Διάκριση των ευαίσθητων στα αντιβιοτικά (wild-type υποπληθυσμών) βάσει των επιδημιολογικών ορίων (epidemiological cut-offs).

Transcript

1 ΜΠΣ ΒΙΟΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΜΗΜΑ ΜΑΘΗΜΑΤΙΚΩΝ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΜΑΘΗΜΑΤΙΚΩΝ Δ Ι Π Λ Ω Μ Α Τ Ι Κ Η Ε Ρ Γ Α Σ Ι Α ΕΥΤΥΧΙΟΥ ΠΡΩΤΟΠΑΠΑΔΑΚΗ Διάκριση των ευαίσθητων στα αντιβιοτικά (wild-type υποπληθυσμών) βάσει των επιδημιολογικών ορίων (epidemiological cut-offs). ΑΘΗΝΑ,

2 Η παρούσα διπλωματική εργασία εκπονήθηκε στο πλαίσιο των σπουδών για την απόκτηση του Μεταπτυχιακού Διπλώματος Ειδίκευσης στη ΒΙΟΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ που απονέμει η Ιατρική Σχολή και το Τμήμα Μαθηματικών του Εθνικού & Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών και το Τμήμα Μαθηματικών του Πανεπιστημίου Ιωαννίνων. Εγκρίθηκε την. από την εξεταστική επιτροπή: ΟΝΟΜΑΤΕΠΩΝΥΜΟ ΒΑΘΜΙΔΑ ΥΠΟΓΡΑΦΗ Α.ΜΠΟΥΡΝΕΤΑΣ(Επιβλέπων) ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Α.ΒΑΤΟΠΟΥΛΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ. Π.ΓΙΑΚΚΟΥΠΗ ΕΠ. ΣΥΝΕΡΓΑΤΗΣ.. 2

3 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1. Γενικό μέρος Εισαγωγή Ρόλος του εργαστηρίου Μηχανισμοί βακτηριακής αντοχής Τεστ αντιμικροβιακής ευαισθησίας Όρια ευαισθησίας Επιδημιολογικά όρια Κατανομή Wild Type πληθυσμού Έλεγχος της κατανομής του Wild Type πληθυσμού με τη NRI μέθοδο Βαθμονόμηση Περαιτέρω πλεονεκτήματα της NRI μεθόδου Τοπική επιτήρηση Προγράμματα παγκόσμιας επιτήρησης Σκοπός της εργασίας Μεθοδολογία WHONET Τεστ διάχυσης με δίσκους Α. Πρώιμη εξέλιξη Β. Περιγραφή της μεθόδου Α. NRI μέθοδος Β. Ανάλυση των παραμέτρων και προτυποποίηση της μεθόδου PROBIT 36 2.Ειδικό μέρος 2.1. Αποτελέσματα Δεδομένα EUCAST A. Staphylococcus aureus B. Escherichia coli Ελληνικό νοσοκομείο Α. Staphylococcus aureus B. Escherichia coli Σύγκριση μεταξύ ελληνικού νοσοκομείου και EUCAST Συζήτηση Αρχές μελετών επιτήρησης Συμβολή των επιδημιολογικών ορίων Οπτική επιθεώρηση ή NRI Επιδημιολογικά όρια στο ελληνικό νοσοκομείο Τελικά συμπεράσματα 58 Περίληψη 59 Abstract 60 Βιβλιογραφία 61 3

4 ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΩΝ ASM: American Society for Microbiology BSAC: British Society for Antimicrobial Chemotherapy CDC: Centers for Disease Control CLSI: Clinical and Laboratory Standard Institute CV: Coefficient of Variation ECOFF: Epidemiological Cut-Off ESCMID: European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases EUCAST: European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing FDA: Food and Drug Administration ICS: International Collaboration Study MIC: Minimum Inhibitory Concentration MH: Müller Hinton NCCLS: National Committee for Clinical Laboratory Standards NRI: Normalized Resistance Interpretation NWT: Non-Wild Type WHO: World health Organization WT: Wild Type 4

5 1. ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας είναι να ελεγχθεί η χρησιμότητα και ο τρόπος εξαγωγής των επιδημιολογικών ορίων (ECOFFs). Αυτά έχουν προταθεί από το EUCAST για να διαχωρίζουν τα wild-type βακτηριακά στελέχη, δηλαδή αυτά που δε φέρουν επίκτητους μηχανισμούς αντοχής. Η στατιστική μέθοδος που θα χρησιμοποιηθεί είναι η NRI μέθοδος για δεδομένα που προέρχονται από τη διεθνή βάση δεδομένων του EUCAST καθώς και από δεδομένα από τριτοβάθμιο αθηναϊκό νοσοκομείο. Στο γενικό μέρος θα περιγραφούν οι λόγοι που οδήγησαν στην ανάπτυξη των επιδημιολογικών ορίων καθώς και το θεωρητικό υπόβαθρο των στατιστικών μεθόδων που θα εφαρμοστούν. Στο ειδικό μέρος θα παρουσιαστούν τα αποτελέσματα και θα αναλυθούν τα συμπεράσματα που προκύπτουν από αυτά ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΡΟΛΟΣ ΤΟΥ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ Ο πρωταρχικός ρόλος του κλινικού μικροβιολογικού εργαστηρίου είναι να παρέχει πληροφορίες με τις οποίες οι κλινικοί ιατροί να μπορούν να διαγιγνώσκουν και να 5

6 θεραπεύουν τις λοιμώδεις ασθένειες. Εάν μία μεταδοτική ασθένεια είναι παρούσα, η ταυτοποίηση του συγκεκριμένου παθογόνου είναι απόλυτης σημασίας για έναν επιδημιολόγο ή για έναν λειτουργό στον τομέα της δημόσιας υγείας. Η ταυτοποίηση του μικροβίου το οποίο απομονώθηκε από ένα κλινικό δείγμα συχνά ωφελεί τον ασθενή επειδή διαγιγνώσκεται το αίτιο και έτσι επιλέγεται η κατάλληλη χημειοθεραπεία. Αλλά τα δύο πιο σημαντικά κομμάτια πληροφορίας για ένα κλινικό είναι εάν ένας λοιμώδης παράγοντας είναι παρών και ποιος αντιμικροβιακός παράγοντας πρέπει να δοθεί. Αυτές οι προτεραιότητες προέκυψαν εξαιτίας μίας από τις μεγαλύτερες ιατρικές προόδους του 20ού αιώνα- την ανακάλυψη της πενικιλίνης [1]. Το 1928, ο Alexander Fleming παρατήρησε έναν μύκητα που είχε επιμολύνει ένα τρυβλίο καλλιέργειας το οποίο κατά λάθος είχε εκτεθεί στον αέρα. Επιπλέον αποικίες σταφυλόκοκκου που αναπτύσσονταν σε επαφή με το μύκητα είχαν υποστεί λύση. Ο Fleming σωστά κατέληξε στο συμπέρασμα ότι ο μύκητας, που αργότερα ταυτοποιήθηκε ως Penicillium notatum, παρήγαγε μία βακτηριολυτική διαχεόμενη ουσία ικανή να σκοτώνει τους σταφυλόκοκκους. Το άγνωστο αντιβιοτικό του Fleming, το οποίο αργότερα ονομάστηκε πενικιλίνη, κήρυξε την έναρξη της σύγχρονης αντιβιοτικής εποχής. Περισσότερο από μία δεκαετία πέρασε πριν η ανακάλυψη του Fleming να έχει πρακτική εφαρμογή στη θεραπεία των λοιμώξεων. Το 1939 οι Florey και Chain ανέπτυξαν μία πρακτική τεχνική με την οποία η αντιμικροβιακή ουσία από το Penicillium μπορούσε να εξαχθεί σε επαρκή καθαρότητα και ποσότητα για χρήση στους ανθρώπους. Η ανάγκη για αντιμικροβιακά τεστ ευαισθησίας κατέστη σύντομα σαφής αφού τα αντιβιοτικά έγιναν εμπορικά διαθέσιμα. Πριν από τον δεύτερο Παγκόσμιο Πόλεμο, η παραγωγή της πενικιλίνης ήταν περιορισμένη και εξαιρετικά ακριβή. Έτσι χρειαζόταν ένας τρόπος για να προβλεφθεί εάν η χρήση της πενικιλίνης θα θεράπευε έναν ασθενή από μία λοίμωξη. Κατά τη διάρκεια του 2 ου Παγκοσμίου Πολέμου, επιπλέον αντιβιοτικά ανακαλύφθηκαν και οι τρόποι δράσης τους εναντίον των διάφορων μικροοργανισμών αποδείχτηκαν. Παρόλο που τα αντιβιοτικά ήταν πραγματικά θαυματουργά φάρμακα 6

