In vivo ΠΡΩΤΕΟΛΥΣΗ ΤΗΣ ΡΙΒΟΣΩΜΙΚΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ S5 ΣΕ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ In vivo ΠΡΩΤΕΟΛΥΣΗ ΤΗΣ ΡΙΒΟΣΩΜΙΚΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ S5 ΣΕ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΕΡΓΑΣΙΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗΣ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ ΤΣΙΤΟΥΡΟΥΔΗ ΦΑΝΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2010

2 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1 ΠΡΟΛΟΓΟΣ 2 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 2.1 ΓΕΝΙΚΑ ΓΙΑ ΤΟ ΡΙΒΟΣΩΜΑ 2.2 ΡΙΒΟΣΩΜΙΚΕΣ ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ 2.3 ΡΙΒΟΣΩΜΙΚΗ ΠΡΩΤΕΪΝΗ S5 (ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ) 2.4 ΑΠΟΙΚΟ ΟΜΗΣΗ ΡΙΒΟΣΩΜΙΚΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ 2.5 ΠΡΩΤΕΟΛΥΣΗ ΤΗΣ ΡΙΒΟΣΩΜΙΚΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ S5 2.6 ΕΝ ΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΕΝΤΟΠΙΣΗ ΤΗΣ rps5 2.7 ΕΝ ΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΤΗΣ rps5 2.8 ΓΕΝΙΚΑ ΓΙΑ ΤΟΥΣ ΙΝΟΒΛΑΣΤΕΣ 3 ΣΚΟΠΟΣ 4 ΥΛΙΚΑ ΜΕΘΟ ΟΙ 4.1 ΥΛΙΚΑ ΒΙΟΛΟΓΙΚΑ ΥΛΙΚΑ ΥΛΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΙΚΩΝ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΩΝ ΧΗΜΙΚΑ ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΑ ΕΝΖΥΜΑ ΚΑΙ ΥΛΙΚΑ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ 4.2 ΜΕΘΟ ΟΙ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΙΝΟΒΛΑΣΤΩΝ ΙΑΤΗΡΗΣΗ ΑΠΟΨΥΞΗ ΙΝΟΒΛΑΣΤΩΝ

3 4.2.3 ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΟΛΙΚΟΥ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΟΥ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΟΣ ΑΠΟ ΙΝΟΒΛΑΣΤΕΣ ΜΕ ΧΡΗΣΗ RIPA BUFFER ΥΠΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΚΛΑΣΜΑΤΩΣΗ ΤΩΝ ΙΝΟΒΛΑΣΤΩΝ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΣΕ ΠΗΚΤΕΣ ΠΟΛΥΑΚΡΥΛΑΜΙ ΙΟΥ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΚΑΤΩ ΑΠΟ ΜΕΤΟΥΣΙΩΤΙΚΕΣ (SDS- PAGE ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ) ΣΤΕΡΕΩΣΗ ΚΑΙ ΒΑΦΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΣΕ ΠΗΚΤΕΣ ΠΟΛΥΑΚΡΥΛΑΜΙ ΙΟΥ ΗΛΕΚΤΡΟΜΕΤΑΦΟΡΑ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΑΠΟ ΠΗΚΤΗ SDS ΣΕ ΜΕΜΒΡΑΝΗ ΑΝΟΣΟΑΝΙΧΝΕΥΣΗ 5 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 5.1 ΠΡΩΤΕΟΛΥΣΗ ΤΗΣ rps5 6 ΣΥΖΗΤΗΣΗ 6.1 ΠΡΩΤΕΟΛΥΣΗ ΤΗΣ rps5 7 ΠΕΡΙΛΗΨΗ 8 SUMMARY 9 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

4 1 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η συγκεκριµένη µεταπτυχιακή εργασία έχει ως αντικείµενο µελέτης την πρωτεόλυση µιας ριβοσωµικής πρωτεΐνης, συγκεκριµένα της rps5 των ευκαρωτικών κυττάρων. Τα τελευταία χρόνια έχει αναφερθεί συµµετοχή των ριβοσωµικών πρωτεϊνών σε διαδικασίες που δεν σχετίζονται µε τη µετάφραση αποκλειστικά, όπως η καρκινογένεση, η επιδιόρθωση του DNA και η φλεγµονή. Η πρωτεόλυση των ριβοσωµικών πρωτεϊνών µπορεί να σχετίζεται µε κάποια από αυτές τις εξωριβοσωµικές λειτουργίες των πρωτεϊνών αυτών και αποτελεί ενδιαφέρον αντικείµενο µελέτης. Τα τελευταία χρόνια έχουν βρεθεί πρωτεολυµένες µορφές της ριβοσωµικής πρωτεΐνης S5 και από προηγούµενη µελέτη του εργαστηρίου στο οποίο εκπονήθηκε η συγκεκριµένη εργασία, βρέθηκε ότι η πρωτεόλυση της rps5 σχετίζεται µε τις φάσεις ανάπτυξης των κυττάρων. Θεωρήθηκε αναγκαία η επιβεβαίωση αυτών των ευρηµάτων µε περαιτέρω πειράµατα, από τα οποία ένα µέρος πραγµατοποιήθηκε στα πλαίσια της συγκεκριµένης εργασίας. Η εργασία εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Βιοχηµείας του Τµήµατος Χηµείας της Σχολής των Θετικών Επιστηµών του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης µε επιβλέπουσα καθηγήτρια την κα. Χολή-Παπαδοπούλου Θεοδώρα. Θέλω να ευχαριστήσω την κα. ώρα που µε ξεχώρισε από τους υπόλοιπους φοιτητές του µεταπτυχιακού και µου έδωσε την ευκαιρία να εκπονήσω τη µεταπτυχιακή µου εργασία υπό την καθοδήγηση της. Επιπλέον θέλω να την ευχαριστήσω για τις πολύτιµες γνώσεις που µου µετέδωσε και για την κατανόηση και υποστήριξη της καθ όλη τη διάρκεια του µεταπτυχιακού. Είναι αξιοθαύµαστο το γεγονός ότι η κα. ώρα προσπάθησε να µου εξασφαλίσει και µία θέση υποψήφιου διδάκτορα στο εργαστήριο της µε χρηµατοδότηση και την ευχαριστώ πάρα πολύ γι αυτό. Ευχαριστώ τον καθηγητή κ. Κυριακίδη. που δέχτηκε να γίνει µέλος της τριµελής µου επιτροπής. Θα ήθελα να ευχαριστήσω την αναπληρώτρια καθηγήτρια κα. Νικολακάκη Ελένη που είναι µέλος της τριµελής µου επιτροπής, καθώς και τον κ. Γιαννακούρο Θωµά για τη καθοδήγηση και των δύο στις τεχνικές µοριακής βιολογίας και βιοχηµείας και για την προθυµία τους να µε βοηθήσουν σε ότι χρειαζόµουν.

5 Θέλω να ευχαριστήσω την διδάκτορα κα. Παπαχρήστου Ελένη, την διδάκτορα κα. Παπή Ρηγίνη, την υποψήφια διδάκτορα Μακρίνα ανιηλίδου, τη µεταπτυχιακή φοιτήτρια Μαρία Κουτρουµάνη και τον µεταπτυχιακό φοιτητή Κ. Ασηµίνα Αντώνη για τη πολύτιµη βοήθεια τους στις πειραµατικές διαδικασίες. Επιπλέον θέλω να ευχαριστήσω και το υπόλοιπο διοικητικό και ερευνητικό προσωπικό του Εργαστηρίου Βιοχηµείας για την συνεργασία και την όποια βοήθεια µου προσέφεραν. Τέλος, θα ήθελα να εκφράσω ένα µεγάλο ευχαριστώ στην οικογένεια µου και ιδιαίτερα στους γονείς µου, Θεοδώρα και Ηλία, που µε στήριξαν οικονοµικά και ψυχολογικά καθ όλη τη διάρκεια των σπουδών µου και που συνεχίζουν να µε στηρίζουν στις επιλογές που κάνω για την πραγµατοποίηση των ονείρων µου.

6 2 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 2.1 ΓΕΝΙΚΑ ΓΙΑ ΤΟ ΡΙΒΟΣΩΜΑ Το ριβόσωµα αποτελεί µια µεγάλη και πολύπλοκη δοµή, η οποία αποτελείται από 2/3 ριβοσωµικό RNA (rrna) και 1/3 ριβοσωµικές πρωτεΐνες. Εντοπίζεται στο κυτταρόπλασµα, στα µιτοχόνδρια των ευκαρυωτικών κυττάρων, όπως επίσης και στους χλωροπλάστες των φυτών και το µοριακό µέγεθος του κυµαίνεται από ~2,4 MDa (στα βακτήρια) έως και ~4 MDa (στα ευκαρυωτικά κύτταρα). Τα ώριµα ερυθροκύτταρα θηλαστικών αποτελούν την εξαίρεση, διότι δεν περιέχουν ριβοσώµατα. Στα ευκαρυωτικά κύτταρα και τα βακτήρια τα ριβοσώµατα λειτουργούν ως ριβοένζυµα, τα οποία καταλύουν τη σύνθεση των πρωτεϊνών, µετατρέποντας την πληροφορία που βρίσκεται στα νουκλεοτίδια του αγγελιοφόρου RNA (mrna) σε αµινοξέα νεοσυντιθέµενων πολυπεπτιδικών αλυσίδων. Στα βακτήρια ο ρυθµός πρωτεϊνοσύνθεσης είναι η ενσωµάτωση 20 αµινοξέων ανά δευτερόλεπτο στη νεοσυντιθέµενη αλυσίδα και στους ευκαρυωτικούς οργανισµούς 5-9 αµινοξέα ανά δευτερόλεπτο. Στην ενεργή του µορφή το ριβόσωµα αποτελείται από δύο υποµονάδες, οι οποίες διακρίνονται από τους διαφορετικούς συντελεστές καθίζησης. Ο καθορισµός της τρισδιάστατης δοµής των µεγάλων και µικρών υποµονάδων του το 2000, επιβεβαίωσε τις προγενέστερες ενδείξεις ότι το rrna, και όχι οι ριβοσωµικές πρωτεΐνες, είναι υπεύθυνο για την δοµή του ριβοσώµατος, για την τοποθέτηση των µεταφορικών RNAs( trnas) στο mrna, και για την καταλυτική του ικανότητα να σχηµατίζει οµοιοπολικούς πεπτιδικούς δεσµούς. Στο βακτήριο E.coli, το ριβόσωµα αποτελεί ένα ριβονουκλεοσωµατίδιο µε συντελεστή καθίζησης 70S, το οποίο διίσταται στην µεγάλη υποµονάδα L µε συντελεστή καθίζησης 50S και στην µικρή υποµονάδα S µε συντελεστή καθίζησης

7 30S. Και οι δύο υποµονάδες αποτελούνται από πρωτεΐνες, οι οποίες για την µεγάλη υποµονάδα συµβολίζονται µε το γράµµα L (L1 έως L34) και για την µικρή µε το γράµµα S ( S1 έως S21), καθώς και από rrna, το οποίο για τη µεγάλη υποµονάδα είναι το 23S και το 5S, ενώ για τη µικρή είναι το 16S. Οι πρωτεΐνες L7 και L12 δηµιουργούν τετραµερή, ενώ όλα τα υπόλοιπα συστατικά του ριβοσώµατος βρίσκονται σε ένα αντίγραφο. ΕΙΚΟΝΑ 2.1 : οµή του ριβοσώµατος από Escherichia coli (ανάλυση:3.5 angstroms). Φαίνονται οι υποµονάδες 50S και 30S, καθώς και οι θέσεις E, P, A της πρωτεϊνοσύνθεσης. (Πηγή: Το ριβόσωµα στα ευκαρυωτικά κύτταρα έχει σταθερά καθίζησης 80S και αποτελείται επίσης από δύο υποµονάδες, µε σταθερές καθίζησης 60S η µεγάλη και 40S η µικρή. Τα rrnas που βρίσκονται στην µικρή υποµονάδα είναι το 18S, ενώ στην µεγάλη είναι το 28S, το 5S και το 5,8S. Οι πρωτεϊνες που αποτελούν την µικρή υποµονάδα είναι περίπου 30 και αυτές της µεγάλης υποµονάδας περίπου 40. Η µικρή υποµονάδα έχει µια χαρακτηριστική µορφολογία, αποτελείται από µια κεφαλή (head), ένα σώµα (body) και µια πλατφόρµα (platform). Η µεγάλη υποµονάδα

8 από την άλλη, έχει τρία εξογκώµατα στην ανώτερη περιοχή µε πιο χαρακτηριστικό το κεντρικό εξόγκωµα (Wolfe, 1993). ΕΙΚΟΝΑ 2.2 : οµική σύγκριση των περιοχών κεφαλής (head), πλατφόρµας (platform) και σώµατος (body) της µικρής υποµονάδας και του 80S ριβοσώµατος της ζύµης. Η παρατηρούµενη διαφορά είναι µια όρθωση της κεφαλής ~10 Α της µικρής υποµονάδας σε σχέση µε την αντίστοιχη περιοχή του ριβοσώµατος εξαιτίας της έλλειψης µη οµοιοπολικών αλληλεπιδράσεων (Gilbert και συνεργάτες). Τα ριβοσώµατα που βρίσκονται στα ευκαρυωτικά κύτταρα διακρίνονται σε δύο τύπους : τα ελεύθερα και τα συνδεδεµένα ριβοσώµατα. Μεταξύ τους δεν υπάρχουν κάποιες δοµικές διαφορές, εναλλάσσονται και οι ριβοσωµικές υποµονάδες τους παραµένουν στο κυτταρόπλασµα, ώστε να µπορέσουν να χρησιµοποιηθούν ξανά για ένα καινούργιο κύκλο πρωτεϊνοσύνθεσης. Τα πολυσώµατα αποτελούν οµάδες δέκα ή περισσότερων ριβοσωµάτων, στα οποία γίνεται η µετάφραση του ίδιου µορίου mrna. Οι πρωτεΐνες που παράγονται κατα αυτόν τον τρόπο, κυρίως προορίζονται για εξωκύττωση, για τα λυσοσωµάτια και τη κυτταρική µεµβράνη. Αντίθετα µε τους ευκαρυωτικούς οργανισµούς, τα ριβοσώµατα στους προκαρυωτικούς βρίσκονται µόνο ελεύθερα στο κυτταρόπλασµα. Ο αυξηµένος αριθµός των ριβοσωµάτων και στους δύο τύπους κυττάρων, παρατηρείται κατά την

