ΑΝΑΣΤΑΣΙΟΣ Ζ. ΑΛΑΤΖΑΣ ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΠΡΟΤΥΠΟΥ ΚΑΤΑΝΟΜΗΣ ΤΩΝ ΙΣΤΟΝΩΝ ΚΑΤΑ ΤΗΝ ΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗ ΦΥΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΚΑΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΑΝΑΣΤΑΣΙΟΣ Ζ. ΑΛΑΤΖΑΣ ΓΕΩΠΟΝΟΣ ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΠΡΟΤΥΠΟΥ ΚΑΤΑΝΟΜΗΣ ΤΩΝ ΙΣΤΟΝΩΝ ΚΑΤΑ ΤΗΝ ΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗ ΦΥΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2009

2

3 ARISTOTLE UNIVERSITY OF THESSALONIKI FACULTY OF SCIENCES SCHOOL OF BIOLOGY DEPARTMENT OF GENETICS, DEVELOPMENT AND MOLECULAR BIOLOGY LABORATORY OF DEVELOPMENTAL BIOLOGY ANASTASIOS Z. ALATZAS AGRICULTURIST HISTONE DISTRIBUTION DURING PLANT CELL DIFFERENTIATION PhD THESIS THESSALONIKI 2009

4

5 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΚΑΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΑΝΑΣΤΑΣΙΟΣ Ζ. ΑΛΑΤΖΑΣ ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΠΡΟΤΥΠΟΥ ΚΑΤΑΝΟΜΗΣ ΤΩΝ ΙΣΤΟΝΩΝ ΚΑΤΑ ΤΗΝ ΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗ ΦΥΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ Υποβλήθηκε στο Τµήµα Βιολογίας, Τοµέα Γενετικής, Ανάπτυξης και Μοριακής Βιολογίας Ηµεροµηνία Προφορικής Εξέτασης: 7 εκεµβρίου 2009 Εξεταστική Επιτροπή Επικ. Καθηγήτρια Αθηνά Φουντούλη, Επιβλέπουσα Καθηγητής ηµήτριος Κυριακίδης, µέλος Συµβουλευτικής Επιτροπής Αναπλ. Καθηγητής Χρήστος Παναγιωτίδης, µέλος Συµβουλευτικής Επιτροπής Καθηγήτρια Μαργαρίτα Χατζοπούλου-Κλαδαρά, µέλος Εξεταστικής Επιτροπής Καθηγητής Ζαχαρίας Σκούρας, µέλος Εξεταστικής Επιτροπής Καθηγητής Μηνάς Αρσενάκης, µέλος Εξεταστικής Επιτροπής Καθηγητής Πολυδεύκης Χατζόπουλος, µέλος Εξεταστικής Επιτροπής

6

7 Ευχαριστίες Η παρούσα διατριβή εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Βιολογίας Ανάπτυξης του Τµήµατος Βιολογίας ΑΠΘ υπό την επίβλεψη της Επ. Καθ. Αθηνάς Φουντούλη, την οποία θα ήθελα να ευχαριστήσω ιδιαιτέρως για την εµπιστοσύνη που µου έδειξε και για τη στήριξη που µου παρείχε όλα αυτά τα χρόνια. Θα ήθελα να ευχαριστήσω τα µέλη της τριµελούς Συµβουλευτικής Επιτροπής, τον Καθ. ηµήτριο Κυριακίδη, οι παρατηρήσεις του οποίου ήταν ιδιαίτερα χρήσιµες για την πορεία της διατριβής και τον Αν. Καθ. Χρήστο Παναγιωτίδη, που στάθηκε δίπλα µου καθ όλη τη διάρκεια της και µε βοήθησε σε κάθε δυσκολία που συνάντησα. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω τα µέλη της επταµελούς Εξεταστικής Επιτροπής, την Καθ. Μαργαρίτα Χατζοπούλου-Κλαδαρά, µε την οποία συνυπήρξαµε όλα αυτά τα χρόνια στο Εργαστήριο Βιολογίας Ανάπτυξης, τους Καθ. Ζαχαρία Σκούρα και Μηνά Αρσενάκη που µου εµπιστεύτηκαν όσες φορές χρειάστηκε τους χώρους και τις συσκευές των εργαστηρίων τους, καθώς και τον Καθ. Πολυδεύκη Χατζόπουλο, για την απλόχερη βοήθειά του όσες φορές του ζητήθηκε. εν θα µπορούσα να παραλείψω την Οµότιµη Ερευνήτρια του ΕΚΕΦΕ ηµόκριτος ρ. Καλλιόπη Σέκερη, για τις ιδιαίτερα χρήσιµες συµβουλές που µου έδωσε στα πρώτα στάδια της εργασίας. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω όλους τους φοιτητές, προπτυχιακούς και µεταπτυχιακούς µε τους οποίους συνυπήρξαµε στο Εργαστήριο Βιολογίας Ανάπτυξης καθώς και στα γειτονικά εργαστήρια και δουλέψαµε µαζί όλα αυτά τα χρόνια. Το κλίµα συνεργασίας, αλληλοβοήθειας και συντροφικότητας που χαρακτήριζε τις τόσες ώρες που περάσαµε µαζί είχε τη δική του ξεχωριστή σηµασία στην ολοκλήρωση της εργασίας µου. Ιδιαίτερα θα ήθελα να ευχαριστήσω την Παναγιώτα Ιορδανίδου και την Έλενα Αγγελίδου, διδάκτορες του Τµήµατος Βιολογίας, που µαζί µοιραστήκαµε όχι µόνο τον χώρο του εργαστηρίου, αλλά τις χαρές, τις στεναχώριες, τα όνειρα και τις αγωνίες µας όλα αυτά τα χρόνια. Τέλος, το µεγαλύτερο «ευχαριστώ» το οφείλω στους γονείς µου, που παρόλο που αναφέρονται τελευταίοι, είχαν πραγµατικά την µεγαλύτερη συµβολή από όλους. Χωρίς την ηθική, ψυχική και οικονοµική στήριξη τους θα ήταν κυριολεκτικά αδύνατη η ολοκλήρωση της παρούσας διατριβής. Για αυτό τον λόγο και την αφιερώνω σε αυτούς.

8

9 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΙΣΟΜΟΡΦΕΣ ΤΩΝ ΙΣΤΟΝΩΝ Ισοµορφές της ιστόνης Η2Α Ισοµορφές της ιστόνης Η2B Ισοµορφές της ιστόνης Η Ισοµορφές της ιστόνης Η Ρόλος των ισοµορφών των ιστονών Τα γονίδια των ιστονών Πρωταµίνες ΟΜΗ ΤΟΥ ΝΟΥΚΛΕΟΣΩΜΑΤΟΣ ΚΑΙ ΤΗΣ ΧΡΩΜΑΤΙΝΗΣ Το ιστονικό οκταµερές Οι συνδετικές ιστόνες και οι ανώτερες δοµές της χρωµατίνης Σχηµατισµός του νουκλεοσώµατος Αναδιαµόρφωση της χρωµατίνης Πρωτεϊνες της οµάδας υψηλής κινητικότητας ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΕΙΣ ΤΩΝ ΙΣΤΟΝΩΝ Ακετυλίωση των ιστονών Φωσφορυλίωση των ιστονών Μεθυλίωση των ιστονών Ουβικουιτίνωση των ιστονών Σουµοϋλίωση των ιστονών Πολυ-ADP-ριβοσυλίωση των ιστονών.. 80

10 1.4 ΦΥΤΟΟΡΜΟΝΕΣ Αυξίνες Γιββεριλλίνες Κυτοκινίνες Αµπσισικό οξύ Αιθυλένιο Μπρασσινοστεροειδή Ιασµονικό οξύ Πεπτίδια ΤΟ ΡΙΖΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ Ανατοµία, µορφολογία και ανάπτυξη της ρίζας Φυτοορµόνες και ανάπτυξη της ρίζας Το ριζικό σύστηµα του καλαµποκιού ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ Φυτικό υλικό και χηµικά αντιδραστήρια Φυτά-µάρτυρες In vitro ιστοκαλλιέργεια κάλλων Φυτά που αναπτύχθηκαν υπό την επίδραση φυτοορµονών ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΠΥΡΗΝΩΝ ΚΑΙ ΙΣΤΟΝΩΝ Αποµόνωση των πυρήνων Εκχύλιση και καθαρισµός των ιστονών Ποσοτικός προσδιορισµός πρωτεϊνης.. 128

11 2.3 ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΤΙΚΟΣ ΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαµιδίου παρουσία SDS Όξινη ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαµιδίου Όξινη δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση Χρώση των πηκτών ΑΝΟΣΟΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Ηλεκτροµεταφορά πρωτεϊνών Ανοσοανίχνευση κατά Western ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ ΠΗΚΤΩΝ ΑΝΟΣΟΪΣΤΟΧΗΜΙΚΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Επεξεργασία των ιστών και λήψη τοµών Ανοσοϊστοχηµική ανίχνευση πρωτεϊνών ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΦΥΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΕΚΧΥΛΙΣΗ ΙΣΤΟΝΩΝ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΚΑΙ ΑΝΟΣΟΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΩΝ ΙΣΤΟΝΩΝ ΠΟΣΟΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ ΠΗΚΤΩΝ Κατανοµή των ισοµορφών της συνδετικής ιστόνης Η Κατανοµή των ισοµορφών της ιστόνης Η2A Κατανοµή των ισοµορφών της ιστόνης Η2B Κατανοµή των ισοµορφών της ιστόνης Η Κατανοµή της ακετυλιωµένης µορφής της ιστόνης Η ΑΝΟΣΟΪΣΤΟΧΗΜΙΚΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΩΝ ΙΣΤΟΝΩΝ

12 3.5 ΣΥΓΚΡΙΤΙΚΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Το πρότυπο κατανοµής των ιστονών κατά τη διαφοροποίηση των φυτικών κυττάρων Το πρότυπο κατανοµής των ιστονών κατά την αποδιαφοροποίηση των φυτικών κυττάρων Το πρότυπου κατανοµής των ιστονών κατά τη διαφοροποίηση των φυτικών κυττάρων παρουσία αυξίνης Το πρότυπου κατανοµής των ιστονών κατά τη διαφοροποίηση των φυτικών κυττάρων παρουσία γιββεριλλίνης Γενικά Συµπεράσµατα ΣΥΖΗΤΗΣΗ Φυτικό Υλικό και Μεθοδολογία Ταυτοποίηση των ιστονών στο καλαµπόκι (Zea mays L.) Το πρότυπο κατανοµής των ιστονών στις αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας Το πρότυπο κατανοµής των ιστονών σε in vitro ιστοκαλλιέργειες κάλλων Το πρότυπο κατανοµής των ιστονών στις αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας παρουσία φυτοορµονών Γενικά Συµπεράσµατα και Μελλοντικές Προοπτικές ΠΕΡΙΛΗΨΗ-SUMMARY ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 232 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Πρωτεϊνικές αλληλουχίες των ιστονών του Zea mays L ηµοσιευµένες Εργασίες

13 ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ APS BCIP BSA CTAB DTT Ammonium persulfate 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Bovine serum albumin Cetyltrimethylammonium bromide Dithiothreitol DMSO Dimethyl sulfoxide NBT PBS PMSF PVDF SDS TBS Nitro blue tetrazolium Phosphate buffer saline Phenylmethylsulfonyl fluoride Polyvinylidene fluoride Sodium dodecylsulfate Tris buffer saline TEMED N,N,N,N-tetramethyl-ethylenediamine

14

15 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Όπως είναι γνωστό, το µέγεθος του DNA των ευκαρυωτικών οργανισµών είναι εξαιρετικά µεγάλο σε σύγκριση µε τον πυρήνα του κυττάρου. Για παράδειγµα, το DNA του ανθρώπου έχει µήκος περίπου 2m, ενώ η διάµετρος του πυρήνα συνήθως δεν ξεπερνάει τα 10µm. Η συµπύκνωση του DNA επιτυγχάνεται µε τη βοήθεια των ιστονών, µίας οµάδας πρωτεϊνών που συνδέονται µε αυτό, σχηµατίζοντας τις δοµές της χρωµατίνης. Ο όρος «ιστόνη» χρησιµοποιήθηκε πρώτη φορά το 1884 από τον Α. Kossel για να περιγράψει την «βασική ουσία» που αποµόνωσε από ερυθροκύτταρα χήνας. Από τη µονογραφία του Kossel για τις ιστόνες που δηµοσιεύτηκε το 1928, αµέσως µετά το θάνατό του, έχουν γίνει πολλές προσπάθειες για να κατανοηθούν οι χηµικές και βιολογικές ιδιότητές αυτών των πρωτεϊνών [1]. Σε γενικές γραµµές, οι ιστόνες µπορούν να περιγραφούν ως µικρές, βασικές και διαλυτές σε οξέα πρωτείνες. Έχουν µικρό µοριακό βάρος και υψηλό ισοηλεκτρικό σηµείο και θεωρούνται, µαζί µε τις πρωταµίνες, ως οι πιο θετικά φορτισµένες πρωτεΐνες στη φύση. Οι ιστόνες αποτελούνται από µία σφαιρική, κεντρική περιοχή που περιβάλλεται από τις υψηλά φορτισµένες περιοχές του αµινοτελικού και του καρβοξυτελικού άκρου. Η κεντρική περιοχή βρέθηκε πως συµµετέχει στις αλληλεπιδράσεις µεταξύ των ιστονών, ενώ οι περιοχές των άκρων αφ ενός είναι σηµαντικές για τον σχηµατισµό των ανώτερων δοµών της χρωµατίνης, αφ ετέρου περιέχουν τις θέσεις των κυριότερων τροποποιήσεων των ιστονών. Εξαιτίας του ρόλου τους στην συµπύκνωση του γενετικού υλικού, οι ιστόνες είναι από τις πλέον συντηρηµένες πρωτεϊνες των ευκαρυωτικών οργανισµών [1]. Οι ιστόνες χωρίζονται σε πέντε κύριες τάξεις, κάθε µία από τις οποίες αποδεικνύεται εξαιρετικά ετερογενής. Οι πέντε κύριες τάξεις των ιστονών, όπως έχει γίνει αποδεκτό διεθνώς σύµφωνα µε την Επιτροπή Ονοµατολογίας της IUPAC - IUB, ονοµάστηκαν Η1, Η2Α, Η2Β, Η3 και Η4, αντικαθιστώντας την προηγούµενη ονοµατολογία που ήταν αντίστοιχα F1(1), F2A2(IIb1), F2B(IIb2), F3(III), F2A1(IV) αντίστοιχα [1]. Κάθε τάξη ιστονών µπορεί να θεωρηθεί ως µία οικογένεια δύο ή περισσοτέρων, δοµικά όµοιων πολυπεπτιδίων, τα οποία διαφέρουν σε ένα ή περισσότερα αµινοξέα, συντίθενται σε διαφορετικές ποσότητες, ανάλογα µε τη φυσιολογική κατάσταση και το βαθµό διαφοροποίησης του κυττάρου και ονοµάζονται ισοµορφές [2]. Οι ισοµορφές των ιστονών έχουν µελετηθεί σε πολλούς ζωικούς και φυτικούς οργανισµούς, έχουν ταυτοποιηθεί 1