7 τη στιγμή της εισαγωγής τους στην καθημερνή κλινική πράξη, δεν πέρασε πολύς καιρός πριν να αναδυθούν ανθεκτικά βακτηριακά στελέχη ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΗΣ ΑΝΤΟΧΗΣ Οι μηχανισμοί της βακτηριακής αντοχής είναι περίπλοκοι, ποικιλόμορφοι και όχι πάντα εντελώς κατανοητοί [2]. Μερικοί μηχανισμοί κωδικοποιούνται από χρωμοσωμιακό DNA, το οποίο προέρχεται από γενετική μετάλλαξη και μπορεί να μεταφερθεί σε άλλα βακτήρια με (1) μεταμόρφωση (transformation), δηλαδή απόκτηση νέου γενετικού υλικού διά της ενσωμάτωσης εξωγενούς ή ξένου DNA, (2) μεταγωγή (transduction), η οποία είναι μεταφορά γενετικού υλικού από ένα βακτήριο σε ένα άλλο μέσω βακτηριοφάγου. Άλλοι μηχανισμοί αντοχής είναι αποτέλεσμα εξωχρωμοσωμιακών τμημάτων DNA, τα οποία ονομάζονται πλασμίδια. Τα πλασμίδια είναι μικρά γενετικά στοιχεία που αντιγράφονται ανεξάρτητα από το βακτηριακό χρωμόσωμα και είναι συνήθως κυκλικά μόρια διπλής έλικας DNA και αυτά μπορούν να περάσουν από το ένα βακτήριο στο άλλο και ίσως από το ένα είδος στο άλλο συνήθως με σύζευξη (conjugation), η οποία είναι ζευγάρωμα ή περίπου σεξουαλική ανταλλαγή μεταξύ δύο βακτηρίων (του δότη και του λήπτη), αλλά και με τους δύο άλλους τρόπους μεταφοράς γενετικού υλικού που αναφέρθηκαν παραπάνω. Ακόμα χειρότερα, ένα κομμάτι του γενετικού υλικού είναι στα τρανσποζόνια (transposon) (αλτικά γονίδια) τα οποία είναι κινητά γενετικά στοιχεία που μπορούν να μεταφέρουν DNA μέσα σε ένα κύτταρο από μία θέση του γονιδιώματος σε άλλη ή μεταξύ διαφορετικών μορίων DNA (π.χ. από πλασμίδιο σε πλασμίδιο, ή από πλασμίδιο σε χρωμόσωμα). Οι μηχανισμοί της αντοχής μπορεί να οφείλονται σε ανεπαρκή είσοδο του αντιβιοτικού στο βακτηριακό κύτταρο, ενζυματική αδρανοποίηση του αντιβιοτικού, μετάλλαξη των πενικιλλινοδεσμευτικών πρωτεϊνών (PBPs), μετάλλαξη των ριβοσωματίων, σύνθεση εναλλακτικών βιοχημικών δρόμων κ.ά ΤΕΣΤ ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗΣ ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑΣ Τα τεστ ευαισθησίας έγιναν μία πρακτική αναγκαιότητα. Μέθοδοι για την ανίχνευση της αντιμικροβιακής αντοχής εφαρμόστηκαν άμεσα στα μικροβιολογικά εργαστήρια [3-6]. Οι μέθοδοι των τεστ ευαισθησίας διέφεραν στην αρχή. Μία κύρια μέθοδος σήμερα, η οποία αποτελεί και μέθοδο αναφοράς για το τεστ διάχυσης με δίσκους, είναι ο καθορισμός της ελάχιστης ανασταλτικής συγκέντρωσης (MIC), είτε 7

8 χρησιμοποιώντας τη μέθοδο διάχυσης σε ζωμό ή σε άγαρ [7-9]. Παρόλα αυτά, στη ρουτίνα του μικροβιολογικού εργαστηρίου, το τεστ διάχυσης με δίσκους κέρδισε εξαρχής αποδοχή ως η βασική μέθοδος, λόγω της απλότητας του και του μικρού του κόστους. Στις επόμενες δεκαετίες πολλές συμπληρωματικές καινοτομίες βελτίωσαν την ακρίβεια των τεστ διάχυσης με δίσκους. Δύο κυρίως πρότυπα έγιναν τα κύρια στα επόμενα χρόνια: το ένα ονομάζεται μέθοδος ICS(International Collaborative Study) και το άλλο μέθοδος διάχυσης Kirby-Bauer [10,11]. Το τεστ διάχυσης με δίσκους ποίκιλλε στα πρώτα χρόνια με τη μέθοδο με τους πολλαπλούς δίσκους να κυριαρχεί στις ΗΠΑ [12] και με πολλά διαφορετικά πρότυπα στην Ευρώπη, ενώ στην Αγγλία επικρατούσε η αποκαλούμενη συγκριτική ή Stokes μέθοδος [13]. Στις ΗΠΑ η μέθοδος των πολλαπλών δίσκων απαγορεύτηκε το 1972 από τον FDA και το πρότυπο του τότε NCCLS υιοθετήθηκε το οποίο ήταν η μέθοδος που προτάθηκε από τους Kirby- Bauer [11,14,15]. Το πρότυπο ICS ήταν κοινό στην Ευρώπη παράλληλα με αυτό του τότε NCCLS (τώρα CLSI ή Clinical and Laboratory Standards Institute) [9,16]. Η μέθοδος Stokes αποσύρθηκε όταν η British Society for Antimicrobial Chemotherapy (BSAC) σύστησε μία κανονική μέθοδος διάχυσης με ένα δίσκο [17,18]. Τώρα λαμβάνει χώρα μία εναρμόνιση των αντιμικροβιακών τεστ ευαισθησίας στην Ευρώπη [19]. Ο εναρμονισμός της μεθοδολογίας και οι ερμηνείες από το EUCAST αλλάζουν το τοπίο στην Ευρώπη με ένα πρότυπο που στην ουσία του είναι όμοιο με αυτό του CLSI αλλά βαθμονομημένο στα MIC όρια του EUCAST ( [20]. Οι πρότυπες μέθοδοι για τεστ διάχυσης με δίσκους, ICS και Kirby-Bauer αλλά ουσιαστικά όλες οι μέθοδοι, βασίζονται στα όρια (breakpoints) της ελάχιστης ανασταλτικής συγκέντρωσης (minimal inhibitory concentration MIC) για την ερμηνεία της ευαισθησίας και μεταφράζουν αυτά τα όρια σε όρια διαμέτρου ζωνών χρησιμοποιώντας τη συσχέτιση μεταξύ των τιμών MIC και των αντίστοιχων ζωνών αναστολής ΟΡΙΑ ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑΣ Η επιτυχία ή αποτυχία της αντιμικροβιακής θεραπείας στις βακτηριακές και μυκητιασικές λοιμώξεις προβλέπεται ιδανικά από τα αντιμικροβιακά τεστ 8

9 ευαισθησίας στα οποία οι μικροοργανισμοί διαχωρίζονται σε θεραπεύσιμους και μη βάσει των ορίων MIC. Στην Ευρώπη παραδοσιακά η κατηγοριοποίηση ήταν κλινική και ήταν ανεξάρτητη από το εάν ή όχι ο μικροοργανισμός είχε μηχανισμούς αντίστασης. Τα MIC όρια διαχωρίζουν τα βακτήρια σε τρεις κατηγορίες: ευαίσθητα (Sensitive όπου η αντιμικροβιακή δραστηριότητα συσχετίζεται με θεραπευτική επιτυχία), ενδιάμεσα (Intermediate όπου η αντιμικροβιακή δραστηριότητα συσχετίζεται με αβέβαιο θεραπευτικό αποτέλεσμα) και ανθεκτικά (Resistant- όπου η αντιμικροβιακή δραστηριότητα συσχετίζεται με αυξημένη πιθανότητα θεραπευτικής αποτυχίας). Τα όρια MIC χρησιμοποιούνται άμεσα, με τον καθορισμό των MIC, ή έμμεσα μετατρεπόμενα σε ζώνες αναστολής με τις τεχνικές διάχυσης αντιβιοτικού με δίσκους. Τα όρια ορίζονται από τοπικές επιτροπές ή ρυθμιστικές αρχές. Συχνά όμως οι μέθοδοι και τα όρια δε συμπίπτουν Ερμηνευτικά όρια ζωνών για τα αντιβιοτικά που τα κατηγοριοποιούν σε ευαίσθητα, ενδιάμεσα και ανθεκτικά, τίθενται από επιτροπές όπως το Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) [21], την British Society for Antimicrobial Chemotherapy (BSAC) [22], τη la Société Francaise de Microbiologie (CA-SFM) [23], την Deutsche Industrie Norm-Medizinische Mikrobiologie(DIN) [24], την Commissie Richtlijnen Gevoeligheidsbepalingen (WRG ή αργότερα CRG) [25] και την Swedish Reference Group for Antibiotics (SRGA). [26] Οι διαφορές μεταξύ των προτεινόμενων ορίων καθώς και οι διαφορές στην προτυποποίηση της μεθοδολογίας έχουν κάνει την απευθείας σύγκριση των επιπέδων αντιβιοτικής ευαισθησίας σχεδόν αδύνατη [27,28]. Στην Ευρώπη, η αρχή που έχει συσταθεί από το ESCMID, το EUCAST, προσπαθεί να συντονίσει τις εθνικές επιτροπές αναφοράς [29]. Η εξέλιξη μέχρι να φτάσουμε στο σημερινό σημείο είναι μία μακρόχρονη πορεία. Τα όρια και ο τρόπος καθορισμού τους έχουν και αυτά μία μακρά ιστορία στην οποία συνέβησαν πολλές βελτιώσεις και αλλαγές. Μια βελτίωση εισήχθη το 1974 για την ελαχιστοποίηση των ερμηνευτικών λαθών συγκρίνοντας τις πραγματικές MIC με τις διαμέτρους ζωνών και τις ερμηνείες τους [30]. Η ανάλυση των ιστογραμμάτων των διαμέτρων των ζωνών αναστολής εισήχθη από τον O Brien [31,32]. Ανεξάρτητα, μια παρόμοια ανάλυση διενεργήθηκε στο Lund και ήταν η βάση για την εισαγωγή 9

