί όγκοι [42]. Τα αδενοκαρκινώματα μπορεί να εμφανισθούν επίσης και στις περιπτώσεις εκτροπών ούρων με τη χρήση εντέρου, όπως οι ουρητηροειλεοδερμοστομίες, ορθότοπες και ετερότοπες νεοκύστεις, ουητηροσιγμοειδοστομίες, και αυξητικές κυστεοπλαστικές [43,44] Πρωτογενές αδενοκαρκίνωμα ουροδόχου κύστης Συνήθως εμφανίζεται στη βάση ή το θόλο, αλλά δυνητικά μπορεί να εμφανισθεί σε οποιοδήποτε σημείο του τοιχώματος της ουροδόχου κύστης. Είναι ο συχνότερος καρκίνος στην εκστροφή της κύστης. Αναπτύσσεται ως αντίδραση στη χρόνια φλεγμονή και ερεθισμό [45,46]. Ολοι οι ιστολογικοί υπότυποι του εντερικού αδενοκαρκινώματος εμφανίζονται και στην κύστη. Οι περισσότεροι είναι βλεννοπαραγωγοί [23]. Τα περισσότερα αδενωκαρκινώματα είναι χαμηλά διαφοροποιημένα και διηθητικά. Σχετίζονται περισσότερο με την ανάπτυξη αδενικής κυστίτιδος παρά με το καρκίνωμα in situ. Η κακή τους πρόγνωση οφείλεται κυρίως στο προχωρημένο στάδιο κατά τη διάγνωση. Δεν υπάρχουν στοιχεία στη βιβλιογραφία που να υποστηρίζουν πως η πρόγνωσή τους είναι διαφορετική από εκείνη των UC του ίδιου σταδίου Καρκίνωμα του ουραχού Είναι ιδιαίτερα σπάνιος όγκος που δημιουργείται έξω από την κύστη, είναι συνήθως αδενοκαρκίνωμα, αλλά μπορεί να είναι αρχικά και UC ή SCC και, σπάνια, ακόμα και σάρκωμα. Τα καρκινώματα του ουραχού έχουν σαφή οριοθέτηση μεταξύ του όγκου και του παρακείμενου επιθηλίου, με τον όγκο να εντοπίζεται κάτω από το φυσιολογικό ουροθήλιο [47]. Μπορεί να εκδηλωθούν με την έκκριση βλεννώδους ή αιματηρού υγρού από τον ομφαλό ή με την δημιουργία βλεννοκήλης, που εμφανίζεται ως ψηλαφητή μάζα. Πολλοί όγκοι εμφανίζουν αποτιτανώσεις στην ακτινογραφία [48,49]. Οι όγκοι που διηθούν τον αυλό της κύστης μπορούν να εκκρίνουν βλέννα στα ούρα. Οι ασθενείς με καρκινώματα του ουραχού έχουν σαφώς 26

27 χειρότερη πρόγνωση από εκείνους με πρωτογενή αδενοκαρκινώματα [47]. Ιστολογικά, οι όγκοι αυτοί επιδεικνύουν ευρύτερη και βαθύτερη από την αναμενόμενη διήθηση, θέτοντας σε κίνδυνο τα ογκολογικά αποτελέσματα της μερικής κυστεκτομής [50,51]. Μεθίστανται στους λαγόνιους και βουβωνικούς λεμφαδένες, στο επίπλουν, το ήπαρ, τους πνεύμονες, και τα οστά [51] Μεταστατικό Αδενοκαρκίνωμα Αποτελεί μια από τις πιο συνηθισμένες μορφές αδενοκαρκινώματος [52]. Οι πρωτογενείς εστίες βρίσκονται στο ορθό, το στόμαχο, το ενδομήτριο, το μαστό, τον προστάτη αδένα, και τις ωοθήκες [53]. 2.4 Χαρακτηριστικά και τρόποι διασποράς του ουροθηλιακού καρκινώματος Πολυεστιακότητα Το ουροθηλιακό καρκίνωμα θεωρείται πολυεστιακή νόσος, και μπορεί να εκδηλώνεται με την παρουσία όγκων σε διαφορετικά χρονικά διαστήματα και διαφορετικά σημεία του ουροθηλίου (πολυχρονοτοπικότητα). Αυτό συνάδει σε μια πολυκλωνική αιτιολογία του καρκίνου της κύστης, ειδικά λόγω της συχνής υποτροπής της νόσου ακόμα και χρόνια μετά την εμφάνιση της πρωτοπαθούς βλάβης [38,39,54-56]. Το φαινόμενο των απώτερων υποτροπών μπορεί ίσως να εξηγηθεί με τη θεωρία, που ισχυρίζεται ότι οι υποτροπές αποτελούν κλωνικές διασπορές του πρωτοπαθούς όγκου, γεγονός που επιβεβαιώνεται και απο τη ραγδαία ανάπτυξη ακόμα και των θηλωματωδών UC με χαμηλό grade [57]. Επιπλέον, διάφορες ανοσοϊστοχημικές και ανοσοκυτταροχημικές μελέτες έχουν επιβεβαιώσει ότι το, ιστολογικά και κυστεοσκοπικά, φυσιολογικά εμφανιζόμενο ουροθήλιο, που βρίσκεται σε απόσταση από τους όγκους μπορεί να παρουσιάζει κοινή αλλοιωμένη έκφραση διαφόρων "καρκινικών δεικτών" όπως η G-ακτίνη, τον υποδοχέα του EGF, και αλλά σχετιζόμενα με τον καρκίνο αντιγόνα [58-61]. Είναι βέβαιο, ότι, σε μερικές περιπτώσεις, πολλαπλοί όγκοι προέρχονται από ένα και μόνο κυτταρικό κλώνο που έχει διασπαρεί σε άλλα σημεία του ουροποιητικού. Ωστόσο, τόσο επιγενετικές [58-61], όσο και γενετικές [62,63] αλλαγές, χαρακτηριστικές 27

28 του UC εμφανίζονται κατά μήκος του ουροθηλίου ασθενών με καρκίνο της κύστης και σε περιοχές μακρυά από την πρωτοπαθή βλάβη. Τα ευρήματα αυτά δε συνάδουν με τους διάφορους μηχανισμούς καρκινικής εμφυτεύσης και μετανάστευσης που θα μπορούσαν να εξηγήσουν μια αύξηση της πυκνότητας των παρακείμενων αλλοιώσεων των όγκων. Το θέμα αυτό επισκιάζεται από το αρκετά μεγάλο ποσοστό ατελούς εκτομής καρκίνων σταδίου T1 [64], που οδηγεί στο ερώτημα για το αν η ανεπαρκής αντιμετώπιση, και όχι η αυτόματη ή η ιατρογενής εμφύτευση ή ακόμα και η διασπορά κατά μήκος του επιθηλίου, ευθύνεται για την υποτροπή των καρκίνων αυτών. Κάποιες πρόσφατες εξελίξεις θα μπορούσαν ίσως να απαντήσουν. Αρχικά, η αναμφίβολη επιτυχία της μίας άμεσης μετεγχειρητικής ενδοκυστικής έγχυσης κυτταροστατικού παράγοντα μετά απο τη TURBT στην πρόληψη των υποτροπών [65,66] θα μπορούσε να υποδείξει την κλωνική εμφύτευση ως τον κύριο μηχανισμό υποτροπής. Επίσης, η επιτυχία της φωτοδυναμικής κυστεοσκόπησης στην αναγνώριση, μη ορατών δια γυμνού οφθαλμού, βλαβών και του αληθινού μεγέθους των ήδη ορατών βλαβών, αλλά και η μείωση των υποτροπών, με την εκτομή των βλαβών αυτών, επίσης αποδεικνύει ότι τη στιγμή που λίγοι καρκίνοι είναι ορατοί μπορεί να συνυπάρχουν πολλαπλοί μη ορατοί, αν και δεν αποδεικνύει την κλωνική προέλευση τους Τρόποι διασποράς Άμεση επέκταση Μ ριακή βι λ α Η διαδικασία της καρκινικής διήθησης, κατά την οποία καρκινικά κύτταρα εκ μεταβατικού επιθηλίου επεκτείνονται κάτω από τη βασική μεμβράνη στο χόριο και, ακολούθως, στο μυικό στρώμα (muscularis propria) και το περικυστικό λίπος, αποτελεί την κορύφωση μιας σειράς βιολογικών/φυσιολογικών διαδικασιών. Τέτοιες διαδικασίες είναι η αγγειογένεση, η πρωτεόλυση της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας, η αύξηση της κινητικότητας και ο πολλαπλασιασμός των καρκινικών κυττάρων, και η απόδραση από τους αμυντικούς μηχανισμούς όπως το ανοσοποιητικό σύστημα. Επιπλέον, επειδή τα μόρια της κυτταρικής προσκόλλησης (πρόσφυσης) ενώνουν τα ουροθηλιακά κύτταρα, τόσο μεταξύ τους όσο και με την υποκείμενη βασική μεμβράνη, οι συνδέσεις αυτές πρέπει να αλλοιώνοναι έτσι ώστε να επιτρέπεται o επιμερισμός και η κινητικότητα των κυττάρων. 28

29 Διάφοροι αγγειογενετικοί παράγοντες έχουν ανιχνευθεί στα ούρα των ασθενών με καρκίνο της κύστης [67]. Ουσίες που θεωρούνται υπεύθυνες για την αγγειογενετική τους δραστηριότητα είναι ο παράγοντας autocrine motility factor (AMF) [68], οι βασικοί και οξεωτικοί αυξητικοί παράγοντες των ινοβλαστών (FGFs), και ο αυξηντικός παράγοντας vascular endothelial growth factor (VEGF) [69-72]. Εχει αποδειχθεί ότι οι FGFs παράγονται μεν και από τα ουροθηλιακά κύτταρα, αλλά σε μικρότερες συγκεντρώσεις από ότι στη βασική μεμβράνη του φυσιολογικού ουροθηλίου [73]. Ετσι, είναι πιθανό ότι οι FGF απελευθερώνονται, κυρίως, από την αποδόμηση της βασικής μεμβράνης του τοιχώματος της κύστης και του εξωστήρα, από όπου μπορεί να πραγματοποιηθεί η διάχυση τους στο καρκινικό μικροπεριβάλλον και η προσκόλληση τους στο ενδοθήλιο των παρακείμενων αγγείων [73]. Η δράση του AMF είναι λιγότερο σαφής. Τα κύτταρα του αγγειακού ενδοθηλίου αλλά και τα κακοήθη ουροθηλιακά κύτταρα περιέχουν υποδοχείς για AMF [74], κάτι που κάνει πιθανή τη συμμετοχή του όχι μόνο στη δημιουργία νέων αγγείων αλλά και, μέσω παρακρινικών μηχανισμών, στην επαγωγή της κινητικότητας των καρκινικών ουροθηλιακών κυττάρων. Το mrna του VEGF αυξορρυθμίζεται στα καρκινικά σε σχέση με τα φυσιολογικά ουροθηλιακά κύτταρα, αλλά, ενώ τα επίπεδα της πρωτεΐνης του VEGF αυξάνουν ανάλογα με το καρκινικό στάδιο, δεν συνοδεύονται από αντίστοιχη αύξηση των επιπέδων του mrna [75]. Αυτό σημαίνει ότι ο η εξέλιξη του καρκίνου της κύστης μπορεί να οφείλεται στη ρύθμιση του VEGF αυξητικού παράγοντα μετά από τη μεταγραφή του DNA. Τα καρκινικά κύτταρα του ουροθηλίου εκκρίνουν διάφορες πρωτεάσες, κυρίως την κολλαγενάση τύπου IV, που δύνανται να αποδομήσουν το συνδετικό ιστό της βασικής μεμβράνης και του υποκείμενου χορίου [76]. Σε παρασκευάσματα από UCCs, η έκφραση της κολλαγενάσης IV συνδέεται με ιστοπαθολογία διηθητικού όγκου [76]. Κάποια κύρια ενδοκυτταρικά μόρια προσκόλλησης/ πρόσφυσης (adhesion molecules), όπως η E-cadherin και η οικογένεια των ιντεγκρινών (integrins), φαίνεται επίσης να αποτελούν σημαντικό φραγμό κατά της καρκινικής διήθησης, που διαταράσσεται σε περίπτωση διηθητικών όγκων. Αυτά τα μόρια είναι απαραίτητα, όχι μόνο στη συνένωση των επιθηλιακών κυττάρων μεταξύ τους και με τη βασική μεμβράνη, αλλά και για την επικοινωνία μεταξύ των κυττάρων ρυθμίζοντας την 29

30 έκφραση και τη δράση των υποδοχέων διαφόρων αυξητικών παραγόντων [77]. Εχει παρατηρηθεί μείωση της έκφρασης της E-cadherin και των α-, β-, και/ή γ-catenins σε διηθητικούς όγκους κάτι που σχετίζεται με μείωση της επιβίωσης των ασθενών [78,79]. Επιπλέον, σε περιπτώσεις Cis, το οποίο απαιτεί ενδοεπιθηλιακή διασπορά και κινητικότητα ως προϋπόθεση για την ανάπτυξη του, παρατηρείται μείωση στην έκφραση της integrin β. Ενα ακόμη μόριο που επηρεάζει την πρόσφυση και την ικανότητα της συνένωσης των συστατικών της εξωκυττάριας ουσίας είναι και το επιφανειακό αντιγόνο CD44. Η μείωση της έκφρασης του CD44 σχετίζεται με την αύξηση του καρκινικού σταδίου και grade στους ουροθηλιακούς καρκίνους, αλλά όχι και στους SCCs [80]. Ενα ακόμα μόριο που, πιθανότατα διευκολύνει τη διήθηση του ουροθηλιακού καρκίνου είναι ο urokinase plasminogen activator (u-pa), μια πρωτεάση που μετατρέπει το πλασμινογόνο σε πλασμίνη και απενεργοποιείται από τους plasminogen activator inhibitors 1 και 2 (PAI-1 και -2). Η πλασμίνη διασπά την λαμινίνη, που αποτελεί κύριο συστατικό της βασικής μεμβράνης, και ο u-pa μπορεί απευθείας να διασπάσει την φιμπρονεκτίνη στην εξωκυττάρια ουσία και να ενεργοποιήσει την κολλαγενάση τύπου IV [81]. Η σύνδεση του u-pa στις επιφάνειες καρκινικών κυττάρων, με τη βοήθεια του υποδοχέα της ουροκινάσης (upar), ενισχύει την παραγωγή πλασμίνης [82]. Εχει αποδειχθεί ότι τα καρκινικά κύτταρα της κύστης παράγουν u-pa και u-par, και η έκφραση αυτών σχετίζεται με το στάδιο και το grade της νόσου [83-85]. Επιπλέον, η έκφραση του u-pa αποτελεί ανεξάρτητο προγνωστικό δείκτη της υποτροπής και της εξέλιξης της νόσου [84]. Κάτω από φυσιολογικές συνθήκες, οι υποδοχείς του EGF περιορίζονται κυρίως στο βασικό στρώμα των επιθηλιακών κυττάρων [58]. Ωστόσο, τόσο στα UCCs όσο και στα SCCs, οι υποδοχείς του EGF εκφράζονται στα κύτταρα όλων των στρωμάτων, ακόμα και στα πιο επιφανειακά [58]. Αυτή η ανώμαλη κατανομή των υποδοχέων του EGF παρατηρείται επίσης σε περίπτωσης δυσπλασίας αλλά και φυσιολογικής εμφάνισης ουροθηλίου, τόσο κοντά όσο και σε απόσταση από περιοχές με UC [58,59]. Ακόμα και καρκινικά κύτταρα με βαθειά διήθηση του τοιχώματος της κύστης εκφράζουν τον υποδοχέα του EGF [58]. Σε αρκετές μελέτες φαίνεται ότι ο βαθμός της έκφρασης του υποδοχέα του EGF σχετίζεται άμεσα με το διηθητικό φαινότυπο [58,86,87]. Επιπλέον έχει φανεί ότι υψηλή έκφραση του υποδοχέα του EGF αποτελεί παράγοντα πτωχής 30

31 πρόγνωσης της νόσου [86-88]. Αλλοι παράγοντες (ligands) που δρουν μέσω των υποδοχέων του EGF, όπως ο transforming growth factor-α (TGF-α) και ο heparin-binding EGF-like growth factor (HB-EGF), πιθανότατα σχετίζονται με τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και την εξέλιξη της νόσου αλλά και με άλλες διαδικασίες [89-92]. Πράγματι, επειδή οι ligands για τον υποδοχέα του EGF αυξάνουν όχι μόνο την μιτογένεση αλλά και την κυτταρική κινητικότητα, διέγερση του υποδοχέα του EGF σε καρκινικά ουροθηλιακά κύτταρα αλλά και φυσιολογικά κύτταρα του ενδοθηλίου μπορεί να ενισχύει την αγγειογένεση, την κινητικότητα, και τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, διαδικασίες που παίζουν σημαντικό ρόλο στην καρκινική διήθηση [93]. Ι αθ λ α και κλι ικ χ ι μ Η τοπική διήθηση του καρκίνου της κύστης μπορεί να συμβεί με τρεις διαφορετικούς μηχανισμούς [94]. Ο πιο συχνός είναι η en bloc διασπορά, που συμβαίνει στο 60% των όγκων, και χαρακτηρίζεται από τη διήθηση των καρκινικών κυττάρων σε ευρεία ακτίνα ακριβώς εν τω βάθει της αρχικής βλάβης στο βλεννογόνο. Η διήθηση, δικήν πλοκαμιού, συμβαίνει στο 25% των καρκίνων, και η πλάγια διασπορά, με τα καρκινικά κύτταρα να αναπτύσσονται κάτω από το μακροσκοπικά φυσιολογικό ουροθήλιο, να παρατηρείται μόνο στο 10% των περιπτώσεων. Τα καρκινικά κύτταρα που εισέρχονται στο χόριο, και, ακολούθως, στο μυϊκό στρώμα, έχουν πλέον πρόσβαση στα αιμοφόρα αγγεία και τα λεμφαγγεία, μέσω των οποίων μπορούν να δώσουν μεταστάσεις στους περιοχικούς λεμφαδένες ή σε απομακρυσμένες εστίες. Η ισχυρή συσχέτιση της διήθησης του μυθικού στρώματος και των απομακρυσμένων μεταστάσεων σημειώθηκε αρχικά από τους Jewett and Strong και παραμένει σήμα κατατεθέν στην σταδιοποίηση, πρόγνωση και αντιμετώπιση της νόσου [31]. Περισσότερο από το 40% των ασθενών που υποβάλλονται σε ριζική κυστεκτομή για μυοδιηθητικό καρκίνο της κύστης παρουσιάζουν διήθηση του προστάτη από τη νόσο [95]. Στις περιπτώσεις αυτές, η προστατική μοίρα της ουρήρθας αποτελεί, κυρίως, το σημείο διήθησης. Στο 6% των περιπτώσεων υπάρχει διήθηση του προστατικού στρώματος χωρίς τη συμμετοχή της προστατικής ουρήθρας. Συνολικά, περίπου στο 40% των περιπτώσεων διήθησης του προστάτη παρατηρείται διήθηση του στρώματος 31