16 και χαρακτηρισθεί πολλές ισοµορφές τόσο των ιστονών Η2Α, Η2Β και Η3 [3-6], όσο και της ιστόνης Η1 [7-10] και έχει προταθεί πως κάθε µία από αυτές παίζει διακριτό ρόλο στη λειτουργία της χρωµατίνης. Η βασική µονάδα της χρωµατίνης είναι το νουκλεόσωµα, το οποίο αποτελείται από ένα οκταµερές των ιστονών Η2Α, Η2Β, Η3 και Η4, στο οποίο περιελίσσονται περίπου 146bp DNA, ενώ η δοµή του ολοκληρώνεται µε την πρόσδεση της συνδετικής ιστόνης Η1 [11,12]. Ο σχηµατισµός των νουκλεοσωµάτων απαιτεί ειδικούς παράγοντες συγκρότησης της χρωµατίνης καθώς και πρωτεϊνες-συνοδούς των ιστονών [13-16]. Οι διαδικασίες που συµβαίνουν στον πυρήνα του κυττάρου και σχετίζονται µε το DNA, όπως π.χ. η αντιγραφή, η µεταγραφή και η επιδιόρθωση απαιτούν την αναδιοργάνωση των χρωµατινικών δοµών, η οποία επιτυγχάνεται είτε µε την εξαρτώµενη από το ΑΤΡ µετακίνηση των νουκλεοσωµάτων, είτε µε τις οµοιοπολικές τροποποιήσεις των ιστονών [17-19]. Σηµαντικότερες τροποποιήσεις των ιστονών είναι η ακετυλίωση [20-22], η φωσφορυλίωση [23-25], η µεθυλίωση [26-30], η ουβικουτίνωση [31-33] και η πολυ-adp-ριβοσυλίωση [34]. Με την τροποποίηση των ιστονών επέρχεται µεταβολή του ηλεκτρικού τους φορτίου, µειώνονται οι αλληλεπιδράσεις τους µε το DNA και δηµιουργείται µία πιο «χαλαρή» δοµή της χρωµατίνης. Επιπλέον, έχει προταθεί πως οι συνδυασµοί τροποποιήσεων στα άκρα των ιστονών αποτελούν σηµεία πρόσδεσης και αλληλεπίδρασης των παραγόντων που απαιτούνται για τις λειτουργίες της χρωµατίνης [35,36]. Η µελέτη τόσο της χρωµατίνης γενικά, όσο και των ιστονών ειδικότερα, παρουσιάζει εξαιρετικό ενδιαφέρον και µπορεί να συµπεριληφθεί σε πολλά ερευνητικά πεδία των βιολογικών επιστηµών. Μεγάλο ενδιαφέρον παρουσιάζει τόσο η µελέτη των ισοµορφών των ιστονών, δεδοµένων των διακριτών ρόλων τους στη δοµή της χρωµατίνης, όσο και η µελέτη των τροποποιήσεών τους, δεδοµένου του ρόλου που αυτές επιτελούν στη ρύθµιση της γονιδιακής έκφρασης αλλά και σε κάθε άλλη λειτουργία που συντελείται στον πυρήνα του κυττάρου. Ανάλογα µε την προσέγγιση που χρησιµοποιείται, οι ιστόνες αποτελούν αντικείµενα της βιοχηµείας, της µοριακής βιολογίας, της γενετικής, της φυσιολογίας, της κυτταρικής και της αναπτυξιακής βιολογίας. 2

17 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 ΙΣΟΜΟΡΦΕΣ ΤΩΝ ΙΣΤΟΝΩΝ Κάθε ιστόνη µπορεί να θεωρηθεί ως µία οικογένεια δύο ή περισσοτέρων, δοµικά όµοιων πολυπεπτιδίων, τα οποία διαφέρουν το ένα από το άλλο σ ένα ή περισσότερα αµινοξέα, συντίθενται σε διαφορετικές ποσότητες, ανάλογα µε τη φυσιολογική κατάσταση του κυττάρου και ονοµάζονται ισοµορφές ή ποικιλοµορφίες [1]. Αρχικά, ο όρος «ισοµορφή» χρησιµοποιήθηκε συµβατικά για να περιγράψει όµοιες πρωτεϊνες που µπορούν να διαχωριστούν µε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαµιδίου παρουσία Triton X-100 [37]. Μεγαλύτερη ετερογένεια παρουσιάζει η συνδετική ιστόνη Η1, που περιλαµβάνει 7 ισοµορφές στα κύτταρα των θηλαστικών, ενώ η ιστόνη Η4 εµφανίζει τη µικρότερη. Οι υπόλοιπες ιστόνες παρουσιάζουν ενδιάµεσο βαθµό ετερογένειας, δεδοµένου ότι έχουν βρέθει ισοµορφές των Η2Α, Η2Β και Η3, οι οποίες παρουσιάζουν διαφορετικό πρότυπο κατανοµής, ανάλογα µε τη φυσιολογική κατάσταση, το βαθµό διαφοροποίησης και τις ιδιαίτερες ανάγκες του κυττάρου σε κάθε περίπτωση [2]. Οι ισοµορφές των ιστονών χωρίζονται σε δύο κύριες κατηγορίες, τις ισοµορφές αντιγραφής, που η συνθεσή τους σχετίζεται µε την αντιγραφή του DNA και τις ισοµορφές αντικατάστασης, που συντίθενται ανεξάρτητα απ αυτή και συναντώνται κυρίως σε µη διαιρούµενα κύτταρα [38]. Οι ισοµορφές αντιγραφής κυριαρχούν σε διαιρούµενα κύτταρα και συντίθεται σε µεγάλες ποσότητες κατά την µεσόφαση, ώστε να καλύπτουν την ανάγκη «πακεταρίσµατος» του νεοσυντιθέµενου DNA. Tα γονίδιά τους δεν περιέχουν ιντρόνια και το mrna τους δεν είναι πολυαδενυλιωµένο. Αντίθετα, οι ισοµορφές αντικατάστασης, συναντώνται σε µη διαιρούµενα κύτταρα και συντίθεται καθ όλη τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου. Τα γονίδιά τους συνήθως περιέχουν ιντρόνια και παράγουν πολυαδενυλιωµένο mrna [2]. Οι παραπάνω ισοµορφές, που η έκφρασή τους συνήθως εξαρτάται από το βαθµό διαφοροποίησης του κυττάρου, «αντικαθιστούν» τις κύριες ισοµορφές των ιστονών στα νουκλεοσώµατα και βρέθηκε πως σχετίζονται µε σηµαντικές λειτουργίες της χρωµατίνης, όπως είναι η ρύθµιση της µεταγραφής, η γονιδιακή καταστολή και η επιδιόρθωση του DNA [6]. 3

18 1.1.1 Ισοµορφές της ιστόνης Η2Α Στα κύτταρα των θηλαστικών έχουν βρεθεί τουλάχιστον τέσσερις ισοµορφές της ιστόνης Η2Α, οι κύριες ισοµορφές Η2Α.1 και Η2Α.2 και οι δευτερεύουσες ισοµορφές Η2ΑΧ και Η2ΑΖ. Η σύνθεση των κύριων ισοµορφών Η2Α.1 και Η2Α.2 βρέθηκε πως εξαρτάται από την αντιγραφή του DNA, ενώ οι Η2ΑΧ και Η2ΑΖ συντίθεται σε µικρότερες ποσότητες καθ όλη τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου [3]. Οι ισοµορφές Η2Α.Ζ και Η2Α.Χ είναι γνωστές από τη δεκαετία του 80, ενώ τη δεκαετία του 90 ανακαλύφθηκαν οι ισοµορφές µακροη2α.1 και µακροη2α.2, ενώ πρόσφατα ανακαλύφθηκε η ισοµορφή Η2Α-Bbd. Οι παραπάνω ισοµορφές, παρόλο που υπάρχουν σε µικρές σχετικά ποσότητες στα κύτταρα, αποδείχθηκε πως είναι ιδαίτερα σηµαντικές για τη δοµή και τη λειτουργία της χρωµατίνης [39-41]. Εκτός από τα θηλαστικά, οµόλογα της Η2Α.Χ έχουν βρεθεί σε πολλούς ζωϊκούς και φυτικούς οργανισµούς καθώς και σε µύκητες και πρωτόζωα. Σε όσους οργανισµούς που µελετήθηκε βρέθηκε πως η καρβοξυτελική περιοχή της Η2Α.Χ περιέχει ένα συντηρηµένο µοτίβο σερίνης-γλυκίνης (µοτίβο SQ), που ακολουθείται πάντα από ένα όξινο αµινοξύ ενώ το καρβοξυτελικό άκρο της πρωτεϊνης καταλήγει σε ένα υδρόφοβο αµινοξύ [3]. Σε πολλούς οργανισµούς, συµπερι-λαµβανοµένων των θηλαστικών, της ζύµης, της δροσόφιλας και του Xenopus, βρέθηκε πως η σερίνη του παραπάνω µοτίβου φωσφορυλιώνεται έπειτα από επίδραση παραγόντων που προκαλούν βλάβες στη διπλή έλικα του DNA [42]. Για λόγους ευκολίας, η συγκεκριµένη φωσφορυλιωµένη µορφή των οµολόγων της Η2ΑΧ ονοµάστηκε γ-η2αχ [3]. Η Η2ΑΧ φωσφορυλιώνεται αµέσως µετά την πρόκληση των βλαβών στο DNA, η τροποποίηση συµβαίνει στις θέσεις του DNA που έχουν υποστεί βλάβη και η κινητική της είναι παρόµοια µε αυτή της επιδιόρθωσής τους [43,44]. Επιπλέον οι πρωτεϊνες που σχετίζονται µε την επιδιόρθωση του DNA εντοπίζονται σε περιοχές µε φωσφορυλιωµένη Η2ΑΧ. Η σερίνη του µοτίβου SQ αποτελεί υπόστρωµα των κινασών PIKK, αναστολή των οποίων πριν την έκθεση του κυττάρου σε ακτινοβολία αποτρέπει τον σχηµατισµό της γ-η2αχ καθώς και την συγκέντρωση στις θέσεις βλάβης των παραγόντων επιδιόρθωσης[45]. Βρέθηκε ότι στη συγκεκριµένη τροποποίηση της Η2ΑΧ εµπλέκονται οι κινάσες DNA-PK, ΑΤΜ και ATR, η απουσία των οποίων προκαλεί µερική απώλεια της ικανότητας φωσφορυλίωσης της Η2ΑΧ. Για να εξηγηθεί η ύπαρξη πολλών και διαφορετικών κινασών της Η2ΑΧ, έχει προταθεί ότι πιθανόν κάθε κινάση 4

19 να σχετίζεται µε επαγωγή της φωσφορυλίωσης από διαφορετικούς παράγοντες. Η γ-η2αχ δεν σχηµατίζεται µόνο κατά την επίδραση εξωτερικών παραγόντων που προκαλούν βλάβες στο DNA, αλλά και σε φυσιολογικές διαδικασίες του κυττάρου που επίσης περιλαµβάνουν διάσπαση της διπλής έλικας, όπως είναι π.χ. ο οµόλογος ανασυνδιασµός και η απόπτωση [45-47]. Η πρωτείνη Η2ΑΖ ταυτοποιήθηκε στα κύτταρα των θηλαστικών το 1980, χαρακτηρίστηκε ως ισοµορφή της Η2Α και αποδείχθηκε η παρουσία της στα νουκλεοσώµατα. Οµόλογα της Η2ΑΖ έχουν βρεθεί σε πολλούς οργανισµούς, όπως η ισοµορφή Η2ΑF στο κοτόπουλο, η H2AvD στη Drosophila, η PHT1 στον S.pombe, η hv1 στον Tetrahynema και οι ισοµορφές ΗΤΑ3 και ΗΤΖ1 στη ζύµη [3]. Η Η2ΑΖ αποτελεί περίπου το 10% της ολικής Η2Α και παίζει σηµαντικό λειτουργικό ρόλο στη χρωµατίνη, χωρίς όµως να µπορεί να αντικαταστήσει πλήρως τις κύριες ισοµορφές της Η2Α. Βρέθηκε ότι η παραπάνω ισοµορφή είναι απαραίτητη για την επιβίωση στη Drososphila, στον Tetrahynema και στον ποντικό [48], ενώ στον Tetrahynema συναντάται στον µεταγραφικά ενεργό µακροπυρήνα και απουσιάζει από τον µικροπυρήνα [49]. Η δοµή των νουκλεοσωµάτων που περιέχουν την ισοµορφή Η2ΑΖ βρέθηκε πως διαφέρει από αυτών που περιέχουν τις κύριες ισοµορφές της Η2Α, έτσι ώστε να διευκολύνεται η πρόσδεση ενός ακόµη µορίου Η2ΑΖ, µε αποτέλεσµα την πιθανή δηµιουργία νουκλεοσωµάτων που περιέχουν δύο µόρια Η2ΑΖ. Η περιοχή πρόσδεσης του διµερούς Η2ΑΖ/Η2Β στο τετραµερές (Η3/Η4)2 εµφανίζει διαφορετική διαµόρφωση, που ως αποτέλεσµα τη µείωση της σταθερότητας του νουκλεοσώµατος [50]. Μελέτες in vitro οδήγησαν στην υπόθεση ότι η παρουσία της συγκεκριµένη ισοµορφής στη χρωµατίνη διευκολύνει την πρόσβαση του µηχανισµού της µεταγραφής στο εκµαγείο του DNA. Στη Drosophila βρέθηκε ότι το επαγόµενο γονίδιο hsp70 είναι εµπλουτισµένο σε Η2ΑΖ και η επιστράτευση της RNA πολυµεράσης ΙΙ και της ΤΒΡ στους προαγωγείς εξαρτάται από το καρβοξυτελικό άκρο της Η2ΑΖ [51]. Στη ζύµη βρέθηκε ότι η Η2ΑΖ ενσωµατώνεται κοντά σε ανενεργές µεταγραφικά περιοχές του γενώµατος και εµποδίζει την εξάπλωσή τους, ενώ το σύµπλοκο που ενσωµατώνει στα νουκλεοσώµατα διµερή Η2ΑΖ/Η2Β περιέχει την υδρολάση του ΑΤΡ Swr1, µέλος της οικογένειας υδρολασών SWI/SNF, που συναντώνται στα σύµπλοκα αναδιαµόρφωσης της χρωµατίνης [3]. 5

20 Την δεκαετία του 90 ανακαλύφθηκαν άλλες δύο ισοµορφές, οι οποίες εµφανίζουν χαµηλή οµολογία µε τις κύριες ισοµορφές της Η2Α και ονοµάστηκαν µάκροη2α1 και µάκροη2α2 [39,40]. Το αµινοτελικό άκρο της µάκροη2α εµφανίζει κατά 64% οµολογία µε το πλήρες µήκος της Η2Α και ακολουθείται από µία µεγάλη µη ιστονική περιοχή, που αποτελεί περίπου το 57% της πρωτεϊνης [52]. Η µάκροη2α εντοπίζεται στο ανενεργό µεταγραφικά χρωµόσωµα Χ των θηλαστικών και µένει συνδεδεµένη στο χρωµόσωµα αυτό κατά τη µετάφαση. Επιπλέον, συναντάται και σε άλλες χρωµοσωµικές περιοχές εκτός από το χρωµόσωµα Χ, γεγονός που ίσως να υποδηλώνει ένα γενικότερο ρόλο της στην καταστολή της γονιδιακής έκφρασης [53]. Πριν λίγα χρόνια ανακαλύφθηκε στα θηλαστικά µία ακόµη ισοµορφή της Η2Α, η Η2Α-Bbd, η οποία εµφανίζει µόνο κατά 42% οµολογία µε την Η2Α. Σε αντίθεση µε την µάκροη2α, βρέθηκε πως απουσιάζει από το µεταγραφικά ανενεργό χρωµόσωµα Χ, ενώ εντοπίζεται µαζί µε τις ακετυλιωµένες µορφές της Η4. Εξαιτίας των παραπάνω παρατηρήσεων έχει προταθεί ότι η Η2Α-Bbd σχετίζεται µε την ενεργή µεταγραφικά χρωµατίνη, ο ακριβής ρόλος της όµως δεν έχει ακόµη διευκρινιστεί [41] Ισοµορφές της ιστόνης Η2Β Στους περισσότερους ζωικούς οργανισµούς βρέθηκε πως υπάρχουν τουλάχιστον δύο κύριες ισοµορφές της Η2Β [1]. Στον άνθρωπο, καθώς και σε άλλα θηλαστικά, έχουν βρεθεί τρείς ισοµορφές της Η2Β, µία από τις οποίες, η Η2Β.1, συντίθεται ανεξάρτητα από την αντιγραφή του DNA [2]. Στα φυτά υπάρχουν επίσης δύο ισοµορφές της Η2Β, η Η2Β.1 και η Η2Β.2, οι οποίες διαφέρουν σηµαντικά, τόσο µεταξύ τους, όσο και µε τις αντίστοιχες ισοµορφές των ζώων. Συγκεκριµένα, έχει βρεθεί πως οι καρβοξυτελικές τους περιοχές είναι εξαιρετικά συντηρηµένες, ενώ οι αµινοτελικές τους περιοχές είναι µεγαλύτερες από αυτές των ισοµορφών που συναντώνται στους ζωικούς οργανισµούς [54]. 6