10 ειδικών για το είδος ορίων [33]. Και αργότερα σε όλα τα σουηδικά εργαστήρια από τον SRGA [34]. Παράλληλα αυτές οι βελτιώσεις υιοθετήθηκαν και στη Γερμανία [35]. Ο ορισμός των ορίων γινόταν μετά από οπτική επιθεώρηση των ιστογραμμάτων και ήταν εύκολος όταν η κατανομή ήταν με μία ή δύο κορυφές. Ο πρώτος που συνηγόρησε για αυτόν τον τρόπο ορισμού των ορίων ήταν ο Williams ο οποίος πρότεινε την χρήση των «μικροβιολογικών ορίων» ορίζοντας τα απομονωμένα στελέχη εκτός των ορίων ως ανθεκτικά [36]. Αυτή ήταν μία πρώτη κοινή βάση ερμηνείας η οποία χώριζε όλα τα στελέχη με κάποιο μηχανισμό αντοχής από τα «φυσιολογικά» χωρίς κάποια μετάλλαξη στελέχη. Μία παρόμοια προσέγγιση σε μία προέκταση της θεωρίας για συγκεκριμένου του βακτηριακού είδους όρια προτάθηκε από τον SRGA, προτείνοντας να τεθούν όρια κοντά στους ευαίσθητους πληθυσμούς με σκοπό να ανιχνεύονται στελέχη με ελαττωμένη ευαισθησία έτσι ώστε να είναι δυνατή η έγκαιρη ανίχνευση της εμφάνισης αντιβιοτικής αντοχής [34]. O ευαίσθητος πληθυσμός o οποίος αναφέρεται παραπάνω είναι αυτός που αργότερα αποκαλέστηκε Wild Type πληθυσμός και οι όροι WT και non-wt προτάθηκαν από τον EUCAST [37,38] ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΚΑ ΟΡΙΑ Τα τελευταία χρόνια, ένας εναλλακτικός όρος σε αυτόν των καλούμενων κλινικών ορίων, τα επιδημιολογικά όρια (Epidemiological Cut-offs ή ECOFFs) προτάθηκε για να διαχωρίζει τον φυσιολογικό ευαίσθητο πληθυσμό (Wild Type πληθυσμό) από στελέχη ενός συγκεκριμένου βακτηριακού είδους τα οποία δείχνουν κάποιο επίπεδο αντοχής [39]. Αυτός ο όρος είναι παρόμοιος από άποψη έννοιας με το μικροβιολογικό όριο και έρχεται να λύσει ένα σημαντικό πρόβλημα αυτό της συγκρισιμότητας των αποτελεσμάτων μεταξύ των διάφορων εργαστηρίων. Όπως έχει υποδειχθεί από άλλους η σωστή προσέγγιση για να λυθεί το πρόβλημα της συγκρισιμότητας είναι να επιτευχθεί συμφωνία στα αποτελέσματα των τεστ, και όχι να προσπαθείται να συμμορφωθεί όλος ο κόσμος με ένα συγκεκριμένο πρότυπο [27]. Την τελευταία δεκαετία έχει αποδειχθεί ότι τα όρια χρειάζονται μία καινούρια λειτουργία: να αναγνωρίζουν το βιολογικό φαινόμενο της φαινοτυπικής αντοχής και 10

11 να επιτηρούν την ανάπτυξη μικροβιακής αντοχής. Η ανάγκη για αυτή την καινούρια εφαρμογή έδειξε καταρχάς ότι τα όρια τα σχεδιασμένα για θεραπεία (clinical breakpoints) δε διακρίνουν απαραίτητα μεταξύ βακτηρίων με και χωρίς μηχανισμούς αντοχής. Δεύτερον αποδείχτηκε ότι η έλλειψη εναρμονισμένων ορίων μεταξύ μεθόδων σε διαφορετικές χώρες, ή ακόμα και εντός της ίδιας χώρας, συχνά δυσχεραίνει την εξαγωγή χρήσιμων συμπερασμάτων σχετικά με την ανάπτυξη αντίστασης στα διεθνή συστήματα επιτήρησης. Παρόλο που ο τρόπος καθορισμού των MIC είναι παρόμοιος, υπάρχουν διαφορές στα συνιστώμενα υλικά. Για τα τεστ διάχυσης με δίσκους οι διαφορές είναι μεγαλύτερες. Αφορούν την πυκνότητα του εναιωρήματος, των μέσων, των περιεχόμενων των δίσκων, των συνθηκών επώασης και άλλων τεχνικών λεπτομερειών. Η έλλειψη εναρμόνισης δημιουργεί προβλήματα στη σύγκριση των αποτελεσμάτων για επιδημιολογική επιτήρηση και για την επικοινωνία μεταξύ των ιατρών, της φαρμακοβιομηχανίας και των επιτροπών. Σε μια προσπάθεια να ξεπεραστούν αυτά τα προβλήματα ο EUCAST ορίζει διαφορετικά όρια από τη μία για την καθοδήγηση της θεραπείας(κλινικά όρια) και από την άλλη για την αναγνώριση βακτηρίων με μηχανισμούς αντίστασης και για επιτήρηση της ανάπτυξης αντοχής (επιδημιολογικά όρια). Για να το επιτύχει αυτό έχει ορίσει wild-type(wt) κατανομές βακτηρίων και μυκήτων, για συνδυασμούς αντιβιοτικού-μικροβίου, που είναι πληθυσμοί με φαινοτυπικά μη αναγνωρίσιμο μηχανισμό αντοχής. Τα δεδομένα συλλέγονται από όσες περισσότερες πηγές είναι δυνατόν (breakpoint επιτροπές, συστήματα επιτήρησης μικροβιακής αντοχής, φαρμακοβιομηχανίες, επιστημονικές αναφορές κ.ά.). Τα δεδομένα εισάγονται σε μία βάση δεδομένων, ελέγχονται αν είναι κατάλληλα για αποδοχή και στη συνέχεια είναι διαθέσιμα ελεύθερα στο διαδίκτυο. Για κάθε συνδυασμό αντιβιοτικούμικροοργανισμού τα δεδομένα συναθροίζονται δημιουργώντας μαζί μία διεθνή αναφορά για την κατανομή των WT πληθυσμών. Έχοντας καθορίσει την κατανομή του wild-type πληθυσμού και της υψηλότερης MIC ή χαμηλότερης διαμέτρου ευαισθησίας αναγνωρίζονται μικροοργανισμοί με επίκτητους μηχανισμούς αντοχής. Αυτή η τιμή MIC ή διαμέτρου ορίζεται ως επιδημιολογικό όριο (Epidemiological cut-off/ecoff). Το ECOFF εκφράζεται ως WT X mg/l ή WT X mm. 11

12 Αυτά τα όρια είναι ιδιαίτερα χρήσιμα ειδικά: i) όταν τα κλινικά breakpoints χωρίζουν τις wild-type κατανομές ii) όταν κλινικά breakpoints ελλείπουν, στην οποία περίπτωση επιτρέπουν την αναγνώριση αντοχής iii) όταν η διαφορά μεταξύ των ECOFFs και των κλινικών breakpoints είναι μεγάλη iv) για καινούρια και παλιά φάρμακα για τα οποία πρέπει να περιγραφεί ο μηχανισμός αντοχής. Οι όροι επιδημιολογικό όριο (ECOFF) και κλινικά όρια ορίστηκαν επίσης από τον EUCAST, με το ECOFF να είναι ταυτόσημο με το μικροβιολογικό όριο. Τα κλινικά όρια διαχωρίζουν τον μικροβιακό πληθυσμό σε ευαίσθητο, ενδιάμεσο και ανθεκτικό ενώ τα επιδημιολογικά όρια σε WT και NWT πληθυσμό. Στο Internet παρουσιάζονται από τον EUCAST οι κατανομές των WT MIC και ζωνών αναστολής πολλών συνδυασμών αντιμικροβιακών και μικροοργανισμών. Αυτές χρησιμοποιούνται ως κατανομές αναφοράς από ερευνητές, κλινικούς και από αυτούς που είναι υπεύθυνοι για βαθμονομήσεις. Πέραν τούτου αυτές οι κατανομές χρησιμοποιούνται από επιτροπές breakpoints ως ένα επιπλέον εργαλείο στη διαδικασία καθορισμού ορίων. Επιπλέον είναι χρήσιμες για να καθορίσουν εάν ή όχι ένα απομονωθέν στέλεχος στερείται μηχανισμού αντοχής φαινοτυπικά αναγνωρίσιμου, άσχετα με το πώς κατηγοριοποιείται από ένα κλινικό όριο από τον EUCAST ή CLSI ΚΑΤΑΝΟΜΗ WILD TYPE ΠΛΗΘΥΣΜΟΥ Όταν ένα μοναδικό στέλεχος (ένα στέλεχος αναφοράς ή μία κλινική απομόνωση) ελέγχεται επανειλημμένα με τεστ διάχυσης με δίσκους, οι συνολικές τιμές των ζωνών αναστολής δημιουργούν μια κατανομή η οποία συχνά καλύπτει 6-8mm. Όταν αναλύεται ένας μεγάλος αριθμός στελεχών τα οποία στερούνται μηχανισμών αντοχής η κατανομή που δημιουργείται είναι οριακά ευρύτερη, δηλαδή 10-12mm. Αυτό αντιστοιχεί καλά σε μία κατανομή ευαίσθητων στελεχών, τον WT πληθυσμό. Αυτές οι κατανομές αναλύθηκαν με σκοπό να ελεγχθεί η συμφωνία τους με την κανονική κατανομή και βρέθηκε να ταιριάζουν καλά εκτός από μία κύρτωση προς τις τιμές των μεγαλύτερων ζωνών και ότι ήταν ελαφρώς πιο οξύαιχμες [40]. Στην πραγματικότητα ένας WT πληθυσμός μπορεί σε μικροεπίπεδο να αποτελείται από στελέχη με ελαφρά 12

