οµική και βιοφυσική µελέτη της πρωτεΐνης HUSho από τον οργανισµό Shewanella oneidensis MR-1

Transcript

1 ΕΛΛΗΝΙΚΗ ΗΜΟΚΡΑΤΙΑ Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήµιο Αθηνών ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ KAI ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Ι Π Λ Ω Μ Α Τ Ι Κ Η Ε Ρ Γ Α Σ Ι Α οµική και βιοφυσική µελέτη της πρωτεΐνης HUSho από τον οργανισµό Shewanella oneidensis MR-1 ΜΕΪΝΤΑΝΗ ΧΡΙΣΤΙΝΑ-ΑΝΝΑ ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ρ. Κωνσταντίνος Ε. Βοργιάς ΑΘΗΝΑ 2017

2 Εξώφυλλο: Μοντέλο της πρωτεΐνης HUSho (Swiss model).

3 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Το αντικείµενο της διπλωµατικής µου εργασίας είναι κυρίως εργαστηριακό και σχετίζεται µε τη σύγχρονη µοριακή βιολογία, µε προεκτάσεις σε ποικίλους τοµείς όπως η βιοτεχνολογία, η βιοφυσική, η ιατρική και η οικολογία. Βασική προϋπόθεση για την έρευνα σε θέµατα µοριακής βιολογίας αποτελεί, τόσο το καλό θεωρητικό υπόβαθρο του µελετητή όσο και η εξοικείωση του µε τις σύγχρονες µεθόδους και τεχνικές που χρησιµοποιούνται για την εξαγωγή αξιόπιστων συµπερασµάτων. Η παρούσα διπλωµατική εργασία πραγµατοποιήθηκε στο εργαστήριο του Καθηγητή, ρ. Κωνσταντίνου Ε. Βοργιά, στον τοµέα Βιοχηµείας και Μοριακής Βιολογίας, του τµήµατος Βιολογίας του Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστηµίου Αθηνών, υπό την άµεση εποπτεία του ιδίου. Θα ήθελα λοιπόν να ευχαριστήσω πολύ τον καθηγητή µου, ρ. Κωνσταντίνο Ε. Βοργιά για την ευκαιρία που µου έδωσε να ασχοληθώ µε το συγκεκριµένο αντικείµενο. Κατά την διάρκεια της διπλωµατικής άσκησης δεν σταµάτησε να µε ενθαρρύνει και να µε προτρέπει να εµβαθύνω σε θέµατα που ταίριαζαν καλύτερα στο γνωστικό µου προφίλ, µεταδίδοντας µου πολύτιµη γνώση αλλά και την µακρόχρονη εµπειρία του. Επίσης, ευχαριστώ εγκάρδια τον µεταδιδακτορικό ερευνητή ρ. Αναστάσιο Γεωργούλη και την µεταπτυχιακή φοιτήτρια Βαρβάρα ράκου για την άψογη συνεργασία µας. Επιπλέον, οφείλω ένα µεγάλο ευχαριστώ στην τεχνολόγο του εργαστηρίου κ. Αγγελική Τσόκα που µε βοήθησε καθόλη τη διάρκεια της εκτέλεσης των πειραµάτων να εξοικειώθω µε τα αντικείµενα και τους χώρους του εργαστηρίου αλλά και να µάθω τις βασικές αρχές και τους κανόνες ασφαλείας που διέπουν την διεξαγωγή πειραµάτων εντός ενός σύγχρονου εργαστηρίου µοριακών µελετών. Μέρος των πειραµάτων διεξήχθησαν στο Εθνικό Κέντρο Έρευνας Φυσικών Επιστηµών «ηµόκριτος» υπό την εποπτεία του προέδρου ρ. Γεωργίου Νούνεση και του ρ. Άγγελου Θανάσουλα. Τους ευχαριστώ θερµά για το χρόνο που αφιέρωσαν και την πολύτιµη βοήθεια, που µου πρόσφεραν στις εγκαταστάσεις του ιδρύµατος. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω την οικογένεια µου για την υποστήριξη που µου παρείχε όλο αυτό το χρονικό διάστηµα, τον σύζυγο µου Ηλία για την εµψύχωση και υποµονή του, αλλά και την κατανόηση από τον µικρό µου γιο Αχιλλέα για το χρόνο που του στέρησα όλα αυτά τα χρόνια των σπουδών µου. 1

4 Περιεχόµενα Σελίδες 1 Εισαγωγή 1.1 Οι HU-histone-like πρωτεΐνες Το βακτήριο Shewanella oneidensis Ιστορικά στοιχεία Ταξινόµηση Περιγραφή Οικολογία και προσαρµογές Εφαρµογές Η πρωτεΐνη HUSho 17 2 Σκοπός της διπλωµατικής εργασίας 18 3 Υλικά και Μέθοδοι Εργαστηριακός εξοπλισµός Μοριακή κλωνοποίηση Σχεδιασµός και σύνθεση του γονιδίου της πρωτεΐνης HUSho Ανασυνδυασµένος πλασµιδιακός φορέας έκφρασης Αντίδραση λιγάσης Gel extraction TA cloning και το σύστηµα φορέων pgem -T Easy Μετασχηµατισµός βακτηριακών κυττάρων Αποµόνωση πλασµιδιακού DNA Επαγωγή του συστήµατος έκφρασης pet Το σύστηµα pet: περιγραφή και ιδιότητες Επαγωγή και έλεγχος της έκφρασης του γονιδίου της HUSho Επαγωγή της έκφρασης του γονιδίου στόχου Κινητική της επαγωγής Έλεγχος της επαγωγής µε SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση ιαδικασία αποµόνωσης και καθαρισµού της HUSho Μεθοδολογική προσέγγιση ιαφορική κλασµάτωση µε τη χρήση θειικού αµµωνίου Χρωµατογραφικός καθαρισµός της HUSho Πειραµατική διαδικασία ιαφορική κλασµάτωση της HUSho µε χρήση θειικού αµµωνίου Κατακρήµνιση µε HUSho τριχλωροξικό οξύ 42 2

5 Καθαρισµός των HUSho πρωτεϊνών µε χρωµατογραφία συγγένειας Ποσοτικοποίηση της HUSho Βιοφυσικός χαρακτηρισµός της πρωτεΐνης HUSho µε Φασµατοπολωσιµετρία Κυκλικού ιχρωισµού (Circular Dichroism, CD spectroscopy ) Βιοπληροφορική ανάλυση 51 4 Αποτελέσµατα Κινητική επαγωγής της έκφρασης του γονιδίου husho Καθαρισµός και αποµόνωση της πρωτεΐνης HUSho Προσδιορισµός συγκέντρωσης της πρωτεΐνης HUSho Βιοφυσικός χαρακτηρισµός και µέτρηση της θερµοσταθερότητας της πρωτεΐνης HUSho µε χρήση φασµατοπολωσιµετρίας κυκλικού διχρωισµού Αποτελέσµατα βιοπληροφορικής ανάλυσης 59 5 Συζήτηση 63 6 Βιβλιογραφία 65 3

6 1 Εισαγωγή 1.1. Οι HU-histone-like πρωτεΐνες Το DNA των βακτηριακών κυττάρων δεν είναι διάχυτο στο εσωτερικό τους παρά την έλλειψη οργανωµένου πυρήνα, όπως στους ευκαρυωτικούς οργανισµούς, αλλά καταλαµβάνει µία συγκεκριµένη περιοχή στο κυτόπλασµα που λέγεται πυρηνοειδές. Στο πυρηνοειδές το κυκλικό DNA υπερελικώνεται, περιελίσσεται και σχετίζεται µε ειδικά πρωτεϊνικά µόρια και RNA µε αποτέλεσµα το συνολικό µήκος του µορίου να µειώνεται εις βάρος της διαµέτρου τόσο ώστε να καταλαµβάνει περιορισµένο χώρο στο κύτταρο ενώ παράλληλα να εξυπηρετεί την µεταγραφή και την µετάφραση µε τοπικό ξετύλιγµα διαφόρων περιοχών του. Τελικά σχηµατίζεται µία συµπαγής δοµή που περιφερειακά φέρει πολλές θηλιές υπερελικωµένου DNA ενώ κεντρικά υπάρχει µια πυκνή και πολύπολοκη δοµή από RNA και πρωτεΐνες. Εικόνα 1.1 Απεικόνιση βακτηριακού κυττάρου στην οποία αναπαρίσταται το πυρηνοειδές µε το συµπυκνωµένο βακτηριακό χρωµόσωµα (Universiteit Leiden, Chromatin Organization and Dynamics, Dr. Remus Dame). 4

7 Στην συµπύκνωση του χρωµοσωµικού DNA, εκτός της υπερελίκωσης του µορίου, συµβάλλει επίσης και ο µοριακός συνωστισµός εντός του κυττάρου καθώς και µικρές πρωτεΐνες που το αναγκάζουν να διπλωθεί προκαλώντας κάµψη, περιέλιξη ή γεφύρωση των τµηµάτων του. Οι πρωτεΐνες αυτές αναφέρονται ευρέως ως histonelike-proteins λόγω της οµοιότητας που παρουσιάζουν ως προς τις ιδιότητες (αφθονία, αλκαλικότητα, ικανότητα πρόσδεσης µε το DNA και χαµηλό µοριακό βάρος) και τη λειτουργία τους µε τις ιστόνες που πακετάρουν τη χρωµατίνη των ευκαρυωτικών κυττάρων. ιαφορετικά, χρησιµοποιείται ο πιο δόκιµος όρος nucleoid associated proteins, NAPs, διότι στερούνται δοµικής οµοιότητας µε τις ιστόνες. Στην κατηγορία αυτή ανήκουν οι τρεις µεγάλες οικογένειες πρωτεϊνών µε καλά χαρακτηρισµένα µέλη όπως φαίνονται στον παρακάτω πίνακα. Πίνακας 1.1 Κατηγορίες πρωτεϊνών που σχετίζονται δοµικά και λειτουργικά µε το βακτηριακό DNA. H-NS Heat-stable Nucleoid-Structuring Μεταγραφική ρύθµιση HU Heat-Unstable Αντιγραφή, ανασυνδυασµός και επιδιόρθωση, µεταγραφική ρύθµιση IHF Integration Host Factor Ανασυνδυασµός Οι NAPs εκτός από την οργάνωση και συµπύκνωση του DNA εξυπηρετούν και άλλες εκτελεστικές διαδικασίες όπως την αντιγραφή, τη µεταγραφή, τον ανασυνδυασµό και την επιδιόρθωση βλαβών της χρωµατίνης, δηλαδή διαθέτουν προστατευτικό και ρυθµιστικό εκτός από δοµικό ρόλο. Τριπλά µεταλλαγµένα στελέχη που στερούνται ταυτόχρονα τις H-NS, HU και IHF δεν επιβιώνουν, γεγονός που υποδηλώνει ότι δεν υπάρχει κάποιος άλλος παράγοντας που συµπληρώνει λειτουργικά τη δράση τους (Kayoko Yasuzawa et al., 1992). Πιο συγκεκριµένα η οικογένεια των HU πρωτεϊνών έχει εντοπιστεί σε όλα τα ευβακτήρια που έχουν αναλυθεί έως σήµερα σε µεγάλη αφθονία της τάξης των µορίων ανά κύτταρο κατά την εκθετική φάση ανάπτυξης (Azam Τ.Α. et al., 1999) και γενικότερα σε όλους τους προκαρυωτικούς οργανισµούς, Βακτήρια και Αρχαία, φαίνεται να υπάρχουν κατά µέσο όρο περίπου µόρια HU πρωτεϊνών ανά κύτταρο (Donita Serban et al., 2003). Στα περισσότερα ευβακτήρια απαντάται ως ένα οµοδιµερές 18 KDa, ενώ σε πολλά εντεροβακτήρια, όπως η Ε.coli, σχηµατίζονται ετεροδιµερή που αποτελούνται από δύο υποµονάδες HUA και HUB, 5

8 µήκους 90 αµινοξικών καταλοίπων έκαστη, οι οποίες κωδικοποιούνται από τα γονίδια hupa και hupb, ενώ παράλληλα εντοπίζονται και οµοδιµερή αυτών (Remus T.Dame, Nora Goosen, 2002). Το διµερές αποτελείται από µια κεντρική περιοχή πλούσια σε α-έλικες και δύο προεξέχοντες, ευέλικτους βραχίονες που αγκαλιάζουν το β-dna εκθέτοντας θετικά φορτισµένες πλευρικές οµάδες αµινοξικών καταλοίπων (White et al., 1989, Rice et al., 1996, Williams and Maher III, 2000). Με αυτό τον τρόπο δηµιουργούνται ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις µεταξύ πρωτεΐνης και DNA που ενισχύονται από την στερεοδιαταξική συµπληρωµατικότητα των σχετιζόµενων περιοχών των δύο µορίων. Η περιοχή πρόσδεσης της πρωτεΐνης στο DNA είναι αρκετά συντηρηµένη, γεγονός που υποστηρίζει την ύπαρξη ενός κοινού µηχανισµού κάµψης της δίκλωνης έλικας. Επιπλέον η περιορισµένη φυλογενετική εξέλιξη των HU πρωτεϊνών εκδηλώνεται µε υψηλή οµολογία (έως και 80%) µεταξύ των προκαρυωτικών οργανισµών εντός του ίδιου γένους (Donita Serban et al., 2003). Οι HU προσδένονται µε µη ειδικό τρόπο σε υπερελικοµένες περιοχές του DNA (Shindo et al., 1992), ενώ υπάρχουν ενδείξεις ότι οι δύο βραχίονες του µορίου εισέρχονται στη µικρή αύλακα της διπλής έλικας, λόγω της δοµικής οµολογίας που παρουσιάζει µε την IHF (Rice P.A. et al., 1996) αλλά και από δεδοµένα κρυσταλλογραφικής ανάλυσης. Οι πρωτεΐνες HU εντοπίζονται επίσης σε σταυροειδείς περιοχές, περιοχές µε κενά ή ψαλιδίσµατα Εικόνα 1.2 Σχηµατικη αναπαράσταση της πρόσδεσης της HU στο DNA ( όπου σταθεροποιούν την κάµψη του DNA (Pontiggia et al., 1993, Kastaing et al., 1995, Kamasev et al., 1999, Kamasev and Rouviere Yaniv, 2000, Anna Balandina et al., 2002). Οι HU δρουν εισάγοντας αρνητική υπερελίκωση στο DNA µε τη βοήθεια της τοποϊσοµεράσης ΙΙ. Επίσης διευκολύνουν ποικίλες διεργασίες της γονιδιακής ρύθµισης, όπως την έναρξη της αντιγραφής, τον µεταµεταγραφικό έλεγχο, την επιδιόρθωση του DNA αλλά και την συµπύκνωση του µορίου σε µία πιο συµπαγή δοµή (Donita Serban et al., 2003). Ωστόσο ο δοµικός ρόλος των HU στο πακετάρισµα της χρωµατίνης αµφισβητείται από ορισµένους µελετητές, ενώ τονίζεται η συµµετοχή τους στην µεταγραφική ρύθµιση έπειτα από τοπικό χαλάρωµα του 6

9 µορίου DNA (Remus Thei Dame, Nora Goosen, 2002). Επιπλέον ο ρόλος των HU δεν περιορίζεται αυστηρά στην αλληλεπίδραση του µε το δίκλωνο β-dna αλλά επίσης και µε µονόκλωνο DNA, µε RNA, καθώς και µε υβρίδια DNA-RNA (Anna Balandina et al., 2002) Το βακτήριο Shewanella oneidensis Το γένος Shewanella περιλαµβάνει αρνητικά κατά Gram πρωτεοβακτήρια, κυρίως µε µορφή βακίλου, µήκους 2-3µm και διαµέτρου 0,4-0,7µm. Πρόκειται για δυνητικά αναερόβιους µικροοργανισµούς που συναντώνται συνήθως σε θαλάσσια ιζήµατα µε ικανότητα ενεργής κολύµβησης χάρη στο µοναδικό µαστίγιο που φέρουν στον ένα τους πόλο (Venkateswaran et al., 1999). Από το 1988, που το γένος Shewanella χαρακτηρίστηκε, απαριθµεί πάνω από 40 είδη. Βασικά χαρακτηριστικά του γένους αποτελούν η ανθεκτικότητα σε χαµηλές θερµοκρασίες, η ήπια αλοφιλικότητα και η ικανότητα να χρησιµοποιεί ένα µεγάλο αριθµό οργανικών και ανόργανων ενώσεων κατά τη διαδικασία της αναπνοής (Gralnick et al., 2007). Τόσο η δυνατότητα των µικροοργανισµών αυτών να χρησιµοποιούν µέταλλα ως δέκτες ηλεκτρονίων για την παραγωγή ενέργειας µε τη µορφή ΑΤΡ, όσο και η παραγωγή αρκετών ενδογενών υδατανθράκων έχει προκαλέσει µεγάλο ενδιαφέρον ως προς τις πιθανές βιοτεχνολογικές εφαρµογές στις οποίες θα µπορούσαν να αξιοποιηθούν τα είδη Shewanella. Για το είδος Shewanella oneidensis συγκεκριµένα, γίνονται προσπάθειες να χρησιµοποιηθεί στην αποµάκρυνση πυρηνικών αποβλήτων από περιοχές ραδιενεργών ρύπων, καθώς απουσία σιδήρου (Fe) µπορεί εναλλακτικά να ανάξει το ουράνιο (U), µετατρέποντας το διαλυτό U(VI) σε µια πιο δυσδιάλυτη µορφή το U(IV), που δεν διαχέεται στο έδαφος. Με τον τρόπο αυτό ο ρύπος ακινητοποιείται και µπορεί να συλλεχθεί και να αποµακρυνθεί µε ασφάλεια από την περιοχή δίνοντας µια βιολογική λύση στο πρόβληµα (Derek et al., 1991) Ιστορικά στοιχεία Βακτήρια του γένους Shewanella ταυτοποιήθηκαν για πρώτη φορά το 1931 µεταξύ πολλών άλλων βακτηρίων που εντοπίστηκαν σε βούτυρο υπό συνθήκες σήψης (Derby et al., 1931). Αρχικά αναγνωρίστηκε ως µέλος του γένους Achromobacter, ενώ αργότερα άλλαξε η ταξινόµηση του αρκετές φορές βάσει µορφολογικών, οικολογικών και µοριακών χαρακτήρων (Gralnick et al., 2007). Το 7