32 [96]. Σε αυτούς τους ασθενείς υπάρχει μεγάλη πιθανότητα (περίπου 80%) για μετέπειτα απομακρυσμένες μεταστάσεις παρά τη, θεωρητικά, πλήρη τοπική εκτομή όλου του καρκινικού ιστού με τη ριζική κυστεοπροστατεκτομή. Οι καρκίνοι που εντοπίζονται σε κολπώματα της κύστης αποτελούν επίσης ένα ιδιαίτερο πρόβλημα, αφού δύνανται να διηθήσουν απευθείας απο το επιθήλιο στο περικυστικό λίπος χάρις στην απουσία του αληθούς μυϊκού στρώματος. Ετσι, στους όγκους εντός κολπώματος, η ενδεδειγμένη θεραπεία είναι η ευρεία εκτομή (μερική κυστεκτομή) και η ριζική κυστεκτομή, κάτι που σε διαφορετική περίπτωση θα μπορούσε να αντιμετωπισθεί με απλή διουρηθρική εκτομή του όγκου [97,98] Μεταστατική διασπορά Περίπου το 5% των ασθενών με καλά η μέτρια διαφοροποιημένους μη μυοδιηθητικούς θηλωματώδεις όγκους και το 20% των μη μυοδιηθητικών όγκων υψηλού grade, συμπεριλαμβανομένου και του Cis, εκδηλώνουν τελικά αιματογενή ή λεμφογενή διασπορά. Ετσι, ενώ, αντικειμενικά, κάποιοι ασθενείς με μη μυοδιηθητικούς όγκους έχουν ήδη αναπτύξει λανθάνουσες μεταστάσεις, στην πλειοψηφία των περιπτώσεων υπάρχει υποσταδιοποίηση της νόσου και, ήδη, παρουσιάζουν διήθηση του μυικού στρώματος [91]. Λ μφ ή δια ρ Οι λεμφογενείς μεταστάσεις παρουσιάζονται νωρίτερα και δε σχετίζονται με την αιματογενή διασπορά στους περισσότερους ασθενείς. Αυτό αποδεικνύεται σε ασθενείς με περιορισμένες λεμφαδενικές μεταστάσεις που μπορούν να θεραπευθούν με τη ριζική κυστεκτομή και την εκτεταμένη πυελική λεμφαδενεκτομή [99-101]. Η έκταση της τοπικής βλάβης, αλλά και οι λεμφαδενικές μεταστάσεις, επηρεάζουν άμεσα την επιβίωση μετά τη χειρουργική αντιμετώπιση [100]. Οι πυελκοί λεμφαδένες αποτελούν την συχνότερη εστία λεμφογενούς διασποράς στον καρκίνο της κύστης. Μεταξύ αυτών, οι παρακυστικοί λεμφαδένες προσβάλλονται στο 16%, οι θυροειδείς λεμφαδένες στο 74%, οι έξω λαγόνιοι στο 65%, και οι προϊεροί στο 25%. Μη περιοχικοί λεμφαδένες μπορεί επίσης να προβληθούν στο 20% των περιπτώσεων, σχεδόν πάντα όμως με ταυτόχρονη συμμετοχή των περιοχικών λεμφαδένων [102]. Αιμα ή δια ρ Οι κυρίες εστίες αιματογενών μεταστάσεων είναι το ήπαρ στο 38%, οι πνεύμονες στο 32

33 36% τα οστά στο 27% τα επινεφρίδια στο 21% και το έντερο στο 13% των περιπτώσεων. Οποιοδήποτε άλλο όργανο μπορεί να προσβληθεί [103]. Οι οστικές μεταστάσεις είναι πιο συχνές σε περιπτώσεις σχιστοσωμιακής νόσου [104]. Παρά την σχετική πρόοδο στην αντιμετώπιση της συστηματικής νόσου, ελάχιστοι ασθενείς με απομακρυσμένες μεταστάσεις επιβιώνουν μετά από 5 έτη [105,106] Εμφύτευση (Implantation) Ο καρκίνος της κύστης διασπείρεται με εμφύτευση σε κοιλιακό τραύμα, απογυμνωμένο ουροθήλιο, προστατική κοίτη μετά διουρηθρικής εκτομής προστατικού αδενώματος, ή τραυματισμένη ουρήθρα [107]. Η εμφύτευση συνήθως χαρακτηρίζει τους όγκους υψηλού grade. Η εμφύτευση του όγκου στην προστατική κοίτη αποτελεί σπάνια εκδήλωση και χαρακτηρίζει, επίσης τους πρωτοεμφανιζόμενους όγκους υψηλού grade αλλά και πολλαπλούς όγκους [108]. Επίσης, διάτρηση της κύστης κατα τη διουρηθρική εκτομή μπορεί να οδηγήσει, αν και όχι τόσο συχνά, σε καρκινική διασπορά ή μεταστάσεις [109]. 2.5 Διάγνωση του καρκίνου της κύστης Ιστορικό του ασθενούς Το ιστορικό του ασθενούς πρέπει να λαμβάνεται και να καταγράφεται σε κάθε περίπτωση. Πρέπει να περιλαμβάνει όλες τις σημαντικές πληροφορίες που μπορεί να σχετίζονται με τον καρκίνο της κύστης, όπως διάφοροι παράγοντες κινδύνου και ιστορικό υπόπτους συμπτωματολογίας. Η ανώδυνη αιματουρία αποτελεί το συχνότερο εύρημα στον καρκίνο της κύστης. Οι όγκοι σταδίου Ta, T1 δεν προκαλούν κυστικό άλγος και σπάνια παρουσιάζουν συμπτώματα απο το κατώτερο ουροποιητικό (LUTS). Σε ασθενείς που αναφέρουν τέτοια συμπτώματα, ειδικά σε εκείνους με ερεθιστικού τύπου LUTS, που δεν ανταποκρίνονται στη συμπτωματική θεραπεία, είναι πιθανή η ύπαρξη CIS. Ειδικά για τους μυοδιηθητικούς όγκους, συχνά συμπτώματα αποτελούν η επιτακτικότητα, η δυσουρία, η συχνουρία, και, σε πιο προχωρημένο στάδιο, πυελικό άλγος και συμπτώματα σχετιζόμενα με την απόφραξη του ουροποιητικού. 33

34 2.5.2 Κλινική εξέταση Η κλινική εξέταση δεν αποκαλύπτει το NMIBC. Σε διηθητικούς όγκους είναι απαραίτητη η αμφίχειρη εξέταση ορθού-κόλπου. Μια ψηλαφητή μάζα αποτελεί χαρακτηριστικό τοπικά εκτεταμένων όγκων. Επιπλέον, κατά τη διάρκεια της γενικής αναισθησίας, η αμφίχειρη εξέταση πρέπει να πραγματοποιείται, τόσο πριν όσο και μετά την διουρηθρική εκτομή του όγκου, με σκοπό την αναγνώριση της ψηλαφητης μάζας η την πιθανή καθήλωση του όγκου στο πυελικό τοίχωμα [110,111]. Ωστόσο, υπολογίζοντας την απόκλιση μεταξύ της αμφίχειρης εξέτασης και του παθολογοανατομικού σταδίου της νόσου μετά την κυστεκτομή (11% κλινική υπερσταδιοποίηση και 31% κλινική υποσταδιοποίηση), υπάρχουν αμφιβολίες σχετικά με την ερμηνεία της αμφίχειρης εξέτασης [112] Απεικόνιση Ενδοφλέβιος ουρογραφία και υπολογιστική τομογραφία Η ενδοφλέβιος ουρογραφία (IVU) χρησιμοποιείται για να εντοπίσει ελλείμματα πλήρωσης στους κάλυκες, τη νεφρική πύελο, και τους ουρητήρες, και υδρονεφρώσεις που υποδεικνύουν την ύπαρξη όγκου στον ουρητήρα η όγκου στην κύστη που αποφράσσει το ουρητηρικό στόμιο. Μεγάλοι εξωφυτικοί όγκοι μπορεί να εντοπισθούν ως ελλείμματα πλήρωσης εντός της ουροδόχου κύστης. Η πραγματοποίηση IVU, ως εξέταση ρουτίνας, μετά απο την εντόπιση καρκίνου της κύστης, αμφισβητείται σήμερα λόγω της μικρής πιθανότητας σημαντικών ευρημάτων με αυτή τη μέθοδο [ ]. Η πιθανότητες ταυτόχρονης ύπαρξης όγκου στο ανώτερο ουροποιητικό είναι λίγες (1.8%), αλλά αυξάνουν σε 7.5% σε όγκους που εντοπίζονται στην περιοχή του τριγώνου της κύστης [114]. Ο κίνδυνος υποτροπής του όγκου στο ανώτερο ουροποιητικό κατά τη διάρκεια της παρακολούθησης αυξάνει σε περίπτωση τόσο πολλαπλών όγκων, όσο και όγκων υψηλού κινδύνου [116]. Στα περισσότερα κέντρα, η υπολογιστική ουρογραφία (CT) χρησιμοποιείται ως εναλλακτική της συμβατικής [117]. Ειδικά σε μυοδιηθητικούς όγκους της κύστης και σε όγκους του ανώτερου ουροποιητικού, η CT ουρογραφία παρέχει περισσότερες πληροφορίες από την IVU, συμπεριλαμβανομένης της κατάστασης των λεμφαδένων αλλά και των γειτονικών οργάνων. Ωστόσο, η CT ουρογραφία έχει το ελάττωμα της εκθεσης σε υψηλή ακτινοβολία σε σχέση με την IVU. 34

35 Υπερηχογράφημα Το υπερηχογράφημα (US) χρησιμοποιείται συχνά ως αρχικό διαγνωστικό μέσο για όγκους του ουροποιητικού. Αυτό συμβαίνει όχι μόνο επειδή κατά τη χρήση του δε χρησιμοποιούνται σκιαγραφικά μέσα, αλλά και επειδή η εξέλιξη του υπερηχογραφικού εξοπλισμού έχει βελτιώσει αισθητά την υπερηχογραφική απεικόνιση του ανώτερου ουροποιητικού και της ουροδόχου κύστης. Το διακοιλιακό US μπορεί να χαρακτηρίσει τις νεφρικές μάζες, να αναγνωρίσει την υδρονέφρωση, και να εντοπίσει μάζες στα τοίχωματα της ουροδόχου κύστης. Είναι το ίδιο ακριβές με την IVU στη διάγνωση της απόφραξης του ανώτερου ουροποιητικού [113]. Αποτελεί έτσι χρήσιμο εργαλείο στην εντόπιση απόφραξης σε ασθενείς με αιματουρία, ωστόσο, δεν μπορεί να αποκλείσει την παρουσία όγκων ανώτερου ουροποιητικού. Το CIS δε δύναται να εντοπισθεί με κανένα είδος απεικόνισης (IVU, CT ουρογραφία ή US) Σταδιοποίηση MIBC Η αντιμετώπιση και η πρόγνωση του MIBC καθορίζεται από το παθολογοανατομικό στάδιο και το grade (βαθμός διαφοροποίησης) της νόσου [118]. Στην κλινική πράξη, η CT και η μαγνητική τομογραφία (MRI) είναι οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται. Ο λόγος που χρησιμοποιείται η απεικόνιση για τη σταδιοποίηση είναι η παροχή σημαντικών πληροφοριών για την πρόγνωση αλλά και την επιλογή της κατάλληλης αντιμετώπισης. Σημαντικές πληροφορίες που παρέχονται από την απεικόνιση για τη σωστή σταδιοποίηση είναι η τοπική επέκταση της νόσου, οι τυχόν λεμφαδενικές μεταστάσεις, η διασπορά της νόσου στο ανώτερο ουροποιητικό ή και τα λοιπά μακρινά όργανα (ήπαρ, πνεύμονες, οστά, περιτόναιο, υπεζωκότας, επινεφρίδια, κτλ) Τοπική σταδιοποίηση του MIBC Τόσο η CT όσο και η MRI μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την εκτίμηση της τοπικής διήθησης, χωρίς, ωστόσο, να μπορούν να διαγνώσουν με ακρίβεια τη μικροσκοπική διήθηση του περικυστικού λίπους (T3a) [119]. Ο κύριος στόχος των CT και MRI είναι η αναγνώριση της T3b ή και υψηλότερου σταδίου νόσου. Η MRI διαθέτει καλύτερη πρόσληψη σκιαγραφικού από τη CT στους συνδετικούς 35

36 ιστούς, αλλά χειρότερη τοπική ανάλυση (spatial resolution). Σε μελέτες πού πραγματοποιήθηκαν πριν την εφαρμογή της MDRCT, η MRI αναφέρονταν ως πιο ακριβής στην εκτίμηση της τοπικής επέκτασης. Η ακρίβεια της MRI για την σταδιοποίηση της πρωτογενούς νόσου κυμαίνεται από 73% μέχρι 96%. Αυτές οι τιμές είναι κατά 10-33% υψηλότερες από τις αντίστοιχες της CT [120]. Η dynamic contrast-enhanced MRI μπορεί να βοηθήσει στη διαφοροποίηση των όγκων της κύστης από τους πεπιβάλλοντες ιστούς ή από την τοπική αντίδραση μετά από τη λήψη βιοψιών, διότι η πρόσληψη σκιαγραφικού απο τον όγκο, λόγω της νεοαγγείωσης, γίνεται γρηγορότερα από το φυσιολογικό τοίχωμα της κύστης [ ]. Τα πλεονεκτήματα της CT περιλαμβάνουν την υψήλη ανάλυση, το μικρότερο χρόνο εξέτασης, την ευρύτερη κάλυψη σε μια αναπνοή και μικρότερη επιδεκτικότητα σε διάφορους παράγοντες των ασθενών. Δε δύναται να διαφοροποιήσει τα στάδια Ta- T3a, αλλά είναι χρήσιμη στοι εντοπισμό της διήθησης του περικυστικού λίπους (T3b) και των γειτονικών οργάνων. Η ακρίβεια της CT στην ανίχνευση εξοκυστικής νόσου ποικίλλει από 55% μέχρι 92% [124] και αυξάνει στις περιπτώσεις προχωρημένης νόσου [125] Απεικόνιση λεμφαδένων στο MIBC Η προσέγγιση των λεμφαδενικών μεταστάσεων, βασιζόμενη αποκλειστικά στο μέγεθος, περιορίζεται από την ανεπάρκεια τόσο της CT όσο και της MRI στον εντοπισμό μεταστάσεων σε λεμφαδένες φυσιολογικού μεγέθους ή ελάχιστα διογκωμένους. Η ευαισθησία ανίχνευσης λεμφαδενικών μεταστάσεων είναι χαμηλή, και κυμαίνεται από 48 μέχρι 87%. Η ειδικότητα είναι επίσης χαμηλή, αφού η λεμφαδενική διόγκωση μπορεί να αποτελεί εκδήλωση καλοήθους νοσήματος. Συνολικά, η CT και η MRI παρουσιάζουν αντίστοιχα αποτελέσματα στην ανίχνευση λεμφαδενικής νόσου στίς περισσότερες περιπτώσεις πυελικών όγκων [ ]. Γενικά, πυελικοί λεμφαδένες με διάμετρο >8 mm και κοιλιακοί λεμφαδένες με διάμετρο >10 mm, πρέπει να θεωρούνται παθολογικά διογκωμένοι [132,133] Μη λεμφαδενικές απομακρυσμένες μεταστάσεις Είναι απαραίτητος ο έλεγχος απομακρυσμένων μεταστάσεων πριν από την επιλογή οποιασδήποτε μορφής θεραπείας του ασθενούς. Η CT και η MRI αποτελούν τις προτιμώμενες διαγνωστικές επιλογές για την ανίχνευση ηπατικών και πνευμονικών 36

37 μεταστάσεων. Οστικές και εγκεφαλικές μεταστάσεις κατά την παρουσίαση της νόσου είναι σπάνιες. Ετσι το σπινθηρογράφημα οστών και η απεικόνιση του εγκεφάλου δεν ενδείκνυνται ως απεικονίσεις ρουτίνας και έχουν θέση μόνο επί συμπτωματικής νόσου [134,135]. Η MRI είναι πιο ευαίσθητη και πιο ειδική απεικονιστική μέθοδος στην ανίχνευση οστικών μεταστάσεων από το σπινθηρογράφημα οστών [136,137] Κυτταρολογική εξέταση των ούρων Η εξέταση των ούρων είτε από την ούρηση είτε με τη μορφή εκπλύμματος, για την ανίχνευση αποφολιδωμένων καρκινικών κυττάρων, παρουσιάζει μεγάλη ευαισθησία σε όγκους υψηλού grade αλλά χαμηλή ευαισθησία σε όγκους χαμηλού grade. Σε περίπτωση CIS, παρατηρείται απώλεια της συνοχής μεταξύ των κυττάρων στην επιθυλιακή επικάλυψη του τοιχώματος της κύστης. Ως αποτέλεσμα, παρατηρείται μεγαλύτερος αριθμός αιωρούμενων κυττάρων στα ούρα αλλά και μεγαλύτερος βαθμός αναπλασίας. Η ευαισθησία της κυτταρολογικής των ούρων στην ανίχνευση του CIS κυμαίνεται από 28 μέχρι 100% [138]. Ετσι, αποτελεί εξέταση εκλογής οταν υπάρχει υποψία για νόσο υψηλού grade συμπεριλαμβανομένου του CIS. Ωστόσο, είναι συχνά αρνητική σε νόσο χαμηλού grade. Θετική κυτταρολογική ούρων υποδεικνύει ουροθηλιακό καρκίνο που μπορεί να εντοπίζεται οπουδήποτε, κατά μήκος του ουροποιητικού συστήματος, από τους κάλυκες και τη νεφρική πύελο, τον ουρητήρα, την κύστη αλλά και το αρχικό τμήμα της ουρήθρας. Ωστόσο, η αρνητική κυτταρολογική εξέταση δεν αποκλείει την ύπαρξη όγκου στο ουροποιητικό. Η ερμηνεία των αποτελεσμάτων της κυτταρολογικής των ούρων ποικίλει ανάλογα με το χρήστη [139]. Τα αποτελέσματα μπορούν να αλλοιωθούν από τη χαμηλή απόδοση των κυττάρων, τυχόν ουρολοιμώξεις, λίθους, ή ενδοκυστικές εγχύσεις. Η ειδικότητα της όμως μπορεί να ξεπεράσει το 90% σε εργαστήρια με μεγάλη εμπειρία [140]. Η κυτταρολογική των ούρων πρέπει να πραγματοποιείται με τη λήψη φρέσκων πρωϊνών ούρων. Τα πρώτα πρωϊνά ούρα δεν είναι κατάλληλα για αυτό το σκοπό, λόγω της ύπαρξης υψηλού βαθμού κυτταρόλυσης Κυστεοσκόπηση Η διάγνωση του καρκίνου της κύστης βασίζεται αποκλειστικά στην κυστεοσκοπική εξέταση και την ιστολογική επιβεβαίωση του παρασκευάσματος της διουρηθρικής εκτομής. Το CIS διαγιγνώσκεται με τη βοήθεια της κυστεοσκόπησης, σε συνδυασμό 37