13 διαφορετικούς μέσους. Πιθανότατα αυτό δείχνει μια ποικιλομορφία στα βιοχημικά χαρακτηριστικά ή σε κάποιους άλλους απροσδιόριστους παράγοντες [41]. Παρά τη μικροετερογένεια ο WT πληθυσμός ακολουθεί την κανονική κατανομή με τις μικρές αποκλίσεις που αναφέρθηκαν. Είναι ενδιαφέρον ότι αυτή η μικροετερογένεια δεν μπορεί να παρατηρηθεί με τα MIC Test που χρησιμοποιούν την κατά δύο αραίωση. Μόνο η μεγαλύτερη ακρίβεια των τεστ με δίσκους κάνει αυτήν την ετερογένεια αντιληπτή [16, 42] ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΗΣ ΚΑΤΑΝΟΜΗΣ ΤΟΥ WT ΠΛΗΘΥΣΜΟΥ ΜΕ ΤΗ NRI ΜΕΘΟΔΟ Ο ορισμός του WT πληθυσμού με οπτική επιθεώρηση παρόλο που είναι υποκειμενικός είναι εύκολος και αρκετά ακριβής. Παρόλα αυτά σε ορισμένες περιπτώσεις μια ασαφής μετάβαση των WT στελεχών σε ανθεκτικά κάνει την απόφαση καθορισμού ενός ECOFF δύσκολη. Επομένως υπάρχει ανάγκη για μία αντικειμενική μέθοδο για να περιγραφεί και να οριστεί ο WT πληθυσμός σε ένα ιστόγραμμα. Η μέθοδος της Normalised Resistance Interpretation (NRI) μπορεί να καλύψει αυτόν τον ρόλο [43-45]. Η μέθοδος χρησιμοποιεί το γεγονός ότι οι κατανομές των log MIC και των ζωνών αναστολής των WT στελεχών ακολουθούν μία κατανομή κατά Gauss και ότι το χαμηλότερο μισό των MIC και το υψηλότερο μισό των ζωνών, δηλαδή η ευαίσθητη πλευρά των κορυφών, οφείλει να μην επηρεάζεται από την παρουσία αντοχής και μπορεί για αυτόν τον λόγο να χρησιμοποιηθεί για την ανακατασκευή της κατανομής όλου του WT πληθυσμού. Αυτό είναι εφικτό εντοπίζοντας την κορυφή χρησιμοποιώντας moving averages και υπολογίζοντας μετά το κλάσμα των στελεχών από την πλευρά των υψηλά ευαίσθητων. Μετά από μετατροπή αυτών των τιμών σε τιμές probit η ευθεία γραμμή που προκύπτει μπορεί να προσδιορισθεί με τη μέθοδο της μέγιστης πιθανοφάνειας, ορίζοντας έναν κανονικό πληθυσμό ο οποίος αντιστοιχεί στο WT πληθυσμό [43, 44]. Αυτή η μέθοδος πρέπει να εστιαστεί επιπλέον στη χρήση της για επιτήρηση. Η πρωταρχική μέτρηση στο τεστ με δίσκους είναι η διάμετρος της ζώνης αναστολής. Μια ενοποιημένη βάση για ερμηνείες, το επιδημιολογικό όριο, μπορεί να υπολογισθεί με αυτή τη μέθοδο, να υπολογισθεί ο κανονικός WT πληθυσμός και να διαχωρισθεί 13

14 από στελέχη με οποιοδήποτε είδος μηχανισμού αντοχής. Σε αυτόματους υπολογισμούς μερικές παράμετροι πρέπει να οριστούν και σε μία δεδομένη συγκριτική μελέτη πρέπει αυτές οι παράμετροι να διατηρηθούν ίδιες καθ όλη τη διάρκεια έτσι ώστε τα αποτελέσματα να είναι συγκρίσιμα [45]. Αντιμετωπίζονται πολλά προβλήματα όταν γίνεται προσπάθεια να συγκριθούν τα αποτελέσματα της αντιβιοτικής ευαισθησίας κατά την επιτήρηση της μικροβιακής αντοχής. Δεδομένου ότι το τεστ ευαισθησίας με δίσκους συνεχίζει να είναι το πιο ευέλικτο, κατά βάση ακριβές και πιο εύκολα αναπαραγώγιμο τεστ που μπορούμε να χρησιμοποιήσουμε στο μικροβιολογικό εργαστήριο [46] πρέπει να μπορούμε να εκμεταλλευτούμε την πληθώρα των αποτελεσμάτων, που παράγονται παγκοσμίως, με τη χρήση της NRI μεθόδου. Αυτό σημαίνει να επιτευχθεί συμφωνία των αποτελεσμάτων των τεστ και όχι να προσπαθείται να εισαχθεί ένα ενιαίο πρότυπο για όλον τον κόσμο [27] ΒΑΘΜΟΝΟΜΗΣΗ Η λέξη βαθμονόμηση σπάνια ακούγεται μεταξύ των μικροβιολόγων όσον αφορά τα τεστ ευαισθησίας. Σε αντίθεση στην κλινική χημεία η βαθμονόμηση είναι μια βασική διαδικασία για όλα τα τεστ που εκτελούνται. Προς το παρόν η έμφαση στα τεστ με δίσκους έχει δοθεί στην προτυποποίηση αλλά τα πρότυπα διαφέρουν. Επιπλέον υπάρχει μια συνιστώσα εργαστηριακής παρέκκλισης η οποία είναι δύσκολο να προτυποποιηθεί και για αυτό υπάρχουν χαλαρά quality control όρια. Η βαθμονόμηση θα έλυνε αυτό το πρόβλημα αλλά προς το παρόν δεν υπάρχει γενικώς αποδεκτή μέθοδος. Σε πρώιμες έρευνες μελετήθηκαν τρόποι για να βαθμονομούνται τα τεστ διάχυσης με δίσκους έτσι ώστε να βελτιώνεται η ακρίβεια και να γίνονται τα τεστ συγκρίσιμα. Η πρώτη μέθοδος [47], η οποία ονομάζεται «peak corrected breakpoints» ή «control strain peak correction», συγκρίνει τις τιμές ζωνών του στελέχους αναφοράς από την επιτροπή αναφοράς και εκδίδει ερμηνευτικά breakpoints με τις τιμές ζωνών που παράγονται στο μεμονωμένο εργαστήριο. Στη συνέχεια μπορεί να γίνει μία διόρθωση των breakpoints. 14

15 Μία άλλη μέθοδος, η οποία καλείται single strain regression analysis(sra), (ανάλυση παλινδρόμησης μεμονωμένου στελέχους), και η οποία είναι μία πραγματική μέθοδος βαθμονόμησης, ελάττωσε τα ψευδώς ανθεκτικά αποτελέσματα από 4,4% σε 2,3% [48,49]. Μία φινλανδική ομάδα εργασίας περιέγραψε έναν γρήγορο τρόπο υπολογισμού μιας γραμμής παλινδρόμησης χρησιμοποιώντας δύο στελέχη για την βαθμονόμηση των τεστ ευαισθησίας σε μεμονωμένα εργαστήρια, μια διαδικασία η οποία μείωσε τα minor errors από 8,5% στο 2,6% [50]. Προς το παρόν αυτές οι μέθοδοι βαθμονόμησης μπορούν να αποδειχθούν χρήσιμες κάτω από ιδιαίτερες καταστάσεις αλλά η προϋπόθεση για στελέχη αναφοράς και στην περίπτωση της SRA ειδικούς δίσκους, τις κάνει μη εφαρμόσιμες για επιτήρηση σε μία μεγαλύτερη κλίμακα. Μια βασική προσέγγιση στην ανάλυση των δεδομένων από τεστ ευαισθησίας είναι να χρησιμοποιούνται οι πρωτογενείς μετρήσεις των τεστ διάχυσης με δίσκους, δηλαδή οι διάμετροι των ζωνών αναστολής. Αυστηρή προσκόλληση στο πρότυπο όπως καθορίζεται από τις αρχές αναφοράς είναι το κλειδί για ακριβή ερμηνεία για αναπαραγώγιμα αποτελέσματα των τεστ ευαισθησίας. Από την στιγμή που δεν υπάρχει μέθοδος βαθμονόμησης η οποία να συνιστάται για το μεμονωμένο εργαστήριο όπως την κλινική χημεία, ακόμα και τα αποτελέσματα του στελέχους που χρησιμοποιείται για control δεν πρέπει να πέφτουν μόνο στο εύρος το οποίο δίνεται από την αρχή αναφοράς, αλλά πρέπει επίσης να κατανέμονται τυχαία σε αυτό το εύρος. Μία ανάλυση της ικανότητας των κατανομών των controls να ανιχνεύουν λάθη στα εργαστήρια τα οποία χρησιμοποιούν τα πρότυπα του Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) δεν ήταν πολύ θετική [51]. Το 2001 εφευρέθηκε μία νέα μέθοδος για την ερμηνεία της μικροβιακής αντοχής, η μέθοδος NRI η οποία περιγράφηκε ακροθιγώς παραπάνω, αλλά μπορεί να χρησιμοποιηθεί και για τον σκοπό της βαθμονόμησης. Η μέθοδος χρησιμοποιεί το γεγονός ότι ο κανονικός ευαίσθητος πληθυσμός των απομονωθέντων μικροβίων κάθε είδους σχηματίζει ένα ιστόγραμμα ζωνών αναστολής στις υψηλές ζώνες το οποίο δεν επηρεάζεται από μία αύξηση του αριθμού των ανθεκτικών στελεχών στο ίδιο ιστόγραμμα. Επιτρέπει την οριοθέτηση ενός κατώτερου ορίου για τον ευαίσθητο πληθυσμό. Η NRI απαιτεί ένα πρότυπο τεστ με δίσκους αλλά είναι ανεξάρτητη από τα MIC όρια τα οποία χρησιμοποιούνται για να τίθενται τα όρια ζωνών, και από 15