21 1.1.3 Ισοµορφές της ιστόνης Η3 Οι ισοµορφές της ιστόνης Η3 των θηλαστικών µπορούν να χωριστούν σε τρείς υποτάξεις. Από αυτές, οι Η3.1 και Η3.2 αποτελούν τις κύριες ισοµορφές και η σύνθεσή τους εξαρτάται από την αντιγραφή του DNA. Αντίθετα, η ισοµορφή Η3.3, η οποία έχει συσχετισθεί µε την µεταγραφικά ενεργή χρωµατίνη, συντίθεται και ενσωµατώνεται στη χρωµατίνη καθ όλη τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου, αντικαθιστώντας τις κύριες ισοµορφές της Η3. Αντίστοιχο ρόλο στα φυτά βρέθηκε πως παίζει η ισοµορφή Η3.2, η οποία εκτός από τα παραπάνω, χαρακτηρίζεται και από υψηλό επίπεδο ακετυλίωσης. Εκτός από τις ισοµορφές αντικατάστασης, στα κύτταρα των ευκαρυωτικών οργανισµών υπάρχει και η ισοµορφή CENP-A, η οποία επίσης συντίθεται ανεξάρτητα από την αντιγραφή του DNA και αντικαθιστά την Η3 στην χρωµατίνη του κεντροµέρους. Βρέθηκε ότι η CENP-A των θηλαστικών και τα οµόλογά της στους άλλους οργανισµούς, που συνολικά ονοµάστηκαν CenH3s, είναι απαραίτητες για τον σωστό σχηµατισµό και τη διατήρηση της δοµής του κεντροµέρους και του κινητοχώρου [4-6]. Η κυριότερη ισοµορφή αντικατάστασης της Η3 στα κύτταρα των ζωϊκών οργανισµών είναι η Η3.3. Η Η3.3 διαφέρει από τις κύριες ισοµορφές της Η3 µόνο σε τέσσερα αµινοξέα και ενσωµατώνεται στη χρωµατίνη καθ όλη τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου, ανεξάρτητα από την αντιγραφή του DNA. Επιπλέον βρέθηκε ότι η Η3.3 ενσωµατώνεται κυρίως σε περιοχές της ευχρωµατίνης in vivo, ενώ κατά την επαγωγή της µεταγραφής αντικαθιστά στα νουκλεοσώµατα την προϋπάρχουσα, µεθυλιωµένη στη Lys9 Η3, η οποία χαρακτηρίζει περιοχές της ετεροχρωµατίνης. Οι παραπάνω παρατηρήσεις οδήγησαν στο συµπέρασµα ότι η παρουσία της ισοµορφής Η3.3 αποτελεί χαρακτηριστικό της ενεργούς µεταγραφικά χρωµατίνης, ενώ πιθανόν να συµµετέχει και στην επιγενετική διατήρηση της παραπάνω κατάστασης [4]. Στη µηδική, καθώς και σε πολλά άλλα µονοκοτυλίδονα και δικοτυλίδονα φυτά, ταυτοποιήθηκε η ισοµορφή Η3.2, η οποία σε αντίθεση µε την ισοµορφή Η3.1, συντίθεται ανεξάρτητα από την αντιγραφή του DNA και χαρακτηρίζεται από υψηλό επίπεδο µετα-µεταφραστικής ακετυλίωσης. Η µελέτη της σύνθεσης και της σταθερότητας της ισοµορφής αυτής έδειξε ότι αποτελεί µία ισοµορφή αντικατάστασης, αντίστοιχη της Η3.3 των ζωϊκών οργανισµών, ενώ αργότερα 7

22 αποδείχθηκε ότι το επίπεδο και οι θέσεις ακετυλίωσης της Η3.2, σχετίζονται µε την µεταγραφικά ενεργή χρωµατίνη [5,55-57]. Η ισοµορφή CENP-A είναι διατηρηµένη στους ευκαρυωτικούς οργανισµούς, εντοπίζεται αποκλειστικά στην χρωµατίνη του κεντροµερούς και σχετίζεται µε τον σχηµατισµό και τη διατήρηση της συγκεκριµένης δοµής [58]. Η CENP-A ανακαλύφθηκε αρχικά στα κεντροµερή των θηλαστικών, όµως στη συνέχεια βρέθηκαν οµόλογά της σε µία ποικιλία οργανισµών, συµπεριλαµβανοµένων της ζύµης, της Drosophila και ορισµένων φυτών, που συνολικά ονοµάστηκαν CenH3s. Η αλληλουχία της καρβοξυτελικής περιοχής της CENP-A εµφανίζει 62% οµολογία µε αυτήν της Η3, περιέχει την περιοχή της ιστονικής αναδίπλωσης η οποία είναι απαραίτητη για την ενσωµάτωσή της στην περιοχή του κεντροµερούς. Στον άνθρωπο και στη ζύµη βρέθηκε ότι η παρουσία της CENP-A και της Cse4 αντίστοιχα, είναι απαραίτητη για την επιβίωση, ενώ απάλειψη της στο ποντίκι οδηγεί σε ατέλειες στην οργάνωση του κεντροµερούς και σε θνησιµότητα. Έχει βρεθεί ότι η CENP-A µπορεί να αντικαταστήσει την Η3 στα νουκλεοσώµατα in vitro και in vivo [59]. Στη Drosophila αποδείχθηκε ότι η Cid, το οµόλογο της CENP-A, επιστρατεύεται επιλεκτικά στη χρωµατίνη του κεντροµερούς, ενώ στην περιοχή αυτή δεν εντοπίζονται οι κύριες ισοµορφές της Η3. Επιπλέον, η απουσία της εµποδίζει την σωστή σύνδεση των υπολοίπων πρωτεϊνών του κεντροµερούς, και πολλών πρωτεϊνών του κινητοχώρου, ενώ είναι ικανή για την έναρξη της επιστράτευσης ορισµένων τουλάχιστον από αυτών. Η CENP-A δεν συντίθεται ταυτόχρονα µε την αντιγραφή του DNA του κεντροµερούς, στο τέλος της µεσόφασης, αλλά ενσωµατώνεται στη χρωµατίνη κατά τη φάσης G2 του κυτταρικού κύκλου [60-62]. 8

23 1.1.4 Ισοµορφές της συνδετικής ιστόνης Η1 Η συνδετική ιστόνη Η1 εµφανίζει την µεγαλύτερη ετερογένεια από όλες τις ιστόνες. Για παράδειγµα, στον άνθρωπο έχουν ταυτοποιηθεί οκτώ ισοµορφές της Η1 (Η1.1-5, Η1 ο, Η1t, και Η1x) [2]. Κάθε µία από αυτές αποτελείται από ένα βραχύ αµινοτελικό άκρο, µία συντηρηµένη, σφαιρική κεντρική περιοχή και ένα µεγάλο, θετικά φορτισµένο καρβοξυτελικό άκρο. Η σφαιρική περιοχή της συνδετικής ιστόνης εµπλέκεται στις αλληλεπιδράσεις της µε το DNA, ενώ οι περιοχές των άκρων είναι απαραίτητες στη συµπύκνωση των ινιδίων της χρωµατίνης. Η τριµερής αυτή δοµή συναντάται σε όλους τους ευκαρυωτικούς οργανισµούς εξαίρεση τον Tetrahynema, όπου απουσιάζει η κεντρική περιοχή της πρωτεϊνης και τη ζύµη, όπου υπάρχουν δύο τέτοιες περιοχές. Παρόλο που ο αριθµός των ισοµορφών της συνδετικής ιστόνης Η1 είναι µεγαλύτερος από αυτόν των νουκλεοσωµικών ιστονών, η ετερογένεια αυτή είναι συντηρηµένη µεταξύ των διαφόρων οργανισµών, γεγονός που υποδηλώνει ότι πιθανόν οι διάφορες ισοµορφές να έχουν και ξεχωριστές ιδιότητες [2,63]. Εκτός από τις κύριες ισοµορφές της Η1, ο αριθµός των οποίων ποικίλει µεταξύ των οργανισµών, υπάρχουν και ορισµένες που η σύνθεσή τους εξαρτάται από το αναπτυξιακό στάδιο του οργανισµού, από τον βαθµό διαφοροποίησης του κυττάρου, από εξωκυτταρικά µηνύµατα ή που συναντώνται σε συγκεκριµένους κυτταρικούς τύπους [7]. Τουλάχιστον δύο ισοµορφές της Η1 µπορούν να χαρακτηριστούν ως απαραίτητες για την διαφοροποίηση, η Η1 0 και η Η5. Η Η1 ο είναι ισοµορφή αντικατάστασης της Η1 που εκφράζεται κυρίως σε διαφοροποιηµένα κύτταρα και η σύνθεσή της είναι ανεξάρτητη της αντιγραφής του DNA. Σε αντίθεση µε την Η1 0, η οποία έχει βρεθεί σε ευρύ φάσµα ζωϊκών και φυτικών οργανισµών, η Η5 συναντάνται µόνο στα ώριµα ερυθροκύτταρα των πτηνών. Στα πτηνά δεν έχει ανιχνευθεί πρωτεϊνη αντίστοιχη της Η1 0 και δεδοµένου ότι η Η5 υπάρχει µόνο στα ερυθροκύτταρα, έχει προταθεί ότι πιθανόν κάποια από τις υπόλοιπες ισοµορφές της Η1 να σχετίζεται µε την διαφοροποίηση των υπολοίπων κυττάρων [7-9]. Άλλες ειδικές ισοµορφές της Η1 είναι οι Η1 του σταδίου αυλάκωσης που έχουν βρεθεί στα ωοκύτταρα πολλών ζωικών οργανισµών, όπως είναι η CS H1 στον αχινό, οι Η1x, Η1Μ και Β4 στα αµφίβια και η Η1 00 στον ποντικό, οι οποίες αποτελούν τις µεγαλύτερες σε µέγεθος συνδετικές ιστόνες και είναι εξελικτικά διατηρηµένες. Έχει βρεθεί ότι τα γονίδια των παραπάνω ισοµορφών περιέχουν ιντρόνια και το mrna τους είναι πολυαδενυλιωµένο, ενώ έχει προταθεί ότι η H1x στα αµφίβια 9

24 αποτελεί µία µητρική, αποθηκευτική ισοµορφή της Η1, απαραίτητη κατά τις πρώτες διαιρέσεις της αυλάκωσης [64-66]. Η H1t είναι µία ισοµορφή της Η1 η οποία εκφράζεται µόνο στα σπερµατογονικά κύτταρα πολλών ειδών σπονδυλωτών και ασπονδύλων [67]. Πιστεύεται πως η H1t ανήκει στις ισοµορφές της Η1 που η σύνθεσή τους εξαρτάται από την αντιγραφή του DNA και βρέθηκε ότι αποτελεί το 50% της ολικής Η1 στις επιµηκυνούµενες σπερµατίδες µέχρι την αντικατάσταση των ιστονών από τις πρωταµίνες [1]. Στα φυτά έχουν βρεθεί τρείς ισοµορφές της Η1 η σύνθεση των οποίων επάγεται σε συνθήκες ξηρασίας, η Η1-3 στο Arabidopsis, η Η1-S στη ντοµάτα και η H1-D στο L. penellii [10,68-70]. Η ισοµορφή H1-C που βρέθηκε στον καπνό, δεν επάγεται σε συνθήκες έλλειψης νερού και συνεπώς δεν ανήκει στην παραπάνω κατηγορία [68]. Ο ρόλος των ισοµορφών αυτών δεν έχει ακόµη διευκρινιστεί, παρόλο που έχει µελετηθεί η υποέκφραση και η υπερέκφραση των γονιδίων τους. Κατά την υποέκφραση του γονιδίου της H1-C στο Arabidopsis σε συνθήκες έλλειψης νερού, δεν παρατηρήθηκαν φαινοτυπικές διαφορές από τους µάρτυρες [70], ενώ για την ισοµορφή H1-S της ντοµάτας έχει προταθεί ότι µπορεί να παίζει δοµικό ρόλο στην προστασία του DNA από βλάβες που σχετίζονται µε την καταπόνηση εξαιτίας της ξηρασίας, ή να παίζει λειτουργικό ρόλο στη ρύθµιση της γονιδιακής έκφρασης [69]. Έχει βρεθεί ότι οι ισοµορφές της Η1 που εκφράζονται στα πρώτα στάδια της ανάπτυξης των θηλαστικών και των αµφιβίων συντίθενται στο ωοκύτταρο, όπου αποθηκεύονται για να χρησιµοποιηθούν κατά την εµβρυογένεση, ενώ οι ισοµορφές που συναντώνται στα σωµατικά κύτταρα συντίθονται στο αναπτυσσόµενο έµβρυο από µητρικά κληρονοµούµενο mrna το οποίο µεταφράζεται µετά την γονιµοποίηση. Με την ολοκλήρωση των πρώτων αναπτυξιακών σταδίων, η σύνθεση των κύριων ισοµορφών της Η1 γίνεται παράλληλα µε τη σύνθεση του DNA κατά την µεσόφαση, ενώ η σύνθεση των ισοµορφών που σχετίζονται µε τα διαφοροποιηµένα κύτταρα ή που συναντώνται σε εξειδικευµένους ιστούς, εξαρτάται από αντίστοιχους ρυθµιστικούς µηχανισµούς [8]. Οι συνδετικές ιστόνες παίζουν άµεσο ρόλο στην σταθεροποίηση των νουκλεοσωµάτων και των ανώτερων δοµών τις χρωµατίνης και επηρεάζουν την µεταγραφή περιορίζοντας την πρόσβαση µεταγραφικών παραγόντων στο εκµαγείο του DNA. Η µεταβολή της σύνδεσης της Η1 στα νουκλεοσώµατα πιθανόν να είναι 10