38 με την κυτταρολογική των ούρων, και την ιστολογική αξιολόγηση πολλαπλών βιοψιών από τα τοιχώματα της ουροδόχου κύστης [141]. Κατά την κυστεοσκόπηση πρέπει να πραγματοποιείται πλήρης περιγραφή των ευρημάτων, όπως η εντόπιση, το μέγεθος, ο αριθμός, και η εμφάνιση (θηλώδες, συμπαγές) των βλαβών, καθώς και η περιγραφή λοιπόν αλλοιώσεων του βλεννογόνου. Συνίσταται η χρήση διαγράμματος της ουροδόχου κύστης Διουρηθρική εκτομή (TURBΤ) των όγκων σταδίου Ta, T1 Ο στόχος της TURBΤ στους καρκίνους σταδίου Ta, T1 είναι η σωστή διάγνωση της νόσου και η εκτομή όλων των ορατών βλαβών. Η πλήρης και σωστή TURBΤ, αποτελεί ιδιαίτερα σημαντικό εργαλείο στη διάγνωση και τη θεραπεία του καρκίνου της κύστης, και είναι απαραίτητη για την καλή πρόγνωση του ασθενούς [142]. Εχει επιβεβαιωθεί ότι η απουσία μυικού στρώματος στο παρασκεύασμα σχετίζεται με σημαντικά υψηλότερο κίνδυνο υπολειπόμενης νόσου και πρόωρης υποτροπής [143] Βιοψίες της κύστης και της προστατικής μοίρας της ουρήθρας Οταν είναι ορατές μη φυσιολογικές περιοχές στα τοιχώματα της κύστης, συνίσταται η λήψη "ψυχρών" βιοψιών, ή βιοψιών με τη χρήση της αγκύλης του ρεζεκτοσκοπίου. Τυχαίες βιοψίες πρέπει να λαμβάνονται σε περίπτωση θετικών κυτταρολογικών των ούρων και απουσία ορατών βλαβών, σε συνδυασμό με την απεικόνιση του ανώτερου ουροποιητικού. Ο κίνδυνος της συμμετοχής της προστατικής μοίρας της ουρήθρας ή των προστατικών πόρων αυξάνει όταν ο όγκος εντοπίζεται στο τρίγωνο ή τον αυχένα της κύστης, όταν συνυπάρχει CIS, ή σε περίπτωση πολλαπλών όγκων [144,145]. Η λήψη βιοψιών από την προστατική μοίρα της ουρήθρας συνίσταται σε περίπτωση θετικών κυτταρολογικών των ούρων χωρίς ορατή βλάβη στα τοιχώματα της κύστης, ή σε περίπτωση ορατών βλαβών της περιοχής αυτής [146] Επαναληπτική διουρηθρική εκτομή (Re-TURBΤ) Εχει αποδειχθεί ότι μπορεί να αυξήσει την ελεύθερη-υποτροπής επιβίωση της νόσου (recurrence-free survival) και συνίσταται στην περίπτωση ατελούς πρώτης TURBΤ, απουσίας μυικού στρώματος από το παρασκεύασμα (εκτός από όγκους Ta G1 και πρωτοπαθούς Cis), όγκου σταδίου T1, όγκου με grade 3 (εκτός πρωτοπαθούς CIS) [147,148]. Δεν υπάρχει συμφωνία σχετικά με την κατάλληλη χρονική περίοδο πραγματοποίησης της Re-TURBΤ, αλλά συνήθως πραγματοποιείται 2-6 εβδομάδες 38

39 μετά την αρχική TURBΤ. Κρίνεται απαραίτητη και η εκτομή του σημείου εντόπισης της αρχικής βλάβης. 2.6 Πρόβλεψη υποτροπής και εξέλιξης μη μυοδιηθητικών όγκων Ο κλασικός τρόπος ταξινόμησης των ασθενών με όγκους Ta, T1 είναι η διαίρεση τους σε ομάδες κινδύνου που βασίζονται σε διάφορους προγνωστικούς παράγοντες. Ετσι, οι ασθενείς μπορεί να είναι χαμηλού, μέσου, και υψηλού κινδύνου [149]. Με σκοπό την πρόβλεψη της υποτροπής και εξέλιξης της νόσου ξεχωριστά για κάθε ασθενή, ο EORTC (European Organization for Research and Treatment of Cancer) δημιούργησε ένα σύστημα βαθμονόμησης καθώς και πίνακες πρόβλεψης κινδύνου υποτροπής και εξέλιξης (πίνακες 4-6) [150]. 39

40 Πίνακας 4: Σύστημα βαθμονόμησης της EORTC με σκοπό τον υπολογισμό της πιθανότητας υποτροπής και εξέλιξης όγκων Ta, T1 Παράγοντας κινδύνου Υποτροπή Εξέλιξη Αριθμός μορφωμάτων Μονήρες >= Διάμετρος όγκου <3 cm 0 0 >=3 cm 3 3 Προηγούμενες υποτροπές Πρωτοπαθής 0 0 <= 1 υποτροπή / έτος 2 2 > 1 υποτροπές / έτος 4 2 Στάδιο Ta 0 0 T1 1 4 Συνύπαρξη CIS Όχι 0 0 Ναι 1 6 Grade (WHO 1973) G1 0 0 G2 1 0 G3 2 5 Σύνολο

41 Πίνακας 5: Πιθανότητες υποτροπής της νόσου σύμφωνα με τος σύστημα βαθμονόμησης της EORTC Score υποτροπής Πιθανότητες υποτροπής στο 1 έτος Πιθανότητες υποτροπής στα 5 έτη 0 15% (10-19%) 31% (24-37%) % (21-26%) 46% (42-49%) % (35-41%) 62% (58-65%) % (55-67%) 78% (73-84%) Πίνακας 6: Πιθανότητες εξέλιξης της νόσου σύμφωνα με τος σύστημα βαθμονόμησης της EORTC Score εξέλιξης Πιθανότητες εξέλιξης στο 1 έτος Πιθανότητες εξέλιξης στα 5 έτη 0 0.2% (0-0.7%) 0.8% (0-1.7%) 2-6 1% ( %) 6% (5-8%) % (4-7%) 17% (14-20%) % (10-24%) 45% (35-55%) 3. ΒΙΟΜΟΡΙΑΚΟΙ ΔΕΙΚΤΕΣ ΣΤΟΝ ΚΑΡΚΙΝΟ ΤΗΣ ΚΥΣΤΗΣ 3.1 Μοριακοί δείκτες που ανιχνεύονται στα ούρα Ενας καλός μοριακός δείκτης πρέπει να έχει τα ακόλουθα χαρακτηριστικά [151] : Εργαστηριακή μέτρηση τεχνικά απλή, εφικτή και εύκολη στην πραγματοποίηση της, με άμεσα διαθέσιμα αποτελέσματα, και με βραχεία καμπύλη εκμάθησης. Χαμηλό κόστος. Αξιοπιστία και αναπαραγωγιμότητα. Υψηλή ειδικότητα, ώστε να αποφεύγονται ψευδώς θετικά αποτελέσματα Υψηλή ευαισθησία, ώστε να αποφεύγονται ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα. Ικανότητα στην ανίχνευση όγκων υψηλού grade πρωτού ξεφύγουν της 41

42 θεραπευτικής αντιμετώπισης. Λόγω της χαμηλής ευαισθησίας της κυτταρολογικής εξέτασης των ούρων, εκτεταμένη εργαστηριακή έρευνα έχει οδηγήσει στην εξέλιξη πολυάριθμων εργαστηριακών εξετάσεων των ούρων για την ανίχνευση του καρκίνου της κύστης [ ]. Επίσης, έχουν εμφανιστεί, τα τελευταία χρόνια, πολυάριθμες ανασκοπήσεις σχετικά με τους βιομοριακούς δείκτες στον καρκίνο της κύστης [ , ]. Ειδικά οι δείκτες για την ανίχνευση των υποτροπών θα ήταν ιδιαίτερα χρήσιμοι, συμπεριλαμβανομένης της συχνότητας των κυστεοσκοπήσεων κατα την παρακολούθηση των ασθενών. Επιπλέον, θα μπορούσαν να χρησιμεύσουν στην πρόβλεψη της ανταπόκρισης της νόσου στην επικουρική θεραπεία των ενδοκυστικών εγχύσεων [ ]. Κανείς όμως από αυτούς τους δείκτες δεν έχει καθιερωθεί η αναγνωρισθεί ως εξέταση επιλογής, στη διάγνωση της νόσου και στην παρακολούθηση των ασθενών, τόσο σε επίπεδο κατευθυντήριων οδηγιών, όσο και στην καθημερινή κλινική πράξη. Κάποιοι δείκτες των ούρων που έχουν εκτιμηθεί σε αρκετά εργαστήρια/κέντρα συνοψίζονται στον πίνακα 7. Πίνακας 7: Οι κυριότεροι μοριακοί δείκτες των ούρων για τον καρκίνο της κύστης (EAU Guidelines: Non-muscle invasive bladder cancer, 2013) Δείκτης Συνολική Συνολική Ευαισθησία στους LE (level of ευαισθησία (%) ειδικότητα (%) όγκους υψηλού evidence) grade (%) UroVision Microsatellite analysis b Immunocyt/uCyt Nuclear matrix protein BTA stat BTA TRAK Cytokeratins BTA = bladder tumor antigen. 42

43 Τοσο η ευαισθησία, όσο και η ειδικότητα πρέπει να χρησιμοποιούνται στη σύγκριση των διαφόρων δεικτών γιατί παραμένουν σταθερές, σε αντίθεση με τις τιμές των positive και negative predictive values που ποικίλλουν μεταξύ των διαφόρων πληθυσμών [ ]. Ακολουθούν διάφορα συμπεράσματα σχετικά με τους δείκτες των ούρων. Η ευαισθησία είναι συνήθως υψηλότερη αλλά η ειδικότητα χαμηλότερη από αυτήν της κυτταρολογικής εξέτασης των ούρων [ ]. Διάφορες κακοήθεις βλάβες αλλά και οι ενδοκυστικές εγχύσεις BCG μπορούν να επηρεάσουν την έκφραση πολλών από τους δείκτες [ ]. Τοσο η ευαισθησία όσο και η ειδικότητα εξαρτώνται απο το κλινικό πλαίσιο στο οποίο ανήκει ο ασθενής (screening, πρώτη διάγνωση, follow-up για high risk, και follow-up για low/intermediate risk) [ ]. Για παράδειγμα, η ευαισθησία ενός δείκτη είναι υψηλότερη για την ανίχνευση μιας πρωτοεμφανιζόμενης βλάβης απο την ανίχνευση μιας υποτροπής [154]. Μέχρι σήμερα, η περισσότερο υποσχόμενη μέθοδος είναι η microsatellite analysis [ ] Πρακτική εφαρμογή της κυτταρολογικής εξέτασης των ούρων και των μοριακών δεικτών Μαζικός έλεγχος (Screening) του πληθυσμού με υψηλό κίνδυνο για καρκίνο της κύστης Εχει περιγραφεί η εφαρμογή dipstick αιματουρίας, NMP22 ή UroVysion, στο μαζικό έλεγχο για καρκίνο της κύστης, σε πληθυσμούς υψηλού κινδύνου [ ]. Η χαμηλή επίπτωση της νόσου στο γενικό πληθυσμό και ο βραχύς lead time καθιστούν τις εξετάσεις αυτές κοστοβόρες και μη εφαρμόσιμες στο γενικό πληθυσμό [157, ]. Η εφαρμογή των δεικτών, ως εξέταση ρουτίνας, στο μαζικό έλεγχο των ασθενών θα πρέπει να αποφεύγεται Έλεγχος των ασθενών με συμπτώματα ενδεικτικά για καρκίνο της κύστης (πρώτη διάγνωση) Είναι γενικά αποδεκτό ότι κανείς δείκτης δεν μπορεί να αντικαταστήσει την κυστεοσκόπηση. Ωστόσο, η κυτταρολογική των ούρων ή οι διάφοροι δείκτες μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως συμπληρωματικές εξετάσεις για τη διάγνωση, μη 43

44 ορατών με την κυστεοσκόπηση, όγκων, ιδιαίτερα του CIS. Ως αποτέλεσμα, η ευαισθησία για τους όγκους υψηλού grade και η ειδικότητα αποτελούν ιδιαίτερα σημαντικούς παράγοντες. Η κυτταρολογική των ούρων παρουσιάζει υψηλή ειδικότητα, κάτι που δε διαθέτουν οι δείκτες των ούρων, γεγονός που τους καθιστά ακατάλληλους για την πρώτη διάγνωση. Μελλοντικές μελέτες θα πρέπει να εστιάσουν την έρευνα στην εφαρμογή των μοριακών δεικτών των ούρων ως εξετάσεων επιλογής σε περιπτώσεις μικροσκοπικής αιματουρίας Διευκόλυνση της παρακολούθησης των NMIBC [154,159,175,176] Παρακ λ ύθη η ω high-risk NMIBC Οι high-risk όγκοι πρέπει να εντοπίζονται νωρίς κατά την παρακολούθηση, και το ποσοστό των μη ανιχνευθέντων όγκων να είναι, όσο το δυνατό, χαμηλότερο. Ως εκ τούτου, η καλύτερη τακτική παρακολούθησης για αυτούς τους ασθενείς θα πρέπει να περιλαμβάνει την κυστεοσκόπηση και κυτταρολογική των ούρων σε τακτά χρονικά διαστήματα. Η ειδικότητα είναι σημαντικότερη απο την ευαισθησία σε αυτήν την ομάδα των ασθενών, αφού ούτως η άλλως οι δείκτες των ούρων αποτελούν εξετάσεις συμπληρωματικές της κυστεοσκόπησης. Ετσι, κανείς δείκτης εκτός της κυτταρολογικής των ούρων δε συνίσταται για την παρακολούθηση των high-risk NMIBC. Παρακ λ ύθη η ω low/intermediate risk NMIBC Με σκοπό τη μείωση του αριθμού των κυστεοσκοπήσεων, οι δείκτες των ούρων θα πρέπει να μπορούν να ανιχνεύουν την υποτροπή των όγκων πριν αυτοί μεγαλώσουν και πολλαπλασιαστούν. Ο περιορισμός της κυτταρολογικής των ούρων είναι η χαμηλή της ευαισθησία για τις υποτροπές χαμηλού grade/risk. Μερικοί δείκτες των ούρων παρουσιάζουν υψηλότερη ευαισθησία αλλά, ακόμα, δεν μπορούν να ανιχνεύουν ούτε τους μισούς από τους όγκους low- grade που ανιχνεύονται με την κυστεοσκόπηση [154,157]. Μέχρι σήμερα, κανένας δείκτης των ούρων δεν μπορεί να αντικαταστήσει την κυστεοσκόπηση κατα την παρακολούθηση ή να βοηθήσει στη μείωση της συχνότητας των κυστεοσκοπήσεων στην καθημερινή κλινική πράξη. 44

45 4. ΟΙ ΙΣΤΙΚΕΣ ΚΑΛΛΙΚΡΕΪΝΕΣ (KLKs) Οι καλλικρεΐνες χωρίζονται σε δύο κύριες κατηγορίες: την καλλικρεΐνη του πλάσματος (plasma kallikrein/klkb1) και τις ιστικές καλλικρεΐνες (tissue kallikreins/klks) [177,178]. Οι δύο αυτές ομάδες διαφέρουν σημαντικά ως προς το μοριακό βάρος, την ειδικότητα του υποστρώματος, τα ανοσολογικά χαρακτηριστικά, τη γονιδιακή δομή, και του τύπου της εκκρινόμενης πρωτεάσης. Η καλλικρεΐνη του πλάσματος ή παράγοντας "Fletcher" (KLKB1) κωδικοποιείται από ένα, και μόνο, γονίδιο, το οποίο εντοπίζεται στη χρωμοσωμική περιοχή 4q35 [179,180]. Εκφράζεται αποκλειστικά από τα ηπατοκύτταρα. Συμμετέχει στις διαδικασίες της πήξης του αίματος, της ινοδόλυσης και, μέσω της έγκρισης της βραδυκινίνης, στον έλεγχο του αγγειακού τόνου και διαφόρων φλεγμονωδών αντιδράσεων [181]. Το γονίδιο που κωδικοποιεί την KLKB1 δεν έχει ομοιότητες με τα γονίδια των ιστικών καλλικρεϊνων και, στην ουσία δεν είναι αληθινό μέλος της πολυγονιδιακής αυτής οικογένειας. Ως εκ τούτου δε θα γίνει περαιτέρω αναφορά στη KLKB1. Η γονιδιακή οικογένεια των ιστικών καλλικρεϊνών του ανθρώπου είναι μια υποοικογένεια των πρωτεασών σερίνης. Μέχρι το 1998, τρία μέλη της οικογένειας των καλικερεϊνών ήταν γνωστά: η παγκρεατική/νεφρική καλλικρεΐνη 1 (KLK1), η αδενική καλλικρεΐνη 2 (KLK2) και το ειδικό προστατικό αντιγόνο (KLK ή PSA). Η πρωτεΐνη KLK1 προσδιορίστηκε σε υψηλά επίπεδα στο πάγκρεας, το 19, από τους Kraut και Frey. Η ονομασία καλλικρεΐνη προέρχεται από το πάγκρεας, που στα αρχαία ελληνικά ονομάζεται "καλλίκρεας" [182]. Το έτος 1999 κλωνοποιήθηκαν και χαρτογραφήθηκαν ακόμη 1 γονίδια των ανθρώπινων καλλικρεϊνών από την ομάδα Yousef, Scorilas και Diamandis, συμπληρώνοντας έτσι ολόκληρη τη γονιδιακή οικογένεια [183]. Τα γονίδια των καλλικρεϊνών (KLK1-KLK15) στον άνθρωπο συγχαρτογραφούνται διαδοχικά, δίχως να διακόπτονται από κανένα μη καλλικρεϊνικό γονίδιο, στο μεγάλο βραχίονα του χρωμοσώματος 19, σε μια περιοχή ~300 Kb μεταξύ των χρωμοσωμικών θέσεων (19q ) [184]. 45

46 Εικόνα 1: Η χαρτογράφηση των καλλικρεϊνών στο χρωμόσωμα 19q13.4, καθώς και τα νουκλεϊνικά και αμινοξικά τους χαρακτηριστικά [185]. Αποτελούν το μεγαλύτερο, μέχρι σήμερα, διαδοχικό γονιδιακό σύμπλεγμα πρωτεασών τόσο μεταξύ των 18 γονιδίων πρωτεασών σερίνης, όσο και στο σύνολο των καταλυτικών τάξεων. Τα μέλη της οικογένειας μοιράζονται υψηλά ποσοστά ομοιότητας, τόσο σε νουκλεϊνικό όσο και αμινοξικό επίπεδο, με τις KLK2 και PSA/KLK να θεωρούνται ως τα περισσότερο συγγενικά μέλη της οικογένειας, εμφανίζοντας ποσοστό ομολογίας περίπου 8. Όλα τα μέλη της οικογένειας εμφανίζουν σημαντικές ομοιότητες σε γονιδιακό επίπεδο, αποτελούμενα από τον ίδιο αριθμό και παρόμοιο μήκος εξωνίων και την όμοια θέση των κωδικονίων της έναρξης, της λήξης και της καταλυτικής τριάδας των πρωτεασών. Η έκφρασή τους ελέγχεται, κυρίως στο επίπεδο της μεταγραφής, από τις στεροειδείς ορμόνες. Ανάλογες είναι και οι ομοιότητες των πρωτεϊνικών μορίων των καλλικρεϊνών, οι οποίες αρχικά συντίθενται ως ανενεργά ζυμογόνα, των οποίων η έκκριση και η ενεργοποίηση ρυθμίζεται από περαιτέρω πρωτεoλυτικές διαδικασίες. Επίσης, ιδιαίτερα συντηρημένη μεταξύ των καλλικρεϊνών είναι η θέση της καταλυτικής τους τριάδας 41His, 96Asp και 189Ser, των κατάλοιπων δηλαδή εκείνων του ενεργού κέντρου, μέσω των οποίων πραγματοποιείται ο ενζυμικός τους ρόλος [182,186,187]. 46