16 άλλες μεθοδολογικές διαφορές και για αυτό είναι κατάλληλη για επιτήρηση αντιμικροβιακής αντοχής ΠΕΡΑΙΤΕΡΩ ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ ΤΗΣ NRI ΜΕΘΟΔΟΥ Μία άλλη χρήση της NRI μεθόδου παρουσιάστηκε σε μία μελέτη του 2010 [52]. Παρόλο που τα αποτελέσματα της συγκρισιμότητας, της selection bias κλπ. δεν επηρεάζουν σοβαρά την επιλογή αντιβιοτικού για εμπειρική θεραπεία στο τοπικό νοσοκομείο σε μία συγκεκριμένη στιγμή, μία επιτήρηση σε βάθος χρόνου στο ίδιο εργαστήριο θα είναι κατά πάσα πιθανότητα άκυρη εξαιτίας των αλλαγών στα όρια, στα υλικά των καλλιεργειών, στα περιεχόμενα των δίσκων κλπ. κάνοντας τις ερμηνείες μη συγκρίσιμες. Η μέθοδος NRI χρησιμεύει στη συγκεκριμένη περίπτωση ως εργαλείο για να κάνει τα αποτελέσματα των τεστ ευαισθησίας συγκρίσιμα. Αυτή η μέθοδος εφαρμόστηκε πράγματι σε αποτελέσματα από τεστ ευαισθησίας για μία περίοδο 30 χρόνων στο Karolinska, ένα παγκοσμίου φήμης νοσοκομείο στη Στοκχόλμη. Για να γίνουν τα αποτελέσματα συγκρίσιμα στην πάροδο των 30 χρόνων, τα ιστογράμματα των διαμέτρων ζωνών από τον Staphylococcus aureus και το Escherichia coli σε σχέση με τα διάφορα αντιβιοτικά εξετάστηκαν ανά χρόνο με τη NRI για να ανιχνευθεί ο WT πληθυσμός. Η χρήση των ορίων για τον WT πληθυσμό ή τα επιδημιολογικά όρια είναι ένα κατάλληλο σημείο κατάληξης στην επιτήρηση [37,38]. Η NRI μέθοδος βαθμονομεί τα όρια κατευθείαν από τις αρχικές μετρήσεις, τις ζώνες αναστολής των ιστογραμμάτων. Αυτό σημαίνει ότι τα αποτελέσματα είναι ανεξάρτητα του υλικού καλλιέργειας που χρησιμοποιείται, του περιεχόμενου του δίσκου και τις άλλες παραλλαγές της μεθόδου που χρησιμοποιείται κάνοντας τα αποτελέσματα πραγματικά συγκρίσιμα. Ένα παράδειγμα της δυνατότητας βαθμονόμησης που προσφέρει η NRI επιδεικνύεται με το παρακάτω παράδειγμα. Σε τεστ ευαισθησίας E.coli του 1983 σε σχέση με τη δοξυκυκλίνη τα ερμηνευτικά όρια που χρησιμοποιούνταν ήταν S 26mm, R<21mm και όμως αυτά τα όρια διαιρούσαν τον WT πληθυσμό σε τρία μέρη το καθένα με διαφορετική ερμηνεία. Ένα μέρος του WT πληθυσμού κατατασσόταν ως ανθεκτικός, ένα μέρος ως ευαίσθητος και ένα τρίτο ως ενδιάμεσης ευαισθησίας, ενώ εξ ορισμού 16

17 το σύνολο του WT πληθυσμού έχει την ίδια συμπεριφορά, είναι ευαίσθητό ή ανθεκτικό. Είναι ξεκάθαρο ότι τα γενικά όρια που ίσχυαν τότε έδιναν εσφαλμένα αποτελέσματα και επίσης έκαναν τις συγκρίσεις βασιζόμενες σε αυτές τις ερμηνείες αδύνατες, ενώ τα όρια που προκύπτουν από τη μέθοδο NRI κάνουν τα αποτελέσματα πραγματικά συγκρίσιμα. Αυτό το παράδειγμα δείχνει την παράλογη κατάσταση όταν εκείνη την περίοδο δεν χρησιμοποιούνταν ερμηνευτικά όρια για το κάθε είδος χωριστά. Και ενώ η μέθοδος NRI εφευρέθηκε αρχικά για να παρέχει ένα τρόπο για εσωτερική βαθμονόμηση του τεστ ευαισθησίας με δίσκους για συγκριτικούς λόγους κάνοντας την επιτήρηση της μικροβιακής αντοχής δυνατή σε μεγαλύτερη κλίμακα, όταν χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογήσει τα ιστογράμματα των στελεχών ελέγχου μία άλλη πλευρά της μεθόδου έγινε εμφανής [45]. Η σύγκριση των πραγματικών και των υπολογιζόμενων μέσων και της υπολογιζόμενης CV παρείχε πολύτιμα συμπεράσματα για την επίδοση των τεστ με δίσκους τα οποία δεν ανιχνεύονται με τα τυπικά τεστ με τα στελέχη ελέγχου τα οποία πρέπει να εμπίπτουν σε ένα συγκεκριμένο εύρος ζωνών [51]. Μπορεί λοιπόν η NRI μέθοδος να χρησιμοποιείται ως εργαλείο για ποιοτικό έλεγχο. Μπορεί εύκολα να ενσωματωθεί σε αυτόματες συσκευές μέτρησης διαμέτρου με αποτέλεσμα να κάνει τις καταγραφές των διαμέτρων των ζωνών πιο αντικειμενικές και ακριβείς [53]. Εναλλακτικά θα μπορούσε να εφαρμοσθεί σε αποτελέσματα τα οποία καταγράφονται με το πρόγραμμα WHONET, ένα λογισμικό ελεύθερο για χρήση μέσω του ΠΟΥ στην αρχική του ιστοσελίδα [54, 55]. Η παγκόσμια επιτήρηση για την αντιβιοτική αντοχή βρίσκεται στα πρώτα της βήματα. Πολλά προγράμματα επιτήρησης καλύπτουν ειδικούς τομείς ενδιαφερόντων. Λίγα από αυτά βασίζονται σε αποτελέσματα τα οποία προκύπτουν από το μεμονωμένο εργαστήριο λόγω της έλλειψης συγκρισιμότητας. Έτσι η πλειοψηφία των αποτελεσμάτων αντιμικροβιακής ευαισθησίας δεν συμπεριλαμβάνεται στην επιτήρηση αντοχής από τα συγκεκριμένα προγράμματα. Η NRI μέθοδος μπορεί να παρέχει ένα τρόπο για να κάνει τα τεστ αντιβιοτικής ευαισθησίας συγκρίσιμα. Θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως άριστο όργανο αντιβιοτικής αντοχής τόσο προοπτικών όσο και αναδρομικών μελετών σε τεστ με καταγεγραμμένες τις 17

18 διαμέτρους ζωνών από αντιβιοτικά τεστ ευαισθησίας από εργαστήρια σε όλο τον κόσμο ΤΟΠΙΚΗ ΕΠΙΤΗΡΗΣΗ Με τα πρώτα σημάδια της ανάπτυξης αντοχής, έγινε ένα σημαντικό καθήκον του τοπικού μικροβιολογικού εργαστηρίου να παρέχει πληροφορίες στους κλινικούς σχετικά με την κατάσταση της αντιμικροβιακής αντοχής. Αυτή η πληροφορία αποτελεί τη βάση για την επιλογή αποτελεσματικής εμπειρική θεραπείας πριν τα αποτελέσματα των καλλιεργειών να είναι έτοιμα. Για αυτό η τοπική επιτήρηση της αντοχής είναι ένα φυσικό και σημαντικό καθήκον στο μικροβιολογικό εργαστήριο. Το αντιμικροβιακό τεστ ευαισθησίας συνήθως έδειχνε υψηλή αναπαραγωγιμότητα στο κάθε εργαστήριο. Η επιλογή των δειγμάτων δεν έδινε την απαραίτητη πληροφορία για την εκτίμηση της αντοχής στον πληθυσμό αλλά έδινε μία καλή εικόνα για την αντιμικροβιακή αντοχή στο υλικό του ασθενή, το οποίο ήταν το σημαντικότερο στοιχείο για τον κλινικό όσον αφορά την επιλογή της θεραπείας [56]. Παραδείγματα από αποτελέσματα από τοπικές μελέτες αντιμικροβιακής αντοχής περιλαμβάνουν μελέτες όπου η εκτέλεση έχει υψηλό επίπεδο, πράγμα το οποίο παρέχει καλή συγκρισιμότητα και άλλες που είναι πιο πολύ του είδους που περιγράφηκε παραπάνω, δηλαδή μπορούν να χρησιμοποιηθούν μόνο σε τοπικό επίπεδο [57-59]. Περιορίζοντας την τοπική επιτήρηση σε απομονώσεις από αιμοκαλλιέργειες κάνει αμέσως τα αποτελέσματα συγκρίσιμα χρησιμοποιώντας μία καλά προτυποποιημένη μέθοδο. [60] ΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΑ ΠΑΓΚΟΣΜΙΑΣ ΕΠΙΤΗΡΗΣΗΣ Η επιτήρηση της μικροβιακής αντοχής γίνεται καίριας σημασίας σε μία παγκόσμια κατάσταση εξάπλωσης γονιδίων αντοχής μεταξύ των μικροβιακών παθογόνων. Ανασκοπήσεις και απόψεις όσον αφορά την επιτήρηση της αντιμικροβιακής αντοχής έχουν δημοσιευτεί, ειδικότερα τις τελευταίες δεκαετίες. [32, 61-63] Η παγκόσμια επιτήρηση αντοχής, ένας όρος που χρησιμοποιείται σε αντιπαράθεση με την τοπική επιτήρηση, είναι σπάνια παγκόσμια στην πραγματικότητα, αλλά συνήθως περιορίζεται γεωγραφικώς σε μία χώρα, περιοχή ή σε μία ήπειρο ή σε μία επιλογή συμμετεχόντων κέντρων. Καθώς τα περισσότερα εργαστήρια στην πράξη χρησιμοποιούν τη μέθοδο διάχυσης με δίσκους ως αντιμικροβιακό τεστ ευαισθησίας, 18

