Πανεπιστήμιο Πατρών Σχολή Επιστημών Υγείας Τμήμα Ιατρικής

Transcript

1 Πανεπιστήμιο Πατρών Σχολή Επιστημών Υγείας Τμήμα Ιατρικής Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών «Εφαρμογές στις Βασικές Ιατρικές Επιστήμες» Κατεύθυνση: Μοριακή Γενετική Κυτταρογενετική Διπλωματική εργασία «Ανάλυση με βιοπληροφορικά εργαλεία της πρωτεΐνης Castor και μελέτη της έκφρασης της και των μοριακών αλληλεπιδράσεων της σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα» Πεφάνη Ελευθερία-Δάφνη Δεκέμβριος 2008

2 H παρούσα διπλωματική εργασία έλαβε χώρα στα εργαστήρια Γενικής Βιολογίας του τμήματος Ιατρικής του πανεπιστημίου Πατρών υπό την επίβλεψη της επίκουρης καθηγήτριας Λυγερού Ζωής. Σε αυτό το σημείο θα ήθελα να ευχαριστήσω την επιβλέπουσα καθηγήτρια μου, για την δυνατότητα που μου έδωσε να εργαστώ σε ένα τόσο ενδιαφέρον θέμα. Την ευχαριστώ επίσης για την καθοδήγηση της και τις πολύτιμες συμβουλές της. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω τα μέλη της τριμελούς επιτροπής, κ. Σταύρο Ταραβήρα, για την στενή παρακολούθηση της δουλειάς μου και τις πολύ χρήσιμες παρατηρήσεις και επισημάνσεις του, και τον κ. Ιωάννη Ζαρκάδη, για τις εύστοχες παρατηρήσεις του και την παρακολούθηση της εργασίας αυτής μέσα από τις συναντήσεις του εργαστηρίου Θα ήθελα να ευχαριστήσω επίσης όλα τα μέλη ΔΕΠ του τομέα της Γενικής Βιολογίας για το ενδιαφέρον τους και τα εποικοδομητικά σχόλια και παρατηρήσεις. Τέλος θα ήθελα να ευχαριστήσω όλα τα νεότερα και παλαιότερα μέλη του εργαστηρίου Βασίλη Ρούκο, Μαρία Ηλιού, Χαρούλα Σιρινιάν, Ελεάννα Συμεωνίδου και Παναγιώτη Κωτσαντή και ιδιαιτέρως την Μαρία Δημάκη καθώς και τα μέλη του εργαστηρίου Γενικής Φαρμακολογίας, Πανωραία Κοταντάκη, Μάγδα Σπέλλα, Νικόλα Καραντζέλη, Νάνσυ Σταθοπούλου, Δημήτρη Καραμήτρο και Χριστίνα Κυρούση για την προσφορά της βοήθειας τους όποτε και αν την χρειάστηκα. 2

3 Περιεχόμενα Περίληψη..6-7 Summery Εισαγωγή Ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός και η κυτταρική διαφοροποίηση είναι δύο συντονισμένες διαδικασίες Μόρια ρυθμιστές μεταξύ κυτταρικού πολλαπλασιασμού και κυτταρικής διαφοροποίησης Η σημαντικότητα της παρεμπόδισης του πολλαπλασιασμού σε τελικά διαφοροποιημένα κύτταρα H απόφαση για διαφοροποίηση ή πολλαπλασιασμό εξαρτάται από εξωκυττάρια ερεθίσματα και ενδοκυττάριους παράγοντες του κυτταρικού κύκλου Geminin, ένα μόριο με διττό ρόλο που συντονίζει τον κυτταρικό κύκλο με την διαφοροποιήση κατά την ανάπτυξη Η Geminin στον κυτταρικό κύκλο Η Geminin στη διαφοροποίηση Οι πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις της Geminin καθορίζουν την λειτουργία της Η Geminin σαν ρυθμιστής μεταξύ κυτταρικού πολλαπλασιασμού και κυτταρικής διαφοροποίησης Εύρεση και περιγραφή ενός νέου γενετικού τόπου στο ανθρώπινο γονιδίώμα με σημαντική ομολογία για την περιοχή σπειροειδούς σπειράματος της Geminin Στοιχεία που υποστηρίζουν την έκφραση του γονίδιου του Castor Η πρωτεϊνική αλληλουχία του Castor Στόχος Υλικά και μέθοδοι

4 3.1 Προγράμματα και βάσεις δεδομένων που χρησιμοποιήθηκαν για την βιοπληροφορική ανάλυση του Castor Πρωτοκολλά κυτταροκαλείεργειας και μεθόδων χειρισμού κύτταρων Ξεπάγωμα κυττάρων Αλλαγή θρεπτικού μέσου (100mm dish) Διαχωρισμός κυττάρων (Split) (100mm dish) Συλλογή κυτταρικών εκχυλισμάτων Γονιδιακή αποσιώπηση με τη μέθοδο του RNAi Παροδική διαμόλυνση κυττάρων Διαλύματα και υλικά μεθόδων χειρισμού κυττάρων SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών Καθαρισμός χημικής συγγένειας αντισώματος με τη χρήση πρωτεΐνης ακινητοποιημένης σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης Ανοσοαποτύπωση Western Ανοσοφθορισμός Ανοσοκατακρήμνιση (IP) Πλασμίδια που χρησιμοποιήθηκαν Aποτελέσματα Α Μερος Ανάλυση των καταχωρημένων σε βάσεις δεδομένων ΕSTs και cdnas για την κατασκευή του προφίλ έκφρασης του μορίου Ανάλυση της πρωτεϊνικής αλληλουχίας του Castor και σύγκριση με αυτή της Geminin Εύρεση δομών, μοτίβων και θέσεων πιθανών μεταμεταφραστικών τροποποιήσεων στην πρωτεϊνική αλληλουχία του Castor με πιθανή λειτουργική σημασία Β Μερος Μελέτη των μοριακών αλληλεπιδράσεων της ανθρώπινης πρωτεΐνης Castor με την μέθοδο της συνανοσοκατακρήμνησης Μελέτη και χαρτογράφηση της αλληλεπίδρασης του Castor με την Geminin

5 4.2.2 Mελέτη και χαρτογράφηση της αλληλεπίδρασης της πρωτεΐνης Castor με τον εαυτό του Σύγκριση της αλληλεπίδρασης Geminin-Castor με Castor-Castor Σύνοψη των μοριακών αλληλεπιδράσεων του Castor με την Geminin και τον εαυτό του Ανάπτυξη μοριακών εργαλείων για την μελέτη του Castor Παραγωγή,καθαρισμός και χαρακτηρισμός πολυκλωνικού αντισώματος κατά της ανθρώπινης Castor πρωτεΐνης Παραγωγή πολυκλωνικού αντισώματος κατά της ανθρώπινης πρωτεΐνης Castor Kαθαρισμός πολυκλωνικού αντισώματος έναντι της hcastor Eλεγχος της ειδικότητας του αντισώματος έναντι της hcastor με ανοσοαποτύπωση Western Αποσιώπιση του γονιδίου του Castor σε σταθερά διαμολυσμένη κυτταρική σειρά για τον CastorGFP Έλεγχος της λειτουργικότητας του RNAi για το γονίδιο του Castor με ανάλυση Western Έλεγχος της λειτουργικότητας του RNAi για το γονίδιο του Castor με ανοσοφθορισμο Συζήτηση Βιβλιογραφία

6 Περίληψη Η ισορροπία μεταξύ κυτταρικού πολλαπλασιασμού και κυτταρικής διαφοροποίησης είναι εξέχουσας σημασίας κατά την ανάπτυξη των πολυκύτταρων οργανισμών. Κεντρικοί ρυθμιστές του κυτταρικού κύκλου έχει δειχθεί να συμμετέχουν και σε διαδικασίες κυτταρικής διαφοροποίησης, όπως η οικογένεια των E2F μεταγραφικών παραγόντων, το prb και οι αναστολείς των κυκλινοεξατώμενων κινασών (CKIs). H Geminin είναι μία πρωτεΐνη με διττό ρόλο τόσο στον κυτταρικό κύκλο όσο και στην ανάπτυξη, η οποία έχει προταθεί σαν ένας πιθανός ρυθμιστής αυτών των διαδικασιών. H Geminin εμφανίζει διαφορετικές δράσεις, αλληλεπιδρώντας με ένα σημαντικό αριθμό κυτταρικών παραγόντων. Σε αυτές τις αλληλεπιδράσεις σημαντικό ρόλο παίζει η περιοχή του σπειροειδούς σπειράματος της Geminin. Πρόσφατα, μέσω βιοπληροφορικών αναλύσεων βρέθηκε ένας γενετικός τόπος στο ανθρώπινο γονιδίωμα ο οποίος κωδικοποιεί για μία πρωτεϊνική αλληλουχία με σημαντική ομολογία με το σπειροειδές σπείραμα της Geminin. H πρωτεΐνη αυτή ονομάστηκε Castor. Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν εργαλεία βιοπληροφορικής, για την ανάλυση της πρωτεϊνικής αλληλουχίας του Castor και τη σύγκριση αυτής με την Geminin. Στη συνέχεια, μελετήθηκε με την μέθοδο της ανοσοκατακρήμνισης η αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης Castor με τη Geminin και ο ομοδιμερισμός του Castor και χαρτογραφήθηκαν οι περιοχές που ευθύνονται για τις αλληλεπιδράσεις αυτές.. Ο Castor σχηματίζει σύμπλοκο με την Geminin και η αλληλεπίδραση αυτή απαιτεί το σπειροειδές σπείραμα της Geminin και τα 254 καρβοξυτελικά αμινοξέα του Castor, στα οποία περιέχεται το σπειροειδές σπείραμα του. Τα τελευταία 254 αμινοξέα είναι υπεύθυνα και για τον ομοδιμερισμό του μορίου. Σύγκριση της ισχύος αλληλεπιδράσεων έδειξε ότι η αλληλεπίδραση μεταξύ Castor και Geminin είναι ισχυρότερη από τον ομοδιμερισμό του Castor, αφού η Geminin δύναται να ανταγωνιστεί την πρόσδεση του Castor στον εαυτό του. Τέλος, αναπτύχθηκαν μοριακά εργαλεία απαραίτητα για τη μελέτη του Castor. To πρώτο αφορά την παραγωγή και καθαρισμό πολυκλωνικού αντισώματος κατά αμινοτελικού τμήματος της Castor πρωτεΐνης. Η ειδικότητα του αντισώματος ελέγχθηκε με ανοσοτύπωση Western. To αντίσωμα είναι λειτουργικό αφού αναγνωρίζει την εξωγενή πρωτεΐνη CastorGFP ενώ δεν μπορούν να εξαχθούν ασφαλή συμπεράσματα για την ενδογενή ανθρώπινη πρωτεΐνη. Το δεύτερο αφορά την 6

7 ανάπτυξη της μεθοδολογίας RNAi για την αποσιώπηση του γονιδίου του Castor σε κυτταρικές σειρές. Η λειτουργικότητα του RNAi ελέγχθηκε τόσο σε ανοσοτύπωση Western όσο και σε ανοσοφθορισμό σε σταθερά διαμολυσμένη με CastorGFP κυτταρική σειρά και είναι λειτουργικό. Τα παραπάνω εργαλεία είναι απαραίτητα για μελλοντικές λειτουργικές μελέτες του Castor. Summary Τhe coordination of cellular proliferation and differentiation is of critical importance for the development of multicellular organisms. Cell cycle regulators have been shown to participate in the regulation of these two processes, such as E2F transcriptional factors family, prb and Cdk inhibitors (CKIs). Geminin is a bifunctional protein participating in cell cycle regulation and in developmental processes and has been proposed as a candidate for the regulation of these two processes. Geminin balanced interactions with various binding partners are central to its different function. In these interactions the coiled coil of Geminin plays an important role not only as a binding interface but also maintaining the structural integrity of the molecule. Recently in silico analysis has revealed a new genetic locus in the human genome that codes for a protein with significant homology to the Geminin coiled coil region. This protein is named Castor. In this study, in silico analysis was performed to examine the expression of the molecule by analyzing the available ESTs, sequence analysis of Castor protein and comparison to Geminin structural and functional motifs.. We also studied the molecular interaction between Geminin and Castor and Castror homodimerization. We show that Geminin formes a complex with Castor.The coiled coil of Geminin is required for the interaction. Castor interacts with Geminin through its 254 C-terminal amino acids which include its coiled coil. The 254 C-terminal amino acids are also responsible for the self-association of the molecule. We further wanted to established which interaction, the heterodimerazition with Geminin or Castor homodimerazition is stronger. Geminin interacts stronger with Castor, than Castor with itself since overexpressing Geminin and Castor together results in full binding of Castor to Geminin Finally we developed molecular tools required for the functional study of the molecule. Firstly, a specific polyclonal antibody against the N terimus of Castor was 7

8 produced and then affinity purified. The specificity of the antibody was tested by Western blotting analysis. The antibody recognizes the transfected CastorGFP protein, but no safe conclusion can be drawn for the endogenous protein. Secondly, silencing Castor by RNAi technique for silencing Castor gene in cell lines was set up. The effect of the RNAi was tested by Western blotting and immunofluorescence in CastorGFP stable cell lines. These tools will be required in future studies for investigating the function of Castor. 8

9 1.Εισαγωγή 9

10 1.1 Ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός και η κυτταρική διαφοροποίηση είναι δύο συντονισμένες διαδικασίες Η ανάπτυξη των πολυκύτταρων οργανισμών εξαρτάται από την παραγωγή του κατάλληλου αριθμού κυττάρων μέσω του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και τη σωστή χρονικά απόκτηση εξειδικευμένων κυτταρικών λειτουργιών μέσω της κυτταρικής διαφοροποίησης. Συνήθως η κυτταρική διαφοροποίηση συμβαίνει σταδιακά μετά από κάποιους κύκλους κυτταρικών διαιρέσεων μέχρι το τελικό σημείο της απόκτησης του διαφοροποιημένου κυτταρικού φαινοτύπου. Η απόφαση για κυτταρικό πολλαπλασιασμό ή κυτταρική διαφοροποίηση είναι εν μέρει εξαρτώμενη από εξωκυττάρια σήματα όπως αυξητικοί παράγοντες, μιτογόνα ή μορφογόνα (Wildwater et al., 2007). Aυτές οι δύο διαδικασίες του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της κυτταρικής διαφοροποίησης πρέπει να βρίσκονται σε ισορροπία και να είναι καλά ρυθμισμένες ώστε να προκύψει ο κατάλληλος αριθμός διαφοροποιημένων κυττάρων την κατάλληλη χρονική στιγμή. Εξίσου σημαντική για την σωστή δομή και λειτουργία του ιστού είναι η διατήρηση του διαφοροποιημένου φαινοτύπου με την έξοδο από τον κυτταρικό κύκλο. Αποκλίσεις από αυτή την ισορροπία έχουν θεωρηθεί υπεύθυνες για καταστάσεις καρκινογενεσης. Ο προσδιορισμός λοιπόν μορίων που είναι υπεύθυνα για τη διατήρηση της ισορροπίας πολλαπλασιασμού-διαφοροποίησης είναι σημαντικός. Οι κυκλινοεξαρτώμενες κινάσες αποτελούν Κεντρικό ρυθμιστής του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Οι κυκλινοεξαρτώμενές κινάσες απαρτίζονται από μία καταλυτική υπομονάδα (Cdk), η οποία για να είναι λειτουργική πρέπει να συνδεθεί με μία ρυθμιστική υπομονάδα (κυκλίνη). Η ρύθμιση της ενεργότητας των Cdks, εκτός από την πρόσδεση των κυκλινων επιτυγχάνεται και με άλλους τρόπους, όπως η φωσφορυλίωση και η αποφωσφορυλίωση της κινάσης αλλά και με την πρόσδεση σε αυτές ανασταλτικών παραγόντων (Cyclin Kinase Inhibitors, CKIs) (Morgan, 1997). Υπάρχουν δύο οικογένειες CKIs, η INK4 οικογένεια και η KIP οικογένεια. Τα μέλη της INK4 οικογένειας είναι οι p16 ink4a, p15 ink4b, p18 ink4c και p19 ink4d ενώ μέλη της KIP οικογένειας είναι οι p21 cip1, p27 kip1 και p57 kip2 (Cheng et al., 1999). Η p16 οικογένεια αναστέλλει τις Cdk4 και Cdk6 ενώ η p21 αναστέλλει όλες τις Cdks που εμπλέκονται στην μετάβαση από την G1 φάση στην S φάση του κυτταρικού κύκλου. 10

11 Ένα από τα υποστρώματα των Cdks είναι το προϊόν του γονιδίου του ρετινοβλαστώματος (Retinoblastoma gene product), prb, ένας βασικός αρνητικός ρυθμιστής της μετάβασης του κυτταρικού κύκλου από την G1 στην S φάση. Οι Cdks στοχεύουν το prb φωσφορυλιώνοντας το, με αποτέλεσμα να το απενεργοποιούν και να επιτρέπουν στα κύτταρα να εισέλθουν στην S φάση (Hatakeyama and Weinberg, 1995) Μόρια ρυθμιστές μεταξύ κυτταρικού πολλαπλασιασμού και κυτταρικής διαφοροποίησης Καθώς η μετάβαση από την G1 φάση στην S αποτελεί το βήμα κλειδί για την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, μόρια τα οποία ελέγχουν τη μετάβαση αυτή είναι πιθανό να αποτελούν βασικούς ρυθμιστές της ισορροπίας μεταξύ πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης Οι οικογένεια των Ε2F μεταγραφικών παραγόντων αποτελούν βασικούς ρυθμιστές του κυτταρικού πολλαπλασιασμου Η οικογένεια των E2F μεταγραφικών παραγόντων παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού καθώς είναι υπεύθυνη για τη μεταγραφή γονιδίων που σχετίζονται με την σύνθεση του DNA αλλά και γονιδίων που σχετίζονται με την κυτταρική απόπτωση. H ενεργοποίηση των Ε2F παραγόντων συμβαίνει μετά τον διμερισμό τους με ένα μέλος της οικογένειας των DP παραγόντων Η ρύθμιση των πρωτεϊνών αυτών γίνεται μέσω της οικογένειας των pocket πρωτεϊνων, μέλος της οποίας αποτελεί και το prb. (Stevens and Thangue, 2003). Οι οικογένεια των Ε2F αποτελείται από έξι μέλη, τα οποία σχηματίζουν τρεις υποομάδες με βάση κυρίως την ομοιότητα στην αλληλουχία τους. Οι παράγοντες E2F1, E2F2 και E2F3 αποτελούν την μία υποομάδα καθώς μοιράζονται μία αμινοτελική θέση πρόσδεσης κυκλίνης Α/Cdk και ένα κανονικό σήμα πυρηνικού εντοπισμού (ΝLS) τα οποία απουσιάζουν από την δεύτερη υποομάδα των E2F4 και Ε2F5 παραγόντων, oι οποίοι φέρουν ένα σήμα πυρηνικής εξόδου (NES) (Gaubatz et al, 2001). Οι E2F1, E2F2 και E2F3 ρυθμίζονται κυρίως από το prb, ενώ οι E2F4 και Ε2F5 από τις p107 και p130. O Ε2F6 αποτελεί την τρίτη υποομάδα καθώς δεν 11

12 μοιράζεται κάποια ομολογία με τα άλλα μέλη της οικογένειας με εξαίρεση την περιοχή διμερισμού και στην περιοχή πρόσδεσης στο DNA (Dyson, 2002). Oι E2F1, E2F2 και E2F3 είναι υπεύθυνοι για την ενεργοποίηση γονιδίων που επάγουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Υπερέκφραση οποιουδήποτε από αυτούς τους παράγοντες είναι επαρκής για να προκαλέσει την είσοδο κυττάρων που βρίσκονται σε G0 στον κυτταρικό κύκλο. Αντίθετα, συνδυασμένη απαλοιφή των παραγόντων E2F1, E2F2 και E2F3 έχει σαν αποτέλεσμα την παρεμπόδιση εισόδου στην S φάση (Johnson et al, 1993;Lukas et al. 1996). Oι E2F4 και Ε2F5, σε αντίθεση με τους E2F1, E2F2 και E2F3, οι οποίοι ρυθμίζονται κατά την διάρκεια του κυτταρικού κύκλου με τα επίπεδα τους να αυξάνονται καθώς τα κύτταρα πλησιάζουν από την μετάβαση από την G1 στην S, εκφράζονται σε όλη την διάρκεια του κυτταρικού κύκλου με ανιχνεύσιμα επίπεδα και σε κύτταρα που έχουν εξέλθει του κυτταρικού κύκλου. Οι E2F4 και Ε2F5 είναι κατά βάση κυτταροπλασματικές πρωτεΐνες και για να εισέλθουν στον πυρήνα πρέπει να συνδεθούν με μία pocket πρωτεΐνη (Allen et al. 1997). Οι ενδογενείς E2F4 και Ε2F5 μπορούν να δράσουν σαν καταστολείς των Ε2F μεταγραφόμενων γονιδίων. Το γεγονός ότι η έκφραση τους κυριαρχεί σε G0/G1 κύτταρα υποδεικνύει ότι εμπλέκονται στην καταστολή γονιδίων νωρίς κατά την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. Σε αυτό το συμπέρασμα οδηγεί και το γεγονός ότι μεταλλάξεις σε υποκινητές στην περιοχή πρόσδεσης των E2F4 και Ε2F5, όπως των γονιδίων B-myc, cdc2 και E2F1, οδηγούν σε αυξημένη έκφραση των γονιδίων αυτών κατά την G0/G1 φάση του κυτταρικού κύκλου. Επίσης η μείωση της πρόσδεσης του E2F4 συμβαίνει κατά το τέλος της G1 όπου παρατηρείται αύξηση των επιπέδων των E2F1, E2F2 και E2F3 και ακετυλίωση των ιστονών Η3 και Η4 (Τakahashi et al, 2000). Καθώς οι Ε2F μεταγραφικοί παράγοντες είναι βασικοί ρυθμιστές γονιδίων του κυτταρικού κύκλου και προωθούν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό είναι σαφές ότι η ρύθμιση τους είναι εξαιρετικά σημαντική για την διατήρηση της ισορροπίας μεταξύ κυτταρικού πολλαπλασιασμού και κυτταρικής διαφοροποίησης. 12

13 Το prb μπορεί να δρα και σαν μεταγραφικός αναστολέας και σαν μεταγραφικός ενεργοποιητής Το prb είναι μέλος της οικογένειας των pocket πρωτεϊνων στην οποία συγκαταλέγοντα και οι p107 και p130 πρωτεϊνες. Είναι γνωστό σαν ένα ογκοκατασταλτικό γονίδιο, του οποίου η ογκοκατασταλτική δράση έγκειται στην παρεμπόδιση του κυτταρικού κύκλου κατά την είσοδο στην S φάση, καταστέλλοντας γονίδια που ενεργοποιούνται από την οικογένεια των μεταγραφικών παραγόντων E2F και συγκεκριμένα τους E2F1, E2F2 και E2F3 (Hatakeyama and Weinberg, 1995). Tα γονίδια στόχοι του E2F όπως αναφέρθηκε και παραπάνω, κωδικοποιούν ένζυμα για την σύνθεση του DNA και άλλους ρυθμιστές του κυτταρικού κύκλου, ο πιο αξιοσημείωτος από τους οποίους είναι η κυκλίνη Ε (Geng et al., 1996) (Εικόνα 1) Εικόνα1: Έλεγχος κατά την μετάβαση από την G1 στην S. Oι κυκλίνες D, επαγόμενες από μιτογονα ερεθίσματα, συνδέονται με τις Cdk4 ή 6 για να φωσφορυλιώσουν το prb. Η έκφραση της κυκλίνης E οδηγεί σε ενεργοποίηση της Cdk2 και περαιτέρω απενεργοποίηση του prb φωσφορυλιώνοντας το (Zhang, 1999). Η καταστολή των γονιδίων στόχων του E2F επιτυγχάνεται τόσο μέσω της κάλυψης της ενεργοποιητικής περιοχής του Ε2F η οποία αλληλεπικαλύπτεται με την περιοχή 13