47 4.1 Ρόλος των ιστικών καλλικρεϊνών σε φυσιολογικές λειτουργίες του οργανισμού (εικόνα 2) Μέχρι σήμερα, έχουν αποδοθεί διάφορες βιολογικές λειτουργίες στη δράση των καλλικρεϊνών KLK1, KLK2, and KLK3. Η κύρια δραστηριότητα της KLK1 αποτελεί τη διάσπαση του κινινογόνου χαμηλού βάρους, με αποτέλεσμα την απελευθέρωση της καλλιδίνης η οποία, με τη σειρά της, ενώνεται με τους Β1 και Β υποδοχείς της, στα κύτταρα στόχους, και μεσολαβεί σε διάφορες βιολογικές διαδικασίες. Αυτές είναι η ρύθμιση της αρτηριακής πίεσης, η σύσπαση των λείων μυών, η χημειόταξη των ουδετερόφιλων κυττάρων και η πρόκληση πόνου, η διαπερατότητα των αγγείων, η ανάπτυξη των αγγειακών κυττάρων, η ηλεκτρολυτική ισορροπία, και η φλεγμονή [181,188]. Διάφοροι ρόλοι του συστήματος KLK1-κινίνης είναι η δημιουργία και η διατήρηση της αίματωσης στον πλακούντα μέσω αγγειοδιαστολής, η εμπόδιση της συνάθροισης των αιμοπεταλίων, ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός, και η εισβολή των ινοβλαστών σε διάφορα στάδια της κύησης [189,190]. Η KLK1 συμμετέχει και σε άλλες κυτταρικές και ιστικές λειτουργίες, όπως η επεξεργασία αυξητικών παραγόντων και πεπτιδικών ορμονών στην υπόφυση, το πάγκρεας, και σε άλλους ιστούς [181, ]. Στην ενεργό τους μορφή, οι KLK2 και KLK3 συμμετέχουν στην ρευστοποίηση του σπέρματος μετά την εκσπερμάτιση που είναι καθοριστική για την κινητικότητα των σπερματοζωαρίων, μέσω της υδρόλυσης τών αμινοξέων, των σπερματοδόχων κύστεων, και των σεμινογελίνη I και II, και φιμπρονεκτίνη [195,196]. Μέχρι σήμερα, οι φυσιολογικές λειτουργίες των λοιπών καλλικρεϊνών, KLK4- KLK15, δεν έχουν πλήρως αποσαφυνισθεί. Ωστόσο, έχουν προταθεί διάφορες πιθανές λειτουργίες, βάσει των σημείων της έκφρασης τους και/ή τη δράση τους. Ετσι, αρκετές από αυτές μπορεί να συμμετέχουν στην επεξεργασία πεπτιδικών ορμονών του παγκρέατος [ ]. Εξάλλου, η μετατροπή της προινσουλίνης στην ενεργό ινσουλίνη, από την KLK1 έχει ήδη αποδειχθεί [204]. Οι KLK5 [205] και KLK7 [206] φαίνεται ότι συμμετέχουν στη φυσιολογία του δέρματος, και ειδικά στη ομοιόσταση της επιδερμίδας. Επιπλέον, οι KLK6 και KLK8 φαίνεται ότι εμπλέκονται σε διάφορες λειτουργίες του κεντρικού νευρικού συστήματος, όπως η γένεση των συνάψεων και η ανάπτυξη των νευρώνων [207,208]. 47

48 Εικόνα 2: Σχηματική απεικόνιση της έκφρασης των ιστικών καλλικρεϊνών στους διάφορους ιστούς. Το έντονο μαύρο χρώμα υποδηλώνει την έντονη έκφραση [209]. 48

49 4.2 Ρόλος των ιστικών καλλικρεϊνών σε διάφορες παθήσεις Το σύστημα καλλικρείνης-κινίνης συμμετέχει σε πολλές παθολογικές διαδικασίες, όπως η φλεγμονή [187], η υπέρταση [210], οι νεφρικές παθήσεις [211,212], η παγκκρεατίτιδα [213], και ο καρκίνος [ ]. 4.3 Ρόλος των ιστικών καλλικρεϊνών στην καρκινική ανάπτυξη (Εικόνες 3,4,5,6) [185] Εικόνα 3: Ρόλος των καλλικρεϊνών στην ανάπτυξη και την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων Οι KLK1, KLK2 και PSA/KLK3, πιθανά, προάγουν την αύξηση και την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων αποδομώντας τις IGFBP2, 3, 4 και 5 (insulin-like growth factor binding proteins). Ετσι, απελευθερώνεται ο αυξητικός παράγοντας IGF1 (insulin-like growth factor 1), ο οποίος ενώνεται με τον υποδοχέα του στην κυτταρική μεμβράνη (IGF1R) προκαλώντας τον πολλαπλασιασμό και προλαμβάνοντας την απόπτωση των κυττάρων. Οι KLK2 και ΚLΚ, επίσης, ενεργοποιούν το σύστημα upa upar (urokinase plasminogen activator urokinase plasminogen activator receptor), οδηγώντας στην απελευθέρωση και/ή την ενεργοποίηση αυξητικών παραγόντων από την εξωκυττάρια ουσία (Extracellular Matrix/ECM). Οι καλλικρεΐνες μπορούν, ακόμη, να διεγείρουν άμεσα την ανάπτυξη των καρκινικών 49

50 κυττάρων, μέσω της πρωτεόλυσης και ενεργοποίησης των μεμβρανικών υποδοχέων PARs (protease-activated receptors). Ωστόσο, το PSA/KLK3 μπορεί, επίσης να καταστείλει την καρκινική ανάπτυξη απελευθερώνοντας τον αυξητικό παράγοντα TGFβ (transforming growth factor-β) από το ανενεργό του σύμπλεγμα, επιτρέποντας του έτσι να συνδεθεί με τον υποδοχέα του (TGFβR). Εικόνα 4: Ρόλος των καλλικρεϊνών στην αγγειογένεση Οι καλλικρεΐνες μπορούν να προωθήσουν την αγγειογένεση διασπώντας δομικά συστατικά της υποενδοθηλιακής βασικής μεμβράνης (BM) και της εξωκυττάριας ουσίας (ECM). Συμμετέχουν, επίσης, στην περι-κυτταρική πρωτεολυτική διαδικασία, ενεργοποιώντας το σύστημα upa-upar (οδηγώντας στην ενεργοποίηση της πλασμίνης) και των μεταλλοπρωτεϊνασών (MMPs) της εξωκυττάριας ουσίας. Ετσι, ευνοούν την αποδόμηση της, διευκολύνοντας την ενδοθηλιακή καρκινική διήθηση και επέκταση. Η KLK3 ενεργοποιεί τον αυξητικό παράγοντα TGFβ και η KLK1 απελευθερώνει τη βραδυκινίνη από το κινινογόνο, διεγείροντας την αγγειογενετική απάντηση μέσω ενός υποδοχεώς της βραδυκινίνης. Οι καλλικρεΐνες μπορεί, επίσης, να εμπλέκονται στήν σηματοδότηση (signalling) των υποδοχέων PAR προκαλώντας τον πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων. Ωστόσο, οι KLK3, KLK6 και KLK13 μπορεί, επίσης, να εμποδίζουν την αγγειογένεση δημιουργώντας θραύσματα, όμοια με την αγγειοστατίνη, από το πλασμινογόνο. 50

51 Εικόνα 5: Ρόλος των καλλικρεϊνών στην καρκινική διήθηση Η KLK3 δύναται, έμμεσα, να προάγει την αποδιαφοροποίηση των καρκινικών επιθηλαικών κυττάρων σε μεσεγχυματικού χαρακτήρα κύτταρα (epithelial-tomesenchymal transition - EMT) απελευθερώνοντας τον αυξητικό παράγοντα TGFβ από το ανενεργό του σύμπλεγμα. Επίσης, οι καλλικρεΐνες ελέγχουν την καρκινική διήθηση διαλύοντας τους φραγμούς της εξωκυττάριας ουσίας (ECM) είτε άμεσα πρωτεολύοντας την είτε έμεσα μέσω της ενεργοποίησης της πλασμίνης και των μεταλλοπρωτεϊνασών. Μπορούν επίσης, ενεργοποιώντας τη σηματοδότηση των υποδοχέων PAR, να διεγείρουν ή να αναστείλουν τη διήθηση των καρκινικών κυττάρων. 51

52 Εικόνα 6: Ρόλος των καλλικρεϊνών στη δημιουργία οστεοβλαστικών μεταστάσεων στον καρκίνο του προστάτη. Η KLK3, εμπλέκεται, πιθανά, στην επιλεκτική προσκόλληση των καρκινικών προστατικών κυττάρων στο ενδοθήλιο του νωτιαίου μυελού. Ο καρκίνος του προστάτη παράγει KLKs, TGFβ και IGF1, που διεγείρουν άμεσα την οστεοβλαστική δραστηριότητα και την μετέπειτα δημιουργία οστού. Η KLK3 ενεργοποιεί επίσης τον ανενεργό TGFβ, και απελευθερώνει τους IGFs από τους IGFBPs. 4.4 Οι ιστικες καλλικρεΐνες ως βιομοριακοί καρκινικοί δείκτες To PSA/KLK3 έχει εξελιχθεί, τα τελευταία χρόνια, στον πολυτιμότερο καρκινικό δείκτη και χρησιμοποιείται ευρέως στη διάγνωση, την παρακολούθηση, αλλά και τον πλυθησμιακό έλεγχο (screening) στον καρκίνο του προστάτη [194, ]. Η κλινική εφαρμογή της είχε τεράστιο αντίκτυπο στη διάγνωση του καρκίνου του προστάτη και ακόμη βρίσκεται σε εξέλιξη [224,225]. Τελευταία, οι εφαρμογή του PSA έχει επεκταθεί πέρα από τον καρκίνο του προστάτη και περιλαμβάνει τον καρκίνο του μαστού καθώς και άλλα είδη καρκίνων [ ]. Τα τελευταία επίσης έτη, η KLK2 εξελίσσεται ως ένας συμπληρωματικός δείκτης στον καρκίνο του μαστού και του προστάτη, και είναι πλέον σαφές ότι μπορεί να βοηθήσει στη βελτίωση της διάγνωσης και της διαφορικής διάγνωσης ιδιαίτερα στην γκρίζα ζώνη» του PSA [ ]. 52

53 Έχει ήδη αποδειχθεί ότι αρκετά από τα νέα γονίδια των καλλικρεϊνών υπερεκφράζονται ή υποεκφράζονται σε διάφορα νεοπλάσματα και ότι μπορούν να χρησιμεύσουν ως βιολογικοί δείκτες για την πρόγνωση και την έγκαιρη διάγνωση πολλών μορφών καρκίνου [ ,240,241]. Ως εκ τούτου, παρατηρείται μια έντονη ερευνητική δραστηριότητα για την εντόπιση εφαρμογών και άλλων μελών της γονιδιακής αυτής οικογένειας για την διάγνωση και παρακολούθηση διαφόρων μορφών καρκίνων αλλά και άλλων νοσημάτων. Εικόνα 7: Σχηματική απεικόνιση των καλλικρεϊνών στο χρωμόσωμα 19, και συνοπτική παρουσίαση της ενδεχόμενης χρήσης τους, ως βιομοριακούς δείκτες, στη διάγνωση (diagnosis), τον έλεγχο (monitoring), και την πρόγνωση (prognosis) διαφόρων μορφών καρκίνου [242] Ιστικές καλλικρεΐνες ως βιομοριακοί δείκτες του καρκίνου της κύστης Έχει παρατηρηθεί υπερέκφραση των KLK5, -6, -8, -9 στους καρκινικούς, σε σχέση με τους φυσιολογικούς ιστούς. Η in vitro απενεργοποίηση των KLK αντιγράφων (transcripts) χρισημοποιώντας μικρά παρεμβαλλόμενα τμήματα RNA εμποδίζει σημαντικά την καρκινική εισβολή των ιστών. Κατά την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης αντίστροφης μεταγραφής, 42 καρκινικά δείγματα ουροδόχου κύστης παρουσίασαν υπερέκφραση της KLK5, η οποία παρατηρήθηκε συχνά στους MIBC (14.3%, 6/42) σε σύγκριση με τους NMIBC (0%, 0/42; P =. ). Επιπλέον, τα επίπεδα έκφρασης mrna των KLK5, -6, -8 και -9 είναι υψηλότερα στους MIB σε σύγκριση με τους NMIBC (P < , P = , P = και P =

54 αντίστοιχα). Ως εκ τούτου, οι KLK5, -6, -8 και -9 παίζουν σημαντικό ρόλο στην προαγωγή της κυτταρικής διήθησης του καρκίνου της κύστης [243]. 4.5 Η καλλικρεΐνη 13 (KLK13 ή KLK-L4) ως καρκινικός δείκτης Υπάρχουν πολύ λίγα στοιχεία στη διεθνή βιβλιογραφία. Το γονιδιό KLK13 συγχαρτογραφείται μαζί με τα υπόλοιπα γονίδια της οικογένειας στην χρωμοσωμική περιοχή 19q13.3-q13.4, αποτελούμενο από πέντε κωδικά εξώνια και τέσσερα εσώνια. Εχει φανεί ότι αποτελεί ευνοϊκό προγνωστικό παράγοντα στον καρκίνο του μαστού, του όρχεως, των ωοθηκών, και του στομάχου, αλλά και δυσμενή προγνωστικό παράγοντα στον καρκίνο του πνεύμονος [ ]. Πιο συγκεκριμένα, υποεκφράζεται, σε επίπεδο mrna, σε καρκινικούς ιστούς αλλά και σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού. Η έκφραση της στην καρκινική κυτταρική σειρά BT-474, ελέγχεται από στεροειδικές ορμόνες [244]. Αύξηση της έκφρασης της KLK13 σχετίζεται με μείωση της πιθανότητας υποτροπής αλλά και της θνησιμότητας κατά 55 με 80% [245]. Πέντε ξεχωριστές ισομορφές της KLK13, προερχόμενες από διαφορετικά εναλλακτικά μετάγραφα του KLK13 γονιδίου, εκφράζονται μόνο στον ανθρώπινο όρχι και μπορούν να εντοπισθούν στο φυσιολογικό αλλά όχι στον καρκινικό ιστό. Επιπρόσθετα, έχει παρατηρηθεί διαφορά στην έκφραση του γονιδίου της KLK13 σε διαφορετικούς ιστολογικούς τύπους καρκίνου του όρχεως. Ωστόσο, η φυσιολογική σχέση των εναλλακτικών μεταγράφων αλλά και η κλινική επίπτωση της διαφοράς στην έκφρασή της, μεταξύ καρκινικών και φυσιολογικών ιστών, δεν έχει ακόμη διευκρυνισθεί [246]. Τέλος, έχει παρατηρηθεί υπερέκφραση της KLK13 στο μεταστατικό αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονος. Συγχρόνως, η μείωση της έκφρασης της οδηγεί σε σημαντική μειώση της μετανάστευσης αλλά της διηθητικότητας των καρκινικών κυττάρων. 54

55 Ακολούθως, η αύξηση της πρωτεϊνης της KLK13 ενισχύει την ικανότητα των καρκινικών κυττάρων στην αποδόμηση της εξωκυττάριας λαμινίνης (laminin) που, στη συνέχεια, διευκολύνει το μεταστατικό τους δυναμικό. Η KLK13 προκαλεί επίσης την έκφραση της N-cadherin προάγοντας έτσι την κινητικότητα των καρκινικών κυττάρων [248]. Ο διαγνωστικός και προγνωστικός της ρόλος στον καρκίνο της κύστης δεν έχει ακόμη μελετηθεί. 55

56 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟ 56

57 1. ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΣ 1.1 Βιολογικό υλικό Η συλλογή του βιολογικού υλικού της διατριβής πραγματοποιήθηκε, από το έως το 2011, στην Ά Πανεπιστημιακή Ουρολογική Κλινική του Λαϊκού Νοσοκομείου. Στη μελέτη συμμετείχαν 158 ασθενείς, 107 με NMIBC και 51 με MIBC. Οι ασθενείς αυτοί υπεβλήθησαν σε διουρηθρική εκτομή, για μη-μυοδιηθητικούς όγκους, και σε ριζική κυστεκτομή με πυελική λεμφαδενεκτομή, για τους διηθητικούς όγκους. Σε όλους ελήφθησαν ιστοτεμάχια κατά ζεύγη, τόσο από τον καρκινικό ιστό, όσο και από παρακείμενο μακροσκοπικά φυσιολογικό τοίχωμα της ουροδόχου κύστης, τα οποία και χρησιμοποιήθηκαν ως ομάδα ελέγχου. Όλα τα ιστοτεμάχια της δεύτερης ομάδας, αμέσως μετά την χειρουργική επέμβαση, χωρίζονταν σε δυο ιστοτεμαχίδια (mirrorimage sections). Το ένα εκ των δυο εξετάζονταν παθολογοανατομικά για να αποκλεισθεί η ύπαρξη CIS, που δεν ήταν ορατό δια γυμνού οφθαλμού, και να επιβεβαιωθεί με αυτόν τον τρόπο η καλοήθεια του ιστού. Το άλλο ιστοτεμαχίδιο καταψύχονταν αμέσως σε υγρό άζωτο και διατηρούνταν μέχρι την επεξεργασία του στους -80 o C. Τα καρκινικά ιστοτεμάχια καταψύχονταν με την ίδια διαδικασία. Η επεξεργασία των ιστοτεμαχιδίων και η περαιτέρω ανάλυση και αξιολόγηση τους ξεκινούσε μετά την ιστολογική επιβεβαίωση της φύσης τους. Στην μελέτη της KLK13 ως διαφοροδιαγνωστικού και προγνωστικού δείκτη στον καρκίνο του κύστης, έλαβαν μέρος επιτυχώς 96 από τους 1 ασθενείς με NMIBC και 41 από τους 51 ασθενείς με MIBC. Αποκλείστηκαν κάποια δείγματα λόγω ακαταλληλότητας, εξαιτίας κακής διατήρησης και επεξεργασίας. Επίσης, δεν συμπεριλήφθηκαν όσοι ασθενείς είχαν υποβληθεί, προεγχειρητικά, σε κάποια άλλη μορφή θεραπείας (ακτινοθεραπεία, χημειοθεραπία), αλλά και αυτοί που έπασχαν από κάποια άλλη μορφή καρκίνου που θα μπορούσε να επηρεάσει τα αποτελέσματα της μελέτης. Τέλος, δεν συμπεριλήφθηκαν όσοι δεν ανευρέθηκαν, δεν αποδέχτηκαν ή δε συμμορφώθηκαν πλήρως με την παρακολούθησή τους. Όλα τα καρκινικά δείγματα προέρχονταν απὀ πρωτοεμφανιζόμενους όγκους. Η μετεγχειρητική αντιμετώπιση και παρακολούθηση όλων των ασθενών έγινε σύμφωνα με τις αρχές των κατευθυντήριων οδηγιών της Ευρωπαϊκής Ουρολογικής Εταιρείας (EAU Guidelines). 57