19 ήταν φυσικό αρχικά να χρησιμοποιηθούν αυτά τα δεδομένα από τη καθημερινή ρουτίνα του εργαστηρίου για επιτήρηση. Σε μελέτες από τους O Brien et al. αυτή η πηγή των δεδομένων αντοχής ελέγχθηκε προσεκτικά από την άποψη της συγκρισιμότητας μέσω ανάλυσης των ιστογραμμάτων των διαμέτρων των ζωνών και αποδείχτηκε έγκυρη [32,64,65]. Το παλιό άρθρο των O Brien et al. είναι ενδιαφέρον γιατί οι συγγραφείς τονίζουν διάφορους σημαντικούς παράγοντες για την επιτήρηση [32]. Πρώτος παράγοντας είναι η συγκρισιμότητα των αποτελεσμάτων, ενώ άλλοι είναι η χρήση ποσοτικών δεδομένων και το πρόβλημα στις διαφορές των δειγμάτων. Όταν σύγκριναν τα αποτελέσματα δύο νοσοκομείων σε διαφορετικές χώρες, τα ποσοτικά αποτελέσματα επέτρεπαν τη διόρθωση των ορίων έτσι ώστε οι ερμηνείες να είναι συγκρίσιμες. Τα όρια ορίστηκαν σε σχέση με τον κύριο ευαίσθητο πληθυσμό. Αυτός ο πληθυσμός πλέον αναφέρεται ως wild-type(wt) πληθυσμός. Η χρήση των ορίων των WT πληθυσμών ή επιδημιολογικά όρια μπορούν να γίνουν ένα προτιμητέο σημείο αναφοράς στην επιτήρηση [37, 66]. Πρόσφατα άρθρα για την επιτήρηση της αντοχής έχουν συνηγορήσει υπέρ αυτού [66,67]. Η χρήση των επιδημιολογικών ορίων για να υπολογίζεται η αντοχή κάνει την πληροφορία από διαφορετικά εργαστήρια συγκρίσιμη. Πολλά προγράμματα επιτήρησης έγιναν ή συνεχίζονται για να ανακτηθούν οι απαραίτητες πληροφορίες σχετικά με τη μικροβιακή αντοχή. Αυτές οι μελέτες συνήθως πραγματοποιούνται με έναν από τους παρακάτω τρόπους. Ο ένας τρόπος είναι να στέλνονται όλα τα απομονωθέντα στελέχη από τα συμμετέχοντα εργαστήρια στο εργαστήριο αναφοράς, όπου πραγματοποιούνται τα τεστ ευαισθησίας με τη μέθοδο αναφοράς [68,69]. Μία παρόμοια συγκεντρωτική προσέγγιση, αλλά χρησιμοποιώντας το προτυποποιημένο τεστ ευαισθησίας με δίσκους, έχει επίσης εφαρμοστεί [70]. Η βάση δεδομένων TSN [71,72] αποτελεί από την άλλη μεριά ένα αποκεντρωμένο σχέδιο με τα αποτελέσματα των τεστ να παράγονται στα κατά τόπους εργαστήρια αλλά να συλλέγονται κεντρικά και να αναλύονται. Παρόλα αυτά, δεν υπάρχει τεκμηριωμένη διαδικασία για να ελέγχεται η διεργαστηριακή διακύμανση με τον τρόπο που προτείνεται από τις εργασίες των O Brien et al. και για αυτό η παγκόσμια επιτήρηση σε μεγαλύτερη κλίμακα χρησιμοποιώντας αποτελέσματα ρουτίνας από τα τεστ ευαισθησίας με δίσκους 19

20 έπρεπε να περιμένει μία αυστηρότερη προτυποποίηση ή βαθμονόμηση των αποτελεσμάτων των τεστ. Μία ακόμα πρώιμη μελέτη επιτήρησης που χρησιμοποιούσε αποτελέσματα από τεστ ευαισθησίας ρουτίνας ήταν μία δωδεκάχρονη μελέτη που χρησιμοποίησε σχεδόν 10 εκατομμύρια στελέχη από 242 νοσοκομεία στις ΗΠΑ [73]. Μία λύση στο πρόβλημα της διεργαστηριακής διακύμανσης ήταν η παγκόσμια επιτήρηση να γίνεται στέλνοντας τα στελέχη σε ένα κεντρικό εργαστήριο για να πραγματοποιηθούν τα αντιμικροβιακά τεστ ευαισθησίας. Αυτό υιοθετήθηκε στο Alexander Project το οποίο ξεκίνησε το 1992 [68,74]. Οι μικροοργανισμοί οι οποίοι μελετήθηκαν περιορίστηκαν σε τρία είδη τα οποία βρίσκονται συχνά ως παθογόνα σε δείγματα από ενήλικους με λοιμώξεις του αναπνευστικού της κοινότητας. Από τα αρχικά 15 κέντρα που περιλαμβάνονταν στην Ευρώπη και στις ΗΠΑ, το πρόγραμμα εξαπλώθηκε παγκόσμια με κέντρα από όλες τις ηπείρους [75]. Το αντιμικροβιακό τεστ ευαισθησίας που χρησιμοποιήθηκε στα κέντρα αναφοράς ήταν η broth microdilution method σύμφωνα με τα πρότυπα του CLSI. Ένα μεγάλο μειονέκτημα του να γίνονται τα τεστ κεντρικά είναι το κόστος που προκύπτει και ως εκ τούτου οι περιορισμοί στον αριθμό των στελεχών που μπορούν να συμπεριληφθούν. Ένα πλεονέκτημα αυτού του τρόπου είναι η διαθεσιμότητα των στελεχών για περαιτέρω τεστ, για παράδειγμα μοριακές μελέτες μηχανισμών αντοχής. Σε ένα άλλο μεγάλο διεθνές πρόγραμμα επιτήρησης, το SENTRY project το οποίο ξεκίνησε το 1997, τα στελέχη που εξετάσθηκαν στάλθηκαν σε ένα κεντρικό εργαστήριο για MIC test [76,77]. Αυτό το πρόγραμμα είχε μία ευρύτερη οπτική περιλαμβάνοντας νοσοκομειακές και λοιμώξεις της κοινότητας, βακτηριακές ή μυκητιακές, περιλαμβάνοντας βακτηριαιμίες, λοιμώξεις του αναπνευστικού της κοινότητας, λοιμώξεις των μαλακών μορίων, ουρολοιμώξεις από νοσηλευόμενους ασθενείς κλπ. Το SENTRY project κατέληξε σε ένα μεγάλο αριθμό δημοσιεύσεων με διαφορετικό επίκεντρο ενδιαφέροντος, τοπικό ή παγκόσμιο [76-79]. Το MYSTIC (Meropenem Yearly Susceptibility Test Information Collection) πρόγραμμα επιτήρησης, εστιάζει στην ευαισθησία στη μεροπενέμη σε στελέχη από κέντρα από όλον τον κόσμο σε σύγκριση με την ευαισθησία σε άλλα σχετικά αντιβιοτικά [80,81]. 20

21 Στη συγκεκριμένη περίπτωση τα τεστ πραγματοποιούνται στα κατά τόπους εργαστήρια αλλά ο αριθμός των εργαστηρίων είναι περιορισμένος και η μέθοδος ελέγχεται αυστηρά για να διασφαλίζεται η συγκρισιμότητα. Τα αποτελέσματα από το SENTRY και το MYSTIC έχουν επιτυχώς ενσωματωθεί χρησιμοποιώντας στατιστικές μεθόδους με τα οποία γίνεται μία εκτεταμένη ανάλυση και επικύρωση των αποτελεσμάτων [82]. Το European Antimicrobial Resistance Surveillance System (EARSS) χρηματοδοτείται από δημόσιους πόρους και συλλέγει δεδομένα αντιμικροβιακής ευαισθησίας για επτά αντιπροσωπευτικά βακτηριακά είδη από εκατοντάδες μικροβιολογικά εργαστήρια σε όλη την Ευρώπη και παρουσιάζει τα αποτελέσματα με έναν ενδιαφέροντα νέο τρόπο μέσω μίας διαδραστικής βάσης δεδομένων στην ιστοσελίδα τους καθώς και σε αναφορές και δημοσιεύσεις ( Παλαιότερα ευρωπαϊκά προγράμματα υπό το ESCMID μελέτησαν την αντιμικροβιακή ευαισθησία χρησιμοποιώντας την κεντρικοποιημένη προσέγγιση των τεστ [83,84]. Πολλοί συγγραφείς έχουν επισημάνει παλαιοτέρα πόσο σημαντική πηγή από αντιμικροβιακά τεστ ευαισθησίας είναι τα τεστ ρουτίνας στα μικροβιολογικά εργαστήρια [32, 67, 85]. Εάν το πρόβλημα της συγκρισιμότητας μπορούσε να λυθεί, αυτή η πηγή θα μπορούσε να εκμεταλλευθεί για να βοηθήσει στις προσπάθειες της επιτήρησης της μικροβιακής αντοχής. Ένα τέτοιο επιτυχημένο πρόγραμμα προς αυτή την κατεύθυνση είναι το The Surveillance Network (TSN). Το TSN, ένα ηλεκτρονικό πρόγραμμα επιτήρησης που έχει στηθεί από μία ιδιωτική εταιρεία το οποίο συλλέγει αντιμικροβιακά τεστ ευαισθησίας από μικροβιολογικά εργαστήρια όπου η συγκρισιμότητα διατηρείται από μία καλά ελεγμένη προτυποποιημένη μέθοδο [86-88]. Η ηλεκτρονική σύνδεση όπου γίνεται η κατάθεση των αποτελεσμάτων διασφαλίζει τις εκτιμήσεις τη μικροβιακής αντοχής σε πραγματικό χρόνο. Το δίκτυο είναι τώρα εξαπλωμένο σε πολλές χώρες και η βάση δεδομένων είναι μάλλον η μεγαλύτερη στον κόσμο σε ότι αφορά τα τεστ ευαισθησίας. Εκατομμύρια αποτελεσμάτων τεστ ευαισθησίας συναθροίζονται, πράγμα που δίνει την ιδέα του τεράστιου όγκου δεδομένων των τεστ ευαισθησίας που είναι διαθέσιμα για επιτήρηση, εάν αυτά τα αποτελέσματα μπορούν να καταστούν συγκρίσιμα. 21

22 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Η θεραπεία των λοιμώξεων με τη βοήθεια των αντιβιοτικών από την εποχή της ανακάλυψης της πενικιλίνης μέχρι και σήμερα επέφερε μία πραγματική επανάσταση στην Ιατρική. Όμως γρήγορα οι μικροοργανισμοί απέκτησαν αντοχές σε αυτά τα φάρμακα και η επιτυχία ή αποτυχία της θεραπείας έπρεπε να προβλεφθεί με τη βοήθεια των τεστ ευαισθησίας. Αυτό όμως πλέον δεν αρκεί. Οι συνεχώς νέες αναδυόμενες αντοχές καταστούν αυτά τα πολύτιμα φάρμακα άχρηστα, οπότε είναι απαραίτητη η επιτήρηση των αντοχών ώστε να ληφθούν έγκαιρα μέτρα. Το ερώτημα που τίθεται λοιπόν είναι εάν τα σχετικώς πρόσφατα επιδημιολογικά όρια μπορούν να βοηθήσουν προς αυτή την κατεύθυνση καθιστώντας χρήσιμα δεδομένα από κατά τόπους εργαστήρια, όπως στην προκειμένη περίπτωση από ένα ελληνικό νοσοκομείο. 22