14 πρόσδεσης του prb (Dyson, 1998) όσο και μέσω της ικανότητας του prb να στρατολογεί απακετυλάσες των ιστονών (ΗDAC) στους υποκινητές των γονιδίων στόχων του E2F (Brehm et al., 1998). Eξίσου σημαντική είναι και η δράση του prb κατά την διαφοροποίηση όπου λειτουργεί σαν μεταγραφικός ενεργοποιητής για τη μεταγραφή γονιδίων που επάγουν τη διαφοροποίηση σε συνεργασία με άλλους ενεργοποιητικούς μεταγραφικούς παράγοντες όπως οι MyoD και ΜEF2 κατά την διαφοροποίηση των μυϊκών κυττάρων (Gu et al., 1993), το C/EBPs στα λιποκύτταρα (Chen et al., 1996) και το c- jun στα κερατινοκύτταρα (Nead et al., 1998). Η συνενεργοποιητική δράση του prb έγκειται και πάλι στην ικανότητα του να αναδιατάσσει την χρωματίνη. Το prb δρώντας σαν συνενεργοποιητής έχει δειχτεί ότι αλληλεπιδρά με την καταλυτική υπομονάδα του SWI/SNF συμπλόκου αναδιάταξης της χρωματίνης, Brg1 διευκολύνοντας με αυτόν τον τρόπο την μεταγραφή γονιδίων που σχετίζονται με την διαφοροποίηση (Dunaief et al., 1994). Τα παραπάνω οδήγησαν στην κατασκευή ενός μοντέλου το οποίο λαμβάνει υπόψη τη δράση του prb τόσο στον κυτταρικό κύκλο όσο και στην διαφοροποίηση. Με βάση το μοντέλο αυτό, όταν το prb είναι ενεργό στην υποφωσφορυλιωμένη του μορφή αναστέλλει τα γονίδια που μεταγράφονται από τον E2F, μπλοκάροντας τα κύτταρα στην G1, ενώ την ίδια στιγμή, λειτουργεί σαν ενεργοποιητής γονιδίων που επάγουν τη διαφοροποίηση των κυττάρων (Zhang, 1999) (Εικόνα 2) 14

15 Εικόνα2 : Η διττή λειτουργία το prb. Όταν είναι ενεργό, μπλοκάρει τα κύτταρα στην G1 καταστέλλοντας γονίδια που μεταγράφονται από τον E2F, στρατολογώντας την HDAC. Παράλληλα αλληλεπιδρώντας με τον παράγοντα ΒRG1 επάγει την έκφραση γονιδίων προς κυτταρική διαφοροποίηση (Zhang, 1999). Ένα πρόβλημα που ανακύπτει από το παραπάνω μοντέλο είναι πώς το prb γνωρίζει ποιόν υποκινητή να καταστείλει και ποιόν να ενεργοποιήσει. Μία πιθανότατα είναι ότι αλληλεπιδρώντες μεταγραφικοί παράγοντες καθορίζουν αν το prb θα δράσει σαν καταστολέας μέσω της HDAC ή σαν ενεργοποιητής μέσω του Brg Οι αναστολείς των κυκλινοεξαρτώμενων κινασών (CKIs) ρυθμίζουν την ισορροπία μεταξύ διαφοροποίησης και κυτταρικού πολλαπλασιασμού Oι αποφάσεις για κυτταρική διαφοροποίηση λαμβάνονται συνήθως κατά την G1 φάση του κυτταρικού κύκλου. Διακοπή του κυτταρικού κύκλου στην G1 επιτυγχάνεται με υπερέκφραση των αναστολέων των κυκλινοεξαρτώμενων κινασών (CKIs). Το ερώτημα είναι αν η διακοπή του κυτταρικού κύκλου στη G1 φάση είναι αρκετή για την επαγωγή διαφοροποίησης. Πειράματα για την απάντηση τέτοιων ερωτημάτων διεξάγονται σε καλλιέργειες κυτταρικών σειρών που έχουν υποστεί ήδη κάποιο βαθμό διαφοροποίησης. Η μυογένεση του σκελετικού μυός αποτελεί ένα από τα καλύτερα μελετημένα συστήματα. Διαιρούμενοι μυοβλάστες εκφράζουν το MyoD, ένα μέλος της οικογένειας των μυογενετικών παραγόντων, αλλά δεν 15

16 διαφοροποιούνται παρουσία αυξητικών παραγόντων. Σε τέτοια κυτταρικά συστήματα, επαγωγή της έκφρασης των p16 ink4a και p21 cip1 είναι αρκετή για να οδηγήσει σε απόσυρση από τον κυτταρικό κύκλο και έκφραση συγκεκριμένων μαρτύρων διαφοροποίησης παρά την παρουσία αυξημένων συγκεντρώσεων αυξητικών παραγόντων. Υπερέκφραση άλλων CKIs όπως, p27 kip1 και p57 kip2 έχει επίσης δειχτεί ότι επάγει τη μεταγραφική ενεργοποίηση του MyoD, ωθώντας τα κύτταρα προς περαιτέρω διαφοροποίηση (Rao et al., 1994). Η διαφοροποιητική δράση των CKIs διαμεσολαβείται και μέσω του prb. Αυτό επιτυγχάνεται μέσω της πρόσδεσης και απενεργοποίησης των Cdks, αποτρέποντας με αυτόν τον τρόπο τη φωσφορυλίωση του prb, διατηρώντας το σε μία ενεργοποιημένη μορφή (Zhang, 1999). H διαφοροποιητική δράση των CKIs μπορεί να συμβαίνει και ανεξάρτητα από την παρεμπόδιση του κυτταρικού κύκλου μέσω της αναστολής των Cdks. Τέτοια παραδείγματα προέρχονται από πειράματα σε Muller γλοιϊκά κύτταρα από Xenopus, τα οποία διαφοροποιούνται παρουσία p27 xipc1. Aν η επαγωγή της κυτταρικής διαφοροποίησης μέσω του p27 xipc1 συνέβαινε μόνο λόγω της δράσης του σαν αναστολεάς των κυκλινοεξαρτώμενων κινασών, με αποτέλεσμα την παύση του κυτταρικού κύκλου κατά την G1, τότε οποιοσδήποτε παράγοντας που προκαλεί την παύση του κυτταρικού κύκλου θα ήταν σε θέση να προκαλέσει και κυτταρική διαφοροποίηση, κάτι το οποίο δεν ισχύει. Η λειτουργία του p27 kip1 κατά την γλοιογένεση διαμεσολαβείται από μία περιοχή στο αμινοτελικό άκρο του μορίου η οποία αλληλεπικαλύπτεται αλλά είναι διακριτή από την περιοχή πρόσδεσης στις Cdks. Στην ίδια μελέτη δείχνεται ότι η διαφοροποίηση των γλοιϊκών κυττάρων επάγεται και από ένα μετάλλαγμα την ανθρώπινης p27 GIP1 το οποίο δεν μπορεί να παρεμποδίσει την δράση του συμπλόκου Cdk/κυκλίνη. Τα παραπάνω δεδομένα υποδεικνύουν ότι οι CKIs έχουν δράση στην διαφοροποίηση ανεξάρτητα από την δράση τους στην αναστολή του κυτταρικού κύκλου (Ohnuma et al., 1999). Oι παραπάνω παρατηρήσεις σχετικά με την δράση των CKIs συνοψίζονται στο παρακάτω σχήμα (Εικόνα 3). 16

17 Εικόνα 3: Έλεγχος του κυτταρικού κύκλου και διαφοροποίησης. Όταν τα κύτταρα λαμβάνουν διαφοροποιητικά ερεθίσματα από το περιβάλλον τους, ενεργοποιείται η μεταγραφή των CKIs μέσω ενός υποθετικού παράγοντα 1 (TF1) με αποτέλεσμα το μπλοκάρισμα του κυτταρικού κύκλου. Παράλληλα ένας δεύτερος θετικός παράγοντας (TF2) ενεργοποιεί διαφοροποιητικές διαδικασίες μέσα στο κύτταρο που πιθανό να απαιτούν την παρουσία ενεργοποιημένου prb (Zhang, 1999). Σύμφωνα με τo παραπάνω μοντέλο, οι CKIs ενεργοποιούνται από σήματα διαφοροποίησης και δρουν εμμέσως σαν ενεργοποιητές του prb εμποδίζοντας την απενεργοποίηση του από τις Cdks. Το prb με την σειρά του συμβάλει στις διαδικασίες διαφοροποίησης συνενεργοποιώντας ειδικούς μεταγραφικούς παράγοντες για την έναρξη της διαφοροποίησης. Παράλληλα, οι CKIs ενδέχεται να συμμετέχουν ανεξάρτητα και από το prb στη σύνδεση αναπτυξιακών μονοπατιών με τον έλεγχο της μηχανής ελέγχου του κυτταρικού κύκλου Η σημαντικότητα της παρεμπόδισης του πολλαπλασιασμού σε τελικά διαφοροποιημένα κύτταρα. Παραπάνω αναφέρθηκε η σημαντικότητα της σωστής χρονικά εξόδου από τον κυτταρικό κύκλο για τη διαφοροποίηση των κυττάρων. Εξίσου σημαντική όμως για 17

18 τη διατήρηση της ισορροπίας μεταξύ κυτταρικού πολλαπλασιασμού και κυτταρικής διαφοροποίησης κατά την επαγωγή της διαφοροποίησης είναι η παραμονή των διαφοροποιημένων κυττάρων εκτός κυτταρικού κύκλου. Ορισμένα ώριμα διαφοροποιημένα κύτταρα δεν βρίσκονται μη αντιστρεπτά εκτός κυτταρικού κύκλου. Τέτοια παραδείγματα προέρχονται από πειράματα στα οποία ρυθμιστές του κυτταρικού κύκλου έχουν διαταραχτεί σε καλλιέργειες διαφοροποιημένων κυττάρων ή in vivo σε οργανισμούς μοντέλα. Τελικά διαφοροποιημένα μυοινίδια δεν μπορούν να εισέλθουν και πάλι σε κυτταρικό κύκλο παρά την παρουσία αυξητικών παραγόντων, μπορούν ωστόσο να επαναεκφράσουν κάποια συγκεκριμένα γονίδια που εκφράζονται νωρίς κατά την G1 (Tiainen et al., 1996). Πειράματα επαγόμενης υπερέκφρασης ογκοπρωτεϊνών σε διαφοροποιημένα μυϊκά κύτταρα οδηγούν στην απενεργοποίηση του prb και άλλων μελών της οικογενείας του, με αποτέλεσμα την επαγωγή σύνθεσης DNA (Lipinski and Jacks, 1999). To prb μπορεί να δρά σε διαφοροποιημένα κύτταρα, είτε αναστέλλοντας την σύνθεση πρωτεϊνών απαραίτητων στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, είτε επάγοντας τη μεταγραφή γονιδίων που κωδικοποιούν φρένα του κυτταρικού κύκλου, όπως οι CKIs, είτε κάνοντας και τα δύο. Έχει προταθεί ότι το prb μπορεί να εμποδίζει και την αντιγραφή του DNA στοχεύοντας την MCM7 ένα μέλος του εξαμερούς συμπλόκου του Μinichromosome Μaintenance Complex, βασικού συστατικού του προαντιγραφικού συμπλόκου. Έχει δειχτεί σε in vitro πειράματα ότι prb και η p130 αλληλεπιδρούν με την MCM7 και έχει προταθεί ότι μέσω αυτής της αλληλεπίδρασης αναστέλλεται η έναρξη της αντιγραφής (Sterner et al., 1998). Oι CKIs αποτελούν βασικούς ρυθμιστές τόσο κατά τον προσδιορισμό του αριθμού των τελικών κυτταρικών διαιρέσεων, όπως αναφέρθηκε παραπάνω, όσο και στην διατήρηση της τελικής εξόδου από τον κυτταρικό κύκλο. Αυτό υποστηρίζεται από πειράματα κατά τα οποία διαφοροποιημένοι κυτταρικοί πληθυσμοί προερχόμενοι από διαγονιδιακά ποντίκια στα οποία έχουν απενεργοποιηθεί ένα ή δύο γονίδια των CKIs εμφανίζουν σύνθεση DNA (Sterner et al., 1998). 18

19 1.1.4 H απόφαση για διαφοροποίηση ή πολλαπλασιασμό εξαρτάται από εξωκυττάρια ερεθίσματα και ενδοκυττάριους παράγοντες του κυτταρικού κύκλου Συνοψίζοντας τα παραπάνω, η απόφαση για το αν ένα σωματικό κύτταρο θα παραιτηθεί από τον κυτταρικό κύκλο οδηγούμενο προς διαφοροποίηση ή θα περάσει στη επόμενη κυτταρική διαίρεση συνεχίζοντας τον πολλαπλασιασμό του εξαρτάται τόσο από τα εξωκυττάρια ερεθίσματα που λαμβάνει όσο και από την ανταπόκριση παραγόντων του κυτταρικού κύκλου σε αυτά. Oι κυκλινοεξαρτώμενες κινάσες αποτελούν τα μόρια κλειδιά για την τύχη του κυττάρου και η ρύθμιση τους είναι βασική για το αν το κύτταρο θα εξέλθει από τον κυτταρικό κύκλο ή θα συνεχίσει να διαιρείται (Galderisi et al., 2003). Καθώς η μετάβαση από την G1 στην S είναι καθοριστική για την τύχη του κυττάρου, βασικής σημασία είναι η σωστή ρύθμιση των κυκλινοεξαρτώμενων κινασών του κυτταρικού κύκλου που ελέγχουν την φάση αυτή. Η κυκλινη D, σε συνδυασμό με τις Cdk2 και Cdk4, δρα κατά την μέση της G1 ενώ στο τέλος αυτής δρα η κυκλινη Ε σε σύμπλοκο με την Cdk2 (Kasten and Giordano, 1998; Sherr and Roberts, 1999). Το prb ( και οι σχετιζόμενες με αυτό πρωτεΐνες p130 και p107) είναι βασικό υπόστρωμα των CDK. Όπως αναφέρθηκε και παραπάνω, η φωσφορυλίωση του κατά την G1 έχει σαν αποτέλεσμα την απελευθέρωση των E2F μεταγραφικών παραγόντων με αποτέλεσμα την μεταγραφή γονιδίων που σχετίζονται με τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την είσοδο στην S φάση (Kasten and Giordano, 1998). Oι CKIs επίσης προσδενόμενες στις Cdks τις απενεργοποιούν με αποτέλεσμα την έξοδο από τον κυτταρικό κύκλο και την παραμονή στην G1. Καθώς το βασικό χαρακτηριστικό των καρκινικών κυττάρων είναι η ανάπτυξη ενός φραγμού προς τη διαφοροποίηση και ο συνεχής κυτταρικός πολλαπλασιασμός, γίνεται αντιληπτή η σημαντικότητα της σωστής ρύθμισης των πρωτεϊνών του κυτταρικού κύκλου για τη διατήρηση της ισορροπίας μεταξύ κυτταρικής διαφοροποίησης και κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Τα παραπάνω συνοψίζονται στο παρακάτω σχήμα ( Εικόνα 4) 19

20 Εικόνα 4: Ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και της διαφοροποίησης. Διαφορετικά εξωκυττάρια ερεθίσματα έχουν αποτέλεσμα την ενεργοποίηση διαφορετικών πρωτεϊνών. Μιτογόνα ερεθίσματα έχουν σαν αποτέλεσμα την ενεργοποίηση των myc πρωτεϊνών με αποτέλεσμα τη μεταγραφή πρωτεϊνών που θα οδηγήσουν στην συνέχιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Από την άλλη η ενεργοποίηση του p53 οδηγεί κυρίως μέσω της CKI p21 στην παύση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού μέσω της ενεργοποίησης του prb. Το αποτέλεσμα είναι η απενεργοποίηση της μεταγραφής γονιδίων από τον Ε2F τα οποία και εμπλέκονται στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και η έκφραση γονιδίων που προωθούν την διαφοροποίηση. (Galderisi et al., 2003) 20

21 1.2 Geminin, ένα μόριο με διττό ρόλο που συντονίζει τον κυτταρικό κύκλο με την διαφοροποίηση κατά την ανάπτυξη. Η Geminin είναι μία πρωτεΐνη η οποία εξ αρχής χαρακτηρίστηκε σαν ένα διλειτουργικό μόριο με δύο διακριτούς ρόλους στον κυτταρικό κύκλο και την διαφοροποίηση. Σε ότι αφορά, το κυτταρικό κύκλο αρχικά περιγράφικε σαν μία πρωτεΐνη αναστολέας της αντιγραφής του DNA η οποία αποικοδομείται κατά τη μετάβαση από τη μετάφαση στην ανάφαση από το σύμπλοκο προαγωγής της ανάφασης/κυκλόσωμα (ΑPC/C) (McGarry and Kirschner, 1998) Σε ότι αφορά το ρόλο της στη διαφοροποίηση, βρέθηκε αρχικά να συμμετάσχει στο σχηματισμό του νευρικού σωλήνα, επάγοντας τη διαφοροποίηση των εξωδερμικών κυττάρων σε νευρικά στο Xenopus (Kroll et al., 1998). Ακριβώς η διττή αυτή φύση του μορίου της Geminin και η συμμετοχή της τόσο στον κυτταρικό κύκλο όσο και στις διαδικασίες διαφοροποίησης της δίνει έναν ρυθμιστικό ρόλο στον έλεγχο αυτών των δύο λειτουργιών. Η Geminin πιστεύεται ότι συμμετέχει και ρυθμίζει αυτή την πολύ σημαντική για την ομοιόσταση των πολυκύτταρων οργανισμών ισορροπία Η Geminin στον κυτταρικό κύκλο Η διατήρηση της γονιδιωματικής σταθερότητας απαιτεί τον πολλαπλασιασμό του γενετικού υλικού μία φορά κατά την διάρκεια της S φάσης κάθε κυτταρικού κύκλου και στη συνέχεια τον ακριβή διαχωρισμό του στα δύο θυγατρικά κύτταρα κατά την μίτωση. Αν το κύτταρο εισέλθει στην μίτωση με εν μέρει διπλασιασμένα χρωμοσώματα ή με υπερδιπλασιασμένο γενετικό υλικό τότε θα οδηγηθεί είτε σε κυτταρικό θάνατο είτε προς κακοήθη εξαλλαγή. Για το σκοπό αυτό το κύτταρο έχει αναπτύξει σημεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου ώστε κύτταρα με ανώμαλο ποσό DNA να μην συνεχίζουν να πολλαπλασιάζονται ανεξέλεγκτα. Η έναρξη της αντιγραφής είναι μία διαδικασία η οποία βρίσκεται υπό αυστηρό έλεγχο έτσι ώστε η χρωματίνη να αδειοδοτείται για αντιγραφή μόνο μία φορά κατά την διάρκεια του κυτταρικού κύκλου (Nishitani et al., 2000) 21

22 H αδειοδότηση της αντιγραφής (licensing) είναι μια αυστηρά ρυθμιζόμενη διαδικασία η οποία λαμβάνει χώρα κατά την G1 φάση του κυτταρικού κύκλου με την συγκρότηση του προαντιγραφικού συμπλόκου (pre-rc) στις αφετηρίες έναρξης της αντιγραφής (Bastians et al., 1999; Blow and Laskey, 1988; Dutta and Bell, 1997). Το πρωτεϊνικό εξαμερές σύμπλοκο Οrigin Recognition Complex (ORC) αποτελεί το υπόστρωμα για τη σταδιακή στρατολόγηση των υπόλοιπων συστατικών του προαντιγραφικού συμπλόκου. Η πρόσδεση του ORC στη χρωματίνη ρυθμίζεται κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου. Στα ανθρώπινα κύτταρα η ORC1 αποδεσμεύεται από τη χρωματίνη κατά την προχωρημένη S, G2 και M φάση, ενώ οι ORC 2-5 παραμένουν προσδεμένες στη χρωματίνη καθ όλη τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου (Natale et al., 2000). Στην αρχή της G1 οι πρωτεΐνες Cdc6, ένα μέλος της οικογένειας των ΑΑΑ+ ATPσών, και Cdt1 στρατολογούνται ανεξάρτητα στη χρωματίνη. H στρατολόγηση των παραπάνω πρωτεϊνών επάγει την πρόσδεση του (MCM2-7) πρωτεϊνικού συμπλοκου (mini-chromosome maintenance). Οι MCMs(2-7) έχουν δράση ελικάσης και πιστεύεται ότι ξετυλίγουν το DNA κατά τη διάρκεια της αντιγραφής στα ευκαρυωτικά κύτταρα κινούμενες μπροστά από την αντιγραφική διχάλα (Blow and Hodgson, 2002; Diffley, 1992; Nishitani and Lygerou, 2002) Εικόνα 5: Η σταδιακή στρατολόγηση του προαντιγραφικού συμπλόκου κατά την αδειοδότηση της αντιγραφής. (Nishitani and Lygerou, 2002) 22

23 Με τη στρατολόγηση των MCM2-7 ολοκληρώνεται ο σχηματισμός του προαντιγραφικού συμπλόκου και η διαδικασία της αδειοδότησης. Το προαντιγραφικό σύμπλοκο μετατρέπεται σε προενακτήριο (pre-ic) με την πρόσδεση των Cdc45 και Sld3 και πιθανών άλλων παραγόντων όπως το σύμπλοκο Dpb11/Cut5. Τελικά, πρωτεΐνες κι ένζυμα που σχετίζονται άμεσα με τη διαδικασία της αντιγραφής, όπως οι DNA πολυμεράσες, οι παράγοντες Sld2, GINS και RPA προσελκύονται επίσης στις θέσεις αυτές. Δύο είδη πρωτεϊνικών κινασών επάγουν την πυροδότηση της αντιγραφής, οι CDK και οι DDK. Oι κινάσες αυτές φωσφορυλιώνουν πολλά από τα συστατικά του pre-ic, προκαλώντας πιθανόν μια τέτοια αλλαγή στην στερεοδιαμόρφωση του συμπλόκου, που διευκολύνει την προσέλευση ενζύμων πολυμερισμού και πυροδοτώντας την έναρξη της αντιγραφής (Forsburg, 2004 Bell and Dutta, 2002) Mετά το τέλος της έναρξης της αντιγραφής, οι ΜCM2-7 αποδεσμεύονται από την χρωματίνη και το σύμπλοκο διαλύεται προκειμένου να εξασφαλιστεί ότι η συγκεκριμένη αφετηρία δεν θα πυροδοτηθεί ξανά κατά την διάρκεια του ίδιου κυτταρικού κύκλου (Nishitani and Lygerou, 2002). Οι παράγοντες Cdc6 και Cdt1 αδρανοποιούνται με πολλούς διαφορετικούς τρόπους, με στόχο την αποφυγή της επαναδειοδότησης των ίδιων αφετηριών αντιγραφής κατά τη διάρκεια του ίδιου κυτταρικού κύκλου. Ο παράγοντας Cdc6 έχει δειχθεί ότι φωσφορυλιώνεται, με αποτέλεσμα του την έξοδο από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα (Fujita et al. 1999), ενώ μέρος της πρωτεΐνης αποικοδομείται στο τέλος της μίτωσης από το σύστημα APC/C (Petersen et al., 2000). Ο Cdt1, κατά την μετάβαση από την G1 στην S φάση, φωσφορυλιώνεται από τις CDKs στο αμινοτελικό του άκρο και οδηγείται στο πρωτεάσωμα για αποικοδόμηση. Η διαδικασία αυτή διαμεσολαβείται από την ουβικουιτινυλίωση του μέσω του συμπλόκου SCF-Skp2, που δρα ως Ε3 λιγάση της ουβικουιτίνης (Li et al., 2003; Liu et al., 2004; Nishitani et al., 2004). Η αποικοδόμηση του Cdt1 μπορεί να πραγματοποιηθεί μετά την έναρξη της S φάσης με έναν επιπλέον ανεξάρτητο από τον προηγούμενο μηχανισμό. Ο μηχανισμός αυτός βασίζεται στο μονοπάτι της Cul4/DDB1 Ε3 λιγάσης (Arias and Walter, 2005; Hu et al., 2004; Nishitani et al., 2006; Senga et al., 2006). Η πρωτεόλυση του Cdt1 μέσω αυτού του μονοπατιού απαιτεί την πρόσδεση του PCNA σε αμινοτελική περιοχή του Cdt1. Το PCNA συνδέει τον Cdt1 με το σύμπλοκο Cul4/DDB1, με αποτέλεσμα την ουβικουιτινυλίωση και την πρωτεόλυσή του. Το μονοπάτι αυτό έχει δειχθεί ότι, 23