10 1985, µε την αλληλούχηση του 5S rrna αποδόθηκε τελικά το όνοµα του γένους, Shewanella, προς τιµήν του ρ. James M. Shewan για το έργο του στη µικροβιολογία των θαλάσσιων οικοσυστηµάτων (MacDonell et al., 1985). Το 1988, οµάδα επιστηµόνων ανίχνευσε την ύπαρξη υψηλών επιπέδων ανηγµένου µαγγανίου Mn(II) στην λίµνη Oneida της Νέας Υόρκης. Στη φύση το µαγγάνιο απαντάται συνήθως στην οξειδωµένη του µορφή Mn(IV), συνεπώς οι επιστήµονες υπέθεσαν ότι κάποιο είδος βιολογικής δραστηριότητας λάµβανε χώρα στη λίµνη που προκαλούσε την αναγωγή του στοιχείου. Εκτελώντας σειρά πειραµάτων, ανακάλυψαν ότι το υπεύθυνο είδος, για τη µικροβιακή αναγωγή του µαγγανίου, ανήκε στο γένος Shewanella και χρησιµοποιούσε το διαθέσιµο Mn(IV) ως δέκτη ηλεκτρονίων στην αναπνευστική αλυσίδα. εδοµένου ότι το οξειδωµένο µαγγάνιο είναι δυσδιάλυτο, τα βακτήρια αυτά έχουν βρει τρόπο να µεταφέρουν τα ηλεκτρόνια στο µέταλλο εξωτερικά των κυττάρων για τις ανάγκες της αναπνοής. Μετά την αλληλούχηση των rrna γονιδίων, στα εν λόγω βακτήρια αποδόθηκε το όνοµα του είδους Shewanella oneidensis MR-1 ( manganese reducer ) που θυµίζει τη λίµνη Oneida στην οποία ανακαλύφθηκαν (Venkateswaran et al., 1999) Ταξινόµηση Βασίλειο: Bacteria Φύλο: Proteobacteria Κλάση: Gammaproteobacteria Τάξη: Alteromonadales Οικογένεια: Shewanellaceae Εικόνα 1.3 Shewanella oneidensis MR-1 Γένος: Shewanella που αναπτύσσεται πάνω σε πέτρωµα Είδος: Shewanella oneidensis αιµατίτη. Χρησιµοποιεί το Fe 2 O 3 ως δέκτη Το στέλεχος MR-1 ήταν το πρώτο ηλεκτρονίων ( που αλληλουχήθηκε και ως εκ τούτου αποτελεί οργανισµό µοντέλο για τη µελέτη του γένους (Gralnick et al., 2007). 8

11 Αρχικά το είδος ονοµάστηκε Shewanella putrefaciens MR-1, έως το 1999 που του δόθηκε το όνοµα Shewanella oneidensis MR-1 (Venkateswaran et al., 1999). Το στέλεχος MR-1 (manganese reducer) συχνά συγχέεται µε τον όρο metal reducer εξαιτίας της ποικιλίας µετάλλων που χρησιµοποιεί ως δέκτες ηλεκτρονίων Περιγραφή Το είδος Shewanella oneidensis περιλαµβάνει δυνητικά αναερόβια, Gram αρνητικά βακτήρια που έχουν ένα κυκλικό χρωµόσωµα bp µε Εικόνα 1.4 Αναπαράσταση του χρωµοσωµικού (δεξια) και πλασµιδιακού DNA (αριστερά). Από έξω προς τα µέσα: οι πρώτοι δύο κύκλοι ενδείξεων παριστάνουν τις προβλεπόµενες κωδικές περιοχές της (+) και (-) αλυσίδας αντίστοιχα. Με σοµόν χρώµα: γονίδια που αφορούν στη βιοσύνθεση αµινοξέων, µε ανοικτό µπλε: βιοσύνθεση συµπαραγόντων, προσθετικών οµάδων και µεταφορέων, ανοικτό πράσινο: κυτταρικό τοίχωµα, κόκκινο: κυτταρικές διεργασίες, καφέ: πρωτογενής µεταβολισµός, κίτρινο: µεταβολισµός του DNA, πράσινο: παραγωγή ενέργειας, µωβ: µεταβολισµός φωσφολιπιδίων και λιπαρών οξέων, ροζ: πρωτεϊνοσύνθεση, πορτοκαλί: βιοσύνθεση αζωτούχων βάσεων, νουκλεοσιδίων και νουκλεοτιδίων, µπλε: ρυθµιστικές διεργασίες, γκρι: µεταγραφή, κυανό: ενδοκυτταρική µεταφορά και binding proteins, µαύρο: υποθετικά γονίδια που κωδικοποιούν για πρωτεΐνες συντηρηµένες ή µη. Ο τρίτος κύκλος υποδεικνύει τα γονίδια που σχετίζονται µε την αλυσίδα µεταφοράς ηλεκτρονίων. Ο τέταρτος κύκλος δείχνει γονίδια σχετιζόµενα µε τρανσποζόνια (πράσινα) και µε φάγους (κόκκινα) ιικής µεταγωγής. Ο πέµπτος κύκλος αναφέρεται στο ποσοστό G+C συγκριτικά µε τη µέση περιεκτικότητα G+C σε παράθυρο 2.000bp (χρωµόσωµα) και 200bp (µεγαπλασµίδιο) κατά την αντιγραφή (John F. Heidelberg et al., 2002). 9

12 ανοικτά πλαίσια ανάγνωσης (ORFs) εκ των οποίων τα αφορούν υποθετικά γονίδια (36%) (Kolker et al., 2004) και ένα αυτόνοµο αντιγραφικό πλασµίδιο µε 173 κωδικές περιοχές, το 23% των οποίων έχουν βρέθει µόνο σε αυτό το είδος (John F. Heidelberg et al., 2002). Όπως αναφέρθηκε προηγουµένως τα στελέχη του είδους Shewanella oneidensis έχουν την ικανότητα να χρησιµοποιούν µεγάλη ποικιλία οργανικών ενώσεων, µεταλλικών ιόντων και ραδιονουκλιδίων ως δέκτες ηλεκτρονίων κατά την αναερόβια αναπνοή. Μεταξύ των ενώσεων αυτών περιλαµβάνονται εξωκυττάριες οξειδωµένες µορφές µετάλλων όπως Mn(III) και (IV), Fe(III), Tc(VII), Cr(VI), U(VI), φουµαρικό, νιτρικό, Ν-οξείδιο τριµεθυλαµίνης, διµεθυλοσουλφοξείδιο, θειώδη άλατα, θειοθειικό και στοιχειώδες θείο. Αφού τα βακτήρια σχηµατίσουν βιοµεµβράνη (biofilm) γύρω από το υλικό (µέταλλο), ξεκινούν τη µεταφορά ηλεκτρονίων προς αυτό µε τη βοήθεια ειδικών πρωτεϊνικών µεταφορέων ηλεκτρονίων, τα κυτοχρώµατα. Το στέλεχος Shewanella oneidensis MR-1 θεωρείται ότι έχει τουλάχιστον 42 τύπους κυτοχρωµάτων c (Meyer et al., 2004), που εντοπίζονται στην εσωτερική µεβράνη (CymA), στον περιπλασµικό χώρο (MtrA) και στην εξωτερική µεµβράνη (OmcA και MtrC). Οι τελευταίες είναι λιποπρωτεΐνες που σχετίζονται µε αγκυροβοληµένες εκκριτικές πρωτεΐνες τύπου ΙΙ (MtrB) µε τη βοήθεια Εικόνα 1.5 Μόρια κυτοχρωµάτων c (µωβ) µε πολλαπλά µόρια αίµης (κόκκινα) για τη µεταφορά ηλεκτρονίων από τις λιποδιαλυτές κινόνες της εσωτερικής µεµβράνης (MQH 2 ) προς το µέταλλο Fe(III) του εξωκυττάριου περιβάλλοντος, κατά την αναερόβια αναπνοή. Με πράσινο απεικονίζονται οι εκκριτικές πρωτεΐνες MtrB (Fredrickson et al., 2008). 10

13 των οποίων έρχονται σε επαφή µε το µέταλλο για την µεταφορά ηλεκτρονίων. Στην εξωκυττάρια µεταφορά ηλεκτρονίων συµµετέχουν και άλλα πολικά µόρια γνωστά ως ριβοφλαβίνες (βιταµίνη Β2). Οι ριβοφλαβίνες που παράγονται σε µεγάλες ποσότητες στα κύτταρα Shewanella oneidensis MR-1 διαχέονται στο υδατικό περιβάλλον των βακτηρίων επιτελώντας την µεταφορά ηλεκτρονίων µακριά από την εξωτερική µεµβράνη, σε αποστάσεις έως και 50µm από αυτή (Lies et al., 2005). Η εξέχουσα σηµασία των ριβοφλαβινών για την αναερόβια αναπνοή των βακτηρίων Shewanella oneidensis µε αναγωγή µετάλλων, κυρίως Fe(III) και Mn(IV), τονίστηκε ιδιαιτέρως σε πειράµατα στα οποία, µετά την αποµάκρυνση του υγρού µέσου των βιοϋµενίων των βακτηρίων, παρατηρήθηκε µείωση µεταφοράς ηλεκτρονίων κατά 70% (Marsili et al., 2007). Η δε ανάλυση του υγρού µέσου, µε µεθόδους υγρής χρωµατογραφίας και φασµατοσκοπίας µάζας LC-MS, φανέρωσε την παρουσία ριβοφλαβινών. Επιπλέον, το βακτήριο Shewanella oneidensis MR-1 υπό αναερόβιες συνθήκες συνθέτει ηλεκτρικά αγώγιµα τριχοειδή νηµάτια, γνωστά και ως βακτηριακά νανοκαλώδια (bacterial nanowires), διαµέτρου nm, που συνδέουν τόσο τα βακτηριακά κύτταρα µεταξύ τους όσο και µε τη βιοµεµβράνη που παράγουν. Εικόνα 1.6 (Α) Τριχοειδές νηµάτιο (bacterial nanowire) στο οποίο σηµειώνονται µε βέλη οι κρύσταλλοι ανηγµένου οξειδίου του σιδήρου. (Β) Σχηµατισµός κρυστάλλων οξειδίων του σιδήρου σε όλο το µήκος των νηµατίων µακριά από το βακτηριακό κύτταρο (Gorby et al., 2006). Χάρη σε αυτούς τους σχηµατισµούς τα βακτήρια µπορούν να ανάγουν µεταλλικές ενώσεις σε µεγάλες αποστάσεις από τα κύτταρα. Επίσης µπορούν να εκτελούν µεταφορά ηλεκτρονίων σε νανοηλεκτρόδια (100V, 1Ωcm), που 11

14 προσαρµόζονται στα άκρα των νηµατίων, µε ρυθµό 109 ηλεκτρόνια/sec (Gorby et al., 2006) Οικολογία και προσαρµογές Το είδος Shewanella oneidensis MR-1 είναι ένας µεσόφιλος µικροοργανισµός που παρουσιάζει µέγιστο ρυθµό αύξησης σε θερµοκρασία 35ᵒC, διατηρεί όµως ικανότητα ανάπτυξης σε πολύ χαµηλότερες θερµοκρασίες κόντα στο µηδέν. Η λίµνη Oneida της Ν.Υόρκης αποτελεί ένα ρηχό ολιγοτροφικό σύστηµα εσωτερικών υδάτων το οποίο, κατά τη διάρκεια του χειµώνα (αρχές εκεµβρίου µε τέλη Απριλίου), καλύπτεται από στρώµα πάγου, πάχους έως και 70cm. Τον Μάιο, η θερµακρασία σταδιακά αρχίζει να ανεβαίνει, φτάνοντας σε ένα µέγιστο 25ᵒC, στη µέση του καλοκαιριού. Σε θερµοκρασία δωµατίου (22ᵒC) το Shewanella oneidensis MR-1 εµφανίζει χρόνο διπλασιασµού 40 λεπτών, ενώ όταν µεταφέρεται από τους 22ᵒC στους 3ᵒC, εισέρχεται σε µακρά λανθάνουσα κατάσταση, για ένα χρονικό διάστηµα περίπου 100 ωρών. Στο διάστηµα αυτό παρατηρείται πολύ αργή αύξηση, µε χρόνο διπλασιασµού 67 ωρών, καθώς τα βακτηριακά κύτταρα προσαρµόζονται στις νέες συνθήκες ψύχους. Μεταξύ των άλλων τα βακτήρια γίνονται πιο επιµήκη (50% µικρότερη διαµέτρος κυττάρου), σχηµατίζουν µακριά κινούµενα νηµάτια (έως και 70 φορές µακρύτερα από ότι σε θερµοκρασία δωµατίου), κυτταρικές προεκτάσεις που οµοιάζουν µε σφαιροπλάστες, συνθέτουν πολλούς και διαφορετικούς τύπους πρωτεϊνών και λιπιδίων από εκείνους που διαθέτουν σε υψηλότερες θερµοκρασίες (Randa Abdoud et Εικόνα 1.7 Εικόνα κυττάρων από µικροσκόπιο διέλευσης στους 3 και 22ᵒC, (Sp) δοµές σαν σφαιροπλάστες, (Tr) εγκάρσια τοµή κυττάρου, (Fl) νηµάτια (Randa Abdoud et al., 2005). 12

15 al., 2005). Γενικότερα αλλάζουν ολόκληρο το µεταβολισµό τους προκειµένου να αντέξουν στις πολύ χαµηλές θερµοκρασίες, καθώς σε αντίθεση µε άλλους οργανισµούς που φέρουν προστατευτικούς µηχανισµούς (τρίχωµα, λίπος κ.ά.) τα βακτήρια είναι εκτεθιµένα στις αντίξοες συνθήκες. Το γεγονός ότι εξελικτικά, όχι απλά κατάφεραν να ανταπεξέλθουν, αλλά επιβίωσαν δίνοντας πολλά νέα είδη, σε σειρά εναλλασσόµενων κλιµατικών αλλαγών όλα αυτά τα εκατοµµύρια χρόνια που κατοικούν τη γη, τα κατατάσει στους ταχύτερα προσαρµοζόµενους οργανισµούς σε ακραίες περιβαλλοντικές συνθήκες. Όλες αυτές οι αλλαγές προϋποθέτουν ένα πολύ δυναµικό µηχανισµό ρύθµισης της γονιδιακής έκφρασης, µέρος του οποίου αποτελούν οι πρωτεΐνες που σχετίζονται λειτουργικά µε το DNA, όπως οι histone-like-proteins Εφαρµογές Η διαδικασία της εξωκυττάριας µεταφοράς ηλεκτρονίων για την αναγωγή ραδιενεργών ουσιών, µεταλλικών ιόντων και οργανικών ενώσεων µπορεί να διαδραµατίσει καταλυτικό ρόλο στους τοµείς της βιοεξυγίανσης και παραγωγής βιοηλεκτροχηµικών συστηµάτων, συνεισφέροντας στην αειφόρο πράσινη ανάπτυξη που εδώ και αρκετά χρόνια προωθείται από ανεπτυγµένες χώρες παγκοσµίως. Η βιοεξυγίανση περιλαµβάνει διαδικασίες αποικοδόµησης ρυπογόνων ουσιών, κυρίως από µικροοργανισµούς, και µετατροπής τους σε µη τοξικά παράγωγα. Η µη χρήση συνθετικών ή χηµικών ουσιών κάνει µία τέτοια προσέγγιση πιο ελκυστική, οικονοµική και φιλική στο περιβάλλον. Η ανάπτυξη µικροοργανισµών στην υπηρεσία του ανθρώπου θα ήταν ένα µεγάλο επίτευγµα για τη σηµερινή επιστήµη και οικονοµία µιας και αποτελούν ανανεώσιµη πηγή που µπορεί να ενσωµατωθεί αρµονικά στο περιβάλλον και να επιτελέσει το έργο της πολύ πιο σύντοµα και αποδοτικά. Παρόλα αυτά υπάρχουν ακόµα πολλά θέµατα που πρέπει να επιλυθούν κυρίως ως προς τη δυνατότητα ελέγχου και παρακολούθησης των διαδικασιών που λαµβάνουν χώρα σε µία βιολογική επέµβαση στο περιβάλλον, αλλά και την απόδοση τέτοιων µεθοδολογιών που ακόµα είναι χαµηλή. Το πρώτο σκέλος απαιτεί πολύ καλή γνώση της βιολογίας των µικροοργανισµών, των βιολογικών συστηµάτων που αυτοί συµµετέχουν αλλά και των ευρύτερων οικοσυστηµάτων στα οποία πρόκειται να επιχειρήθει µία βιολογική επέµβαση. Στο δεύτερο, είναι απαραίτητη η συµβολή της 13

16 βιοτεχνολογίας που µέσω της γενετικής µηχανικής επιχειρεί να δηµιουργήσει στελέχη µικροοργανισµών µε ενισχυµένες ενδογενείς ιδιότητες. Βεβαίως στα ανωτέρω προβλήµατα πρέπει να προστεθούν θέµατα βιοηθικής, πολιτικές και κοινωνικές παράµετροι που ανακύπτουν και δυσχεραίνουν περισσότερο την ανάπτυξη ανάλογων πρακτικών εφαρµογών. Ο µικροοργανισµός Shewanella oneidensis MR-1 αποτελεί οργανισµό- µοντέλο για την µελέτη συστηµάτων αποδόµησης ρύπων. Σε πειράµατα υπερέκφρασης γονιδίων βιοσύνθεσης φλαβινών (ribd-ribc-ribba-ribe) και κυτοχρωµάτων c (mtrc-mtra-mtrb), τα βακτήρια κατάφεραν να αποικοδοµήσουν τρεις φορές γρηγορότερα την χρωστική (πορτοκαλί του µεθυλίου) που αντιπροσώπευε τον ρύπο, ενώ ταυτόχρονα βελτιώθηκε η απόδοση µεταφοράς ηλεκτρονίων σε MFCs (microbial fuel cells) στο 110% (Min D et al., 2017). Μια άλλη εφαρµογή των βακτηρίων Shewanella oneidensis MR-1 που έχει κεντρίσει το ενδιαφέρον των επιστηµών τα τελευταία χρόνια είναι η ανάπτυξη των MFCs. Κύτταρα αυτού του τύπου θα µπορούσαν να χρησιµοποιηθούν στη δηµιουργία Εικόνα 1.8 Microbial fuel cells. Αξιοποίηση ηλεκτρικού ρεύµατος που παράγεται από βακτήρια, καθώς ηλεκτρόνια µεταφέρονται από τα κύτταρα προς την άνοδο και από εκεί µέσω αγωγού στην κάθοδο, όπου τελικά ενώνονται µε κατιόντα υδρογόνου και οξυγόνο προς σχηµατισµό νερού ( 14