9 ωογένεση, την ανάπτυξη και γενικότερα όταν υπάρχει αυξηµένη ανάγκη των κυττάρων για τη σύνθεση µεγαλύτερων ποσοτήτων πρωτεϊνών. Στα ριβοσώµατα πραγµατοποιείται η διαδικασία της µετάφρασης, µε τη συµµετοχή του mrna, των trnas και διαφόρων παραγόντων έναρξης, επιµήκυνσης και τερµατισµού. Στην µικρή υποµονάδα βρίσκεται η θέση αποκωδικοποίησης, η οποία είναι η περιοχή αναγνώρισης των κωδικονίων του mrna από τα αντικωδικόνια του trna, στη βάση της ρωγµής που χωρίζει την κεφαλή από την πλατφόρµα. Οι θέσεις Α και P που βρίσκονται στην ευρύτερη περιοχή της πεπτιδυλοτρανσφεράσης µέχρι το σηµείο εξόδου της νεοσυντιθέµενης πολυπεπτιδικής αλυσίδας εντοπίζονται στη µεγάλη ριβοσωµική υποµονάδα ( Brandt et al., 2009). Στα προκαρυωτικά κύτταρα στην έναρξη σύνθεσης των πρωτεϊνών συµµετέχει η µικρή ριβοσωµατική υποµονάδα µε τη βοήθεια των τριών παραγόντων έναρξης IF1, IF2 και IF3. Μετά την εύρεση του κωδικονίου έναρξης AUG δεσµεύεται και η µεγάλη υποµονάδα. Στα ευκαρυωτικά κύτταρα, η έναρξη γίνεται αφού φορτωθεί η µικρή ριβοσωµική υποµονάδα µε το trna έναρξης (µεθειονίνη) και έπειτα συνδεθεί στο mrna µε τη βοήθεια των παραγόντων έναρξης eifs. Αφού συνδεθεί το σύµπλοκο στο κωδικόνιο έναρξης, προστίθεται και η µεγάλη υποµονάδα. Για την επιµήκυνση της πολυπεπτιδικής αλυσίδας χρησιµοποιούνται οι παράγοντες επιµήκυνσης EFs (προκαρυωτικά) και eεfs (ευκαρυωτικά) και για τη λήξη της πρωτεϊνοσύνθεσης οι παράγοντες λήξης RFs(προκαρυωτικά) και erfs(ευκαρυωτικά). Μετά την απελευθέρωση της πολυπεπτιδικής αλυσίδας το ριβόσωµα διίσταται και πάλι στις δύο υποµονάδες του. Τα ριβοσώµατα αυτοσυγκρατούνται στον πυρηνίσκο από rrna και πρωτεΐνες (όπως αναφέρθηκε προηγουµένως) και κατόπιν µετακινούνται στο κυτταρόπλασµα. Τα γονίδια που κωδικοποιούν για τα απαραίτητα µόρια rrnas (18S, 28S και 5,8S) που συµµετέχουν στη συγκρότηση βρίσκονται στον οργανωτή του πυρηνίσκου και του 5S rrna βρίσκεται σε άλλα σηµεία του γενώµατος και κατόπιν εισέρχεται στον πυρηνίσκο. Οι ριβοσωµικές πρωτεΐνες συντίθενται από την πρωτεϊνοσυνθετική µηχανή του κυτταροπλάσµατος και κατόπιν εισέρχονται στον πυρήνα. Η είσοδος τους στον πυρήνα επιτυγχάνεται µε τη βοήθεια ειδικής αλληλουχίας αµινοξέων (gly-arglys-lys-arg-arg-glu-arg-arg-arg). Η συγκρότηση του ριβοσώµατος αρχίζει µόλις

10 συγκεντρωθούν όλα τα δοµικά στοιχεία του στον πυρηνίσκο και ολοκληρώνεται στο κυτταρόπλασµα. Οι πυρηνίσκοι δεν σχηµατίζονται τυχαία, αλλά δηµιουργούνται γύρω από ειδικούς γενετικούς τόπους που ονοµάζονται οργανωτές πυρηνίσκου (NORs-Nuclear Organizing Regions), γι αυτό και χαρακτηρίζονται ως «γενετικά καθορισµένα στοιχεία». Η περιοχή οργανωτή NOR αποτελείται από πολλαπλές επαναλήψεις των γονιδίων που κωδικοποιούν για τα rrnas. Μορφολογικά διακρίνονται τρεις περιοχές στον πυρηνίσκο µε το ηλεκτρονικό µικροσκόπιο. Αυτές είναι οι εξής : 1) Ινώδες κέντρο (Fibrillar Center - FC) : Βάφεται ασθενώς από χρώση µε βαρέα µέταλλα, αποτελείται από ινίδια, σ αυτό εντοπίζεται η RNA πολυµεράση Ι και αποτελεί το 1-2% του ολικού όγκου του πυρηνίσκου. 2) Πυκνό ινώδες κέντρο (Dense Fibrillar Center - DFC) : Περιβάλλει το ινώδες κέντρο, αποτελείται από πυκνά «πακεταρισµένα» ινίδια, βάφεται εντονότερα µε κάποιες χρωστικές και αποτελεί ένα µεγαλύτερο κοµµάτι του πυρηνίσκου (>17%). 3) Κοκκιώδης περιοχή (Granular Region GR) : Περιβάλλει και το ινώδες κέντρο αλλά και το πυκνό ινώδες κέντρο, αποτελείται από κοκκία και αποτελεί το µεγαλύτερο κοµµάτι του πυρηνίσκου ( ~75%). ΕΙΚΟΝΑ 2.3 : Απεικόνιση των περιοχών του πυρηνίσκου, FC(*), DFC ( ) και GC (G). ( Πηγή : review-springerlink springer-verla /s ).

11 Στη βιογένεση του ριβοσώµατος είναι απαραίτητες τρεις RNA πολυµεράσες (pol Ι, ΙΙ, ΙΙΙ) οι οποίες δρουν µε συντονισµένο τρόπο. Αρχικά τα γονίδια των rrnas µεταγράφονται σαν µία ενιαία µονάδα από την RNA pol I και γι αυτή τη διαδικασία είναι απαραίτητοι πολλοί συσχετιζόµενοι µε την RNA pol I παράγοντες και rdna ειδικοί συνδεόµενοι παράγοντες. Το αρχικό µόριο που προκύπτει είναι ένα µόριο prerrna (45S), το οποίο µε περαιτέρω επεξεργασία, η οποία περιλαµβάνει τη µεθυλίωση και την δραστικότητα ενδο- και εξω-νουκλεασών, δίνει τα απαιτούµενα 18S, 5,8S και 28S RNA µόρια. Στην ωρίµανση του rrna συµµετέχει και µία τάξη µικρών πυρηνικών RNAs, τα λεγόµενα snornas, τα οποία βρίσκονται σε σύµπλοκα µε πρωτεΐνες και υπάρχουν ως µικρά πυρηνικά ριβονουκλεοπρωτεϊνικά σωµατίδια (snornps ). Ένας µικρός αριθµός πρωτεϊνών έχει βρεθεί ότι παίζει ρόλο στα αρχικά όσο και στα τελικά στάδια της ωρίµανσης των ριβοσωµάτων. Έχει βρεθεί ότι στο αρχικό προριβόσωµα 90S υπάρχουν οι παράγοντες για τη σύνθεση του 40S, αλλά απουσιάζουν αυτοί για τη σύνθεση του 60S (Grandi, Rybin et al., 2002). H πρωτεΐνη που παίζει το ρόλο της γέφυρας µεταξύ του 90S και του 40S είναι η Enp1p. Η πρωτεΐνη Rio2, η οποία είναι κινάση σερίνης-θρεονίνης, δεσµεύεται στο 40S, ενώ δεν έχει βρεθεί στο πρόδροµο σωµατίδιο 90S (Schafer, et al. 2003). Με τη συγκρότηση της 40S υποµονάδας, συσχετίζεται ο παράγοντας Rrp7p, όπως επίσης και η πρωτεΐνη Nob1 που θεωρείται µάρτυρας της κυτταροπλασµατικής εντόπισης της 40S, χωρίς να είναι γνωστός ο ακριβής της ρόλος ( Tschochner and Hurt, 2003). Η πρωτεΐνη Hrr25 εντοπίζεται στον πυρήνα, αλλά και στο κυτταρόπλασµα, συµµετέχει στην ωρίµανση του πρόδροµου ριβοσωµικού 40S και παρουσιάζει δράση κινάσης καθώς και ενεργοποιεί τη µετάφραση σε απόκριση βλάβης του DNA. Η πρωτεΐνη Tsr1 µαζί µε την Hrr25 εντοπίζονται σε σύµπλοκα 40S ενδιάµεσων σταδίων. Τα 60S pre-ριβοσώµατα µετακινούνται από τον πυρηνίσκο στο πυρηνόπλασµα µετά την ωρίµανση των rrnas. Οι πρωτεΐνες Nog1, Nog2, Nug1 και Nug2 εµπλέκονται στην επεξεργασία του 27SB και 7S pre-rrna, εντοπίζονται στον πυρηνίσκο αλλά συνοδεύουν το 60S και στο πυρηνόπλασµα µέχρι τους πυρηνικούς πόρους. Τα

12 πρωτεϊνικά σύµπλοκα Noc1p-Noc2p και Noc2p-Noc3p συµµετέχουν στην ωρίµανση και την ενδοπυρηνική µετακίνηση των pre-ριβοσωµάτων ( Milkereit et al., 2001). Στη διαδικασία φαίνεται ότι συµµετέχουν επίσης οι πρωτεΐνες Nop4p και Nop8p καθώς και οι ελικάσες Dbp6p και Dbp9p, αφού απάλειψη των γονιδίων τους οδηγεί σε µείωση των επιπέδων του 27S pre-rna(berge s et al., 1994, Daugeron et al., 1999, Kressler et al., 1998, Sun c. and J.L. Woolford, Jr, 1994, Zanchin, N.I.T. and D.S.Goldfarb., 1999). H Nip7p φαίνεται να είναι µια πολυλειτουργική πρωτεΐνη, ενώ η Ras1p εµπλέκεται σε µετέπειτα στάδια της πρόδροµης 60S υποµονάδας και απαιτείται για τη στρατολόγηση του συµπλόκου RpI10p/Qsr1p, το οποίο µε τη σειρά του είναι απαραίτητο διότι αποτελεί σηµείο σύνδεσης της 40S µε την 60S υποµονάδα. Η Nmd3 φαίνεται να παρέχει το σήµα εξόδου της 60S στο κυτταρόπλασµα( Karl et al.,1999) Η ριβοσωµική πρωτεΐνη Rp15p αλληλεπιδρά µε το 5S rrna στα πρώιµα στάδια συγκρότησης-βιογένεσης της 60S υποµονάδας και είναι απαραίτητη για τη σταθεροποίηση της 60S( Deshmukh et al., 1993). H Nop53p εντοπίζεται κυρίως στον πυρήνα και φαίνεται να συµµετέχει στη δηµιουργία των 60S υποµονάδων καθώς και στο ρυθµό ισορροπίας 60S:40S (Sydorskyy et al., 2005). Τέλος η κυτταροπλασµατική πρωτεΐνη Sqt1p αλληλεπιδρά ισχυρά µε το σύµπλοκο σύνδεσης των δύο υποµονάδων. Γενικότερα η βιογένεση των ριβοσωµάτων αποτελεί µια πολύπλοκη διαδικασία και υπάρχουν σηµεία που παραµένουν να διαλευκανθούν στο µέλλον. Μετά τη συγκρότηση των υποµονάδων, αυτές µεταφέρονται από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασµα µέσω των πυρηνικών πόρων οι οποίοι συγκροτούνται από τις νουκλεοπορίνες. Οι πυρηνικοί πόροι, λόγω της ύπαρξης των νουκλεοπορινών και άλλων πρωτεϊνών, περιέχουν αρνητικά φορτισµένες και µη διαµορφωµένες περιοχές µε υδρόφοβες επαναλαµβανόµενες αλληλουχίες FG µε τις οποίες αλληλεπιδρούν οι καρυοφερίνες(rout et al., 2000) Οι ριβοσωµικές υποµονάδες χρειάζονται τη βοήθεια διάφορων πρωτεϊνών για τη µεταφορά τους µέσω του πυρήνα, η δε pre-40s υποµονάδα απελευθερώνεται ταχύτατα στο κυτταρόπλασµα(leger-silvestre, Milkereit et al., 2004).

13 Οι πρωτεΐνες που εµπλέκονται στην µεταφορά της 40S υποµονάδας από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασµα είναι οι Enp1p/ Rio2 που αλληλεπιδρούν µε µια GTPσυνδεόµενη πρωτεΐνη, την Tsr1p(Thorsten et al, 2003) όπως επίσης και η GTPάση Ran καθώς και οι νουκλεοπρωτεΐνες των πυρηνικων πόρων (Moy and Silver, 1999). Η καρυοφερίνη Crm1p πιθανώς αλληλεπιδρά µε την πρωτεΐνη Rps15p για την έξοδο της 40S υποµονάδας στο κυτταρόπλασµα (Leger-Silvestre, Milkereit et al., 2004). Επιπλέον βιοχηµικά πειράµατα έχουν δείξει ότι η πυρηνική µυοσίνη Ι (ΝΜΙ) και η ακτίνη συσχετίζονται λειτουργικά µε την έξοδο της µικρής υποµονάδας στο κυτταρόπλασµα, διότι παρεµπόδιση τους οδηγεί στη συσσώρευση της S6 ριβοσωµικής πρωτεΐνης στο πυρηνόπλασµα. Ο πλήρης µηχανισµός µεταφοράς της 60S υποµονάδας δεν έχει αποσαφηνιστεί πλήρως, αλλά σύµφωνα µε πρόσφατες εργασίες φαίνεται ότι απαιτούνται γι αυτήν την διαδικασία τρεις υποδοχείς εξόδου : Η πρωτεΐνη Crm1 προσδένεται στην 60S υποµονάδα µέσω της πρωτεΐνης Nmd3p (Gadal et al., 2001) το ετεροδιµερές Mex67/Mtr2 (Yao et al., 2007) και ένας µη κανονικός υποδοχέας που προσδένεται απευθείας στην υποµονάδα και τις νουκλεοπορίνες (Hedges et al., 2006). Πιο πρόσφατα δεδοµένα υποστηρίζουν ότι η έξοδος της µεγάλης υποµονάδας στηρίζεται στην παρουσία ενός ισχυρού σήµατος εξόδου πλούσιο σε λευκίνες.

14 2.2 ΡΙΒΟΣΩΜΙΚΕΣ ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ Οι ριβοσωµικές πρωτεΐνες που συγκροτούν την µεγάλη υποµονάδα του ριβοσώµατος, όπως αναφέρθηκε νωρίτερα, χαρακτηρίζονται από το λατινικό γράµµα L το οποίο συνοδεύεται από έναν αριθµό και αντίστοιχα της µικρής υποµονάδας από το λατινικό γράµµα S και έναν αριθµό. Στον επίµυ για παράδειγµα οι ριβοσωµικές πρωτεΐνες S είναι περίπου 33 ενώ οι L 49. Τα mrnas που κωδικοποιούν για τις ριβοσωµικές πρωτεϊνες προκύπτουν από την δράση της RNA πολυµεράσης ΙΙ στον πυρήνα και στη συνέχεια εξέρχονται στο κυτταρόπλασµα, όπου γίνεται η σύνθεση των πρωτεϊνών. Για να γίνει η συγκρότηση των ριβοσωµικών υποµονάδων, οι ριβοσωµικές πρωτεΐνες µετά τη σύνθεση τους στον κυτταρόπλασµα µεταφέρονται στον πυρήνα και ακολούθως στον πυρηνίσκο και ενώνονται µε τα κατάλληλα rrnas (Warner, 2001). Η είσοδος τους στον πυρήνα επιτυγχάνεται µε τη βοήθεια ειδικής αλληλουχίας αµινοξέων (gly-arg-lys-lys-arg-arg-glu-arg-arg-arg). Οι λειτουργίες που επιτελούν οι ριβοσωµικές πρωτεΐνες στη βιοσύνθεση του ριβοσώµατος σχετίζονται µε την επεξεργασία του pre-rrna, την αναδίπλωση του rrnα, την µεταφορά πρόδροµων ριβοσωµάτων, την σταθερότητα της δοµής των ριβοσωµικών υποµονάδων, καθώς αλληλεπιδρούν µε διάφορους άλλους παράγοντες. Μετά την αλληλεπίδραση των ριβοσωµικών πρωτεϊνών µε τα rrnas για τη δηµιουργία των πρόδροµων ριβοσωµικών υποµονάδων, αυτές µεταφέρονται στο κυτταρόπλασµα. Στη συνέχεια οι ριβοσωµικές υποµονάδες ανασυγκροτούνται για να δώσουν το 80S ριβόσωµα, το οποίο επιτελεί τη διαδικασία της µετάφρασης και στην συνέχεια αποσυγκροτούνται όταν ολοκληρωθεί η πρωτεϊνική σύνθεση (Ανακύκλωση Ριβοσώµατος, Mao-De and Jing, 2007). Τα επίπεδα των ελεύθερων ριβοσωµάτων, rrnas και ριβοσωµικών πρωτεϊνών ελέγχονται από σύο συστήµατα ανάδρασης (feedback). Το πρώτο σύστηµα είναι η ριβοσωµική ανάδραση (ribosomal inhibition), όπου τα πλεονάζοντα ελεύθερα ριβοσώµατα καταστέλλουν κατά κάποιο τρόπο την σύνθεση του rrna. Στο δεύτερο σύστηµα (µεταφραστική καταστολή-translational control), ορισµένες ριβοσωµικές