24 εκτός από την S φάση μπορεί να ενεργοποιηθεί και στη G1 φάση μετά από βλάβη στο DNA (Hu et al., 2004; Nishitani et al., 2006). Στα μετάζωα υπάρχει και ένας επιπλέον ρυθμιστικός μηχανισμός μέσω της δέσμευσης και της αδρανοποίησης του Cdt1 από την Geminin. H Geminin αποτελεί αναστολέα του κυτταρικού κύκλου που απαντάται μόνο στα μετάζωα και αποικοδομείται κατά την μίτωση από το APC/C. Στο αμινοτελικό άκρο της πρωτεΐνης (23-31αα) υπάρχει μία αλληλουχία αποικοδόμησης (destruction box), η οποία είναι παρούσα και στις μιτωτικές κυκλίνες (Benjamin et al., 2004; McGarry and Kirschner, 1998). H Geminin είναι παρούσα από την S φάση μέχρι την μίτωση και έχει βρεθεί ότι προσδένεται άμεσα στο Cdt1. Μέσω αυτής της αλληλεπίδρασης η Geminin εξασφαλίζει ότι μόρια Cdt1 τα οπoία έχουν διαφύγει της πρωτεόλυσης δεν θα προσδεθούν στη χρωματίνη οδηγώντας στην πρόσδεση των MCMs και στην επαναπυροδότηση των ίδιων θέσεων έναρξης της αντιγραφής μέχρι το τέλος της μίτωσης (Tada et al., 2001; Wohlschlegel et al., 2000) (Εικόνα 6). 24

25 Εικόνα 6: Ο ρόλος της Geminin στον κυτταρικό κύκλο. Κατα την G1 οι πρωτεΐνες Cdc6 και Cdt1 προσδένονται στις αφετηρίες της αντιγραφής με αποτέλεσμα την στρατολόγηση των MCM(2-7) και την αδειοδότηση της αντιγραφής. Μετά την έναρξη της αντιγραφής η Geminin,της οποίας τα επίπεδα αυξάνονται στην S φάση, προσδένεται στο Cdt1 ενώ οι MCMs και το Cdc6 φωσφορυλιώνονται και απομακρύνονται από τη χρωματίνη. Το Cdc6 απομακρύνεται προς το κυτταρόπλασμα και η Geminin παραμένει προσδεδεμένη στο Cdt1 μέχρι το τέλος της αντιγραφής. Κατά την μίτωση η Geminin αποικοδομείται από το APC/C, επιτρέποντας μετά το πέρας της μίτωσης την εκ νέου αδειοδότηση της αντιγραφής.(montanari et al., 2006) O προσδιορισμός της κρυσταλλικής δομής του συμπλόκου Geminin/Cdt1 έδειξε ότι υπάρχουν δύο περιοχές αλληλεπίδρασης μεταξύ Geminin και Cdt1. Στην πρώτη συμμετέχουν τα αμινοξικά κατάλοιπα που εδράζονται στο αμινινοτελικό τμήμα του σπειροειδούς σπειράματος του μορίου της Geminin, ενώ στη δεύτερη τα δέκα αμινοξικά κατάλοιπα που βρίσκονται αμέσως αμινοτελικά του σπειροειδούς 25

26 σπειράματος του μορίου. Η συμμετοχή των αμινοξέων αυτών στην αλληλεπίδραση ελέγχθηκε με σημειακές μεταλλάξεις (Lee et al.,2004). H εύρεση της κρυσταλλικής δομής της περιοχής της Geminin που απαιτήται για την αναστολή της αδειοδότησης της αντιγραφής μέσω της πρόσδεσης στο Cdt1, είχε σαν αποτέλεσμα και την επέκταση της περιοχής σπειροειδούς σπειράματος της Geminin από την αρχική πρόβλεψη μέσω αλγορίθμων (αμινοξέα ) στα αμινοξέα (Saxena et al., 2004). H ρύθμιση των πρωτεϊνικών επιπέδων της Geminin εκτός από το APC/C έχει αναφερθεί ότι γίνεται και με αλλαγή του υποκυτταρικού εντοπισμού του μορίου, με την είσοδο του μορίου από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα (Hodgson et al., 2002) Τα επίπεδα της Geminin είναι αυξημένα σε διαιρούμενα κύτταρα αλλά μειώνονται κατά την έξοδο από τον κυτταρικό κύκλο (Yoshida and Inoue, 2004, Χouri et al,) H υπερέκφραση της Geminin έχει αναφερθεί ότι προκαλεί παύση του κυτταρικού κύκλου κατά την G1 φάση, σταματώντας τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό ή οδηγώντας τα κύτταρα σε απόπτωση (Shreeram et al., 2002). Η αποσιώπηση της Geminin στη Drosophila οδηγεί σε υπερδιπλασιασμό του γονιδιώματος που συνοδεύεται από πυρήνες αυξημένου μεγέθους και ενεργοποίηση του σημείου ελέγχου του κυτταρικού κύκλου που εξαρτάται από την Chk1 (Mihaylov et al., 2002). Aποσιώπηση της Geminin σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές οδηγεί σε παύση του κυτταρικού κύκλου στην G2 φάση. Το μοντέλο που έχει προταθεί γι αυτό είναι ότι η εξάλειψη της Geminin οδηγεί σε υπερδιπλασισμό του DNA με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση των κινασών Chk1 και Chk2 οι οποίες φωσφορυλυώνουν το Cdc25C οδηγώντας το εκτός πυρήνα αποτρέποντας έτσι την ενεργότητα της κυκλίνης Β/Cdc2 και την είσοδο σε μίτωση (McGarry, 2002; Zhu et al., 2004). Πρόσφατα αναφέρθηκε ότι η αποσιώπηση της Geminin προκαλεί υπερπoλλαπλασιασμό των κεντροσωμάτων, προσδίδοντας έτσι ένα καινούργιο ρόλο στο μόριο κατά τον κυτταρικό κύκλο εκτός αυτού του αναστολέα της αντιγραφής του DNA (Tachibana et al., 2005). 26

27 1.2.2 Η Geminin στη διαφοροποίηση Η Geminin είναι ένα πολυλειτουργικό μόριο και πέρα από τον κυτταρικό κύκλο συμμετέχει και στην διαφοροποίηση. Aρχικά η Geminin περιγράφηκε σαν ένα μόριο του οποίου η υπερέκφραση έχει σαν αποτέλεσμα την επέκταση της νευρικής πλάκας στο Xenopus με δοσοεξαρτώμενο τρόπο. Το Ν τελικό τμήμα του μορίου (38αα-90αα της ΧGemininL) είναι αρκετό για την απόκτηση αυτού του φαινοτύπου (Kroll et al., 1998). Ενώ το N-τελικό τμήμα της πρωτεΐνης είναι απαραίτητο για τον προσδιορισμό των νευρικών κυττάρων κατά τη γαστριδίωση, το C-τελικό τμήμα της Geminin είναι υπεύθυνο για τον έλεγχο της νευρογένεσης μεταγενέστερα. Συγκεκριμένα η Geminin έχει βρεθεί να αλληλεπιδρά με την καταλυτική υπομονάδα του συμπλόκου αναδιάταξης της χρωματίνης SWI/SNF, Brg1 (Seo et al, 2005). Έκτοπη έκφραση της Geminin σε έμβρυα οδηγεί σε αύξηση της νευρικής περιοχής χωρίς όμως να αυξάνονται οι διαφοροποιημένοι νευρώνες, ενώ η έκτοπη έκφραση μεταλλαγμένων μορφών της Geminin οι οποίες δεν αλληλεπιδρούν με το Brg1 οδηγούν και σε παράλληλη αύξηση και του αριθμού των διαφοροποιημένων κυττάρων. Tα παραπάνω δεδομένα οδηγούν στο προτεινόμενο μοντέλο σύμφωνα με το οποίο η αλληλεπίδραση μεταξύ Geminin και Brg1 δεν επιτρέπει την αλληλεπίδραση του Brg1 με πρωτεΐνες με περιοχή έλικας θηλιά έλικας (bhlh) όπως η Neurogenin και NeuroD, με τις οποίες είναι γνωστό ότι αλληλεπιδρά το Brg1, εμποδίζοντας αυτές να ενεργοποιήσουν τα γονίδια στόχους τους τα οποία και επάγουν την νευρική διαφοροποίηση (Seo et al., 2005). Η Geminin εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα στα διαιρούμενα αρχέγονα νευρικά κύτταρα εμποδίζοντας την καθοδηγούμενη από τις Ngn και NeuroD διαφοροποίηση προς νευρικά κύτταρα. Στους διαφοροποιούμενους νευρώνες τα επίπεδα έκφρασης της Geminin μειώνονται και η επαγώμενη νευρογένεση από την σύνδεση του Brg1 με τις bhlh πρωτεΐνες και την ενεργοποίηση των γονιδίων στόχων των bhlh πρωτεϊνών μπορεί να λάβει χώρα. Τα παραπάνω δεδομένα οδηγούν στο συμπέρασμα ότι η Geminin αλληλεπιδρώντας με το Brg1 διατηρεί τα αρχέγονα νευρικά κύτταρα σε ένα στάδιο πολλαπλασιασμού και αποτρέπει την πρόωρη νευρογένεση (Seo and Kroll, 2006) (Eικόνα7). 27

28 Εικόνα 7:Το προτεινόμενο μοντέλο από του Seo et al. για τον ρόλο της Geminin κατά την νευρογένεση Έχει δειχθεί ότι η Geminin συνδέεται στον Ν2 ενισχυτή του γονιδίου του Sox2 μέσω της αλληλεπίδρασης της με το Brg1 και ελέγχoντας την έκφραση του Sox2 (Nielsen et al., 2002).Το Sox2 είναι ένα γονίδιο που εκφράζεται σε αρχέγονα κύτταρα του κεντρικού νευρικού συστήματος και τα διατηρεί σε κατάσταση πολλαπλασιασμού, κατά τη δημιουργία της νευρικής πλάκας. Παρά το γεγονός της συνεχούς έκφρασης του Brg1 στο έμβρυο (Scofieled et al., 1999) το Sox2 δεν εκφράζεται πρόωρα, λόγω της άμεσης αλληλεπίδρασης του Brg1 με τον καταστολέα HP1a. O HP1a, o oποίος επίσης εκφράζεται συνεχώς, έχει δειχθεί ότι καταστέλλει την έκφραση του Sox2, καθώς όταν λαμβάνει χώρα έκτοπη έκφραση ενός μεταλλάγματος του το οποίο αλληλεπιδρά με το Brg1 αλλά δεν προσδένεται στην χρωματίνη παρατηρείται επαγωγή του Sox2. Πρόσφατα προτάθηκε ένας ρυθμιστικός μηχανισμός μέσω του οποίου ελέγχεται η έκφραση του Sox2 παρά την συνεχόμενη έκφρασή τόσο του Brg1 όσο και του HP1a (Papanayotou et al., 2008). Αυτός ο μηχανισμός βασίζεται στην αλληλεπίδραση της Geminin με δύο άλλες πρωτεΐνες με σπειροειδή σπειράματα, τις ERNI και BERT νωρίς κατά την δημιουργία της νευρικής πλάκας. Έχει δειχτεί ότι η έκτοπη έκφραση της Geminin οδηγεί σε επαγωγή του Sox2 και για να συμβεί αυτό απαιτείται η αλληλεπίδραση της με το Brg1 (Papanayotou et al., 2008). Καθώς η Geminin εκφράζεται από την αρχή της γαστριδίωσης πολύ πριν την έναρξη της έκφρασης του Sox2, και άλλοι παράγοντες θα πρέπει να εμπλέκονται στην ρύθμιση αυτή. Σύμφωνα με το προτεινόμενο μοντέλο, κατά την γαστριδίωση σε έμβρυα κοτόπουλου η πρόωρη ενεργοποίηση του Sox2 αποτρέπεται καθώς ο ERNI συνδεδεμένος με τον καταστολέα Hp1α αλληλεπιδρά με την Geminin επιτρέποντας 28

29 στον καταστολέα HP1α να εμποδίζει την έκφραση του Sox2. Προς το τέλος της γαστριδίωσης η καταστολή αυτή ανατρέπεται από την ανταγωνιστική πρόσδεση του BERT στον ERNI και την Geminin, με αποτέλεσμα την απομάκρυνση του αναστολέα Ηp1α γεγονός το οποίο οδηγεί σε ενεργοποίηση της έκφραση του Sox2 μέσω της δράσης του SWI/SNF συμπλόκου (Papanayotou et al., 2008). Εικόνα 8: Το προτεινόμενο μοντέλο για την ρύθμιση της έκφρασης του Sox2. H Geminin αλληλεπιδρώντας με δύο άλλες πρωτεΐνες με σπειροειδή σπειράματα, ERNI και BERT ρυθμίζει την έκφραση του Sox2 (Papanayotou et al., 2008). Η Geminin έχει επίσης βρεθεί να ελέγχει την έκφραση των Hox γονιδίων, τα οποία καθορίζουν την διάταξη του προσοπίσθιου άξονα κατά την ανάπτυξη των σπονδυλωτών, αλληλεπιδρώντας είτε άμεσα με τα Hox γονίδια, είτε μέσω του polycomb συμπλόκου. Μια γενετική σάρωση για πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν με την Geminin έδωσε ως αλληλεπιδρώντα μόρια τα Hoxd10, Ηοxa11 και Schm1 (sex comb on midleg homologue 1) το οποίο είναι μέλος του πολυπρωτεϊνικού συμπλόκου Polycomb (Luo, Yang et al. 2004). Χρήση βιοχημικών μεθόδων επιβεβαίωσε την αλληλεπίδραση της geminin με όλες τις Hox πρωτεΐνες (Hoxa7, Hoxb7, Hoxc8, Hoxc9 και Hoxa10). Επίσης δείχθηκε ότι η Geminin αλληλεπιδρά παροδικά μέσω του polycomb συμπλόκου με ρυθμιστικές αλληλουχίες του Hoxd11 γονιδίου στο 3 άκρο του ( Luo et al., 2004). Μέσω αυτών των αλληλεπιδράσεων έχει προταθεί ότι αναστέλλει τη δράση των Hox γονιδίων κατά το σχηματισμό του προσθοπίσθιου εμβρυϊκού άξονα Η αλληλεπίδραση της Geminin με τις Ηοx πρωτεΐνες 29

30 διαμεσολαβείται από το σπειροειδές σπείραμα της Geminin και εν μέρη αλληλεπικαλύπτεται με την περιοχή πρόσδεσης του Cdt1 οδηγώντας σε ένα πιθανό ανταγωνισμό για την πρόσδεση των δύο μορίων και κατ επέκταση αποκτώντας έναν ρυθμιστικό ρόλο στην διατήρηση ισορροπίας μεταξύ πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης H Geminin έχει βρεθεί να αλληλεπιδρά άμεσα με την Six3 μέλος της οικογένειας Six/So στον ιχθύ Medaka, επηρεάζοντας με αυτόν τον τρόπο την ρετινογένεση κατά την ανάπτυξη του οφθαλμού. Η υπερέκφραση της Geminin έχει το ίδιο αποτέλεσμα με την απαλοιφή του Six3, οδηγώντας στον σχηματισμό μικρότερων οφθαλμών, κυκλοπίας ή ακόμα και απώλεια ολόκληρου του πρόσθιου εγκέφαλου με δοσοεξαρτώμενο τρόπο. Αντίθετα, η απαλοιφή της Geminin προκαλεί υπέρμετρη αύξηση των βλαστικών κυττάρων του οπτικού δισκίου και δημιουργία έκτοπων δομών (Del Bene et al., 2004). Eικόνα 9: Ανωμαλίες στην ανάπτυξη του οφθαλμού στον ιχθύ Medaka λόγω υπερέκφρασης της Geminin. (a) μάρτυρας, (g) ζώο στο οποίο έχει υπερεκφραστεί η Geminin (Del Bene et al., 2004). Η αλληλεπίδραση της Geminin με το Six3 είναι πολύ σημαντική για τη φυσιολογική ανάπτυξη του οφθαλμού. Έχει προταθεί ότι η Geminin και το Six3 δρουν στο ίδιο μοριακό μονοπάτι δρώντας σαν ανταγωνιστές και ρυθμίζουν την ισορροπία μεταξύ 30

31 κυτταρικού πολλαπλασιασμού και κυτταρικής διαφοροποίησης κατά την ανάπτυξη του οφθαλμού (Luo and Kessel, 2004) Οι πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις της Geminin καθορίζουν την λειτουργία της Όπως είναι εμφανές από τα παραπάνω, η Geminin συμμετέχει σε μια πληθώρα μοριακών αλληλεπιδράσεων, οι οποίες προσδιορίζουν τη λειτουργία της. Οι αλληλεπιδράσεις αυτές διαμεσολαβούνται από διάφορα τμήματα του μορίου της Geminin. Η περιοχή του σπειροειδούς σπειράματος όμως θα μπορούσαμε να πούμε ότι αποτελεί την καρδιά του μορίου της Geminin καθώς είναι απαραίτητη για μία πληθώρα αλληλεπιδράσεων. Η παρουσία του σπειροειδούς σπειράματος είναι απαραίτητη για την αλληλεπίδραση της Geminin με το Cdt1, τόσο για τη διατήρηση της δομής της πρωτεΐνης κατά την αλληλεπίδραση της με το Cdt1 όσο και με την συμμετοχή συγκεκριμένων αμινοξέων στην περιοχή αλληλεπίδρασης (Lee et al, 2004). Το σπειροειδές σπείραμα συμμετέχει και στον ομοδιμερισμό του μορίου καθώς οι λευκίνες και ισολευκίνες στις θέσεις 120, 124, 131 και 134 έχουν μεσω μεταλλάξεων αποδειχτεί σημαντικές για τον ομοδιμερισμό του μορίου (Saxena et al, 2002). Το σπειροειδές σπείραμα της Geminin είναι υπεύθυνο και για την αλληλεπίδραση με τις Hox πρωτεΐνες ενώ οι περιοχές πρόσδεσης του Cdt1 και των Hox πρωτεϊνών στην Geminin εν μέρει αλληλεπικαλύπτονται. Τέλος το σπειροειδές σπείραμα συμμετέχει και στην αλληλεπίδραση με το Six3. Πρόσφατα, δύο άλλες πρωτεΐνες με σπειροειδή σπειράματα βρέθηκε να αλληλεπιδρούν με την Geminin μέσω του σπειροειδούς σπειράματος της για να ρυθμίσουν την έκφραση του Sox2 κατά τον σχηματισμό της νευρικής πλάκας. 31

32 Εικόνα 10 : Η δομική οργάνωση του τετραμερούς της Geminin από ανάλυση ηλεκτρονικής μικροσκοπίας (Okorokov et al., 2004) Oι περιοχές που είναι υπεύθυνες για το ρόλο της Geminin κατά την νευρογένεση είναι ανεξάρτητες του σπειροειδούς σπειράματος της καθώς όπως αναφέρθηκε και παραπάνω διαμεσολαβούνται από το N τελικό τμήμα του μορίου της κατά την γαστριδίωση για το σχηματισμό του νευρικού σωλήνα και το C-τελικό τμήμα της (161αα-176αα) μέσω της αλληλεπίδρασης με το Brg1 κατά την νευρική διαφοροποίηση των αρχέγονων νευρικών κυττάρων (Kroll, 2007). Ωστόσο τελευταία δεδομένα για τη ρύθμιση του Sox2 δείχνουν ότι η περιοχή του σπειροειδούς σπειράματος, εμπλέκεται και εκεί καθώς απαιτείται για την αλληλεπίδραση του μορίου με τα ERNI και BERT στον μηχανισμό ρύθμισης της έκφρασης του (Papanayiotoy et al., 2008). 32

33 Cdt1, Hox, Six3, ERNI, BERT, Geminin Εικόνα 11: Σχηματική απεικόνιση του πρωτεϊνικού μορίου της Geminin και των δομικών περιοχών με λειτουργική σημασία και των πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων μέσω αυτών των περιοχών Η Geminin σαν ρυθμιστής μεταξύ κυτταρικού πολλαπλασιασμού και κυτταρικής διαφοροποίησης. Με βάση τα όσα αναπτύχθηκαν παραπάνω, η Geminin είναι ένα μόριο με δύο διακριτούς ρόλους σε κυτταρικό κύκλο και διαφοροποίηση. Αυτές οι δύο λειτουργίες της ωστόσο την καθιστούν ένα μόριο κλειδί για την ρύθμιση της ισορροπίας των δύο διαδικασιών. Αυτό γίνεται σαφές μέσω των ανταγωνιστικών αλληλεπιδράσεων που έχει προταθεί ότι συμβαίνουν μεταξύ της Geminin για την πρόσδεση στα Ηox και Six3 ή το Cdt1. Αν και ακόμα δεν υπάρχουν ακριβή δεδομένα για την αλληλεπίδραση μεταξύ Geminin και Ηοx ή Six3, σε αυτή συμμετέχει το σπειροειδές σπείραμα της Geminin το οποίο απαιτείται για την αλληλεπίδραση της με το Cdt1. To γεγονός αυτό οδηγεί σε ένα μοντέλο σύμφωνα με το οποίο υπάρχει μία σχέση ανταγωνιστική για πρόσδεση στο μόριο της Geminin. Στο μοντέλο αυτό, στην περίπτωση των Hox πρωτεϊνών, όταν η Geminin βρίσκεται σε σύμπλοκο με το Cdt1, αυτές δεν βρίσκονται υπό την ανασταλτική επίδραση της Geminin με αποτέλεσμα να μπορούν να προσδεθούν στις αλληλουχίες ενισχυτών των καθοδικών γονιδίων στόχων τους και να ενεργοποιήσουν τη μεταγραφή τους. Παράλληλα το Cdt1 είναι προσδεδεμένο στην Geminin και δεν είναι διαθέσιμο για την αδειοδότηση της αντιγραφής του DNA. Αυτό έχει σαν αποτέλεσμα την παρεμπόδιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και την επαγωγή της κυτταρικής διαφοροποίησης. Αντίθετα όταν επικρατεί η αλληλεπίδραση μεταξύ της Geminin και των Hox πρωτεϊνών, το Cdt1 είναι διαθέσιμο για τον σχηματισμό του προαντιγραφικού συμπολόκου ενώ οι Hox πρωτεΐνες δεν θα είναι σε θέση να ενεργοποιήσουν τη μεταγραφή των καθοδικών γονιδίων στόχων τους με αποτέλεσμα 33