25 απαραίτητη για την ενεργοποίηση της µεταγραφής ορισµένων γονιδίων και εποµένως, οι ποιοτικές ή ποσοτικές µεταβολές στη δοµή της χρωµατίνης που επιφέρει η πρόσδεση των διαφόρων ισοµορφών πιθανόν να παρέχουν µία εξήγηση της λειτουργικής ετερογένειας των συνδετικών ιστονών [71]. Το πρότυπο έκφρασης των διαφόρων ισοµορφών της Η1 διαφέρει κατά την ανάπτυξη των οργανισµών και την διαφοροποίηση των κυττάρων. Επίσης, κατά την διάρκεια του κυτταρικού κύκλου είναι διαφορετικός ο ρυθµός σύνθεσης και αποικοδόµησής τους καθώς και το επίπεδο φωσφορυλίωσής τους. Κάθε ισοµορφή εµφανίζει διαφορετική ικανότητα συµπύκνωσης της χρωµατίνης και τέλος, η κατανοµή των διαφόρων ισοµορφών στη χρωµατίνη δεν είναι τυχαία αλλά βρίσκεται σε αντιστοιχία µε την παρουσία ή µη ενεργών γονιδίων [72,73]. Στα σπονδυλωτά βρέθηκε ότι η Η1 εµπλέκεται στη ρύθµιση της έκφρασης γονιδίων που σχετίζονται µε την διαφοροποίηση των κυττάρων και την ανάπτυξη του οργανισµού [8]. Στο Xenopus αποδείχθηκε ότι η Η1 συµµετέχει στη ρύθµιση της έκφρασης των γονιδίων των 5S rrna στα πρώτα στάδια της εµβρυϊκής ανάπτυξης, ενώ έχει παρατηρηθεί ότι η καταστολή της έκφρασης των γονιδίων που ρυθµίζουν την διαφοροποίηση του µεσοδέρµατος εξαρτάται από την Η1. Έχει προταθεί ότι η επιλεκτική καταστολή των γονιδίων των 5S rrna πιθανόν να οφείλεται στον ρόλο της Η1 στον καθορισµό της θέσης των νουκλεοσωµάτων πάνω στο DNA. Παρόλα αυτά, η έκφραση της µεγάλης πλειοψηφίας των απαραίτητων για την επιβίωση του οργανισµού γονιδίων δεν επηρεάζεται απουσία της Η1 [74]. Έχει επίσης προταθεί ότι η σηµαντική µείωση της ποσότητας της ολικής Η1 επιφέρει σοβαρές µεταβολές στη δηµιουργία και σταθερότητα των ανώτερων δοµών της χρωµατίνης, επηρεάζοντας άµεσα την ανάπτυξη των οργανισµών [38]. Βρέθηκε όµως in vitro ότι κύτταρα που δεν περιέχουν την ιστόνη Η1 δεν διαφέρουν από τα κανονικά στην ικανότητα σχηµατισµού και συµπύκνωσης της χρωµατίνης [75], γεγονός που επιβεβαιώθηκε και in vivo µε τη δηµιουργία µεταλλαγµάτων από τα οποία απουσιάζει η Η1. Τουλάχιστον σε τέσσερις τέτοιους οργανισµούς, τον Tetrahynema, τον Ascobolus, τον Aspergillus και τον S.cerevisiae, δεν παρατηρήθηκαν σηµαντικές µεταβολές στον κυτταρικό κύκλο, γεγονός που οδήγησε στο συµπέρασµα πως οι συνδετικές ιστόνες δεν πρέπει να παίζουν γενικό ρόλο στην καταστολή της µεταγραφής, αλλά πιθανόν να συµµετέχουν στη ρύθµιση της έκφρασης ορισµένων µόνο γονιδίων [7]. Επιπλέον, η απουσία κάθε µίας από τις ισοµορφές 11

26 της Η1 πιστεύεται πως αναπληρώνεται µε αύξηση της έκφρασης των εναποµείναντων ισοµορφών, µε αποτέλεσµα τη διατήρηση της κανονικής στοιχειοµετρίας της ολικής Η1 στα νουκλεοσώµατα [38]. Στον ποντικό απάλειψη του γονιδίου κάθε µίας από τις ισοµορφές Η1 0, Η1.1 και Η1t δεν οδήγησε σε φαινοτυπικές διαφορές [76-78]. Για παράδειγµα, η απουσία της Η1 0 δεν επηρέασε την διαφοροποίηση των κυττάρων, ούτε την εµβρυϊκή ανάπτυξη, ενώ η αναλογία της ολικής Η1 έναντι των νουκλεοσωµάτων διατηρείται σταθερή σε όλους τους ιστούς, υποδηλώνοντας ότι και σ αυτή την περίπτωση, η έλλειψη µίας ισοµορφής αναπληρώνεται από αυξηµένη παρουσία των υπολοίπων. Αντίθετα, ταυτόχρονη απάλειψη των γονιδίων που κωδικοποιούν τις H1c, H1d και H1e στον ποντικό οδηγεί σε µείωση της αναλογίας της ολικής Η1 έναντι των νουκλεοσωµάτων στο µισό, µε αποτέλεσµα τον θάνατο κατά την εµβρυογένεση [78]. Στον καπνό µειωµένη έκφραση των δύο κύριων ισοµορφών Η1Α και Η1Β επηρεάζει την αναπαραγωγική ικανότητα των φυτών, προκαλώντας ανωµαλίες στο σχηµατισµό των ανθέων και στη σποριογένεση. Παρόλο που οι αποστάσεις µεταξύ των νουκλεοσωµάτων δεν επηρεάζονται από το µειωµένο επίπεδο της Η1, παρατηρείται µειωµένη συµπύκνωση των χρωµοσωµάτων [79]. Παρόλα αυτά, υπάρχουν στοιχεία που υποδηλώνουν την ύπαρξη ξεχωριστών, µη αλληλοεπικαλυπτόµενων ρόλων των διαφόρων ισοµορφών της Η1. Έχει προταθεί ότι το είδος της ισοµορφής που θα εκφραστεί έχει σχέση µε την ικανότητα πολλαπλασιασµού των κυττάρων και η µεταβολή του ρυθµού των κυτταρικών διαιρέσεων ίσως να είναι η κύρια αιτία σύνθεσης διαφορετικών ισοµορφών της Η1 [7]. Για παράδειγµα, η αναλογία της ισοµορφής Η1 0 σε σχέση µε την ολική Η1 είναι αυξηµένη σε µη διαιρούµενα κύτταρα ή σε κύτταρα µε χαµηλό ρυθµό διαιρέσεων, όµως αύξηση του ρυθµού κυτταροδιαιρέσεων επιφέρει µείωση της αναλογίας της Η1 0. Αύξηση της συχνότητας των διαιρέσεων απαιτεί πιο συχνή αναδιαµόρφωση της χρωµατίνης, συνεπώς λιγότερο σταθερή δοµή, που πιθανόν να επιτυγχάνεται µε την πρόσδεση συγκεκριµένων ισοµορφών της Η1 [7]. Έχει βρεθεί in vitro ότι η σταθερότητα της πρόσδεσης των διαφόρων ισοµορφών της Η1 ποικίλει, όµως είναι βέβαιο ότι η σχέση µεταξύ ισοµορφών και σταθερότητας της χρωµατίνης πρέπει είναι πιο περίπλοκη in vivo [80]. Σύµφωνα µε µία άλλη υπόθεση η εµφάνιση των ισοµορφών της Η1 κατά την εξέλιξη οφείλεται απλά σε ουδέτερους πολυµορφισµούς που προέκυψαν έπειτα 12

27 από διπλασιασµό των γονιδίων, οπότε η χρονική στιγµή στην οποία εκφράζεται η κάθε ισοµορφή έχει περισσότερη σηµασία απ ότι η αλληλουχία της. Είναι εποµένως πιθανό τα γονίδια που κωδικοποιούν τις ισοµορφές της Η1 να υπάρχουν για να εξασφαλίζουν την έκφρασή της την κατάλληλη χρονική στιγµή και σε κάθε στάδιο της ζωής του οργανισµού, ενώ η πρωτοταγής αλληλουχία τους να µη έχει µεγάλη σηµασία, όπως φαίνεται και από το γεγονός ότι η απουσία κάθε µίας συγκεκριµένης ισοµορφής αναπληρώνεται από την υπερέκφραση των υπολοίπων [7] Ρόλος των ισοµορφών των ιστονών Από όλα τα παραπάνω φαίνεται ότι η ετερογένεια των ιστονών παίζει σηµαντικό ρόλο σε πολλές και σηµαντικές λειτουργίες της χρωµατίνης. Η σύνθεση των περισσότερων ισοµορφών είναι στενά συνδεδεµένη µε την ανάπτυξη του οργανισµού καθώς και µε τον βαθµό διαφοροποίησης του κυττάρου. Πέρα από τις κύριες ισοµορφές των ιστονών, βρέθηκε πως και οι ισοµορφές αντικατάστασης συµµετέχουν σε πολλές διαδικασίες που συµβαίνουν στην χρωµατίνη. Υπάρχουν ισοµορφές που σχετίζονται µε την ενεργή µεταγραφικά χρωµατίνη, όπως η Η2ΑΖ [3], η Η3.3 των θηλαστικών [4] και αντίστοιχα η Η3.2 των φυτών [5], ενώ άλλες ισοµορφές εµπλέκονται στην καταστολή της γονιδιακής έκφρασης, όπως η µακροη2α [42], στην επιδιόρθωση βλαβών του DNA, όπως η Η2ΑΧ [43] ή στον σχηµατισµό εξειδικευµένων χρωµατινικών δοµών, όπως η CENP- A [4]. Ορισµένες ισοµορφές σχετίζονται µε τα πρώτα αναπτυξιακά στάδια του οργανισµού, όπως τα οµόλογα της Η1x, άλλες συναντώνται σε πλήρως διαφοροποιηµένα κύτταρα, όπως η Η5 των πτηνών [7], ενώ άλλες υπάρχουν αποκλειστικά σε συγκεκριµένους ιστούς, όπως οι Η1t, η ΤΗ2Α, ΤΗ2Β, και ΤΗ3 στα ζώα [2] και οι gh2a, gh2b και gh3 στα φυτά [81]. Υπάρχουν πολλές υποθέσεις αναφορικά µε την ύπαρξη των ισοµορφών των ιστονών και των γονιδίων που τις κωδικοποιούν [63,72]. Πρώτα απ όλα, η ανάγκη για µεγάλες ποσότητες ιστονών σε συγκεκριµένες χρονικές στιγµές, όπως για παράδειγµα κατά την αντιγραφή του DNA και το «πακετάρισµά» του στα νουκλεοσώµατα κατά την µεσόφαση, οδηγεί στην ανάγκη για αυξηµένη έκφραση των γονιδίων των ιστονών, κάτι που µπορεί να επιτευχθεί µε την ύπαρξη πολλών, ενεργών µεταγραφικά µονάδων µέσα στο γονιδίωµα. Σ αυτή την 13

28 περίπτωση, η ετερογένεια στο επίπεδο της πρωτεϊνης πιθανόν να έχει δευτερεύουσα σηµασία. Επέκταση της παραπάνω υπόθεσης περιλαµβάνει και ετερογένεια στο επίπεδο της ρύθµισης, όπου η ύπαρξη πολλαπλών γονιδίων, µε διαφορετικό πρότυπο έκφρασης κατά την διαφοροποίηση του κυττάρου, σε εξειδικευµένους ιστούς ή/και υπό την επίδραση συγκεκριµένων συνθηκών, πιθανόν να είναι απαραίτητη για να διασφαλιστεί η παρουσία επαρκών ποσοτήτων ιστονών σε κάθε περίπτωση. Αυτό πιθανόν να εξηγεί και την ύπαρξη των ισοµορφών αντικατάστασης στους ανώτερους ευκαρυωτικών οργανισµούς, οι οποίες εκφράζονται καθ όλη τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου. Η ετερογένεια στην αλληλουχία της πρωτείνης σ αυτή την περίπτωση θα έπρεπε να είναι περιορισµένη, όµως πιθανόν οι ισοµορφές που εµφανίζουν την µεγαλύτερη σταθερότητα να έχουν επιλεγεί εξελικτικά. Σύµφωνα µε µία άλλη υπόθεση, οι ισοµορφές των ιστονών υπάρχουν για να εξασφαλίζουν τον σχηµατισµό συγκεκριµένων και διακριτών χρωµατινικών δοµών. Κάθε ισοµορφή συµµετέχει στον σχηµατισµό νουκλεοσωµάτων µε συγκεκριµένη αρχιτεκτονική, η οποία πιθανόν να είναι απαραίτητη σε διακριτές λειτουργίες της χρωµατίνης, όπως η µεταγραφή, η γονιδιακή καταστολή, η αντιγραφή και ο ανασυνδιασµός του DNA. Σ αυτή την περίπτωση, η αλληλουχία κάθε ισοµορφής πιθανόν να παίζει κρίσιµο ρόλο στην δηµιουργία και διατήρηση της συγκεκριµένης δοµής. Τέλος, δεν αποκλείεται η περίπτωση και οι δύο παραπάνω αναγκαιότητες, δηλαδή της εξασφάλισης επαρκών ποσοτήτων ιστονών σε κάθε φάση του κυτταρικού κύκλου και της δηµιουργίας διακριτών χρωµατινικών δοµών, να καθορίζουν συνεργιστικά την σύνθεση των ισοµορφών των ιστονών [38]. 14

29 1.1.6 Τα γονίδια των ιστονών Τα γονίδια που κωδικοποιούν τις ιστόνες έχουν κλωνοποιηθεί και µελετηθεί σε µία ποικιλία ζωικών και φυτικών οργανισµών [1,2,82-85]. Οι πρώτες µελέτες είχαν οδηγήσει στο συµπέρασµα ότι τα γονίδια αυτά δεν περιέχουν ιντρόνια και βρίσκονται οργανωµένα σε διαδοχικά επαναλαµβανόµενες, διατηρηµένες οµάδες µέσα στο γονιδίωµα. Η έκφρασή τους θεωρήθηκε εξαρτώµενη από το στάδιο ανάπτυξης και το mrna τους µη πολυαδενυλιωµένο. Αργότερα όµως αποδείχθηκε ότι η οργάνωσή τους ποικίλει από διαδοχικές, επαναλαµβανόµενες οµάδες γονιδίων µέχρι τυχαία κατανεµηµένα στο γονιδίωµα, µεµονωµένα αντίγραφα γονιδίων. Το πρότυπο οργάνωσής τους µπορεί να διαφέρει σηµαντικά µεταξύ στενά συγγενικών οργανισµών, ενώ αποδείχθηκε ότι ακόµη και στο ίδιο γονιδίωµα µπορούν να συνυπάρχουν οµαδοποιήσεις γονιδίων και µεµονωµένα γονίδια. Τα γονίδια των ιστονών µπορούν να χωριστούν σε τρείς κύριες κατηγορίες: στα γονίδια που η έκφρασή τους εξαρτάται από την αντιγραφή του DNA, στα γονίδια που εκφράζονται σε όλη τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου και σ αυτά που εκφράζονται σε συγκεκριµένους ιστούς [2]. Έχει βρεθεί πως γονίδια της πρώτης κατηγορίας δεν περιέχουν ιντρόνια και κωδικοποιούν µη πολυαδενυλιωµένα mrna, το 3 άκρο των οποίων περιέχει ένα µοτίβο στελεχιαίου βρόγχου, ακολουθούµενο από µία αλληλουχία πλούσια σε πουρίνες. Η έκφραση των παραπάνω γονιδίων περιορίζεται στα διαιρούµενα κύτταρα και συµβαίνει κατά την µεσόφαση. Αντίθετα, τα γονίδια που κωδικοποιούν τις ισοµορφές αντικατάστασης περιέχουν ιντρόνια και κωδικοποιούν πολυαδενυλιωµένα mrna, τα οποία φέρουν στο 5 και στο 3 άκρο τους µεγάλες, µη µεταφραζόµενες περιοχές. Τα γονίδια αυτά εκφράζονται σε χαµηλά, αλλά σταθερά επίπεδα καθ όλη τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου, κυρίως σε µη διαιρούµενα κύτταρα. Τέλος, υπάρχουν γονίδια που η έκφρασή τους περιορίζεται σε συγκεκριµένους ιστούς, τα οποία δοµικά βρέθηκε πως µοιάζουν µε αυτά που η έκφρασή τους εξαρτάται από την αντιγραφή (Εικόνα 1.1.1). Σε γενικές γραµµές, τα γονίδια των ιστονών που εξαρτώνται από την αντιγραφή βρίσκονται συγκεντρωµένα σε οµάδες, ενώ τα γονίδια που εκφράζονται ανεξάρτητα από την αντιγραφή, συνήθως εντοπίζονται µεµονωµένα, σε ξεχωριστές θέσεις µέσα στο γονιδίωµα. Τέλος, υπάρχουν γονίδια τα οποία εντοπίζονται τόσο σε οµάδες γονιδίων, όσο και σε µεµονωµένες θέσεις και το mrna τους µπορεί να µοιάζει είτε µε αυτό των 15