15 πρωτεΐνες καταστέλλουν την µετάφραση ενός mrna που κωδικοποιεί για µία ριβοσωµική πρωτεΐνη ή περισσότερες. Οι ριβοσωµικές πρωτεΐνες παρουσιάζουν µεγάλη οµολογία ανάµεσα στα διάφορα είδη και µπορούν να διακριθούν σε δύο µεγάλες κατηγορίες, αυτές που είναι συντηρηµένες ανάµεσα σε βακτήρια, αρχαιοβακτήρια και ευκαρυωτικά κύτταρα και σε αυτές που είναι κοινές σε αρχαιοβακτήρια και ευκαρυωτικούς οργανισµούς. Στα ευκαρυωτικά κύτταρα, κάθε ριβοσωµική πρωτεΐνη κωδικοποιείται από ένα λειτουργικό γονίδιο, αλλά υπάρχουν και πολλά ψευδογονίδια για κάθε µία επίσης. Έχει αποδειχθεί ότι υπάρχει µια κοινή οµάδα προγονικών γονιδίων που κωδικοποιούν για τις ριβοσωµικές πρωτεΐνες των ευκαρυωτικών οργανισµών. Η προέλευση των ριβοσωµικών πρωτεϊνών µπορεί να βασιστεί σε δύο θεωρίες. Η πρώτη θεωρία υποστηρίζει ότι οι ριβοσωµικές πρωτεΐνες σχεδιάστηκαν εξ αρχής αποκλειστικά για το ριβόσωµα και η δεύτερη ότι από ήδη υπάρχουσες πρωτεΐνες είχαν επιλεγεί αυτές που υπηρετούσαν καλύτερα τις ανάγκες του ριβοσώµατος. ιακρίνονται κάποια κοινά δοµικά χαρακτηριστικά στις ριβοσωµικές πρωτεΐνες των θηλαστικών, τα οποία είναι δέσµες 3 ή 4 βασικών αµινοξέων που εντοπίζονται κοντά στο N-τελικό και στο C-τελικό άκρο, επαναλαµβανόµενες ακολουθίες 3-8 αµινοξέων, δοµές δακτυλου ψευδαργύρου και φερµουάρ λευκίνης (Wool, 1995). Πιο σπάνια εντοπίζονται δέσµες όξινων αµινοξέων στο C-τελικό άκρο. Το µέγεθος των ριβοσωµικών πρωτεϊνών των θηλαστικών κυµαίνεται κατά µέσο όρο στα Da και ο αριθµός των αµινοξέων στα 164. Τα όρια για το µοριακό βάρος κυµαίνονται από Da για την L41 και Da για την L4, ενώ για τον αριθµό αµινοξέων από 25 µέχρι 421. Το φορτίο των περισσότερων ριβοσωµικών πρωτεϊνών είναι βασικό, µε τα ισοηλεκτρικά σηµεία να κυµαίνονται από 4.07 για την όξινη πρωτεΐνη P1 µέχρι για την πολύ βασική L41, µε γενικό µέσο όρο το Οι ριβοσωµικές πρωτεΐνες υφίστανται διάφορες µεταµεταφραστικές τροποποιήσεις, µετά από τη σύνθεση τους. Οι τροποποιήσεις αυτές περιλαµβάνουν την ακετυλίωση, τη µεθυλίωση και τη φωσφορυλίωση. Η ακετυλίωση συµβαίνει κυρίως στο Ν-τελικό άκρο των πρωτεϊνών, αλλά δεν έχει παρατηρηθεί όταν αποµονώνονται οι πρωτεΐνες από τα ριβοσώµατα. Μία πιθανή εκδοχή είναι ότι η ακετυλίωση συµβαίνει αρχικά, ώστε να συµβάλλει στην παραµονή των ριβοσωµικών πρωτεϊνών στο κυτταρόπλασµα

16 και έπειτα αναιρείται, ώστε να διασφαλιστεί η βιογένεση των ριβοσωµάτων στον πυρηνίσκο σε περαιτέρω στάδια. Η RPD3 είναι µια αποακετυλάση ιστόνης που παίζει σηµαντικό ρόλο στην αποακετυλίωση των ριβοσωµικών πρωτεϊνών (Dinman, 2009). Η φωσφορυλίωση είναι µια πολύ κοινή τροποποίηση σε πολλές κυτταρικές πρωτεΐνες. Αρκετές ριβοσωµικές πρωτεΐνες υπόκεινται σε φωσφορυλίωση, η οποία µε αυτόν τον τρόπο ρυθµίζει διάφορες κυτταρικές λειτουργίες. Μία από αυτές είναι η rps3 που φωσφορυλιώνεται από τις κινάσες ERC και PKC delta (Kim et al., 2009) ενώ για τις υπόλοιπες δεν είναι γνωστό από ποιες κινάσες. Η rps5, που είναι και το αντικείµενο µελέτης της συγκεκριµένης εργασίας, έχει βρεθεί ότι είναι φωσφορυλιωµένη όταν δεν είναι ενσωµατωµένη στο ριβόσωµα (Matragkou, Papachristou et al, 2009). H µεθυλίωση είναι επίσης συχνή µεταµεταφραστική τροποποίηση στις ριβοσωµικές πρωτεΐνες. Για παράδειγµα η rps3 σε ανθρώπινα κύτταρα µεθυλιώνεται από την µεθυλτρανσφεράση 1 (PRMT1) σε κατάλοιπα αµινοξέων αργινίνης. Η παρεµπόδιση της µεθυλίωσης της rps3 παρεµποδίζει την είσοδο της πρωτεΐνης στον πυρηνίσκο, συνεπώς η είσοδος της στον πυρηνίσκο απαιτεί αυτήν την τροποποίηση (Shin et al., 2009). Η rps2 έχει βρεθεί επίσης ότι µεθυλιώνεται από την µεθυλτρανσφεράση 3 (PRMT3) σε κατάλοιπα αργινίνης (Swiercz, Cheng et al., 2007). Οι ριβοσωµικές πρωτεΐνες συµµετέχουν όχι µόνο στη συγκρότηση των ριβοσωµάτων και τη λειτουργία τους, αλλά και σε πολλές διαφορετικές κυτταρικές λειτουργίες. Η εµπλοκή τους αυτή σε µη ριβοσωµικές λειτουργίες έχει αποδειχθεί από την υπερπαραγωγή τους σε διάφορες καρκινικές σειρές όπως επίσης και από την σύνθεση τους ακόµη και αν παρεµποδίζεται η σύνθεση του rrna. Οι εξωριβοσωµατικές λειτουργίες στις οποίες συµµετέχουν διάφορες ριβοσωµικές πρωτεΐνες είναι η αντιγραφή του DNA, η ρύθµιση της µεταγραφής, η ρύθµιση της αυτοµετάφρασης, το µάτισµα και η τροποποίηση του RNA, η δράση της DNA τοποϊσοµεράσης, η επιδιόρθωση του DNA, η ρύθµιση της ανάπτυξης, η κυτταρική ανάπτυξη και ρύθµιση του πολλαπλασιασµού, η ρύθµιση της κυτταρικής απόπτωσης, η ρύθµιση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων, η ρύθµιση των πρωτοογκογονιδίων, η

17 κακοήθης µεταµόρφωση, η µετάσταση, η δηµιουργία όγκων και η διαφοροποίηση ακόµα και η φλεγµονή. Σε πολλές κληρονοµήσιµες γενετικές ασθένειες έχουν βρεθεί µεταλλάξεις σε γονίδια ριβοσωµικών πρωτεϊνών ή διαταραχές έκφρασης των επιπέδων τους. Τέτοιες ασθένειες µπορεί να είναι το σύνδροµο Turner, το σύνδροµο Noonan, το σύνδροµο Bardet-Biedi (Kongssuwan, Yu et al., 1985) και διάφορες µορφές καρκίνου όπως του µαστού, προστάτη, τραχήλου της µήτρας, οισοφάγου και ήπατος. Στην καρκινογένεση µπορεί να συµµετέχουν µε δύο πιθανούς τρόπους: είτε η διαταραχή των επιπέδων των ριβοσωµικών πρωτεϊνών επηρεάζει την πρωτεϊνική σύνθεση, ή έχουν άµεση συµµετοχή στον µηχανισµό της καρκινογένεσης µέσω του µη ριβοσωµικού τους ρόλου (Mao-De and Jing, 2007). Το πρωτοογκογονίδιο c-myc δρα ρυθµιστικά στη βιογένεση των ριβοσωµάτων (Coller et al., 2000) και υπερέκφραση του οδηγεί σε αύξηση του µεγέθους των πυρηνίσκων των κυττάρων και ταυτόχρονη υπερέκφραση πολλών ριβοσωµικών πρωτεϊνών και πρωτεϊνών του πυρηνίσκου (Kim S et al., 2000). Η ριβοσωµική πρωτεΐνη S5 αποτελεί έναν από τους στόχους των προϊόντων του c-myc. Μερικές άλλες ριβοσωµικές πρωτεΐνες που αποτελούν στόχοι του c-myc είναι οι L3, L15, L39, L37, S2, S3a, S6 (Ruggero D and Pandolfi P., 2003). H ριβοσωµική πρωτεΐνη L11 δρα ως αναδραστικός ρυθµιστής του c-myc. Μία εκδοχή είναι ότι δεσµεύεται στον προαγωγέα του γονιδίου c-myc δρώντας έτσι ως καταστολέας της γονιδιακής έκφρασης του. Άλλη εκδοχή είναι ότι µπορεί να ρυθµίζει τα επίπεδα του mrna του c-myc µέσω του µονοπατιού αποσιώπησης του microrna. Ο ακριβής µηχανισµός ρύθµισης του c-myc από την L11 είναι ακόµη άγνωστος, αλλά είναι φανερό ότι υπάρχει συσχετισµός του c-myc και της βιογένεσης των ριβοσωµάτων (Dai and Lu, 2008). Η ωρίµανση του ριβοσώµατος ελέγχεται επίσης από έναν καταστολέα ογκογονιδίου, τον λεγόµενο PTEN(Phosphatase and Tensin Homolog), ο οποίος καταστέλλει τη δράση της κινάσης που φωσφορυλιώνει την ριβοσωµική πρωτεΐνη S6 µέσω του PI3K µονοπατιού (Vogt, 2001 και Backman et al., 2002). Αυτός ο συσχετισµός πρωτοογκογονιδίων και ριβοσωµικών πρωτεϊνών ενισχύει την άποψη της άµεσης

18 εµπλοκής τους στην καρκινογένεση. Τα ογκογονίδια διαταράσσουν τα επίπεδα έκφρασης των ριβοσωµικών πρωτεϊνών µε αποτέλεσµα τη µη φυσιολογική έκφραση τους. Υπάρχουν περιπτώσεις όµως που οι ριβοσωµικές πρωτεΐνες µπορεί να εµπλέκονται µε έµµεσο τρόπο στα στάδια της καρκινογένεσης. Για παράδειγµα, οι ριβοσωµικές πρωτεΐνες L5, L11 και L23 αλληλεπιδρούν απευθείας µε την ογκοπρωτεΐνη MDM2, η οποία παίζει σηµαντικό ρόλο στην αρνητική ρύθµιση της δραστικότητας της p53 που είναι ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη. Η αλληλεπίδραση αυτή οδηγεί στην παρεµπόδιση της ουβικιτινιλίωσης της p53 µέσω της MDM2 µε αποτέλεσµα την ενεργοποίηση της p53 και συσσώρευση της στην G1 φάση του κυτταρικού κύκλου (Hanhui Ma and Thoru Pederson, 2008). Άλλες διεργασίες στις οποίες µπορεί να συµµετέχουν οι ριβοσωµικές πρωτεΐνες, όπως αναφέρθηκε νωρίτερα, µπορεί να είναι η επιδιόρθωση του DNA και η κυτταρική απόπτωση. Στην επιδιόρθωση του DNA συµµετέχει η ριβοσωµική πρωτεΐνη S3, η οποία έχει δράση ενδονουκλεάσης (Kim et al., 1995). Η ίδια πρωτεΐνη συµµετέχει και στην κυτταρική απόπτωση, αφού ενεργοποιεί την κασπάση 8 και 3 και οδηγεί στην απόπτωση. Μία ακόµη ριβοσωµική πρωτεΐνη που συµµετέχει στην απόπτωση είναι η L4, διότι σε πειράµατα στα οποία προστέθηκε ο αποπτωτικός παράγοντας 5- acazytidine, παρατηρήθηκε αύξηση της έκφρασης του γονιδίου της πριν την αποικοδόµηση του DNA ( Naora et al., 1998). Μία εντυπωσιακή µη ριβοσωµική δράση των ριβοσωµικών πρωτεϊνών είναι η συµµετοχή τους στη φλεγµονή. Όταν προστίθεται ιντερφερόνη γ (INF-γ) σε καλλιέργεια ανθρώπινων µονοκυττάρων, παράγεται σε λίγες ώρες η σερουλοπλασµίνη, η οποία συµµετέχει στη φλεγµονώδη απόκριση. Μετά από ώρες µετά την προσθήκη της INF-γ, η έκφραση της σερουλοπλασµίνης αποσιωπάται. Η ριβοσωµική πρωτεΐνη L13a εµπλέκεται στην µετάφραση της σερουλοπλασµίνης, αλληλεπιδρώντας µε την περιοχή 3 -UTR του mrna της προκαλώντας αναστολή της µετάφρασης (Mazumder et al., 2003).