34 να πριμοδοτείται ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός σε σχέση με τη διαφοροποίηση (Luo and Kessel, 2004) Eικόνα 11: Το μοντέλο σύμφωνα με το οποίο ο ανταγωνισμός μεταξύ των Hox πρωτεϊνών και της Geminin έχει σαν αποτέλεσμα την κυτταρική διαφοροποίηση όταν επικρατεί η αλληλεπίδραση μεταξύ Geminin-Cdt1 και τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό όταν επικρατεί η αλληλεπίδραση μεταξύ Geminin-Hox (Luo and Kessel, 2004) Σε ότι αφορά την αλληλεπίδραση της Geminin με το Six 3 κατά την ανάπτυξη του αμφιβληστροειδούς στον ιχθύ Medaka και πώς αυτή μπορεί να οδηγήσει στην ρύθμιση του πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης, έχει προταθεί ένα μοντέλο βάση του οποίου το Six 3 μπορεί να συναγωνιστεί ή να παρεμποδίσει τη δέσμευση του Cdt1 στην Geminin. Όταν είναι προσδεδεμένη στο Six3 η Geminin ανταγωνίζεται την δράση του στην ενεργοποίηση γονιδίων που επάγουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό στον αμφιβληστροειδή, ενώ στο σύμπλοκο με το Cdt1 συμβάλει στην διατήρηση της γονιδιωματικής πιστότητας αποτρέποντας την Cdt1 διαμεσολαβούμενη έναρξη της αντιγραφής του DNA. H αλληλεπίδραση μεταξύ Geminin και Six3 μπορεί να επηρεάσει την διαθέσιμη δεξαμενή της Geminin για το Cdt1 και με αυτό τον τρόπο να συντονίζει τον έλεγχο της αντιγραφής του DNA με 34

35 μεταγραφικές αλλαγές που συμβαίνουν κατά την μετάβαση από τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό στην κυτταρική διαφοροποίηση (Kroll, 2007; Luo et al., 2004). Ο ρυθμιστικός ρόλος της Geminin είναι εμφανής και μέσα από την δράση της κατά την ανάπτυξη του νευρικού συστήματος. Όπως αναφέρθηκε παραπάνω η αλληλεπίδραση της Geminin με το Βrg1 διατηρεί την πολλαπλασιαστική ικανότητα των αρχέγονων νευρικών κυττάρων καθώς δεν επιτρέπει την επαγόμενη από το SWI/SNF μεταγραφή γονιδίων που επάγουν την νευρογένεση (Kroll et al., 1998) Στην παρακάτω εικόνα συνοψίζεται ο ρόλος της Geminin σε κυτταρικό κύκλο και διαφοροποίηση και η συμβολή της στη ρύθμιση αυτών των δύο διαδικασιών. Εικόνα 12: Οι δράσεις της Geminin και η συμβολή της στη ρύθμιση μεταξύ πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης.(βλ.κείμενο) (Kroll, 2007) 35

36 1.3.1 Εύρεση και περιγραφή ενός νέου γενετικού τόπου στο ανθρώπινο γονιδίωμα με σημαντική ομολογία για την περιοχή σπειροειδούς σπειράματος της Geminin Η εύρεση και ο χαρακτηρισμός γονιδίων αποτελούν βασικό στόχο για την απόκτηση μιας πλήρους εικόνας της κυτταρικής λειτουργίας. Αυτή η προσπάθεια συχνά μπορεί να είναι κατευθυνόμενη με βάση την ήδη υπάρχουσα γνώση για μελετημένες πρωτεΐνες. Η Geminin είναι μία εξαιρετικά ενδιαφέρουσα πρωτεΐνη με πολυδιάστατη λειτουργία που μέσα από ένα σημαντικό αριθμό μοριακών αλληλεπιδράσεων συμμετέχει σε πολλές διαδικασίες. Mε χρήση βάσεων δεδομένων και προγραμμάτων τα οποία είναι σε θέση να κάνουν στοχευόμενες αναζητήσεις μέσα σε αυτές είναι δυνατός ο προσδιορισμός νέων γονιδίων και στην συνέχεια η ανάλυση τους με χρήση υπολογιστικών προγραμμάτων για την εύρεσή στοιχείων στην αλληλουχία τους που μπορούν να μας βοηθήσουν στον προσδιορισμό της λειτουργικότητας τους. Στα πλαίσια της προσπάθειας εύρεσης πρωτεϊνών με αμινοξική και πιθανή λειτουργική ομολογία με την Geminin χρησιμοποιήθηκε η αμινοξική αλληλουχία αυτής και με χρήση εργαλείων βιοπληροφορικής ανάλυσης συγκρίθηκε με όλα τα ανθρώπινα cdna προκειμένου να βρεθούν cdna τα οποία θα μπορούσαν να κωδικοποιόυν για πρωτεΐνες με παρόμοια αμινοξική αλληλουχία. Τα αποτελέσματα της προσπάθειας αυτής περιλαμβάνουν και ένα προβλεπόμενο mrna μήκους 2609bp, καταχωρημένο ως similar to Geminin που αντιστοιχεί στον γενετικό τόπο LOC Η πρωτεΐνη που προκύπτει από αυτό το mrna αναλύθηκε και βρέθηκε να εμφανίζει σημαντική ομολογία με την Geminin στην ευρύτερη περιοχή του σπειροειδούς σπειράματος της τελευταίας. Η περιοχή αυτή συγκεκριμένα εντοπίζεται μεταξύ 96αα-158αα στην Geminin και στο προβλεπόμενο mrna(sbjct) μεταξύ νουκλεοτιδίων. (Δριτσοπούλου Ελίνα, 2005). Η πρωτεΐνη που κωδικοποιείται από το προβλεπόμενο αυτό mrna ονομάστηκε Castor Το πιθανό γονίδιο του Castor στον άνθρωπο χαρτογραφείται στο πέμπτο χρωμόσωμα και συγκεκριμένα στην θέση μεταξύ των βάσεων , και έχει μήκος 8517bp ( Εικόνα 13) 36

37 Εικόνα 13 : Χρωμοσωμική θέση των γονιδίων της Geminin και του Castor Σε ότι αφορά τον ευρύτερο γενετικό τόπο του Castor αυτός γειτνιάζει ανοδικά με το γονίδιο που κωδικοποιεί τον παράγοντα CDC20B και καθοδικά με το γονίδιο CCNO. Το μεν CDC20B κωδικοποιεί για τoν παράγοντας CDC20, ο οποίος αποτελεί ενεργοποιητή του APC (Anaphase Promoting Complex) (Zachariae and Nasmyth, 1999). Το δε CCNO κωδικοποιεί την Uracil-DNA glycosilase2. Η UNG-2 (uracil DNA N-glycosylase) είναι ένα επιδιορθωτικό ένζυμο που αναγνωρίζει και αφαιρέι μόρια ουρακίλης από το DNA μετά την μεταγραφή (Lindahl et al., 1977). Η μεταγραφή των γειτονικών αυτών γονιδίων γίνεται με την ίδια φορά με αύτή του γονιδίου του Castor. (Δριτσοπούλου Ελίνα, 2005, Δημάκη Μαρία 2008) Στοιχεία που υποστηρίζουν την έκφραση του γονίδιου του Castor H έκφραση του γονιδίου του Castor βασίζεται τόσο στην ύπαρξη 11 ESTs (Expresssed sequence Tags) όσο και ενός cdna προερχόμενο από HeLa κύτταρα τα οποία και είναι καταχωρημένα στις βάσεις δεδομένων. Με βάση τα παραπάνω 37

38 δεδομένα είναι δυνατή η πρόβλεψη του mrna που μεταγράφεται από αυτό το γονίδιο. Το mrna έχει μήκος 2087 bp και αποτελείται από 7 εξώνια (εικόνα 14) Μη μεταγράψιμο Μεταγράψιμο Εικόνα 14: Το προτεινόμενο mrna Η έκφραση του γονίδιου του Castor έχει πιστοποιηθεί και πειραματικά τόσο με Reverse Transcription PCR όσο και με Real Time PCR αναλύσεις στις οποίες χρησιμοποιήθηκαν ΗeLa και MCF7 καρκινικές κυτταρικές σειρές (Πεφάνη Δάφνη,2006, Συμεωνιδου Ελεάννα,2008). Μια ενδιαφέρουσα διαφορά μεταξύ του προβλεπόμενου mrna του Castor και του καταχωρημένου στις βάσεις δεδομένων cdna είναι η ύπαρξη τεσσάρων (GCAA) νουκλεοτιδίων στα όρια του τέταρτου και πέμπτου εξωνίου (Εικόνα 3) Εικόνα 3: Αποτελέσματα από Blast 2 sequences μεταξύ του προβλεπόμενου mrna και του (CR ) Η ύπαρξη των τεσσάρων αυτών νουκλεοτιδίων οδηγεί σε δύο πιθανά αναγνωστικά πλαίσια με πρωτεϊνικά προϊόντα που αποτελούνται είτε το καρβοξυτερικό τμήμα της πλήρους πρωτεΐνης, συμπεριλαμβανομένου και του σπειροειδούς σπειράματος είτε από το μεγαλύτερο μέρος του αμινοτελικού τμήματος του πλήρους πρωτεϊνικού μορίου με κάποια επιπλέον αμινοξέα (Δριτσοποπούλου Ελίνα, 2006). 38

39 Πειραματικά δεδομένα ωστόσο που προέρχονται από ενίσχυση της συγκεκριμένης περιοχής με PCR με υπόστρωμμα ΗeLa cdna από ακολουθούμενη κλωνοποίηση και αλληλούχιση αυτών των κλώνων υποδεικνύουν την απουσία των τεσσάρων νουκλεοτιδίων Η πρωτεϊνική αλληλουχία του Castor Το προβλεπόμενο mrna του Castor κωδικοποιεί για μία πρωτεΐνη μήκους 385 αμινοξέων, η οποία εμφανίζει υψηλή ομολογία με την πρωτεϊνική αλληλουχία της Geminin στην ευρύτερη περιοχή του σπειροειδούς σπειράματος της τελευταίας. Πειραματικά δεδομένα τα οποία προέρχονται από πειράματα ανοσοφθορισμού σε παροδικά διαμολυσμένα κύτταρα με την υβριδική πρωτεΐνη CastorGFP αναφέρουν ότι ο Castor είναι μια πυρηνική πρωτεΐνη, η οποία εντοπίζεται αποκλειστικά στον πυρήνα και αποκλειόμενη από τους πυρηνισκούς. Το πρότυπο δηλαδή της ενδοκυτταρικής κατανομής του μορίου συμπίπτει με αυτό της ενδογενούς Geminin Πεφάνη Δάφνη, 2006, Δημάκη Μαρία,2008) Ορθόλογα της ανθρώπινης πρωτεΐνης έχουν βρεθεί και σε άλλους οργανισμούς τόσο σε θηλαστικά, όσο και σε αμφίβια και ιχθύες (Πίνακας 2) 39

40 Θηλαστικά Mus musculus Rttus norvegicus Equus caballus Mcaca mulatta Pan troglodytes Αμφίβια Ιχθύες Xenopus laevis Oryzias latipes Danio rerio Tetraodon nigroviridis Πίνακας 2: Ορθόλογα της ανθρώπινης πρωτεΐνης Castor σε άλλους οργανισμούς. Τα παραπάνω δεδομένα καθιστούν τον Castor σαν ένα πολύ ενδιαφέρον προς μελέτη μόριο, τόσο για την περεταίρω in silico μελέτη του όσο και για τον πειραματικό προσδιορισμό της λειτουργικότητας του, τόσο σε σχέση όσο και ανεξάρτητα από το ομόλογο του, την Geminin 40

41 2.Στόχος 41

42 Οι στόχοι της παρούσας διπλωματικής εργασίας ήταν οι εξής 1.Η in silico ανάλυση ενός νέου μορίου μπορεί να μας δώσει ενδιαφέρουσες πληροφορίες σχετικά με στοιχεία στην πρωτεϊνική της αλληλουχία που θα μπορούσαν να χρησιμεύσουν στον προσδιορισμό της λειτουργίας της. Πρώτο στόχο αποτέλεσε η ανάλυση της πρωτεϊνικής αλληλουχίας του ομολόγου της Geminin, Castor αλλά η σύγκρισή του με την πρωτεϊνική αλληλουχία της Geminin με την χρήση κατάλληλων εργαλείων βιοπληροφορικής.. 2. Για την μελέτη ενός μορίου απαιτούνται κατάλληλα μοριακά εργαλεία τα οποία στην συνέχεια θα χρησιμοποιηθούν σε πειραματικές προσεγγίσεις με στόχο τον προσδιορισμό της δράσης του. Δεύτερο στόχο αποτέλεσε η ανάπτυξη τέτοιων εργαλείων για το μόριο του Castor. Α) Το πρώτο αφορά την παραγωγή και καθαρισμό πολυκλωνικού αντισώματος κατά κατά της 6His-N-CastorGFP πρωτεΐνης και στην συνέχεια τον προσδιορισμό της λειτουργικότητας αυτού σε ανοσοτύπωση Western. Το αντίσωμα θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί στην συνέχεια σε πειραματικές διαδικασίες για τον εντοπισμός της ενδογενόυς πρωτεΐνης Castor. B) Το δεύτερο αφορά την ανάπτυξη της μεθοδολογίας του RNAi για την αποσιώπηση του γονιδίου του Castor σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές. Η αποσιωπήσει ενός γονίδιου είναι σημαντικό εργαλείο για τον προσδιορισμό της λειτουργίας του. 3. Σε προηγούμενη μελέτη του εργαστηριού μας είχε βρεθεί ότι o Castor αλληλεπιδρά με την Geminin (Δημάκη Μαρία, 2008). Τρίτο στόχο της παρούσας μελέτης αποτέλεσε η επιβεβαίωση της αλληλεπίδρασης μεταξύ Castor και Geminin και η χαρτογράφηση αυτής. Στην συνέχεια μελετήθηκε και ο ομοδιμερισμός του Castor. Τέλος προκειμένου να διαπιστώσουμε αν υπάρχει πιθανός ανταγωνισμός μεταξύ της πρόσδεσης στην Geminin και τον ομοδιμερισμό του Castor, συγκρίθηκε η ισχύς των δύο αλληλεπιδράσεων. 42

43 3.Υλικά και Μέθοδοι 43

44 3.1 Προγράμματα και βάσεις δεδομένων που χρησιμοποιήθηκαν για την βιοπληροφορική ανάλυση του Castor Για την εύρεση των ESTs και του καταχωρημένου cdnα του Castor χρησιμοποιήθηκαν οι βάσεις δεδομένων του NCBI(National Center Biotechnology Information) και το πρόγραμμα ΒLAST από τα NCBI tools. Για την έυρεση ομόλογων πρωτεϊνών τον Castor χρησιμοποιήθηκε το πρόγραμμα blastp του NCBI στο οποίο σαν ερώτημα (query) τοποθετείται η πρωτεϊνική αλληλουχία του Castor και η αναζήτηση γίνεται σε Refseq βιβλιοθήκες. Για την εύρεση της ομολογιάς μεταξύ των πρωτεϊνών Castor και Geminin αλλά και επιμέρους περιοχών αυτών χρησιμοποιήθηκε το πρόγραμμα BLAST 2 sequences του NCBI. Για την εύρεση πιθανού coiled coil στον Castor τοποθετήθηκε η πρωτεϊνική του αλληλουχία στο πρόγραμμα Coils από τα Expasy tools Για την ευθυγράμμιση των πρωτεϊνικών ορθολόγων της Geminin και του Castor (full sequence alignments) χρησιμοποιήθηκε το πρόγραμμα clustal W από τα Εxpasy tools. Για την εύρεση μοτίβων στον Castor με πιθανή λειτουργική σημασεία η πρωτεϊνική του αλληλουχία εισήχθηκε στο πρόγραμμα ELM (Eukaryotic Linear Motif resource for functional sites in protein) από τα Expasy tools. Για την εύρεση θέσεων πιθανών μετε-μεταφραστικών τροποποιήσεων η πρωτεϊνική αλληλουχία του Castor εισήχθηκε στο πρόγραμμα Pro-scan από τα Expasy tools 44

45 3.2 Πρωτόκολλαμεθόδων χειρισμού κύτταρων Ξεπάγωμα κυττάρων 1. Το σωληνάκι με τα παγωμένα κύτταρα μεταφέρεται από το υγρό άζωτο στο υδατόλουτρο των 37 o C, όπου και παραμένει υπο ελαφριά ανάδευση για λίγη ώρα μέχρι να αρχίσουν να ξεπαγώνουν τα κύτταρα. 2. Στη συνέχεια, τα κύτταρα μεταφέρονται σε τρυβλίο petri που περιέχει θρεπτικό μέσο. Το τρυβλίο με τα κύτταρα φυλάσσεται στον επωαστή με 37 o C και 5% CO Την επόμενη ημέρα γίνεται αλλαγή του θρεπτικού μέσου Αλλαγή θρεπτικού μέσου (100mm dish) 1. Αφαίρεση του υπερκείμενου θρεπτικού μέσου. 2. Ακολουθούν δύο πλύσεις με 10 ml διαλύματος PBS (1x). 3. Προσθήκη στο τρυβλίο 10 ml φρέσκου θρεπτικού διαλύματος και επανατοποθέτηση στον επωαστή Διαχωρισμός κυττάρων (Split) (100mm dish) Λαμβάνει χώρα όταν τα κύτταρα έχουν καλύψει το 70-80% της επιφάνειας του τρυβλίου. 1. Αφαιρείται το υπερκείμενο θρεπτικό μέσο. 2. Ακολουθούν δύο γρήγορες πλύσεις με PBS (1x). 3. Στη συνέχεια προστίθενται 800 μl διαλύματος τρυψίνης (1x). Το τρυβλίο τοποθετείται στον επωαστή των 37 o C για 1 λεπτό. 4. Καλή ανάμειξη των κυττάρων με την πιπέτα, έτσι ώστε να ανασηκωθούν όλα τα κύτταρα και να σπάσουν τυχόν συσσωματώματα ml από τα κύτταρα αυτά μεταφέρονται σε νέο τρυβλίο petri που περιέχει 7 ml φρέσκου θρεπτικού μέσου και μεταφέρονται στον επωαστή 45

46 3.2.4 Συλλογή κυτταρικών εκχυλισμάτων 1.To τρυβλίο από το οποίο θα γίνει η συλλογή των πρωτεϊνικών εκχυλισμάτων τοποθετείται σε πάγο. 2. Αφαιρείται το υπερκείμενο θρεπτικό. 3. Τα κύτταρα ξεπλένονται γρήγορα δύο φορές με παγωμένο PBS (1x). 4. Προστίθεται 1 ml PBS (1x) και με χρήση scrapper συλλέγονται τα κύτταρα σε σωληνάκι eppendorf. 5. Τα κύτταρα φυγοκεντρούνται στις rpm, στους 4ºC, για 10 λεπτά. 6. Απομακρύνεται το υπερκείμενο PBS και προστίθεται στο ίζημα των κυττάρων διάλυμα FSB-DTT 1x. 7. Το πρωτεϊνικό εκχύλισμα βράζεται στους 95ºC για 5 λεπτά. 8. Το πρωτεϊνικό εκχύλισμα αποθηκεύεται στους -20ºC Γονιδιακή αποσιώπηση με τη μέθοδο του RNAi (RNA interference) Με σκοπό τη γονιδιακή αποσιώπηση του γονιδίου του Castor σχεδιάστηκαν 2 sirna δίκλωνα ολιγονουκλεοτίδια sirnai (Invitrogen) με την εξής αλληλουχία: 5 CCCACCAAACGGAAGCAGACTTCAAT 3 5 GAGACGCGCTTGTTGAGAATAATCA 3 Με βάση την αλληλουχία σχεδιάστηκε και ένα δίκλωνο RNA ολιγονουκλεοτίδιο το οποίο χρησιμοποιείται σαν αρνητικός μάρτυρας με αλληλουχία: 5 CCAAACAGGAACGGACAUUCCCAAU 3 Η διαμόλυνση έγινε με 100nM τελική συγκέντρωση και των δύο sirna μαζί με την χρήση του αντιδραστηρίου lipofectamine 2000 (Invitrogen, ) με βάση τις οδηγίες του κατασκευαστή. Δύο διαμολύνσεις λαμβάνουν χώρα μία τη χρονική στιγμή 0 και μια μετά απο 24 ώρες, ενώ πρωτεϊνικά εκχυλίσματα λαμβάνονται τόσο 24 ώρες μετά την πρώτη διαμόλυνση όσο και 48 ώρες από την πρώτη διαμόλυνση αφού έχει μεσολαβήσει και η δεύτερη. 46

47 Υλικά για την συγκεκριμένη μέθοδο RNAi (stealth RNAi, Invitrogen) lipofectamine 2000 (Invitrogen, ) Παροδική διαμόλυνση κυττάρων Για την παροδική διαμόλυνση κυττάρων χρησιμοποιείται το αντιδραστήριο GeneJammer (Stratagene, ) και ακολουθείται το πρωτόκολλο που προτείνουν οι κατασκευαστές. Πειραματική πορεία για διαμόλυνση σε 35mm dish. 1. Tα κύτταρα καλλιεργούνται μέχρι να καλύψουν περίπου το 70% του τρυβλίου 2. Αναμειγνύονται 5μλ από το αντιδραστήριο με DMEM 100 μλ τελικό όγκο και επώαση 5-10 λεπτά 3. Εισαγωγή 1 μg πλασμιδιακού DNA και αναμονή για 5-10 λεπτά. Στην περίπτωση παράλληλης εισαγωγής τριών διαφορετικών πλασμιδίων, η συνολική ποσότητα του DNA είναι 1,5μg. 4. Αναρρόφηση του θρεπτικού μέσου των κυττάρων. 5. Ξέπλυμα των κυττάρων δύο φορές με PBS (1x). 6. Προσθήκη 1ml DMEM 20%(P/S+) στο τρυβλίο 7.Προσθήκη του μείγματος DNA-αντιδραστηρίου στο τρυβλίο 8. Μετά το πέρας 3 ωρών προστίθεται επιπλέον ποσότητα medium ώστε ο τελικός όγκος να είναι 2 ml. Υλικά για την συγκεκριμένη μέθοδο Αντιδραστήριο GeneJammer (Stratagene, ) Διαλύματα και υλικά μεθόδων χειρισμού κυττάρων Θρεπτικό μέσο καλλιέργειας ευκαρυωτικών καρκινικών κυττάρων: Οι καρκινικές κυτταρικές σειρές HeLa και MCF7 οι οποίες χρησιμοποιήθηκαν καλλιεργήθηκαν σε θρεπτικό μέσο DMEM (Gibco Cat.No ) εμπλουτισμένο με 10% ή 20% αντίστοιχα FBS (fetal bovine serum, Gibco Cat. No. 47

48 ) και παρουσία αντιβιοτικών πενικιλίνης και στρεπτομυκίνης (P/S, Gibco, Cat. No ) σε τελική συγκέντρωση 5%. PBS (συγκέντρωση stock ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών, 10x) Για την παρασκευή stock διαλύματος (10x) PBS, 80 gr NaCl, 2 gr KCl, 2,4 gr KH 2 PO 4 και 14,4 gr Na 2 HPO 4 αναδιαλύονται σε τελικό όγκο 1 l ddh 2 O. Ακολουθεί αποστείρωση. PBS (συγκέντρωση ρυθμιστικού διαλύματος εργασίας φωσφορικών, 1x) Ποσότητα του stock διαλύματος 10X PBS αραιώνεται σε αναλογία αρχικού:τελικού όγκου, 1:10. Το ph του διαλύματος ρυθμίζεται με προσθήκη μικρής ποσότητας 5 Ν HCl, έτσι ώστε η τιμή του να κυμαίνεται μεταξύ 7,2 και 7,4. Ακολουθεί αποστείρωση Διάλυμα τρυψίνης (συγκέντρωση διαλύματος εργασίας, 1x) Για την παρασκευή διαλύματος εργασίας 1x τρυψίνης, ποσότητα 1 ml stock διαλύματος 10x τρυψίνης (Biochrom AG, L2153) αραιώνεται υπό άσηπτες συνθήκες σε τελικό όγκο 10 ml αποστειρωμένου διαλύματος (1x) PBS 2X FSB DTT Για την παρασκευή του οποίου χρησιμοποιούμε: 20% γλυκερόλη, 160mM Tris HCl ph 6,8 4% SDS 0,01% bromophenol blue 0,2M DTT (προστίθεται τελευταίο μόνο σε διάλυμα το οποίο πρόκειται να χρησιμοποιηθεί άμεσα) DTT (1 M stock) Για την παρασκευή 1Μ DTT διαλύματος, 2,66 gr ουσίας αναδιαλύονται με 17,24 ml ddh 2 O σε τελικό όγκο 20 ml. Το διάλυμα φυλάσσεται στους -20 ο C. 3.3 SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) Με την SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση επιτυγχάνεται διαχωρισμός πρωτεϊνών με βάση την ηλεκτροφορητηκή τους κινητικότητα. Η τελευταία καθορίζεται από το μοριακό βάρος και το ισοηλεκτρικό σημείο κάθε πρωτεΐνης. Στην SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate) ηλεκτροφόρηση με τη χρήση του ανιονικού 48