23 1.2 ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ Παρακάτω θα αναλυθεί και θα επεξηγηθεί, όπου είναι απαραίτητο, το θεωρητικό υπόβαθρο των μεθόδων που χρησιμοποιήθηκαν για την εξαγωγή των αποτελεσμάτων, της επεξεργασίας τους καθώς και από πού προήλθαν τα δεδομένα WHONET Η αντιμικροβιακή αντοχή, όπως έχει αναφερθεί, εδώ και καιρό έχει γίνει ένα σημαντικό πρόβλημα που αφορά τη δημόσια υγεία σε πολλά μέρη του κόσμου. Η συστηματική παρακολούθηση αυτής της αντοχής σε τοπικό, εθνικό και διεθνές επίπεδο έχει αναγνωρισθεί ως αναπόσπαστο κομμάτι της στρατηγικής ελέγχου από τους περισσότερους εθνικούς και διεθνείς οργανισμούς συμπεριλαμβανόμενου και του ΠΟΥ. [89-91] Πολλές πολυκεντρικές μελέτες οι οποίες πραγματοποιήθηκαν στην Ελλάδα τη δεκαετία του 80 και του 90 αναγνώρισαν αυτό το πρόβλημα και υπογράμμισαν την ανάγκη για άμεση δράση. [92-95] Για παράδειγμα το ελληνικό υπουργείο υγείας έχει θέσει περιορισμούς στην χρήση νεότερων αντιβιοτικών (τρίτης γενιάς κεφαλοσπορίνες, κινολόνες κ.ά.) δημιουργώντας μία διαδικασία συνταγογράφησης μέσω της οποίας δικαιολογείται η χρήση αυτών των φαρμάκων. Για να ικανοποιηθεί η επείγουσα ανάγκη για ένα αποτελεσματικό σύστημα επιτήρησης και για να μελετηθεί η επιδημιολογία της αντιμικροβιακής αντοχής, το 1995 ξεκίνησε ένα πρόγραμμα με σκοπό να θεμελιωθεί ένα εθνικό δίκτυο συνεχούς παρακολούθησης αυτής της αντοχής. Αυτό το πρόγραμμα είναι προέκταση ενός ήδη προϋπάρχοντος διεθνούς προγράμματος. Το πρόγραμμα βασίζεται στην παραδοχή ότι τα αποτελέσματα των τεστ ευαισθησίας, τα οποία πραγματοποιούνται καθημερινά στη ρουτίνα του κάθε μικροβιολογικού εργαστηρίου μπορούν να θεωρηθούν μία πολύτιμη πηγή πληροφορίας για επιτήρηση της αντοχής. Από τη στιγμή που η ποιότητα και η συμβατότητα αυτών των δεδομένων είναι αβέβαιη, η προσέγγιση είναι παράλληλα να εκτιμάται η ποιότητα των δεδομένων. Έχει στηθεί λοιπόν μία διαδικασία ελέγχου ποιότητας και χρησιμοποιείται ένας πρότυπος ηλεκτρονικός κώδικας και σχήμα για την εισαγωγή δεδομένων βασισμένο στο λογισμικό WHONET. Αυτό το λογισμικό είχε αρχικά επινοηθεί από το WHO Collaborating Centre for Surveillance of Antibiotic Resistance, Boston, MA, USA και αργότερα αναπτύχθηκε περαιτέρω από τον WHO 23

24 στη Γενεύη. Το WHONET διανέμεται δωρεάν από τον ΠΟΥ και διευκολύνει τη διαχείριση των αποτελεσμάτων των τεστ ευαισθησίας από τα στελέχη που εξετάζονται στην καθημερινή εργαστηριακή ρουτίνα [55, 96]. Το WHONET είναι ένα λογισμικό το οποίο αναπτύχθηκε με σκοπό να παρέχει βοήθεια στον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας για τον σκοπό της παγκόσμιας επιτήρησης της μικροβιακής αντοχής στους αντιμικροβιακούς παράγοντες. Μικροβιολόγοι, κλινικοί και υπάλληλοι που δουλεύουν στον τομέα του ελέγχου των λοιμώξεων μπορούν να χρησιμοποιήσουν το λογισμικό για να βελτιώσουν την παρακολούθηση της αντοχής στα νοσοκομεία και στις κοινότητες και να συγχωνεύσουν τα αρχεία σε εθνικό, τοπικό και παγκόσμιο δίκτυο για επιτήρηση της μικροβιακής αντοχής. Το WHONET μπορεί να εγκατασταθεί σε ηλεκτρονικούς υπολογιστές και να διαμορφωθεί αντίστοιχα για τα τεστ που κάνει ένα εργαστήριο και για τους αντιμικροβιακούς παράγοντες που εξετάζει. Το πρόγραμμα δέχεται αποτελέσματα από τα τεστ ευαισθησίας και επιτρέπει την εκτύπωση των αναφορών και την ανάκτηση των δεδομένων. Εάν το εργαστήριο έχει ήδη ένα λογισμικό για την αναφορά των δεδομένων, ένα πρόγραμμα μπορεί να μεταφράσει τα δεδομένα και να τα εισάγει στο WHONET. Με τον έναν ή τον άλλο τρόπο, οι μικροβιολόγοι και οι άλλοι ειδικοί των λοιμώξεων κερδίζουν ένα καινούριο αναλυτικό εργαλείο για να παρακολουθούν και να διαχειρίζονται την ευαισθησία των τεστ ευαισθησίας και την εξάπλωση της μικροβιακής αντοχής τοπικά και εκτός της περιοχής. Το WHONET μπορεί να αναλύσει αποθηκευμένα δεδομένα. Από μία οθόνη, ο χρήστης του WHONET επιλέγει τον τύπο της ανάλυσης που θέλει να τρέξει, το είδος του βακτηρίου που θέλει να αναλύσει, τα υποσύνολα των στελεχών που θα συμπεριληφθούν (π.χ. όλα, απομονώσεις από τα ούρα μόνο, απομονώσεις ανθεκτικές στη γενταμικίνη και από συγκεκριμένο υλικό) και τους αντιμικροβιακούς παράγοντες και την περίοδο που θέλει να εξετάσει. Οι τύποι της ανάλυσης περιλαμβάνουν κατηγοριοποίηση ως ανθεκτικά, ενδιάμεσα ή ευαίσθητα σύμφωνα με τα όρια αντοχής και εξαγωγή των αποτελεσμάτων ως ποσοστά. Επίσης περιλαμβάνουν κατανομές των μετρήσεων των τεστ (διάμετροι ζωνών, MIC) στη μορφή των ιστογραμμάτων, στικτογράμματα τα οποία συγκρίνουν τις μετρήσεις διαφορετικών αντιβιοτικών ή μεθόδων για τα ίδια στελέχη. Τέλος τα στελέχη διαχωρίζονται βάσει του συνδυασμού των αντιβιοτικών στα οποία είναι ανθεκτικά(αντιβιότυποι). Στελέχη με ασυνήθιστες 24

25 αντοχές μπορούν να επισημαίνονται έτσι ώστε να εξετάζονται και να αποφεύγονται οι τοπικές επιδημίες. Παρόλο που τα αποτελέσματα των τεστ εισάγονται και παρακολουθούνται τοπικά από λογισμικό που είναι προσαρμοσμένο για τοπική χρήση, καταχωρούνται σε ένα τύπο αρχείου για παγκόσμια χρήση, έτσι ώστε το πρόγραμμα να μπορεί να αναλύει τα αρχεία οποιουδήποτε εργαστηρίου. Αυτό το χαρακτηριστικό έδωσε τη δυνατότητα σε χρήστες να στήσουν συστήματα επιτήρησης. Η τοπική ανάλυση από τους ερευνητές κατά τόπους είναι η κύρια λειτουργία του συστήματος. Αναγνωρίζει τοπικά προβλήματα στις εξετάσεις, που κανένα εργαστήριο δεν μπορεί να αποφύγει εντελώς και έτσι βελτιώνει τη συνολική ποιότητα του προγράμματος. Οριοθετεί την τοπική εξάπλωση των ανθεκτικών στελεχών, πράγμα που βοηθάει στον έλεγχο των λοιμώξεων και μπορεί να εξηγήσει και να διορθώσει την ασυνήθιστη επικράτηση συγκεκριμένων τύπων αντιβιοτικής αντοχής. Το λογισμικό WHONET παρέχει μία μεγάλη βάση δεδομένων για ειδικές του είδους διαμέτρους ζωνών για κάθε αντιβιοτικό. Αυτές οι κατανομές είναι συμβατές με την ύπαρξη δύο (ή περισσοτέρων) υποπληθυσμών βακτηρίων: ένα ευαίσθητο και ένα ή περισσότερους πληθυσμούς οι οποίοι φέρουν μηχανισμούς αντοχής. Τα επιδημιολογικά όρια μπορούν να τεθούν για να διαχωρίσουν τους διάφορους βιολογικά καθορισμένους πληθυσμούς και πρέπει να διαχωρίζονται από τα κλινικά όρια. Η παρακολούθηση της κατανομής των συχνοτήτων των ζωνών(ή των MIC) παρέχει σημαντική πληροφορία. Μία ελάττωση στο ποσοστό του ευαίσθητου υποπληθυσμού ή ανάδυση νέων υποπληθυσμών μπορεί να υποδείξει προβλήματα σχετικά με τον έλεγχο της ποιότητας ή να δείξει την ανάδυση ενός νέου μηχανισμού αντίστασης. Πρέπει να γίνει η παρατήρηση ότι αυτού του είδους η επιτήρηση μπορεί να γίνει μόνο σε εργαστήρια που εκτελούν Kirby-Bauer ή πλήρους εύρους MIC. Είναι γνωστό ότι η επιδημιολογία της αντιμικροβιακής αντοχής είναι τοπική, πιθανότατα λόγω των διαφορών στις τοπικές αντιμικροβιακές πολιτικές και πρότυπα αντοχής. Από τη φύση τους οι μεγάλης κλίμακας μελέτες επιτήρησης μπορούν να αγνοούν το γεγονός ότι η μικροβιακή αντοχή δεν αναπτύσσεται ενιαία στα είδη, στα κέντρα και στις χώρες. Μάλλον αυτές οι αλλαγές είναι το αποτέλεσμα της 25