19 2.3 ΡΙΒΟΣΩΜΙΚΗ ΠΡΩΤΕΪΝΗ S5 (ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ) Η ριβοσωµική πρωτεΐνη S5 των ευκαρυωτικών οργανισµών ανήκει στην ευρύτερη οικογένεια S7 των προκαρυωτικών ριβοσωµικών πρωτεϊνών. Η οικογένεια αυτή περιλαµβάνει τις S7 ριβοσωµικές πρωτεΐνες των βακτηρίων, των φυκιών, των χλωροπλαστών, των κυανοβακτηρίων, των αρχαιοβακτηρίων, των µιτοχονδρίων και τις S5 ριβοσωµικές πρωτεΐνες των θηλαστικών και φυτών. Το χαρακτηριστικό γνώρισµα της οικογένειας αυτής είναι µια συντηρηµένη αλληλουχία αµινοξέων στο C-τελικό άκρο των πρωτεϊνών, η οποία είναι της µορφής : [DENSK]-x-[LIVMDET]- x(3)-[livmfta](2)-x(6)-g-k-[kr]-x(5)-[livmf]-[livmfv]-x(2)-[stac] ( prosite). EIKONA 2.4 : Σχηµατική αναπαράσταση της ριβοσωµικής πρωτεΐνης rps5 Η δοµή της προκαρυωτικής rps7 αποτελείται από έξι α-έλικες και µια β-φουρκέτα ανάµεσα στις έλικες 3 και 4 και τα Ν- και C- τελικά άκρα είναι εκτεθειµένα χωρίς καµµία τάξη (Hosaka et al., 1997). Ο ρόλος της rps7 στα βακτήρια στα αρχικά στάδια βιογένεσης των ριβοσωµάτων βοηθά στη σωστή αναδίπλωση του 3 κύριου τµήµατος του 16S rrna, το οποίο µε τη σειρά του σχηµατίζει την κεφαλή της 30S υποµονάδας του ριβοσώµατος ( Nowotny and Nierhaus, 1998). Οι περιοχές σύνδεσης µε το rrna εντοπίζονται σε δύο εσωτερικές θηλιές της δευτεροταγούς δοµής του 16S rrna, οι οποίες αποτελούν ενώσεις τριπλής και τετραπλής έλικας (αµινοξέα , , ) (Dragon et al., 1993, Powers and Noller, 1995). Ο

20 εντοπισµός της rps7 είναι πολύ κοντά στα σηµεία A, P και Ε, όπου δεσµεύεται το trna. H rps7 έχει δυναµικό ρόλο στον µηχανισµό της µετάφρασης καθώς αλληλεπιδρά µε τον παράγοντα έναρξης IF-3 της πρωτεϊνικής σύνθεσης (Ehresmann et al., 1986). Επιπλέον συµβάλλει στη διαµόρφωση του καναλιού εξόδου του mrna και αλληλεπιδρά µε την rps11 στην περιοχή πλατφόρµας της 30S υποµονάδας ( Robert et al., 2003). Το ριβόσωµα είναι επιρρεπές σε λάθη κατά τη µετάφραση, αν παρεµποδιστεί η αλληλεπίδραση της rps7 µε την rps11 προκαλώντας µετάλλαξη σε µία από αυτές. Σε αντίθεση µε τους προκαρυωτικούς οργανισµούς, στους ευκαρυωτικούς δεν είναι συντηρηµένη η αλληλεπίδραση των ριβοσωµικών πρωτεϊνών S7 και S11 (αντίστοιχα S5 και S14). Στα αρχαιοβακτήρια και στους ευκαρυωτικούς οργανισµούς παρατηρείται οµολογία στο N-τελικό άκρο της S7/S5 µια προέκταση περίπου 60 αµινοξέων, η οποία δεν παρατηρείται στα βακτήρια. Το γεγονός αυτό επιβεβαιώνει ότι οι ριβοσωµικές πρωτεΐνες των αρχαιοβακτηρίων βρίσκονται πλησιέστερα εξελικτικά µε τις οµόλογες πρωτεΐνες των ευκαρυωτικών. Ο αριθµός (204) των αµινοξέων της όµως είναι κοινός και στα τρία είδη κυττάρων. Η ευκαρυωτική πρωτεΐνη S5 δρα στα αρχικά στάδια της βιογένεσης των ριβοσωµάτων αλληλεπιδρώντας µε την κινάση KKr1 καθώς επίσης µε τις YHR196w και YGR090w, οι οποίες εµπλέκονται στη διαδικασία ωρίµανσης του 18S rrna στον πυρηνίσκο (Grandi et al., 2002). Από µελέτες της S5 από ανθρώπινο πλακούντα, έχει βρεθεί ότι αλληλεπιδρά συγκεκριµένα µε ένα ολιγονουκλεοτίδιο (αµινοξέα ) που είναι συµπληρωµατικό της περιοχής του 18S rrna. Έτσι η rps5 αποτελεί µία από τις πρόδροµες πρωτεΐνες που συνδέονται µε το 18S rrna, προκειµένου να αρχίσει η συγκρότηση της µικρής υποµονάδας του ευκαρυωτικού ριβοσώµατος (Kressler et al., 1999). Έχει βρεθεί ότι η ευκαρυωτική ριβοσωµική πρωτεΐνη S5 αλληλεπιδρά µε την περιοχή IRES (Internal Ribosome Entry Site) του ιού της ηπατίτιδας C και βοηθά στην τοποθέτηση του RNA του ιού στην υποµονάδα 40S του ριβοσώµατος κατά την έναρξη της µετάφρασης.

21 Η rps5 συµµετέχει όπως και άλλες ριβοσωµικές πρωτεΐνες στην διαδικασία της καρκινογένεσης. Το γονίδιο της rps5 επάγεται από µια κατηγορία µεταγραφικών παραγόντων (myc γονίδια) που ενεργοποιούνται συχνά σε ανθρώπινους όγκους και παίζουν κυρίαρχο ρόλο στον καρκίνο. Στην περίπτωση της επαγόµενης διαφοροποίησης ερυθρολευχαιµικών κυττάρων ποντικού MEL (Murine ErythroLeukemia Cells), βρέθηκε ότι το γονίδιο της rps5 σε επίπεδο mrna καταστέλλεται σταδιακά κατά τη διαφοροποίηση (Vizirianakis et al., 1999), ενώ αντίθετα σε διάφορες άλλες µορφές καρκίνου, έχει βρεθεί να υπερεκφράζεται. Χαρακτηριστικό της rps5 είναι επίσης ότι υπόκειται σε φωσφορυλίωση στον µύκητα S. Cerevisiae (Ignatovich et al., 1995). Στον επίµυ έχει βρεθεί φωσφορυλιωµένη µαζί µε άλλες πρωτεΐνες (S3a, L14, L19) στα ελεύθερα ριβοσώµατα, όχι όµως στα πολυσώµατα ( Francis et al., 1982). Στον επίµυ έχει βρεθεί επίσης η πρωτεΐνη S5a, στην οποία λείπουν τα 5 πρώτα αµινοξέα αλλά κατά τα άλλα είναι ταυτόσηµη µε την rps5. Οι δύο µορφές της πρωτεΐνης rps5 προέρχονται από το ίδιο µεταγράφηµα cdna και πιθανόν η rps5a προέρχεται από πρωτεόλυση της rps5 (Kuwano and Wool, 1992). Όσον αφορά την κινητικότητα της rps5, έχει παρατηρηθεί ότι η µετακίνηση της από τον πυρηνίσκο στο πυρηνόπλασµα είναι σηµαντικά πιο αργή σε σχέση µε άλλες πρωτεΐνες που συµµετέχουν στα διάφορα στάδια της βιογένεσης των ριβοσωµάτων (Chen & Huang, 2001).

22 2.4 ΑΠΟΙΚΟ ΟΜΗΣΗ ΡΙΒΟΣΩΜΙΚΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Οι ριβοσωµικές πρωτεΐνες εκφράζονται σε υψηλότερα επίπεδα από αυτά που είναι απαραίτητα για τον τυπικό ρυθµό παραγωγής των ριβοσωµικών υποµονάδων και συγκεντρώνονται στον πυρηνίσκο πιο γρήγορα από άλλα συστατικά του πυρηνίσκου. Σύµφωνα µε τους Yuh Wah Lam και συνεργάτες (Curr Biol.2007), αυτή η υψηλή έκφραση των ριβοσωµικών πρωτεϊνών αντισταθµίζεται από τη συνεχή αποικοδόµηση στο πυρηνόπλασµα αυτών που δεν έχουν συγκροτηθεί σε ριβοσώµατα, παρέχοντας έτσι έναν µηχανισµό στα κύτταρα των θηλαστικών να διατηρούν τον αριθµό των ριβοσωµικών πρωτεϊνών σε ένα επιθυµητό επίπεδο για την αποτελεσµατική συγκρότηση των ριβοσωµικών υποµονάδων. Μελέτες µε τεχνικές ποσοτικής φασµατοµετρίας µάζας και απεικόνισης φθορισµού ζωντανών κυττάρων επέτρεψαν την ανάλυση της σύνθεσης και της ενδοκυτταρικής δυναµικής των ριβοσωµικών πρωτεϊνών σε καλλιέργειες κυττάρων θηλαστικών. Και οι δύο αυτές προσεγγίσεις είχαν παρόµοια αποτελέσµατα και έδειξαν την ταχεία σύνθεση και συγκέντρωση των ριβοσωµικών πρωτεϊνών στον πυρηνίσκο. Επιπλέον παρατηρήθηκε µια εµφανής διαφορά στην ποσότητα των ριβοσωµικών πρωτεϊνών που εισερχόταν στον πυρήνα σχετικά µε αυτήν που εξερχόταν στο κυτταρόπλασµα ως ριβοσωµικές υποµονάδες. Οι πυρηνικές ριβοσωµικές πρωτεΐνες µπορούν να µετακινούνται συνεχώς από τον πυρήνα στον πυρηνίσκο και το αντίστροφο στη µορφή ελεύθερων πρωτεϊνών ή πρωτεϊνικών συµπλεγµάτων, αλλά διατηρούνται στους πυρηνίσκους όταν η σύνθεση του rrna είναι ενεργή. Παρεµπόδιση της δράσης του πρωτεασώµατος είχε ως αποτελέσµα την µη πραγµατοποίηση της συνεχούς πυρηνοπλασµατικής αποικοδόµησης των ριβοσωµικών πρωτεϊνών. Το γεγονός αυτό υποδεικνύει ότι το πρωτεάσωµα εµπλέκεται στην αποικοδόµηση των ριβοσωµικών πρωτεϊνών στο πυρηνόπλασµα. Επιπλέον µε φασµατοµετρία µάζας έχουν βρεθεί πολλά παραδείγµατα ουβικιτινιλιωµένων ριβοσωµικών πρωτεϊνών σε ανθρώπινα κύτταρα, γεγονός που ενισχύει ότι οι ριβοσωµικές πρωτεΐνες αποτελούν υποστρώµατα για το µονοπάτι

23 αποικοδόµησης από το πρωτεάσωµα. Η προσθήκη ουβικιτίνης στις ριβοσωµικές πρωτεΐνες και η ρύθµιση των επιπέδων τους στον πυρήνα από το πρωτεάσωµα, µπορεί να έχουν άµεσα ή έµµεσα αποτελέσµατα στο µονοπάτι βιογένεσης του ριβοσώµατος. Η αποικοδόµηση των ριβοσωµικών πρωτεϊνών φαίνεται ότι συµβαίνει στο πυρηνόπλασµα και όχι στους πυρηνίσκους. Βιοχηµικά πειράµατα έχουν δείξει ότι υψηλά επίπεδα ενεργότητας του πρωτεασώµατος παρατηρούνται στο πυρηνόπλασµα, ενώ οι πυρηνίσκοι δεν παρουσιάζουν καθόλου ενεργότητα πρωτεασώµατος. Η συνεχής µετακίνηση των ριβοσωµικών πρωτεϊνών από το πυρηνόπλασµα στους πυρηνίσκους επιτρέπει την αποικοδόµηση τους στο πυρηνόπλασµα, αφού εκτίθενται στη δράση του πρωτεασώµατος. Ο ακριβής µηχανισµός αποικοδόµησης των ριβοσωµικών πρωτεϊνών δεν είναι ακόµη ξεκάθαρος. Σε γενικές γραµµές όµως µπορεί να υποστηριχθεί το γεγονός ότι οι νεοσυντιθέµενες ριβοσωµικές πρωτεΐνες εισέρχονται ταχέως στο πυρηνίσκο και χρησιµοποιούνται όσες είναι απαραίτητες για τη βιογένεση των ριβοσωµάτων ενώ οι υπόλοιπες βρίσκονται σε µια διαρκή κίνηση ανάµεσα στον πυρηνίσκο και στο πυρηνόπλασµα όπου γίνονται στόχοι αποικοδόµησης από το πρωτεάσωµα. Οι ριβοσωµικές πρωτεΐνες που είναι συγκροτηµένες στις ριβοσωµικές πρωτεΐνες φαίνεται ότι είναι προστατευµένες απέναντι στη δράση του πρωτεασώµατος και έτσι αποικοδοµούνται µόνο αυτές σε ελεύθερη µορφή. Σύµφωνα µε τους Xirodimas και συνεργάτες (EMBO reports 2008) έδειξαν ότι οι ριβοσωµικές πρωτεΐνες είναι στόχοι για το µονοπάτι NEDD8. Η πρωτεΐνη NEDD8 είναι ένα µόριο που µοιάζει µε την ουβικιτίνη και εµπλέκεται στην ρύθµιση του κυτταρικού πολλαπλασιασµού, επιβίωσης και ανάπτυξης. H NEDD8 προσδένεται στα υποστρώµατα της µε έναν ισοπεπτιδικό δεσµό ανάµεσα στην καρβοξυτελική γλυκίνη 76 και σε µία λυσίνη της πρωτεΐνης-υπόστρωµα. Το µονοπάτι NEDDυλίωσης ( Rabut & Peter, 2008) περιλαµβάνει αρχικά την επεξεργασία του πρόδροµου µορίου της NEDD8 για να προκύψει η ώριµη µορφή της. Μετά από την επεξεργασία της, η ώριµη NEDD8 ενεργοποιείται µέσω ενός ATPεξαρτώµενου µηχανισµού που ενεργοποιείται από ένα ένζυµο ενεργοποίησης, Ε1, το

24 οποίο δηµιουργεί ένα ενδιάµεσο υψηλής ενέργειας. Στη συνέχεια, µεταφέρεται σε ένα συνδετικό ένζυµο, το Ε2, το οποίο µεταφέρει την NEDD8 σε µία λιγάση (Ε3), η οποία µε τη σειρά της εξασφαλίζει την εξειδικευµένη σύνδεση της NEDD8 στα υποστρώµατα της. Στην παρακάτω εικόνα φαίνεται σχηµατικά το γενικό µονοπάτι NEDDυλίωσης : ΕΙΚΟΝΑ 2.5 : Μονοπάτι NEDDυλίωσης : Σχηµατική αναπαράσταση των κύριων βηµάτων της NEDDυλίωσης που περιλαµβάνει την επεξεργασία της πρόδροµης πρωτεΐνης NEDD8, την ενεργοποίηση της από τον Ε1 (ετεροδιµερές UBA3- APPBP1), τη φόρτωση της στον Ε2 (Ubc12), την σύνδεση της σε υπόστρωµα µε τη βοήθεια του Ε3 και την ανακύκλωση της από µία ισοπεπτιδάση. ( Rabut & Peter, 2008).

25 Τα πιο καλά χαρακτηρισµένα υποστρώµατα της NEDD8 είναι οι πρωτεΐνες της οικογένειας cullin. Η αναζήτηση για άλλα υποστρώµατα της NEDD8 οδήγησε στην εύρεση 36 µικρών (S) και µεγάλων (L) ριβοσωµικών υποµονάδων ανάµεσα σε άλλες πρωτεΐνες που είναι πιθανοί στόχοι NEDDυλίωσης. Η έλλειψη NEDDυλίωσης στα κύτταρα προκαλεί αστάθεια των ριβοσωµικών πρωτεϊνών, το οποίο σηµαίνει ότι η προσθήκη της NEDD8 στις ριβοσωµικές πρωτεΐνες έχει προστατευτική δράση έναντι της αποικοδόµησης τους από το πρωτεάσωµα. Στον παρακάτω πίνακα φαίνονται οι πρωτεΐνες που αποτελούν στόχοι NEDDυλίωσης στα κύτταρα.

26 ΠΙΝΑΚΑΣ 2.1 : Οι στόχοι της NEDD8 στα κύτταρα. Πρωτεϊνικοί στόχοι του µονοπατιού NEDD8 Cullin 4A Ribosomal protein L7 Ribosomal protein L21 Ribosomal protein S4 Cullin 4B Ribosomal protein L7a Ribosomal protein L23 Ribosomal protein S6 Cullin 1 Ribosomal protein L8 Ribosomal protein L24 Ribosomal protein S7 Cullin 2 Ribosomal protein L9 Ribosomal protein L26 Ribosomal protein S8 Cullin 3 Ribosomal protein L10a Ribosomal protein L27 Ribosomal protein S11 Cullin 5 Ribosomal protein L11 Ribosomal protein L29 Ribosomal protein S13 NEDD8 Ribosomal protein L12 Ribosomal protein L30 Ribosomal protein S14 UBC12 Ribosomal protein L13 Ribosomal protein L31 Ribosomal protein S15a NAE1/APPBP1 Ribosomal protein L14 Ribosomal protein L35a Ribosomal protein S16 Ribosomal protein L5 Ribosomal protein L17 Ribosomal protein S2 Ribosomal protein S20 Ribosomal protein L6 Ribosomal protein L18 Ribosomal protein S3 Ribosomal protein S23 Ribosomal protein S26

27 Από τον προηγούµενο πίνακα φαίνεται ότι η ριβοσωµική πρωτεΐνη S5 δεν αποτελεί στόχο NEDDυλίωσης στα κύτταρα. Αυτό σηµαίνει ότι η προστασία έναντι της αποικοδόµησης από το πρωτεάσωµα που προσφέρει η προσθήκη της NEDD8 στις υπόλοιπες ριβοσωµικές πρωτεΐνες, δεν ισχύει στην περίπτωση της rps5.