49 απορρυπαντικού SDS επιτυγχάνεται η αποδιάταξη των πρωτεϊνικών αλυσίδων ενώ προσδίδεται σε αυτές ενιαίο αρνητικό φορτίο προκείμενου να είναι δυνατός ο διαχωρισμός τους μόνο βάση του μοριακού βάρους της πρωτεΐνης.. Η επιπλέον χρήση αναγωγικών παραγόντων όπως είναι το DTT (DiThioThreitol) ή η β- μερκαπτοαιθανόλη, έχει ως αποτέλεσμα τη διάσπαση των δισουλφιδικών δεσμών των πρωτεϊνών. Η πλήρης αποδιάταξη των πρωτεϊνών επιτυγχάνεται με τη θέρμανση των πρωτεϊνικών δειγμάτων για 5 min στους 95 ο C, παρουσία των παραπάνω αποδιατακτικών παραγόντων. Στο συγκεκριμένο αυτό είδος ηλεκτροφόρησης (SDS-PAGE) χρησιμοποιούμε ως μέσο διαχωρισμού το ακρυλαμίδιο. Το ακρυλαμίδιο δημιουργεί τρισδιάστατα πολυμερή δίκτυα σε μια ευρεία κλίμακα συγκεντρώσεων από 3% μέχρι 30%. Το πήκτωμα σχηματίζεται με πολυμερισμό των μονομερών ακρυλαμιδίου, που οδηγεί στη δημιουργία αλυσίδων πολυακρυλαμιδίου. Στις αλυσίδες αυτές ενσωματώνονται κατά διαστήματα μόρια ΝΝ-μεθυλεν-bis-ακρυλαμιδίου (bis), τα οποία λόγω της δομής τους μπορούν να ενσωματωθούν σε δύο διαφορετικές αλυσίδες και έτσι να δημιουργηθεί πλέγμα. Ο πολυμερισμός του ακρυλαμιδίου είναι ένα παράδειγμα καταλυτικής δράσης των ελευθέρων ριζών. Η κατάλυση γίνεται μέσω μίας βάσης, της ΝΝΝ Ν -τετραμεθυλαιθυλενοδιαμίνη (TEMED), αλλά μόνο με τη βοήθεια ελευθέρων ριζών που δημιουργούνται χημικά με υπερθειϊκά ιόντα (S 2 O 2-3 ), χάρη στην παρουσία ενός δεύτερου καταλύτη του Ammonium Persulphate (APS). Η διαδικασία είναιη εξής: 1. Αρχικά συναρμολογείται η συσκευή(εγχειρίδιο χρήσης BIORAD) ετοιμάζεται το πήκτωμα διαχωρισμού των πρωτεϊνών και φορτώνεται στη συσκευή καλύπτοντας περίπου τα 3:4 αυτής. Το ποσοστό του ακριλαμιδιόυ εξαρτάται από το μοριακό μέγεθος της πρωτεΐνης που θέλουμε να ανιχνεύσουμε 2.Όταν το πήκτωμα διαχωρισμού πήξει, ετοιμάζεται το πήκτωμα πακεταρίσματος και τοποθετείται πάνω από το πρώτο. 3. Η συσκευή τοποθετείται μέσα στο δοχείο της ηλεκτροφόρησης που περιέχει το διάλυμα Laemmli (1x). 4. Φορτώνονται τα δείγματα 5. Στη συνέχεια κλείνεται η συσκευή και εφαρμόζεται ηλεκτρικό πεδίο τάσης 100 V. Όταν το μέτωπο της χρωστικής περάσει από το πήκτωμα πακεταρίσματος στο πήκτωμα διαχωρισμού η τάση μπορεί να προσαρμοστεί στα 150 V. 6. Όταν ολοκληρωθεί η ηλεκτροφόρηση το πήκτωμα βάφεται με τη χρωστική Coomasie 49

50 Υλικά για την συγκεκριμένη μέθοδο Αναλυτικός πίνακας συγκεντρώσεων των διαλυμάτων που χρησιμοποιούνται για την παρασκεύη του πηκτώματος διαχωρισμού ανάλογα με το ποσοστό πολυακρυλαμιδίου του πηκτώματος 10% SDS Για την παρασκευή 10% SDS διαλύματος, 10 gr ουσίας αναδιαλύονται σε τελικό όγκο 100 ml ddh 2 O. 10% APS Για την παρασκευή 10% APS διαλύματος, 2 gr ουσίας αναδιαλύονται σε τελικό όγκο 20 ml ddh 2 O. 50

51 Acrylamide/bis-Acrylamide 30% Solution, Electrophoresis reagent (Sigma, A3574) Ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροφόρησης Laemmli (συγκέντρωση stock διαλύματος, 10x) Για την παρασκευή ρυθμιστικού διαλύματος ηλεκτροφόρησης Laemmli 10x αναδιαλύονται 30,3 gr Tris-base, 144,2 gr γλυκίνης και 10 gr SDS σε τελικό όγκο 1 l ddh 2 O. Το διάλυμα φυλάσσεται σε θερμοκρασία δωματίου. Διάλυμα αποχρωματισμού της χρωστικής Coomassie Για την παρασκευή διαλύματος αποχρωματισμού της χρωστικής Coomassie, οξικό οξύ και απόλυτη αιθανόλη αραιώνονται σε ddh 2 O σε αναλογίες 10% και 20% αντίστοιχα, επί του τελικού όγκου. Mάρτυρας μοριακών μεγεθών πρωτεϊνών Ο πρωτεϊνικός μάρτυρας (BIORAD, ) αραιώνεται σε αναλογία αρχικού:τελικού όγκου 1:10, με διάλυμα 1XFSB+DTT. 3.4 Καθαρισμός χημικής συγγένειας αντισώματος με τη χρήση πρωτεΐνης ακινητοποιημένης σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης Πειραματική διαδικασία 1. Σε πήκτωμα πολυκαρυλαμιδίου συγκέντρωσης 10% αναλύονται με SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση 300 μg 6His-N Castor πρωτεΐνης τα οποία αναμειγνύονται με ίσο όγκο 2x FSB+DTT. 2. Μεταφορά της πρωτεΐνης σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Η μεταφορά πραγματοποιείται υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου τάσης 42 V για 45 λεπτά, χρησιμοποιώντας το ρυθμιστικό διάλυμα 10 mm CAPS. 3. Η πρωτεΐνη γίνεται ορατή μετά από επώαση της μεμβράνης με την χρωστική Ponceau 51

52 4. Το τμήμα της μεμβράνης στο οποίο βρίσκεται η πρωτεΐνη απομονώνεται με χρήση ξυραφιού και επωάζεται με διάλυμα μπλοκαρίσματος 5% γάλατος σε PBS(1x), για 1 ώρα ώστε να καλυφθούν οι μη ειδικές θέσεις. 5. Η περίσσεια του διαλύματος μπλοκαρίσματος των μη ειδικών θέσεων απομακρύνεται με 3 πεντάλεπτες πλύσεις με διάλυμα PBS(1x). 6. Η μεμβράνη επωάζεται με 300 μl αντιορρού, στον οποίο έχουν προστεθεί 0,6 μλ 10% NaN 3, καθ όλη την διάρκεια της νύχτας σε θερμοκρασία δωματίου. 7. Την επόμενη ημέρα, αφαιρείται ο αντιορρός και ακολουθούν 3 δεκάλεπτες πλύσεις της μεμβράνης με PBS (1x). 8. Η έκλουση των αντισωμάτων που έχουν δεσμευτεί στην ακινητοποιημένη στη μεμβράνη πρωτεΐνη, πραγματοποιείται με διάλυμα γλυκίνης 0,2 Μ, 1 mm EGTA, ph 2,5. Γίνονται δύο εκλούσματα, των 300 μl το καθένα. Η μεμβράνη επωάζεται με το διάλυμα έκλουσης για 10 λεπτά. 9. Τα δύο εκλούσματα συλλέγονται και τοποθετούνται σε δύο σωληνάκια eppendorf, στα οποία έχει τοποθετηθεί κατάλληλη ποσότητα Tris-base (1M), έτσι ώστε η τελική συγκέντρωση του στο διάλυμα να είναι 0,1Μ. Επιπλέον σε καθένα από αυτά προστίθενται 0,6 μl 10% NaN 3. Τα εκλούσματα φυλάσσονται στους 4 o C Υλικά για την συγκεκριμένη μέθοδο Διάλυμα έκλουσης αντισώματος από μεμβράνη νιτροκυτταρίνης: Η σύσταση του διαλύματος αυτού είναι η εξής: 0,2 Μ γλυκίνη, 1 mm EGTA. To ph προσαρμόζεται στην τιμή 2,5 με χρήση διαλύματος HCl. 3.5 Ανοσοαποτύπωση κατά western Η συγκεκριμένη μεθοδολογία χρησιμοποιείται για την ανίχνευση ειδικών επιτόπωνπρωτεϊνών με τη χρήση αντισωμάτων που έχουν αναπτυχθεί και αναγνωρίζουν τους επιθυμητούς επιτόπους-πρωτεΐνες. Προβλέπει αρχικά τον ηλεκτροφοριτικό διαχωρισμό των πρωτεϊνών σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου για τον διαχωρισμό τους με βάση το μέγεθός τους και την επακόλουθη μεταφορά-μονιμοποίηση των πρωτεϊνών σε ειδική μεμβράνη. Στο επόμενο βήμα οι μεμβράνες επωάζονται με το ειδικό αντίσωμα έναντι της πρωτεΐνης που επιθυμούμε να ανιχνεύσουμε ή ποσοτικοποιήσουμε. Μετά από αρκετές πλύσεις πραγματοποιείται επώαση της 52

53 μεμβράνης με το δευτερογενές αντίσωμα που αναγνωρίζει ειδικά το πρωτογενές. Το δευτερογενές αντίσωμα είναι συζευγμένο ομοιοπολικά με κάποιο ένζυμο, το οποίο παρουσία κατάλληλου υποστρώματος συμβάλλει στην εμφάνιση του σήματος. Η εμφάνιση του σήματος γίνεται μέσω της μεθόδου της ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (Enhanced ChemiLuminescence, ECL). Σε αυτή την περίπτωση, τo δευτερογενές αντίσωμα είναι συζευγμένο με το ένζυμο της αλκαλικής υπεροξειδάσης (Horseradish Peroxidase), το οποίο παρουσία του υποστρώματος υπεροξειδίου προκαλεί την οξείδωση της λουμινόλης και την επακόλουθη εκπομπή ακτινοβολίας. Η εκπεμπόμενη ακτινοβολία ανιχνεύεται από την αμαύρωση που προκαλεί η πρόσπτωσή της στο φωτογραφικό φιλμ. Πειραματική πορεία 1. Αρχικά πραγματοποιήται SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση 2. Oι πρωτεΐνες μεταφέρονται σε μεμβράνη PVDF. Η μεταφορά γίνεται μέσα σε ρυθμιστικό διάλυμα 10 mm CAPS με 10% μεθανόλη, υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου τάσης 42 V, για 45 λεπτά. 3. Οι αναλυμένες πρωτεΐνες γίνονται ορατές με χρώση με Ponceau για 20 λεπτά 4. Στην συνέχεια η μεμβράνη ξεβάφεται με Η2Ο και στην συνέχεια με PBS-Tween 5.Παράλληλα το πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου, στο οποίο αναλύθηκαν οι πρωτεΐνες κατά την SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση, βάφεται με τη χρωστική Coomasie Brilliant Blue και ελέγχεται η επιτυχία της μεταφοράς στη μεμβράνη 6. Κάλυψη των μη ειδικών θέσεων δέσμευσης με διάλυμα δέσμευσης μη ειδικών θέσεων 5% γάλα σε PBS, 0,1% Tween (PBS-T), για 1 ώρα. 7. Η μεμβράνη επωάζεται με το πρωτογενές αντίσωμα, σε θερμοκρασία δωματίου σε περιστρεφόμενο τροχό, για όλη τη νύχτα 8. Την επόμενη ημέρα η μεμβράνη ξεπλένεται 2 φορές γρήγορα με PBS-Tween. Ακολουθούν μια 15 λεπτη και μια 5 λεπτη πλύση με PBS-Tween. 9. H μεμβράνη επωάζεται με το δευτερογενές αντίσωμα σε διάλυμα δέσμευσης μη ειδικών θέσεων για 1 ώρα. Το δευτερογενές αντίσωμα είναι συνδεδεμένο με μόρια ενζύμου υπεροξειδάσης. 10. Ακολουθούν 2 γρήγορες πλύσεις, καθώς και μια 15 λεπτη και μια 5 λεπτη με PBS-T. 53

54 11.Το σήμα ανιχνεύεται με τη χρήση του αντιδραστηρίου ECL και αποτυπώνεται σε φωτογραφικό φιλμ. Yλικά για την συγκεκριμένη μέθοδο PBS (1x) - 0.1%Tween (PBS-T) Για την παρασκευή 0,1% PBS-Tween διαλύματος, 0.5 ml 100% Tween-20 προστίθεται σε τελικό όγκο 500 ml (1x) PBS. CAPS (10x) Για την παρασκευή 10x stock διαλύματος υγρής ηλεκτρομεταφοράς πρωτεϊνών, 22,13g ουσίας CAPS αναδιαλύονται σε τελικό όγκο 1 l ddh 2 O. Το ph προσαρμόζεται στην τιμή 11 με προσθήκη διαλύματος NaOH (10N) (συγκέντρωση διαλύματος εργασίας, 10 mm / 1x) Για την παρασκευή διαλύματος εργασίας (1x) CAPS, ποσότητα του stock διαλύματος (10x) CAPS αραιώνεται σε αναλογία αρχικού:τελικού όγκου, 1:10. Επιπλέον, στον τελικό όγκο προστίθεται διάλυμα μεθανόλης (100%) σε τελική αναλογία όγκου 10%. Ponceau S Για την παρασκευή διαλύματος χρωστικής Ponceau S, 0,2 gr Ponceau (Sigma P- 3504) και 3 gr (ή 3 ml) 100% TCA αναδιαλύονται σε τελικό όγκο 100 ml ddh 2 O. Το διάλυμα φυλάσσεται στο σκοτάδι και επαναχρησιμοποιείται. Δευτέρα αντισώματα α-mouse HRP (1:4000) (Chemicon,ΑP160P) α-rabbit HRP (1:6000) (Chemicon, AP187P) 54

55 3.6 Ανοσοφθορισμός Πειραματική διαδικασία 1. Τοποθέτηση αποστειρωμένων καλυπτρίδων επικαλυμένων με poly-l-λυσίνη στα τρυβλία, όπου θα επιστρωθούν τα υπό μελέτη κύτταρα 2. Αφαίρεση του θρεπτικού μέσου και πλύσιμο των κυττάρων 2 φορές με κρύο PBS(1x). 3. Προσθήκη 4% παραφορμαλδεύδης για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. 4. πλύσιμο 2 φορές με PBS (1x),για 5 λεπτά. 5. Eπώαση με 0,3% Triton σε 1xPBS για πέντε λεπτά 6. Πλύσιμο 3 φορές με 1x PBS, για 5 λεπτά 7. Επώαση με διάλυμα μπλοκαρίσματος για την κάλυψη των μη ειδικών θέσεων 3% BSA/10% FBS σε1x PBS για 1 ώρα 8. Προσθήκη του πρώτου αντισώματος (περίπου 40μl σε διάλυμα κάλυψης μη ειδικών θέσεων ) και επώαση όλη τη νύχτα στους 40C. 7. Πλύσεις 3 φορές με 0,1% Tween σε PBS 8. Προσθήκη δεύτερου αντισώματος σε κατάλληλη αραίωση σε 3% ΒSA/10% FBS σε 1xPBS και επώαση για 1h σε θερμοκρασία δωματίου. 9. Πλύσεις 3 φορές με 0,1% Tween σε PBS για 5 λεπτά 10. Πλύση με dd H2O 11. Τοποθέτηση των καλυπτρίδων ανάποδα πάνω σε mounting medium με χρωστική DAPI (VectorLaboratories,CA 94010) και παρατήρηση σε μικροσκόπιο φθορισμού. Υλικά για την συγκεκριμένη μέθοδο Διάλυμα επικάλυψης καλυπτρίδων poly-d-lysine ( 0,1mg/ml) Το διάλυμα αυτό προκύπτει από την αντίστοιχη αραίωση του stock διαλύματος σε αναλογία 1:500. Διάλυμα παραφολμαδεϋδης 4% (PFA) Για την παρασκευή διαλύματος παραφορμαλδεϋδης τελικής συγκέντρωσης 4%, 20 gr PFA (MERCK, Art 4005) αναδιαλύονται σε τελικό όγκο 500 ml διαλύματος (1x) 55

56 PBS. Η ανάδευση πραγματοποιείται σε θερμοκρασία 65 ο C και για αρκετή ώρα, μέχρις ότου να διαλυτοποιηθεί πλήρως η ουσία. Διάλυμα 0,3% Triton X-100 Για την παρασκευή διαλύματος 0,3% Triton X-100,λαμβάνεται κατάλληλος όγκος από το πυκνό 100% Triton X-100 και διαλύεται σε (1x) PBS. Διάλυμα κάλυψης μη ειδικών θέσεων στον ανοσοφθορισμό Το δίαλυμα παρασκευάζεται ως εξής: σε διάλυμα (1x) PBS προστίθεται BSA (Bovine Serum Albumin, Sigma Cat. No. A-9418) σε τελική συγκέντρωση 3% και FBS σε τελική συγκέντρωση 10%. Δεύτερα αντισώματα Αlexa a-mouse 488 (Molecular probes, A11029) Alexa a-rabbit 568 (Molecular probesa11077) 3.7 Ανοσοκατακρήμνιση (IP) Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων της πρωτεΐνης Castor ώρες πριν την εκτέλεση του πειράματος προηγείται παροδική διαμόλυνση στα κύτταρα των συζευγμένων με GFP ή HA πρωτεϊνών των οποίων θέλουμε να εξετάσουμε την πιθανότητα αλληλεπίδρασης. A.Προετοιμασία των σφαιρίδια αγαρόζης τα οποία είναι συνδεδεμένα με την πρωτεΐνη Α του Staphylococus aureus (upstait, ) 1.50 μλ σφαιριδίων/ιp φυγοκεντρούνται στις 5000 rpm για 5 λεπτά και απομακρίνεται το υπερκείμενο της φυγοκέντρισης 2. Προστίθεται 1ml διαλύματος λύσης και ακολουθεί 5λεπτη ανακίνηση 3. Φυγοκέντριση για 5 λεπτά στις 5000 rpm 4. Επανάληψη των βημάτων 1-3 για 3 φορές. 56

57 5. Επαναδιάλυση των σφαιριδίων σε τόσο όγκο διαλύματος λύσης όσος ήταν και ο όγκος των σφαιριδίων που χρησιμοποιήθηκε αρχικά. Β. Πρόσδεση αντισώματος στα πρωτεϊνικά σφαιρίδια Σε όλες τις περιπτώσεις η ανοσοκατακρίμνηση έγινε με α-ηα (mouse monoclonal 12ca5, Santa Cruz), ενώ χρησιμοποιούνται 1,5 μg αντισώματος/ιp 1. To αντίσωμα αναμειγνύεται με τα πρωτεϊνικά σφαιρίδια 2. Επώαση υπό ανακίνηση σε ρόδα για 2 ώρες στους 4 0 C. 3. Προσθήκη 1ml διαλύματος λύσης 4. Ανακίνηση για 5 λεπτά 5. Φυγοκέντριση για 5 λεπτά στις 5000 rpm 6. Αφαίρεση του υπερκειμένου 7. Επανάληψη των βημάτων 3-6 για 3 φορές 8. Τελική επαναδίαλυση των σφαιριδίων σε 100μλ διαλύματος λύσης/ιp Γ. Κατεργασία κυττάρων ώρες μετά την παροδική διαμόλυνση τα κύτταρα λαμβάνονται από τον επωαστικό θάλαμο με πάγο 2. Αφαίρεση θρεπτικού μέσου 3. Δύο γρήγορα πλυσίματα με κρύο PBS(1x) 4. Προσθήκη 120 μλ από το διάλυμα λύσης /35 mm dish 5. Επώαση για 10 λεπτά 6. Συλογή κυτταρικού εκχυλίσματος με scraper και τοποθέτηση σε σωληνάκι ependorf 7. Πέρασμα των συνολικών κυτταρικών εκχυλισμάτων από σύριγγα 57

58 8. Φυγοκέντριση στις rpm για 10 λεπτά 9. Λήψη δείγματος (totals) υπερκειμένου και ανάμειξη με ίση ποσότητα 2xFSB+DTT.Βράσιμο για 5 λεπτά στους 95 0 C και φύλαξη στους C 10. Προσθήκη της υπόλοιπης ποσότητας του υπερκειμένου στα πρωτεϊνικά σφαιρίδια που έχουν επωαστεί με το αντίσωμα και επώαση για 3 ώρες υπο ανάδευση σε ρόδα στους 4 0 C. 11. Φυγοκέντριση για 5 λεπτά στις 5000 rpm 12. Λήψη ποσότητας από το υπερκείμενο(supernatant) και ανάμειξη με ίση ποσότητα 2xFSB+DTT.Βράσιμο για 5 λεπτά στους 95 0 C και φύλαξη στους C. 12. Απόρριψη του υπόλοιπου υπερκειμένου και προσθήκη 1ml διαλύματος λύσης. 13. Aνάδευση για 5 λεπτά 14. Φυγοκέντριση για 5 λεπτά στις 5000 rpm 15. Επανάληψη των βημάτων12-14 για 3 φορές 16. Τελική επαναδίαλυση των σφαιριδίων (IPs) σε 40 μλ 1xFSB+DTT. Βράσιμο για 5 λεπτά στους 95 0 C και φύλαξη στους C Ακολουθεί ανοσοαποτύπωση Western κατά την οποία το σύμπλοκο αναλύεται στα συστατικά του και με την χρήση α-gfp στην συγκεκριμένη περίπτωση διαπιστώνουμε ή όχι την συνανοσοκατακρήμνηση της πρωτεΐνης με την οποία θέλουμε να δούμε αν σχηματίζει σύμπλοκο ο Castor Υλικά για την συγκεκριμένη μέθοδο Σφαιρίδια αγαρόζης με protein A (upstait, ) a-ha (mouse monoclonal 12ca5,Santa cruz) a-gfp (rabbit polyclonal,santa cruz) miggs (Sigma) 58

59 Διάλυμα λύσης Συστατικά Tris-HCl Τελική συγκέντρωση 50 mm NaCl 150 mm EDTA 5 mm Triton X-100 0,5 % MgCl2 5 mm PMSF 1 mm Benzamidine 2 mm Pepstatin 1,4 μg/ml Leupeptin 1 μg/ml Aprotinin 1 μg/ml Chymostatin 1 μg/ml NaVanadate 0,1 mm 3.10 Πλασμίδια που χρησιμοποιήθηκαν Πλασμίδιο Προσθίoς εκκινητής CastorGFP 5 - ACGCTAGCAG GCAGGAGG CACAATGCAG G -3 Οπίσθιος εκκινητής 5 - ACGGTACCAC TGGGGAC CCAGCGGAAC TTGTAAC C -3 Προέλευση PCR για το αναγνωστικό πλάισιο τoυ Castor με μήτρα cdna από HeLa κύτταρα και ένθεση στο όχημα pcdna3.1gfp μεταξύ των θέσεων NheI- KpnI (Πεφάνη Δάφνη, 2006) 59