58 Δημιουργήθηκε μια βάση δεδομένων για όλους τους ασθενείς που έλαβαν μέρος στη μελέτη και στην οποία περιλαμβάνονταν τα δημογραφικά στοιχεία των ασθενών, το πλήρες ιστορικό τους, τα ευρήματα της κλινικής εξέτασης, το κλινικό στάδιο της νόσου και τα ευρήματα της ιστολογικής έκθεσης του χειρουργικού παρασκευάσματος-παθολογοανατομικό στάδιο της νόσου. Επίσης, οι ασθενείς παρακολουθούνταν και καταγράφονταν η ύπαρξη και η χρονική εμφάνιση της τοπικής υποτροπής ή της μεταστατικής νόσου, η ενδεχόμενη συμπληρωματική θεραπεία που έλαβαν οι ασθενείς αυτοί, ο χρόνος έναρξης της, καθώς και η καταγραφή ενδεχόμενου θανάτου των ασθενών και η συσχέτιση η μή του θανάτου με τη νόσο. Οι ασθενείς, οι οποίοι έλαβαν μέρος στην ανάλυση της έκφρασης του γονιδίου, εμφάνισαν ηλικιακό εύρος έτη, με διάμεση ηλικία τα 71 έτη. Μεταξύ των ασθενών που έλαβαν μέρος στην ανάλυση έκφρασης, 45 ασθενείς εμφάμισαν στάδιο pτ1, 19 εμφάνισαν pτ, ενώ 12 και 10 εμφάνισαν στάδιο pτ & pτ αντίστοιχα. Σχετικά με το βαθό διαφοροποίησης, 18 ασθενείς εμφάνισαν Grade 1, 56 σθενείς Grade 2 και 63 ασθενείς Grade 3 κατά WHO 1973, ενώ κατά WHO 2004, ως χαμηλού (low) και υψηλού (high) βαθμού κακοήθειας χαρακτηρίστηκαν 62 και 75 ασθενείς αντίστοιχα. 1.2 Απομόνωση RNA Η απομόνωση του ολικού RNA του υπό εξέταση δείγματος και η μετέπειτα ανάλυση τους είναι απαραίτητη για τη μελέτη της γονιδιακής έκφρασης. Τα μόρια RNA δεν προστατεύονται όπως το DNA από τη σταθερή διαμόρφωση της διπλής έλικας, ενώ παράλληλα υφίστανται αλκαλική υδρόλυση εξαιτίας της - υδροξυλικής ομάδας της ριβόζης. Ως εκ τούτου, είναι, γενικά, λιγότερο σταθερά από το DNA. Επιπλέον, τόσο το DNA, όσο και το RNA, πέπτονται ενζυμικά από ειδικές DNA και RNA νουκλεάσες (DNάσες και RΝάσες, αντίστοιχα). Οι RΝάσες συναντώνται παντού δυσκολεύοντας ακόμη περισσότερο την εργασία με τα μόρια RNA. Ως αποτέλεσμα, το RNA πρέπει να διατηρείται σε πολύ χαμηλές θερμοκρασίες, να ελαχιστοποιούνται οι κύκλοι παγώματος και ξεπαγώματος του, και να αποφευχθεί η μόλυνσή του με RΝάσες, τόσο από τα χρησιμοποιούμενα υλικά και αντιδραστήρια, όσο και από τον χώρο εργασίας και τον ίδιο τον ερευνητή. 58

59 Η απομόνωση του ολικού RNA τόσο των καρκινικών ιστών όσο και των φυσιολογικών δειγμάτων του τοιχώματος της ουροδόχου κύστης, επιτεύχθηκε με τη σύνθλιψη του σε κονιορποιητή (BioPulverizer, BioSpec Inc) και την ομογενοποίηση του σε διάλυμα TRI Reagent (Ambion). Η ομογενοποίηση του ιστού οδηγεί στη διάσπαση των κυτταρικών μεμβρανών και την απελευθέρωση του κυτταρικού περιεχομένου στο διάλυμα. Το TRI Reagent είναι ένα εμπορικά διαθέσιμο διάλυμα, το οποίο προστατεύει το RNA εκτός των κυττάρων και επιτρέπει την εκχύλισή του με την μέθοδο Chomczynski. Σύμφωνα με αυτή, μείγμα φαινόλης-ισοθειοκυανικής γουανιδίνης προκαλεί τη λύση των κυττάρων, την αποδιάταξη των ανώτερων πρωτεϊνικών δομών και την προστασία του RNA από τις κυτταρικές RNάσες, καθώς και αυτές του περιβάλλοντος της εκχύλισης. Για την απομόνωση του ολικού RNA των κυτταρικών σειρών που χρησιμoποιήθηκαν στην παρούσα έρευνα, αποφεύγεται, κατά την ομογενοποίηση, το στάδιο της σύνθλιψης στον κονιορποιητή. Αντίθετα, τα κύτταρα που συλλέγονται από την καλλιέργεια, μεταφέρονται απ ευθείας σε διάλυμα TRI Reagent για την ομογενοποίησή τους Ομογενοποίηση ιστών Απαιτούμενα Υλικά Υγρό Άζωτο TRI Reagent (Ambion) Κονιορποιητής (BioPulverizer, BioSpec Inc.) Μέθοδος Ο κονιορποιητής παγώνει σε υγρό άζωτο. Ζυγίζονται mg ιστού και τοποθετούνται επίσης στο υγρό άζωτο. Ο ιστός συνθλίβεται από τον κονιορποιητή και στη συνέχεια γίνεται μεταφορά του δείγματος σε αποστειρωμένο φιαλίδιο τύπου Eppendorf (tubes) στο οποίο έχει προστεθεί 1 ml TRI Reagent/100 mg ιστού (σύμφωνα με το προτεινόμενο πρωτόκολλο της εταιρείας). Ακολούθως, πραγματοποιείται περαιτέρω ομογενοποίηση του δείγματος με την βοήθεια πιπεταρίσματος του. Το ομογενοποιημένο, πλέον, δείγμα παραμένει σε ηρεμία, σε θερμοκρασία δωματίου, για 5 min. Τέλος, το δείγμα φυλάσσεται στους -80 ο C μέχρι την εκχύλιση του RNA. Η φύλαξη του δείγματος στους -80 o C δεν είναι απαραίτητη, 59

60 αν, αμέσως μετά το πέρας των 5 min, ακολουθήσει η απομόνωση του RNA του δείγματος Εκχύλιση του ολικού RNA Απαιτούμενα Υλικά Χλωροφόρμιο (Lab-Scan) Ισοπροπανόλη (Pancreac) Αιθανόλη 75% v/v (Merck) RNA storage solution (Ambion) Μέθοδος Αρχικά, γίνεται απόψυξη του ομογενοποιημένου δείγματος (ιστός ή κύτταρα) και ακολουθεί η προσθήκη μ χλωροφόρμιου/ I και πολύ καλή ανάμειξη του μείγματος. Το μείγμα παραμένει σε ηρεμία, και σε θερμοκρασία δωματίου, για 10 min. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στις rpm, για 15 min, στους 4 o C, με τη βοήθεια της οποίας το μείγμα χωρίζεται σε τρεις φάσεις. Μια ανώτερη υδατική φάση όπου βρίσκεται διαλυμένο το RNA, μια κατώτερη οργανική φάση όπου περιέχει τις πρωτεΐνες και μία μεσόφαση που σχηματίζεται από το DNA. Η ανώτερη φάση συλλέγεται σε καθαρό tube και προστίθεται 500 μl ισοπροπανόλης/ ml TRI Reagent. Ακολουθεί vortex του μείγματος για 5-10 sec το οποίο παραμένει σε ηρεμία, σε θερμοκρασία δωματίου, για 10 min. Στη συνέχεια, πραγματοποιείται φυγοκέντρηση στις rpm για 10 min στους 4 o C, με τη βοήθεια της οποίας επιτυγχάνεται κατακρήμνιση του ολικού RNA του ιστού. Απομακρύνεται το υπερκείμενο, με τη βοήθεια σύριγγας, για να προστεθεί στο ίζημα 1.0 ml διαλύματος αιθανόλης 75% v/v /ml TRI Reagent. Ακολουθεί, ξανά, σύντομο vortex και φυγοκέντρησή του στις rpm για 5 min στους 4 o C, έτσι ώστε να επιτευχεθεί κατακρήμνιση του ολικού RNA του ιστού. Ακολουθεί, εκ νέου, απομάκρυνση του υπερκειμένου με τη βοήθεια σύριγγας. Στη συνέχεια, το σχηματιζόμενο ίζημα αφήνεται να στεγνώσει σε θερμοκρασία δωματίου, για να ακολουθήσει η διαλυτοποίηση του σε κατάλληλη ποσότητα διαλύματος RNA storage solution (RNAss). Το διάλυμα αυτό προστατεύει το RNA από την δράση των RNασών και την ψύξη. Τέλος, το διάλυμα διατηρείται στους -80 o C. 60

61 1.2.3 Εκτίμηση της συγκέντρωσης του ολικού RNA Η εκτίμηση της απόδοσης της απομόνωσης του RNA από τα δείγματα βασίζεται στην ιδιότητα των νουκλεϊκών οξέων να απορροφούν μέγιστα την υπεριώδη ακτινοβολία στα 260nm. Η συγκέντρωση του διαλύματος ολικού RNA που προκύπτει από το πρωτόκολλο απομόνωσής του, υπολογίζεται φασματοφωτομετρικά με τη μέτρηση της απορρόφησης του στα 260nm σε φωτόμετρο Ultraspec III, Pharmacia, Biotech Μέθοδος Πραγματοποιείται αραίωση του ολικού RNA 1:200 σε DEPC-H 2 O. Το φωτόμετρο μηδενίζεται στα 260nm με τη χρήση ως τυφλού διαλύματος, DEPC-H 2 O. Ακολούθως, μετράται η απορρόφηση του αραιωμένου διαλύματος ολικού RNA στα 260nm και υπολογίζεται η συγκέντρωση του διαλύματος trna που προκύπτει από το πρωτόκολλο απομόνωσης, μέσω της σχέσεως (1 Α= 40 μg RNA/ml, παράγοντας διάλυσης = 200). A260 x 200 x 40 = μ / ή Α260 x 200 x 0,04 = μg trna / μl Εκτίμηση της ποιότητας του ολικού RNA Μπορεί να γίνει, τόσο φασματοφωτομετρικά, όσο και με ηλεκτροφόρησή του σε πήκτωμα αγαρόζης Φασματοφωτομετρική ανάλυση Κατά τη διάρκεια της, εκτιμάται η καθαρότητα του απομονωμένου ολικού RNA, με την βοήθεια του λόγου των απορροφήσεων του διαλύματος του στα 260nm και 280nm (A/A). Η απορρόφηση στα 260nm οφείλεται στις αζωτούχες βάσεις των νουκλεϊκών οξέων, ενώ τα αρωματικά αμινοξέα των πρωτεϊνών απορροφούν μέγιστα στα 280nm. Σύμφωνα με τις οδηγίες της εταιρείας παραγωγής του TRI Reagent (Ambion), με τη βοήθεια του οποίου γίνεται η ομογενοποίηση των δειγμάτων, οι ικανοποιητικοί λόγοι κυμαίνονται σε Τιμές μικρότερες του 1.6 υποδηλώνουν μεγάλη συγκέντρωση πρωτεϊνών στο διάλυμα του ολικού RNA, ενώ τιμές μεγαλύτερες του. υψηλή συγκέντρωση DNA. 61

62 Μέθ δ Πραγματοποιείται μέτρηση της απορρόφησης του διαλύματος ολικού RNA στα 260nm, όπως στην μέθοδο της εκτίμησης της απόδοσης του ολικού RNA. Ακολούθως το φωτόμετρο μηδενίζεται στα 280nm με τη χρήση ως τυφλού διαλύματος, DEPC- H 2 O. Πραγματοποιείται μέτρηση της απορρόφησης του αραιωμένου διαλύματος ολικού RNA στα 280nm και υπολογισμός του λόγου A/A Ηλεκτροφόρηση του διαλύματος RNA σε πήκτωμα αγαρόζης Κατά τη διάρκεια της, εκτιμάται η ακεραιότητα του RNA που απομονώθηκε μέσω της παρουσίας των 18S και 28S ριβοσωμικού RNA (rrna). Αφού κατακερματισθεί το RNA, η κατανομή των μεγεθών μετατοπίζεται σε μικρότερα τμήματα και η εμφάνιση των rrna μορίων μειώνεται/εξαφανίζεται. Αξίζει να σημειωθεί ότι η ηλεκτροφόρηση του διαλύματος RNA σε πήκτωμα αγαρόζης, για τον έλεγχο της ποιότητάς του, αποφεύγεται σε δείγματα τα οποία εμφανίζουν μικρή απόδοση απομόνωσης RNA για να επαρκέσει η ποσότητά του για τους σκοπούς της ανάλυσης. Α αι ύμ α λικ DEPC-H 2 O (Applichem) Αγαρόζη (Biotools) Ρυθμιστικό διάλυμα ΤΒΕ (1 ) Μ Tris (Merck) M Bορικό οξύ (Applichem) M EDTA (Applichem) Βρωμιούχο αιθίδιο (Biorad) Διάλυμα χρώσης: RNA loading dye solution (Fermentas) 95% formamide 0.025% SDS 0.025% bromophenol blue xylene cyanol FF 0.025% ethidium bromide 0.5mM EDTA Μέθ δ Πραγματοποιείται παρασκευή πηκτώματος αγαρόζης 1.5 % w/ σε ρυθμιστικό διάλυμα ΤΒΕ 1Χ (. 1 / βρωμιούχο αιθίδιο). Γίνεται μεταφορά του πηκτώματος στην συσκευή ηλεκτροφόρησης (, I ), η οποία προηγουμένως έχει πληρωθεί με ρυθμιστικό διάλυμα ΤΒΕ, Χ. Ακολουθεί προετοιμασία των μειγμάτων της ηλεκτροφόρησης και φόρτωση τους στο πήκτωμα. 62

63 Γίνεται ηλεκτροφόρηση, για 60 min, στα 50V. Το πήκτωμα μεταφέρεται από την συσκευή ηλεκτροφόρησης σε UV τράπεζα και φωτογραφίζεται με σύστημα Kodak Digital Science DC120 Zoom Digital Camera. 1.3 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης αντίστροφης μεταγραφής (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction / RT-PCR) Στη σύγχρονη βιολογία, η ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης είναι ιδιαίτερα σημαντική, όχι μόνο στην προσπάθεια κατανόησης της κυτταρικής και γονιδιακής λειτουργίας, αλλά και στη συμμετοχή της στις βιοτεχνολογικές εφαρμογές και την ιατρική διάγνωση. Ο ακριβής προσδιορισμός των mrna επιπέδων στα υπό ανάλυση δείγματα, αποτελεί απαραίτητη προϋπόθεση της ανάλυσης της γονιδιακής έκφρασης. Η ανάλυση κατά Northern, η in situ υβριδοποίηση κ.α. αποτελούσαν, παλαιότερα, συνήθεις προσεγγίσεις για το σκοπό αυτό. Ωστόσο, οι τεχνικές αυτές είναι, τις περισσότερες φορές, χρονοβόρες και χαρακτηρίζονται από τη μικρή τους ευαισθησία στην ανίχνευση μεταγράφων σε χαμηλά επίπεδα. Η εφαρμογή όμως της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction PCR), βελτίωσε σημαντικά την ευαισθησία της ανάλυσης της γονιδιακής έκφρασης, επιτέποντας, με αυτόν τον τρόπο, την ανίχνευση σπάνιων μεταγράφων. Η μέθοδος RT-PCR αποτελείται από δυο στάδια. Κατά τη διάρκεια του πρώτου πραγματοποιείται η αντίδραση της αντίστροφης μεταγραφής, στην οποία τα μόρια mrna χρησιμοποιούνται ως μήτρα για τη δημιουργία συμπληρωματικών μορίων DNA (complementary DNA/cDNA). Κατά τη διάρκεια του δευτέρου πραγματοποιείται η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης, κατά την οποία επιχειρείται επιλεκτική ενίσχυση των cdna μορίων στόχων Αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής (Reverse Transcriptase Reaction) Πραγματοποιείται με την βοήθεια της αντίστροφης μεταγραφάσης (reverse trascriptase), ένα ένζυμο που καταλύει την μεταγραφή των RNA ιών, δηλαδή τη μετατροπή του RNA γενετικού τους υλικού σε DNA, στο εσωτερικό του ξενιστικού κυττάρου. Η αντίστροφη μεταγραφάση αποτελεί μια RNA-εξαρτώμενη DNA πολυμεράση, που δημιουργεί συμπληρωματικά μόρια DNA (cdna), 63

64 χρησιμοποιώντας RNA μόρια ως μήτρα. Στόχος της αντίδρασης αντίστροφης μεταγραφής, είναι η δημιουργία, κατά την ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης, συμπληρωματικών αλυσίδων DNA (first-strand DNA), χρησιμοποιώντας ως μήτρα τον mrna πληθυσμό του δείγματος. Ο πληθυσμός αυτός προκύπτει από την έκφραση και την σωστή ωρίμανση των γονιδιακών μετάγραφων. Η χρήση των ολιγονουκλεοτιδίων δεοξυθυμίνης (oligo-dt), στην αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής, εκμεταλλεύεται την -polya ουρά των ευκαρυωτικών mrnas και υβριδοποιείται σ αυτή επιτρέποντας τη δημιουργία cdna μορίων από κάθε mrna μετάγραφο. Γνωρίζοντας ότι το polya RNA (mrna) αποτελεί το 1- του ολικού RNA των κυττάρων, η χρήση των oligodt έχει ως αποτέλεσμα τη μείωση της πολυπλοκότητας του παραγόμενου πληθυσμού cdna και τη βελτίωση της απόδοσης της αντίδρασης, κάτι πολύ σημαντικό για τον ακριβή έλεγχο σπάνιων μετάγραφων. Για τους σκοπούς της συγκεκριμένης μελέτης επιλέχθηκε, ελέγχθηκε και χρησιμοποιήθηκε η Moloney Murine Leukemia Virus (M-MuLV) Reverse Transcriptase RNase Η - (minus) (Finnzymes), η οποία συνθέτει μονόκλωνες συμπληρωματικές αλυσίδες DNA ξεκινώντας από ένα εκκινητήριο RNA μόριο. Η MMuLV-RT RNase H - καθαρίζεται από ένα στέλεχος βακτηρίου E. Coli στο οποίο έχει κλωνοποιηθεί το γονίδιο της αντίστροφης μεταγραφάσης του M-MuLV Απαιτούμενα Υλικά DEPC-HO (Applichem) Ολιγονουκλεοτίδια δεοξυθυμίνης (Oligo-dT) 100 pmol/μl Mίγμα δεοξυνουκλεοτιδίων 10 mm (dntps) (Bioron GmbH) 2.5 mm datps 2.5 mm dgtps 2.5 mm dctps 2.5 mm dttps Ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης 1 (1 Reaction buffer) (Finnzymes) 500mM Tris-HCl (ph 8.3 at 25 o C) 30mM MgCl 750mM KCl 100mM DTT Human Placental Ribonuclase Inhibitor 40 /μ (HT Biotechnology Limited) M- MuLV Reverse Transcriptase RNase H /μ (Finnzymes) 64