28 2.5 ΠΡΩΤΕΟΛΥΣΗ ΤΗΣ ΡΙΒΟΣΩΜΙΚΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ S5 Η πρωτεόλυση της ριβοσωµικής πρωτεΐνης S5 σε φυσιολογικά ευκαρυωτικά κύτταρα είναι το κύριο θέµα που απασχολεί τη συγκεκριµένη εργασία. Αρκετά χρόνια πριν η πρωτεόλυση της rps5 είχε απασχολήσει την επιστηµονική κοινότητα. Το 1992 ο Kuwano και συνεργάτες είχαν αναφέρει στον επίµυ την ύπαρξη της rps5a, η οποία αποτελεί πρωτεόλυµα της rps5 και της λείπουν τα πέντε πρώτα αµινοξέα της ολικής rps5. Αργότερα το 1996, οι Vladimirov και συνεργάτες ανέφεραν επίσης ίδια συµπεριφορά για την rps5 από ανθρώπινο πλακούντα. εν ήταν όµως διευκρινισµένο αν το γεγονός αυτό ήταν τυχαίο ή φυσιολογικό. Το εργαστήριο µας σε προηγούµενες έρευνες (Papachristou και συνεργάτες) ασχολήθηκε µε την διαλεύκανση της πρωτεόλυσης της πρωτεΐνης rps5, αφού είχε παρατηρηθεί το γεγονός ότι µε τη µέθοδο του Western blot ανιχνεύονταν δύο ευδιάκριτες ζώνες χρησιµοποιώντας αντίσωµα έναντι της C-τελικής περιοχής της, ενώ κάποιες άλλες φορές υπήρχε µία ζώνη. Η διαφορά των ζωνών αποδίδονταν όχι µόνο στα 5 αµινοξέα, όπως είχε προαναφερθεί, αλλά περίπου σε αµινοξέα. Τα αποτελέσµατα ήταν επαναλήψιµα ανεξάρτητα από τα διαφορετικά διαλύµατα λύσης που είχαν χρησιµοποιηθεί. A) B) 23 kb > EIKONA 2.6 : A) Ανοσοανίχνευση της rps5 µετά από 48 ώρες καλλιέργειας MEL κυττάρων. Χρησιµοποιήθηκαν τέσσερα διαφορετικά διαλύµατα λύσης των κυττάρων. Β) Ανοσοανίχνευση της ακτίνης και της rps5 µετά από 48 ώρες (1) και 96 ώρες (2) καλλιέργειας MEL κυττάρων. Μετά τις 96 ώρες εµφανίζεται διπλή ζώνη που υποδεικνύει την πρωτεόλυση της rps5.

29 Τα συµπεράσµατα στα οποία κατέληξε η ερευνητική οµάδα ήταν ότι η πρωτεόλυση της rps5 συµβαίνει in vivo στη στατική φάση ανάπτυξης (µετά από 96 ώρες) των κυττάρων MEL και όχι στη λογαριθµική φάση ανάπτυξης τους (µετά από 48 ώρες). Οι έρευνες συνεχίστηκαν για να εξακριβωθεί αν η παρατηρούµενη αυτή πρωτεόλυση συµβαίνει µόνο σε καρκινικά κύτταρα όπως τα MEL κύτταρα ή προκύπτει επίσης σε σειρές φυσιολογικών κυττάρων. Τα συµπεράσµατα θα αναλυθούν περαιτέρω στο κεφάλαιο της συζήτησης. Επιπλέον σύµφωνα µε προηγούµενα αποτελέσµατα, υπήρχαν ενδείξεις ύπαρξης ενός σήµατος PEST στην αµινοτελική περιοχή της rps5. Το σήµα PEST είναι ακολουθίες αµινοξέων οι οποίες περιέχουν συνήθως τα τέσσερα αµινοξέα προλίνη, γουταµινικό οξύ, σερίνη και θρεονίνη αλλά όχι απαραίτητα µε αυτήν την σειρά. Η φωσφορυλίωση µιας σερίνης ή θρεονίνης ενεργοποιεί την λανθάνουσα PEST περιοχή και µε αυτόν τον τρόπο δίδεται σήµα αυτοπρωτεόλυσης της πρωτεΐνης που περιέχει την PEST ακολουθία. Σύµφωνα µε την εργασία των Maria M. Garcia-Alai και συνεργατών (Elsevier 2006) πολλές πρωτεΐνες που περιέχουν την PEST ακολουθία αποικοδοµούνται από το 26S πρωτεάσωµα το οποίο αναγνωρίζει µόρια ουβικιτίνης πάνω σε αυτές, ώστε έπειτα να αναγνωριστούν από το σύστηµα λιγάσης U2/U3 και να γίνουν υποστρώµατα για πρωτεόλυση. Αν και το σήµα PEST είναι παρόν όλη τη διάρκεια της ζωής µιας πρωτεΐνης, αυτή δεν αποικοδοµείται αν δεν έχει σηµανθεί πρώτα καταλλήλως. Ο ακριβής µηχανισµός αναγνώρισης των σηµάτων αποικοδόµησης από την πρωτεολυτική µηχανή του κυττάρου δεν είναι ακόµη γνωστός, αλλά ούτε και ο ρόλος της ακολουθίας αυτής στη σταθερότητα της πρωτεΐνης και στην αναγνώριση πρωτεΐνης-πρωτεΐνης. Σύµφωνα µε θεωρητική προσέγγιση σύµφωνα µε τους Matragkou και συνεργάτες (JMB 2009) χρησιµοποιώντας εργαλεία βιοπληροφορικής ( analysis) βρέθηκε ότι στην αµινοτελική περιοχή της rps5 υπάρχει µία ακολουθία (MTEWEAATPAVAETPDIK---) στα 18 πρώτα αµινοξέα που µπορεί να αποτελεί σήµα PEST. H τιµή για την συγκεκριµένη πρωτεΐνη ήταν 2.5, που αποτελεί ασθενές PEST σήµα. Σύµφωνα µε το πρόγραµµα αυτό, τιµές άνω του µηδενός υποδηλώνουν την πιθανή ύπαρξη µιας PEST περιοχής, µε ενδεχόµενη ενδοκυτταρική λειτουργία.

30 EIKONA 2.7 : Σχηµατική αναπαράσταση της Ν-τελικής περιοχής (αµινοξέα 1-50), η οποία περιλαµβάνει το σήµα πυρηνικού εντοπισµού (NLS) και την ακολουθία PEST. Ο συσχετισµός της παρατηρούµενης πρωτεόλυσης της rps5 δεν έχει συσχετισθεί ακόµη µε φωσφορυλίωση, η οποία ενεργοποιεί την PEST ακολουθία και αναµένεται να αποσαφηνιστεί στο µέλλον.

31 2.6 ΕΝ ΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΕΝΤΟΠΙΣΗ ΤΗΣ rps5 Η ριβοσωµική πρωτεΐνη S5 εντοπίζεται κυρίως στους πυρηνίσκους των κυττάρων και λιγότερο στο κυτταρόπλασµα σύµφωνα µε προηγούµενες µελέτες µε πειράµατα ανοσοφθορισµού, ανοσοανίχνευσης, έµµεσου φθορισµού µε µικροσκοπία συνεστίασης και άλλες βιοχηµικές µεθόδους. Συγκεκριµένα στους πυρηνίσκους η rps5 καλύπτει την ινώδη, αλλά και την κοκκιώδη περιοχή, σύµφωνα µε πειράµατα που έγιναν µε συνδιαµόλυνση HeLa κυττάρων µε ανασυνδυασµένους φορείς pegfpfibrillarin και pcdna3.1-rps5. Η fibrillarin είναι θετικός µάρτυρας για την ινώδη υποπεριοχή του πυρηνίσκου και όχι για την κοκκιώδη ( Matragkou et al., 2009) Πειράµατα ανοσοφθορισµού (Matragkou et al., 2009) έδειξαν ότι όταν λείπουν τα πρώτα 37 αµινοξέα από την rps5, η πρωτεΐνη εντοπίζεται παντού στον πυρήνα, όχι όµως στο κυτταρόπλασµα σε αντίθεση µε την ολόκληρη rps5. Το εύρηµα αυτό παραπέµπει σε µία πιθανή εµπλοκή των 37 πρώτων αµινοξέων στην ενδοκυτταρική εντόπιση της πρωτεΐνης. Επιπλέον έχει βρεθεί ότι στην περιοχή των 37 πρώτων αµινοξέων υπάρχουν πιθανές θέσεις φωσφορυλίωσης από την κινάση της καζεΐνης ΙΙ, αλλά και από άλλες κινάσες. Στην επόµενη σελίδα φαίνεται η ενδοκυτταρική εντόπιση της συζευγµένης rps5 µε GFP µε µικροσκοπία φθορισµού (confocal microscopy).

32 Α) Β) Γ) Δ) EIKONA 2.8 : A) Εντοπισμός της ολικής ριβοσωμικής πρωτεΐνης S5 συζευγμένη με GFP. Β) GFP-rpS5 (περιοχή 1-37 αμινοξέα). Γ) GFP-rpS5 ( περιοχή 1-50). Δ) GFP-rpS5 (περιοχή )

33 2.7 ΕΝ ΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΤΗΣ rps5 Όπως έχει προαναφερθεί οι ριβοσωµικές πρωτεΐνες συντίθενται στο κυτταρόπλασµα και διαπερνούν τους πυρηνικούς πόρους ώστε να εισέλθουν στον πυρήνα και να καταλήξουν στον πυρηνίσκο, όπου συνδέονται µε τα νεοσυντιθέµενα rrnas για τη συγκρότηση των ριβοσωµικών υποµονάδων. Η rps5 αποτελεί µία από τις πρόδροµες πρωτεΐνες που συµµετέχουν στην πυρηνική επεξεργασία του pre-rrna και συνδέεται µε το 18S rrna προκειµένου να αρχίσει η συγκρότηση της µικρής υποµονάδας του ευκαρυωτικού ριβοσώµατος. Η µεταφορά της rps5 από το κυτταρόπλασµα στους πυρήνες γίνεται µε έναν ακόµη άγνωστο µηχανισµό χρησιµοποιώντας σίγουρα όµως την αµινοτελική περιοχή Προηγούµενες µελέτες του εργαστηρίου µας είχαν ως αντικείµενο τη µεταφορά της rps5 από τον πυρήνα στους πυρηνίσκους. Σύµφωνα µε τους Matragkou και συνεργάτες, η Ser-24 είναι απαραίτητη για την είσοδο της πρωτεΐνης στους πυρηνίσκους και πιθανόν η Ser-34 είναι απαραίτητη για µια γενικότερη διευθέτηση του εντοπισµού της πρωτεΐνης στα ενδοκυτταρικά διαµερίσµατα, γεγονός που απαιτεί περαιτέρω διερεύνηση. Για τη µετακίνηση των ριβοσωµικών πρωτεΐνών από το κυτταρόπλασµα στους πυρήνες έχει αναφερθεί ότι απαιτείται συνέργια δοµικών στοιχείων της αµινοτελικής και καρβοξυτελικής περιοχής. Στην περίπτωση της rps5 έχει βρεθεί ότι η αµινοτελική περιοχή της (Ser-24) συνεργάζεται µε την καρβοξυτελική περιοχή της (Thr-133), για να πραγµατοποιηθεί η εισαγωγή της πρωτεΐνης στους πυρηνίσκους. Συγκεντρωτικά η rps5 µεταφέρεται από το κυτταρόπλασµα στους πυρήνες µε τον βρόγχο 38-50, ο οποίος λειτουργεί ως σήµα εισόδου στον πυρήνα (NLS) και µετέπειτα για τη µεταφορά της στους πυρηνίσκους συνεργάζεται η αµινοτελική περιοχή µε την καρβοξυτελική της περιοχή ως εξής : H Thr-133 φωσφορυλιώνεται από την PKC και η φωσφορυλίωση της πυροδοτεί την φωσφορυλίωση της Ser-24 από την κινάση CK II και πραγµατοποιείται έτσι η µεταφορά της στους πυρηνίσκους.

34 2.8 ΓΕΝΙΚΑ ΓΙΑ ΤΟΥΣ ΙΝΟΒΛΑΣΤΕΣ Οι ινοβλάστες αποτελούν τον πιο συνηθισµένο τύπο κυττάρων στο ανθρώπινο σώµα και θεωρούνται σηµαντικά δοµικά στοιχεία των ιστών. Εκτός από τη δοµική στήριξη που προσφέρουν στους ιστούς, µπορούν να επιτελέσουν και διάφορες άλλες λειτουργίες. Μπορούν να παίξουν σηµαντικό ρόλο ως ανοσορυθµιστικά κύτταρα που έχουν τη δυνατότητα να αρχίσουν ή να επηρεάσουν ανοσολογικές αποκρίσεις, αφού εκκρίνουν κυτοκίνες (cytokines) και χυµοκίνες (chemokines), οι οποίες έλκουν φλεγµονώδη κύτταρα και ανοσολογικά κύτταρα. Ινοβλάστες από διαφορετικές ανατοµικές τοποθεσίες εµφανίζουν κοινά φαινοτυπικά χαρακτηριστικά και είναι ικανοί να εκκρίνουν πολλά ρυθµιστικά µόρια, όπως κυτοκίνες, αυξητικούς παράγοντες, χυµοκίνες, αντιγόνα κυτταρικών επιφανειών, µόρια προσκόλλησης και ουσίες µικρού µοριακού βάρους. Το γεγονός αυτό τους επιτρέπει να επηρεάζουν το µικροπεριβάλλον τους και να αποκρίνονται σε περιβαλλοντικά ερεθίσµατα µε ποικίλους τρόπους. Στους ενήλικες οι ινοβλάστες εκκρίνουν ενεργά κολλαγόνο. Συνθέτουν όλες τις πρωτεΐνες των ινών του συνδετικού ιστού, τις δοµικές γλυκοπρωτεΐνες και τις πρωτεογλυκάνες της θεµέλιας ουσίας και µε αυτόν τον τρόπο ελέγχουν τη σύσταση αλλά και τη διατήρηση της ακεραιότητας της. Παρ όλες τις φαινοτυπικές οµοιότητες που διαθέτουν οι ινοβλάστες από διαφορετικούς ιστούς, κάθε υποπληθυσµός έχει διακριτά χαρακτηριστικά που τον ξεχωρίζει από τους υπόλοιπους. Εξειδικευµένοι ινοβλάστες που παρουσιάζουν µορφολογικά και βιοχηµικά χαρακτηριστικά παρόµοια µε αυτά των λείων µυϊκών κυττάρων ονοµάζονται µυοϊνοβλάστες (myofibroblasts). Οι ινοβλάστες των όγκων είναι γνωστό ότι εµφανίζουν διακριτά προφίλ έκφρασης και επίσης κατέχουν διαφορετικά αγγειογενετικές και καρκινογενετικές ιδιότητες. Η γενική µορφολογική εικόνα που παρουσιάζουν είναι ότι έχουν σχήµα ατρακτοειδές ή αστεροειδές και από το κυτταρικό σώµα προεκβάλλουν κοντές διακλαδιζόµενες αποφυάδες. Ο πυρήνας τους είναι µεγάλος και ωοειδής και η χρωµατίνη του

35 συγκεντρώνεται σε περιφερικά αθροίσµατα κάτω από την πυρηνική µεµβράνη. Το κυτταρόπλασµα είναι βασεόφιλο και περιέχει οργανίδια που συµµετέχουν στην πρωτεϊνοσύνθεση. Οι ενεργοποιηµένες ινοβλάστες ανιχνεύονται κατά την επούλωση τραυµάτων, έχουν µεγάλο υποστρόγγυλο πυρήνα µε εµφανές πυρήνιο, άφθονο κυτταρόπλασµα και µεγάλες επιµήκεις κυτταροπλασµατικές αποφυάδες. Στον λεµφικό ιστό και τον µυελό των οστών, όταν οι ινοβλάστες σχηµατίζουν τις δικτυωτές ίνες λαµβάνουν αστεροειδές σχήµα µε πολλές διακλαδώσεις και ονοµάζονται δικτυωτά κύτταρα. Στην συγκεκριµένη εργασία χρησιµοποιήθηκαν καλλιέργειες φυσιολογικών ινοβλαστών, ώστε να αποµονωθεί η rps5 σε διαφορετικές φάσεις ανάπτυξης τους και να διαπιστωθεί η ύπαρξη ή µη πρωτεόλυσης της πρωτεΐνης.