60 C-CastorGFP 5 - ATGCTAGCATG ATGTCGCC TACCCTGGCCA GC ATAAGCTTAC TGGGGAC CCAGCGGAAC TTG -3 PCR για το καρβοξυτελικό τμήμα του Castor (αμινιξέα ) με μήτρα το πλασμίδιο CastorGPF και ένθεση του προιόντος της PCR στο όχημα pcdna3.1 μεταξύ των θέσεων NheI-KpnI (Δημάκη Μαρία, 2008) Ν-CastorGFP 5 - ATGCTAGCATG ATGTCGCC TACCCTGGCCA GC ATAAGCTTTG AAATGAG ATCATCCACC GTGTC -3 PCR για το αμινοτελικό τμήμα του Castor (αμινοξέα 1-127) με μήτρα το πλασμίδιο CastorGPF και ένθεση του προϊόντος στο όχημα pcdna3.1gfp, μεταξύ των θέσεων NheI-KpnI. (Δημάκη Μαρία, 2008) Ν-Castor στο PCR για το αμινοτελικό pet28 ATGCTAGCATG ATAAGCTTTG τμήμα του Castor ATGTCGCC AAATGAG (αμινοξέα 1-127) με TACCCTGGCCA ATCATCCACC μήτρα το πλασμίδιο GC -3 GTGTC CastorGFP και ένθεση του προϊόντος στο όχημα PeT28 μεταξύ των θέσεων ΝheI HindIII (Πεφάνη Δάφνη, 2006) 60

61 Castor3HA 5 - ACCAATGGAT GTTTTACCATA CGAGGTTC-3 GemininGFP 5 - TACAAGCTTGA ATTCATGA ATCCCAGTATG AAGCAGA AACAAG GTATACTGCA AGGTCTAATG CGACTTAAGA C ACTGGTACCT ATACATG GCTTTGCATC CGTAGAG GAAGA-5 PCR με μήτρα το πλασμίδιο pcdna3.1/hydro3ηα για την ενίσχυση του 3ΗΑ επιτόπου και κατάτμηση του προϊόντος της PCR και του πλασμιδιόυ CastorGFP, με τα ένζυμα ΚpnI/EcoRI και ένθεση του πρoιόντος στο όχημα pcdna3.1gfp με αντικατάσταση του αναγνωστικού πλαισίου του Castor Ένθεση του αναγνωστικού πλαισιόυ της Geminin στο όχημα pcdna3.1gfp μεταξύ των θέσεων HindIII-KpnI GemininΔ GFP (από Dr.Helin), αφαίρεση με NheI-PmeI από το όχημα pdha και κλωνοποίηση στις ίδιες θέσεις στο όχημα pcdna3.1-egfp (Melixetian et al., 2004) 3HAGeminin Κατάτμηση του οχήματος pcdna3.1/hydro3ηα με ΝοtΙ-HindIII για την 61

62 λήψη του επιτόπου 3ΗΑ και κλωνοποίηση του στις ίδιες θέσεις στο GFPGeminin πλασμίδιο, στο όχημα pcdna3.1gfp αντικαθηστώντας το GFP με το 3ΗΑ 62

63 4. Αποτελέσματα 63

64 A ΜΕΡΟΣ H βιοπληροφορική ανάλυση ενός καινούργιο γονίδιου αποτελεί ένα πρώτο και εξαιρετικά χρήσιμο βήμα για τη μελέτη του. Με τη χρήση εργαλείων βιοπληροφορικής μπορούμε να εξάγουμε κατευθυντήριες πληροφορίες για την περαιτέρω πειραματική μελέτη του μορίου. Αυτές οι πληροφορίες αφορούν την έκφραση του μορίου, την εύρεση μοτίβων στην αμινοξική του αλληλουχία με πιθανή λειτουργική σημασία, την εύρεση ομολογίας του με άλλες πρωτεΐνες, την πιθανότητα αλληλεπίδρασης του με άλλες πρωτεΐνες. Με σκοπό την ανάλυση της έκφρασης και της πρωτεϊνικής αλληλουχίας του Castor, πραγματοποιήσαμε την παρακάτω βιοπληροφορική ανάλυση Ανάλυση των καταχωρημένων σε βάσεις δεδομένων ΕSTs και cdnas για την κατασκευή του προφίλ έκφρασης του μορίου Τα ESTs είναι μικρές αλληλουχίες οι οποίες ανήκουν σε ένα μεταγραφόμενο mrna και προέρχονται από τη γρήγορη αλληλούχιση τυχαία επιλεγμένων κλώνων από cdna βιβλιοθήκες. Τα ESTs είναι ιδιαίτερα χρήσιμα καθώς μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την αναγνώριση μεταγράφων. Όπως αναφέρθηκε στην εισαγωγή, η έκφραση του Castor υποστηρίζεται από 11 ESTs και 1 cdna. Mε σκοπό την απόκτηση μίας πιο ολοκληρωμένης εικόνας για το προφίλ έκφρασης του Castor, θελήσαμε να μελετήσουμε τα καταχωρημένα σε βάσεις δεδομένων ESTs προκειμένου να δούμε ποιό μέρος του mrna καλύπτει το καθένα από αυτά καθώς και από ποιους ιστούς ή κυτταρικές σειρές προέρχονται. H έκφραση του Castor στον άνθρωπο υποστηρίζεται από 11 ΕSTs με κωδικούς καταχώρισης BX , BX , BX , BX , BX , BE , BE , AL , AL , BG , BI Τα παραπάνω ΕSTs συγκρίθηκαν με τη χρήση του προγράμματος blast (NCBI) με το προτεινόμενο mrna του Castor. Τα αποτελέσματα αυτά συγκεντρώθηκαν και τα ESTs που προέρχονταν από τον ίδιο κλώνο κατηγοριοποιήθηκαν σε ένα cdna. Με βάση τα παραπάνω, τα υπάρχοντα ΕSTs αναφέρονται σε 6 διαφορετικά cdnas, από τα οποία τα 2 καλύπτουν όλο το μήκος του mrna του Castor (Εικόνα 1). 64

65 BX BX , BX BX BX BE BX BE AL BG προβλεπόμενο mrna cdna1 cdna2 cdna3 cdna4 cdna5 BI cdna6 Εικόνα 1: Σχηματική απεικόνιση των ESTs σε σχέση με το προβλεπόμενο mrna. Τα παραπάνω ΕSTs προέρχονται κυρίως από καρκινικές κυτταρικές σειρές και καρκινικούς ιστούς. Η προέλευση του κάθε cdna που προκύπτει από τα καταχωρημένα ESTs φαίνεται στον παρακάτω πίνακα cdna cdna1 cdna2 cdna3 cdna4 cdna5 cdna6 Κυτταρική σειρά/ ιστός προέλευσης HeLa (κυτταρική σειρά) Jurkat (κυτταρική σειρά) Κυτταρική σειρά από αδενοκαρκίνωμα του μαστού Νεφρικό αδενοκαρκίνωμα από βιοψία νεφρού Δεξαμενή πρωτογενών ιστών Δεξαμενή πρωτογενών ιστών Πινακάς 1: Τα cdnas που αντιστοιχούν στα καταχωρημένα ΕSTs και η προέλευση τους. Τα ESTs που αντιστοιχούν στα cdnas 1 και 2, τα οποία και καλύπτουν όλο το προβλεπόμενο mrna του Castor, προέρχονται από καρκινικές κυτταρικές σειρές. Τα ΕSTs από τα cdna 3 και 4 προέρχονται από βιοψίες όγκων. Ενδείξεις για έκφραση 65

66 σε πρωτογενείς ιστούς δίνουν τα ESTs (cdnas) 5 και 6 τα οποία και προέρχονται από δεξαμενή πρωτογενών ιστών αλλά και τα δύο καλύπτουν ένα πολύ μικρό μέρος του προβλεπόμενου mrna. Πληροφορίες για την έκφραση του μορίου σε πρωτογενείς ιστούς μπορούμε να εξαγάγουμε από cdnas προερχόμενα από ιστούς ποντικού. Για αυτό το σκοπό εισαγάγουμε το προτεινόμενο mrna (2355nt) του Castor του ποντικού στο πρόγραμμα Blast του NCBI και ακολουθεί αναζήτηση σε cdna βιβλιοθήκες. Το πρόγραμμα εμφανίζει δύο καταχωρημένα cdnas. To ένα προέρχεται από θύμο αρσενικού ενήλικου ποντικού και ταυτίζεται με το προβλεπόμενο mrna του Castor. Tο δεύτερο προέρχεται από προμήκη μυελό και ταυτίζεται από το 710 nt μέχρι το 1207 nt και από το 599nt έως το 684nt. Aπο τα παραπάνω μπορούμε να συμπεράνουμε ότι ο Castor εκφράζεται σε ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές και όγκους. Ενώ από τα προερχόμενα από ποντίκια cdnas παρατηρείται η έκφραση του και σε πρωτογενείς ιστούς όπως ο θύμος και ο προμήκης μυελός Ανάλυση της πρωτεϊνικής αλληλουχίας του Castor και σύγκριση με αυτή της Geminin. Προκειμένου να μελετήσουμε την ομολογία του Castor με άλλες πρωτεΐνες εισαγάγαμε την πρωτεϊνική αλληλουχία του Castor (385 αμινοξέα) στο πρόγραμμα blastp (ΝCBI). Tα αποτελέσματα του προγράμματος, θέτοντας ως ερώτημα (query) την αμινοξική ακολουθία του Castor και αναζητώντας για άλλες πρωτεΐνες σε RefSeq βιβλιοθήκες, φαίνονται στην παρακάτω εικόνα (Εικόνα 2). 66

67 Εικόνα 2: Αποτελέσματα από το πρόγραμμα Pblast για την αμινοξική αλληλουχία του Castor σε RefSeq βιβλιοθήκες. Παρατηρούμε ότι το πρώτο αποτέλεσμα μετά την εμφάνιση των ορθολόγων του Castor είναι η Geminin. Όπως φαίνεται και στην ευθυγράμμιση (alignment) η περιοχή ομολογίας των δύο πρωτεϊνών εντοπίζεται μεταξύ των αμινοξέων 94 έως 158 της Geminin και 177 έως 241 του Castor και περιλαμβάνει την περιοχή του σπειροειδούς σπειράματος (coiled coil) της Geminin. Η ομολογία των πρωτεϊνών σε αυτήν την περιοχή είναι 44%. Γνωρίζοντας ότι η περιοχή μέγιστης ομολογίας της Geminin με τον Castor βρίσκεται στην περιοχή του σπειροειδούς σπειράματος της Geminin (Lee et al., 2004) θελήσαμε να δούμε αν η περιοχή ομολογίας στον Castor συμπίπτει με την περιοχή σπειροειδούς σπειράματος του. Mε τη χρήση του προγράμματος Coils (Expasy tools) βρέθηκαν δύο πιθανά σπειροειδή σπειράματα στην πρωτεϊνική αλληλουχία του Castor, με το πρώτο (αμινοξέα ) να έχει σημαντικά μεγαλύτερη πιθανότητα από το δεύτερο (αμινοξέα ). Παρατηρείται ότι το πρώτο και πιθανότερο σπειροειδές 67

68 σπείραμα συμπίπτει με την περιοχή μέγιστης ομολογίας (αμινοξέα ) με το πρωτεϊνικό μόριο της Geminin (σηματοδοτείται από τα βέλη) (Εικόνα 3). Εικόνα 3: Αποτελέσματα προγράμματος Coils για την εύρεση προβλεπόμενου σπειροειδούς σπειράματος στην πρωτεϊνική αλληλουχία του Castor Συμπερασματικά, η περιοχή μέγιστης ομολογίας των δύο μορίων περιλαμβάνει το σπειροειδές σπείραμα της Geminin και συμπίπτει με το σπειροειδές σπείραμα του Castor (Εικόνα 4). Castor coiled coil Geminin coiled coil Εικόνα 4: Σχηματική αναπαράσταση του σπειροειδούς σπειράματος του Castor και τις Geminin σε σχέση με την περιοχή μέγιστης ομολογίας των δύο μορίων Χρησιμοποιώντας την αντιστοίχιση των εξωνίων σε αμινοξέα (Δριτσοπούλου Ελίνα, 2005) μπορεί να διαπιστωθεί από πόσα και ποια εξώνια προέρχονται τα αμινοξέα της περιοχής στην οποία εμφανίζεται η μέγιστη ομολογία (Εικόνα 5). 68

69 Castor (8517bp) aa Coiled coil 1 Coiled coil 2 ex2 ex3 ex4 ex5 ex6 ex7 1 39aa 71aa 102aa 127aa 202aa 238aa 178aa 241αα 261 αα 295aa 385αα Εικόνα 5: Αντιστοίχηση των εξωνίων του προβλεπόμενου mrna του Castor με τα αντίστοιχα αμινοξέα στην πρωτεΐνη και προσδιορισμός των εξωνίων στα οποία αντιστοιχούν τα πιθανά σπειροειδή σπειράματα. Παρατηρείται ότι το μεγαλύτερο μέρος του πρώτου και πιθανότερου σπειροειδούς σπειράματος (αμινοξέα ) στο οποίο εντοπίζεται και η μεγαλύτερη περιοχή ομολογίας με την Geminin, αντιστοιχεί στα εξώνιο έξι. Δεκατέσσερα αμινοξέα του αντιστοιχούν στο εξώνιο πέντε ενώ τα δύο τελευταία αμινοξέα στο εξώνιο επτά. Τα αμινοξέα του δευτέρου και λιγότερο πιθανού σπειροειδούς σπειράματος (261αα- 295αα) εντοπίζονται στο έβδομο εξώνιο του προβλεπόμενου mrna. Σε ότι αφορά τo σπειροειδές σπείραμα της Geminin με βάση την πρόβλεψη του προγράμματος Coils εντοπίζεται μεταξύ των αμινοξέων (Thepaut et al., 2002; Thepaut et al., 2004) ωστόσο μετά την κατασκευή της κρυσταλλικής δομής του συμπλόκου και με βάση την ευθυγράμμιση της hgeminin με την mgeminin αυτό μπορεί να επεκταθεί επεκτάθηκε μεταξύ των αμινοξέων (Lee et al, 2004). Tα αμινοξέα του σπειροειδούς σπειράματος αντιστοιχούν στα εξώνια πέντε και έξι του mrna της Geminin. Σε ότι αφορά την αντιστοίχηση σε εξώνια της περιοχής μέγιστης ομολογίας με τον Castor (αμινοξέα ),αυτή συμπίπτει με το σπειροειδές σπείραμα της Geminin και εντοπίζεται επίσης εξώνια πέντε και έξι (Εικόνα 6) 69

70 1aa ex2 ex3 ex4 ex5 ex6 ex7 17aa 43aa 91aa 127aa 164aa 98aa 158aa 209αα Geminin Εικόνα 6:Αντιστοίχιση των εξωνίων με τα αμινοξέα που αποτελούν το σπειροειδές σπείραμα της Geminin Στο παρακάτω σχήμα φαίνεται ακριβώς η αντιστοίχiση των αμινοξέων της περιοχής της μέγιστης ομολογίας με τα εξώνια για Geminin και Castor καθώς και τα σπειροειδή σπειράματα των μορίων. Οι θέσεις των εσωνίων σημειώνονται με βέλη. Geminin Castor ex Geminin coiled coil ex ex ex ex Castor coiled coil Εικόνα 7: Αντιστοίχιση εξωνίων και αμινοξέων σε Geminin και Castor στην περιοχή μέγιστης ομολογίας των δύο πρωτεϊνών Η περιοχή του σπειροειδούς σπειράματός είναι μία περιοχή εξαιρετικής σημασίας για την Geminin καθώς αποτελεί την περιοχή πρόσδεσης για ένα σημαντικό αριθμό μορίων συμπεριλαμβανομένου και του εαυτού της. Συγκεκριμένα, το σπειροειδές σπείραμα της Geminin έχει δειχτεί ότι είναι απαραίτητο για την αλληλεπίδραση της με το Cdt1, το Six3, τις Hox πρωτεΐνες και πρόσφατα δείχθηκε η αλληλεπίδραση της μέσω αυτού με δύο άλλες πρωτεΐνες με σπειροειδή σπειράματα, τις ERNI και ΒΕRT (Kroll, 2007; Papanayotou et al., 2008). Σε αντίθεση με την περιοχή του σπειροειδούς σπειράματος όπου η ομολογία μεταξύ Geminin και Castor είναι σημαντική, οι επιμέρους ομολογίες στα υπόλοιπα τμήματα του μορίου είναι χαμηλές (Εικόνα 8) με αποτέλεσμα το συνολικό ποσοστό ταυτοσημίας μεταξύ των δύο μορίων να είναι χαμηλό (18,5%). 70

71 Coiled coil 385 aa Identity:10,7% Similarity:16% Identity:53% Similarity:62,5 Identity:2,2% Similarity:4,4% Castor DB Coiled coil Brg1 B.D 209 aa Geminin Εικόνα 8: Επιμέρους ομολογίες μεταξύ Castor και Geminin στο καρβοξυτελικό τμήμα, στο αμινοτελικό τμήμα και στην ευρύτερη περιοχή του σπειροειδούς σπειράματος Για την απόκτηση μιας πιο ολοκληρωμένης εικόνας σχετικά με τις συντηρημένες περιοχές μεταξύ των πρωτεϊνικών αλληλουχιών Geminin και Castor αλλά και μεταξύ των ορθολόγων του Castor, χρησιμοποιήθηκε το πρόγραμμα CLUSTAL, στο οποίο εισήχθησαν αντιπροσωπευτικές πρωτεϊνικές αλληλουχίες από όλο το φάσμα των ορθολόγων τόσο της Geminin όσο και του Castor (Εικόνα 9) 71

72 D-Box hgeminin mgeminin XGemininH XGemininL hcastor mcasto r XCasto r DGeminin hgeminin mgeminin XGemininH XGemininL hcastor mcasto r XCasto r DGeminin BOXA hgeminin mgeminin XGemininH XGemininL hcastor mcasto r XCasto r DGeminin hgeminin mgeminin XGemininH XGemininL hcastor mcasto r XCasto r DGeminin BOXB Εικόνα 9: Αποτελέσματα σύγκρισης ορθόλογων μορφών των πρωτεϊνών Geminin και Castor. Τα ΒοxA και BoxB είναι οι περιοχές με αυξημένη συντήρηση μεταξύ των μορίων Geminin και Castor και των ορθολόγων του Castor αντίστοιχα. Τα αμινοξέα που συμμετέχουν στην κύρια περιοχή αλληλεπίδρασης Geminin-Cdt1 συμβολίζονται με αστερίσκους. Σε κόκκινο πλαίσιο βρίσκονται σημαντικά αμινοξέα τα οποία όταν μεταλλάσσονται μειώνεται σημαντικά η συγγένεια πρόσδεσης της Geminin στο Cdt1. Tα αμινοξέα τα οποία βρίσκονται στη δεύτερη περιοχή αλληλεπίδρασης Geminin-Cdt1 είναι υπογραμμισμένα με μαύρο. Aπο την παραπάνω εικόνα είναι εμφανείς δύο περιοχές αυξημένης συντήρησης. Η πρώτη (ΒΟΧΑ) έχει αναφερθεί και παραπάνω και αφορά την περιοχή του σπειροειδούς σπειράματος της Geminin ( αμινοξέα ) και το πιθανό σπειροειδές σπείραμα του Castor. Η δεύτερη περιοχή (ΒΟΧΒ) παρατηρείται μεταξύ των ορθολόγων του Castor και εδράζεται στο καρβοξυτελικό τμήμα των μορίων και συγκεκριμένα μεταξύ των αμινοξέων της ανθρώπινης πρωτεΐνης. Η εύρεση της τρισδιάστατης κρυσταλλικής δομής του συμπλόκου Geminin-Cdt1 μέσω κρυσταλλογραφίας ακτίνων Χ παρέχει πληροφορία για τα αμινοξέα της 72

73 Geminin που συμμετέχουν στην αλληλεπίδραση με το Cdt1. Δύο επιμέρους περιοχές αλληλεπίδρασης έχουν προσδιοριστεί. Στη πρώτη περιοχή συμμετέχουν τα αμινοξέα που βρίσκονται στο αμινοτελικό κομμάτι του σπειροειδούς σπειράματος της Geminin. Στην Εικόνα 9 με αστερίσκους έχουν σημειωθεί τα αμινοξέα τα οποία συμμετέχουν στην αλληλεπίδραση Geminin-Cdt1. H δομή του συμπλόκου φανερώνει την σημαντικότητα των αμινοξέων στην mgeminin που αντιστοιχούν στα στην hgeminin ( κόκκινο πλαίσιο εικόνα 9). Πολλαπλές σημειακές μεταλλάξεις στην περιοχή αυτή μειώνουν έως και 2000 φορές την συγγένεια πρόσδεσης της Geminin στο Cdt1. Στην δεύτερη περιοχή αλληλεπίδρασης συμμετέχουν τα αμινοξέα που βρίσκονται αμινοτελικά του σπειροειδούς σπειράματος και αντιστοιχούν στα κατάλοιπα της hgeminin (υπογραμμισμένα στο σχήμα) (Lee et al., 2004). Στο μόριο του Castor τα αμινοξέα τα οποία συμμετέχουν στην αλληλεπίδραση Geminin-Cdt1 μέσω της πρώτης περιοχής αλληλεπίδρασης είναι συντηρημένα (σημειώνονται με αστερίσκους) όπως και τα αμινοξέα τα οποία αντιστοιχούν στα σημαντικά για την αλληλεπίδραση Geminin-Cdt1 αμινοξέα της mgeminin (σε κόκκινο πλαίσιο). Σε ότι αφορά τα αμινοξέα τα οποία συμμετέχουν στην δεύτερη περιοχή αλληλεπίδρασης (υπογραμμισμένα με μαύρο) αυτά δεν είναι συντηρημένα μεταξύ Geminin και Castor, ενώ όπως φαίνεται και από την ευθυγράμμιση, στον Castor παρεμβάλλονται και επιπλέον αμινοξέα ανάμεσα τους. Η δεύτερη περιοχή αλληλεπίδρασης των δύο μορίων έχει επεκταθεί καθώς από πειράματα με μεταλλάξεις βρέθηκε ότι και τα αμινοξέα (υπογραμμισμένα με πράσινο στο σχήμα) συμμετέχουν στην αλληλεπίδραση Geminin-Cdt1. Τα αμινοξέα αυτά επίσης δεν είναι συντηρημένα μεταξύ Geminin και Castor (Saxena et al., 2004). Συμπερασματικά σε ότι αφορά την πιθανότητα αλληλεπίδρασης του Castor με τον Cdt1, αν και τα σημαντικά για την αλληλεπίδραση αυτή αμινοξέα της πρώτης περιοχής αλληλεπίδρασης με την Geminin είναι συντηρημένα και στον Castor. Η έλειψη συντήρησης της δεύτερης περιοχής αλληλεπίδρασης μπορεί να εξηγήσει προηγούμενα πειραματικά δεδομένα που υποδεικνύουν αδυναμία αλληλεοίδρασης του Castor με το Cdt1 (Δημάκη Μαρία, 2008) 73