17 βιολογικών µπαταριών στις οποίες αξιοποιείται η παραγωγή ηλεκτρικού ρεύµατος από τα βακτήρια κατά τη διάρκεια της αναερόβιας αναπνοής. Σε µία τέτοια διάταξη τα βακτήρια σχηµατίζουν βιοµεµβράνη πάνω στο υλικό της ανόδου και αποµακρύνουν κατιόντα υδρογόνου (Η + ), που διαπερνούν τη διαχωριστική µεµβράνη, και ηλεκτρόνια που προωθούνται µέσω αγώγιµου σύρµατος στην κάθοδο. Στο αγώγιµο σύρµα µπορεί να συνδεθεί αντιστάτης, για παράδειγµα κάποια ηλεκτρική συσκευή. έκτης ηλεκτρονίων στην κάθοδο θα µπορούσε να είναι το ατµοσφαιρικό οξυγόνο, µε αποτέλεσµα το σχηµατισµό καθαρού νερού ως τελικό προϊόν της αντίδρασης (Logan et al., 2006). Για την ανάπτυξη και επιβίωση των βακτηριακών κυττάρων θα πρέπει να παρέχεται θρεπτικό µέσο, το οποίο µπορεί να αποτελεί παραπροϊόν άλλης βιοτεχνολογικής διαδικασίας, όπως απόβλητα της βιοµηχανίας τροφίµων (τυρόγαλο, µούργα κ.ά.), καθώς τα βακτήρια είναι ικανά να µεταβολίζουν σχεδόν όλες της φυσικές πηγές άνθρακα. Τα οφέλη από µία τέτοια εφαρµογή θα ήταν πολλαπλά τόσο για την ποιότητα ζωής του ανθρώπου όσο και για τη διατήρηση του περιβάλλοντος. Εναλλακτικά, αντί της παραγωγής ηλεκτρικού ρεύµατος, τα MFGs θα µπορούσαν να χρησιµοποιηθούν σε έναν αριθµό άλλων εφαρµογών, όπως η παραγωγή υγραερίου, προς αντικατάσταση του πετρελαίου κίνησης και της βενζίνης που δηµιουργούν µεγάλα προβλήµατα ρύπανσης στα αστικά κέντρα. Αν από τα MFCs αφαιρούνταν το οξυγόνο και εφαρµοζόταν µικρή διαφορά δυναµικού της τάξης των 0,25V, θα µπορούσε να παραχθεί αέριο υδρογόνο στην κάθοδο. Αυτή η διαδικασία ονοµάζεται βακτηριακή ηλεκτρόλυση της οργανικής ύλης, γιατί τα ηλεκτρόνια και το υδρογόνο προέρχονται από διάσπαση οργανικών ενώσεων αντί του νερού (Rozendal et al., 2007). Ένω η διάσπαση του νερού είναι µία αρκετά ενεργοβόρα ενδόθερµη αντίδραση, η βακτηριακή διάσπαση οργανικής ύλης για την παραγωγή υδρογόνου είναι ελαφρώς εξώθερµη, οπότε και πραγµατοποιείται αυθόρµητα. Τέλος, ανάµεσα στις δυνητικές εφαρµογές του Shewanella oneidensis MR-1 θα µπορούσε να αναφερθεί και η εκτεταµένη σύνθεση υδρογονανθράκων για την παραγωγή υγρών καυσίµων. Στη λίµνη Oneida όπου και ανακαλύφθηκε το είδος, επικρατούν πολύ χαµηλές θερµοκρασίες κατά τη διάρκεια του χειµώνα, µε αποτέλεσµα οι οργανισµοί που κατοικούν σε αυτή να φέρουν σειρά προσαρµογών που τους επιτρέπουν να ανταπεξέλθουν στο ψύχος. Συγκεκριµένα τα βακτήρια συνθέτουν λιπίδια, µε µακριές αλυσίδες λιπαρών οξέων, προκειµένου να 15

18 διατηρήσουν τη ρευστότητα των µεµβρανών τους ώστε να επιβιώσουν. Η γενετική τροποποίηση για την ανεξαρτήτου θερµοκρασίας σύνθεση τέτοιων υδρογονανθράκων, η συλλογή και επεξεργασία τους θα µπορούσε να δώσει ικανές ποσότητες βιολογικών καυσίµων µιας και τα βακτήρια ως γνωστόν ακολουθούν εκθετικό ρυθµό αύξησης και µπορούν σε ελάχιστο χρόνο να παράξουν µεγάλο όγκο ακατέργαστης βιοµάζας. Εικόνα 1.9 Σχηµατική απεικόνιση διαδικασίας σχηµατισµού υγρών καυσίµων από βακτήρια του είδους Shewanella oneidensis MR-1. Από πάνω προς τα κάτω παρουσιάζεται η τροφοδοσία των βακτηρίων άµεσα, µε σάκχαρα ή έµµεσα µε τη βοήθεια στρώµατος αυτότροφων µικροοργανισµών (κύτταρα του κυανοβακτηρίου Synechococcus), η συλλογή των υδρογονανθράκων, η επεξεργασία (διαχωρισµός αλειφατεικών αλυσίδων) και τελικά η απόκτηση των υγρών καυσίµων σε εκµεταλλεύσιµη µορφή ( 16

19 1.3 Η πρωτεΐνη HUSho Η αξιοποίηση των ιδιοτήτων των µικροοργανισµών για τη βελτίωση της ζωής του ανθρώπου, τη διατήρηση του περιβάλλοντος και την αειφόρο ανάπτυξη µέσα από ανανεώσιµες πηγές ενέργειας και παραγωγής φυσικών προϊόντων που θα αντικαταστήσουν τις έως σήµερα ακολουθούµενες πρακτικές, απαιτούν πολύ καλή γνώση της βιολογίας και της οικολογίας τους. Ένα πρώτο βήµα στην κατανόηση των µικροοργανισµών αποτελεί η αποσαφήνιση του µηχανισµού µε τον οποίο αυτοί χειρίζονται το γενετικό τους υλικό, δηλαδή τη γονιδιακή ρύθµιση, επιτρέποντας ή µη την έκφραση επιθυµητών τελικών προϊόντων, όπως οι υδρογονάνθρακες και οι πρωτεΐνες. Όπως είδαµε νωρίτερα, καίριο ρόλο στη γονιδιακή ρύθµιση παίζουν οι σχετιζόµενες µε το DNA πρωτεΐνες, γνωστές και ως ΝΑΡs, µεταξύ των οποίων περιλαµβάνονται και οι HU. Στον οργανισµό Shewanella oneidensis MR-1, η αντίστοιχη πρωτεΐνη ονοµάζεται HUSho (HU Shewanella oneidensis), ένα οµοδιµερές που αποτελείται από δύο πολυπεπτιδικές αλυσίδες 90 αµινοξικών καταλοίπων και συµµετέχει στην αντιγραφή, τη µεταγραφική ρύθµιση, τον ανασυνδυασµό, την επιδιόρθωση βλαβών της χρωµατίνης αλλά και τη σταθεροποίηση της ιδιαίτερα κάτω από αντίξοες συνθήκες, όπως το ψύχος. Από την υψηλή οµολογία στην αµινοξική αλληλουχία µε πρωτεΐνες της ίδιας οικογένειας άλλων οργανισµών, υποθέτουµε ότι η τριτοταγής δοµή της HUSho περιλαµβάνει µία κεντρική σφιαρική περιοχή πλούσια σε α-έλικα και δύο ευέλικτους βραχίονες, µε τρεις β-κλώνους ο καθένας που σχηµατίζουν β-πτυχωτή επιφάνεια, µεταξύ των β-κλώνων εντοπίζονται β- στροφές, πολύ υψηλής συντήρησης µήκους 18 αµινοξικών καταλοίπων, µε τις οποίες αλληλεπιδρά µη ειδικά µε τη µικρή αύλακα του β-dna. Εικόνα 1.10 Σχηµατική αναπαράσταση της αντίστοιχής HU πρωτεΐνης από τον οργανισµό Bacillus anthracis µε την οποία εµφανίζει υψηλή οµολογία η HUSho. Με διαφορετικό χρώµα παριστάνονται οι δύο αλυσίδες του οµοδιµερούς. 17

20 2 Σκοπός της διπλωµατικής εργασίας Τόσο ο προστατευτικός ρόλος της HUSho ως προς τη συντήρηση του γενετικού υλικού, όσο και η επίδραση στο µηχανισµό ανάπτυξης και παραγωγής µακροµορίων του κυττάρου, είναι εκείνα που κάνουν την µελέτη της εν λόγω πρωτεΐνης τόσο ελκυστική για τοµείς όπως η βιοτεχνολογία και η γενετική µηχανική. Οι εφαρµογές στις οποίες µπορεί να αξιοποιηθεί ο µικροοργανισµός Shewanella oneidensis MR-1 είναι ποικίλες και µεγάλου οικονοµικού ενδιαφέροντος. Η γνώση όµως των βιολογικών και οικολογικών παραµέτρων που πρέπει να λαµβάνονται υπόψη για την ανάπτυξη νέων τεχνολογιών σε αυτό τον τοµέα παραµένει ελλειπής. Η συστηµατκή µελέτη του µικροοργανισµού και ειδικά σε ότι αφορά στη διαχείρηση του γενετικού του υλικού είναι απαραίτητη για την αξιοποίηση του σε πρακτικές εφαρµογές. Στην παρούσα διπλωµατική εργασία επιχειρήθηκε η µελέτη της πρωτεΐνης HUSho εξαιτίας της σηµαντικότητας της σε όλους τους τοµείς που αναφέρθηκαν αναλυτικά στην εισαγωγή. Η πρωτεΐνη εκφράστηκε αποµονώθηκε, καθαρίστηκε και µελετήθηκε µε θερµοδυναµικές µεθόδους, ενώ τέλος µε τη βοήθεια υπολογιστικών εργαλείων βιοπληροφορικής ανάλυσης συσχετίστηκε µε άλλες οµόλογες πρωτεΐνες για τις οποίες διαθέτουµε πληροφορίες δοµής και λειτουργίας στις σύγχρονες βάσεις δεδοµένων. Εκτός από τους εκπαιδευτικούς σκοπούς τους οποίους εξυπηρετεί µία διπλωµατική εργασία, δηλαδή την εξοικείωση µε εργαστηριακές µεθοδολογίες και τεχνικές, αποσκοπεί επίσης στην συνδιαλαγή µε έγκριτους επιστήµονες του κλάδου και την επαφή µε θέµατα και ερωτήµατα που απασχολούν στις µέρες µας την επιστηµονική κοινότητα. 18

21 3 Υλικά και Μέθοδοι 3.1 Εργαστηριακός Εξοπλισµός Αποστειρωµένοι σωλήνες eppendorf 1,1.5,2 ml Αποστειρωµένοι σωλήνες Falcon 15,50 ml Αυτόκαυστο Γυάλινα δοχεία (κωνικές φιάλες, µπουκάλια, ογκοµετρικοί κύλινδροι, ποτήρια ζέσεως) Επωαστήρας ρυθµιζόµενης θερµοκρασίας για σωλήνες eppendorf µε δυνατότητα ανάδευσης Επωαστήρας ρυθµιζόµενης θερµοκρασίας µε δυνατότητα ανάδευσης για υγρές καλλιέργειες Επωαστήρας ρυθµιζόµενης θερµοκρασίας για τρυβλία Τρυβλία petri Ζυγός ακριβείας Ηλεκτρόδιο µέτρησης ph Μηχανικές πιπέτες και αποστειρωµένα tips Συσκευές ηλεκτροφόρησης αγαρόζης και ακρυλαµίδης Συσκευή παραγωγής υπέρηχων µε έµβολο Σύστηµα χρωµατογραφίας µε κολώνα ηπαρίνης, κολώνα SP και περισταλτική αντλία Φυγόκεντροι για σωλήνες eppendorf, falcons και ψυχόµενη υπερφυγόκεντρος (Sorvall) Φωτόµετρο UV-VIS, κυψελίδες φωτοµέτρου Κρύος θάλαµος (Cold room) 4 o C Ηλεκτρονικός υπολογιστής 19

22 3.2 Μοριακή Κλωνοποίηση Σχεδιασµός και σύνθεση του γονιδίου της πρωτεΐνης HUSho Συνθετικά γονίδια ονοµάζονται οι νουκλεοτιδικές αλληλουχίες που αντιστοιχούν σε ανοικτά πλαίσια ανάγνωσης ORFs (open reading frames), τα συνθέτουµε in vitro και κωδικοποιούν για κάποιο επιθυµητό προϊόν, όπως µία πρωτεΐνη. Τα συνθετικά γονίδια χρησιµοποιούνται σε περιπτώσεις που δεν υπάρχει εύκολη πρόσβαση στη φυσική αλληλουχία ή κρίνεται απαραίτητη η επέµβαση σε αυτή, µε αλλαγή ενός ή και περισσοτέρων τµηµάτων της ώστε να εξυπηρετούνται οι σκοποί της έρευνας. Για παράδειγµα, τροποποιούµε µία αλληλουχία ώστε να επιτύχουµε µεγαλύτερο ποσοστό ταύτισης µε κάποια άλλη αλληλουχία από βάσεις δεδοµένων ή για να µεγιστοποιήσουµε την απόδοση του τελικού προϊόντος (αυξηµένη σταθερότητα ή αλλαγή τοπολογίας της πρωτεΐνης) µιας και η έκφραση των γονιδίων πραγµατοποιείται σε συγκεκριµένους οργανισµούς που ονοµάζονται συστήµατα έκφρασης και όχι στον οργανισµό προέλευση τους. Τα συνθετικά γονίδια σχηµατίζονται µε ολιγονουκλεοτιδική σύνθεση DNA ακόµα και αν είναι γνωστή µόνο η πολυπεπτιδική ακολουθία. Το συνθετικό γονίδιο της πρωτεΐνης HUSho, µήκους 282 βάσεων και περιεκτικότητας GC 51,43%, είναι το : >HUSho dei CAT ATG AAT AAA ACC GAA CTG ATC GCC AAG ATT GCT GAA AAT M N K T E L I A K I A E N GCG GAT ATT ACG AAA GCC CAA GCC ACC CGT GCT CTG AAG A D I T K A Q A T R A L K TCC TTT GAA GCG GCC ATT TAC GAA AGT ATG AAA AAC GGC S F E A A I T E S M K N G GAT AAG ATT AGC ATC GTC GGC TTT GGT TCT TTC GAA ACC D K I S I V G F G S F E T ACG ACC CGT GCA GCT CGT ACG GGC CGT AAT CCG CAG ACC T T R A A R T G R N P Q T 20

23 GGT AAA GAA ATT CAA ATC GCG GAA GCC ACG GTG CCG AAA G K E I Q I A E A T V P K TTT AAG GCG GGC AAG ACC CTG CGC GAC AGC GTT AAC TAA F K A G K T L R D S V N GGATCC BamHI Το συνθετικό γονίδιο αποσπάται µε τη βοήθεια των περιοριστικών ενδονουκλεασών BamHI και dei και ενσωµατώνεται σε πλασµιδιακό φορέα κλωνοποίησης puc57. Εικόνα 3.1 Χάρτης πλασµιδιακού φορέα κλωνοποίησης puc57 όπως είναι πριν την εισαγωγή του συνθετικού γονιδίου της HUSho. Πίνακας 3.1 Αλληλουχίες αναγνώρισης των περιοριστικών ενδονουκλεασών. Περιοριστικές ενδονουκλεάσες BamHI dei Αλληλουχίες αναγνώρισης 5 G/GATCC 3 3 CCTAG/G 5 5 CA/TATG 3 3 GTAT/AC 5 21

24 3.2.2 Ανασυνδυασµένος πλασµιδιακός φορέας έκφρασης Μετά την απόσπαση του συνθετικού γονιδίου για την παραγωγή της πρωτεΐνης HUSho από τον πλασµιδιακό φορέα κλωνοποίησης puc57 µε τη χρήση των περιοριστικών ενδονουκλεασών dei και BamHI, ακολουθεί η ενσωµάτωση του στον πλασµιδιακό φορέα έκφρασης pet-11a. Η διαδικασία ενσωµάτωσης περιλαµβάνει πέψη του φορέα κλωνοποίησης και της αλληλουχίας εισδοχής µε τα ίδια περιοριστικά ένζυµα ώστε τα άκρα τους να είναι συµπληρωµατικά και χρήση DNA λιγάσης που συνδέει τα δύο µόρια µεταξύ τους. Εικόνα 3.2 Χάρτης πλασµιδιακού φορέα έκφρασης pet-11a όπως είναι πριν την εισαγωγή του συνθετικού γονιδίου της HUSho. Πίνακας 3.2 Χαρακτηριστικά του πλασµιδιακού φορέα έκφρασης pet-11a. Χαρακτηριστικά amp R Τ7 υποκινητής και σηµείο έναρξης Σηµείο έναρξης pbr322 ori Λειτουργία Ανθεκτικότητα στην αµπικιλλίνη για επιλογή µετασχηµατισµένων στελεχών Μεταγραφή του εισαχθέντος γονιδίου από την Τ7 πολυµεράση Έναρξη αντιγραφής σε κύτταρα E.coli 22