36 3 ΣΚΟΠΟΣ Οι ριβοσωµικές πρωτεΐνες, τα τελευταία χρόνια, αποτελούν ενδιαφέρον αντικείµενο µελέτης διότι συµµετέχουν στη διαδικασία της µετάφρασης, αλλά και σε διάφορες λειτουργίες που δεν σχετίζονται µε αυτήν. Η πρωτεόλυση των ριβοσωµικών πρωτεϊνών µπορεί να εµπλέκεται στις µη ριβοσωµικές λειτουργίες τους και αποτελεί ενδιαφέρον αντικείµενο µελέτης. Από προηγούµενες µελέτες είχαν αναφερθεί διάφορες πρωτεολυµένες µορφές της ριβοσωµικής πρωτεΐνης S5 και υπήρχαν ενδείξεις από προηγούµενα ευρήµατα του εργαστηρίου µας ότι η συγκεκριµένη πρωτεΐνη πρωτεολύεται σε συγκεκριµένη φάση ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων (στατική φάση), γεγονός που υποδεικνύει ότι σχετίζεται µε τον κυτταρικό κύκλο. Ο σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η µελέτη της πρωτεόλυσης της ριβοσωµικής πρωτεΐνης S5 σε φυσιολογικά κύτταρα. Συγκεκριµένα έγιναν προσπάθειες να διευκρινιστεί αν η πρωτεόλυση της rps5 σχετίζεται µε την λογαριθµική ή στατική φάση των φυσιολογικών κυττάρων και σε ποιο κυτταρικό διαµέρισµα λαµβάνει χώρα. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιήθηκαν πρωτεϊνικά εκχυλίσµατα φυσιολογικών ινοβλαστών από διάφορες φάσεις ανάπτυξης τους. Η αποµόνωση των πρωτεϊνικών εκχυλισµάτων πραγµατοποιήθηκε ξεχωριστά για το πυρηνικό και το κυτταροπλασµατικό διαµέρισµα των ινοβλαστών, ώστε να διαπιστωθεί σε ποιο µέρος ακριβώς πραγµατοποιείται η πρωτεόλυση.

37 4 ΥΛΙΚΑ ΜΕΘΟΔΟΙ 4.1 ΥΛΙΚΑ ΒΙΟΛΟΓΙΚΑ ΥΛΙΚΑ Για τις ανάγκες των πειραµάτων της συγκεκριµένης εργασίας χρησιµοποίηθηκαν ανθρώπινα κύτταρα ινοβλάστες που είχαν αποµονωθεί από δέρµα ή πνεύµονα ενήλικα. Η παραχώρηση των κυττάρων έγινε από τον κ. Κλέτσα του ινστιτούτου βιολογίας του εθνικού κέντρου φυσικών επιστηµών «ΗΜΟΚΡΙΤΟΣ» που εδρεύει στην Αθήνα ΥΛΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΙΚΩΝ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΩΝ Για τη διεξαγωγή των κυτταρικών καλλιεργειών χρησιµοποιήθηκαν τα ακόλουθα υλικά και αντιδραστήρια: Καλλιεργητικό υλικό DMEM 1Χ, (Dulbeccos Modified Eagle Medium) µε L- γλουταµίνη, (Gibco BRL, U.S.A, ) Μίγµα αντιβιοτικών πενικιλίνης,στρεπτοµυκίνης και Βόειος εµβρυϊκός ορός (Fetal Bovine Serum- E.U approved Gibco BRL, ) ιάλυµα Trypan Blue 0.4% (Sigma-Aldrich, Inc, Saint Louis Missouri, U.S.A, T8154) Ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικών (PBS 10X ph=7.2, Gibco BRL, ). Trypsin-EDTA (Gibco) Όλα τα αναλώσιµα των κυτταρικών καλλιεργειών (π.x. πιάτα καλλιέργειας, φλάσκες, πιάτα πολλαπλών πηγαδιών, σωλήνες φυγοκέντρησης, πιπέτες, αντικειµενοφόρες πλάκες κ.α), προµηθεύτηκαν από τις εταιρίες εταιρίες Corning (Inc, N.Y, U.S.A) και VWR Int. (Inc, West Chester,U.S.A).

38 4.1.3 ΧΗΜΙΚΑ ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΑ Οι µεµβράνες νιτροκυτταρίνης ήταν της εταιρείας Schleicher & Schuell, (Dassel, Germany) και οι µεµβράνες PVDF, (Polyvinylidene difluoride-immobilon) της εταιρείας Millipore, (Bedford, U.S.A.). Τα χηµικά αντιδραστήρια που χρησιµοποιήθηκαν προµηθεύτηκαν από τους οίκους Merck (Darmstadt, Germany), Sigma-Aldrich (St.Louis, USA), Serva (Heidelberg, Germany), Riedel de Haen (Hannover, Germany). Το διάλυµα λύσης των κυττάρων για την αποµόνωση ολικού πρωτεϊνικού εκχυλίσµατος ήταν RIPA buffer από την εταιρία Sigma - Aldrich (Product number R0278) ΕΝΖΥΜΑ ΚΑΙ ΥΛΙΚΑ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Τo πρώτo αντίσωµα που χρησιµοποιήθηκε ήταν πολυκλωνικό ενάντια της καρβοξυτελικής περιοχής της rps5 µε τη µέθοδο του Western blot και ήταν ευγενική προσφορά του Dr.Fukushi και των συνεργατών του. Επίσης χρησιµοποιήθηκε και µονοκλωνικό αντίσωµα ενάντια στην καρβοξυτελική περιοχή της rps5 της εταιρίας Abcam (ab58345). Τα δεύτερα αντισώµατα που χρησιµοποιήθηκαν για Western blot ανάλυση ήταν rabbit anti-mouse και goat anti-rabbit της εταιρείας Chemicon International Inc., (Temecula, CA USA). Τα αντισώµατα αυτά ήταν συζευγµένα µε αλκαλική φωσφατάση, ώστε να δίνουν τη χαρακτηριστική χρωµοαντίδραση.

39 4.2 ΜΕΘΟ ΟΙ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΙΝΟΒΛΑΣΤΩΝ Τα αρχικά κύτταρα ινοβλαστών αποµονώθηκαν από το εργαστήριο του κ. Κλέτσα του ινστιτούτου βιολογίας του «ΕΚΕΦΕ ΗΜΟΚΡΙΤΟΣ». Τα κύτταρα αυτά έχουν τη δυνατότητα να προσκολλώνται στην επιφάνεια των τρυβλίων ανάπτυξης, οπότε δίνουν κυτταροκαλλιέργειες προσκόλλησης (adhesion cultures). Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε κυτταροκαλλιέργειες προσκόλλησης σε θρεπτικό υγρό DMEM (Dulbeco s Modified eagle medium) που περιείχε 10% v/v ορό εµβρύου µόσχου, (fetal bovine serum, FBS), καθώς και µίγµα αντιβιοτικών 100 µg/ml βένζυλο πενικικιλλίνης και 100µg/ml στρεπτοµυκίνης που αναστέλλει την ανάπτυξη µυκήτων και µικροβίων. Η ανάπτυξη έγινε σε κατάλληλο επωαστήρα, (water-jacketed incubator της Forma Scientific, Inc., U.S.A.) στους 37 ο C µε ατµόσφαιρα κορεσµένη µε υδρατµούς και µε σταθερή παροχή 5% CO 2. Η ανακαλλιέργεια των κυττάρων γινόταν ως εξής : 1. Αφαίρεση του θρεπτικού υλικού από το τρυβλίο 2. Πλυσίµατα µε PBS 1X 3. Προσθήκη 1 ml Trypsin-EDTA στο τρυβλίο και επώαση τους 37 ο C για πέντε λεπτά, για να αποκολληθούν από τον πάτο τα κύτταρα. 4. Συλλογή των κυττάρων και φυγοκέντρηση τους για τρία λεπτά στις 1100 στροφές. 5. Αφαίρεση του υπερκείµενου και ανασύσταση του ιζήµατος σε θρεπτικό υλικό 6. Σε νέα τρυβλία µε 10 ml θρεπτικού υλικού προστίθενται το µείγµα κυττάρων. Η συλλογή των κυττάρων γινόταν σε συγκεκριµένες φάσεις (µετά από 48, 72 και 96 ώρες). Ο προσδιορισµός του αριθµού των ινοβλαστών γινόταν µε την προσθήκη 10 µl Trypan blue και 10 µl κύτταρα σε πλάκα ειδική για το κυτταρόµετρο Countess TM automated cell counter της invitrogen. Η µέτρηση γινόταν αυτόµατα.

40 4.2.2 ΙΑΤΗΡΗΣΗ ΑΠΟΨΥΞΗ ΙΝΟΒΛΑΣΤΩΝ 1. Για διατήρηση στους -80 ο C : Μετά την προετοιµασία και την τοποθέτηση τους στα ειδικά φιαλίδια τοποθετούνται Α) Στους -20 ο C για 1 ώρα Β) Στους -80 ο C για 12 ώρες (overnight) και στη συνέχεια στο υγρό άζωτο 2. Απόψυξη (από το υγρό άζωτο) : Σε ένα φάλκον προσθέτουµε 10 ml DMEM (+PS+FBS) και σε ένα τρυβλίο επίσης 10 ml και τα µεταφέρουµε στον incubator για περίπου (Να αποκτήσει 37 ο C!). Τα κύτταρα τοποθετούνται κατευθείαν αµέσως µετά το υγρό άζωτο στο φάλκον ( περνούν από τους -50 ο C 0 ο C γρήγορα και έτσι δεν σχηµατίζονται κρύσταλλοι οι οποίοι θα µπορούσαν να καταστρέψουν τις κυτταρικές µεµβράνες). Στη συνέχεια γίνεται µια σύντοµη φυγοκέντρηση ( rpm) για δύο λεπτά, αποχύνεται προσεχτικά η υπερκείµενη στοιβάδα και προστίθενται 500 µl θρεπτικού υλικού (37 ο C), ανακινούνται προσεκτικά και µεταφέρονται σε τρυβλίο που περιέχει 10 ml θρεπτικού υλικού.

41 4.2.3 ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΟΛΙΚΟΥ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΟΥ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΟΣ ΑΠΟ ΙΝΟΒΛΑΣΤΕΣ ΜΕ ΧΡΗΣΗ RIPA BUFFER Αρχικά αφαιρέθηκε το θρεπτικό υλικό από τα τρυβλία ανάπτυξης των κυττάρων και έγιναν πλυσίµατα µε PBS 1X περίπου δύο ή τρεις φορές. Μετά από την αφαίρεση του διαλύµατος πλύσης από τα πιάτα καλλιέργειας, προστέθηκε ένας κατάλληλος όγκος του διαλύµατος RIPA ( 1 ml για 0,5 µε 5 Χ 107 κύτταρα). Ακολούθησε επώαση των πιάτων σε πάγο για πέντε λεπτά. Με τη βοήθεια µίας σπάτουλας (cell scraper) αφαιρέθηκαν τα λυµένα κύτταρα από το πιάτο και το διάλυµα µεταφέρθηκε σε σωληνάκι (tube) στον πάγο. Στη συνέχεια πραγµατοποιήθηκε φυγοκέντρηση του διαλύµατος για 10 λεπτά στις 8000 x g και το υπερκείµενο που περιείχε το πρωτεϊνικό εκχύλισµα µεταφέρθηκε σε άλλο σωληνάκι, το οποίο χρησιµοποιήθηκε αργότερα για ανοσοανίχνευση.

42 4.2.4 ΥΠΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΚΛΑΣΜΑΤΩΣΗ ΤΩΝ ΙΝΟΒΛΑΣΤΩΝ Μετά τη συλλογή και πλύση 1 Χ 10 6 κυττάρων µε ισότονο διάλυµα PBS, αυτά φυγοκεντρήθηκαν και στη συνέχεια αιωρήθηκαν σε 100 µl διαλύµατος Α (20 mm Hepes-KOH ph 7.5, 100 mm KCl, 5% σουκρόζη, 1 mm DTT). Στη συνέχεια, προστέθηκε σε αυτά ίσος όγκος διαλύµατος Α, στο οποίο όµως είχε προστεθεί 0,8% (v/v) από το µη ιονικό απορρυπαντικό NP-40 (τελική περιεκτικότητα σε ΝΡ-40 0,4%) και τα κύτταρα παρέµειναν για 10 λεπτά στον πάγο. Η προσθήκη του απορρυπαντικού έγινε προκειµένου να σπάσουν οι κυτταροπλασµατικές µεµβράνες των κυττάρων χωρίς να σπάσουν όµως οι πυρηνικές. Στη συνέχεια το αιώρηµα φυγοκεντρήθηκε για 10 λεπτά στα 4300 x g και το υπερκείµενο αποτέλεσε το διαλυτό κλάσµα του κυτταροπλάσµατος. Το ίζηµα, αφού επαναιωρήθηκε σε 100 µl διαλύµατος Α, επιστοιβάχθηκε σε µαξιλάρι σουκρόζης (1.2 ml διάλυµα A µε 0,8 Μ σουκρόζη) και φυγοκεντρήθηκε για 10 λεπτά στα 4300 x g ώστε να παραληφθούν καθαροί πυρήνες. Οι πυρήνες πλύθηκαν µε PBS και εκχυλίστηκαν για 5 min στον πάγο µε 100 µl διαλύµατος EB (10 mm PIPES ph 6.8, 250 mm (NH 4 ) 2 SO 4, 300 mm σουκρόζη, 3 mm MgCl 2 και αναστολείς πρωτεασών 1 mm PMSF. Η εκχύλιση αυτή είχε ως αποτέλεσµα το σπάσιµο της πυρηνικής µεµβράνης και την αποµάκρυνση των διαλυτών στοιχείων του πυρήνα. Ακολούθησε φυγοκέντρηση για 5 min στα 4300 x g. Το υπερκείµενο αυτό αποτέλεσε το κλάσµα του διαλυτού νουκλεοπλάσµατος.