74 4.1.3 Εύρεση δομών, μοτίβων και θέσεων πιθανών μεταμεταφραστικών τροποποιήσεων στην πρωτεϊνική αλληλουχία του Castor με πιθανή λειτουργική σημασία. Με στόχο την εύρεση πιθανών θέσεων μεταμεταφραστικών τροποποιήσεων και μοτίβων στο μόριο του Castor χρησιμοποιήθηκαν τα προγράμματα Pro-scan (Expasy tools) και ELM (Eukaryotic Linear Motif resource for functional sites in proteins, Expasy tools). Τα αποτελέσματα του προγράμματος Pro-scan (Expasy tools) φαίνονται στην παρακάτω εικόνα (Εικόνα 10) Geminin Castor Εικόνα 10: Αποτελέσματα προγράμματος Pro-scan για τις πρωτεϊνικές αλληλουχίες της Geminin και του Castor Από τα αποτελέσματα του προγράμματος προκύπτουν δύο θέσεις γλυκοζυλίωσης, έξι θέσεις φωσφορυλίωσης από την πρωτεϊνική κινάση C, δέκα θέσεις φωσφορυλίωσης από την CK2, και έντεκα θέσεις μυρηστυλίωσης. 74

75 Τα αποτελέσματα του προγράμματος ΕLM φαίνονται στην παρακάτω εικόνα: Εικόνα 11: Αποτελέσματα προγράμματος ΕLM με στόχο την εύρεση μοτίβων με πιθανή λειτουργική σημασία στο μόριο του Castor Από τα αποτελέσματα του προγράμματος προκύπτουν μία δομή σπειροειδούς σπειράματος, τρία πιθανά μοτίβα αποικοδόμησης (destruction boxes) (LIG_APCC_Dbox_1), τέσσερις θέσεις πρόσδεσης κυκλίνης (LIG_CYCLIN_1), έξι θέσεις φωσφορυλίωσης από την κινάση CK1 (MOD_CK1_1), πέντε θέσεις φωσφορυλίωσης από την κινάση CK2 (MOD_CK2_1), έξι θέσεις φωσφορυλίωσης κινάσης που κατευθύνεται από προλίνη (MOD_ProDKIN_1) και μία θέση φωσφορυλίωσης από την Polo-like κινάση (ΜΟD-PLK). Aπο τα παραπάνω αποτελέσματα, εκτός από την εύρεση της δομής σπειροειδούς σπειράματος στο μόριο, η οποία και αναλύθηκε παραπάνω, ενδιαφέρον παρουσιάζει η ύπαρξη πιθανών μοτίβων αποικοδόμησης στις θέσεις αμινοξέα 27-32, , (Εικόνα 11). 75

76 MQACGGGAAGRRAFDSICPNRMLALPGRALLCKPGKPERKFAPPRKFFP GCTGGSPVSVYEDPPDAEPTALPALTTIDLQDLADCSSLLGSDAPPGGDLA ASQNHSHQTEADFNLQDFRDTVDDLISDSSSMMSPTLASGDFPFSPCDISPF GPCLSPPLDPRALQSPPLRPPDVPPPEQYWKEVADQNQRALGDALVENN QLHVTLTQKQEEIASLKERNVQLKELASRTRHLASVLDKLMITQSRDCG AAAEPFLLKAKAKRSLEELVSAAGQDCAEVDAILREISERCDEALQSRDP KRPRLLPEPANTDTRPGNLHGAFRGLRTDCSRSALNLSHSELEEGGSFST RIRSHSTIRTLAFPQGNAFTIRTANGGYKFRWVPS Eικόνα 11: Γραφική απεικόνιση της αμινοξικής αλληλουχίας του Castor και των πιθανών μοτίβων αποικοδόμησης Tα μοτίβα αποικοδόμησης (D-boxes) αποτελούν θέσεις αναγνώρισης πρόσδεσης του συμπλόκου προαγωγής της ανάφασης/κυκλόσωμα (ΑPC/C) το οποίο είναι υπεύθυνο για την αποικοδόμηση πρωτεϊνών κατά τη μίτωση και G1 φάση (Nigg, 2001).Το μοτίβο της αλληλουχίας πρόσδεσης είναι RxxLGVIxN και αναγνωρίστηκε αρχικά στην κυκλινη Β (Glotez,1991). Το ΑPC/C ανάλογα με τον συνενεργοποιητή με τον οποίο συνδέεται αναγνωρίζει και διαφορετικά υποστρώματα. Όταν συνδέεται με το Cdc20 αναγνωρίζει υποστρώματα που φέρουν D-boxes ενώ όταν συνδέεται με το Cdh1 αναγνωρίζει υποστρώματα που φέρουν τόσο D-Boxes όσο και KEN-boxes.( Nigg,2001, Matt Sullivan and David O.Morgan, 2007). H Geminin, η οποία αποικοδομείται κατά το τέλος της μίτωσης, φέρει στο αμινοτελικό τμήμα του μορίου της (αμινοξέα 23-31) ένα μοτίβο αποικοδόμησης (McGarry and Kirschner, 1998). Παρακάτω παρατίθενται τα γνωστά μοτίβα αποικοδόμησης των κυκλινών Α, Β1 και της Geminin καθώς και τα μοτίβα αποικοδόμησης του Castor όπως τα προέβλεψε το ELM. 76

77 cyclina D box 46 RAALAVLKS 54 cyclinb1 D box 42 RTALGDIGN 50 Geminin D box 23 RRTLKMIQP 31 Castor possible D box1 27 RALLCKPGK 34 Castor possible D box2 301 RPRLLPEPΑ 309 Castor possible D box3 331 RSALNLSHS 339 Παρατηρούμε ότι το πιθανό D box1 εντοπίζεται στο αμινοτελικό άκρο του μορίου όπως και τα υπόλοιπα γνωστά D boxes. Mε βάση τα παραπάνω, το D box1 έχει περισσότερες πιθανότητες να αποτελεί πραγματικό μοτίβο αποικοδόμησης. Mε βάση τα πειραματικά δεδομένα, το υβριδικό μόριο του Castor εντοπίζεται στον πυρήνα γεγονός που ανασύρει το ερώτημα αν η πρωτεϊνική αλληλουχία του Castor περιέχει ενδογενές σήμα πυρηνικού εντοπισμού (NLS). Στο καρβοξυτελικό τμήμα του μορίου εντοπίζονται δύο αθροίσματα βασικών αμινοξέων (αμινοξέα και αμινοξέα ) τα οποία ωστόσο χωρίζονται από περισσότερα των 10 αμινοξέων όπως απαιτεί το μοτίβο του διμερούς σήματος πυρηνικού εντοπισμού (bipartite NLS) (Robbins et al., 1991) (Εικόνα12). MQACGGGAAGRRAFDSICPNRMLALPGRALLCKPGKPERKFAPPRKFFP GCTGGSPVSVYEDPPDAEPTALPALTTIDLQDLADCSSLLGSDAPPGGDLA ASQNHSHQTEADFNLQDFRDTVDDLISDSSSMMSPTLASGDFPFSPCDISPF GPCLSPPLDPRALQSPPLRPPDVPPPEQYWKEVADQNQRALGDALVENN QLHVTLTQKQEEIASLKERNVQLKELASRTRHLASVLDKLMITQSRDCG AAAEPFLLKAKAKRSLEELVSAAGQDCAEVDAILREISERCDEALQSRDP KRPRLLPEPANTDTRPGNLHGAFRGLRTDCSRSALNLSHSELEEGGSFST RIRSHSTIRTLAFPQGNAFTIRTANGGYKFRWVPS Εικόνα 12. Γραφική απεικόνιση της αμινοξικής αλληλουχίας του Castor και του πιθανού διμερούς σήματος πυρηνικού εντοπισμού To δεύτερο συνάθροισμα βασικών αμινοξέων φαίνεται να είναι συντηρημένο εξελικτικά μεταξύ των οργανισμών (Εικόνα 13), γεγονός που ενισχύει την πιθανή λειτουργική του αξία. Στο ορθόλογο του Xenopus εντοπίζεται ένα κανονικό NLS στην ίδια θέση, με τις δύο ομάδες των βασικών αμινοξέων να χωρίζονται από 77

78 λιγότερα από 10 αμινοξέα. Η δεύτερη ομάδα βασικών αμινοξέων του συμπίπτει με αυτή στην ανθρώπινη πρωτεΐνη. Σε καμία από αυτές τις περιοχές δεν υπάρχει ομολογία μεταξύ των μορίων του Castor και της Geminin hgeminin mgeminin XGemininH XGemininL hcastor mcastor XCastor DGeminin Εικόνα 13: Τα πιθανά σήματα πυρηνικού εντοπισμού στην ευθυγράμιση των ορθολόγων του Castor. Στο μόριο της Geminin έχει επιβεβαιωθεί πειραματικά η παρουσία διμερούς σήματος πυρηνικού εντοπισμού στο Χenopus στο αμινοτελικό άκρο του μορίου (μεταξύ 60αα-62αα και 71αα-74αα) (Benjamin et al., 2004;Yoshida et al., 2005). Στην Geminin στον άνθρωπο περιέχεται ένα άθροισμα βασικών αμινοξέων στις θέσεις που όμως δεν απαιτείται για τον πυρηνικό εντοπισμό του μορίου (Δημάκη Μαρία,2008). Συμπερασματικά ο Castor είναι πιθανό να περιέχει στο αμινοτελικό τoυ άκρο ένα μοτίβο αποικοδόμησης (D box) και στο καρβοξυτελικό του άκρο ένα ενδογενές σήμα πυρηνικού εντοπισμού το οποίο ευθύνεται για το πυρηνικό πρότυπο ενδοκυτταρικού εντοπισμού. Από τις θέσεις φωσφορυλίωσης, ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζουν οι πιθανές θέσεις φωσφορυλίωσης από την CK2, η οποία έχει δειχτεί ότι τροποποιεί και την Geminin αλλά και αυτή από την polo like κινάση (Plk), η οποία παίζει σημαντικό ρόλο στην μίτωση. 78

79 Β ΜΕΡΟΣ 4.2 Μελέτη των μοριακών αλληλεπιδράσεων της ανθρώπινης πρωτεΐνης Castor με την μέθοδο της συνανοσοκατακρήμνησης Η μελέτη των μοριακών αλληλεπιδράσεων ενός μορίου αποτελεί έναν βασικό τρόπο για την διαλεύκανση της λειτουργίας του. Για την μελέτη των μοριακών αλληλεπιδράσεων υπάρχει μια πλειάδα μεθοδολογικών προσεγγίσεων (συνανοσοκατακρήμνιση, GST-pulldown, yeast two-hybrid, FRET, BiFC κ.α) με διαφορετικά πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα η καθεμία. Στην παρούσα εργασία επιλέχτηκε η μέθοδος της συνανοσοκατακρήμνισης. Η αρχή της συνανοσοκατακρήμνησισης βασίζεται στη χρήση ενός ειδικού (πολυκλωνικού ή μονοκλωνικού) αντισώματος κατά της προς μελέτη πρωτεΐνης η οποία και πιστεύεται ότι αποτελεί μέρος ενός μοριακού συμπλόκου. Το αντίσωμα αυτό είναι προσδεδεμένο σε σφαιρίδια, που φέρουν πρωτεΐνη Α ή G με αποτέλεσμα το πρωτεϊνικό σύμπλοκο να απομονώνεται στην στερεή φάση των σφαιριδίων. Η ανάλυση του συμπλόκου στα συστατικά του γίνεται με ηλεκτροφόριση SDS/PAGE η οποία συχνά ακολουθείται από ανάλυση Western με τη χρήση συγκεκριμένων αντισωμάτων για τον ακριβή προσδιορισμό των συστατικών του συμπλόκου. Εικόνα 14: Σχηματική απεικόνιση απομόνωσης πρωτεϊνικού συμπλόκου με την μέθοδο της συνανοσοκατακρήμνισης. 79

80 Η μέθοδος αυτή θεωρείται εξαιρετικά ακριβής και έγκυρη καθώς αποτελεί την καλύτερη πειραματική προσέγγιση στον προσδιορισμό αλληλεπιδράσεων σε περιπτώσεις σχηματισμού διαλυτών μακρομοριακών δομών, εμφανίζει ωστόσο κάποια μειονεκτήματα τα οποία αφορούν την αδυναμία ανίχνευσης αλληλεπιδράσεων μεταξύ πρωτεϊνών οι οποίες είναι είτε παροδικές είτε χαμηλής συγγένειας. Δεδομένης της σημαντικής ομολογίας του Castor με τη Geminin στην περιοχή του σπειροειδούς σπειράματος, η οποία αποτελεί την περιοχή του μορίου της Geminin που είναι υπεύθυνη για πολλές από τις μοριακές της αλληλεπιδράσεις με άλλα μόρια καθώς και τον ομοδιμερισμό της, θελήσαμε να εξετάσουμε αν ο Castor αλληλεπιδρά με κάποιο από αυτά τα μόρια, την ίδια την Geminin αλλά και τον εαυτό του. Από προηγούμενα πειράματα είναι γνωστό ότι ο Castor δεν αλληλεπιδρά με τον μοριακό συνοδό της Geminin, Cdt1 ενώ υπάρχουν ενδείξεις για την αλληλεπίδραση του Castor με την ίδια την Geminin (Δημάκη Μαρια,2008). Σε όλες τις ανοσκοκατακρημνίσεις που έλαβαν χώρα στην παρούσα εργασία, οι προς μελέτη πρωτεΐνες ήταν συζευγμένες με μόρια αναφοράς και εκφράστηκαν εξωγενώς, ενώ όλες οι ανοσοκατακρημνίσεις έγιναν με αντισώματα ειδικά για τα μόρια αναφοράς με τα οποία ήταν συζευγμένες οι πρωτεΐνες. Τα μόρια αναφοράς (tags) είναι συνήθως μικρού μοριακού βάρους πρωτεΐνες οι οποίες χρησιμοποιούνται για την σήμανση πρωτεϊνών. Υπάρχουν τρείς κατηγορίες μορίων αναφοράς : οι αντιγονικοί επίτοποι (πχ. myc, HA) για τους οποίους υπάρχει διαθέσιμη μία πλειάδα αντισωμάτων που επιτρέπουν την αναγνώριση των υβριδικών πρωτεϊνών, μόρια που δεσμεύονται σε προσδέτες και επιτρέπουν την απομόνωση των υβριδικών πρωτεϊνών (6-His, GST, MBP, Protein A) και αυτοφθορίζοντα μόρια (GFP, YFP, cherry, RFP) τα οποία δίνουν το πλεονέκτημα μικροσκοπικής παρατήρησης της πρωτεΐνης χωρίς την χρήση αντισωμάτων τόσο σε μονιμοποιημένα όσο και σε ζωντανά κύτταρα. Σε αυτήν τη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν GFP συνδεδεμένες πρωτεΐνες, κλωνοποιημένες στον φορέα ευκαριωτικής έκφρασης pcdna3.1egfp o οποίος φέρει έναν ισχυρό CMV υποκινητή και οι προς μελέτη πρωτεΐνες εκφράζονται συντηγμένες στο καρβοξυτελικό τους άκρο. Όλες οι ΗΑ συνδεδεμένες πρωτεΐνες είναι κλωνοποιημένες στον φορέα ευκαριωτικής έκφρασης pcdna3.1 ο οποίος φέρει έναν ισχυρό CMV υποκινητή και οι προς μελέτη πρωτεΐνες βρίσκονται στο ίδιο πλαίσιο ανάγνωσης με τρεις επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες του HA επιτόπου. 80

81 4.2.1 Μελέτη και χαρτογράφηση της αλληλεπίδρασης του Castor με την Geminin Προκειμένου να μελετηθεί η αλληλεπίδραση του Castor με την Geminin αλλά και να διαπιστωθεί αν αυτή συμβαίνει μέσω του σπειροειδούς σπειράματος της Geminin, MCF7 κύτταρα διαμολύνθηκαν παροδικά με CastorHA και GemininGFP ή GemininΔ90-120GFP, ένα μετάλλαγμα της Geminin από το οποίο απουσιάζει ένας σημαντικός αριθμός αμινοξέων από το σπειροειδές σπείραμα, ή GFP, ως αρνητικός μάρτυρας. GFP Full length geminingfp GFP gemininδ90-120gfp Coiled coil ΗΑ Full length CastorHA Εικάνα15: Σχηματική απεικόνιση των GFP και HA συνδεδεμένων μορφών της Geminin και του Castor που χρησιμοποιήθηκαν. Η ανοσοκατακρήμνιση έγινε σε εκχυλίσματα των κυττάρων αυτών χρησιμοποιώντας αντίσωμα ειδικό για τον επίτοπο της αιματογλουτίνης του ιού influenza HA ( mouse monoclonal, clone 12ca5, Santa cruz), κατακρημνίζοντας τον CastorHA. Παράλληλα εκχυλίσματα από κύτταρα διαμολυσμένα με CastorHA και GemininGFP ανοσοκατακρημνίστηκαν με μη ειδικές ανοσοσφαιρίνες από ορρό ποντικού (miggs) ως επιπλέον αρνητικός μάρτυρας. Στην συνέχεια, τόσο τα συνολικά κυτταρικά εκχυλίσματα (totals) όσο και τα ανοσοκατακρημνίσματα (IPs) αναλύθηκαν με ανοσοαποτύπωση Western όπου χρησιμοποιήθηκε αντίσωμα HA για την πιστοποίηση της κατακρήμνισης του CastorHA, ενώ οι συνδεδεμένες με GFP μορφές της Geminin ανιχνεύονται με αντίσωμα ειδικό για την GFP πρωτεϊνη (rabbit polyclonal, Santa cruz) (Εικόνα 16). 81

82 Εικόνα 16: Πείραμα ανοσοκατακρήμνισης με α-ha σε κυτταρικά εκχυλίσματα διαμολυσμένα με (1) CastorHA και GemininGFP, (2) CastorHA και GemininΔ90-120GFP, (3) CastorHA και GFP, (4) κατακρήμνιση με miggs κυτταρικών εκχυλισμάτων διαμολυσμένα με CastorHA και GemininGFP και ανάλυση Western με a-ha και a-gfp. Στο αριστερό πάνελ έχουν ηλεκτροφορηθεί τα συνολικά κυτταρικά εκχυλίσματα και στο δεξί τα κατακρημνίσματα Παρατηρούμε ότι ο CastorHA συγκατακρημνίζει την GemininGFP (Eικ.16 (5)) ωστόσο δεν συγκατακρημνίζει την GemininΔ90-120GFP (Eικ.20(6)), από την οποία απουσιάζει ένα σημαντικό μέρος του σπειροειδούς σπειράματος της. Επομένως ο Castor αλληλεπιδρά με την Geminin και για την αλληλεπίδραση αυτή απαιτείται το σπειροειδές σπείραμα της Geminin. Προκειμένου να μελετήσουμε ποια περιοχή του πρωτεϊνικού μορίου του Castor είναι υπεύθυνη για την αλληλεπίδραση, ΜCF7 κύτταρα διαμολύνθηκαν παροδικά με GemininHA και CastorGFP ή C-CastorGFP, ένα μετάλλαγμα του Castor που περιέχει τα τελευταία 254 αμινοξέα της πρωτεΐνης συμπεριλαμβανομένου και του σπειροειδούς σπειράματος, ή Ν-CastorGFP, ένα μετάλλαγμα του Castor που περιέχει τα πρώτα 127 αμινοξέα της πρωτεΐνης, ή GFP, ως αρνητικός μάρτυρας. 82

83 ΗΑ GemininHA Coiled coil GFP C Castor(254aa) GFP N Castor (127aa) Εικόνα17: Σχηματική απεικόνιση των GFP και HA συνδεδεμένων μορφών του Castor και της Geminin που χρησιμοποιήθηκαν Η ανοσοκατακρήμνιση έγινε σε εκχυλίσματα των κυττάρων αυτών χρησιμοποιώντας αντίσωμα α-ha, κατακρημνίστηκε δηλαδή η GemininHA. Παράλληλα εκχυλίσματα από κύτταρα διαμολυσμένα με GemininHA και CastorGFP ανοσοκατακρημνίστηκαν με miggs ως επιπλέον αρνητικός μάρτυρας. Στην ανοσοαποτύπωση Western των συνολικών κυτταρικών εκχυλισμάτων όσο και των ανοσοκατακρημνισμάτων που ακολούθησε χρησιμοποιήθηκε α-ha για την πιστοποίηση της κατακρήμνισης της GemininHA, ενώ οι συνδεδεμένες με GFP μορφές τoυ Castor ανιχνεύονται με α-gfp (Santa cruz) (Eικόνα 18). 83

84 Eικόνα 18: Πείραμα ανοσοκατακρήμνισης με α-ha σε κυτταρικά εκχυλίσματα διαμολυσμένα με (1)GemininHA και CastorGFP (2)GemininHA και Ν-CastorGFP (3) GemininHA και C-CastorGFP, (4)GemininHAκαι GFP, (5) Κατακρήμνιση με miggs κυτταρικών εκχυλισμάτων διαμολυσμένα με GemininHA και CastorGFP και ανάλυση Western με α-ha και α-gfp. Στο αριστερό πάνελ έχουν ηλεκτροφορηθεί τα συνολικά κυτταρικά εκχυλίσματα και στο δεξί τα κατακρημνίσματα. Παρατηρούμε πως ενώ η GemininHA συγκατακρημνίζει την CastorGFP (Εικ.18(6)) και την C-CastorGFP (Εικ.18(8)), δεν συγκατακρημνίζει την N-CastorGFP (Εικ.18(7)). Επομένως ο Castor αλληλεπιδρά με την Geminin μέσω του C-τελικού τμήματος του μορίου του, το οποίο περιέχει την περιοχή σπειροειδούς σπειράματος του μορίου. Συμπερασματικά μπορούμε να πούμε πως η Geminin αλληλεπιδρά με τον Castor, καθώς τόσο στο κατακρήμνισμα του Castor εντοπίζεται η Geminin όσο και στο κατακρήμνισμα της Geminin εντοπίζεται ο Castor. Για την αλληλεπίδραση αυτή είναι υπεύθυνο το σπειροειδές σπείραμα της Geminin καθώς και η καρβοξυτελική περιοχή του μορίου του Castor, στην οποία περιέχεται το σπειροειδές σπείραμα του. 84

85 4.2.2 Mελέτη και χαρτογράφηση της αλληλεπίδρασης της πρωτεΐνης Castor με τον εαυτό του Προκειμένου να μελετηθεί το ενδεχόμενο της αλληλεπίδρασης του Castor με τον εαυτό του, κυτταρικά εκχυλίσματα από MCF7 κύτταρα διαμολυσμένα με CastorHA και GemininGFP (θετικός μάρτυρας) ή CastorGFP ή GFP (Αρνητικός μάρτυρας) κατακρημνίστηκαν με αντίσωμα α-ha. Παράλληλα εκχυλίσματα από κύτταρα διαμολυσμένα με CastorHA και GemininGFP ανοσοκατακρημνίστηκαν με miggs ως επιπλέον αρνητικός μάρτυρας. Tα συνολικά κυτταρικά εκχυλίσματα και τα ανοσοκατακρημνίσματα αναλύθηκαν με ανοσοαποτύπωση Western όπου και χρησιμοποιήθηκε α-ha για την πιστοποίηση της κατακρήμνισης του CastorHA, ενώ οι συνδεδεμένες με GFP μορφές τoυ Castor και της Geminin ανιχνεύονται με α-gfp (Eικόνα 19) Eικόνα 19: Πείραμα ανοσοκατακρήμνισης με α-ha σε κυτταρικά εκχυλίσματα διαμολυσμένα με (1) CastorHA και GemininGFP,(2) CastorHA και CastorGFP (3) CastorHA και GFP (4) Κατακρήμνιση με miggs κυτταρικών εκχυλισμάτων διαμολυσμένα με CastorHA και GemininGFP και ανάλυση Western με α-ha και α- GFP. Στο αριστερό πάνελ έχουν ηλεκτροφορηθεί τα συνολικά κυτταρικά εκχυλίσματα και στο δεξί τα κατακρημνίσματα 85