25 Το σύστηµα φορέων pet (plasmid for expression by T7 RNA polymerase) αναπτύχθηκε για την κλωνοποίηση και έκφραση ανασυνδυασµένων γονιδίων σε κύτταρα E. coli υπό τον έλεγχο του ισχυρού υποκινητή του φάγου T7. Τα ανασυνδυασµένα γονίδια διατηρούνται σε µεταγραφικώς ανενεργή κατάσταση απουσία της Τ7 RNA πολυµεράσης, καθώς η RNA πολυµεράση του E. coli δεν αναγνωρίζει τον Τ7 υποκινητή, οπότε δεν παρατηρείται µεταγραφή του ανασυνδυασµένου γονιδίου. Με τρόπο αυτό αποδεσµεύεται η διαδικασία της κλωνοποίησης από τη διαδικασία της έκφρασης Αντίδραση λιγάσης Η DNA λιγάση είναι ένας ειδικός τύπος ενζύµου που συνδέει δύο αλυσίδες DNA καταλύοντας το σχηµατισµό 3-5 φωσφοδιεστερικού δεσµού µε κατανάλωση δύο µορίων ΑΤΡ. Συµµετέχει στη διαδικασία της αντιγραφής για τη συνένωση των τµηµάτων Okazaki του συνοδού-κλώνου, στην επιδιόρθωση του δίκλωνου DNA σε περιπτώση που δηµιουργηθούν σπασίµατα σε κάποιον από τους δύο κλώνους, χρησιµοποιώντας τη συµπληρωµατική αλυσίδα ως καλούπι, ενώ µερικές µορφές της (DNA λιγάση IV) έχουν τη δυνατότητα να επιδιορθώσουν σπασιµάτα και των δύο κλώνων του DNA. Η DNA λιγάση χρησιµοποιείται ευρέως στην τεχνολογία του ανασυνδυασµένου DNA λειτουργώντας ως µοριακή κόλλα που ενώνει τµήµατα DNA. H T4 DNA λιγάση (DNA λιγάση του βακτηριοφάγου T4) είναι η πλέον χρησιµοποιούµενη λιγάση σε εργαστήρια µοριακής βιολογίας λόγω της ικανότητας της να συνδέει τα κολλώδη άκρα του DNA µε µεγαλύτερη αποτελεσµατικότητα από ότι η DNA λιγάση του βακτηρίου E. coli. Συνδέει συµπληρωµατικά άκρα DNA, ολιγονουκλεοτίδια, δίκλωνο RNA καθώς και RNA-DNA υβρίδια, όχι όµως µονόκλωνα νουκλεϊκά οξέα. Η Τ4 DNA λιγάση δεν χρησιµοποιεί ως συµπαράγοντα το NAD +, όπως η DNA λιγάση του E. coli, αλλά απαιτεί ATP για το σχηµατισµό φωσφοδιεστερικού δεσµού. Η αντίδραση λιγάσης για την εισαγωγή του συνθετικού γονίδιου της πρωτεΐνης HUSho σε πλασµίδια έκφρασης, παρουσιάζεται στον Πίνακα 3.3. Το buffer λιγάσης που χρησιµοποιείται έχει δεκαπλάσια συγκέντρωση από εκείνο που απαιτεί η διαδικασία της αντίδρασης, γι αυτό προηγείται αραίωση από 10x σε 1x, για να επιτύχουµε τη βέλτιστη δραστικότητα του ενζύµου. 23

26 Πίνακας 3.3 Πρωτόκολλο αντίδρασης λιγάσης, διάρκειας 2h στους 25ºC. Αντίδραση λιγάσης Αντίδραση λιγάσης-control 4 λ dh2o 6.5 λ dh2o 1λ 10x T4 DNA ligase buffer 1λ 10x T4 DNA ligase buffer 1 λ Τ4 DNA ligase 1 λ T4 DNA ligase 1.5 λ πλασµίδιο έκφρασης 1,5 λ πλασµίδιο έκφρασης 2.5 λ συνθετικό γονίδιο - Έπειτα το συνθετικό γονίδιο αποσπάται από τον φορέα puc57 µε τη βοήθεια των περιοριστικών ενδονουκλεασών dei και BamHI και µε ηλεκτροφόρηση σε gel αγαρόζης 1%, το ανακτούµε σε καθαρή µορφή µε τη χρήση ειδικού kit για gel extraction Gel extraction Για να αποσπάσουµε τις αλληλουχίες του DNA που µας ενδιαφέρουν ώστε να προχωρήσουµε σε περαιτέρω διαδικασίες, όπως εισαγωγή ενός γονιδίου σε κάποιον φορέα κλωνοποίησης, χρησιµοποιήσαµε το ucleospin Gel and PCR Clean-up kit της εταιρείας Macherey-Nagel. Αρχή της µεθόδου Το ucleospin Gel and PCR Clean-up kit είναι ένα kit 2 σε 1 που επιτρέπει τον καθαρισµό τµηµάτων DNA από ενζυµικές αντιδράσεις, όπως την PCR, καθώς και από gel αγαρόζης. Το δείγµα αναµιγνύεται µε ρυθµιστικό διάλυµα δέσµευσης ΝΤΙ και, σε περίπτωση που µπάντα DNA αποκόπτεται από gel, θερµαίνεται ώστε να διαλυθεί η αγαρόζη. Παρουσία χαοτροπικού άλατος, το DNA προσδένεται στη µεµβράνη σιλικόνης της στήλης καθαρισµού του ucleospin Gel and PCR Cleanup kit. Επιµολύνσεις αποµακρύνονται µε απλά βήµατα πλύσεως µε αιθανολικό ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης ΝΤ3. Τέλος, το καθαρό DNA εκλούεται υπό συνθήκες χαµηλού άλατος µε ελαφρώς αλκαλικό ρυθµιστικό διάλυµα έκλουσης ΝΕ (5 mm Tris/HCl, pη 8.5). Πειραµατική διαδικασία Πρωτόκολλο καθαρισµού DNA από gel αγαρόζης: 24

27 1. Αποκοπή τµήµατος D A/διαλυτοποίηση λωρίδας του gel. Με αποστειρωµένο νυστέρι, αποκόπτουµε λωρίδα του gel αγαρόζης που περιέχει το κοµµάτι του DNA που θέλουµε να καθαρίσουµε, προσπαθώντας η λωρίδα αυτή να έχει όσο το δυνατό λιγότερη αγαρόζη. Τοποθετούµε τη λωρίδα αυτή σε προζυγισµένο σωληνάριο τύπου eppendorf. Ταυτόχρονα το gel αγαρόζης εκτίθεται σε UV ακτινοβολία. Για κάθε 100 mg από gel αγαρόζης < 2% προσθέτουµε 200 µl ρυθµιστικού διαλύµατος NTI, ενώ για gel αγαρόζης > 2%, διπλασιάζουµε τον όγκο του NTI. Επωάζουµε το δείγµα για 5-10 min στους 50 o C. Αναδεύουµε στο vortex το δείγµα κάθε 2-3 min µέχρι να διαλυθεί πλήρως η αγαρόζη. 2. έσµευση του D A. Τοποθετούµε τη στήλη ucleospin Gel and PCR Clean-up σε ένα σωλήνα συλλογής και φορτώνουµε έως 700 µl δείγµατος. Φυγοκεντρούµε για 30 s σε rpm. Απορρίπτουµε το flow-through και επιστρέφουµε τη στήλη στο σωλήνα συλλογής. Φορτώνουµε και το υπόλοιπο δείγµα εάν χρειάζεται και επαναλαµβάνουµε τη φυγοκέντρηση. 3. Ξέπλυµα µεµβράνης της στήλης. Προσθέτουµε 700 µl ρυθµιστικού διαλύµατος ΝΤ3 στη στήλη. Φυγοκεντρούµε για 30 s σε rpm. Απορρίπτουµε το flow-through και επιστρέφουµε τη στήλη στο σωλήνα συλλογής. 4. Στέγνωµα µεµβράνης της στήλης. Φυγοκέντρηση για 1 min στις rpm για να φύγει το NT3 διάλυµα εντελώς. Πετάµε το σωλήνα συλλογής και τοποθετούµε τη στήλη σε eppendorf 1.5 ml. 5. Έκλουση D A. Προσθέτουµε µl ρυθµιστικού διαλύµατος NE και επωάζουµε σε θερµοκρασία δωµατίου για 1 min. Φυγοκεντρούµε για 1 min στις rpm TA cloning και το σύστηµα φορέων pgem -T Easy Το TA cloning είναι µια τεχνική υποκλωνοποίησης που αποφεύγει τη χρήση περιοριστικών ενδονουκλεασών και είναι ευκολότερη και ταχύτερη από την παραδοσιακή υποκλωνοποίηση. Η τεχνική στηρίζεται στην ικανότητα της αδενίνης (Α) και της θυµίνης (Τ) συµπληρωµατικών βάσεων- διαφορετικών τµηµάτων DNA να υβριδοποιούνται και παρουσία λιγάσης, να ενώνονται µεταξύ τους. Τα προϊόντα του PCR συνήθως ενισχύονται µε τη χρήση Taq DNA πολυµεράσης η οποία προσθέτει κατά προτίµηση µία αδενίνη στο 3 άκρο του προϊόντος. Τέτοια 25

28 ενισχυµένα µε PCR τµήµατα κλωνοποιούνται σε γραµµικούς φορείς που έχουν 3 συµπληρωµατικά άκρα θυµίνης. Η διαδικασία συµπεριλαµβάνει την προσθήκη αδενινών και στα δύο 3 άκρα του προϊόντος του PCR (Πίνακας 3.4) και την προσθήκη θυµίνης και στα δύο 3 άκρα του φορέα που µας ενδιαφέρει, ο οποίος πρέπει να είναι γραµµικός. Συνήθως, χρησιµοποιούνται kits από εταιρείες που συµπεριλαµβάνουν µεγάλο εύρος φορέων που είναι ήδη έτοιµοι για TA cloning, που έχουν δηλαδή ήδη γίνει γραµµικοί µε µια θυµίνη στο 3 ελεύθερο άκρο τους. Ένας τέτοιο φορέας είναι και ο pgem -T Easy φορέας της εταιρείας Promega. Στη συνέχεια πραγµατοποιείται η αντίδραση λιγάσης του φορέα µε το εισαγώµενο τµήµα DNA (Πίνακας 3.5) και ακολουθεί µετασχηµατισµός σε κύτταρα E. coli DH5a και επίστρωση των µετασχηµατισµένων κυττάρων σε τρυβλία LB agar/amp R, επιστρωµένα µε 100mM IPTG και 2% x-gal. Πίνακας 3.4 Προσθήκη αδενινών (datps) στο προϊόν της PCR, 5min στους 72 ºC. Αντιδραστήρια Ποσότητα (µl) Προϊόν PCR (από gel extraction) 12 datp (5 mm) 1 MgCl x buffer C 5 KAPA Taq DNA polymerase 0.5 dh 2 O sterile 5 Πίνακας 3.5 Ligation TA, για 2h σε θερµοκρασία δωµατίου. Αντιδραστήρια Ποσότητα (µl) pgem -T Easy (50 ng/µl- Promega- Amp R ) 1 Προϊόν PCR µε da-άκρα 3 10x buffer λιγάσης (Takara) 1 Λιγάση 1 dh 2 O sterile 4 Χαρακτηριστικά του φορέα κλωνοποίησης pgem -T Easy Τ-προεξοχές για εύκολη κλωνοποίηση του προϊόντος του PCR. Οι pgem -T Easy φορείς είναι γραµµικοί φορείς κλωνοποίησης µε µια θυµίνη στα 3 τελικά άκρα, και στα δύο άκρα. Οι Τ-προεξοχές στη θέση εισαγωγής βελτιώνουν σηµαντικά την αποδοτικότητα της σύνδεσης µε λιγάση των προϊόντων PCR, αποτρέποντας την 26

29 επανένωση των άκρων του φορέα κλωνοποίησης και παρέχοντας µια συµβατή προεξοχή για προϊόντα PCR που έχουν προέλθει από µία θερµοσταθερή πολυµεράση. Μπλε/Λευκή επιλογή των ανασυνδυασµένων. Οι φορείς κλωνοποίησης pgem -T Easy είναι φορείς πολλών αντιγράφων που περιλαµβάνουν τους υποκινητές των Τ7 και SP6 πολυµερασών που πλευρίζουν µια πολλαπλή περιοχή κλωνοποίησης µέσα στην περιοχή που κωδικοποιείται το α-πεπτίδιο του ενζύµου β- γαλακτοζιδάση. Η εισαγωγή ενός τµήµατος εκεί, απενεργοποιεί το α-πεπτίδιο και επιτρέπει την αναγνώριση των επιτυχώς ανασυνδυασµένων φορέων µε τη διαλογή µπλε/λευκών αποικιών που εµφανίζονται σε τρυβλίο που ενδείκνυται από το kit. Επιλογή περιοριστικών θέσεων για απόσπαση του εισαγµένου τµήµατος. Ο φορέας κλωνοποίησης pgem -T Easy περιλαµβάνει πολυάριθµες θέσεις περιορισµού µέσα στην πολλαπλή περιοχή κλωνοποίησης. Αυτή πλαισιώνεται από περιοριστικές θέσεις για τις περιοριστικές ενδονουκλεάσες EcoRI, BstZI και oti, παρέχοντας τρεις µονές ενζυµικές πέψεις για απόσπαση του εν λόγω εισαγµένου τµήµατος. Εναλλακτικά, µια διπλή πέψη µπορεί να απελευθερώνει το τµήµα αυτό από το φορέα κλωνοποίησης. Γρήγορη πρόσδεση. Στο kit pgem -T Easy Vector Systems συµπεριλαµβάνετια ένα 2x Rapid Ligation Buffer. Οι αντιδράσεις λιγάσης που χρησιµοποιούν το συγκεκριµένο ρυθµιστικό διάλυµα µπορούν να επωαστούν για µια ώρα σε θερµοκρασία δωµατίου. Ο χρόνος επώασης µπορεί να αυξηθεί για να αυξηθούν και οι αποικίες µετά από µετασχηµατισµό. Γενικά, µια επώαση στους 4 o C για όλο το βράδυ, παράγει το µέγιστο αριθµό των µετασχηµατισµών. 3.3 Μετασχηµατισµός βακτηριακών κυττάρων Ο µετασχηµατισµός (transformation) είναι ένας τρόπος µεταφοράς γενετικού υλικού µε τον οποίο ανασυνδυασµένα µόρια DNA επανεισάγονται σε κύτταραξενιστές, τα οποία έχουµε καταστήσει παροδικά διαπερατά σε µακροµόρια και αποτελεί ένα από τα σηµαντικότερα εργαλεία της τεχνολογίας του ανασυνδυασµένου DNA. Κατά τον µετασχηµατισµό, τα ανασυνδυασµένα πλασµίδια εισάγονται εκ νέου, συνήθως σε βακτηριακά κύτταρα, που δεν φέρουν πλασµίδια στο κυτόπλασµα τους και εποµένως είναι ευαίσθητα σε ορισµένα αντιβιοτικά. Τα πλασµίδια που φέρουν το κλωνοποιηµένο τµήµα DNA αναπαράγουν αυτόνοµα τον εαυτό τους δηµιουργώντας ένα µεγάλο αριθµό αντιγράφων µέσα στα κύτταρα-ξενιστές. Καθώς τα τελευταία 27

30 πολλαπλασιάζονται, τα πλασµίδια µε τα αντίγραφα του ανασυνδυασµένου µορίου DNA περνούν και στις επόµενες γενιές. Μετά από πολλές διαδοχικές κυτταρικές διαιρέσεις, δηµιουργούνται κλώνοι κυττάρων οι οποίοι περιέχουν τουλάχιστον ένα πλασµίδιο ο καθένας. Κατάλληλα βακτηριακά κύτταρα για κλωνοποίηση ανασυνδυασµένων µορίων DNA αποτελούν τα στελέχη E. coli DH5a, λόγω της υψηλής απόδοσης µετασχηµατισµού και της έλλειψης του γονιδίου της Τ7 πολυµεράσης, έτσι ώστε να µπορεί να γίνει η επιλογή κυττάρων ανθεκτικών σε αντιβιοτικά που φέρουν τα ανασυνδυασµένα πλασµίδια χωρίς όµως την υπέρµετρη έκφραση του κλωνοποιηµένου γονιδίου σε ποσότητες που θα µπορούσαν να είναι τοξικές για το βακτηριακό κύτταρο. Πειραµατική ιαδικασία Παρασκευή εκτικών Κυττάρων Για την παρασκευή δεκτικών κυττάρων ακολουθήθηκε το πρωτόκολλο των Inoue et al. (Inoue H, Nojima H, Okayama H., 1990) τα συστατικά του οποίου αναγράφονται στον Πίνακα 3.6. Το θρεπτικό διάλυµα που χρησιµοποιήθηκε είναι SOB ενώ το διάλυµα αναδιάλυσης ΤΒ (10 mm PIPES, 15 mm CaCl 2, 250 mm KCl, 55 mm MnCl 2, ph 6.7). Στάδια της διαδικασία παρασκευής δεκτικών κυττάρων: 1. Επιλογή αποικίας, διαµέτρου 2-3 mm, από τρυβλίο που έχει επωαστεί για h στους 37 ο C. 2. Εµβολιασµός της αποικίας σε 25 ml θρεπτικού υλικού SOB σε κωνική φιάλη των 250 ml. 3. Επώαση καλλιέργειας για 6-8 h στους 37 ο C υπό ανάδευση ( rpm). 4. Εµβολιασµός 10 ml από την καλλιέργεια σε 250 ml SOB και επώαση τους 25 o C. 5. Όταν OD 600nm =0.55, η καλλιέργεια µεταφέρεται σε παγόνερο για 10 min. 6. Φυγοκέντρηση της καλλιέργειας σε φυγόκεντρο Sorvall στους 4 ο C, στις 3900 rpm για 10 min και απόρριψη του υπερκειµένου. 7. Αναδιάλυση των κυττάρων σε 80 ml παγωµένου διαλύµατος Inoue για µετασχηµατισµό. 28

31 8. Φυγοκέντρηση της καλλιέργειας σε φυγόκεντρο Sorvall στους 4 ο C στις 3900 rpm για 10 min και απόρριψη υπερκειµένου. Το ίζηµα των κυττάρων στο τέλος θα πρέπει να είναι απολύτως στεγνό. 9. Αναδιάλυση των κυττάρων σε 20 ml παγωµένου διαλύµατος Inoue για µετασχηµατισµό. 10. Προσθήκη 1.5 ml DMSO που προστατεύει τα κύτταρα από κρυστάλλωση στο εσωτερικό τους όταν τοποθετούνται στον πάγο. Ήπια ανάδευση του βακτηριακού εναιωρήµατος σε παγωµένα και αποστειρωµένα eppendorfs τα οποία βυθίζονται σε υγρό άζωτο, ώστε να καταψυχθούν. 11. Αποθήκευση κυττάρων στους -80 ο C. Μετασχηµατισµός εκτικών Κυττάρων E. coli DH5a Στάδια µετασχηµατισµού δεκτικών κυττάρων E. coli DH5a: 1. Προσθήκη 1 µl του ανασυνδυασµένου πλασµιδίου σε 50 µl δεκτικών κυττάρων (σωλήνας 1). 2. Επώαση του σωλήνα 1 στον πάγο για 30 min. Σε αυτό το στάδιο το αρνητικά φορτισµένο DNA θα αλληλεπιδράσει µε τους πόρους της κυτταρικής µεµβράνης οι οποίοι έχουν επενδυθεί µε τα θετικά φορτισµένα ιόντα. 3. Πρόκληση θερµικού σοκ (heat shock). Μεταφορά του σωλήνα 1 σε υδατόλουτρο µε θερµοκρασία 42 ο C για 90 sec. Το θερµικό σοκ συµβάλλει στην είσοδο του DNA εντός των κυττάρων. 4. Τοποθέτηση του σωλήνα 1 για 5 min σε παγόνερο. 5. Προσθήκη 250 µl SOC medium υπό ασηπτικές συνθήκες, (Πίνακας 3.6) στο σωλήνα Επώαση στους 37 ο C για 50 min. Αυτό το στάδιο επιτρέπει την ανάκαµψη των κυττάρων από το κρύο. Αρχίζουν να µεγαλώνουν και να συνθέτουν πρωτεΐνες πριν την προσθήκη αντιβιοτικών. 7. Επίστρωση, σε τρυβλίο µε LB agar (Πίνακας 3.6), 150 µl αντιβιοτικού αµπικιλλίνη (amp) συγκέντρωσης 100 µg/ml. Αφήνω τα τρυβλία να στεγνώσουν σε θερµοκρασία δωµατίου. Έπειτα τοποθετώ τα τρυβλία στους 37 ο C ανάποδα, ώστε αν συµβεί συµπύκνωση υδρατµών, το νερό να συσσωρευτεί στο καπάκι και όχι στο άγαρ, προκειµένου να αποφευχθούν οι επιµολύνσεις. Επώαση για h. 29