30 εξαρτώµενων, είτε µε αυτό των ανεξάρτητων από την αντιγραφή γονιδίων [1,2]. Έχει προταθεί ότι η συγκέντρωση των γονιδίων των ιστονών σε οµάδες πιθανόν να βοηθά στην συντονισµένη παραγωγή µεγάλων ποσοτήτων mrna ιστονών κατά τη µεσόφαση, ώστε η σύνθεση των ιστονών να ανταποκριθεί στην ανάγκη να «πακετάρουν» το νεοσυντιθέµενο DNA. Η ανάγκη αυτή δεν υπάρχει για τα γονίδια που κωδικοποιούν ισοµορφές αντικατάστασης, τα οποία βρίσκονται διασκορπισµένα. Ο µεµονωµένος εντοπισµός των παραπάνω γονιδίων πιθανόν να επιτρέπει την συνεχή έκφρασή τους ακόµη και όταν, κατά την τελική διαφοροποίηση του κυττάρου, καταστέλλεται η έκφραση των γονιδίων στις περιοχές που πιθανόν να περιέχουν εξαρτώµενα από την αντιγραφή γονίδια ιστονών [1,2]. Εικόνα Η δοµή των mrna των τριών κατηγοριών ισοµορφών των ιστονών: Α. mrna ισοµορφής εξαρτώµενης από την αντιγραφή του DNA που δεν περιέχει ιντρόνια και το 3 άκρο του δεν είναι πολυαδενυλιωµένο. Β. mrna ισοµορφής ανεξάρτητης από την αντιγραφή του DNA, το οποίο περιέχει µεγαλύτερες 5 και 3 µη µεταφραζόµενες περιοχές, µπορεί να περιέχει ιντρόνια ή/και µοτίβο στελεχιαίου βρόγχου και το 3 άκρο του είναι πολυαδενυλιωµένο. Γ. mrna ισοµορφής µη εξαρτώµενης από την αντιγραφή το οποίο µπορεί να υποστεί διαφορική επεξεργασία και να µοιάζει µε καθένα από τα mrna των άλλων δύο κατηγοριών [The structure of mrna from three distinct types of histone variants: A. replication variant s mrna, lacking introns and 3 terminal non-polyadenylated B. replacement variant s mrna, containing large 5 and 3 domains, introns and loop motif and polyadenylated 3 terminal C. replication-independent variant s mrna which can undergo differential splicing] 16

31 1.1.7 Πρωταµίνες Ο όρος «πρωταµίνη» εισήχθη στα τέλη του 19 ου αιώνα από τον J.F. Miescher για να περιγράψει την «οργανική βάση» που βρέθηκε στο σπέρµα του σολωµού, ενώ περίπου είκοσι χρόνια αργότερα αποσαφηνίστηκε η πρωτεϊνική φύση των πρωταµινών [1]. Στα χρόνια που ακολούθησαν, οι πρωταµίνες και γενικότερα οι βασικές πρωτεϊνες του πυρήνα των σπερµατοζωαρίων, µελετήθηκαν σε πολλούς ζωϊκούς οργανισµούς και υπάρχουν πολλά στοιχεία για την παρουσία, την αποµόνωση και τον χαρακτηρισµό των πρωτεϊνών αυτών [1,86,87]. Με βάση τις παραπάνω µελέτες, οι πρωταµίνες είναι εξαιρετικά θετικά φορτισµένες πρωτεϊνες, στις οποίες κυριαρχούν τα αµινοξέα αργινίνη, λυσίνη και ιστιδίνη. Εκτός όµως από τη σύστασή τους, οι πρωταµίνες εµφανίζουν ελάχιστη εξελικτική διατήρηση µεταξύ των οργανισµών τόσο σε γονιδιακό όσο και σε πρωτεϊνικό επίπεδο. Για παράδειγµα, παρατηρείται µία σταδιακή αύξηση στο µέγεθος των πρωταµινών κατά την εξέλιξη των σπονδυλωτών, ενώ στα θηλαστικά υπάρχει και µία δεύτερη ισοµορφή, η Ρ2, η αλληλουχία της οποίας διαφέρει σηµαντικά από αυτή της κύριας ισοµορφής Ρ1 και ο ρόλος της παραµένει αδιευκρίνιστος. Η ποικιλοµορφία που παρατηρείται στις αλληλουχίες των πρωταµινών στους διάφορους οργανισµούς εκτός από την εξελικτική της σηµασία, παίζει ρόλο και στη λειτουργία τους, επηρεάζοντας την σταθερότητα της χρωµατίνης και την γονιµότητα του σπέρµατος [87]. Κατά την έναρξη της σπερµατογένεσης, οι πρωταµίνες αντικαθιστούν τις ιστόνες και λόγω του υψηλού θετικού φορτίου τους δηµιουργούν ισχυρές συνδέσεις µε το αρνητικά φορτισµένο DNA µε αποτέλεσµα την παρεταίρω συµπύκνωσή του. Τέλος, βρέθηκε πως κατά την έναρξη της αντικατάστασης των ιστονών από τις πρωταµίνες σηµαντικό ρόλο παίζει η φωσφορυλίωση αµινοξέων σερίνης και θρεονίνης στην περιοχή του αµινοτελικού άκρου των πρωταµινών, µία τροποποίηση σηµαντική για την ενσωµάτωσή τους στη χρωµατίνη και τον σωστό σχηµατισµό του συµπλόκου πρωταµινών-dna. Στον άνθρωπο έχουν ήδη ταυτοποιηθεί πολλές κινάσες των πρωταµινών, συµπεριλαµβανοµένης και της ειδικής κινάσης που καταλύει την φωσφορυλίωση των παραπάνω αµινοξέων [87]. 17

32 1.2 ΟΜΗ ΤΟΥ ΝΟΥΚΛΕΟΣΩΜΑΤΟΣ & ΤΗΣ ΧΡΩΜΑΤΙΝΗΣ Η δοµή της χρωµατίνης αποτελεί ένα ενδιαφέρον πεδίο της έρευνας τις τρείς τελευταίες δεκαετίες. Τα πρώτα στοιχεία αναφορικά µ αυτή προέρχονται από µελέτες της δεκαετίας του 70, που αν και άνοιξαν τον δρόµο για την κατανόησή της, έδωσαν την εντύπωση µίας στατικής δοµής, όπου οι ιστόνες και οι υπόλοιπες χρωµοσωµικές πρωτεϊνες απλά «πακετάρουν» το DNA στον πυρήνα του κυττάρου. Το νουκλεόσωµα και οι ανώτερες δοµές τις χρωµατίνης θεωρούνταν σταθερές δοµικές κατασκευές, που ο λειτουργικός τους ρόλος περιορίζεται στη συµπύκνωση του DNA και συνεπώς, δυσχεραίνει την πρόσβαση σ αυτό των διαφόρων ρυθµιστικών πρωτεϊνών. Η παραπάνω θεώρηση άλλαξε λόγω των νεότερων δεδοµένων που προέκυψαν τη δεκαετία του 90. Παρόλο που επιβεβαιώθηκε η συµµετοχή των διαφόρων δοµών της χρωµατίνης στην καταστολή της γονιδιακής έκφρασης, πλέον θεωρείται εξαιρετικά επιλεκτική και εξαρτώµενη από την ύπαρξη συγκεκριµένων ρυθµιστικών στοιχείων στα νουκλεοσώµατα. Επιπλέον, βρέθηκε ότι ορισµένα χαρακτηριστικά της χρωµατίνης παίζουν σηµαντικό ρόλο στην ενεργοποίηση της µεταγραφής και σε ορισµένες περιπτώσεις διευκολύνουν την έναρξή της. Ανακαλύφθηκαν µηχανισµοί που, χρησιµοποιώντας ενέργεια από την υδρόλυση του ΑΤΡ, καταλύουν την αναδιαµόρφωση της χρωµατίνης σε συγκεκριµένες περιοχές του γενώµατος, δηµιουργώντας µία πιο «ανοιχτή» δοµή που διευκολύνει την πρόσβαση των µεταγραφικών παραγόντων στο εκµαγείο του DNA. Τέλος, τα ολοένα και περισσότερα δεδοµένα, που προέρχονται από την µελέτη των τροποποιήσεων των ιστονών και του ρόλου τους στη ρύθµιση της µεταγραφής, ενισχύουν την άποψη ότι η δοµή της χρωµατίνης, εκτός από το «πακετάρισµα» του DNA, επιτελεί επίσης σηµαντικό ρόλο στη ρύθµιση των διαδικασιών που συµβαίνουν στον πυρήνα [11,88]. Έχει βρεθεί πως το 80% περίπου του DNA των ευκαρυωτικών οργανισµών βρίσκεται οργανωµένο στα νουκλεοσώµατα [89]. Το νουκλεόσωµα είναι η βασική µονάδα της χρωµατίνης και αποτελείται από 146bp DNA τα οποία περιελίσσονται γύρω από το ιστονικό οκταµερές. Το οκταµερές σχηµατίζεται από ένα τετραµερές, αποτελούµενο από δύο µόρια των ιστονών Η3 και Η4 [(Η3/Η4)2], στην περιφέρεια του οποίου συνδέονται δύο διµερή, που το καθένα αποτελείται από ένα µόριο των ιστονών Η2Α και Η2Β (Η2Α/Η2Β). Στην αριστερόστροφη, ελικοειδή δοµή του οκταµερούς, περιελίσσονται 146bp DNA, δηµιουργώντας δύο 18

33 υπερελικοειδείς βρόγχους, που µαζί µε το οκταµερές των ιστονών αποτελούν τον νουκλεοσωµικό πυρήνα [11] (Εικόνα 1.2.1). Μεταξύ δύο διαδοχικών νουκλεοσωµάτων υπάρχει ένα τµήµα DNA, που ονοµάζεται συνδετικό DNA και στο οποίο προσδένεται η συνδετική ιστόνη Η1, η οποία συµβάλλει στη δηµιουργία και τη σταθερότητα των ανώτερων επίπεδων οργάνωσης της χρωµατίνης [12]. Η σηµαντικότερη απ αυτές είναι το ινίδιο των 30nm ή σωληνοειδές, µία σπειροειδής δοµή που κυριαρχεί στη µεσοφασική χρωµατίνη και αποτελεί το υπόστρωµα για όλες τις διαδικασίες που σχετίζονται µε το DNA. Εικόνα Η δοµή του νουκλεοσώµατος. Τα βέλη δείχνουν τον άξονα δυαδικής συµµετρίας και τις θέσεις πέψης µε µικροκοκκική νουκλεάση, ενώ οι αριθµοί δείχνουν τις θέσεις επαφής DNA-ιστονών. Με κόκκινο εικονίζεται η Η4, µε κίτρινο η Η3, µε µπλε η Η2Β και µε πράσινο η Η2Α, ενώ το οκταµερές περιβάλλεται από τη δίκλωνη έλικα του DNA. Επίσης, φαίνονται οι πιθανές θέσεις πρόσδεσης της συνδετικής ιστόνης Η1 (µώβ), η σφαιρική περιοχή της οποίας απεικονίζεται µε ανοιχτό κίτρινο. [Nucleosome structure. The dyad axis and micrococcal nuclease digestion positions are indicated by arrows, while DNAhistone contacts are indicated by numbers (red: histone H4; yellow: histone H3; blue: histone H2B; green: histone H2A; purple: linker histone H1; pale yellow: histone H1 globular domain)] 19

34 1.2.1 Το ιστονικό οκταµερές Η συγκρότηση του νουκλεοσωµικού πυρήνα αρχίζει µε το σχηµατισµό του αρχικού ετεροδιµερούς της Η3 µε την Η4 και τον µετέπειτα διµερισµό δύο µορίων Η3, ενός από κάθε ετεροδιµερές, έτσι ώστε να σχηµατιστεί το τετραµερές (Η3/Η4)2, το οποίο µπορεί να σχηµατίσει σταθερό σύµπλοκο µε περίπου 120bp του DNA. Οι άλλες δύο νουκλεοσωµικές ιστόνες, οι Η2Α και Η2Β, µε παρόµοιο τρόπο, σχηµατίζουν επίσης σταθερά ετεροδιµερή, δεν µπορούν όµως να σχηµατίσουν σταθερά τετραµερή. Αντίθετα, σε κάθε πλευρά του του τετραµερούς (Η3/Η4)2 προσδένεται ένα διµερές (Η2Α/Η2Β) µε αποτέλεσµα τη δηµιουργία µίας αριστερόστροφης ελικοειδούς δοµής, πάνω στην οποία περιελίσσεται το DNA και ουσιαστικά αποτελείται από τέσσερα ιστονικά διµερή, τα οποία συνδέονται µε την παρακάτω σειρά: (Η2Α/Η2Β)-(Η4/Η3)-(Η3/Η4)- (Η2Β/Η2Α) [11,88,90]. Στο εσωτερικό της παραπάνω δοµής βρίσκονται 8 αναδιπλούµενες περιοχές, οι οποίες αποτελούνται από τις κεντρικές περιοχές των ιστονών. Οι περιοχές αυτές έχουν δοµή α-έλικας, η οποία περιλαµβάνει µία κεντρική έλικα που περιβάλλεται σε κάθε πλευρά της από ένα βρόχο και µία µικρότερη έλικα, δηµιουργώντας ένα µοτίβο γνωστό ως «ιστονική αναδίπλωση». Μετά το διµερισµό των ιστονών, οι 16 συνολικά βρόχοι δηµιουργούν ανα δύο 8 παράλληλες β-γέφυρες, δύο σε κάθε διµερές (Η3/Η4 και Η2Α/Η2Β), που η κάθε µία έρχεται σε επαφή µε τουλάχιστο δύο θετικά φορτισµένα αµινοξέα, τα οποία συµµετέχουν στη σύνδεση του ιστονικού οκταµερούς µε το DNA. Το οκταµερές των ιστονών έχει σφηνοειδές σχήµα, είναι στενότερο στο ένα άκρο που σχηµατίζεται από το τετραµερές (Η3/Η4)2 και πλατύτερο εκεί όπου προσδένονται τα διµερή (Η2Α/Η2Β). Ένα χαρακτηριστικό µοτίβο του νουκλεοσώµατος είναι η σύνδεση των αµινοτελικών άκρων της πρώτης ελικοειδούς περιοχής κάθε µιας από τις τέσσερις ιστόνες των ετεροδιµερών. Τα τέσσερα αυτά ζευγαρωµένα άκρα έρχονται επίσης σε επαφή µε το DNA µε αποτέλεσµα κάθε ετεροδιµερές, που παίρνει µέρος στο σχηµατισµό του νουκλεοσωµικού πυρήνα, να έχει τουλάχιστο τρία σηµεία επαφής µε τρεις διαδοχικές µικρές αύλακες του DNA, µήκους 30bp περίπου. Οι 8 παράλληλες β-γέφυρες και τα τέσσερα ζευγαρωµένα άκρα των α-ελίκων δηµιουργούν θέσεις επαφής µε 12 από τις 14 ελικοειδείς στροφές του 20