43 4.2.5 ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΣΕ ΠΗΚΤΕΣ ΠΟΛΥΑΚΡΥΛΑΜΙ ΙΟΥ Τα πρωτεϊνικά µόρια, όπως κάθε άλλο φορτισµένο σωµατίδιο, µετακινούνται κάτω από την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου. Το φαινόµενο αυτό ονοµάζεται ηλεκτροφόρηση. Η ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών εφαρµόστηκε από τον Tiselius το 1937 και έκτοτε χρησιµοποιείται ευρύτατα. Οι πρωτεΐνες, ως φορτισµένα σωµατίδια, έχουν την ιδιότητα να διαχωρίζονται καθώς κινούνται δια µέσου των πόρων µιας πηκτής, υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου. Η διεύθυνση της κινήσεως των µορίων προς το θετικό ή αρνητικό πόλο εξαρτάται από το καθαρό φορτίο της πρωτεΐνης. Η ταχύτητα µε την οποία κινούνται οι πρωτεΐνες στην πηκτή, (v), εξαρτάται από τη διαφορά δυναµικού του ηλεκτρικού πεδίου, (Ε) και από το καθαρό φορτίο της πρωτεΐνης, (q), σχέση που δίνεται από την ακόλουθη εξίσωση: v= E q f όπου f είναι παράγοντας της εξίσωσης που εκφράζει την εξάρτηση από τη µάζα και το σχήµα της πρωτεΐνης, όπως επίσης και το ιξώδες της πηκτής όπου κινείται η πρωτεΐνη. Το πολυακρυλαµίδιο, που χρησιµοποιείται συνήθως για τις ηλεκτροφορήσεις πρωτεϊνών, παρουσιάζει αρκετά πλεονεκτήµατα, όπως είναι η χηµική αδράνεια, η αντοχή σε υψηλή θερµοκρασία, και τα αποτελέσµατα των ηλεκτροφορήσεων µε πολυακρυλαµίδιο είναι επαναλήψιµα. Η δηµιουργία των πηκτών πολυακρυλαµιδίου επιτυγχάνεται µε τον πολυµερισµό του ακρυλαµιδίου, (CH 2 =CH-CO-NH 2 ), και του Ν,Ν-µεθυλενο-δις-ακρυλαµιδίου, (bis-ακρυλαµιδίου) (CH 2 =CH-CO-NH-CH 2 -NH- CO-CH=CH 2 ). Η αναλογία µε την οποία χρησιµοποιούνται τα δυο υλικά είναι 30:1 w/w. Το bis-ακρυλαµίδιο, συντελεί στο σχηµατισµό γεφυρών µεταξύ των αλυσίδων των πολυµερών του ακρυλαµιδίου. Κατ αυτόν τον τρόπο, δηµιουργείται ένα τριδιάστατο πολυµερές πλέγµα, το µέγεθος των πόρων του οποίου εξαρτάται από το βαθµό πολυµερισµού και είναι αντιστρόφως ανάλογο της συγκέντρωσης των µονοµερών του ακρυλαµιδίου. Ο πολυµερισµός πραγµατοποιείται µε το µηχανισµό των ελευθέρων ριζών. Σαν δότης των ελευθέρων ριζών χρησιµοποιείται το υπερθειϊκό αµµώνιο, (Ammonium PerSulfate, APS, (NH 4 ) 2 S 2 O 8 ). Στη συνέχεια προστίθεται ο

44 φωτοχηµικός καταλύτης Ν,Ν,-τετραµεθυλοαιθυλενοδιαµίνη, (TEMED), ο οποίος αποσυνθέτει το υπερθειϊκό ιόν και δίνει µια ελεύθερη ρίζα, (S 2 O e - SO SO4 -. ), η οποία διαδίδεται σε άλλα µόρια ακρυλαµιδίου προς σχηµατισµό του πολυµερούς. Η ηλεκτροφόρηση γίνεται απουσία ή παρουσία µετουσιωτικών παραγόντων, όπως είναι το ανιονικό απορρυπαντικό SDS, (µετά νατρίου άλας του θειικού δωδεκυλίου), ή η ουρία. Στην πρώτη περίπτωση οι πρωτεΐνες διατηρούν τις ανώτερες διαµορφώσεις τους και παραµένουν ενεργές, ενώ στην περίπτωση προσθήκης µετουσιωτικών παραγόντων, οι πρωτεΐνες αποδιατάσσονται και λαµβάνουν τυχαία διαµόρφωση. Επίσης, η ηλεκτροφόρηση µπορεί να γίνει παρουσία ή απουσία αναγωγικών, όπως είναι η β-µερκαπτοαιθανόλη και το DTT (διθειοθρεϊτόλη) (Stern et al., 1993). Τα αναγωγικά ανάγουν τις σουλφυδριλικές οµάδες των κυστεϊνών και καταστρέφουν τις δισουλφιδικές γέφυρες. Το σύστηµα της ηλεκτροφόρησης µπορεί να είναι συνεχές ή ασυνεχές. Στο συνεχές σύστηµα, χρησιµοποιείται το ίδιο ρυθµιστικό διάλυµα τόσο στην πηκτή, όσο και στα δοχεία των ηλεκτροδίων. Στο ασυνεχές σύστηµα, χρησιµοποιούνται δύο διαφορετικές πηκτές: η πηκτή επιστοίβαξης, όπου γίνεται συµπύκνωση των πρωτεϊνών του δείγµατος σε µια λεπτή στοιβάδα, (χαµηλή συγκέντρωση ακρυλαµιδίου, ph ~7), και η πηκτή διαχωρισµού, όπου οι πρωτεΐνες διαχωρίζονται σε λεπτές ζώνες, ανάλογα µε το µοριακό τους µέγεθος, (υψηλή συγκέντρωση ακρυλαµιδίου, ph ~9). Το διάλυµα ηλεκτροδίων διαφέρει από τα δυο προηγούµενα, (Andrews, 1968).

45 4.2.6 ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΚΑΤΩ ΑΠΟ ΜΕΤΟΥΣΙΩΤΙΚΕΣ (SDS-PAGE ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ) Η αρχή της µεθόδου αυτής στηρίζεται στο διαχωρισµό των πρωτεϊνών ανάλογα µε το µοριακό τους µέγεθος. Το ηλεκτρικό φορτίο των πρωτεϊνών συνήθως δεν είναι µεγάλο και το σχήµα τους ποικίλει, εποµένως είναι πολύ δύσκολο να προβλεφτεί η κίνηση τους στο ηλεκτρικό πεδίο. Για να απλοποιηθεί η ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών και για να είναι η κίνηση τους ανάλογη µε το µοριακό τους βάρος χρησιµοποιείται ως αποδιατακτικό µέσο το ανιονικό τασιενεργό απορρυπαντικό SDS, (µετά νατρίου άλας του θειικού δωδεκυλίου) το οποίο σε ουδέτερες τιµές ph είναι αρνητικά φορτισµένο. Το SDS δεσµεύεται στις πρωτεΐνες µε υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις και τις αποδιατάσσει, µε αποτέλεσµα όλες οι πρωτεΐνες να αποκτούν αρνητικό ηλεκτρικό φορτίο άσχετα µε το δικό τους αρχικό φορτίο. Η δέσµευση του SDS στα αµινοξέα της πρωτεΐνης οδηγεί στην καταστροφή της φυσικής δοµής της πρωτεΐνης η οποία παίρνει την µορφή ελάσµατος. Έτσι, δηµιουργούνται επιµήκη µόρια, αρνητικά φορτισµένα, µε σαφή και καθορισµένη δοµή. Το ποσό του SDS που δεσµεύεται είναι αρκετά σταθερό, (1.4g SDS/g πρωτ.). Επειδή το φορτίο ανά µονάδα µάζας είναι περίπου σταθερό και οι υδροδυναµικές ιδιότητες είναι συνάρτηση µόνο του µοριακού µεγέθους, η ηλεκτροφορητική κινητικότητα των πολυπεπτιδικών αλυσίδων, κάτω από αυτές τις συνθήκες, εξαρτάται αποκλειστικά από το µοριακό µέγεθος. Η παραδοχή αυτή δεν ισχύει απόλυτα στις περιπτώσεις πρωτεϊνών που είναι πολύ βασικές ή πολύ όξινες, καθώς και πρωτεϊνών που παρουσιάζουν µεγάλο ποσοστό γλυκοζυλίωσης, Οι πρωτεΐνες αυτές, δεσµεύουν µικρότερα ποσά SDS ανά µονάδα βάρους και έτσι κινούνται πιο αργά στην πηκτή διαχωρισµού µε αποτέλεσµα να παρουσιάζουν φαινόµενο µοριακό βάρος υψηλότερο του πραγµατικού. Όταν µια πρωτεΐνη περιέχει υψηλά ποσοστά του αµινοξέως προλίνη τότε η τιµή του µοριακού βάρους που προκύπτει από την ηλεκτροφόρηση είναι πάντοτε υψηλότερη από την πραγµατική, αυτό οφείλεται στις φυσικοχηµικές ιδιότητες της προλίνης που είναι από τα πλέον υδρόφοβα αµινοξέα.

46 Το σύστηµα που χρησιµοποιείται για το διαχωρισµό των διαφόρων πρωτεϊνικών παρασκευασµάτων, αποτελείται από την πηκτή διαχωρισµού, ύψους 7.5cm και πάχους 1.5mm, καθώς και την πηκτή επιστοίβαξης, όπου οι πρωτεΐνες διανύουν απόσταση 1cm περίπου, πριν εισέλθουν στην πηκτή διαχωρισµού. Οι θέσεις εισαγωγής του κάθε δείγµατος, δηµιουργούνται µε τη βοήθεια πλαστικής οδοντωτής µήτρας, η οποία αφαιρείται προσεκτικά, αφού ολοκληρωθεί ο πολυµερισµός της πηκτής επιστοίβαξης. Η σύσταση των πηκτών διαχωρισµού και επιστοίβαξης είναι η ακόλουθη: Πηκτή επιστοίβαξης (Συνολικός όγκος 5 ml) Ακρυλαµίδιο 5% w/v bis- ακρυλαµίδιο 0.17% w/v SDS 0.50% w/v Tris-HCl ph M APS 0.08% w/v TEMED 0.20% v/v Πηκτή διαχωρισµού (Συνολικός όγκος 10 ml) Ακρυλαµίδιο 12% w/v, 15% w/v, 20% w/v bis-ακρυλαµίδιο 0.4% w/v SDS 0.5% w/v Tris-HCl ph M APS 0.08% w/v TEMED 0.20% v/v Επίσης χρησιµοποιείται διάλυµα ηλεκτροδίων µε την παρακάτω σύσταση: ιάλυµα ηλεκτροδίων ph 8.9 Tris 25mM Γλυκίνη 0.192M SDS 0.1% w/v Τα δείγµατα πριν εισέλθουν στην πηκτή επιστοίβαξης αναµιγνύονται µε το εξής διάλυµα:

47 ιάλυµα διαλυτοποίησης των δειγµάτων SDS 2% w/v Tris-HCl ph mM β- µερκαπτοαιθανόλη 1% v/v Γλυκερόλη 10% v/v Κυανούν της βρωµοφαινόλης 0,02% w/v Το αρχικό διάλυµα των ηλεκτροδίων είναι τέσσερις φορές πυκνότερο, (4x). Τα δείγµατα, πριν την επιστοίβαξή τους θερµαίνονται στους 100 ο C για 5 λεπτά. Με αυτόν τον τρόπο επιτυγχάνεται η πλήρης αποδιάταξη των πρωτεϊνών, καθώς και η δηµιουργία συµπλόκων πρωτεΐνης-sds. Η β-µερκαπτοαιθανόλη προστίθεται για την αναγωγή των δισουλφιδικών δεσµών και το διαχωρισµό των υποµονάδων των πρωτεϊνών, αν υπάρχουν. Απουσία της β-µερκαπτοαιθανόλης δίνει τη δυνατότητα απεικόνισης πρωτεϊνών που αποτελούνται από παραπάνω από µία υποµονάδες. Εφαρµόζεται σταθερή τάση 100V µέχρι το τέλος της ηλεκτροφόρησης. Για την ηλεκτροφόρηση αυτού του τύπου χρησιµοποιήθηκαν οι επίπεδες συσκευές πάχους 1,5mm και µήκους 7.5cm, που κατασκευάστηκαν στο Ινστιτούτο Max-Panck Μοριακής Γενετικής του Βερολίνου. Στα πειράµατα χρησιµοποιήθηκε σύστηµα ασυνεχές (Laemmli, 1970).

48 4.2.7 ΣΤΕΡΕΩΣΗ ΚΑΙ ΒΑΦΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΣΕ ΠΗΚΤΕΣ ΠΟΛΥΑΚΡΥΛΑΜΙ ΙΟΥ Η βαφή των πρωτεϊνών έγινε µε Coommassie Blue: Η αρχή της µεθόδου αυτής στηρίζεται στη δηµιουργία συµπλόκου κυανού χρώµατος, µεταξύ των πρωτεϊνών και της χρωστικής CBB R-250. Τα διαλύµατα που χρησιµοποιούνται έχουν την εξής σύσταση: ιάλυµα χρώσης CBB R-250 Μεθανόλη Οξικό οξύ 0.1% w/v 50% v/v 10% v/v ιάλυµα αποχρωµατισµού Μεθανόλη Οξικό οξύ 50% v/v 10% v/v Προκειµένου να δηµιουργηθεί το σύµπλοκο, η πηκτή εµβαπτίζεται στο διάλυµα χρώσης και αφήνεται για µια ώρα περίπου. Με το διάλυµα αυτό, γίνεται συγχρόνως και στερέωση των πρωτεϊνικών ζωνών στην πηκτή. Ακολούθως, η πηκτή τοποθετείται στο διάλυµα αποχρωµατισµού και ανακινείται για αρκετές ώρες. Με τη µέθοδο αυτή είναι δυνατή η ανίχνευση µέχρι και 0.1µg πρωτεΐνης.

49 4.2.8 ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΗ ΜΕΘΟ ΟΣ ΚΑΤΑ BRADFORD, ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΜΕΝΗ ΑΠΟ ΤΟΝ BEARDEN Η αρχή της µεθόδου αυτής στηρίζεται στην ιδιότητα που έχει η χρωστική ουσία Coomasie Brilliant Blue (CBB) G-250 να δεσµεύεται στα µόρια των πρωτεϊνών. Η χρωστική αυτή, όταν βρίσκεται σε ελεύθερη κατάσταση και σε όξινο περιβάλλον, απορροφά στα 465 nm και το χρώµα της είναι καστανό. Η δηµιουργία του συµπλόκου πρωτεΐνης-χρωστικής, έχει ως αποτελέσµα την εµφάνιση κυανού χρώµατος και τη µεταβολή του µεγίστου απορρόφησης στα 595 nm, όπου µετράται φωτοµετρικά. Το αντιδραστήριο Bradford παρασκευάζεται ως εξής : Αντιδραστήριο Bradford CBB G-250 H 3 PO 4 85% 1 mg/ml 200 ml Ακολουθεί ανάδευση ώρες. Στη συνέχεια γίνεται αραίωση του διαλύµατος µε απιονισµένο νερό στο 1 λίτρο. Το αντιδραστήριο είναι φωτοευαίσθητο και για το λόγο αυτό, φυλάσσεται σε σκουρόχρωµη φιάλη. Προκειµένου να προσδιοριστεί η συγκέντρωση των πρωτεϊνών στα δείγµατα, γίνεται ανάµιξη του κάθε δείγµατος, (αραιωµένου στα 2 ml µε απιονισµένο νερό), µε 2 ml αντιδραστηρίου Bradford και ακολουθεί µέτρηση της απορρόφησης στα 595 nm. Ο υπολογισµός της συγκέντρωσης των πρωτεϊνών γίνεται χρησιµοποιώντας πρότυπη καµπύλη αναφοράς µε αλβουµίνη, (BSA) ( Bradford, 1976, Bearden, 1978).