32 Αποθήκευση Μετασχηµατισµένων Κυττάρων Οι κλώνοι των βακτηριακών κυττάρων µπορούν να διατηρηθούν ζωντανοί στους -80 ο C για πολύ µεγάλα χρονικά διαστήµατα. Στάδια αποθήκευσης κττάρων στους -80 ο C: 1. Εµβολιασµός µονής αποικίας από φρέσκο τρυβλίο σε 10 ml LB (Πίνακας 3.6) που περιέχει το κατάλληλο αντιβιοτικό. 2. Επώαση της καλλιέργειας στους 37 ο C υπό ανάδευση ( rpm) µέχρι η OD 600nm να πάρει τιµή 0.8, δηλαδή η καλλιέργεια να φτάσει στη µέση λογαριθµική φάση ανάπτυξης. 3. Μεταφορά 900 µl καλλιέργειας σε σωλήνα eppendorf και προσθήκη 100 µl διαλύµατος γλυκερόλης 60%. Καλή ανάδευση µε πιπετάρισµα. Ο ρόλος της γλυκερόλης είναι να προστατεύει τα κύτταρα από τη θραύση κατά την ψύξη. Πίνακας 3.6 Συστατικά των θρεπτικών υλικών που χρησιµοποιήθηκαν. Θρεπτικό Υλικό Super Optibal Broth (SOB medium) Σύσταση 2% w/v tryptone 0.5% w/v yeast extract 10 mm NaCl 2.5 mm KCl 10 mm MgCl 2 S.O.C. medium 10 mm MgSO 4 2% tryptone 0.5% yeast extract 10 mm NaCl 2.5 mm KCl 10 mm MgCl 2 LB agar LB SIGMA 10 mm MgSO 4 20 mm glucose 10g/L Bacto-tryptone 5g/L yeast extract 10 g/l NaCl 15 g/l agar 10g/L Tryptone 5 g/l Yeast Extract 5 g/l NaCl 30

33 3.4 Αποµόνωση Πλασµιδιακού DNA Για την αποµόνωση πλασµιδιακού DNA χρησιµοποιήσαµε το kit ucleospin Plasmid της εταιρείας Macherey-Nagel. Αρχή της µεθόδου Με τη µέθοδο ucleospin Plasmid τα βακτήρια που έχουν µετατραπεί σε ίζηµα επαναδιαλύονται Ρυθµιστικό διάλυµα A1 (Πίνακας 3.7) και το πλασµιδιακό DNA απελευθερώνεται από τα κύτταρα-ξενιστές E. coli µε SDS/αλκαλική λύση (Ρυθµιστικό διάλυµα A2). To ρυθµιστικό διάλυµα A3 ουδετεροποιεί το προκύπτον λύµα των κυττάρων και δηµιουργεί κατάλληλες συνθήκες για την προσθήκη του πλασµιδιακού DNA στη µεµβράνη σιλικόνης της στήλης καθαρισµού του ucleospin Plasmid kit. Κατακρηµνισµένες πρωτεΐνες, γενωµικό DNA και συντρίµµατα του κυττάρου ιζηµατοποιούνται µετά από φυγοκέντρηση. Το υπερκείµενο περνά από τη στήλη καθαρισµού του kit. Με το ucleospin Plasmid kit επιµείξεις όπως άλατα, µεταβολίτες και διαλυτά συστατικά µακροµόρια του κυττάρου αφαιρούνται µε απλή πλύση µε το αιθανολικό ρυθµιστικό διάλυµα Α4. Καθαρό πλασµιδιακό DNA εκλούεται υπό συνθήκες χαµηλού ιονικού δυναµικού µε το ελαφρώς αλκαλικό ρυθµιστικό διάλυµα ΑΕ. Όταν χρησιµοποιούνται κλώνοι ξενιστών µε υψηλά επίπεδα νουκλεασών, ένα επιπλέον βήµα ξεπλύµατος ακολουθείται µε προθερµασµένο ρυθµιστικό διάλυµα AW. Επιπλέον πλύσιµο µε ρυθµιστικό AW θα αυξήσει επίσης το µήκος ανάγνωσης των αυτοµατοποιηµένων αντιδράσεων προσδιορισµού αλληλουχίας του DNA µε φθορισµό. Πίνακας 3.7 Συστατικά των ρυθµιστικών διαλυµάτων που χρησιµοποιήθηκαν (όπου σηµειώνεται - η εταιρία δεν αναφέρει την σύσταση του ρυθµιστικού). Ρυθµιστικό διάλυµα Σύσταση Α1 - Α2 Sodium hydroxide 0.2-2% Α3 Guanidine hydrochloride 36-50% Α4 - AW Guanidine hydrochloride 36-50% Isopropanol 20-50% ΑΕ 5 mm Tris/HCl, ph

34 Πειραµατική διαδικασία ιαδικασία αποµόνωσης του πλασµιδιακού DNA: 1. Καλλιέργεια και συλλογή βακτηριακών κυττάρων. Φυγοκέντρηση 2 ml καλλιέργειας βακτηρίων στις rpm για 30 min και απόρριψη υπερκειµένου. 2. Λύση των κυττάρων. Αναδιάλυση του ιζήµατος των κυττάρων µε προσθήκη 250 µl ρυθµιστικού διαλύµατος Α1 και ανάδευση στο vortex. Πρόσθεση 250 µl ρυθµιστικού διαλύµατος Α2 µε ήπια ανάδευση του σωλήνα. Επώαση για 5 min σε θερµοκρασία δωµατίου µέχρι τη διαύγαση του λύµατος. Πρόσθεση 300 µl ρυθµιστικού διαλύµατος Α3 και ήπια ανάδευση. 3. ιαύγεια λύµατος. Φυγοκέντρηση στις rpm για 5 min σε θερµοκρασία δωµατίου. 4. έσµευση D A. Το υπερκείµενο του βήµατος 3 τοποθετείται σε στήλη ucleospin Plasmid η οποία έχει τοποθετηθεί µέσα σε ένα σωλήνα συλλογής. Φυγοκέντρηση rpm για 1 min. Απόρριψη του flow-through. 5. Ξέπλυµα µεµβράνης της στήλης. Προσθήκη 600 µl ρυθµιστικού διαλύµατος Α4. Φυγοκέντρηση rpm για 1 min. Απόρριψη του flow-through. 6. Στέγνωµα µεµβράνης της στήλης. Φυγοκέντρηση στις rpm για 2 min και απόρριψη σωλήνα συλλογής. 7. Έκλουση D A. Μεταφορά της στήλης σε σωλήνα eppendorf 1.5 ml και προσθήκη 50 µl ρυθµιστικού διαλύµατος AE. Επώαση για 1 min σε θερµοκρασία δωµατίου. Φυγοκέντρηση rpm για 1 min. 3.5 Επαγωγή του συστήµατος έκφρασης pet Tο σύστηµα έκφρασης pet: περιγραφή και ιδιότητες Το pet σύστηµα είναι το πιο αποτελεσµατικό σύστηµα που έχει αναπτυχθεί για κλωνοποίηση και έκφραση ανασυνδυασµένων γονιδίων σε κύτταρα Ε. coli. Τα γονίδια-στόχοι υποκλωνοποιούνται σε pet πλασµίδια κάτω από τον έλεγχο των ισχυρών µεταγραφικά σηµάτων του βακτηριοφάγου Τ7 (Studier, 1991; Studier FW, 1986). Τα γονίδια-στόχοι αρχικά κλωνοποιούνται σε ξενιστές (π.χ. κύτταρα DH5a) που δεν περιέχουν το γονίδιο της Τ7 RNA πολυµεράσης κι έτσι διατηρούνται µεταγραφικώς ανενεργά. Στον µη εκφράζοντα ξενιστή η παραγωγή της πρωτεΐνης- 32

35 στόχου επάγεται είτε µολύνοντας τον ξενιστή µε έναν CE6 φάγο που περιέχει το γονίδιο της Τ7 RNA πολυµεράσης, υπό τον έλεγχο των pl και pi υποκινητών, ή µεταφέροντας το πλασµίδιο σε έναν εκφράζοντα ξενιστή (π.χ. κύτταρα BL21(DE3)) ο οποίος περιέχει χρωµοσωµικό αντίγραφο του γονιδίου της Τ7 RNA πολυµεράσης υπό τον έλεγχο του υποκινητή, lacuv5. Στη δεύτερη περίπτωση η έκφραση του ανασυνδυασµένου γονιδίου επιτυγχάνεται µε την εισαγωγή επαγωγέα του οπερονίου της λακτόζης. Όταν η Τ7 RNA πολυµεράση ενεργοποιηθεί πλήρως εντός των βακτηριακών κυττάρων, σχεδόν όλα τα αποθέµατα του µεταφραστικού τους µηχανισµού χρησιµοποιούνται για την έκφραση της επιθυµητής πρωτεΐνης σε τέτοιο βαθµό που µπορεί να υπερβαίνει το 50% του συνόλου των πρωτεϊνών του κυττάρου, µόλις µερικές ώρες µετά την επαγωγή. Η απόδοση της έκφρασης ορισµένων πρωτεϊνών-στόχων βελτιώνεται σηµαντικά όταν ελαττώνονται τα επίπεδα έκφρασής τους. Αυτό επιτυγχάνεται µε την εξασθένιση Εικόνα 3.3 pet system. H έκφραση της Τ7 RNA πολυµεράσης οδηγεί στην έκφραση της πρωτεΐνης HUSho ( της έκφρασης της Τ7 RNA πολυµεράσης ελαττώνοντας τα επίπεδα του επαγωγέα Επαγωγή και έλεγχος της έκφρασης του γονιδίου της HUSho Επαγωγή της έκφρασης του γονιδίου στόχου Ο µετασχηµατισµός των κυττάρων έκφρασης BL21(DE3) µε το ανασυνδυασµένο πλασµίδιο pet-11a-husho έχει ως αποτέλεσµα την υπερέκφραση του γονιδίου-στόχου µόνο όταν συµβεί επαγωγή της Τ7 RNA πολυµεράσης. Η T7 RNA πολυµεράση βρίσκεται υπό τον αυστηρό έλεγχο του lacuv5 υποκινητή του οπερονίου της λακτόζης. Όταν τα κύτταρα αναπτύσσονται σε θρεπτικό υλικό χωρίς επαγωγέα (π.χ. λακτόζη), ο καταστολέας laci είναι δεσµευµένος στο χειριστή Ο του οπερονίου εµποδίζοντας τη µεταγραφή. Εάν στο θρεπτικό υλικό εισαχθεί λακτόζη ή κάποιο ανάλογο της λακτόζης, όπως η αλλολακτόζη ή το τεχνητό µόριο IPTG (Isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside), προσδένεται στον καταστολέα laci και έτσι επάγεται η µεταγραφή του lac οπερονίου το οποίο περιέχει το γονίδιο της Τ7 RNA πολυµεράσης. 33

36 Για την επαγωγή της έκφρασης του γονιδίου της πρωτεΐνης HUSho µετασχηµατίστηκαν δεκτικά κύτταρα E. coli BL21(DE3) µε το πλασµιδιακό ανασυνδυασµένο DNA που αποµονώθηκε από τους ξενιστές κλωνοποίησης. Τα µετασχηµατισµένα στελέχη µεταφέρθηκαν υπό στείρες συνθήκες σε θρεπτικό LB (5 ml) µε αντιβιοτικό αµπικιλλίνη (5 µl) για 20 min, κατόπιν προστέθηκε θρεπτικό LB ώστε ο τελικός όγκος να γίνει σταδιακά 200 ml και τελικά 1L και επωάστηκαν για µία µέρα (overnight) στους 37 ο C µε ήπια ανάδευση (258 rpm). Την επόµενη µέρα, µετρήθηκε η οπτική πυκνότητα της καλλιέργειας στα 600 nm και η καλλιέργεια αραιώθηκε έτσι ώστε η τελικά OD 600nm =0.5. Η αραίωση έγινε σύµφωνα µε τον τύπο: ( ) ( ) = ( ) ( ) Φυλάξαµε µικρή ποσότητα καλλιέργειας (250 µl) σε eppendorf 1 ml στην οποία προσθέσαµε κατάλληλη ποσότητα διαλύµατος λύσης κυττάρων Laemli buffer 1x, ως αρνητικό control της επαγωγής κατά την ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE που ακολουθεί. Για το Laemli buffer ισχύει γενικά ότι σε OD=1 αντιστοιχούν 100µl Laemli buffer. To Laemli buffer 1x λαµβάνεται από stock Laemmli Buffer 2x (4% SDS, 20% glycerol, 0.004% bromophenol blue, M Tris-Cl, 10% betamercaptoethanol) µετά από αραίωση µε dh 2 O σε αναλογία 1:1. Στη συνέχεια, η καλλιέργεια επωάστηκε έως ότου η OD 600nm προσεγγίσει την τιµή 0.8. Σε αυτό το σηµείο της διαδικασίας, προστέθηκε ο επαγωγέας IPTG 1Μ ώστε να ξεκινήσει η επαγωγή και η καλλιέργεια επωάστηκε για 3 ώρες στους 37 ο C Κινητική της επαγωγής Μετά την προσθήκη του επαγωγέα IPTG, πήραµε δείγµατα (250 µl) της καλλιέργειας και αφού τα φυγοκεντρήσαµε στις rpm για 3 min στους 4 ο C, ώστε να καθιζάνουν τα κύτταρα, απορρίψαµε το υπερκείµενο και προσθέσαµε κατάλληλη ποσότητα Laemli buffer 1x (10 µl για 0.1 OD 600nm της καλλιέργειας) για τη λύση των κυττάρων, ανά µία ώρα, για τρεις συνεχόµενες ώρες. Ακολουθούσε ισχυρή ανάδευση του κάθε δείγµατος για 10 min, επίδραση υπερήχων για 30 min και θέρµανση στους 100 ο C για 3 min Έλεγχος της επαγωγής µε SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση 34

37 Οι πρωτεΐνες ως επί τω πλείστω φέρουν καθαρό θετικό ή αρνητικό φορτίο, υπό ορισµένες συνθήκες σε δεδοµένο περιβάλλον, το οποίο προκύπτει από το άθροισµα των επιµέρους φορτίων των φορτισµένων αµινοξικών καταλοίπων από τα οπoία αποτελούνται. Η εφαρµογή ηλεκτρικού πεδίου σε διάλυµα πρωτεΐνης, προκαλεί την προσανατολισµένη κίνηση της ανάλογα µε το φορτίο, το σχήµα και το µέγεθός της. Η τεχνική αυτή ονοµάζεται ηλεκτροφόρηση και χρησιµοποιείται για το διαχωρισµό µιγµάτων πρωτεϊνών που περιέχονται σε ένα υδατικό διάλυµα ή σε διαλύµατα που συγκρατούνται σε στερεό πορώδες υλικό. Εικόνα 3.4 Πειραµατική διάταξη ηλεκτροφόρησης SDS-PAGE. Το διάλυµα της πρωτεΐνης φορτώνεται στα πηγάδια (sample wells) του staking gel. Με την εφαρµογή διαφοράς δυναµικού µεταξύ ανόδου (+) και καθόδου (-) οι αρνητικά φορτισµένες πρωτεΐνες (λόγω κάλυψης µε SDS) κινούνται προς την άνοδο και διαχωρίζονται ανάλογα µε το φορτίο, το σχήµα και το µέγεθός τους ( Μια εκδοχή αυτής της µεθόδου ονοµάζεται SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση και χρησιµοποιεί πήκτωµα ακρυλαµίδης ως αδρανές υλικό µέσα στο οποίο θα γίνει ο διαχωρισµός των πρωτεϊνών. Το πήκτωµα παρασκευάζεται, ακριβώς πριν τη χρήση του, µε τον πολυµερισµό µονοµερών ακρυλαµίδης. Ο πολυµερισµός επάγεται παρουσία ενώσεων όπως το TEMED (N,N,N,Ν -τετραµεθυλαιθυλενοδιαµίνη) και το APS (ammonium persulfate). Το TEMED καταλύει το σχηµατισµό ελεύθερων ριζών από το APS, οι οποίες στη συνέχεια προκαλούν τον πολυµερισµό της ακρυλαµίδης. Σε χαµηλό ph καταστέλλεται η δράση του TEMED, οπότε χρησιµοποιείται η βιταµίνη ριβοφλαβίνη. Αύξηση της συγκέντρωσης του TEMED ή του APS οδηγεί σε 35