86 Παρατηρούμε ότι ο CastorHA συγκατακρημνίζει τον CastorGFP (Εικ.19(6)) και άρα το μόριο αλληλεπιδρά με τον εαυτό του. Προκειμένου να διαπιστώσουμε αν και για αυτήν την αλληλεπίδραση ευθύνεται το καρβοξυτελικο τμήμα του μορίου του Castor, κυτταρικά εκχυλίσματα από MCF7 κύτταρα διαμολυσμένα με CastorHA και GemininGFP (θετικός μάρτυρας) ή CastorGFP ή C-CastorGFP ανοσοκατακρημνίστηκαν με α-ha. Παράλληλα εκχυλίσματα από κύτταρα διαμολυσμένα με CastorHA και GemininGFP ανοσοκατακρημνίστηκαν με miggs ως αρνητικός μάρτυρας. Tα συνολικά κυτταρικά εκχυλίσματα και τα ανοσοκατακρημνίσματα αναλύθηκαν με ανοσοτύπωση Western όπου η πιστοποίηση της ανοσοκατακρήμνισης έγινε με την χρήση α-ha ενώ η παρουσία των συνδεδεμένων με GFP μορφών στο ανοσοκατακρήμνισμα έγινε με α- GFP (Εικόνα 20). Εικόνα 20: Πείραμα ανοσοκατακρήμνισης με α-ha σε κυτταρικά εκχυλίσματα διαμολυσμένα με (1) CastorHA και GemininGFP, (2) CastorHA και CastorGFP (3) CastorHA καιc-castorgfp (4) Κατακρήμνιση με miggs κυτταρικών εκχυλισμάτων διαμολυσμένα με CastorHA και GemininGFP και ανάλυση Western με α-ha και α- GFP. Στο αριστερό πάνελ έχουν ηλεκτροφορηθεί τα συνολικά κυτταρικά εκχυλίσματα και στο δεξί τα κατακρημνίσματα 86

87 Παρατηρούμε ότι μαζί με τον CastorHA συγκατακρημνίζεται ο CastorGFP (Εικ20 (2)) όπως και ο C-CastorGFP (Εικ 20(3)) άρα είναι πιθανό ο ομοδιμερισμός του μορίου να συμβαίνει μέσο της καρβοξυτελικής περιοχής και κατ επέκταση μέσω του σπειροειδούς σπειράματος Σύγκριση της αλληλεπίδρασης Geminin-Castor με Castor-Castor Προκειμένου να διαπιστωθεί ποια αλληλεπίδραση Castor-Geminin ή Castor-Castor, είναι ισχυρότερη και αν υπάρχει ανταγωνισμός μεταξύ της πρόσδεσης σε Geminin ή του ομοδιμερισμού, ΜCF7 κύτταρα διαμολύνθηκαν με CastorGFP, CastorHA και GemininGFP ή με CastorGFP, CastorHA και GFP ή με GemininGFP (μάρτυρας) και τα κυτταρικά τους εκχυλίσματα κατακρημνίστηκαν με α-ha. Τόσο τα συνολικά κυτταρικά εκχυλίσματα όσο και τα ανοσοκατακρημνίσματα ηλεκτροφορήθηκαν και αναλύθηκαν με ανοσοαποτύπωση Western χρησιμοποιώντας αντισώματα α-ha για την πιστοποίηση της ανοσοκατακρήμνισης και α-gfp για την ανίχνευση των GFP συνδεδεμένων μορφών στο ανοσοκατακρήμνισμα (Εικόνα 21). 87

88 Εικόνα 21: Πείραμα ανοσοκατακρήμνισης με a-ha σε κυτταρικά εκχιλισματα διαμολυσμένα με (1) CastorGFP, CastorHA και GFP (2) CastorGFP CastorHA και GemininGFP (3) GemininGFP και ανάλυση Western με α-ha και α-gfp. Στο αριστερό πάνελ έχουν ηλεκτροφορηθεί τα συνολικά κυτταρικά εκχυλίσματα και στο δεξί τα κατακρημνίσματα Παρατηρούμε ότι απουσία εξωγενούς Geminin (Εικ.21 (4)) στο κατακρήμνισμα του CastorHA εντοπίζεται και CastorGFP, όταν όμως στα κύτταρα υπερεκφράζεται και η Geminin (Εικ.21(5)) εξωγενώς τότε υπερισχύει η αλληλεπίδραση του Castor με την Geminin και δεν παρατηρείται ομοδιμερισμός του μορίου Σύνοψη των μοριακών αλληλεπιδράσεων του Castor με την Geminin και τον εαυτό του Συνοψίζοντας τα συμπεράσματα που εξάγονται από τα παραπάνω πειράματα, η Geminin αλληλεπιδρά με τον Castor. Για την αλληλεπίδραση αυτή είναι απαραίτητο το σπειροειδές της Geminin καθώς και τα τελευταία 254 αμινοξέα του Castor στα οποία περιέχεται το σπειροειδές σπείραμα του μορίου. Ο Castor αλληλεπιδρά με τον εαυτό του. Η αλληλεπίδραση αυτή συμβαίνει και παρά την εξάλειψη των πρώτων

89 αμινοξέων από το μόριο του. Η αλληλεπίδραση του Castor με την Geminin είναι ισχυρότερη σε σχέση με τον ομοδιμερισμό του μορίου καθώς όταν παράλληλα με τον Castor υπερεκφράζεται και η Geminin παρατηρείται αλληλεπίδραση μόνο μεταξύ Geminin και Castor και όχι ομοδιμερισμός, γεγονός που υποδεικνύει πως η περιοχή αλληλεπίδρασης με την Geminin και του ομοδιμερισμού συμπίπτουν ή αλληλεπικαλύπτονται. 4.3 Ανάπτυξη μοριακών εργαλείων για την μελέτη του Castor Για την μελέτη ενός μορίου είναι απαραίτητη η δημιουργία ενός αντισώματος το οποίο θα προσδένεται ειδικά στην ενδογενή πρωτεΐνη και θα δίνει την δυνατότητα ανίχνευσής της. Ένα αντίσωμα κατά μιας πρωτεΐνης μπορεί στην συνέχεια να χρησιμοποιηθεί σε ένα μεγάλο αριθμό τεχνικών μεθόδων για τον προσδιορισμό των λειτουργικών ιδιοτήτων της πρωτεΐνης. Για το σκοπό αυτό παρήχθηκε πολυκλωνικό αντίσωμα κατά της hcastor πρωτεΐνης το οποίο στην συνέχεια καθαρίστηκε και η ειδικότητα του ελέγχθηκε με ανοσοαποτύπωση western Η αποσιώπηση ενός γονίδιου αποτελεί ένα χρήσιμο εργαλείο καθώς μέσω αυτής μπορούν να εξαχθούν συμπεράσματα για τη φυσιολογική του λειτουργία. Ένας διαδεδομένος τρόπος αποσιωπήσης γονιδίων σε κύτταρα είναι το RNAi. Στην παρούσα εργασία αναπτύχθηκε η μέθοδος αυτή για το γονίδιο του Castor, προκειμένου να είναι δυνατή η χρήση του μελλοντικά στην διεξαγωγή λειτουργικών πειραμάτων Παραγωγή, καθαρισμός και χαρακτηρισμός πολυκλωνικού αντισώματος κατά της ανθρώπινης Castor πρωτεΐνης. H παραγωγή αντισώματος κατά μιας νέας πρωτεΐνης κρίνεται απαραίτητη καθώς η χρήση του μπορεί να δώσει απαντήσεις σε κρίσιμα ερωτήματα που αφορούν την λειτουργικότητα του μορίου. Η χρήση ενός αντισώματος μπορεί να μας δώσει πληροφορίες για τα επίπεδα, τον υποκυτταρικό εντοπισμό και τη ρύθμιση της έκφρασης της ενδογενούς πρωτεΐνης, ενώ μπορεί να εξυπηρετήσει ένα μεγάλο αριθμό 89

90 τεχνικών μεθόδων για τον προσδιορισμό των λειτουργικών ιδιοτήτων της πρωτεΐνης. Για το σκοπό αυτό παρήχθηκε πολυκλωνικό αντίσωμα κατά της hcastor πρωτεΐνης το οποίο στην συνέχεια καθαρίστηκε και η ειδικότητα του ελέγχθηκε με ανοσοαποτύπωση western και με ανοσοφθορισμό Παραγωγή πολυκλωνικού αντισώματος κατά της ανθρώπινης πρωτεΐνης Castor Mε σκοπό την παραγωγή πολυκλωνικού αντισώματος κατά της hcastor κλωνοποιήθηκε το Ν-τελικό τμήμα της πρωτεΐνης (αμινοξέα1-127) σε φορέα βακτηριακής έκφρασης (pεt28), υπερεκφράστηκε σε βακτηριάκά κύτταρα Rosseta και στην συνέχεια καθαρίστηκε με χρήση κολώνας νικελίου. Η ποσότητα της πρωτεΐνης που καθαρίστηκε υπολογίστηκε περίπου στα 320 mg και ήταν καθαρή χωρίς προσμίξεις ώστε να σταλεί για ανοσοποίηση κουνελιών (Πεφάνη Δάφνη, 2006). hcastor 385aa Ν-Castor 127aa Eικονα 22: Σχηματική απεικόνιση της ανθρώπινης Castor πρωτεΐνης και του Nτελικού τμήματος αυτής που υπερεκφράστηκε με σκοπό την παραγωγή πολυκλωνικού αντισώματος. Η καθαρισμένη πρωτεΐνη στάλθηκε για την ανοσοποίηση κουνελιών. Δύο κουνέλια ανοσοποιήθηκαν με συνολικά επτά δόσεις αντιγόνου. Στην πρώτη δόση χορηγήθηκαν 200 μg καθαρισμένης πρωτεΐνης ενώ στις έξι αναμνηστικές δόσεις που ακολούθησαν χορηγήθηκαν από 100 μg καθαρισμένης πρωτεΐνης. Η πρώτη ανοσοποίηση έγινε με πλήρες ανοσοενισχυτικό Freund (Complete Freud s adjuvant). Οι ενέσεις γίνονται σε διαφορετικές θέσεις και ο όγκος κάθε ένεσης δεν ξεπερνάει τα 0,25ml. Δέκα ημέρες μετά την τελευταία επαναληπτική δόση, τα ζώα θανατώθηκαν και ο ολικός τους αντιορός απομονώθηκε και χρησιμοποιήθηκε για τον καθαρισμό του αντισώματος κατά του Ν-τελικού τμήματος της hcastor (6Ηis-N-hCastor). 90

91 Ημέρα 0η Πράξη Απομόνωση 10ml ορρού μη ανοσοποιημένων ζώων (control) / 1η ανοσοποίηση 14η 28η 35η 42η 56η 63η 70η 77η 87η 1η αναμνηστική δόση 2η αναμνηστική δόση 1η Απομόνωση 10 ml αντιορρού 3η αναμνηστική δόση 4η αναμνηστική δόση 2η Απομόνωση 5 ml αντιορρού 5η αναμνηστική δόση 6η αναμνηστική δόση Θανάτωση ζώου / Απομόνωση ολικού αντιορρού Πίνακας 3 :Αναλυτικό πρόγραμμα ανοσοποίησης κουνελιών Kαθαρισμός πολυκλωνικού αντισώματος έναντι της hcastor Ο καθαρισμός του αντισώματος κατά της 6Ηis-N-hCastor πραγματοποιήθηκε με βάση τη συγγένεια του παραγόμενου αντισώματος κατά της 6Ηis-N-hCastor με τη 6Ηis-N-hCastor πρωτεϊνη. 350 μg πρωτεΐνης αναλύθηκαν με SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Το τμήμα της μεμβράνης στο οποίο είχε μεταφερθεί η πρωτεΐνη απομονώθηκε και επωάσθηκε με 300 μλ αντιορρού κατά τη διάρκεια της νύχτας. Την επόμενη μέρα ακολούθησε έκλουση του δεσμευμένου αντισώματος από τα ακινητοποιημένα πάνω στην μεμβράνη μόρια της 6Ηis-N-hCastor πρωτεΐνης. Έκλουση πραγματοποιήθηκε με διάλυμα γλυκίνης σε ph 2,5 το οποίο στη συνέχεια και ουδετεροποιείται με την προσθήκη Tris-base. 91

92 Eλεγχος της ειδικότητας του αντισώματος έναντι της hcastor με ανοσοαποτύπωση Western Ο έλεγχος της ειδικότητας των παραγόμενων αντισωμάτων έγινε τόσο με ανοσοαποτύπωση western όσο και με ανοσοφθορισμό. Για την ανοσοαποτύπωση Western χρησιμοποιήθηκαν κυτταρικά εκχυλίσματα από καρκινικές κυτταρικές σειρές (ΗeLa και MCF7) και από πρωτογενείς ινοβλάστες. Παράλληλα χρησιμοποιήθηκαν κυτταρικά εκχυλίσματα από παροδικά διαμολυσμένα HeLa κύτταρα με το πλασμίδιο CastorGFP προκειμένου να ελεγχθεί η πιστότητα των αποτελεσμάτων με βάση την αναγνώριση της υβριδικής πρωτεΐνης, η ηλεκτροφορητική εικόνα της οποία είναι ήδη γνωστή με χρήση αντισώματος κατά του GFP (Δημάκη Μαρία, 2008). Το μοριακό βάρος της ενδογενούς πρωτεΐνης υπολογίζεται Da (ProtParam, Expasy). Δοκιμάστηκαν διαφορετικές συγκεντρώσεις και από τα δύο εκλούσματα και από τα δύο αντισώματα που προέκυψαν από τα δύο κουνέλια. To καθαρότερο αποτέλεσμα προέκυψε από το πρώτο έκλουσμα του δεύτερου κουνελιού σε αραίωση 1:250 (Εικόνα 22) , Εικόνα 24: Έλεγχος των καθαρισμένων αντισωμάτων με ανάλυση Western. (1) Mάρτυρας μοριακών μεγεθών, (2) ΗeLa κύτταρα παροδικά διαμολυσμένα με CastorGFP, (3) MCF7 κύτταρα, (4) ΗeLa κύτταρα, (5) ινοβλάστες. 92

93 Aπο την παραπάνω εικόνα παρατηρούμε ότι το αντίσωμα αναγνωρίζει το υβριδικό μόριο CastorGFP, καθώς παρατηρείται μία ζώνη στο αναμενόμενο μέγεθος (κόκκινο βέλος). Παρατηρείται επίσης μία ζώνη κοντά στο αναμενόμενο μοριακό μέγεθος της ενδογενούς πρωτεΐνης (πράσινο βέλος). Με βάση τα μέχρι τώρα δεδομένα από Real time PCR (Συμεωνίδου Ελεάννα,2008) ωστόσο δεν θα περιμέναμε τόσο έντονη έκφραση της hcastor πρωτεΐνης σε πρωτογενή κύτταρα Αποσιώπηση του γονιδίου του Castor σε σταθερά διαμολυσμένη κυτταρική σειρά για τον CastorGFP με RNAi H αποσιώπηση και η υπερέκφραση ενός γονιδίου αποτελούν τους δύο βασικούς τρόπους μελέτης της λειτουργικότητας του. Η τεχνολογία του RNAi είναι ένας διαδεδομένος τρόπος στοχευόμενης αποσιώπησης της γονιδιακής έκφρασης με την παρεμπόδιση της μεταγραφής συγκεκριμένων γονιδίων. Μικρά δίκλωνα μόρια RNA (sirna) με συμπληρωματική αλληλουχία προς το γονίδιο στόχο εισάγονται στα κύτταρα με τεχνικές διαμόλυνσης. Εντός του κυττάρου αυτά τα μικρά δίκλωνα RNA διασπώνται σε μονόκλωνα και στη συνέχεια η μία αλυσίδα (οδηγός αλυσίδα) ενσωματώνεται στο RNA-induces silencing complex (RISC) ζευγαρώνοντας με την συμπληρωματική αλυσίδα του mrna του προς σιώπηση γονιδίου επάγοντας την διάσπαση του mrna του με αποτέλεσμα την μετα-μεταγραφική αποσιώπηση του (Εικόνα 23). 93

94 Εικόνα 25:Μηχανισμός αποσιώπησης ενός γονιδίου μέσω RNAi Mε σκοπό την αποσιώπηση του γονίδιου του Castor χρησιμοποιήθηκαν δύο δίκλωνα RNA ολιγονουκλεοτίδια (stealth RNAi, Ιnvitrogen) τα οποία εδράζονται μέσα στο ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης του mrna. Tα stealth RNAi περιέχουν συγκεκριμένες χημικές τροποποιήσεις, προσφέροντας αυξημένη ειδικότητα, καθώς επιτρέπουν μόνο στην μη κωδική αλυσίδα να εισέλθει στο RNAi μονοπάτι δίνοντας καλύτερα αποτελέσματα. H αλληλουχία και η ακριβής τους θέση στο mrna του Castor φαίνονται στην παρακάτω εικόνα (Εικόνα 26). CCCGCCATCTCTCAGCACCTCCTCGGCAGCCCCTCGGCTCCTTCTCGGTCACGCGCCTGCCCCAACCTCT GGCTGGCTTCGGAGCCTGCAGGCACTGAAGGGAGTGCAGGGTGTGGATCGCTGCCCCAGCCCGGGCCGCC GCCTCCGAGCAGTCGGCACCCGGAGGCAGGAGGCACAATGCAGGCGTGCGGGGGCGGCGCGGCCGGCCGT CGGGCCTTCGACAGCATCTGCCCCAACAGAATGCTGGCACTGCCGGGCCGGGCGCTGCTCTGCAAGCCGG GGAAGCCGGAGAGGAAGTTCGCTCCTCCGCGGAAGTTCTTCCCCGGATGCACAGGCGGGAGCCCGGTGTC GGTGTACGAGGATCCCCCGGACGCCGAGCCCACAGCGCTGCCAGCCCTCACCACCATAGACCTGCAGGAC CTCGCTGACTGCTCTTCGCTACTCGGGTCCGACGCGCCGCCTGGTGGTGACCTGGCCGCCTCGCAGAACC ATT CCCACCAAACGGAAGCAGACTTCAATCTGCAAGATTTCAGAGACACGGTGGATGATCTCATTTCAGA 94

95 CTCATCCTCTATGATGTCGCCTACCCTGGCCAGCGGAGACTTCCCCTTCTCTCCTTGCGACATATC ACCATTCGGGCCCTGCCTCTCCCCGCCACTGGACCCACGGGCCCTGCAGTCACCACCGCTGCGCCCTCCA GACGTGCCCCCGCCTGAGCAATACTGGAAGGAGGTGGCGGACCAGAACCAGAGAGCGTTGGGAGACGCGC TTGTTGAGAATAATCAACTGCACGTGACATTGACCCAGAAACAGGAGGAGATCGCCTCGCTCAAGGAGCG GAACGTGCAGCTGAAGGAACTCGCCAGCCGAACCCGGCACCTGGCCTCGGTGCTGGATAAGCTGATGATC ACACAGTCCCGGGATTGTGGGGCGGCGGCCGAGCCCTTCCTGCTCAAGGCGAAGGCCAAAAGGAGCCTGG AGGAGTTGGTCAGCGCTGCGGGGCAGGATTGCGCGGAAGTGGACGCCATCCTGAGGGAGATTTCCGAGCG CTGCGATGAAGCCCTTCAGAGCCGCGATCCCAAGCGGCCCCGACTGCTGCCAGAGCCCGCGAATACTGAC ACCAGGCCCGGGAACCTGCATGGCGCCTTCCGGGGGCTGCGCACAGACTGCAGCCGGAGCGCGTTGAACC TGAGCCACAGTGAGCTGGAGGAGGGCGGCTCCTTCAGCACCCGCATCCGCAGCCACAGCACCATCCGCAC CCTCGCCTTCCCCCAGGGCAATGCCTTCACCATCAGAACAGCCAACGGGGGTTACAAGTTCCGCTGGGTC CCCAGTTGAGCTGTGATGTGGTCCCCCAAAACACTGCCCTGTGTTTCCACTGAAGTGCCTGGGGGCTTCC CAGAACTTTGCCTTCAGGTTGAATGCCACCCTGAAACACTTTTTCAGGAACAAAAGCATCTTGATACCGA TGCATTGTAAATTTCTGCTACAAAACATTGTATAGCCCCTCCCCTTGTCACAGTGAAACTCTGTTTATAT ATGTATATGTCACATATGTCACAGCCAATTTTAAAAGTATTTATTTTTAGCAGCTTTGAATTATGTATTT TTAGAGCAGGGAAGGATTTAGAAACCATAGTTACTTTTATAATTATGTAATGCTCTAATATTATAAGAAG GAAAAGAAGGCTCTAAGAGATTAAGTAATTTCCTGCAATGGGAAACACTGGAACCTTTCAATCACTTTAA CTAGTCACTTAAGGACTCTAGGCCCAGAAGCCTGGTTTCTGGGTGAATGTTTTTATACATCACTCAACTT CCCTCGTCCTAAAAGGACACCTAATTTTGTTACTATTGAAAATTTTTATTTTGGTGGCCAGAATACGAAA TCGGGAGAGGTAACCCAAACAGTTGTCTTAGGAAAAGGCAGATTCTCAGAGGCAATGGGCTATCAACAAA ATAGGTGCTAAGCACATTTGTTTGTAATGATCATTCATATAATTTAGAAGATTTATGGTAACAGTTTATA TTCATTATCCATACAGTTCTATTTGTGCAAATAGAATAACCACCTATAAGCAAACAGTGTT Εικόνα 26: Η αλληλουχία του mrna του Castor με τα δύο sirna που χρησιμοποιήθηκαν μαρκαρισμένα με κόκκινο και μοβ χρώμα Έλεγχος της λειτουργικότητας του RNAi για το γονίδιο του Castor με ανάλυση Western ΗeLa σταθερά διαμολυσμένη κυτταρική σειρά με το πλασμίδιο CastorGFP διαμολυνεται με τελική συγκέντρωση και των δύο si RNA 100nM με Lipofectamin 2000 (invitrogen). Δύο διαμολύνσεις λαμβάνουν χώρα μία τη χρονική στιγμή 0 και μία μετά από 24 ώρες ενώ τα κυτταρικά εκχυλίσματα συλλέγονται τόσο 24 ώρες μετά την πρώτη διαμόλυνση όσο και 48 ώρες μετά από την πρώτη διαμόλυνση, αφού έχει μεσολαβήσει και δεύτερη διαμόλυνση. Τα κυτταρικά εκχυλίσματα αυτά συλλέγονται και υποβάλλονται σε ανάλυση Western με το πρώτο έκλουσμα του Castor (1:250) από το δεύτερο κουνέλι που είχε δώσει και την καθαρότερη εικόνα στην ανάλυση Western (Εικόνα 27). 95

96 CastortGFP τουμπουλίνη Εικόνα 27: Ανάλυση κατά Western κυτταρικών εκχυλισμάτων που προέρχονται από HeLa σταθερά διαμολυσμένη κυτταρική σειρά μετά από RNAi για το γονίδιο του Castor. (1) Control sirna 24h μετά το πρώτο χτύπημα (2) Castor sirna 24h μετά το πρώτο χτύπημα (3) Control sirna 48h μετά το πρώτο χτύπημα αφού έχει μεσολαβήσει και δεύτερο (4) Castor sirna 48h μετά το πρώτο χτύπημα Παρατηρούμε ότι ενώ στα δείγματα μάρτυρες εμφανίζεται μία ζώνη που αντιστοιχεί στην υβριδική πρωτεΐνη CastorGFP (κόκκινο βέλος) αυτή χάνεται μετά την επίδραση με RNAi για τον Castor, υποδεικνύοντας ότι και το RNAi είναι λειτουργικό και το γονίδιο του Castor έχει αποσιωπηθεί. Η τουμπουλίνη (mouse monoclonal, Sigma 1:20000) έχει χρησιμοποιηθεί σαν μάρτυρας ισοφόρτωσης Έλεγχος της λειτουργικότητας του RNAi για το γονίδιο του Castor με ανοσοφθορισμό Η λειτουργικότητα του RNAi του γονιδίου του Castror ελέγχθηκε και με ανοσοφθορισμό. Για το σκοπό αυτό HeLa σταθερά διαμολυσμένη κυτταρική σειρά με 96