26 αλληλεπίδρασης μεταξύ των διαφόρων γονιδίων σε διαφορετικές περιοχές με διαρκείς εναλλασσόμενες πιέσεις φυσικής επιλογής [97]. Μελέτες των διαφορών στα επίπεδα αντοχής μεταξύ νοσοκομείων διαφορετικού μεγέθους, είδους, φόρτου εργασίας και γεωγραφικής περιοχής είναι για αυτό το λόγο πολύτιμες για την ερμηνεία της σχετικής σημασίας των διαφόρων παραγόντων κινδύνου που συμμετέχουν. Ωστόσο, εθνικά και διεθνή δεδομένα είναι επίσης χρήσιμα από τη στιγμή που επιτρέπουν την εκτίμηση του συνολικού φορτίου της μικροβιακής αντοχής και της εξέλιξής της στον χρόνο, την εκτίμηση των παραγόντων κινδύνου και τα προληπτικά μέτρα και τη σύγκριση του βαθμού και των προτύπων αντοχής σε διαφορετικές καταστάσεις. Παρόλο που το λογισμικό του WHONET δίνει έμφαση στην τοπική παρακολούθηση και διαχείριση της αντοχής από κάθε ιατρικό κέντρο ξεχωριστά, η κοινή μορφή του αρχείου διευκολύνει τη σύγκριση του επιπέδου αντοχής. Από τη στιγμή που τα διάφορα μικροβιακά είδη απομονώνονται, τα επίπεδα αντοχής και οι φαινότυποι αντοχής μπορούν να συγκριθούν μεταξύ των νοσοκομείων, τα προβλήματα αντοχής να αναγνωριστούν και οι προτεραιότητες για περαιτέρω έρευνα μπορούν να τεθούν βασιζόμενες σε στέρεα επιδημιολογικά δεδομένα. Η ανάπτυξη κατευθυντήριων γραμμών για την εμπειρική θεραπεία των λοιμώξεων πρέπει να βασίζεται στην κατανόηση της επιδημιολογίας της αντιβιοτικής αντοχής και του τρόπου εξάπλωσης των ανθεκτικών στελεχών και των γονιδίων εντός και μεταξύ των νοσοκομείων. Τα δεδομένα τα οποία παρέχονται από το ηλεκτρονικό δίκτυο είναι πολύτιμα για την ανάπτυξη κατευθυντήριων γραμμών εντός του νοσοκομείου ή ακόμα και εντός μίας κλινικής, τα οποία θα αντικαταστήσουν τις ανά χώρα γενικές κατευθυντήριες γραμμές ΤΕΣΤ ΔΙΑΧΥΣΗΣ ΜΕ ΔΙΣΚΟΥΣ Το σχήμα α. αποτυπώνει τη βασική αρχή της μεθόδου διάχυσης με δίσκους ως τεστ της αντιμικροβιακής ευαισθησίας [98]. 26

27 Σχήμα α. Απεικόνιση της διάχυσης του αντιβιοτικού γύρω από δίσκο εμποτισμένο με αυτό. Από τη στιγμή που ο εμποτισμένος με αντιβιοτικό δίσκος έρχεται σε επαφή με την υγρή επιφάνεια του άγαρ, νερό απορροφάται στο χαρτί του δίσκου και το αντιβιοτικό διαχέεται στο περιβάλλον υλικό. Ο βαθμός εξαγωγής του αντιβιοτικού από τον δίσκο είναι μεγαλύτερος από την εξωτερική διάχυση στο υλικό, έτσι ώστε η συγκέντρωση αμέσως στο σημείο επαφής με το δίσκο να είναι μεγαλύτερη από τον ίδιο το δίσκο. Καθώς η απόσταση από τον δίσκο αυξάνει υπάρχει λογαριθμική μείωση της συγκέντρωσης του αντιβιοτικού. Εάν το τρυβλίο έχει προηγουμένως ενοφθαλμιστεί με βακτηριακό εναιώρημα, συγχρόνως αναπτύσσονται βακτήρια στην επιφάνεια του άγαρ. Όταν τα βακτήρια φτάνουν ένα κρίσιμο αριθμό, η ανασταλτική δραστηριότητα του αντιβιοτικού ξεπερνιέται και λαμβάνει χώρα βακτηριακή ανάπτυξη. Ο χρόνος που απαιτείται για να φτάσει ο αριθμός των βακτηρίων στο κρίσιμο σημείο (4-10 ώρες για τα περισσότερα κοινώς εξεταζόμενα βακτήρια) είναι χαρακτηριστική του είδους, αλλά επηρεάζεται από τη σύνθεση του υλικού και τη θερμοκρασία της επώασης. Η πλάγια έκταση της διάχυσης του αντιβιοτικού πριν από το κρίσιμο σημείο επηρεάζεται από το βάθος του άγαρ, επειδή η διάχυση συμβαίνει σε τρεις διαστάσεις. Τα σημεία στα οποία εντοπίζεται ο κρίσιμος όγκος των βακτηρίων εμφανίζεται ως ένας σαφώς αφορισμένος κύκλος βακτηριακής ανάπτυξης, με το κέντρο του δίσκου να αποτελεί το κέντρο του κύκλου εάν το τεστ έχει πραγματοποιηθεί σωστά όπως φαίνεται στο σχήμα β. 27

28 Η συγκέντρωση του διαχυμένου αντιβιοτικού σε αυτό τον συνδυασμό ανάπτυξης και αναστολής των βακτηρίων ορίζεται ως οριακή συγκέντρωση και προσεγγίζει τη MIC από τα dilution τεστ. Παρόλο που ο απευθείας υπολογισμός της ανασταλτικής συγκέντρωσης δεν πραγματοποιείται στην πράξη, η MIC μπορεί να υπολογιστεί με αποδεκτή ακρίβεια εάν τα χαρακτηριστικά της αντιβιοτικής διάχυσης και της βακτηριακής ανάπτυξης είναι γνωστά [98] Α.ΠΡΩΙΜΗ ΕΞΕΛΙΞΗ Με την έλευση πολλών νέων αντιβιοτικών κατά τη διάρκεια της δεκαετίας του 40, οι μέθοδοι διάλυσης σε σωληνάριο δεν ήταν πλέον πρακτικές λόγω του μεγάλου όγκου δουλειάς που απαιτούνταν. Το 1943, οι Foster και Woodruf τοποθέτησαν μία χάρτινη ταινία η οποία είχε εμποτιστεί με αντιβιοτικά στην επιφάνεια ενός τρυβλίου με άγαρ το οποίο είχε ενοφθαλμιστεί προηγουμένως [99]. Πολλαπλά αντιβιοτικά μπορούσαν να εξεταστούν με αυτή τη μέθοδο απλά. Τον επόμενο χρόνο οι Vincent και Vincent εισήγαγαν χάρτινους δίσκους οι οποίοι επέτρεπαν την ταυτόχρονη εξέταση ακόμα περισσότερων δίσκων [4]. Το 1945, ο Morley άνοιξε τον δρόμο για εμπορική κατασκευή των δίσκων επιδεικνύοντας ότι οι εμποτισμένοι με αντιβιοτικό δίσκοι μπορούσαν να αποξηρανθούν και να αποθηκευτούν πριν από τη χρήση [100]. 28

29 Η αποκαλούμενη ζώνη vs μη ζώνης μέθοδος χρησιμοποιήθηκε αρχικά για την ερμηνεία των αποτελεσμάτων. Η ανάπτυξη μίας ανασταλτικής ζώνης οποιουδήποτε μεγέθους θεωρούταν ένδειξη ότι ο μικροοργανισμός ήταν ευαίσθητος στο αντιβιοτικό. Ανθεκτικά βακτήρια κατατάσσονταν αυτά που αναπτύσσονταν ακριβώς στο όριο του δίσκου. Το σχήμα γ δείχνει ένα τεστ ευαισθησίας σε τρυβλίο με άγαρ. Σχήμα γ. Τεστ ευαισθησίας με δίσκους στο οποίο τοποθετήθηκαν 12 δίσκοι, ο καθένας από τους οποίους περιέχει διαφορετικό αντιβιοτικό. Παρατηρείστε τις διαφορές στο μέγεθος των ζωνών αναστολής. Παρατηρείστε ότι υπάρχουν διαφορές στο μέγεθος των ζωνών γύρω από τους δίσκους. Παλαιότερα υπήρχε η πεποίθηση ότι το μέγεθος των ζωνών γύρω από τους εμποτισμένους δίσκους θα μπορούσε να συσχετισθεί με τη σχετική ευαισθησία του μικροοργανισμού με τα αντιβιοτικά. Δηλαδή όσο μεγαλύτερη η ζώνη τόσο πιο αποτελεσματικό το αντιβιοτικό θεραπευτικά. Όσο αυξανόταν η γνώση σχετικά με τους μηχανισμούς διάχυσης και τις ζώνες αναστολής, γινόταν εμφανές ότι οι παράγοντες που επηρεάζουν το βαθμό διάχυσης in vitro δε συσχετίζονται απαραίτητα με την αντιμικροβιακή δραστηριότητα in vivo. Η έλλειψη ικανότητας να παράγονται ποσοτικά αποτελέσματα από την αρχικό τεστ ευαισθησίας με δίσκους θεωρήθηκε μειονέκτημα. O Schneierson ανέπτυξε ένα τεστ με δύο σωληνάρια με θρεπτικό ζωμό [101]. Το ένα περιείχε αντιβιοτικό σε σχετικά υψηλή συγκέντρωση και το άλλο σε χαμηλή συγκέντρωση. Ένας μικροοργανισμός με υψηλή αντοχή αναπτυσσόταν και στα δύο σωληνάρια. Ένας μικροοργανισμός με ενδιάμεση αναπτυσσόταν μόνο στο 29