38 αύξηση της ταχύτητας πολυµερισµού της ακρυλαµίδης. Το µέγεθος των πόρων του πηκτώµατος µπορεί να προσαρµοσθεί κατάλληλα σε κάθε πείραµα έτσι ώστε να επιβραδύνεται η κίνηση των πρωτεϊνικών µορίων που µας ενδιαφέρουν. Οι πρωτεΐνες που πρόκειται να διαχωρισθούν βρίσκονται σε διάλυµα το οποίο περιέχει έναν ισχυρώς αρνητικά φορτισµένο αποδιατακτικό παράγοντα, το SDS (sodium dodecyl sulfate). Εικόνα 3.5 Ο αποδιατακτικός παράγοντας SDS καλύπτει τα υδρόφοβοβα µέρη της πρωτεΐνης και προσδίδει σε αυτή επιφανειακό αρνητικό φορτίο ανάλογου µεγέθους µε το σχήµα και το µέγεθος της αποδιατεταγµένης πρωτεΐνης ( Το SDS προσδένεται στις υδρόφοβες περιοχές των πρωτεϊνικών µορίων, προκαλώντας την αποδιάταξη του πρωτεϊνικού µορίου και εξαλείφοντας τις αλληλεπιδράσεις τους µε άλλες πρωτεΐνες ή λιπίδια. Επιπλέον, ένας αναγωγικός παράγοντας, όπως η µερκαπτοαιθανόλη, χρησιµοποιείται για να σπάσει τους διαµοριακούς και ενδοµοριακούς δισουλφιδικούς δεσµούς, καταστρέφοντας την τριτοταγή ή και τεταρτοταγή δοµή, αν υπάρχει. Έτσι κάθε πρωτεϊνικό µόριο προσδένει τελικά µεγάλο αριθµό αρνητικά φορτισµένων µορίων SDS, µε αποτέλεσµα να επικαλύπτεται το ενδογενές φορτίο της πρωτεΐνης και να κατευθύνεται προς το θετικό ηλεκτρόδιο όταν εφαρµοσθεί τάση στο σύστηµα. Πρωτεΐνες του ίδιου µεγέθους εµφανίζουν παρόµοια συµπεριφορά κατά την ηλεκτροφόρηση διότι η δοµή τους είναι εντελώς αποδιαταγµένη από το SDS, µε αποτέλεσµα το σχήµα τους να είναι περίπου το ίδιο. Επιπλέον, προσδένουν την ίδια ποσότητα SDS συνεπώς φέρουν το ίδιο µέγεθος αρνητικού φορτίου. 36

39 Εικόνα 3.6 Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα ακρυλαµίδης (SDS-PAGE). Τα µικρότερου µεγέθους µόρια διανύουν µεγαλύτερη απόσταση στο πήκτωµα και εντοπίζονται στις χαµηλότερες ζώνες του (Dr Anurag Yadav, Bio-FMMC). Για να διαπιστωθεί η επιτυχής έκφραση του γονιδίου της πρωτεΐνης HUSho, γίνεται ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα ακρυλαµίδης (SDS-PAGE 15%, Πίνακας 3.8) των πρωτεϊνών που προκύπτουν από τα δείγµατα της βακτηριακής καλλιέργειας που είχε υποβληθεί σε επαγωγή µε IPTG. Για τον εντοπισµό της πρωτεΐνης στο πήκτωµα, βάσει του µοριακού της βάρους, χρησιµοποιείται ο Marker Nippon-Cat No MWPO3. Πίνακας 3.7 Συστατικά πηκτώµατος SDS-PAGE 15%. Running gel (15%) Stacking gel (5%) Ποσότητες Ποσότητες Συστατικά συσυτατικών για πήκτωµα 10 ml Συστατικά συσυτατικών για πήκτωµα 3 ml dh 2 O 2.3 ml dh 2 O 2.1 ml Ακρυλαµίδη- bis Ακρυλαµίδη- bis 5.00 ml ακρυλαµίδη (30:0,8%) ακρυλαµίδη (30:0,8%) 500 µl 1.5 M Tris/HCl ph ml 1 M Tris/HCl ph µl 10% SDS 100 µl 10% SDS 30 µl 10% APS 100 µl 10% APS 30 µl TEMED 4 µl TEMED 3 µl 37

40 3.6 ιαδικασία αποµόνωσης και καθαρισµού της πρωτεΐνης HUSho Μεθοδολογική προσέγγιση Η στρατηγική του καθαρισµού της υπερπαραγόµενης πρωτεΐνης εξαρτάται από την τοπολογία της, καθώς µπορεί να εκκριθεί εκτός του βακτηριακού κυττάρου έκφρασης, να µεταφερθεί στον περιπλασµατικό χώρο ή να καταλήξει σαν διαλυτό ή αδιάλυτο πολυπεπτίδιο µέσα στο κυτόπλασµα, και επιπροσθέτως από τα βιοχηµικά και βιοφυσικά χαρακτηριστικά της. Σε κάθε περίπτωση για την αποµόνωση ακολουθείται διαφορετική διαδικασία. Οι µέθοδοι αποµόνωσης περιλαµβάνουν χρωµατογραφικές τεχνικές ανάλογα µε τα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά της κάθε πρωτεΐνης ιαφορική κλασµάτωση µε τη χρήση θειικού αµµωνίου Μιας και η HUSho είναι µία διαλυτή στο κυτόπλασµα πρωτεΐνη θα πρέπει αρχικά να µειωθούν οι υδρογονικοί δεσµοί που σχηµατίζει µε το νερό για να µπορέσει να κατακρυµνιστεί. Με την προσθήκη αλάτων υψηλής συγκέντρωσης τα µόρια του νερού αποµακρύνονται από τις πρωτεΐνες καθώς ελαττώνεται ο αριθµός των υδρογονικών δεσµών και έτσι αυξάνεται η τάση της πρωτεΐνης προς κατακρήµνιση. Η διαδικασία αυτή, γνωστή ως εξαλάτωση (salting out), πραγµατοποιείται σε υψηλή συγκέντρωση άλατος. Το άλας ανταγωνίζεται τις πολικές πλευρικές αλυσίδες των πρωτεϊνών για τα µόρια του νερού, ενώ παράλληλα µειώνει τον αποτελεσµατικό όγκο του διαλύτη. Η διαλυτότητα των πρωτεϊνών ποικίλει ανάλογα µε την ιονική ισχύ του διαλύµατος, και εξαρτάται από την συγκέντρωση του άλατος. Σε χαµηλές συγκεντρώσεις άλατος, η διαλυτότητα των πρωτεϊνών αυξάνεται καθώς αυξάνεται η συγκέντρωση του άλατος, ένα φαινόµενο που καλείται salting in. Όσο η συγκέντρωση του άλατος, δηλαδή η ιονική ισχύς του διαλύµατος, αυξάνεται πέρα από ένα όριο, η διαλυτότητα των πρωτεϊνών αρχίζει σταδιακά να µειώνεται. Σε υψηλή ιονική ισχύ, η πρωτεΐνη τελικά θα κατακρηµνιστεί. Η κατακρήµνιση µε θειικό αµµώνιο είναι µια ευρέως χρησιµοποιούµενη προσέγγιση για µερικό καθαρισµό πρωτεϊνών. Το θειικό ανιόν αλληλεπιδρά µε τα µόρια του νερού µειώνοντας την διαθεσιµότητα τους για τα πρωτεϊνικά µόρια. Σε ορισµένη συγκέντρωση θειικού αµµωνίου, η ποσότητα των µορίων νερού που δεν έχουν προσδεθεί στο θειικό ανιόν, δεν είναι πλέον ικανή να διατηρήσει την πρωτεΐνη 38

41 σε διαλυτή κατάσταση κι έτσι αυτή κατακρηµνίζεται (Burgess, 2009) Χρωµατογραφικός καθαρισµός της HUSho Η χρωµατογραφία είναι µία χηµική αναλυτική τεχνική που περιλαµβάνει σειρά µεθόδων διαχωρισµού ενός µίγµατος ουσιών στα επιµέρους συστατικά του. Ο διαχωρισµός ουσιών στηρίζεται στην κατανοµή των ουσιών µεταξύ δύο φάσεων, µιας κινητής (συνεχούς ροής) και µιας ακίνητης (στατική φάση). Το προς διαχωρισµό µίγµα τοποθετείται στη µία άκρη της στατικής φάσης και εκλούεται µε σταθερή ταχύτητα από την κινητή φάση. Η επιλογή των δύο φάσεων γίνεται ανάλογα µε τα συστατικά του µίγµατος, ώστε ο διαχωρισµός τους να είναι σαφής. Τα συστατικά που συγκρατούνται ισχυρότερα από τη στατική φάση κινούνται πιο αργά κατά τη ροή της κινητής φάσης µε αποτέλεσµα να διανύουν µικρότερη απόσταση στο πήκτωµα. Αντίθετα, τα συστατικά τα οποία συγκρατούνται ασθενέστερα από τη στατική φάση, κινούνται ταχύτερα και διεισδύουν σε µεγαλύτερο µήκος. Οι διάφορες χρωµατογραφικές µέθοδοι διαφέρουν µεταξύ τους ως προς τη φύση της κινητής φάσης (υγρή ή αέρια), τη φύση της στατικής φάσης (στερεό ή υγρό πάνω σε στερεό υπόστρωµα), τον µηχανισµό βάσει του οποίου γίνεται ο διαχωρισµός (προσρόφηση, ιοντοανταλλαγή, κατανοµή, µέγεθος µορίων) καθώς και ως προς το µέσο στο οποίο έχει τοποθετηθεί η στατική φάση (στήλη, λεπτή στοιβάδα πάνω σε γυάλινη πλάκα ή χαρτί). Ο καθαρισµός της πρωτεΐνης HUSho πραγµατοποιήθηκε µε χρωµατογραφία συγγένειας. Στη συγκεκριµένη χρωµατογραφική µέθοδο χρησιµοποιήθηκε στήλη ηπαρίνης, αρνητικού φορτίου, εφόσον η υπό µελέτη πρωτεΐνη HUSho έχει θετικά φορτισµένο σηµείο πρόσδεσης µε το DNA, που ως γνωστόν είναι ένα αρνητικά φορτισµένο µακροµόριο. Η χρωµατογραφία συγγένειας αποτελεί την πιο αποτελεσµατική χρωµατογραφική τεχνική καθαρισµού πρωτεϊνων. Η αρχή λειτουργίας της βασίζεται στην ικανότητα των βιολογικών µορίων να αναγνωρίζουν και να δεσµεύουν µε εκλεκτικό και αντιστρέψιµο τρόπο συγκεκριµένα µόρια-συνδέτες (ligand). Ο προσροφητής συγγένειας αποτελείται από ένα κατάλληλο πολυµερές στερεό υλικό στο οποίο έχει δεσµευθεί το µόριο-συνδέτης. Όταν ένα δείγµα που περιέχει µίγµα µακροµορίων περνά από τη στήλη που φέρει τον προσροφητή συγγένειας, θα συγκρατηθεί στη στήλη µόνο το µακροµόριο που παρουσιάζει συγγένεια µε τον συνδέτη, ενώ τα υπόλοιπα µόρια θα εκλουθούν. 39

42 Κατόπιν, εφαρµόζοντας συνθήκες που εξασθενούν τις δυνάµεις αναγνώρισης µε τον συνδέτη, µπορούµε µε έκλουση να ανακτήσουµε το προσροφηµένο µόριο. Στάδια χρωµατογραφίας συγγένειας: 1. Εξισορρόπηση. Καθορίζονται οι ευνοϊκές συνθήκες (ph, ιονική ισχύς της στήλης) στις οποίες επιτρέπεται η πρόσδεση µόνο των επιθυµητών µορίων στον προσρροφητή συγγένειας. 2. Πρόσδεση µορίων του µίγµατος. Το δείγµα φορτώνεται στην στήλη και καθώς το διάλυµα έκλουσης περνά από τη στήλη τα επιθυµητά µόρια προσδένονται ειδικά και αντιστρεπτά στον συνδέτη ενώ τα υπόλοιπα αποµακρύνονται. 3. Έκλουση. Με σταδιακή ή απότοµη µεταβολή του ph του διαλύµατος έκλουσης ή αύξηση της ιονικής δύναµης της στήλης, τα µόρια-στόχοι εκλούονται και συλλέγονται στο τέλος της διαδικασίας. 4. Αναγέννηση στήλης. Η στήλη θα πρέπει να εξισορροπηθεί ξανά στις αρχικές συνθήκες Πειραµατική διαδικασία Την υπερπαραγωγή της πρωτεΐνης HUSho σε καλλιέργεια 1 L, ακολούθησε φυγοκέντρηση της καλλιέργειας σε ψυχόµενη φυγόκεντρο τύπου Sorvall στους 4 ο C σε rpm για 15 min ώστε τα κύτταρα να καθιζάνουν. Το υπερκείµενο απορρίφθηκε και προστέθηκε διάλυµα PBS 1x (8 g/l NaCl, 0.2 g/l KCl, 1,44 g/l Na 2 HPO 4, 0.24 g/l KH 2 PO 4 ) για την επαναδιάλυση των κυττάρων. ιαδικασία λύσης των κυττάρων: 1. Αναδιάλυση των κυττάρων στο διάλυµα λύσης που περιέχει αναστολέα πρωτεασών (lysis buffer: 20mM Tris ph 7.0, 1mM EDTA, 100mM NaCl, 0.1% PMSF, 0.5% NP-40) 2. Λύση των κυττάρων µε χρήση υπερήχων για 20 min µε ταυτόχρονη ήπια ανάδευση. Τα κύτταρα πρέπει να έχουν επωαστεί σε παγόνερο και να βρίσκονται σε θερµοκρασία 4 ο C καθόλη τη διαδικασία. 3. Φυγοκέντρηση του εναιωρήµατος σε rpm για 30 min στους 4 ο C. To ίζηµα (pellet) περιέχει υπολείµµατα µεµβρανών, οργανιδίων, κυτταρικού σκελετού, το µεγαλύτερο µέρος του χρωµοσωµικού DNA, ενώ το υπερκείµενο (super ή total extraction, διαλυτό κλάσµα) περιέχει τις διαλυτές πρωτεΐνες, θραύσµατα DNA, RNA, µικρά µόρια, ριβοσώµατα, κ.ά.. 40

43 ιαφορική κλασµάτωση της HUSho µε χρήση θειικού αµµωνίου Μετά τη λύση των κυττάρων και τη συλλογή του υπερκείµενου ακολουθεί η διαδικασία της κλασµάτωσης µε θειικό αµµώνιο, στην οποία ποσότητα θειικού αµµωνίου ανάλογη του όγκου του υπερκείµενου προστίθεται σταδιακά σε αυτό έως ότου πάρουµε διαδοχικά κλάσµατα αυξανόµενης συγκέντρωσης. Η συγκέντρωση θειικού αµµωνίου στην οποία κατακρηµνίζεται κάθε πρωτεΐνη είναι διαφορετική. Γι αυτό το λόγο η διαδικασία κατακρήµνισης πραγµατοποιήθηκε σε τρεις φάσεις, αυξάνοντας κάθε φορά το βαθµό κορεσµού του διαλύµατος σε θειικό αµµώνιο, ώστε να προκύψουν κλάσµατα µε 0-40%,40-60% και 60-80% κορεσµό. Η ποσότητα του θειικού αµµωνίου που προστίθεται κάθε φορά δίνεται από τον Πίνακα 3.9, διότι το θειικό αµµώνιο µεταβάλλει τον όγκο του διαλύµατος, συνεπώς θα πρέπει σε κάθε στάδιο να υπολογίζεται εκ νέου η προστιθέµενη ποσότητα. Τα τρία διαλύµατα φυγοκεντρούνται για 15 min στις rpm, στους 4 ο C. Πριν την κλασµάτωση αλλά και σε κάθε κλάσµα µετά από τη φυγοκέντρηση κρατάµε 200 µl από το υπερκείµενο, ενώ το ίζηµα επαναδιαλύεται σε ρυθµιστικό διάλυµα (20 mm Phosphate buffer, 1 mm EDTA, ph 8) από το οποίο κρατάµε και πάλι δείγµα όγκου 200 µl. Πίνακας 3.9 Ποσότητα θειικού αµµωνίου που πρέπει να προστεθεί σε ένα λίτρο διαλύµατος ανάλογα µε το ποσοστό κορεσµού του θειικού αµµωνίου. 41

44 Κατακρήµνιση της HUSho µε τριχλωροξικό οξύ (TCA) Το τριχλωροξικό οξύ προκαλεί αντιστρεπτά µερική αποδιάταξη των πρωτεϊνικών µορίων και ως εκ τούτου χρησιµοποιείται για την κατακρύµνιση τους. Πιο συγκεκριµένα, σε χαµηλές συγκεντρώσεις TCA, τα αρνητικά φορτισµένα τριχλωροξικά ιόντα διαταράσσουν τις ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις που σταθεροποιούν τη φυσική διαµόρφωση των πρωτεϊνών. Η µερική αποδιάταξη οδηγεί στην έκθεση µη πολικών περιοχών του µορίου στο διαλύτη, µε αποτέλεσµα την διαµοριακή συνένωση πρωτεϊνικών µορίων και τελικά την κατακρήµνισή τους. Κατακρήµνιση της HUSho µε τριχλωροξικό οξύ πραγµατοποιήθηκε στα δείγµατα που είχαν φυλαχθεί από την προηγούµενη διαδικασία κατακρήµνισης µε θειικό αµµώνιο. Σε κάθε υπερκείµενο προσθέσαµε τόση ποσότητα TCA 50%, ώστε η τελική του συγκέντρωση στο διάλυµα να είναι 10%, σύµφωνα µε τον τύπο: % = ( ύ + ) % ιαδικασία κατακρήµνισης: 1. Σε δεδοµένη ποσότητα από το κάθε δείγµα (200 µl) προστίθεται το TCA που του αναλογεί µε βάση τον παραπάνω τύπο (50 µl) και το διάλυµα αφήνεται για 15 min στους 4 ο C. 2. Φυγοκέντρηση rpm για 15 min στους 4 ο C και απόρριψη του υπερκειµένου. 3. Ξέπλυµα του ιζήµατος µε 1 ml παγωµένης ακετόνης έως ότου εξατµηστεί πλήρως και φυγοκέντρηση rpm για 15 min στους 4 ο C. Απόρριψη υπερκειµένου και επανάληψη αυτού του βήµατος άλλη µία φορά. 4. Αφού αφαιρεθεί η ακετόνη, αφήνω το ίζηµα να στεγνώσει τελείως και προσθέτω 50 µl Laemmli Buffer 1x Καθαρισµός της HUSho µε χρωµατογραφία συγγένειας Χρωµατογραφία συγγένειας Ο καθαρισµός της πρωτεΐνης HUSho έγινε µε χρήση της στήλης HiTrap Heparin HP, 5 ml. και τη βοήθεια περισταλτικής αντλίας. Στάδια της χρωµατογραφίας: 1. Εξισορρόπηση (equilibration). Προσαρµόζουµε τη στήλη σε κατάλληλες συνθήκες ph µε το διάλυµα εξισορρόπησης ώστε να προσδεθεί ειδικά η 42