65 Μέθοδος Το πρωτόκολλο που ακολουθείται στην αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής αποτελείται από δυο στάδια που πραγματοποιούνται σε θερμικό κυκλοποιητή MultiGene II labnet Internatinal Inc. Στο πρώτο στάδιο λαμβάνει χώρα η αποδιάταξη ανώτερων δομών που πιθανώς να έχουν αναπτυχθεί στα RNA μετάγραφα των δειγμάτων. Το μείγμα της αντίδρασης αποτελείται από κατάλληλο όγκο διαλύματος ολικού RNA που να αντιστοιχεί σε 1. μg ολικού RNA, 1.00 μl από 1 μμ oligo-dt εκκινητή και συμπληρώνεται με DEPC-H 2 O μέχρις όγκου 12,5 μl. Το μίγμα της αντίδρασης επωάζεται σε θερμοκρασία 70 o C για 5 min και γρήγορη μεταφορά τους στους C, μετά το τέλος της επώασης. Ο υπολογισμός του όγκου του διαλύματος ολικού trna (V) που να αντιστοιχεί σε 1 μg ολικού RNA, δίνεται από τη σχέση: V (1.0 μg) = 1 μl / 8 x Α260 όπου: Α260 = απορρόφηση ολικού RNA στα 260nm με αραίωση 1/200 Πίνακας 8: Άλληλουχία και χαρακτηριστικά εκκινητή (oligo-dt) της RT αντίδρασης Αλληλου ία (5-3 ) Τm ( o C) Μήκος (nt) % GC MB (g/mol) oligo-dt ΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤ Στο δεύτερο στάδιο της αντίδρασης αντίστροφης μεταγραφής τα δείγματα επωάζονται στις κατάλληλες συνθήκες για το απαραίτητο χρονικό διάστημα, ώστε να πραγματοποιηθεί η υβριδοποίηση των oligo-dt μορίων με την -polya ουρά των mrna μετάγραφων και στη συνέχεια τη δράση της M-MuLV-RT για την δημιουργία των cdna μορίων. Μετά το τέλος του πρώτου σταδίου, στα δείγματα προστίθενται 50 U αντίστροφης μεταγραφάσης M-MuLV (Invitrogen), 10 U αναστολέα RNασών RNaseOUT (Invitrogen), 4 μl από 5X First-Strand Buffer ρυθμιστικού διαλύματος (250 mm Tris- HCl (ph 8.3), 375 mm KCl και 15 mm MgCl 2 ) (Invitrogen), 2 μl από 0,1 Μ DTT 65

66 (Invitrogen), 1,0 μl από 10 μμ μείγματος dntps (10 μμ από κάθε datp, dgtp, dctp και dttp) (Invitrogen) και κατάλληλος όγκος DEPC-H 2 O μέχρις όγκου 20 μl. Το μείγμα της αντίδρασης επωάζεται στους 37 o C για 60 min και στην συνέχεια τερματίζεται στους 70 o C για 15 min Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction / PCR) Η αντίδραση PCR εφαρμόζεται στη βασική έρευνα για τον χαρακτηρισμό, κλωνοποίηση και τον έλεγχο της έκφρασης των γονιδίων. Αποτελεί ιδιαίτερα χρήσιμο εργαλείο στη μοριακή διαγνωστική για την ταυτοποίηση παθογόνων μικροοργανισμών, μοριακών δεικτών των ασθενειών, μεταλλάξεων υπεύθυνων για τις κληρονομικές ασθένειες, την εγκληματολογία και την ιατροδικαστική. Χαρακτηρίζεται από εξαιρετική ευαισθησία και εξειδίκευση στην ενίσχυση των αλληλουχιών, καθώς και πολύ μεγάλη ταχύτητα και απλότητα κατά την πραγματοποίησή της. Η PCR αποτελεί μια μέθοδο επιλεκτικής ενίσχυσης αλληλουχιών DNA, in vitro, η ερχή μεθόδου της οποίας βασίζεται στο μηχανισμού της in vivo αντιγραφής του DNA. Η τελευταία αποτελεί μια ιδιαίτερα πολύπλοκη κυτταρική διαδικασία, που πραγματοποιείται με την βοήθεια πολλών και διαφορετικών μορίων. Ωστόσο in vitro, χρησιμοποιούνται μόνο τα βασικά συστατικά του πολύπλοκου αυτού μηχανισμού για την αντιγραφή μικρών τμημάτων DNA. Για το σκοπό αυτό, είναι απαραίτητη μια θερμοάντοχη DNA πολυμεράση, δεοξυνουκλεοτίδια (dntps), η αλληλουχία στόχος, και ένα ζεύγος εκκινητών (primers) της PCR αντίδρασης, συμπληρωματικά στις δυο αλυσίδες του DNA, στα άκρα της αλληλουχίας-στόχου του ενδιεφέροντος μας. Κατά το πρώτο στάδιο της αντίδρασης, γνωστό ως αποδιάταξη (denaturation), προκαλείται το σπάσιμο των δεσμών υδρογόνου μεταξύ των συμπληρωματικών ζευγαριών βάσεων των αλυσίδων του DNA. Αυτό είναι δυνατό με τη θέρμανση του μείγματος της αντίδρασης στους ο C. ς αποτέλεσμα, οι αλυσίδες της διπλής έλικας του DNA διαχωρίζονται. Στο επόμενο στάδιο της αντίδρασης πραγματοποιείται η υβριδοποίηση (annealing) των εκκινητών στην αλληλουχία-στόχο. Η θερμοκρασία επώασης του δείγματος 66

67 μειώνεται επιτρέποντας στους εκκινητές, να υβριδοποιηθούν ειδικά με τις συμπληρωματικές αλληλουχίες τους σε αυτή. Η θερμοκρασία του σταδίου αυτού ποικίλει ανάλογα με την αλληλουχία και το μήκος των εκκινητών. Το στάδιο αυτό είναι απολύτως καθοριστικό για την ειδικότητα της PCR, αφού οι εκκινητές αποτελούν τα απαραίτητα εναρκτήρια μόρια για την λειτουργία των DNA πολυμερασών. Τα ένζυμα αυτά, απαιτούν την ύπαρξη ενός πρωταρχικού τμήματος, που θα παρέχει ένα ελεύθερο -ΟΗ για την διαδοχική προσθήκη - δεοξυριβονουκλεοτιδίων. Έτσι, η μη ειδική υβριδοποίηση των εκκινητών στις αλυσίδες του DNA, θα προκαλέσει την ενίσχυση διαφορετικών τμημάτων από την αλληλουχία στόχο. Αφού ολοκληρωθεί η υβριδοποίηση των εκκινητών, η δράση της DNΑ πολυμεράσης δημιουργεί δυο συμπληρωματικές αλυσίδες DNA, οι οποίες φέρουν τους εκκινητές στο άκρο τους. Το στάδιο αυτό της προέκτασης (extension) πραγματοποιείται στους 72 ο C, που είναι η βέλτιστη θερμοκρασία της Τaq DNA πολυμεράσης, και για χρόνο ανάλογο με το μήκος της αλληλουχίας στόχου που επιχειρούμε να ενισχύσουμε (Ταχύτητα κοινών DNA πολυμερασών: 1 Kb/min). Οι κύκλοι της αντίδρασης PCR συνεχίζονται τυπικά μεταξύ αυτών των τριών θερμοκρασιών: o C, για την αποδιάταξη της αλληλουχίας στόχου, o C, η οποία επιτρέπει την ειδική υβριδοποίηση των εκκινητών στον στόχο, και 72 o C, κατάλληλη για τη δράση της πολυμεράσης. Ωστόσο, οι επαναλαμβανόμενοι αυτοί θερμοκρασιακοί κύκλοι έχουν ως αποτέλεσμα την εκθετική συσσώρευση της αλληλουχίας στόχου, η οποία θα αποτελείται από τους εκκινητές στο άκρο τους και όλες τις ενδιάμεσες αλληλουχίες. Στο τέλος κάθε κύκλου, και αν η απόδοση του είναι βέλτιστη, ο αριθμός των αλληλουχιών στόχων διπλασιάζεται (απόδοση=100%). Στην πράξη όμως, η απόδοση της αντίδρασης PCR, όπως και περισσότερες άλλες αντιδράσεις, κυμαίνεται μεταξύ , με αποτέλεσμα, συνήθως, να απαιτούνται περισσότεροι κύκλοι, συνήθως -, εξαρτώμενοι από την αρχική συγκέντρωση της αλληλουχίας στόχου. Οι εκκινητές υβριδοποιούνται σταθερά με το υπόστρωμα αφού συναντήσουν τις απόλυτα συμπληρωματικές τους αλληλουχίες. Έτσι επιτρέπεται η αλληλεπίδραση με το μόριο της θερμοάντοχης DNA πολυμεράσης και η επέκταση της αλληλουχίας 67

68 στόχου. Οι αρχικοί αυτοί κύκλοι, είναι ιδιαίτερα σημαντικοί για την ειδικότητα της αντίδρασης. Έτσι, αν στους αρχικούς κύκλους, οι λάθος υβριδοποιημένοι εκκινητές οδηγήσουν στην επέκταση μη ειδικών αλληλουχιών, αυτοί θα αποτελέσουν υποστρώματα στους επόμενους κύκλους επηρεάζοντας στο τέλος της αντίδρασης, τόσο την ποσότητα της αλληλουχίας στόχου, όσο και τα εξαγόμενα συμπεράσματα. Οι ενδιάμεσοι κύκλοι περιλαμβάνουν την εκθετική ενίσχυση, θεωρητικά τον διπλασιασμό ανά κύκλο, των περιοχών του υποστρώματος που ενισχύθηκαν» στους αρχικούς κύκλους. Όσο περνούν οι κύκλοι, η ανίχνευση την συμπληρωματικών αλληλουχιών των εκκινητών γίνεται ιδιαίτερα εύκολη, αφού συσσωρεύεται μεγάλος αριθμός αντιγράφων που φέρουν τις συμπληρωματικές αλληλουχίες των εκκινητών. Η ταχεία αυτή συσσώρευση του PCR προϊόντος θα συνεχιστεί μέχρι να επηρεαστεί η απόδοση της αντίδρασης και περάσει στην στατική φάση (plateau), η οποία είναι αποτέλεσμα της αλλαγής των σχετικών συγκεντρώσεων των συστατικών της αντίδρασης. 1.4 Ημιποσοτική RT-PCR (Semi-quantitative RT-PCR) Η κλασσική RT-PCR αντίδραση έχει την ικανότητα να ανιχνεύσει την παρουσία ή απουσία ενός μορίου-στόχου (αντίδραση τελικού σημείου), αλλά δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον ποσοτικό προσδιορισμό των επιπέδων της γονιδιακής έκφρασης. Ωστόσο, με κατάλληλο σχεδιασμό η RT-PCR αντίδραση μπορεί να επιτρέψει τον ημι-ποσοτικό προσδιορισμό των επιπέδων των μορίων-στόχων και την εκτίμηση των σχετικών διακυμάνσεων/διαφοροποιήσεων τους μεταξύ των υπό μελέτην δειγμάτων Ο συνηθέστερος τρόπος για την ημιποσοτική ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης με την βοήθεια της RT-PCR, είναι ο προσδιορισμός των προϊόντων της PCR αντίδρασης, κατά την διάρκεια της εκθετικής φάσης συσσώρευσης τους, πριν δηλαδή από την στατική φάση της αντίδρασης. Η προσέγγιση αυτή δεν μπορεί να προσδιορίσει απόλυτα το επίπεδο των μορίων-στόχων στο μείγμα της αντίδρασης, αλλά μπορεί να ανιχνεύσει διαφορές μεγαλύτερες των 1 φορών των mrna επιπέδων σε διαφορετικά δείγματα. Προϋπόθεση για την αξιοποίηση των συγκρίσεων αυτών, είναι μεταξύ των δειγμάτων να χρησιμοποιείται ο ίδιος συνδυασμός 68

69 εκκινητών και οι ίδιες συνθήκες της αντίδρασης, όπως και η χρήση εσωτερικού γονιδίου αναφοράς (housekeeping gene) Απαιτούμενα Υλικά DEPC-H 2 O(Applichem) Mείγμα δεοξυνουκλεοτιδίων 10 mm (dntps) (Bioron GmbH) Ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης ( Reaction buffer) (Promega) Διάλυμα ΜgCl 25mM(Promega) Ζεύγος πρόσθιου και ανάστροφου εκκινητή (Forward & Reverse Primer) GoTaq Flexi DNA polymerase 5 u/μl (Promega) Αντίδραση PCR για το γονίδιο της φωσφοριβοζυλοτρανσφεράσης 1 της υποξανθίνης, HPRT1 (hypoxanthine phosphoribosyl-transferase 1) Ο έλεγχος της επιτυχούς απομόνωσης του ολικού RNA των υπό μελέτη δειγμάτων και της επιτυχούς αντίστροφης μεταγραφής των poly(a) RNA σε cdna πραγματοποιήθηκε μέσω αντίδρασης PCR για ένα γονίδιο βασικής λειτουργίας (housekeeping gene). Τα γονίδια βασικών λειτουργιών, αποτελούν τα πλέον διαδεδομένα γονίδια αναφοράς σε πειράματα ελέγχου της γονιδιακής έκφρασης. Τα γονίδια αυτά πληρούν συγκεκριμένα κριτήρια, για να μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως γονίδια αναφοράς στις αντιδράσεις PCR, εκ των οποίων το σημαντικότερο είναι η σταθερή έκφραση τους στα κύτταρα των διαφόρων ιστών. Γενικά, θεωρείται ότι τα γονίδια αυτά εκφράζονται σταθερά και έχουν παρόμοια επίπεδα mrna σε διάφορους τύπους κυττάρων. Στα πειράματά μας επιλέγεται ως γονίδιο αναφοράς αυτό της της φωσφοριβοζυλοτρανσφεράσης 1 της υποξανθίνης, HPRT1 (hypoxanthine phosphoribosyl-transferase 1) Για το σκοπό αυτό σχεδιάστηκε και συντέθηκε ένα ζεύγος PCR εκκινητών για την επιλεκτική ενίσχυση των cdna μορίων του HPRT1, ο σχεδιασμός των οποίων βασίστηκε στην δημοσιευμένη αλληλουχία των mrna μεταγράφων του HPRT1 γονιδίου. Οι αλληλουχίες και τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά των PCR εκκινητών 69

70 που χρησιμοποιήθηκαν στην PCR αντίδραση για το γονίδιο HPRT1 παρουσιάζονται στον ακόλουθο πίνακα. Πίνακας 9: Αλληλουχίες και ιδιότητες των real-time qpcr εκκινητών για το γονίδιο αναφοράς HPRT1 Όνομα Αλληλουχία ( ) Μήκος (bases) % GC Tm ( o C) HPRT1 F TGGAAAGGGTGTTTATTCCTCAT 23 39,1 57,73 HPRT1 R ATGTAATCCAGCAGGTCAGCAA 22 45,5 60,03 Προϊόν PCR (PCR amplicon) 151 Οι ανώτεροι εκκινητές του γονιδίου αναφοράς HPRT1 υβριδοποιούνται, ο μεν πρόσθιος εκκινητής HPRT1_F στο 2 ο εξώνιο και ο δε ανάστροφος εκκινητής HPRT1_R στο 3 ο εξώνιο του γονιδίου ενισχύοντας ένα τμήμα μήκους 151 bp. Ο σχεδιασμός του ζεύγους των εκκινητών σε διαφορετικά εξώνια δεν επιτρέπει την ενίσχυση γενωμικού DNA. Οι συγκεκριμένοι εκκινητές επιτρέπουν τον έλεγχο έκφρασης του μεταγράφου του γονιδίου HPRT1 (NM_ ) τα οποίο κωδικοποιεί την πλήρους μήκους HPRT1 πρωτεΐνη μήκους 218 αμινοξέων. Το μείγμα της αντίδρασης συμβατικής PCR για την ενίσχυση του γονιδίου αναφοράς HPRT1 αποτελείται από 10 μl από Χ Colorless GoTaq Flexi Buffer (Promega Corp., Madison, WI, USA), 1,0 μl από 10 μμ μείγματος dntps (10 μμ από κάθε datp, dgtp, dctp και dttp) (Invitrogen), 3,0 μl από 25 mm MgCl 2 (Promega), 0,5 μl από 100 μμ κάθε εκκινητή, 0,25 μl από 5U/μl GoTaq Flexi DNA πολυμεράση (Promega), 1,2 μl cdna και DEPC-H 2 O μέχρι τελικό όγκο 50 μl. Το θερμοκρασιακό πρωτόκολλο της αντίδρασης περιλαμβάνει ένα αρχικό στάδιο αποδιάταξης στους 95 o C για 2 min, το οποίο ακολουθείται από 40 κύκλους αποτελούμενοι από στάδιο αποδιάταξης στους 95 o C για 30 sec, στάδιο υβριδοποίησης στους 60 o C για 30 sec και στάδιο ενίσχυσης στους 72 o C για 1 min. Μετά το πέρας των 40 κύκλων, ακολουθεί στάδιο τελικής ενίσχυσης στους 72 ο C για 5 min. 70

71 1.4.3 Αντίδραση PCR για το γονίδιο της καλλικρεΐνης 13, KLK13 (kallikrein-related peptidase 13) Σχεδιάστηκε και συντέθηκε ζεύγος PCR εκκινητών για την επιλεκτική ενίσχυση των mrna μετάγραφων του KLK13 γονιδίου, ο σχεδιασμός των οποίων βασίστηκε στις δημοσιευμένες πληροφορίες για τη αλληλουχία των KLK13 mrna μεταγράφων. (NCBI Reference Sequences: NM_ , NM_ , NM_ ). Οι αλληλουχίες και τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά των PCR εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν στην PCR αντίδραση για το γονίδιο KLK13 παρουσιάζονται στον ακόλουθο πίνακα: Πίνακας 10: Αλληλουχίες και ιδιότητες των PCR εκκινητών για το γονίδιο KLK13 Όνομα Αλληλουχία ( ) Μήκος (bases) % GC Tm ( o C) α KLK13_F CAGCCCCCAGGTGAATTAC KLK13_R CAGGAGACGATGCCATACAGT Προϊόν PCR (PCR amplicon) 204 Ο πρόσθιος εκκινητής (KLK13_F) υβριδοποιείται στις θέσεις της NM καταγραφής, επικαλλύπτοντας το σημείο σύνδεσης (junction) των εξωνίων και του γονιδίου. Ο οπίσθιος εκκινητής (KLK13_R) υβριδοποιείται στις θέσεις της NM καταγραφής, στο εξώνιο του γονιδίου. Ο σχεδιασμός του ζεύγους των εκκινητών σε διαφορετικά εξώνια δεν επιτρέπει την ενίσχυση γενωμικού DNA. Οι συγκεκριμένοι εκκινητές επιτρέπουν τον έλεγχο έκφρασης του μεταγράφου του γονιδίου KLK13 (NM_ ) τα οποίο κωδικοποιεί την πλήρους μήκους KLK13 πρωτεΐνη 277 αμινοξέων. Το μείγμα της αντίδρασης συμβατικής PCR για την ενίσχυση του γονιδίου KLK13 αποτελείται από 10 μl από 5Χ Colorless GoTaq Flexi Buffer (Promega Corp., Madison, WI, USA), 1,0 μl από 10 μμ μείγματος dntps (10 μμ από κάθε datp, dgtp, dctp και dttp) (Invitrogen), 3,0 μl από 25 mm MgCl 2 (Promega), 0,5 μl από 100 μμ κάθε εκκινητή, 0,25 μl από 5U/μl GoTaq Flexi DNA πολυμεράση (Promega), 1,2 μl cdna και DEPC-H 2 O μέχρι τελικό όγκο 50 μl. Το 71