35 νουκλεοσωµικού DNA, ενώ οι υπόλοιπες δύο πιθανόν να προσδένονται στα επιπλέον τµήµατα µε δοµή έλικαβρόχου της ιστόνης Η3 [11,88,90]. Στην «εξωτερική» πλευρά του νουκλεοσώµατος εκτείνονται οι περιοχές των άκρων των ιστονών, γνωστές και ως «ουρές» των ιστονών, οι οποίες αντιπροσωπεύουν το 25% περίπου της ολικής µάζας του οκταµερούς. Οι περιοχές αυτές, που αποτελούν συνέχεια των αµινοτελικών περιοχών όλων των νουκλεοσωµικών ιστονών καθώς και της καρβοξυτελικής περιοχής της Η2Α, προεξέχουν από την επιφάνεια του νουκλεοσώµατος και προβάλλουν πίσω από τις υπερελικοειδείς περιστροφές του DNA [90]. Η πρωτεολυτική αποµάκρυνση των περιοχών των άκρων δεν µεταβάλλει σηµαντικά τη διαµόρφωση του νουκλεοσώµατος, ενώ βρέθηκε ότι δεν παίζουν ρόλο στη συγκρότηση του νουκλεοσώµατος in vitro. Μελέτες µε ακολουθίες νουκλεοσωµάτων απουσία της συνδετικής ιστόνης Η1 έδειξαν ότι οι περιοχές των άκρων των ιστονών ρυθµίζουν τις επαφές µεταξύ γειτονικών νουκλεοσωµάτων και συµµετέχουν στη σχηµατισµό των ανώτερων δοµών της χρωµατίνης. Τέλος, στις περιοχές των άκρων υπάρχουν οι θέσεις όπου συµβαίνουν οι διάφορες µετα-µεταφραστικές τροποποιήσεις των ιστονών, οι οποίες επηρεάζουν τόσο τη δοµή, όσο και τη λειτουργία της χρωµατίνης [11]. Για να ακολουθήσει την αριστερόστροφη, σπειροειδή δοµή του νουκλεοσωµικού πυρήνα, το µόριο του DNA αναδιπλώνεται και σχηµατίζει δύο υπερελικοειδείς βρόγχους, ο καθένας από τους οποίους αποτελείται από περίπου 80bp. Οι εκτεταµένες α-έλικες επιτρέπουν τη σύνδεση του κάθε ιστονικού ετεροδιµερούς του νουκλεοσωµικού πυρήνα µε τρείς περίπου στροφές της διπλής έλικας του DNA, δηλαδή περίπου κάθε 30bp. Οι αλληλεπιδράσεις µεταξύ των ιστονών και του µορίου του DNA συµβαίνουν ανεξάρτητα από την αλληλουχία του και συνεπώς, όλες οι αλληλουχίες νουκλεοσωµικού DNA αποκτούν παρόµοια διαµόρφωση, όταν συνδέονται στα νουκλεοσώµατα. Το DNA του νουκλεοσωµικού πυρήνα φαίνεται να αποκτά µια τριµερή διαµόρφωση, ανάλογη µε αυτή του ιστονικού οκταµερούς, ιδανική για να έρχεται σε επαφή µε την επιφάνεια του ιστονικού οκταµερούς στις συγκεκριµένες θέσεις που προβλέπονται, συµπεριλαµβανοµένων των τριών κοντά στον άξονα συµµετρίας [91]. Σύµφωνα µε την κρυσταλλική δοµή του νουκλεοσωµικού πυρήνα, το DNA των 146bp τυλίγεται 1.75 φορές γύρω από τις ιστόνες. Η περιέλιξη αυτή δεν γίνεται µε έναν οµοιόµορφο τρόπο ενώ το οκταµερές ασκεί περιορισµούς στον τρόπο µε τον οποίο διευθετείται το DNA στο νουκλεόσωµα. Το 21

36 διµερές Η2Α/Η2Β αλληλεπιδρά µε το DNA, τόσο γύρω από το δυαδικό άξονα, όσο και στην περιφέρεια του νουκλεοσώµατος. Η ιστόνη Η2Α είναι η µοναδική που διαθέτει και καρβοξυτελική «ουρά» η οποία προσδένεται στο DNA στην περιοχή του άξονα συµµετρίας. Οι αµινοτελικές «ουρές» των Η2Α και Η2Β συνδέονται στο DNA στην περιφέρεια του νουκλεοσώµατος, σε απόσταση 80bp από τον δυαδικό άξονα. Η κατανοµή των ιστονών και του DNA στο νουκλεόσωµα είναι τέτοια, ώστε κάθε µεταβολή στην επαφή οποιουδήποτε από τα ετεροδιµερή µε το DNA ή τις άλλες πρωτείνες, να προκαλεί δοµικές µεταβολές στα υπόλοιπα [88] Συνδετικές ιστόνες και οι ανώτερες δοµές της χρωµατίνης Μεταξύ δύο διαδοχικών νουκλεοσωµάτων βρίσκεται ένα κοµµάτι DNA, ποικίλου µεγέθους στο οποίο προσδένεται η συνδετική ιστόνη Η1 [92]. Με την πρόσδεση των συνδετικών ιστονών καθώς και άλλων παραγόντων σχηµατίζονται τα ινίδια της χρωµατίνης, τα οποία in vitro υιοθετούν µία διαµόρφωση διαµέτρου 10nm ή αναδιπλώνονται για να σχηµατίζουν ένα ινίδιο διαµέτρου 30nm. Στη συνέχεια, η χρωµατίνη συµπυκνώνεται ακόµη περισσότερο, δηµιουργούνται µεγάλοι, υπερελικοειδείς βρόγχοι, για να σχηµατιστούν τα µεσοφασικά και τα µιτωτικά χρωµοσώµατα [1]. Η βασική δοµή της συµπυκνωµένης χρωµατίνης, του ινιδίου των 30nm, το οποίο ονοµάζεται και «σωληνοειδές», είναι το χρωµατόσωµα. Το χρωµατόσωµα αποτελείται από το ιστονικό οκταµερές στο οποίο έχει προσδεθεί η συνδετική ιστόνη Η1 και έχουν συνδεθεί 168bp DNA. Σύµφωνα µε το αρχικό µοντέλο της δοµής του ινιδίου των 30nm, µία ελικοειδής σειρά νουκλεοσωµάτων, που κάθε στροφή της περιέχει 6-8 νουκλεοσώµατα, συνδέεται µέσω των µορίων της Η1, η σφαιρική περιοχή των οποίων βρίσκεται στην περιοχή του άξονα συµµετρίας του ινιδίου, ενώ τα γειτονικά νουκλεοσώµατα της έλικας συνδέονται µόνο µέσω τµηµάτων συνδετικού DNA (Εικόνα 1.2.2). Παράλληλα, πολλά εναλλακτικά µοντέλα έχουν προταθεί αναφορικά µε τη διαµόρφωση του ινιδίου στο χώρο καθώς και µε την ακριβή θέση της Η1 µέσα σ αυτό [71]. Αρχικά είχε προταθεί ότι η κεντρική περιοχή της Η1 προσδένεται στο DNA στα σηµεία εισόδου και εξόδου του από το νουκλεόσωµα, όµως η µελέτη της κρυσταλλικής δοµής της έδειξε πολλές οµοιότητες µε την αντίστοιχη δοµή ορισµένων µεταγραφικών παραγόντων, οι οποίοι έχουν παρόµοια δοµή και προσδένονται 22

37 στο DNA σε ένα µόνο σηµείο. Η παρατήρηση αυτή οδήγησε σε ένα νέο µοντέλο αναφορικά µε τη δοµή του νουκλεοσώµατος, σύµφωνα µε το οποίο η σφαιρική περιοχή της συνδετικής ιστόνης διαπερνά τις στροφές του νουκλεοσωµικού DNA και προσδένεται επίσης και στις νουκλεοσωµικές ιστόνες. Το πλούσιο σε βασικά αµινοξέα καρβοξυτελικό άκρο της Η1 βρέθηκε πως προσδένεται στο συνδετικό DNA, εξουδετερώνοντας το αρνητικό του φορτίο µε αποτέλεσµα τη συµπύκνωση της χρωµατίνης. Πιστεύεται ότι η σφαιρική περιοχή της Η1 βρίσκεται κοντά στις θέσεις εισόδου και εξόδου του DNA στο νουκλεόσωµα και έχουν προταθεί διάφορα µοντέλα σχετικά µ αυτό. Συνεπώς, η θέση πρόσδεσης της συνδετικής ιστόνης µπορεί να θεωρηθεί ως µία «πύλη» προς το νουκλεοσωµικό DNA, η οποία είναι «κλειστή» όταν η Η1 βρίσκεται συνδεδεµένη στο νουκλεόσωµα και «ανοιχτή» όταν αυτή απουσιάζει, και από την οποία εξαρτάται η πρόσβαση στο DNA των διαφόρων ρυθµιστικών παραγόντων. Επιπλέον, υπάρχουν πολλά στοιχεία σύµφωνα µε τα οποία πολλοί µεταγραφικοί παράγοντες έχουν την ικανότητα να αποµακρύνουν άµεσα την Η1 από τα νουκλεοσώµατα ώστε να διευκολυνθεί η ενεργοποίηση της µεταγραφής, ενώ πολλοί καταστολείς της µεταγραφής µπορούν να προσδεθούν ισχυρότερα στην θέση της Η1, ώστε να καταστείλλουν την µεταγραφή. Άλλωστε είναι γνωστό ότι οι συνδετικές ιστόνες, σε αντίθεση µε τις νουκλεοσωµικές, είναι πιο εύκολο να αποµακρυνθούν από τα νουκλεοσώµατα και να ανακατανεµηθούν στη χρωµατίνη κάτω από φυσιολογικές συνθήκες [71]. Για πολλά χρόνια πιστευόταν ότι η Η1 είναι απαραίτητη για τη συµπύκνωση του συνδετικού DNA και τη δηµιουργία του δεύτερου επιπέδου συµπύκνωσης της χρωµατίνης, του ινιδίου των 30nm [1]. Παρόλο που µία ακολουθία νουκλεοσωµάτων µπορεί να σχηµατίσει ανώτερες δοµές ακόµη και απουσία της Η1, η συγκρότηση του ινιδίου των 30nm σε φυσιολογικές συνθήκες µπορεί να επιτευχθεί µόνο µε την πρόσδεση της Η1 στο συνδετικό DNA, ενώ το καρβοξυτελικό της άκρο θεωρείται απαραίτητο για τη συµπύκνωση της χρωµατίνης [93]. Στη συµπύκνωση της χρωµατίνης σηµαντικό ρόλο παίζουν επίσης οι περιοχές των αµινοτελικών άκρων των νουκλεοσωµικών ιστονών, οι οποίες βρέθηκε πως ρυθµίζουν τις αλληλεπιδράσεις µεταξύ των γειτονικών νουκλεοσωµάτων. Απουσία των αµινοτελικών άκρων των νουκλεοσωµικών ιστονών δεν παρατηρείται συµπύκνωση της χρωµατίνης, ακόµη και όταν η Η1 προσδένεται κανονικά στα νουκλεοσώµατα [12]. 23

38 Εικόνα Απεικόνιση του πρώτου µοντέλου που είχε προταθεί για τον σχηµατισµό του ινιδίου των 30nm και κατά το οποίο µία σειρά νουκλεοσωµάτων που συνδέονται µέσω της Η1, σχηµατίζουν µία σπειροειδή δοµή. Η Η1 βρίσκεται στο εσωτερικό του ινιδίου, στην περιοχή του άξονα συµµετρίας, ενώ τα γειτονικά νουκλεοσώµατα της έλικας συνδέονται µόνο µέσω ενός τµήµατος συνδετικού DNA. [The first model regarding 30nm fiber formation suggesting that an array of nucleosomes connected by histone H1 form a spiral structure. Histone H1 is localized in the dyad axis area of the fiber while the nucleosomes are connected by a linker DNA segment] 24

39 1.2.3 Σχηµατισµός του νουκλεοσώµατος Το πρώτο βήµα για τη συγκρότηση της χρωµατίνης είναι η περιέλιξη ενός τµήµατος DNA γύρω από το ιστονικό οκταµερές και ο σχηµατισµός του νουκλεοσώµατος. Στη συνέχεια, µία ακανόνιστη διαδοχή νουκλεοσωµάτων πρέπει να µετατραπεί σε ακολουθία νουκλεοσωµάτων που θα χωρίζονται από ισοµεγέθη τµήµατα συνδετικού DNA. Ο σχηµατισµός των νουκλεοσωµάτων κατά την αντιγραφή του DNA απαιτεί ειδικούς παράγοντες συγκρότησης της χρωµατίνης και πρωτεϊνες-συνοδούς των ιστονών. Πιστεύεται ότι αρχικά ενσωµατώνονται στο DNA τα τετραµερή (Η3/Η4)2, τα οποία φέρουν τροποποιήσεις στα αµινοτελικά τους άκρα [13] και στη συνέχεια προστίθενται τα διµερή (Η2Α/Η2Β) [14]. Ο σχηµατισµός των νουκλεοσωµάτων κατά την αντιγραφή του DNA επιτυγχάνεται µε δύο τρόπους. Σύµφωνα µε τον πρώτο, οι ιστόνες του αντιγραφόµενου DNA µεταφέρονται άµεσα και τοποθετούνται στις νεοσυντιθέµενες αλυσίδες, «πακετάρωντας» τη µισή ποσότητα του DNA. Το υπόλοιπο DNA ενσωµατώνεται στη χρωµατίνη µε de novo σχηµατισµό νουκλεοσωµάτων, για τον οποίο απαιτούνται οι παράγοντες συγκρότησης της χρωµατίνης, οι οποίοι λειτουργούν ως συνοδοί των ιστονών και τις µεταφέρουν στις κατάλληλες θέσεις στο «πηρούνι» αντιγραφής. Οι πρωτεϊνες-συνοδοί των ιστονών, συνδέονται µε τις ιστόνες και διευκολύνουν στις αλληλεπιδράσεις τους µε άλλα µόρια, ώστε σε συνεργασία µε το µηχανισµό συγκρότησης της χρωµατίνης να γίνει εφικτός ο σχηµατισµός των νουκλεοσωµάτων [14,93,94]. Ο σχηµατισµός των νουκλεοσωµάτων κατά την αντιγραφή του DNA βρέθηκε ότι απαιτεί την παρουσία του συµπλόκου CAF-1 [95], το οποίο αρχικά ταυτοποιήθηκε στον άνθρωπο ως παράγοντας συγκρότησης της χρωµατίνης κατά την αντιγραφή του DNA και στη συνέχεια βρέθηκε πως απαιτείται για την διαδικασία αυτή και κατά την επιδιόρθωση του DNA. Αντίστοιχα σύµπλοκα έχουν βρεθεί σε πολλούς οργανισµούς, όπως στη ζύµη, στη Drosophila, στο κοτόπουλο, σε θηλαστικά και σε φυτά. Ο CAF-1 αποτελείται από τρείς υποµονάδες, τις p150, p60 και p48 και συνδέεται µε τις ιστόνες Η3 και Η4, οι οποίες φέρουν το πρότυπο ακετυλίωσης των νεοσυντιθέµενων ιστονών (Lys5 και Lys12 της Η4 και Lys14 της Η3) [14,15,96,97]. Έχει βρεθεί ότι ο CAF-1 µεταφέρει τις νεοσυντιθέµενες ιστόνες Η3 και Η4 που υπάρχουν στο κυτταρόπλασµα, στο αντιγραφόµενο DNA, ώστε να σχηµατίσουν το τετραµερές (Η3/Η4)2. Την ενσωµάτωση του τετραµερούς στη χρωµατίνη 25