45 πρωτεΐνη-στόχος. Ο όγκος του διαλύµατος εξισορρόπησης ισούται µε 5 φορές τον όγκο της στήλης. 2. Φόρτωση του δείγµατος. Το δείγµα πρέπει και αυτό να βρίσκεται σε συνθήκες όµοιες µε του διαλύµατος εξισορρόπησης. Αν το διάλυµα εξισορρόπησης έχει επιλεχθεί σωστά αναµένουµε ότι η πρωτεΐνη-στόχος θα συγκρατηθεί στον προσροφητή ενώ οι υπόλοιπες πρωτεΐνες του δείγµατος θα διέλθουν από τη στήλη χωρίς να προσδεθούν (flow-through). 3. Έκπλυση (washing).το διάλυµα της πρωτεΐνης διέρχεται από τη στήλη. 4. Έκλουση (elution). Σταδιακή αποδέσµευση της πρωτεΐνης HUSho από τη στήλη µε χρήση διαλύµατος έκλουσης µε γραµµικά διαβαθµισµένη αύξηση άλατος (gradient). Πίνακας 3.10 ιαλύµατα που χρησιµοποιήθηκαν κατά τη χρωµατογραφία συγγένειας ιάλυµα Εξισορρόπηση Συστατικά 20 mm Na-phosphate buffer ph 8.0, 1 mm EDTA (P 20 E 1 ph 8.0) Έκλουση 20mM Na-P buffer ph M gradient NaCl, 1 mm EDTA Τα κλάσµατα (1 ml) που συλλέγονται κατά την έκλουση ηλεκτροφορούνται σε 15% SDS πήκτωµα πολυακρυλαµίδης και εντοπίζονται τα κλάσµατα εκείνα στα οποία περιέχεται η επιθυµητή πρωτεΐνη Ποσοτικοποίηση της HUSho Τελικό στάδιο της βιοχηµικής επεξεργασίας της πρωτεΐνης αποτελεί ο ακριβής προσδιορισµός της συγκέντρωσης της στα δείγµατα που συλλέχθηκαν. Η ποσοτικοποίηση της συµπυκνωµένης πρωτεΐνης HUSho πραγµατοποιήθηκε µε τη χρήση του Brij35 ( ιάλυµα Brij35: 1 µl Brij35 σε 10 ml dh 2 O). Η συµπύκνωση επιτυγχάνεται µε χρήση του Aquicide II (άλας νατρίου της καρβοξυµεθυλοκυτταρίνης). Η ένωση αυτή έχει εξαιρετικά υψηλό ιξώδες. Περιέχει κατά µέσο όρο 0,85 καρβοξυµεθυλοµάδες ανά µονάδα ανυδρογλυκόζης. Τα Aquacides είναι χρήσιµα για την αύξηση της συγκέντρωσης βιολογικών 43

46 µακροµορίων και χρησιµοποιείται για την ταχεία αποµάκρυνση των µορίων του νερού από το σωλήνα διαπίδυσης χρησιµοποιώντας είτε το στερεό Aquacide. Τα Aquacides δεν επιδρούν στο ph αλλά ούτε και προκαλούν µετουσίωση πρωτεϊνών, κατά τη διάρκεια της συµπύκνωσης. Σε θερµοκρασία δωµατίου, 1 g του Aquacide ΙΙ απορροφά περίπου 5 ml νερού από το διάλυµα σε 1 h. Στη συνέχεια, το διάλυµα της πρωτεΐνης τοποθετείται σε µεµβράνη διαπίδυσης και επωάζεται για µία ηµέρα σε dialysis buffer (P 20 E 1 ph 8.0) για περαιτέρω συµπύκνωση της πρωτεΐνης, στους 4 o C. Πρωτόκολλο Brij 35: Φωτοµέτρηση στα 205 nm µε κυψελίδα χαλαζία: 1 µl συµπυκνωµένης πρωτεΐνης HUSho µε 999 µl διαλύµατος Brij35 (Αραίωση 1:1000) 5 µl συµπυκνωµένης πρωτεΐνης HUSho µε 995 µl διαλύµατος Brij35 (Αραίωση 1:200) 10 µl συµπυκνωµένης πρωτεΐνης HUSho µε 990 µl διαλύµατος Brij35 (Αραίωση 1:100) Από το νόµο Lambert-Beer, = και πολλαπλασιάζοντας επί την αραίωση µπορούµε να υπολογίσουµε τη συγκέντρωση της πρωτεΐνης C σε mg/ml, όπου l είναι το µήκος της κυψελίδας (1 cm). 3.7 Βιοφυσικός χαρακτηρισµός της πρωτεΐνης HUSho και δοµική ανάλυσή της µε Φασµατοπολωσιµετρία Κυκλικού ιχρωισµού (Circular Dichroism, CD) Η φασµατοπολωσιµετρία κυκλικού διχρωισµού είναι µία αναγνωρισµένη και αξιόπιστη τεχνική για τη δοµική µελέτη διαλυτών πρωτεϊνών. Η αρχή της µεθόδου βασίζεται στην πόλωση γραµµικά πολωµένου φωτός, όταν αυτό διέλθει από µία οπτικά ενεργό ουσία. Το φαινόµενο της πόλωσης προκύπτει από την επαλληλία δύο κάθετων απλών αρµονικών οπτικών ταλαντώσεων. Το φως είναι γραµµικά πολωµένο όταν η ταλάντωση του ηλεκτρικού του πεδίου γίνεται σε ένα επίπεδο, διαγράφοντας ηµιτονοειδή καµπύλη κατά µήκος της διεύθυνσης διάδοσής του. Τα ηλεκτροµαγνητικά κύµατα είναι συγχρονισµένα ταλαντούµενα ηλεκτρικά και µαγνητικά πεδία τα οποία ταλαντώνονται σε κάθετα µεταξύ τους επίπεδα και κάθετα 44

47 προς την διεύθυνση διάδοσής τους (Serway et al., 2000). Όταν αυτά τα κάθετα διαδιδόµενα κύµατα βρίσκονται σε φάση και έχουν ίδια ένταση το συνιστάµενο κύµα διαδίδεται πάνω σε ένα επίπεδο γωνίας 45⁰ και καλείται γραµµικά πολωµένο φως. Εικόνα 3.7 Γραµµικά πολωµένο φως (µπλε) ως αποτέλεσµα επαλληλίας δύο κάθετων απλών αρµονικών οπτικών ταλαντώσεων ( Α Β Εικόνα 3.8 εξιόστροφο (Α) και αριστερόστροφο (Β) κυκλικά πολωµένο φως, όταν τα κάθετα µεταξύ τους κύµατα βρίσκονται εκτός φάσης κατά rad και rad αντίστοιχα ( 45

48 Αντιθέτως, όταν τα δύο κάθετα διαδιδόµενα κύµατα βρεθούν εκτός φάσης το συνιστάµενο κύµα παύει να διαδίδεται πάνω σε ένα επίπεδο και ακολουθεί σπειροειδή τροχιά δεξιόστροφη ή αριστερόστροφη. Η διαφορά στην απορρόφηση του δεξιόστροφα και αριστερόστροφα κυκλικά πολωµένου φωτός από µία οπτικά ενεργό ουσία αποτελεί τη βάση του κυκλικού διχρωισµού. = Ως οπτικά ενεργές χαρακτηρίζονται εκείνες οι ουσίες που παρουσιάζουν τις εξής τέσσερις χαρακτηριστικές ιδιότητες αλληλεπίδρασης µε το φως: 1. Οπτική στρέψη (optical rotation). Στρέφουν το επίπεδο πόλωσης του γραµµικά πολωµένου φωτός. 2. Κυκλική διπλοθλαστικότητα (circular birefringence). Παρουσιάζουν διαφορετικό δείκτη διάθλασης για αριστερόστροφα και δεξιόστροφα κυκλικά πολωµένο φως. 3. Κυκλικό διχρωισµό (circular dichroism). Αλλαγή της πόλωσης από γραµµική σε ελλειπτική και 4. παρουσιάζουν διαφορετικό συντελεστή απορρόφησης για δεξιόστροφα (RCP) και αριστερόστροφα (LCP) κυκλικά πολωµένο φως. Η στρέψη του επιπέδου πόλωσης γραµµικά πολωµένου φωτός είναι συνέπεια της κυκλικής διπλοθλαστικότητας και ο κυκλικός διχρωισµός είναι συνέπεια της διαφοράς των συντελεστών απορρόφησης για αντίθετης φοράς κυκλικά πολωµένο φως. Έτσι οι τέσσερις παραπάνω ιδιότητες ανάγονται σε δύο, µε τις (1) και (2) να αφορούν στη διάθλαση και τις (3) και (4) να αφορούν στην απορρόφηση κυκλικά πολωµένου φωτός. Η διάθλαση σχετίζεται µε την απορρόφηση, καθώς ισχυρότερη απορρόφηση συνεπάγεται ισχυρότερη διάθλαση. Με τον τρόπο αυτό, όποτε παρουσιάζεται οπτική στρέψη παρουσιάζεται και κυκλικός διχρωισµός. Συνήθως αναφερόµαστε σε στρέψη του µεγάλου ηµιάξονα της έλλειψης παρά σε στέψη του επιπέδου πόλωσης. Τελικά, µε την τεχνική CD µετράται η επαγόµενη ελλειπτικότητα θ στην πόλωση που προκαλεί µία οπτικά ενεργός ουσία σε γραµµικά πολωµένο φως, συναρτήσει του µήκους κύµατος λ. 46

49 Α Β Εικόνα 3.10 Οι οπτικά ενεργές ουσίες παρουσιάζουν διαφορά απορρόφησης της RCP και LCP µε αποτέλεσµα το γραµµικά πολωµένο φως από την υπέρθεση των RCP και LCP να παρουσιάζει οπτική στρέψη (Α) και κυκλικό διχρωισµό (Β). Η αρχή λειτουργίας της µεθόδου βασίζεται στην διαφορά µεταξύ δύο γραµµικά πολωµένων δεσµών φωτός µε δεξιόστροφες και αριστερόστροφες συνιστώσες της ίδιας αρχικής έντασης Ι 0 όταν διέρχονται από την κυψελίδα που περιέχει το διάλυµα της οπτικά ενεργού ουσίας. Από τις τελικές τιµές έντασης Ι L και Ι R της εξερχόµενης ακτινοβολίας υπολογίζεται η διαφορά των απορροφήσεων Α L και A R και τελικά η ελλειπτικότητα θ (σε degrees). Η διαφορά απορρόφησης Α είναι ανάλογη της ελλειπτικότητας, =32.98 Το προκύπτον φάσµα κυκλικού διχρωισµού αναπαριστά τιµές ελλειπτικότητας συναρτήσει του µήκους κύµατος λ (nm) της προσπίπτουσας στο δείγµα ακτινοβολίας. Κύρια εφαρµογή της τεχνικής CD αποτελεί η µελέτη βιολογικών µορίων αφού στην πλειοψηφία τους είναι οπτικά ενεργές ουσίες. Επειδή τα επιµέρους δοµικά συστατικά των βιοµορίων απορροφούν ακτινοβολία σε διαφορετικά µήκη κύµατος, η φασµατοσκοπία κυκλικού διχρωισµού δίνει τη δυνατότητα να διακρίνουµε τα δοµικά 47

50 χαρακτηριστικά ενός µορίου ανάλογα µε το µήκος κύµατος. Το σήµα κυκλικού διχρωισµού µιας πρωτεΐνης δεν προκύπτει απλά από το άθροισµα των σηµάτων των επιµέρους αµινοξικών της καταλοίπων αλλά επηρεάζεται σηµαντικά από τη δευτεροταγή δοµή. Κάθε στοιχείο δευτεροταγούς δοµής έχει την δική του «υπογραφή» στο φάσµα λόγω της έντονης απορρόφησης σε ορισµένο µήκος κύµατος, είναι αναγνωρίσιµο και µε τη βοήθεια ειδικών υπολογιστικών προγραµµάτων µπορεί να αναλυθεί και να δώσει πληροφορίες σχετικά µε τη δοµή της πρωτεΐνης. Για τη µελέτη της πρωτεΐνης HUSho χρησιµοποιήθηκε το φασµατοπολωσίµετρο JASCO-715 (JASCO Corporation, Tokyo, Japan) που βρίσκεται στις εγκταστάσεις του Εθνικού Κέντρου Έρευνας Φυσικών Επιστηµών «ηµόκριτος», µε λειτουργικό εύρος µήκους κύµατος στην περιοχή του ορατού (VIS) και του υπεριώδους (UV, λmin= 180 nm). Εικόνα 3.11 Φασµατοπολωσίµετρο κυκλικού διχρωισµού JASCO-715. Η φασµατοπολωσιµετρία κυκλικού διχρωισµού µπορεί να αξιοποιηθεί στα ακόλουθα πεδία µελέτης: Μελέτη της δευτεροταγούς και τριτοταγούς δοµής των πρωτεϊνών και κατάταξή τους σε κατάλληλη δοµική οικογένεια. Μελέτη θερµοσταθερότητας των πρωτεϊνών µέσω σύγκρισης του ποσοστού των πρωτεϊνικών µορίων που βρίσκονται στην φυσική (διπλωµένη, folded) κατάσταση και εκείνων που έχουν αποδιπλωθεί (unfolded). 48

51 Σύγκριση της δοµής µιας πρωτεΐνης υπό διαφορετικές συνθήκες (θερµοκρασίας, ph, διαλύτη) ή σύγκριση της δοµής της µε τις δοµές µεταλλαγµάτων. Μελέτη αλληλεπιδράσεων της πρωτεΐνης µε άλλα µόρια (αναστολείς, υποστρώµατα κ.ά.) ή πρωτεΐνες που µεταβάλλουν τη δοµή των αλληλεπιδρώντων µορίων. Η δευτεροταγής δοµή των πρωτεϊνών µπορεί να προσδιοριστεί µε φασµατοπολωσιµετρία κυκλικού διχροϊσµού στη περιοχή του άπω υπεριώδους ( nm). Στη περιοχή αυτή η χρωµοφόρος οµάδα είναι ο πεπτιδικός δεσµός, όταν η πρωτεΐνη βρίσκεται στην διπλωµένη δοµή. Οι δοµές α-έλικας, β-φύλλου και τυχαίου σπειράµατος (random coil) που αποδίδουν ένα χαρακτηριστικά σε σχήµα και ένταση φάσµατα κυκλικού διχροϊσµού. Χαρακτηριστικά φάσµατα δευτεροταγών δοµών: η α-έλικα παρουσιάζει δυο αρνητικές κορυφές στα 208 και 222 nm και µία θετική στα 192 nm η β-πτυχωτή επιφάνεια παρουσιάζει µια ευρεία αρνητική κορυφή στα nm και µια θετική στα 195 nm. η β-στροφή παρουσιάζει µία ασθενή αρνητική κορυφή στα 225 nm, µία ισχυρή αρνητική στα nm και µία ισχυρή θετική κορυφή στην περιοχή nm, αν και στο φάσµα δεν διακρίνεται εύκολα. το τυχαίο σπείραµα παρουσιάζει µια ισχυρά αρνητική κορυφή κάτω από τα 200 nm και µία ασθενή θετική κορυφή στα 218 nm. Εικόνα 3.12 Φάσµα κυκλικού διχρωισµού α-έλικας (κόκκινη καµπύλη), β-πτυχωτού φύλλου (µπλε καµπύλη) και τυχαίου σπειράµατος (πράσινη καµπύλη) ( 49

52 Όπως και οι υπόλοιπες φασµατοσκοπικές τεχνικές, το σήµα του κυκλικού διχρωισµού απεικονίζει τον µέσο όρο των επιµέρους σηµάτων ολόκληρου του πρωτεϊνικού πληθυσµού. Έτσι µπορούµε να υπολογίσουµε το ποσοστό συµµετοχής ενός στοιχείου δευτεροταγούς δοµής στο πρωτεϊνικό µόριο, αλλά όχι και την αµινοξική της σύσταση. Στα πειράµατα CD που πραγµατοποιήθηκαν για τη µελέτη της δοµής της HUSho σε εύρος µήκους κύµατος nm, χρησιµοποιήθηκε διαφανής κυψελίδα χαλαζία πλάτους 1 mm. Η χρήση ψυκτικού συστήµατος Peltier µε υδάτινο λουτρό επιτρέπει τη λήψη φάσµατος CD σε επιλέξιµη σταθερή θερµοκρασία καθώς και την καταγραφή της µεταβολής της ελλειπτικότητας, σε επιλεγµένο, σταθερό µήκος κύµατος, συναρτήσει της θερµοκρασίας για σταθερό ρυθµό µεταβολής της θερµοκρασίας του δείγµατος. Για κάθε πείραµα κυκλικού διχροϊσµού απαιτείται όγκος πρωτεϊνικού διαλύµατος περίπου 300 µl ανά πείραµα σε συγκεντρώσεις mg/ml. Το ρυθµιστικό διάλυµα δεν πρέπει να εµφανίζει ισχυρή απορρόφηση στην περιοχή του υπεριώδους. Τα πρωτεϊνικά φάσµατα κυκλικού διχροϊσµού αναλύονται ως γραµµικός συνδυασµός των φασµάτων που αναφέρθηκαν νωρίτερα µε την προσθήκη ενός όρου θορύβου, που αντικατοπτρίζει την συνεισφορά των αρωµατικών χρωµοφόρων. Εποµένως, για τον υπολογισµό των στοιχείων δευτεροταγούς δοµής χρησιµοποιείται η εξίσωση: ( )= + ό όπου θ(λ) η ελλειπτικότητα (κυκλικός διχρωισµός) της πρωτεΐνης συναρτήσει του µήκους κύµατος λ, το ποσοστό συµµετοχής του στοιχείου δευτεροταγούς δοµής i στην πρωτεϊνική δοµή σε µήκος κύµατος λ και η ελλειπτικότητα σε µήκος κύµατος λ του χαρακτηριστικού φάσµατος κάθε στοιχείου δευτεροταγούς δοµής i. Πειραµατική διαδικασία Κατά την πειραµατική διαδικασία χρησιµοποιήσαµε 300 µl ανά πείραµα καθαρισµένης HUSho 0.32 mg/ml σε ρυθµιστικό διάλυµα 20 mm Phosphate, ph 7.0. Το ρυθµιστικό διάλυµα επιλέχθηκε ώστε να µην απορροφά έντονα στην περιοχή nm και να είναι σταθερό σε αλλαγές της θερµοκρασίας. 50