72 θερμοκρασιακό πρωτόκολλο της αντίδρασης περιλαμβάνει ένα αρχικό στάδιο αποδιάταξης στους 95 o C για 2 min, το οποίο ακολουθείται από 40 κύκλους αποτελούμενοι από στάδιο αποδιάταξης στους 95 o C για 30 sec, στάδιο υβριδοποίησης στους 60 o C για 30 sec και στάδιο ενίσχυσης στους 72 o C για 1 min. Μετά το πέρας των 40 κύκλων, ακολουθεί στάδιο τελικής ενίσχυσης στους 72 ο C για 5 min Ανίχνευση και ανάλυση των προϊόντων της συμβατικής RT-PCR αντίδρασης Για την ανίχνευση των νουκλεϊκών οξέων, χρησιμοποιούνται δυο προσεγγίσεις, η απορρόφηση της υπεριώδους ακτινοβολίας και η χρώση τους. Η πρώτη προσέγγιση εκμεταλλεύεται την ιδιότητα των νουκλεϊκών οξέων να απορροφούν μέγιστα στα 260 nm και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την μέτρηση των νουκλεϊκών οξέων ενός διαλύματος (βλ Προσδιορισμός συγκέντρωσης ολικού RNA). Ωστόσο, η χρήση φθοριζουσών χρωστικών για την ανίχνευση των νουκλεϊκών οξέων είναι 1-1. φορές πιο ευαίσθητη από τις μετρήσεις της απορρόφησης. Tο βρωμιούχο αιθίδιο (ethidium bromide) αποτελεί τη γνωστότερη χρωστική των νουκλεϊκών οξέων και είναι μια θετικά φορτισμένη χρωστική που παρεμβάλλεται μεταξύ των βάσεων του δίκλωνου DNA. Εντούτοις, και οι δυο αυτές τεχνικές ανίχνευσης δεν εμφανίζουν ειδικότητα ως προς την αλληλουχία του νουκλεϊκού οξέος. Για την διάκριση των νουκλεϊκών οξέων μεταξύ τους εφαρμόζεται ο ηλεκτροφορητικός διαχωρισμός, που επιτρέπει το φυσικό διαχωρισμό διαφορετικών μορίων νουκλεϊκών οξέων με βάση το μοριακό τους βάρος και το σχήμα τους Ανίχνευση και ανάλυση των προϊόντων της ημιποσοτικής RT-PCR (Semiquantitative RT-PCR) Η ανίχνευση των Ήροϊόντων της συμβατικής PCR αντίδρασης και ο ημιήοσοτικός Ήροσδιορισμός της γονιδιακής έκφρασης ΉραγματοΉοιείται με την ηλεκτροφόρηση Ήοσότητας των Ήροϊόντων σε Ήήκτωμα αγαρόζης Ήαρουσία βρωμιούχου αιθιδίου. 72

73 Για την ανίχνευση και τον ημιποσοτικό προσδιοριμσμό των προϊόντων της συμβατικής RT-PCR αντίδρασης που πραγματοποιήθηκε στα υπό εξέταση δείγματά μας, τόσο για το γονίδιο αναφοράς HPRT1, όσο και για το υπό έλεγχο γονίδιο της KLK13, χρησιμοποιήθηκε ο ηλεκτροφορητικός διαχωρισμός των προϊόντων της PCR αντίδρασης σε πήκτωμα αγαρόζης και χρώση με βρωμιούχο αιθίδιο. Ο ηλεκτροφορητικός διαχωρισμός αποτελεί την πιο συχνή και ταχεία μέθοδο για την ανάλυση των νουκλεϊκών οξέων. Τόσο το DNA, όσο και το RNA έχοντας αρνητικό φορτίο, μεταναστεύουν προς τη θετικά φορτισμένη άνοδο του ηλεκτρικού πεδίου της ηλεκτροφόρησης με τη βοήθεια κατάλληλων ρυθμιστικών διαλυμάτων. Ο διαχωρισμός διαφορετικών μορίων DNA βασίζεται στο μοριακό τους βάρος. Έτσι, τα μικρότερα μόρια ταξιδεύουν ταχύτερα ανάμεσα από τους ηθμούς του πολυμερούς της αγαρόζης σε σχέση με τα μεγαλύτερα. Συνηθέστερα, χρησιμοποιούνται πηκτές αγαρόζης συγκέντρωσης.8- οι οποίες περιέχουν 1 μg/ml βρωμιούχο αιθίδιο. Ένα διάλυμα χρώσης των δειγμάτων (loading dye), το οποίο να περιέχει γλυκερόλη και ένα μάρτυρα, όπως το μπλε της βρωμοφαινόλης (bromophenol blue), προστίθεται στον όγκο του δείγματος που θα ηλεκτροφορηθεί και επιτρέπει την φόρτωση του δείγματος στο πήκτωμα και την εμφάνιση του μετώπου της ηλεκτροφόρησης στο πήκτωμα. Με την ηλεκτροφόρηση στο ίδιο πήκτωμα ενός κατάλληλου δείκτη μοριακών βαρών, μπορούμε να υπολογίσουμε κατά προσέγγιση το μοριακό βάρος των προϊόντων που ενισχύονται στην PCR αντίδραση Απαιτούμενα Υλικά DEPC-H 2 O (Applichem) Αγαρόζη (Bioron GmbH) Ρυθμιστικό διάλυμα ΤΒΕ (89 Μ Τ s-hcl ph=8,3, 89 mm βορικό οξύ και 2,0 mm EDTA) Βρωμιούχο αιθίδιο (Applichem) Διάλυμα χρώσης: DNA loading dye solution 6Χ (10 mm Tris-HCl ph=7,6, 0,03% bromophenol blue, 0,03%, xylene cyanol FF, 60% glycerol, 60 mm EDTA) (Thermo Fisher Scientific Inc) Δείκτης μοριακών βαρών: GeneRuler 100 bp DNA Ladder (Fermentas) 73

74 Μέθοδος Αρχικά, πραγματοποιείται παρασκευή πηκτώματος αγαρόζης 1.5 % w/v σε ρυθμιστικό διάλυμα ΤΒΕ 1Χ, παρουσία βρωμιούχουαιθιδίου τελικής συγκέντρωσης 1 μ /. Στη συνέχεια το πήκτωμα μεταφέρεται στη συσκευή ηλεκτροφόρησης (Gel XL Ultra, Labnet international Inc) η οποία προηγουμένως έχει πληρωθεί με ρυθμιστικό διάλυμα ΤΒΕ, Χ. Ακολουθεί, προετοιμασία των μειγμάτων της ηλεκτροφόρησης α) των υπό εξέταση δειγμάτων (15.0 μl μίγματος της PCR αντίδρασης, 3.0 μl διαλύματος χρώσης 6Χ DNA loading dye) και β) του δείκτη μοριακών βαρών (4.0 μl DEPC-HO, 1.0 μl GeneRuler 100 bp DNA Ladder, 1.0 μl διαλύματος χρώσης 6Χ DNA loading dye). Ακολουθεί η φόρτωση των μειγμάτων ηλεκτροφόρησης στο πήκτωμα και η ηλεκτροφόρησή τους στα 120V για min. Στη συνέχεια πραγματοποιείται η μεταφορά του πηκτώματος από την συσκευή ηλεκτροφόρησης σε UV τράπεζα και φωτογράφηση του πηκτώματος αγαρόζης με σύστημα Kodak Digital Science DC120 Zoom Digital Camera Ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (Quantitative Real-Time PCR/qPCR) Η PCR αντίδραση πραγματικού χρόνου ( - ) στηρίζεται σε ιχνηθέτες/φθορισμογόνα οι οποίοι προσδένονται στο προϊόν της αντίδρασης και εκπέμπουν σήμα φθορισμού που ουσιαστικά αντανακλά την ποσότητα του σχηματιζόμενου προϊόντος. Όλη η αντίδραση χωρίζεται σε τέσσερις φάσεις. Η πρώτη φάση είναι γνωστή ως φάση υπόβαθρου ή ως φάση θορύβου (background phase), η οποία χαρακτηρίζεται από ένα ασθενές σήμα των πρώτων κύκλων της αντίδρασης, δίχως να υπάρχει η δυνατότητα να διακριθεί από το σήμα του υποβάθρου του συστήματος. Η δεύτερη φάση ονομάζεται εκθετική (exponential growth phase) ή λογαριθμική φάση (log phase) κατά την οποία συσσωρεύεται το προϊόν της αντίδρασης, κατά την οποία το σήμα ξεπερνά το σήμα του υπόβαθρου, και αρχίζει πλέον να αυξάνεται εκθετικά. Η απόδοση της αντίδρασης προσεγγίζει το 1, οδηγώντας έτσι στο διπλασιασμό του προϊόντος της αντίδρασης σε κάθε κύκλο. Η τρίτη φάση είναι η γραμμική φάση (linear phase) η οποία χαρακτηρίζεται από την ταχύτατη κατανάλωση των συστατικών της αντίδρασης. Η τέταρτη φάση είναι γνωστή και ως φάση κορεσμού (plateau) και οφείλεται στη σημαντική μείωση 74

75 κάποιου εκ των συστατικών της αντίδρασης, έχοντας ως αποτέλεσμα τη μετάβαση από την εκθετική στη γραμμική αύξηση. Στην PCR πραγματικού χρόνου οι καμπύλες ενίσχυσης της αντίδρασης, οι οποίες κατά την φάση του κορεσμού φτάνουν στο ίδιο επίπεδο φθορισμού, διαχωρίζονται κατά την λογαριθμική φάση της αντίδρασης, αντανακλώντας έτσι τη διαφορά της αρχικής συγκέντρωσης του υποστρώματος σε κάθε υπό έλεγχο δείγμα. Όπως είναι αναμενόμενο, όσα περισσότερα μόρια υποστρώματος περιέχει το αρχικό μείγμα της αντίδρασης, τόσο λιγότεροι κύκλοι απαιτούνται για την πρώτη ανίχνευση σήματος φθορισμού μεγαλύτερου από το σήμα του υπόβαθρου. Ο αριθμός των κύκλων που απαιτούνται για την ανίχνευση σήματος φθορισμού μεγαλύτερου από το σήμα του υπόβαθρου, είναι γνωστός ως Threshold cycle ή διαφορετικά C Τ. Ο αριθμός αυτός προσδιορίζεται από την αύξηση του φθορισμού του μείγματος της αντίδρασης πάνω από ένα συγκεκριμένο επίπεδο γνωστό ως Threshold. Εικόνα 8. Καμπύλη ενίσχυσης της αντίδρασης PCR σε πραγματικό χρόνο. Επισημαίνονται οι φάσεις της αντίδρασης (εκθετική φάση και στατική φάση), καθώς και το χρονικό σημείο της αντίδρασης όπου υπολογίζεται η τιμή C T του κάθε δείγματος. 75

76 1.6.1 Αντίδραση της ποσοτικής PCR πραγματικού χόνου Η αντίδραση της ποσοτικής PCR πραγματικού χρόνου πραγματοποιήθηκε σε θερμικό κυκλοποιητή ABI 7500 Real-Time PCR System και επιλέχθηκε ως ιχνηθέτης/φθορισμογόνο η SYBR Green I χρωστική Απαιτούμενα Υλικά α. DEPC-HO (Applichem) β. KAPA SYBR FAST qpcr Kit Master Mix Universal (Kapa Biosystems) Το KAPA SYBR FAST qpcr Kit Master Mix Universal (Kapa Biosystems) παρέχεται σε συγκέντρωση Χ, έχει βελτιστoποιηθεί για αντιδράσεις στις οποίες χρησιμοποιείται το σύστημα ανίχνευσης της SYBR Green I χρωστικής και περιέχει: Reporter dye (Χρωστική αναφοράς): SYBR Green I Dye Πολυμεράση: KAPA SYBR FAST DNA Polymerase Mείγμα δεοξυνουκλεοτιδίων (dntps) Passive reference (Παθητική χρωστική): ROX Βελτιστοποιημένο ρυθμιστικό διάλυμα γ. Ζεύγος ειδικών πρόσθιου και ανάστροφου εκκινητή (Forward & Reverse Primer) δ. Optical 96-Well Reaction Plate ε. Optical Adhesive Covers Αντίδραση ποσοτικής πραγματικού χρόνου για το γονίδιο της φωσφοριβοζυλοτρανσφεράσης 1 της υποξανθίνης, HPRT1 (hypoxanthine phosphoribosyl-transferase 1) Tο γονίδιο HPRT1 (hypoxanthine phosphoribosyl-transferase 1), το οποίο κωδικοποιεί το ένζυμο της φωσφοριβοζυλοτρανσφεράσης 1 της υποξανθίνης, χρησιμοποιήθηκε ως γονίδιο αναφοράς στις μελέτες γονιδιακής έκφρασης σε ιστούς ουροδόχου κύστεως. 76

77 Πίνακας 11: Αλληλουχίες και ιδιότητες των real-time qpcr εκκινητών για το γονίδιο αναφοράς HPRT1 Όνομα Αλληλουχία ( ) Μήκος (bases) % GC Tm ( o C) HPRT1 F TGGAAAGGGTGTTTATTCCTCAT 23 39,1 57,73 HPRT1 R ATGTAATCCAGCAGGTCAGCAA 22 45,5 60,03 Προϊόν PCR (PCR amplicon) 151 Οι ανώτεροι εκκινητές του γονιδίου αναφοράς HPRT1 υβριδοποιούνται, ο μεν πρόσθιος εκκινητής HPRT1_F στο 2 ο εξώνιο και ο δε ανάστροφος εκκινητής HPRT1_R στο 3 ο εξώνιο του γονιδίου ενισχύοντας ένα τμήμα μήκους 151 bp. Ο σχεδιασμός του ζεύγους των εκκινητών σε διαφορετικά εξώνια δεν επιτρέπει την ενίσχυση γενωμικού DNA. Οι συγκεκριμένοι εκκινητές επιτρέπουν τον έλεγχο έκφρασης του μεταγράφου του γονιδίου HPRT1 (NM_ ) τα οποίο κωδικοποιεί την πλήρους μήκους HPRT1 πρωτεΐνη μήκους 218 αμινοξέων. Το μείγμα της αντίδρασης qpcr για την ενίσχυση του γονιδίου αναφοράς HPRT1 αποτελείται από 5 μl από 2X KAPA SYBR FAST qpcr Kit Master Mix Universal (Kapa Biosystems), 50 nm από κάθε εκκινητή, 0,2 μl cdna και DEPC-H 2 O μέχρι τελικό όγκο 10 μl. Το θερμοκρασιακό πρωτόκολλο της αντίδρασης περιλαμβάνει ένα αρχικό στάδιο αποδιάταξης στους 95 o C για 3 min, το οποίο ακολουθείται από 40 κύκλους αποτελούμενοι από στάδιο αποδιάταξης στους 95 o C για 15 sec και το στάδιο υβριδοποίησης/ενίσχυσης στους 60 o C για 60 sec. Μετά το πέρας των 40 κύκλων, ακολουθεί η κατασκευή της καμπύλης τήξης (melting curve) των προϊόντων της qpcr αντίδρασης Αντίδραση ποσοτικής PCR πραγματικού χρόνου για το γονίδιο της καλλικρεΐνης 13, KLK13 (kallikrein-related peptidase 13) Οι αλληλουχίες και τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά των qpcr εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν στην qpcr αντίδραση για το γονίδιο KLK13 παρουσιάζονται στον ακόλουθο πίνακα: 77

78 Πίνακας 12: Αλληλουχίες και ιδιότητες των qpcr εκκινητών για το γονίδιο KLK13 Όνομα Αλληλουχία ( ) Μήκος (bases) % GC Tm ( o C) KLK13_F CAGCCCCCAGGTGAATTAC KLK13_R CAGGAGACGATGCCATACAGT Προϊόν PCR (PCR amplicon) Ο πρόσθιος εκκινητής (KLK13_F) υβριδοποιείται στις θέσεις της NM καταγραφής, επικαλλύπτοντας το σημείο σύνδεσης (junction) των εξωνίων και του γονιδίου. Ο οπίσθιος εκκινητής (KLK13_R) υβριδοποιείται στις θέσεις της NM_ καταγραφής, στο εξώνιο του γονιδίου. Ο σχεδιασμός του ζεύγους των εκκινητών σε διαφορετικά εξώνια δεν επιτρέπει την ενίσχυση γενωμικού DNA. Οι συγκεκριμένοι εκκινητές επιτρέπουν τον έλεγχο έκφρασης του μεταγράφου του γονιδίου KLK13 (NM_ ) τα οποίο κωδικοποιεί την πλήρους μήκους KLK13 πρωτεΐνη 277 αμινοξέων. Το μείγμα της αντίδρασης qpcr για την ενίσχυση του γονιδίου KLK11 αποτελείται από 5 μl από Χ KAPA SYBR FAST qpcr Kit Master Mix Universal (Kapa Biosystems), 100 nm από κάθε εκκινητή, 0,2 μl cdna και DEPC-H 2 O μέχρι τελικό όγκο 10 μl. Το θερμοκρασιακό πρωτόκολλο της αντίδρασης περιλαμβάνει ένα αρχικό στάδιο αποδιάταξης στους 95 o C για 3 min, το οποίο ακολουθείται από 40 κύκλους αποτελούμενοι από στάδιο αποδιάταξης στους 95 o C για 15 sec και το στάδιο υβριδοποίησης/ενίσχυσης στους 60 o C για 60 sec. Μετά το πέρας των 40 κύκλων, ακολουθεί η κατασκευή της καμπύλης τήξης (melting curve) των προϊόντων της qpcr αντίδρασης Ανίχνευση, ανάλυση και ποσοτικός προσδιορισμός των προϊόντων της ποσοτικής αντίδρασης PCR πραγματικού χρόνου (Quantitative Real-Time PCR) Μετά την ολοκλήρωση της real-time qpcr αντίδρασης, ακολουθεί ανάλυση της καμπύλης τήξης (melting curve analysis) των προϊόντων της αντίδρασης. Η SYBR Green I φθορισμογόνος χρωστική δεν εμφανίζει ειδικότητα για την αλληλουχία στόχο και μπορεί να προσδεθεί εκπέμποντας φθορισμό σε οποιοδήποτε δίκλωνο DNA (dsdna) μόριο που σχηματίζεται κατά την αντίδραση, όπως τα μη ειδικά προϊόντα 78

79 και τα διμερή των εκκινητών. Με την ανάλυση καμπύλης τήξης προσδιορίζεται η θερμοκρασία τήξης Tm των προϊόντων της αντίδρασης και παρέχεται η δυνατότητα διαπίστωσης του σχηματισμού διμερών εκκινητών και των μη ειδικών προϊόντων, αφού αυτά εμφανίζουν μικρότερο μήκος από την αλληλουχία στόχο και χαρακτηρίζονται από μικρότερη θερμοκρασία τήξης. Η ανάλυση της πορείας της αντίδρασης ολοκληρώνεται με τον προσδιορισμό του C T (Threshold cycle) κάθε αντίδρασης. Αυτό πραγματοποιείται με την βοήθεια του ειδικού λογισμικού προγράμματος Sequence Detection System 1... (SDS 1...), το οποίο παρέχεται από τον κατασκευαστή του οργάνου της PCR πραγματικού χρόνου, που παρέχει την δυνατότητα επιλογής του επιπέδου Threshold, τόσο αυτόματα με την βοήθεια ειδικών αλγόριθμων του λογισμικού, όσο και από τον ίδιο τον ερευνητή. Για τους στόχους της συγκεκριμένης έρευνας, πραγματοποιήθηκε σχετικός ποσοτικός προσδιορισμός των επιπέδων έκφρασης του KLK13 γονιδίου στόχου, με την εφαρμογή της μεθόδου 2 -ΔΔCT ή μέθοδο σύγκρισης των C T (ΔΔC T ) (Comparative C T method). H Τ καρκινική κυτταρική σειρά ουροδόχου κύστεως χρησιμοποιήθηκε ως βαθμονομητής, ενώ το HPRT1 ως γονίδιο αναφοράς για την κανονικοποίηση των επιπέδων έκφρασης του KLK13 γονιδίου. Oι μονάδες σχετικής ποσοτικοποίησης (RQ units) των επιπέδων έκφρασης του KLK13 σε αυθαίρετες μονάδες των υπό εξέταση δειγμάτων δίνονται από τον τύπο: RQ units, = 2 -ΔΔ, όπου ΔΔ : ΔΔ =Δ,δείγμ. - Δ,Τ = (CT KLK11 -CT HPRT1 ),δείγμ. - (CT KLK11 - CT HPRT1 ),Τ, 1.8. Στατιστική ανάλυση Ο έλεγχος της κανονικής κατανομής των επιπέδων έκφρασης του KLK13 γονιδίου πραγματοποιήθηκε με την χρήση των Sapiro-Wilk test και Normal Q-Q plots. Τα επίπεδα έκφρασης του KLK13 γονιδίου στόχου δεν παρουσιάζουν κανονική κατανομή και για το λόγο αυτό οι μη-παραμετρικές στατιστικές δοκιμασίες Wilcoxon singedrank test και Mann-Whitney U test χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση των διαφορών έκφρασης μεταξύ των όγκων της κύστης και του παρακείμενου 79