40 ακολουθεί η σύνδεση των διµερών Η2Α/Η2Β, η οποία εξαρτάται από άλλους παράγοντες και είναι ανεξάρτητη από την δράση του CAF-1 και την αντιγραφή του DNA [95]. Οι υποµονάδες p150 και p60 βρέθηκε πως συνδέονται µε τις νεοσυντιθέµενες και ακετυλιωµένες ιστόνες Η3 και Η4. Το γεγονός ότι µπορούν να συνδεθούν µε τις παραπάνω ιστόνες ακόµη και όταν απουσιάζουν τα αµινοτελικά τους άκρα, οδήγησε στο συµπέρασµα πως η ακετυλίωση των νεοσυντιθέµενων ιστονών στο κυτταρόπλασµα δεν είναι απαραίτητη για τον εξαρτώµενο από τον CAF-1 σχηµατισµό των νουκλεοσωµάτων [98]. Η µικρότερη υποµονάδα του CAF-1, η p48, είναι µέλος της οικογένειας πρωτεϊνών που καθορίζεται από την RbAp48, µέλη της οποίας αποτελούν µη καταλυτικές υποµονάδες ακετυλοτρανσφερασών και απακετυλασών των ιστονών καθώς και παραγόντων αναδιαµόρφωσης της χρωµατίνης σε διάφορους οργανισµούς [15]. Μετά τον σχηµατισµό των νουκλεοσωµάτων, τόσο ο CAF-1, όσο και το πρότυπο ακετυλίωσης των Η3 και Η4, εξαφανίζονται σχεδόν αµέσως στις αντιγραφόµενες περιοχές της ευχρωµατίνης, ενώ διατηρούνται για µεγαλύτερο χρονικό διάστηµα κατά την αντιγραφή της ετεροχρωµατίνης. Κατά τη µεσόφαση, οι δύο µεγάλες υποµονάδες του CAF-1 εντοπίζονται στις θέσεις αντιγραφής του DNA, µαζί µε την PCNA, µία πρωτεϊνη που συνδέεται µε το σύµπλοκο της DNA πολυµεράσης στο «πηρούνι» αντιγραφής. Επιπλέον, ο CAF-1 µέσω της υποµονάδας p150 αλληλεπιδρά µε την PCNA, ενώ στον ποντικό, η οµόλογη της p150 αλληλεπιδρά µε την ΗΡ1 και την MBD, δύο πρωτεϊνες που σχετίζονται µε την ετεροχρωµατίνη [14,15]. Τα γονίδια που κωδικοποιούν τις υποµονάδες του CAF-1 στη ζύµη (Cac1-3), σε αντίθεση µε τον άνθρωπο, δεν είναι απαραίτητα για την επιβίωση, όµως η απάλειψη καθενός απ αυτά προκαλεί αύξηση της ευαισθησίας στη υπεριώδη ακτινοβολία και ατέλειες στην καταστολή ορισµένων γονιδίων [16]. Στο Arabidopsis, η έκφραση του γονιδίου FASCIATA, που κωδικοποιεί την p150 σχετίζεται µε την µετάβαση από τη φάση G στη µεσόφαση και είναι χαρακτηριστική των µεριστωµατικών κυττάρων [99] ενώ απάλειψη της p150 σε ανθρώπινα κύτταρα είχε ως αποτέλεσµα αναστολή της σύνθεσης του DNA. Ένα άλλο σύµπλοκο συγκρότησης της χρωµατίνης που ανακαλύφθηκε στη Drosophila και είναι ο RCAF που αποτελείται από την ASF1 και τις ακετυλιωµένες ιστόνες Η3 και Η4 [14-16] (Εικόνα 1.2.3). 26

41 Η ενσωµάτωση των διµερών Η2Α/Η2Β στη χρωµατίνη απαιτεί µία άλλη πρωτεϊνη-συνοδό, την ΝΑΡ-1 [100], η οποία ανακαλύφθηκε αρχικά στον άνθρωπο και στη συνέχεια οµόλογά της βρέθηκαν σε πολλούς άλλους οργανισµούς [16]. Η ΝΑΡ-1 προσδένεται σε όλες τις νουκλεο-σωµικές ιστόνες µε προτίµηση στις Η2Α και Η2Β και ρυθµίζει τον σχηµατισµό των νουκλεοσωµάτων στη διπλή έλικα του DNA, χωρίς όµως οι αποστάσεις µεταξύ των νουκλεοσωµάτων να είναι κανονικές. Αντίθετα, σε συνεργασία µε τον CAF-1, σχηµατίζει νουκλεοσώµατα µε κανονικές αποστάσεις, γεγονός που υποδηλώνει µία πιθανή συνεργασία µεταξύ των παραπάνω παραγόντων. In vivo µελέτες σε διάφορους οργανισµούς έδειξαν ότι πιθανόν η ΝΑΡ-1 να εµπλέκεται στη γονιδιακή ρύθµιση καθώς και στον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου. εδοµένου ότι κατά τη φάση G2 η ΝΑΡ-1 εντοπίζεται στο κυτταρόπλασµα, ενώ κατά τη µεσόφαση εντοπίζεται στον πυρήνα, έχει προταθεί ότι πιθανόν να συµµετέχει στη µεταφορά των ιστονών από το κυτταρόπλασµα στον πυρήνα [289], υπόθεση που ενισχύεται από το γεγονός ότι η ΝΑΡ-1 αλληλεπιδρά µε την Kap114p, που είναι υπεύθυνη για την είσοδο των Η2Α και Η2Β στον πυρήνα [16]. Ένας άλλος παράγοντας συγκρότησης της χρωµατίνης είναι η πρωτεϊνη ΝΑΡ-2, η οποία προσδένεται σε όλες τις νουκλεοσωµικές ιστόνες και στη συνδετική ιστόνη Η1 και µπορεί να ρυθµίσει τον σχηµατισµό των νουκλεοσωµάτων στη διπλή έλικα του DNA [101]. Έχει βρεθεί πως η νουκλεοπλασµίνη και η Ν1, δύο αρνητικά φορτισµένες πρωτεϊνες των ωοκυττάρων που βρίσκονται σε σύµπλοκο µε την µητρική δεξαµενή των ιστονών, µπορούν να ρυθµίσουν τον σχηµατισµό των νουκλεοσωµάτων. Οι πρωτεϊνες αυτές παίζουν σηµαντικό ρόλο στην αποθήκευση των ιστονών και επιτρέπουν την σταδιακή απελευθέρωσή τους µετά την γονιµοποίηση, λειτουργώντας παράλληλα ως αποδέκτες των πρωταµινών. Με αυτό τον τρόπο συµµετέχουν στην αποσυµπύκνωση της χρωµατίνης και στον σωστό σχηµατισµό των νουκλεοσωµάτων στα πρώτα στάδια της ανάπτυξης [16]. Με τον σχηµατισµό της χρωµατίνης επίσης σχετίζονται τα γονίδια HIRA, τα οποία αρχικά ταυτοποιήθηκαν στη ζύµη ως αρνητικοί ρυθµιστές της έκφρασης των γονιδίων των ιστονών και αργότερα ανακαλύφθηκε πως συναντώνται σε πολλούς οργανισµούς. Η πρωτείνη Hira εντοπίζεται στον πυρήνα και βρέθηκε ότι µπορεί να συνδεθεί µε τις ιστόνες διευκολύνοντας τη συγκρότηση της χρωµατίνης in vitro ανεξάρτητα από τη σύνθεση του DNA [102]. 27

42 Εικόνα Το µοντέλο συγκρότησης της χρωµατίνης κατά την αντιγραφή του DNA και οι παράγοντες που εµπλέκονται σ αυτήν. Με πράσινο εικονίζονται τα νουκλεοσώµατα και ιστόνες, µε µπλε οι παράγοντες συγκρότησης της χρωµατίνης και µε κόκκινο οι πρωτεϊνες που συνδέονται στο «πηρούνι» της αντιγραφής. [Chromatin assembly during DNA replications and the factors implicated in the process (green: nucleosomes and histones; blue: chromatin assembly factors; red: proteins binding to replication fork)] Αναδιαµόρφωση της χρωµατίνης Το DNA κατά την περιέλιξη του γύρω από το ιστονικό οκταµερές, έρχεται σε επαφή µε τις ιστόνες σε 14 σηµεία και οι δεσµοί που δηµιουργούνται συνολικά σ αυτά συµβάλλουν στη σταθερότητα τόσο της δοµής, όσο και της θέσης του νουκλεοσώµατος πάνω στο µόριο του DNA [103]. Παθητική, µη καταλυτική, µετακίνηση των οκταµερών έχει παρατηρηθεί σε συνθήκες αυξηµένης θερµοκρασίας και ιοντικού δυναµικού, όµως προϋποθέτει την ταυτόχρονη διάσπαση όλων των δεσµών µεταξύ DNA και ιστονών, γεγονός το οποίο απαιτεί ένα εξαιρετικά µεγάλο ποσό ενέργειας. Γι αυτό το λόγο έχει προταθεί ότι µόνο µικρά τµήµατα DNA, που βρίσκονται στην άκρη του νουκλεοσώµατος και περιλαµβάνουν λίγες µόνο συνδέσεις µε τις ιστόνες, µπορούν να διαχωριστούν από το οκταµερές µε αυτό τον τρόπο. Η παθητική κίνηση του ιστονικού οκταµερούς µπορεί 28

43 να συµβεί και σε φυσιολογικές συνθήκες, όµως δεν είναι η διαδικασία που κυριαρχεί στο κύτταρο. Αντίθετα, χρησιµοποιούνται ορισµένα ένζυµα, τα οποία µειώνουν το ενεργεικό κόστος, συνδέοντας την αναδιαµόρφωση της χρωµατίνης µε την υδρόλυση του ΑΤΡ [17,18,104]. Η εξαρτώµενη από το ΑΤΡ µετατόπιση των ιστονικών οκταµερών παρατηρήθηκε αρχικά in vitro στη Drosophila και στη συνέχεια ανακαλύφθηκαν τρία σύµπλοκα που εµπλέκονται σ αυτή, τα σύµπλοκα NURF, ACF και CHRAC. Τα παραπάνω σύµπλοκα βρέθηκε πως µοιράζονται την υποµονάδα ISWI, µία υδρολάση του ΑΤΡ που τους παρέχει τη δυνατότητα να καταλύουν την αναδιαµόρφωση της χρωµατίνης [18]. Η ISWI ανήκει στην οικογένεια υδρολασών του ΑΤΡ SWI2/SNF2, µέλη της οποίας εµπλέκονται σε όλες τις διαδικασίες που συµβαίνουν στον πυρήνα του κυττάρου. Τα µέλη της οικογένειας SWI2/SNF2 χωρίζονται ανάλογα µε τη δοµή τους σε τέσσερις υποοικογένειες, οι οποίες καθορίζονται αντίστοιχα από τις οµόλογες των υδρολασών Swi2, ISWI, CHD και INO80. Τα µέλη της υποοικογένειας που καθορίζεται από την SWI2/SNF2 περιέχουν την συντηρηµένη περιοχή bromodomain, ενώ τα ένζυµα που σχετίζονται µε την ISWI περιέχουν στο καρβοξυτελικό τους άκρο τις περιοχές SANT και SLIDE [18]. Τα ένζυµα της υποοικογένειας CHD, όπως η Mi-2, περιέχουν την συντηρηµένη περιοχή chromodomain, ενώ τα ένζυµα που σχετίζονται µε την ΙΝΟ80 έχουν µία διακεκοµµένη περιοχή κατάλυσης [89,105]. Παρά τις διαφορές που υπάρχουν στη δοµή των παραπάνω υδρολασών του ΑΤΡ και στη σύνδεσή τους µε πολλές και διαφορετικές υποµονάδες, τα σύµπλοκα που τις περιέχουν µπορούν να καταλύσουν την µετατόπιση των ιστονικών οκταµερών πάνω στο DNA [106]. Στη ζύµη βρέθηκε ότι τα µέλη της υπο-οικογένειας SWI2/SNF2 λειτουργούν ως γενικοί ρυθµιστές της µεταγραφής [107], ρυθµίζοντας τις αλληλεπιδράσεις µεταξύ του DNA και των ιστονών, διευκολύνοντας την πρόσβαση των διαφόρων παραγόντων στο νουκλεοσωµικό DNA. Υπεύθυνη για την παραπάνω διαδικασία είναι η υποµονάδα SWI2/SNF2, οµόλογα της οποίας υπάρχουν σε αντίστοιχα σύµπλοκα σε όλους τους ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισµούς [17,18]. Στη ζύµη επίσης βρέθηκαν δύο οµόλογα της ISWI (yisw1 και yisw2), όπως και στα θηλαστικά (SNF2h και SNF2L), τα οποία σχηµατίζουν δύο διακριτά σύµπλοκα, ενώ ένα οµόλογο υπάρχει στο Xenopus, όπου έχουν βρεθεί τουλάχιστον τέσσερα σύµπλοκα, ένα εκ τω οποίων είναι παρόµοιο µε το σύµπλοκο ACF της Drosophila. 29

44 Στον άνθρωπο, υπάρχουν πολλά σύµπλοκα παρόµοια µε το σύµπλοκο ACF και ένα σύµπλοκο παρόµοιο µε το σύµπλοκο CHRAC, ενώ η σύνδεση της ISWI µε µία πρωτεϊνη 300kDa οδηγεί στο σχηµατισµό του συµπλόκου αναδιαµόρφωσης hrsf. Η µεγάλη ποικιλία στη δοµή των ενζύµων που εµπλέκονται στην αναδιαµόρφωση της χρωµατίνης πιθανόν να αντανακλά επιλεκτικότητα ως προς το υπόστρωµα, διαφορετικό µηχανισµό δράσης ή/και τις ειδικές αλληλεπιδράσεις µε τις υπόλοιπες υποµονάδες των συµπλόκων στα οποία ανήκουν [89]. Η δράση των συµπλόκων αναδιαµόρφωσης της χρωµατίνης πιθανόν να υπόκεινται σε ποικίλους ρυθµιστικούς µηχανισµούς, οι οποίοι προς το παρόν δεν έχουν διευκρινιστεί. Ενώ τα παραπάνω ένζυµα µπορούν να λειτουργήσουν µόνα τους in vitro, η δράση τους in vivo πιθανόν να ρυθµίζεται από τις υπόλοιπες υποµονάδες των συµπλόκων στα οποία ανήκουν. Υπάρχουν πολλά στοιχεία αναφορικά µε την επιστράτευση των παραπάνω συµπλόκων σε συγκεκριµένες θέσεις από τους διάφορους παράγοντες που προσδένονται στο DNA. Άµεσες ή έµµεσες αλληλεπιδράσεις µεταξύ των παραγόντων αυτών και των παραπάνω συµπλόκων µπορούν να έχουν ως αποτέλεσµα την ενεργοποίηση ή την καταστολή της γονιδιακής έκφρασης [89,108]. Άγνωστος παραµένει ακόµη ο τρόπος µε τον οποίο εξασφαλίζεται η «συνέχεια» σε µία ακολουθία νουκλεοσωµάτων in vivo, όµως in vitro έχει βρεθεί πως είναι µία διαδικασία εξαρτώµενη από το ΑΤΡ που καταλύεται από ορισµένους παράγοντες αναδιαµόρφωσης της χρωµατίνης, που περιέχουν την υποµονάδα ISWI. Συγκεκριµένα, τα σύµπλοκα αναδιαµόρφωσης της χρωµατίνης ACF και CHRAC στη Drosophila και στον άνθρωπο, το σύµπλοκο ISW1 στη ζύµη καθώς και το σύµπλοκο hrsf στον άνθρωπο, βρέθηκε πως καταλύουν in vitro το σχηµατισµό των ίσων αποστάσεων µεταξύ των νουκλεοσωµάτων. Οι κανονικές αποστάσεις µεταξύ των νουκλεοσωµάτων πιθανόν να καθορίζουν µία κατάσταση µε µειωµένες ενεργειακές απαιτήσεις, δεδοµένου ότι χάσµατα µεταξύ των νουκλεοσωµάτων παρεµποδίζουν την αναδίπλωση του ινιδίου. Παρόλο που φαίνεται παράξενο, είναι πιθανό ότι οι ίδιοι παράγοντες που διευκολύνουν την πρόσβαση των διαφόρων παραγόντων στο DNA «χαλαρώνοντας» τη δοµή της χρωµατίνης, να εµπλέκονται και στην συµπύκνωσή της, διευκολύνοντας τη δηµιουργία των ανωτέρων δοµών της µέσω της ρύθµισης των αποστάσεων µεταξύ των νουκλεοσωµάτων [18,89]. 30