53 Εκτελέσαµε δύο πειράµατα. Στο πρώτο µετρήσαµε την ελλειπτικότητα του πρωτεϊνικού µορίου στην περιοχή του άπω υπεριώδους [ ] nm σε αυξανόµενες τιµές θερµοκρασίας 25 ο C,45 ο C, 55 ο C, 65 ο C, 75 ο C, 90 ο C και επαναφορά στους 25 ο C, ώστε να υπολογίσουµε το ποσοστό συµµετοχής κάθε στοιχείου δευτεροταγούς δοµής στην HUSho και το ποσοστό αντιστρεψιµότητας του µορίου. Στο δεύτερο πείραµα διατηρώντας σταθερό το µήκος κύµατος (222 nm όπου απορροφά εντονότερα η α-έλικα) και αυξάνοντας τη θερµοκρασία σταδιακά από τους 20 ο C έως τους 90 ο C υπολογίσαµε τη θερµοκρασία αποδιάταξης των πρωτεϊνικών µορίων T m (melting temperature). Επιπλέον το πείραµα αυτό µας επιτρέπει να διαπιστώσουµε αν η πρωτεΐνη ξεδιπλώνει σε ένα ή περισσότερα βήµατα. 3.8 Βιοπληροφορική ανάλυση Η βιοπληροφορική ανάλυση έχει ως απώτερο σκοπό την πρόβλεψη της δοµής µιας πρωτεΐνης από την αµινοξική της αλληλουχία. Θεωρητικά, αµινοξικές αλληλουχίες µε οµοιότητα άνω του 30% ακολουθούν παρόµοιο δίπλωµα στο χώρο. Η τριτοταγής δοµή µιας πρωτεΐνης υπαγορεύει τη λειτουργία της και ως εκ τούτου είναι πολύ σηµαντικό να συλλέγουµε στοιχεία για αυτήν, ειδικά σε περιπτώσεις που ο πειραµατικός προσδιορισµός και η λύση της δοµής της πρωτεΐνης δεν είναι εφικτός ή δεν έχει πραγµατοποιηθεί ακόµα. Οµοίως, η πρόγνωση της δοµής βοηθά σε µελέτες θερµοσταθερότητας οικογενειών πρωτεϊνών, όπως η οικογένεια HU. Επιπλέον µε τα σύγχρονα εργαλεία της βιοπληροφορικής είναι εφικτή η εύρεση οµολογίας πρωτεϊνών από συγγενικούς οργανισµούς, η οποία µπορεί να δώσει το έναυσµα για υποθέσεις σχετικά µε τα πρωτεϊνικά µόρια αυτά καθ αυτά, την τοπολογία, τη λειτουργία τους αλλά και τις συνθήκες που επάγουν ή αναστέλλουν τη δράση και σύνθεση τους. Στην παρούσα διπλωµατική, αρχικά εντοπίστηκε στα αρχεία της βάσης δεδοµένων UniProt, ταυτόσηµη αλληλουχία, προσδιορισµένη βάσει οµολογίας (UniProt/TrEMBL), µε κωδικό Q8EJB9. Στη συνέχεια, µε τη βοήθεια του εργαλείου Blast έναντι της βάσης καλά χαρακτηρισµένων αλληλουχιών UniProt/SwissProt, ακολούθησε εύρεση αλληλουχιών µε οµοιότητα άνω του 50% από άλλους οργανισµούς, πολλαπλή στοίχιση και κατασκευή φυλογενετικού δέντρου. 51

54 Για την ανασύσταση της πιθανής τρισδιάστατης δοµής της HUSho, έγινε και πάλι µε τη χρήση του εργαλείου του Blast, αναζήτηση σε δοµές της βάσης δεδοµένων PDB, ώστε να εντοπιστεί αλληλουχία µε οµοιότητα δοµής άνω του 30%. Μετά από στοίχιση µε το εργαλείο T-coffee του ΕΒΙ, ακολούθησε κατασκευή τρισδιάστατου µοντέλου µε την τεχνική Homology Modeling από τον διακοµιστή Swiss-Model του Expasy. Αλληλουχία της HUSho σε FASTA format που χρησιµοποιήθηκε στις αναζητήσεις: >HUShO (9686,04) pi 9.82 MNKTELIAKIAENADITKAQATRALKSFEAAITESMKNGDKISIVGFGSFETTT RAARTGRNPQTGKEIQIAEATVPKFKAGKTLRDSVN 52

55 4 Αποτελέσµατα 4.1 Κινητική επαγωγής της έκφρασης του γονιδίου husho Η επαγωγή ξεκινά από τη στιγµή που προσθέτουµε IPTG στην καλλιέργεια κυττάρων έκφρασης E. coli BL21(DE3) 1L που βρίσκονται στην εκθετική φάση ανάπτυξης (OD 600 = 0.8) και φέρουν το ανασυνδυασµένο πλασµίδιο pet-11a-husho. Η παραγωγή της πρωτεΐνης HUSho ελέγχεται, ανά µία ώρα για τις επόµενες τρεις ώρες, από δείγµα (250 µl) που λαµβάνουµε και µεταχειριζόµαστε κατάλληλα ( ). Τα αποτελέσµατα φαίνονται στην παρακάτω εικόνα: Μ ΗUSho Εικόνα 4.1 Κινητική της επαγωγής µε IPTG στους 37 ο C, σε χρόνους 1h, 2h, 3h σε SDS-PAGE (15%). Όπου M:marker (Nippon-Cat No MWPO3, Tris-Glysine 4-20%), 1: o/n καλλιέργεια, 2: επαγωγή µετά από 3 h, 3: µετά από 2 h και 4: 1 h. εδοµένου ότι το διµερές της ΗUSho έχει µοριακό βάρος περίπου 19 KDa, το µονοµερές θα εµφανίζεται στο SDS-PAGE στο σηµείο που υποδεικνύεται µε το βέλος, ως µία ζώνη στα 9.5 KDa. Επίσης παρατηρείται αύξηση της παραγωγής της ΗUSho µε την πάροδο του χρόνου όπως ήταν αναµενόµενο. 53

56 4.2 Καθαρισµός και αποµόνωση της πρωτεΐνης ΗUSho Τη λύση των κυττάρων έκφρασης ακολούθησε η κλασµάτωση µε θειικό αµµώνιο (AS), κατακρύµνιση µε TCA και η χρωµατογραφία συγγένειας σε στήλη ηπαρίνης. Κατά την διαδικασία της κλασµάτωσης µε θειικό αµµώνιο λάβαµε συνολικά έξι δείγµατα από το υπερκείµενο και το ίζηµα µε ποσοστό κορεσµού AS 0-40%, 4060%, 60-80%. Ακολούθησε κατακρύµνιση µε TCA και ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα ακρυλαµίδης που έδωσε την παρακάτω εικόνα. Μ Εικόνα 4.2 Κλασµάτωση µε θειικό αµµώνιο σε SDS-PAGE (15%), όπου Μ:marker, 1: 0-40%S, 2: 0-40%P, 3: 40-60%S, 4: 40-60%P, 5: 60-80%S, 6: 60-80%P, s: υπερκείµενο, p: ίζηµα. Η πρωτεΐνη παρουσιάζει µέγιστη συγκέντρωση στο κλάσµα του υπερκείµενου µε 40-60% κορεσµό σε AS. Ακολούθησε χρωµατογραφία συγγένειας σε στήλη ηπαρίνης, κατά την οποία 5,5 ml του δείγµατος (υπερκείµενο 40-60% AS) αραιώθηκαν 1:10 µε ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικών P20E1 και πέρασαν από τη στήλη (όπου δεσµεύτηκε η πρωτεΐνη). Κατόπιν η στήλη ξεπλύθηκε µε διάλυµα αυξανόµενης συγκέντρωσης αλάτων 0-1 Μ NaCl και συλλέχθηκαν 21 κλάσµατα 1,5 54

57 ml. Για τον εντοπισµό των κλασµάτων που περιέχουν την πρωτεΐνη πραγµατοποιήθηκε ηλεκτροφόρηση που έδωσε τα εξής αποτελέσµατα: Μ Εικόνα 4.3 Χρωµατογραφία συγγένειας σε στήλη ηπαρίνης. M: marker, 1: (FT) flow trough, οι υπόλοιποι αριθµοί παριστάνουν τα δείγµατα που συλλέχθηκαν κατά την έκλουση της στήλης σε κλίση συγκέντρωσης αλάτων 0-1Μ NaCl σε SDS-PAGE (15%) M Αν και αρκετή από την πρωτεΐνη διέρρευσε στο flow through (FT) η µεγαλύτερη ποσότητα εντοπίζεται στα κλάσµατα έκλουσης 8 (αχνή ζώνη) έως 12 (έντονη ζώνη). Λαµβάνοντας το κλάσµα 11 στο οποίο περιµένουµε την µέγιστη ποσότητα καθαρής πρωτεΐνης, εκτελούµε άλλη µία ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE και παίρνουµε την τελική εικόνα της υψηλής καθαρότητας πρωτεΐνης HUSho. Εικόνα 4.4 Υψηλής καθαρότητας πρωτεΐνη HUSho. Μ: marker, 1: Κλάσµα 13, 2: Κλάσµα 11, 3: FT 55

58 4.3. Προσδιορισµός συγκέντρωσης της πρωτεΐνης HUSho Με την µέθοδο Brij35 που περιγράφηκε στην παράγραφο προσδιορίσαµε τη συγκέντρωση της πρωτεΐνης του δείγµατος στα 1.6 mg/ml Βιοφυσικός χαρακτηρισµός και µέτρηση θερµοσταθερότητας της πρωτεΐνης HUSho µε φασµατοπολωσιµετρία κυκλικού διχρωισµού Με τη βοήθεια της φασµατοπολωσιµετρίας κυκλικού διχρωισµού παίρνουµε πληροφορίες για το είδος και το ποσοστό συµµετοχής των στοιχείων δευτεροταγούς δοµής στο πρωτεϊνικό µόριο, αλλά και για τη θερµοσταθερότητα προσδιορίζοντας τη θερµοκρασία τήξης της πρωτεΐνης. Εικόνα 4.4 Φάσµα CD της πρωτεΐνης HUSho στο άπω υπεριώδες, µε σταδιακή αύξηση της θερµοκρασίας από τους 25 ο C έως τους 90 ο C και επαναφορά στους 25 ο C. 56

59 Εικόνα 4.5 Καµπύλη θερµοσταθερότητας της πρωτεΐνης HUSho στα 222nm, µε σταδιακή αύξηση της θερµοκρασίας από τους 20 ο C έως τους 90 ο C (πάνω). Η πρώτη παράγωγος της καµπλύλης στην οποία υπολογίζονται οι τιµές των κορυφών T m (κάτω). 57

60 Στη µέθοδο CD καλό είναι να αποφεύγονται τα άλατα στο διάλυµα της πρωτεΐνης διότι αυξάνουν το θόρυβο λόγω απορρόφησης ακτινοβολίας στο υπεριώδες. Έτσι το δείγµα της HUSho 1.6 mg/ml που συλλέχθηκε, αραιώθηκε 5 φορές µε phosphate buffer 20 mm, ph7.0, µε τελική συγκέντρωση 0.32 mg/ml. Αρχικά µελετήθηκαν τα στοιχεία δευτεροταγούς δοµής (Εικόνα 4.4) και η µεταβολή του ποσοστού συµµετοχής τους στη δοµή κατά την αποδίπλωση της πρωτεΐνης, µε την αύξηση της θερµοκρασίας από 25 ο C έως 90 ο C. Επίσης, µετρήθηκε το ποσοστό αντιστρεψιµότητας στη φυσική κατάσταση µετά την αποδίπλωση, όταν η θερµοκρασία επανήλθε στους 25 ο C. Η δευτεροταγής δοµή κυριαρχείται από α-έλικα και σε µικρότερο βαθµό από β-πτυχωτή επιφάνεια και β-στροφές, ενώ προφανώς µεγάλο ποσοστό καταλαµβάνουν τα τµήµατα τυχαίας διαµόρφωσης, όπως φαίνεται στον παρακάτω πίνακα. Πίνακας 4.1 Ποσοστό συµµετοχής στοιχείων δευτεροταγούς δοµής κατά την αποδίπλωση και αναδίπλωση της πρωτεΐνης HUSho. β-πτυχωτή επιφάνεια Θερµοκρασία Τυχαίο α-έλικα Παράλληλοι β- Αντιπαράλληλοι β- β-στροφή ( ο C) σπείραµα κλώνοι κλώνοι 25 29,0 9,4 10,3 18,0 32, ,7 12,3 14,4 20,1 38, ,0 13,1 15,6 20,7 40, ,4 14,0 16,8 21,2 42, ,3 14,1 16,8 21,2 42, ,1 14,3 16,9 21,2 42,7 25 (Επαναφορά) 26,1 10,1 11,6 18,7 33,9 Καθώς το διάλυµα της πρωτεΐνης θερµαίνεται και το µόριο σταδιακά αποδιατάσσεται παρατηρούµε ότι χάνει σε δοµή α-έλικας ενώ αυξάνει η τυχαία στερεοδιαµόρφωσή του (τυχαίο σπείραµα). Μικρή αύξηση παρατηρείται στο ποσοστό συµµετοχής των β-δοµών, όπως συνήθως συµβαίνει όταν υπάρχει ελάττωση της α-ελικοειδούς στερεοδιαµόρφωσης των πρωτεϊνικών µορίων. 58

61 Μετά την επαναφορά στους 25 ο C η πρωτεΐνη ανακτά αρκετή από την αρχική της στερεοδιάταξη, δηλαδή παρουσιάζει υψηλή αναστρεψιµότητα, γεγονός που επιβεβαιώνεται και από τον υπολογιζόµενο δείκτη αντιστρεψιµότητας: Reversibility Index (CD 222nm ) = 93.3% Το δεύτερο µέρος πειραµάτων µε την τεχνολογία του κυκλικού διχρωισµού αφορά στη µέτρηση της θερµοσταθερότητας της πρωτεΐνης HUSho. Σε µήκος κύµατος 222 nm (περιοχή απορρόφησης της α-έλικας) όπου παρατηρείται και η πιο έντονη µεταβολή στο φάσµα, µελετάµε δείγµα 300 µl της HUSho ενώ παράλληλα αυξάνουµε τη θερµοκρασία από τους 20 ο C έως τους 90 ο C κατά 1 ο C ανά λεπτό. Η σιγµοειδής καµπλύλη (Εικόνα 4.5) που προκύπτει αναπαριστά την απώλεια δοµής µε την άνοδο της θερµοκρασίας, ενώ η πρώτη παράγωγος αποκαλύπτει τη µέγιστη κλίση της σιγµοειδούς καµπύλης και υπολογίζει τη θερµοκρασία τήξης της πρωτεΐνης HUSho. Η πρωτεΐνη αποδιπλώνεται σε δύο στάδια µε =42.5±0.1 ο C και = 60.4±0.1 ο C. εδοµένου ότι ο οργανισµός Shewanella oneidensis MR-1 εντοπίζεται σε περιβάλλον που φτάνει το πολύ τους 25 ο C τους θερινούς µήνες, η πρωτεΐνη HUSho παρατηρούµε ότι εµφανίζει µεγάλη σταθερότητα (κατώτερο πλατώ της καµπύλης θερµοσταθερότητας), προϋπόθεση αναγκαία για την επιβίωσή του. Αλλά ακόµα και αν µεταφερθεί σε συνθήκες υψηλότερης θερµοκρασίας η HUSho δείχνει ότι διαθέτει µεγάλη σταθερότητα και δυνατότητα επαναφοράς, εξαιρετικά χρήσιµη ιδιότητα για τις πρωτεΐνες που σχετίζονται µε το γενετικό υλικό του κυττάρου Αποτελέσµατα βιοπληροφορικής ανάλυσης Η αναζήτηση έναντι της βάσης δεδοµένων UniProt/TrEMBL έδωσε ταυτόσηµη αλληλουχία µε την HUSho µε κωδικό Q8EJB9. 59

62 Ακολούθησε αναζήτηση (Blast) στη UniProt/SwissProt και πολλαπλή στοίχιση αλληλουχιών της οικογένειας HU µε οµοιότητα άνω του 50%. 60

63 Η στοίχιση αποκαλύπτει πολλά συντηρηµένα κατάλοιπα και αρκετά µη συντηρηµένα αλλά µε παρόµοιες φυσικοχηµικές ιδιότητες. Βάσει αυτών των αποτελεσµάτων κατασκευάστηκε το φυλογενετικό δέντρο που φαίνεται παρακάτω. Με βάση αυτό το φυλογενετικό δέντρο παρατηρούµε υψηλότερη οµολογία της HUSho µε αντίστοιχες πρωτεΐνες που σχετίζονται µε το DNA από µικροοργανισµούς των γενών Aeromonas, Escherichia, Pseudomonas, Salmonella, Shigella, Serratia και Vibrio. Από τη βάση δεδοµένων πρωτεϊνικών δοµών PDB, αναζητήθηκε η πρωτεϊνική δοµή της οποίας η αλληλουχία παρουσιάζει τη µεγαλύτερη οµολογία µε την HUSho και βρέθηκε ότι αυτή είναι η αλυσίδα Α µίας HU (DNA binding protein) του οργανισµού Bacillus anthracis, µε κωδικό 3RΗΙ_Α. Οι αλληλουχίες της HUSho και της 3RHI_A, στοιχήθηκαν µε τη βοήθεια του εργαλείου Τ-coffee (βασισµένο στο CLUSTALW), όπως φαίνεται στην κάτω εικόνα, όπου φαίνεται η µεγάλη συντήρηση αµινοξικών καταλοίπων και τονίζεται η υψηλή οµοιότητα στην περιοχή από το 55ο αµινοξύ έως το 71ο (βέλος). Το τµήµα [55,71] της αλληλουχίας της 3RHI_A αφορά στην περιοχή πρόσδεσής της µε το DNA και όπως ήταν αναµενόµενο είναι εκείνο που παρουσιάζει την υψηλότερη συντήρηση σε επίπεδο δοµής, είναι πλούσιο σε πολικά αµινοξικά κατάλοιπα και έχει αρκετά θετικά 61

64 φορτισµένα (ροζ χρώµατος, R και K) που ευνοούν την πρόσδεση µε το αρνητικά φορτισµένο, λόγω των φωσφορικών οµάδων, µόριο του DNA. Στο µοντέλο που προέκυψε από το διακοµιστή Swiss model, η συντηρηµένη περιοχή εντοπίζεται στους βραχίονες του οµοδιµερούς, που εισέρχονται στη µικρή αύλακα του DNA. Εικόνα 4.6 Υποθετικό τρισδιάστατο µοντέλο της HUSho (Swiss-Model). 62