80 φυσιολογικού ιστού των ασθενών ή του φυσιολογικού ιστού των υγιών-δοτών, αντίστοιχα. Ο έλεγχος της διαφοροδιαγνωστικής ικανότητας του KLK13 μεταξύ των όγκων της κύστεως και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών των ασθενών ή των φυσιολογικών ιστών των μαρτύρων έλαβε χώρα μέσω ROC ανάλυσης και ανάλυσης λογιστικής παλινδρόμησης (logistic regression analysis). Τα δείγματα τα οποία δεν παρουσίασαν ανιχνεύσιμη έκφραση του γονιδίου της KLK13 έλαβαν μέρος στην ανάλυση αντιστοιχώντας τους έκφραση ίση με το υποδιπλάσιο αριθμό αντιγράφων του δείγματος με την μικρότερη ανιχνεύσιμη έκφραση. O έλεγχος της συσχέτισης των επιπέδων έκφρασης του KLK13 γονιδίου στόχου με τα κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά των ασθενών με καρκίνο της κύστης, συμπεριλαμβανομένου του σταδίου του όγκου (tumor stage), του βαθμού κακοήθειας του όγκου (tumor grade), της ομάδας κινδύνου των TaT1 ασθενών με βάση τα EORTC κριτήρια (EORTC-risk group), την υποτροπή κατά την πρώτη κυστεοσκόπηση κατά την παρακολούθηση (first follow-up cystoscopy/ffc) και το φύλο των ασθενών, πραγματοποιήθηκε μέσω των Mann-Whitney U test και Kruskal- Wallis test μη-παραμετρικές δοκιμασίες. Η ανάλυση επιβίωσης των ασθενών με καρκίνο της ουροδόχου κύστεως, για την αξιολόγηση της προγνωστικής αξίας της έκφρασης της KLK13 πραγματοποιήθηκε με την βοήθεια των καμπυλών επιβίωσης Kaplan-Meier και της ανάλυσης παλινδρόμησης κατά Cox (Cox proportional-hazard regression analysis). Πιο συγκεκριμένα, μελετήθηκε η ολική επιβίωση (overall survival/os) των ασθενών με μυοδιηθητικούς όγκους (Τ -Τ ), καθώς και η επιβίωση ελευθέρας υποτροπής (disease-free survival/dfs) και η επιβίωση ελευθέρας εξέλιξης (progression-free survival/pfs) των ασθενών με μη-μυοδιηθητικούς όγκους (Ta, T1). H ολική επιβίωση (ΟS) των ασθενών ορίζεται το χρονικό διάστημα ανάμεσα στην ριζική κυστεκτομή και τον θάνατο αυτών ή την ολοκλήρωση της μελέτης ή της παρακολούθησης για τους ασθενείς που είναι εν ζωή. Ως επιβίωση ελευθέρας υποτροπής (DFS) ή επιβίωση ελευθέρας εξέλιξης (PFS) ορίζεται το χρονικό διάστημα ανάμεσα στην διουριθρική εκτομή του όγκου και την υποτροπή ή εξέλιξη, αντίστοιχα, των ασθενών ή τον πιο πρόσφατο κλινικό έλεγχο των ασθενών που δεν ανέπτυξαν υποτροπή ή εξέλιξη, αντίστοιχα, μέχρι την ολοκλήρωση της μελέτης. 80

81 Η κατασκευή της καμπύλης Kaplan-Meier πραγματοποιήθηκε με την παράσταση της πιθανότητας επιβίωσης προς τον χρονικό διάστημα έπειτα της διουρηθρικής εκτομής των όγκων, ή της ριζικής κυστεκτομής. Η βέλτιστη τιμή λήψης απόφασης (cut-off value) για την κατηγοριοποίηση των ασθενών, ως προς τα επίπεδα έκφρασης του KLK13, σε KLK13-υψηλής έκφρασης ή KLK13(+) και KLK13-χαμηλής έκφρασης ή KLK13(-) προσδιορίστηκε με την χρήση του αλγορίθμου X-tile και ήταν ίση με την διάμεση έκφρασης (50 ο εκατοστημόριο) των TaT1 και των Τ -Τ ασθενών. Τέλος, ως προς την ανάλυση παλινδρόμησης κατά Cox, κατασκευάστηκαν μοντέλα μονομεταβλητής και πολυμεταβλητής ανάλυσης, για τον υπολογισμό του ο συντελεστή σχετικού κινδύνου (HR) τoy KLK13 και της ανεξάρτητης προγνωστικής αξίας αυτoύ σε σχέση με γνωστούς και κλινικά χρησιμοποιούμενους προγνωστικούς δείκτες. 81

82 2. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Πίνακας 9: Κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά των ασθενών Ηλικία Median Εύρος (min max) Μεταβλητή 71 (45 88) Αριθμός ασθενών (N=137) Νόσος Μη μυοδιηθητικός καρκίνος (NMIBC) Μυοδιηθητικός καρκίνος (MIBC) Καρκινικό στάδιο pta pt1 pt2 pt3 pt4 Grade (WHO 2004) Low High Grade (WHO 1973) Φύλο Male Female 96 (70.07%) 41 (29.93%) 51 (37.23%) 45 (32.85%) 19 (13.87%) 12 (8.76%) 10 (7.30%) 62 (45.26%) 75 (54.74%) 18 (13.14%) 56 (40.88%) 63 (45.99%) 120 (87.59%) 17 (12.41%) 82

83 2.1 Σύγκριση των αριθμών της έκφρασης της KLK13 στους καρκινικούς ιστούς σε σχέση με τους παρακείμενους φυσιολογικούς ιστούς (Εικόνες 7-10) Εικόνα 7: Αλλαγή της έκφρασης της KLK13 στους καρκινικούς ιστούς, σε σύγκριση με τους παρακείμενους φυσιολογικούς ιστούς σε όλους τους ασθενείς (Ν=107). Παρατηρείται αύξηση της έκφρασης της KLK13 στους 53 ασθενείς (47.7%) ενώ σε 41 ασθενείς (38.3%) παρατηρείται μείωση της έκφρασης και στους 15 ασθενείς (14.0%) δεν παρατηρείται μεταβολή στην έκφραση. Οι καρκίνοι που παρουσιάζουν αύξηση ειναι στατιστικά σημαντικά περισσότεροι από τους υπολοίπους (p=0.038). 83

84 Εικόνα 8: Αλλαγή της έκφρασης της KLK13 στους καρκινικούς ιστούς, σε σύγκριση με τους παρακείμενους φυσιολογικούς ιστούς στους ασθενείς με NMIBC (Ν=77). Παρατηρείται αύξηση της έκφρασης της KLK13 στους 35 ασθενείς (45.5%) ενώ σε 35 ασθενείς (45.5%) παρατηρείται μείωση της έκφρασης και στους 7 ασθενείς (9.0%) δεν παρατηρείται μεταβολή στην έκφραση. Η διαφορά εδώ δεν είναι στατιστικά σημαντική (p=0.185). 84

85 Εικόνα 9: Αλλαγή της έκφρασης της KLK13 στους καρκινικούς ιστούς, σε σύγκριση με τους παρακείμενους φυσιολογικούς ιστούς στους ασθενείς με MIBC (Ν=30). Παρατηρείται αύξηση της έκφρασης της KLK13 στους 16 ασθενείς (53.3%) ενώ σε 6 ασθενείς (20.0%) παρατηρείται μείωση της έκφρασης και στους 8 ασθενείς (26.7%) δεν παρατηρείται μεταβολή στην έκφραση. Οι καρκίνοι που παρουσιάζουν αύξηση ειναι στατιστικά σημαντικά περισσότεροι από τους υπολοίπους (p=0.042). 85

86 Εικόνα 10: Σύγκριση του βαθμού της έκφρασης της KLK13 μεταξύ των φυσιολογικών ιστών και των καρκινικών ιστών. Δεν προκύπτει σημαντική διαφορά τόσο μεταξύ φυσιολογικών ιστών και NMIBC και MIBC, όσο και συνολικά μεταξύ των φυσιολογικών και μη ιστών (p=0.352). 2.2 Βαθμοί έκφρασης της KLK13 στους καρκινικούς ιστούς αλλά και στους παρακείμενους φυσιολογικούς ιστούς, ανάλογα με το στάδιο της νόσου (Εικόνες 10,11) Εικόνα 11: Σύγκριση του βαθμού της έκφρασης της KLK13 μεταξύ των καρκινικών ιστών διαφορετικών σταδίων. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει η μειωμένη έκφραση των Τ1 όγκων, σε σύγκριση τόσο με τους Τa όγκους όσο και με 86

87 τους μυοδιηθητικούς όγκους (Τ -Τ ). Η διαφορά της έκφρασης είναι στατιστικά σημαντική (p=0.010). Αντιθέτως, η σύγκριση της έκφρασης της KLK13 μεταξύ των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών όγκων διαφορετικών σταδίων, δεν παρουσιάζει στατιστικά σημαντική διαφορά (p=0.464). 2.3 Βαθμοί έκφρασης της KLK13 στους καρκινικούς ιστούς, ανάλογα με το βαθμό διαφοροποίησης (grade), σε σχέση με τους παρακείμενους φυσιολογικούς ιστούς (Εικόνες 12-19) Εικόνα 12: Σύγκριση του βαθμού της έκφρασης της KLK13 μεταξύ των καρκινικών ιστών διαφορετικού grade (WHO 1973). Παρατηρείται στατιστικά σημαντική αύξηση (p=0.035) της έκφρασης της KLK13 στους λιγότερο επιθετικούς όγκους (grade 1), σε σχέση με τους περισσότερο επιθετικούς. Αντίθετα, δεν υπάρχει διαφορά της έκφρασης στους παρακείμενους ιστούς (p=0.342). Εικόνα 13: Σύγκριση του βαθμού της έκφρασης της KLK13 μεταξύ των καρκινικών ιστών διαφορετικού grade (WHO 2004). Παρατηρείται στατιστικά 87

88 σημαντική αύξηση (p=0.029) της έκφρασης της KLK13 στους λιγότερο επιθετικούς όγκους (low grade), σε σχέση με τους περισσότερο επιθετικούς. Και εδώ, δεν υπάρχει διαφορά της έκφρασης στους παρακείμενους ιστούς (p=0.561). Εικόνα 14: Σύγκριση του βαθμού της έκφρασης της KLK13 μεταξύ των καρκινικών ιστών διαφορετικού grade (WHO 1973), ειδικά για τους NMIBC. Παρατηρείται στατιστικά σημαντική αύξηση (p=0.010) της έκφρασης της KLK13 στους λιγότερο επιθετικούς όγκους (grade 1), σε σχέση με τους περισσότερο επιθετικούς. Αντίθετα, δεν υπάρχει στατιστικά σημαντική διαφορά της έκφρασης στους παρακείμενους ιστούς (p=0.191). Εικόνα 15: Σύγκριση του βαθμού της έκφρασης της KLK13 μεταξύ των καρκινικών ιστών διαφορετικού grade (WHO 2004), ειδικά για τους NMIBC. Και εδώ παρατηρείται στατιστικά σημαντική αύξηση (p=0.010) της έκφρασης της KLK13 στους λιγότερο επιθετικούς όγκους (low grade), σε σχέση με τους περισσότερο επιθετικούς. Δεν υπάρχει διαφορά της έκφρασης στους παρακείμενους ιστούς (p=0.086). 88

89 Εικόνα 16: Λεπτομερής σύγκριση του βαθμού της έκφρασης της KLK13 μεταξύ των καρκινικών ιστών διαφορετικού grade (WHO 2004), ειδικά για τους NMIBC. Παρατηρείται στατιστικά σημαντικά υψηλότερη έκφραση (p=0.006) της KLK13 στους ασθενείς χαμηλού grade, ανεξαρτήτως κλινικού σταδίου (Ta ή Τ1). Στους παρακείμενους φυσιολογικούς ιστούς δεν παρατηρείται στατιστικά σημαντική διαφορά (p=0.137). Εικόνα 17: Σ έση του βαθμού της έκφρασης της KLK13 των καρκινικών ιστών ασθενών με NMIBC με τα αποτελέσματα της πρώτης κυστεοσκόπησης στους 3 μήνες. Δεν φαίνεται να υπάρχει σχέση μεταξύ της έκφρασης της KLK13, στους καρκινικούς ιστούς (p=0.683) και στους παρακείμενους φυσιολογικούς ιστούς (p=0.183), με την υποτροπή των όγκων στους πρώτους 3 μήνες. 89

90 Εικόνα 18: Σ έση του βαθμού της έκφρασης της KLK13 των καρκινικών ιστών ασθενών με NMIBC με την υποτροπή και την εξέλιξη της νόσου. Δεν φαίνεται να υπάρχει σχέση μεταξύ της έκφρασης της KLK13, με την ελεύθερης νόσου επιβίωση και την ελεύθερη εξέλιξης επιβίωση (p>0.005). Εικόνα 19: Σ έση του βαθμού της έκφρασης της KLK13 των καρκινικών ιστών ασθενών με MIBC με τη συνολική επιβίωση και την εμφάνιση μεταστατικής νόσου. Δεν φαίνεται να υπάρχει σχέση μεταξύ της έκφρασης της KLK13, με τη συνολική επιβίωση (0 ή 1 έτος, p=0.621) αλλά και με την εμφάνιση λεμφαδενικών ή απομακρυσμένων μεταστάσεων (p=0.104). 90

91 2.4 Έκφραση της KLK13 και καμπύλες επιβίωσης των ασθενών (Εικόνες 20-25) Ασθενείς με NMIBC Εικόνα 20: Μελέτη της ελεύθερης νόσου επιβίωσης, σε 4 έτη παρακολούθησης, στους NMIBC (αριστερά) και ειδικά στους Τ1 NMIBC (δεξιά) σ ετικά με την έκφραση της KLK13. Στην πρώτη κατηγορία, 51 όγκοι δεν παρουσίασαν καμμία έκφραση και 34 παρουσίασαν υπερέκφραση της KLK13. Από τους KLK13(-), 18 όγκοι (35.29%) υποτροπίασαν ενώ από τους KLK13(+), 14 όγκοι (41.17%) υποτροπίασαν. Η διαφορά δεν είναι στατιστικά σημαντική (p=0.743). Ειδικά στους Τ1 NMIBC, 20 όγκοι δεν παρουσίασαν καμμία έκφραση και 20 παρουσίασαν υπερέκφραση της KLK13. Από τους KLK13(-), 7 όγκοι (35%) υποτροπίασαν ενώ από τους KLK13(+), 12 όγκοι (60%) υποτροπίασαν. Η διαφορά πλησιάζει τη στατιστική σημαντικότητα (p=0.087). Εικόνα 21: Μελέτη της ελεύθερης νόσου επιβίωσης, σε 4 έτη παρακολούθησης, στους high grade NMIBC (αριστερά) και ειδικά στους high grade Τ1 NMIBC 91

92 (δεξιά) σ ετικά με την έκφραση της KLK13. Στην πρώτη κατηγορία, 15 όγκοι δεν παρουσίασαν καμμία έκφραση και 15 παρουσίασαν υπερέκφραση της KLK13. Από τους KLK13(-), 5 όγκοι (33.33%) υποτροπίασαν ενώ από τους KLK13(+), 9 όγκοι (60%) υποτροπίασαν. Η διαφορά δεν είναι στατιστικά σημαντική (p=0.138). Ειδικά στους high grade Τ1 NMIBC, 12 όγκοι δεν παρουσίασαν καμμία έκφραση και 12 παρουσίασαν υπερέκφραση της KLK13. Από τους KLK13(-), 4 όγκοι (33.33%) υποτροπίασαν ενώ από τους KLK13(+), 8 όγκοι (66.66%) υποτροπίασαν. Η διαφορά πλησιάζει τη στατιστική σημαντικότητα (p=0.074). Εικόνα 22: Μελέτη της ελεύθερης εξέλιξης επιβίωσης, σε 4 έτη παρακολούθησης, στους NMIBC (αριστερά) και ειδικά στους Τ1 NMIBC (δεξιά) σ ετικά με την έκφραση της KLK13. Στην πρώτη κατηγορία, όπως προαναφέρθηκε, 51 όγκοι δεν παρουσίασαν καμμία έκφραση και 34 παρουσίασαν υπερέκφραση της KLK13. Από τους KLK13(-) 6 όγκοι (11.76%) και από τους KLK13(+), 9 όγκοι (26.47%) παρουσίασαν εξέλιξη της νόσου αντίστοιχα. Η διαφορά πλησιάζει τη στατιστική σημαντικότητα (p=0.088). Ειδικά στους Τ1 NMIBC, από τους KLK13(-), 3 στους 20 όγκους (15%) εξελίχθηκαν, ενώ από τους KLK13(+), 9 στους 20 όγκους (45%) εξελίχθηκαν σε μυοδιηθητικούς όγκους. Η διαφορά εδώ είναι στατιστικά σημαντική (p=0.042). 92

93 Εικόνα 23: Μελέτη της ελεύθερης εξέλιξης επιβίωσης, σε 4 έτη παρακολούθησης, στους high grade Τ1 NMIBC σ ετικά με την έκφραση της KLK13. Εδώ, όπως προαναφέρθηκε, 12 όγκοι δεν παρουσίασαν καμμία έκφραση και 12 παρουσίασαν υπερέκφραση της KLK13. Από τους KLK13(-), 2 όγκοι (16.66%) εξελίχθηκαν ενώ από τους KLK13(+), 7 όγκοι (58.33%) εξελίχθηκαν σε μυοδιηθητική νόσο. Η διαφορά, και εδώ, είναι στατιστικά σημαντική (p=0.043) Ασθενείς με MIBC Εικόνα 24: Μελέτη της ελεύθερης μεταστάσεων επιβίωσης, σε 4 έτη παρακολούθησης σ ετικά με την έκφραση της KLK13. Εδώ, 11 όγκοι δεν παρουσίασαν καμμία έκφραση και 22 παρουσίασαν υπερέκφραση της KLK13. Από τους KLK13(-), 2 ασθενείς (18.18%) και από τους KLK13(+), 13 ασθενείς (59.09%) παρουσίασαν μεταστατική νόσο μέχρι το τέλος της παρακολούθησης. Η διαφορά είναι στατιστικά σημαντική (p=0.025). 93