50 4.2.9 ΗΛΕΚΤΡΟΜΕΤΑΦΟΡΑ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΑΠΟ ΠΗΚΤΗ SDS ΣΕ ΜΕΜΒΡΑΝΗ Πρόκειται για µια εξειδικευµένη µέθοδο που επιτρέπει την ανίχνευση των καθηλωµένων πρωτεϊνών µε χρήση κατάλληλων πολυκλωνικών ή µονοκλωνικών αντισωµάτων. Η µεταφορά των πρωτεϊνών, (western blotting), από πηκτή πολυακρυλαµιδίου σε µεµβράνη νιτροκυτταρίνης ή PVDF (Immobilon), βασίζεται στην κίνηση των πρωτεϊνών, από την πηκτή προς τη µεµβράνη. Η κίνηση επιτυγχάνεται µε την εφαρµογή διαφοράς δυναµικού. Οι πρωτεΐνες βρίσκονται µε τη µορφή συµπλόκου µε το SDS, οπότε το σύµπλοκο είναι αρνητικά φορτισµένο. Εποµένως, µε την εφαρµογή ηλεκτρικού πεδίου, το σύµπλοκο κινείται προς την άνοδο, εξέρχεται από την πηκτή και τελικά καθηλώνεται στο πλέγµα της µεµβράνης, εξαιτίας υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων. Επειδή όµως οι πρωτεΐνες που µεταφέρονται από την πηκτή δεν είναι αρκετές για να καλύψουν όλες τις κενές θέσεις της µεµβράνης, µετά την µεταφορά οι κενές θέσεις καλύπτονται µε µία άσχετη πρωτεΐνη, π.x. ορό γάλακτος ή µοσχαριού. Στο επόµενο στάδιο οι πρωτεΐνες που βρίσκονται ακινητοποιηµένες πάνω στην νιτροκυτταρίνη αντιδρούν µε τα ειδικά αντισώµατα και µετά µε τα αντι-αντισώµατα, τα οποία είναι συνδεδεµένα µε ένα ένζυµο, συνήθως υπεροξειδάση ή αλκαλική φωσφατάση. Επίσης, µπορεί να γίνει προσδιορισµός της αµινοτελικής ακολουθίας τους, χρησιµοποιώντας αυτόµατο αναλυτή (για το σκοπό αυτό χρησιµοποιείται αποκλειστικά η µεµβράνη PVDF). Το διάλυµα που χρησιµοποιείται είναι το εξής: ιάλυµα µεταφοράς (transfer buffer) Tris 12.5 mm H 3 BO mm SDS 0.02% w/v DTT 0.5 mm Αναλυτικά η διαδικασία µεταφοράς των πρωτεϊνών σε µεµβράνη έχει ως εξής: Αφού ολοκληρωθεί η ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών σε πηκτή SDS-PAGE, γίνεται εµβάπτιση τόσο της πηκτής, όσο και της µεµβράνης, στο διάλυµα της µεταφοράς, (transfer buffer). Αν χρησιµοποιείται η µεµβράνη PVDF, είναι απαραίτητη η ενεργοποίησή της µε µεθανόλη 100% για ένα λεπτό, πριν την εµβάπτιση στο

51 διάλυµα της µεταφοράς. Στη συσκευή της ηλεκτροµεταφοράς τοποθετείται πρώτα ένα φύλλο Whatmann 3MM, διαβρεγµένο στο πιο πάνω ρυθµιστικό διάλυµα, η µεµβράνη, η πηκτή και τέλος άλλο ένα φύλλο Whatmann. H µεµβράνη τοποθετείται στην πάνω πλευρά της ανόδου και η πηκτή στην πλευρά της καθόδου. ίνεται ιδιαίτερη προσοχή, ώστε η επαφή µεταξύ της πηκτής και της µεµβράνης να είναι άµεση και χωρίς την παρεµβολή φυσαλίδων, που παρεµποδίζουν τη διέλευση του ηλεκτρικού ρεύµατος. Για την συσκευή της εταιρείας Biorad ( Kisker, SD10, 172) η ηλεκτροµεταφορά γίνεται µε ρεύµα σταθερής έντασης 20 ma, για 30 λεπτά στην περίπτωση της ριβοσωµικής πρωτεΐνης rps5 και 30 ma για 50 λεπτά στην περίπτωση της CREB αντίστοιχα.

52 ΑΝΟΣΟΑΝΙΧΝΕΥΣΗ Η ανοσοανίχνευση αποτελεί µια τεχνική, η οποία επιτρέπει τον εντοπισµό µιας πρωτεΐνης που βρίσκεται καθηλωµένη σε µεµβράνη, µε τη βοήθεια πολυκλωνικού ή µονοκλωνικού αντισώµατος. Η αρχή της τεχνικής στηρίζεται ουσιαστικά στην αλληλεπίδραση της καθηλωµένης πρωτεΐνης-αντιγόνου µε το κατάλληλο αντίσωµα. Η αλληλεπίδραση αυτή ανιχνεύεται µε ένα δεύτερο αντίσωµα, το οποίο εκτός του ότι αναγνωρίζει και δεσµεύεται µε τις ανοσοσφαιρίνες IgG του πρώτου αντισώµατος, συζευγνύεται µε ένα ένζυµο-δείκτη το οποίο αντιδρώντας µε το εξωγενώς προστιθέµενο υπόστρωµα, δίνει χαρακτηριστική χρωµοαντίδραση της ζώνης της πρωτεΐνης- αντιγόνου, (παράγραφος Β.2.18). Επίσης, µπορεί να γίνει προσδιορισµός της αµινοτελικής ακολουθίας τους, χρησιµοποιώντας αυτόµατο αναλυτή (για το σκοπό αυτό χρησιµοποιείται αποκλειστικά η µεµβράνη PVDF). Στην προκείµενη εργασία, η τεχνική της ανοσοανίχνευσης χρησιµοποιήθηκε για την ταυτοποίηση της rps5 και της CREB. Τα δεύτερα αντισώµατα έναντι στις ανοσοσφαιρίνες IgG κουνελιού και ποντικιού ήταν συζευγµένο µε αλκαλική φωσφατάση. Χρησιµοποιήθηκαν τα πιο κάτω διαλύµατα: ιάλυµα κορεσµού Γάλα χωρίς λιπαρά 5 % w/v PBS 1X (8.0 gr/l NaCl, 0.2 gr/l KCl, 1.15 gr/l Na 2 HPO 4, 0.2 gr/l KH 2 PO 4) ιάλυµα αλκαλικής φωσφατάσης (AP) Tris-Cl ph mm NaCl 100 mm MgCl 2 5 mm Η µεθοδολογία αναλυτικά έχει ως εξής: Μετά το τέλος της ηλεκτροµεταφοράς, η µεµβράνη νιτροκυτταρίνης ή PVDF εµβαπτίζεται στο διάλυµα κορεσµού και ανακινείται για µια ώρα. Αυτό γίνεται για τον κορεσµό της µεµβράνης, έτσι ώστε οι ελεύθερες υδρόφοβες οµάδες της να µην αλληλεπιδράσουν µε το αντίσωµα. Κατόπιν, η µεµβράνη επωάζεται µε το κατάλληλο

53 αντίσωµα σε καθορισµένη αραίωση, σε 10ml διαλύµατος κορεσµού που αποτελείται από 5% γάλα ή 1% ζελατίνη σε PBS 1Χ (8.0 gr/l NaCl, 0.2 gr/l KCl, 1.15 gr/l Na 2 HPO 4, 0.2 gr/l KH 2 PO 4 ), υπό συνεχή ανακίνηση για 16 ώρες στους 4 C ή για 2 ώρες σε θερµοκρασία δωµατίου. Η αραίωση στην οποία χρησιµοποιούνται τα διάφορα αντισώµατα είναι 1:500 για το µονοκλωνικό αντίσωµα της τοµπουλίνης και 1:1000 για το πολυκλωνικό αντίσωµα έναντι της καρβοξυτελικής περιοχής της rps5. Ακολουθούν τρεις δεκάλεπτες πλύσεις της µεµβράνης µε διάλυµα PBS 1Χ που περιέχει 0.04% v/v Tween-20 και στη συνέχεια, η µεµβράνη επωάζεται µε το δεύτερο αντίσωµα, (αραίωση 1 : 2000), κατάλληλα αραιωµένο σε διάλυµα κορεσµού, για µια ώρα σε θερµοκρασία δωµατίου, υπό συνεχή ανακίνηση. Tα δεύτερα αντίσωµατα που χρησιµοποιήθηκαν ήταν anti-rabbit και anti-mouse. Αφού γίνουν δύο πλύσεις της µεµβράνης των 10 λεπτών µε PBS/Tween-20, εκτελείται η χρωµοαντίδραση µε την αλκαλική φωσφατάση, έως ότου εµφανιστεί η ζώνη της πρωτεΐνης. Η χρωµοαντίδραση επιτυγχάνεται µε την προσθήκη 30 µl BCIP (Bromo-chloro-indolyl phosphate, Sigma)) και 30 µl NBT (Nitro blue tetrazolium, Sigma) σε 10 ml διαλύµατος αλκαλικής φωσφατάσης (100 mm Tris-HCl ph 9.5, 100 mm NaCl, 5 mm MgCl 2 ) υπό ανάδευση σε θερµοκρασία περιβάλλοντος. Η µεµβράνη αφού πλυθεί 2 φορές µε ddh 2 O φυλάσσεται σε σκοτεινό χώρο µέσα σε ddh 2 O που περιέχει και NaN 3, (Harlow and Lane, 1988).

54 5 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 5.1 ΠΡΩΤΕΟΛΥΣΗ ΤΗΣ rps5 Από προηγούµενα αποτελέσµατα έχει βρεθεί ότι η ριβοσωµική πρωτεΐνη πρωτεολύεται στη στατική φάση των κυττάρων MEL (καρκινική σειρά) και HUVEC (φυσιολογικά κύτταρα). Τα πειράµατα που πραγµατοποιήθηκαν στη συγκεκριµένη εργασία αφορούσαν την αποµόνωση κυτταροπλάσµατος και νουκλεοπλάσµατος από φυσιολογικά κύτταρα (ινοβλάστες) και περαιτέρω ανάλυση τους µε τη µέθοδο της ανοσοανίχνευσης (Western blot). Τα πρώτα αντισώµατα που χρησιµοποιήθηκαν για την ανίχνευση της πρωτεΐνης στα υποκυτταρικά κλάσµατα, ήταν ειδικά για µια περιοχή στην καρβοξυτελική πλευρά της rps5 και το ένα ήταν πολυκλωνικό ενώ το άλλο µονοκλωνικό. Τα δεύτερα αντισώµατα που χρησιµοποιήθηκαν ήταν συζευγµένα µε αλκαλικά φωσφατάση, ώστε να δίνουν χρωµοαντίδραση. Το δεύτερο αντίσωµα για το πολυκλωνικό πρώτο αντίσωµα ήταν goat anti-rabbit και για το µονοκλωνικό ήταν rabbit anti-mouse. Η υποκυτταρική κλασµάτωση επιβεβαιώθηκε από την ανοσοανίχνευση της πρωτεΐνης CREB, η οποία βρίσκεται αποκλειστικά στους πυρήνες. Η εµφάνιση ζώνης στο νουκλεόπλασµα και η µη εµφάνιση της στο κυτταρόπλασµα δείχνει ότι η υποκυτταρική κατανοµή ήταν πετυχηµένη. Το πρώτο αντίσωµα που χρησιµοποιήθηκε για την CREB ήταν µονοκλωνικό και το δεύτερο αντίσωµα ήταν rabbit anti-mouse. Τα κύτταρα που χρησιµοποιήθηκαν για τις ανάγκες των πειραµάτων ήταν ινοβλάστες δέρµατος. Η αποµόνωση κυτταροπλάσµατος και νουκλεοπλάσµατος έγινε από αυτά τα κύτταρα σε διάφορες φάσεις ανάπτυξης τους, συγκεκριµένα σε 48, 72 και 96 ώρες καλλιέργειας τους. Η διαδικασία επαναλήφθηκε για να υπάρχει επιβεβαίωση των αποτελεσµάτων. Τα αποτελέσµατα από την ανοσοανίχνευση της rps5 και της CREB στα παραπάνω δείγµατα φαίνονται στις παρακάτω εικόνες.

55 25 kb > 18 kb > ΕΙΚΟΝΑ 5.1 : Ανοσοανίχνευση (Western blot) της ριβοσωµικής πρωτεΐνης rps5 σε κύτταρα ινοβλαστών σε διάφορες φάσεις ανάπτυξης τους. Οι διαδροµές αντιστοιχούν σε: 1: Κυτταρόπλασµα µετά από 48 ώρες. 2: Νουκλεόπλασµα µετά από 48 ώρες. 3: Κυτταρόπλασµα µετά από 72 ώρες. 4: Νουκλεόπλασµα µετά από 72 ώρες. 5: Κυτταρόπλασµα µετά από 96 ώρες. 6: Νουκλεόπλασµα µετά από 96 ώρες. Στην εικόνα φαίνεται ότι στο νουκλεόπλασµα των 72 και 96 ωρών η ριβοσωµική πρωτεΐνη S5 δεν ανιχνεύεται καθόλου, γεγονός που υποδηλώνει ότι µετά τις 72 ώρες καλλιέργειας των ινοβλαστών αρχίζει η αποικοδόµηση της πρωτεΐνης στον πυρήνα. Η σωστή υποκυτταρική κατανοµή φαίνεται από την παρακάτω εικόνα ανοσοανίχνευσης της CREB. 51 kb > 40 kb > ΕΙΚΟΝΑ 5.2 : Ανοσοανίχνευση της CREB στα δείγµατα ινοβλαστών της εικόνας 5.1. Τα νούµερα 1,2,3,4,5,6 αντιστοιχούν στα παραπάνω της rps5.

56 Είναι φανερό από την εικόνα ότι στα κυτταροπλάσµατα των 48, 72 και 96 ωρών δεν ανιχνεύεται η πρωτεΐνη CREB όπως ήταν αναµενόµενο, ενώ στα νουκλεοπλάσµατα των 48, 72 ωρών και 96 ωρών είναι ξεκάθαρη η ύπαρξη της. Το γεγονός αυτό αποδεικνύει ότι η υποκυτταρική κλασµάτωση των ινοβλαστών έγινε µε το σωστό τρόπο. Τα πρώτα αυτά αποτελέσµατα θεωρήθηκε σωστό να επιβεβαιωθούν µε επαναλήψεις της διαδικασίας αποµόνωσης κυτταροπλάσµατος και νουκλεοπλάσµατος από ινοβλάστες στις ίδιες φάσεις ανάπτυξης. Οι εικόνες από τις επαναλήψεις αυτές φαίνονται παρακάτω. 25 kb > 18 kb > ΕΙΚΟΝΑ 5.3 : Ανοσοανίχνευση της rps5 σε κύτταρα ινοβλαστών από διάφορες φάσεις ανάπτυξης τους. Οι διαδροµές είναι: 1: Κυτταρόπλασµα µετά από 48 ώρες. 2: Νουκλεόπλασµα µετά από 48 ώρες. 3: Κυτταρόπλασµα µετά από 72 ώρες. 4: Νουκλεόπλασµα µετά από 72 ώρες. 5: Κυτταρόπλασµα µετά από 96 ώρες. 6: Νουκλεόπλασµα µετά από 96 ώρες. Παρατηρείται το ίδιο φαινόµενο µετά τις 72 ώρες για τη ριβοσωµική πρωτεΐνη rps5.

57 25 kb > 18 kb > ΕΙΚΟΝΑ 5.4 : Ανοσοανίχνευση της rps5 σε κύτταρα ινοβλαστών από διάφορες φάσεις ανάπτυξης τους. Οι διαδροµές είναι: 1: Κυτταρόπλασµα µετά από 48 ώρες. 2: Νουκλεόπλασµα µετά από 48 ώρες. 3: Κυτταρόπλασµα µετά από 72 ώρες. 4: Νουκλεόπλασµα µετά από 72 ώρες. 5: Κυτταρόπλασµα µετά από 96 ώρες. 6: Νουκλεόπλασµα µετά από 96 ώρες. Σε αυτήν την περίπτωση και πάλι είναι φανερό ότι η παρουσία της rps5 δεν ανιχνεύεται στο νουκλεόπλασµα µετά τις 72 ώρες καλλιέργειας. Όλα τα παραπάνω στοιχεία οδηγούν στο συµπέρασµα ότι η πρωτεόλυση της ριβοσωµικής πρωτεΐνης S5 αρχίζει σε συγκεκριµένη φάση ανάπτυξης των κυττάρων, µετά από 72 ώρες, και αρχίζει από το νουκλεόπλασµα. Στο κυτταρόπλασµα σε όλες τις φάσεις ανάπτυξης υπάρχει η rps5 κι όπως φαίνεται στις τελευταίες δύο εικόνες ανοσοανίχνευσης υπάρχει µια ποσοτική µείωση της µε την πάροδο των φάσεων και στο κυτταρόπλασµα των 96 ωρών της εικόνας 5.4 µπορεί να παρατηρηθεί η ύπαρξη διπλής µπάντας πολύ αχνά όµως.