45 Θεωρητικά, τα νουκλεοσώµατα θα µπορούσαν να µετακινηθούν µέσω αποδιοργάνωσης και µετέπειτα ανασυγκρότησης πάνω σε ένα γειτονικό τµήµα DNA. Εναλλακτικά, θα µπορούσε το DNA να µετακινηθεί σε σχέση µε ένα ιστονικό οκταµερές. Μελέτες in vitro έδειξαν ότι τα σύµπλοκα NURF και CHRAC µπορούν να επιφέρουν την εξαρτώµενη από το ΑΤΡ κίνηση ενός ιστονικού οκταµερούς σε σχέση µε ένα τµήµα του DNA χωρίς την µεταφορά των ιστονών σε άλλο τµήµα DNA, µία διαδικασία γνωστή ως ολίσθηση του νουκλεοσώµατος. Η νέα θέση του νουκλεοσώµατος πιθανόν να καθορίζεται από τις αλληλεπιδράσεις µεταξύ των ιστονών και του DNA, καθώς και από τις αλληλεπιδράσεις µεταξύ του οκταµερούς και του παράγοντα αναδιαµόρφωσης [18]. Παρόλο που η ολίσθηση του νουκλεοσώµατος πάνω στο DNA µπορεί να συµβεί ακόµη και απουσία ενζυµατικής δραστηριότητας, βρέθηκε πως διευκολύνεται από τους παράγοντες αναδιαµόρφωσης της χρωµατίνης [18]. Για να εξηγηθεί η µετατόπιση των νουκλεοσωµάτων αρχικά είχε προταθεί το µοντέλο της «περιστροφικής διάχυσης». Σύµφωνα µ αυτό, η κίνηση Brown έχει ως αποτέλεσµα την περιστροφή της έλικας του DNA στην άκρη του νουκλεοσώµατος, αντικαθιστώντας τους µέχρι τότε δεδοµένους δεσµούς µεταξύ DNA και ιστονών µε αντίστοιχους των γειτονικών ζευγών βάσεων. Ο πολλαπλασιασµός του παραπάνω µοτίβου στην επιφάνεια του οκταµερούς προκαλεί µεταβολές τόσο στην περιστροφή του DNA γύρω απ αυτό, όσο και στη δυνατότητα για µεταγραφή. Το DNA σ αυτή την περίπτωση περιστρέφεται γύρω από τον άξονά του καθώς περιελίσσεται γύρω από το ιστονικό οκταµερές, µετατοπιζόµενο κατά ένα ζεύγος βάσεων, ενώ σύµφωνα µε το µοντέλο δεν είναι απαραίτητη για την παραπάνω διαδικασία η διάσπαση όλων των δεσµών µεταξύ DNA και ιστονών την ίδια χρονική στιγµή [89]. Το εναλλακτικό µοντέλο της «επανάκτησης βρόγχου» προτείνει ότι η θερµική ενέργεια δεν περιστρέφει το DNA στο σηµείο εισόδου του στο νουκλεόσωµα, αλλά οδηγεί στην αποκόλλησει ενός τµήµατος DNA στα σηµεία εισόδου και εξόδου απ αυτό [18]. Η αποσύνδεση ενός τµήµατος DNA µεγέθους 30-35bp από τις «άκρες» του νουκλεοσώµατος απαιτεί λιγότερη ενέργεια απ ότι από τις «εσωτερικές» θέσεις της επιφάνειας του οκταµερούς, δεδοµένου ότι εκεί υπάρχουν περισσότερες θέσεις επαφής και αλληλεπίδρασης µε το οκταµερές. Το τµήµα του DNA που αποσυνδέεται από το οκταµερές µπορεί να επαναπροσδεθεί και να σχηµατιστεί το αρχικό νουκλεόσωµα ή να αλληλεπιδράσει µε µία άλλη θέση του 31

46 ιστονικού οκταµερούς, σχηµατίζοντας ένα βρόγχο DNA στην επιφάνεια του νουκλεοσώµατος (Εικόνα 1.2.4). Η µετατόπιση του βρόγχου πάνω στο οκταµερές, η οποία απαιτεί σχετικά µικρό ποσό ενέργειας, µπορεί να µεταβάλλει την δυνατότητα µεταγραφής του νουκλεοσωµικού DNA. Το αποσυνδεδεµένο τµήµα του DNA είναι προσβάσιµο και διαθέσιµο για τις αλληλεπιδράσεις των µεταγραφικών παραγόντων. Τα ένζυµα που εµπλέκονται στην αναδιαµόρφωση της χρωµατίνης πιθανόν απλά να ενισχύουν αυτές τις ιδιότητες των νουκλεοσωµάτων, µειώνοντας το ενεργειακό κόστος αποσταθεροποιώντας τους δεσµούς µεταξύ DNA και ιστονών. Η καταλυόµενη από τους παράγοντες αναδιαµόρφωσης µετατόπιση των νουκλεοσωµάτων και η διαφορετική συµπεριφορά των διαφόρων συµπλόκων επιχειρήθηκε να ερµηνευτεί τόσο µε βάση το µοντέλο της «περιστροφικής διάχυσης», όσο και το µοντέλο της «επανάκτησης βρόγχου», όµως τα περισσότερα µέχρι στιγµής συµπεράσµατα έχουν εξαχθεί από πειράµατα in vitro. Συνεπώς µένει να επιβεβαιωθούν και σε φυσιολογικές καταστάσεις, δηλαδή στο αναδιπλωµένο ινίδιο της χρωµατίνης [18]. Εικόνα Σχηµατική απεικόνιση των θέσεων επαφής και αλληλεπίδρασης µεταξύ του DNA και των ιστονών (Α) καθώς και των δύο κυριότερων µοντέλων αναδιαµόρφωσής του, του µοντέλου της «περιστροφικής διάχυσης» (Β) και του µοντέλου της «επανάκτησης βρόγχου» (C). [DNA-histone contact and interaction sites (A) and the main models suggested for chromatin remodeling, the twisting (B) and bulging model (C)] 32

47 1.2.5 Πρωτεϊνες της οµάδας υψηλής κινητικότητας (HMG) Εκτός από από τους παραπάνω µηχανισµούς αναδιαµόρφωσης, στον καθορισµό της δοµής της χρωµατίνης συµµετέχουν ορισµένες µη ιστονικές πρωτεϊνες, όπως τα µέλη της οµάδας υψηλής κινητικότητας (HMG). Οι HMG ανακαλύφθηκαν την δεκαετία του 70 ως µικρές, χρωµοσωµικές πρωτεϊνες, εύκολα αναγνωρίσιµες λόγω της υψηλής ηλεκτροφορητικής τους κινητικότητας. Οι HMG συναντώνται σε όλους τους ευκαρυωτικούς οργανισµούς και χωρίζονται σε τρείς υπο-οικογένειες. Τα µέλη της υπο-οικογένειας HMGΑ έχουν µεγέθος 10kDa περίπου και περιέχουν το χαρακτηριστικό µοτίβο «άγκιστρο ΑΤ», η υπο-οικογένεια HMGΒ (γνωστές παλιότερα ως HMG1/2) αποτελείται από πρωτεϊνες µεγέθους 25kDa περίπου που περιέχουν το µοτίβο «κουτί HMG» ενώ τα µέλη της υπο-οικογένειας HMGΝ (που ονοµαζόταν µέχρι πρόσφατα HMG14/17 και µέλη της δεν έχουν βρεθεί στα φυτά) έχουν ενδιάµεσο µέγεθος και χαρακτηριστικό τους είναι η απευθείας πρόσδεση στα νουκλεοσώµατα. Γενικό χαρακτηριστικό των πρωτεϊνων HMG είναι η έλλειψη αυστηρά καθορισµένης δοµής και η εξαιρετική ευελιξία τους, η ικανότητα δηλαδή να υφίστανται αντιστρεπτές µεταβολές στη δοµή τους κατά την πρόσδεση στα διάφορα υποστρώµατα [109,110]. Τα τελευταία χρόνια, έχουν γίνει πολλές µελέτες αναφορικά µε πρωτεϊνες της υπο-οικογένειας HMGA, οι οποίες παλιότερα ανήκαν στις οµάδες HMGI/Y και HMGI/C. Χαρακτηριστικό στοιχείο της δοµής τους είναι η παρουσία περιοχών πρόσδεσης στο DNA, που ονοµάζονται «άγκιστρα ΑΤ», τα οποία επιτρέπουν την επιλεκτική πρόσδεσή τους στη µικρή αύλακα του DNA σε περιοχές πλούσιες σε αδενίνη και θυµίνη. Στις HMGA των θηλαστικών υπάρχουν τρείς τέτοιες περιοχές, ενώ στων φυτών έχουν βρεθεί µέχρι και επτά [ ]. Οι HMGA µπορούν να επιφέρουν σηµαντικές αλλαγές στη διαµόρφωση του DNA, οι οποίες εξαρτώνται από το µήκος και την αλληλουχία του και περιλαµβάνουν κάµψη, ευθυγράµµιση και σχηµατισµό βρόγχων και υπερελίξεων. Επιπλέον, έχει βρεθεί ότι οι πρωτεϊνες HMGA προσδένονται στα νουκλεοσώµατα in vivo ενώ µπορούν και συνδέονται in vitro µε τις νουκλεοσωµικές ιστόνες. Έχει προταθεί ότι οι πρωτεϊνες HMGA εµπλέκονται στην αναδιαµόρφωση της χρωµατίνης στις περιοχές των προαγωγέων ορισµένων γονιδίων, ενώ το µοτίβο «άγκιστρο ΑΤ» έχει βρεθεί σε πρωτεϊνες που αποτελούν υποµονάδες των συµπλόκων αναδιαµόρφωσης της χρωµατίνης και είναι απαραίτητο για τη λειτουργία τους in vivo [109,110]. Εκτός από την 33

48 αναδιαµόρφωση της χρωµατίνης, οι HMGA βρέθηκε πως συµµετέχουν και στη ρύθµιση της γονιδιακής έκφρασης [112]. Η λειτουργία τους ρυθµίζεται από το επίπεδο φωσφορυλίωσής και ακετυλίωσής τους, ενώ ο ρόλος των υπόλοιπων τροποποιήσεών τους, δηλαδή της µεθυλίωσης και της πολυ-adp-ριβοσυλίωσης δεν έχει ακόµη εξακριβωθεί [109,110]. Οι πρωτεϊνες της υπο-οικογένειας HMGB είναι απαραίτητες στα ευκαρυωτικά κύτταρα, δεδοµένου ότι στα περισσότερα κύτταρα των θηλαστικών υπάρχουν περίπου ένα εκατοµµύριο µόρια της HMGB1 και η αλληλουχία της είναι εξαιρετικά συντηρηµένη. Η πρόσδεσή της HMGB1 δεν εξαρτάται από την αλληλουχία του DNA, ενώ βρέθηκε πως προσδένεται ασθενώς στις συνήθεις διαµορφώσεις του και ισχυρότερα σε µη φυσιολογικές, παραµορφωµένες δοµές του DNA, εποµένως είναι πιθανόν να αλληλεπιδρά µε περιοχές του DNA που υπάρχουν διάφορες τροποποίησεις ή βλάβες. Επιπλέον, βρέθηκε ότι η αλληλεπίδρασή της µε το συνδετικό DNA διευκολύνει την πρόσδεση του παράγοντα αναδιαµόρφωσης της χρωµατίνης ACF στο νουκλεοσωµικό DNA και την µετατόπιση του νουκλεοσώµατος. Έχει προταθεί ότι η αλληλεπίδραση της HMGB1 µε το DNA κατά την έξοδό του από το νουκλεόσωµα το καθιστά πιο ευέλικτο και διευκολύνει την µετέπειτα αλληλεπίδρασή του µε το σύµπλοκο ACF [109]. Κατά τη µίτωση, η HMGB1 εντοπίζεται στα χρωµοσώµατα, αν και ένα σηµαντικό ποσοστό της βρίσκεται σε ελεύθερη µορφή στο κυτταρόπλασµα. Η πρωτεϊνη εναλλάσσεται συνεχώς µεταξύ χρωµοσωµάτων και κυτταροπλάσµατος, εκτός από την περίπτωση που το κύτταρο υφίσταται απόπτωση, οπότε η εναλλαγή αυτή σταµατά. Πιστεύεται ότι κάθε νουκλεόσωµα έρχεται σε επαφή µε ένα µόριο της HMGB1 κάθε δύο δευτερόλεπτα, και η πρωτεϊνη παραµένει στο νουκλεόσωµα για µερικά κλάσµατα του δευτερολέπτου. Έχει προταθεί ότι η συγκεκριµένη πρωτεϊνη «εξερευνά» τα χρωµοσώµατα και «ανιχνεύει» τις κατάλληλες θέσεις πρόσδεσης, ενώ η υψηλή της συγκέντρωση ενισχύει την πιθανότητα πρόσδεσης και αλληλεπίδρασης [109]. 34

49 1.3 ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΕΙΣ ΤΩΝ ΙΣΤΟΝΩΝ Οι σηµαντικότερες τροποποιήσεις των ιστονών είναι η ακετυλίωση, η φωσφορυλίωση, η µεθυλίωση, η ουβικουιτίνωση και η πολυ-adp-ριβοσυλίωση [19]. Οι παραπάνω τροποποιήσεις δηµιουργούν ένα επιπλέον επίπεδο ετερογένειας των ιστονών και παράλληλα επιτελούν σηµαντικό ρόλο στις λειτουργίες της χρωµατίνης. Η ακετυλίωση, που συµβαίνει στα αµινοτελικά άκρα των ιστονών, έχει συσχετισθεί µε την ενεργοποίηση της µεταγραφής, ενώ πολλοί συνενεργοποιητές βρέθηκε πως είναι ταυτόχρονα και ακετυλοτρανσφεράσες των ιστονών [20]. Η φωσφορυλίωση των ιστονών εµπλέκεται τόσο στη συµπύκνωση των χρωµοσωµάτων κατά τη µίτωση, όσο και στην µεταγραφή των γονιδίων που επάγονται από αυξητικούς παράγοντες [25]. Η µεθυλίωση των ιστονών σχετίζεται τόσο µε την µεταγραφική ενεργοποίηση όσο και µε το σχηµατισµό της ετεροχρωµατίνης [26]. Τέλος, η ουβικουιτίνωση, που συµβαίνει στο καρβοξυτελικό άκρο των ιστονών Η2Α και Η2Β, καθώς και η πολυ-adp-ριβοσυλίωση των ιστονών παίζουν σηµαντικό ρόλο σε ποικίλες λειτουργίες της χρωµατίνης, όπως την µεταγραφή, την αντιγραφή, την επιδιόρθωση του DNA κ.α. [31,34]. Έχουν προταθεί δύο µοντέλα για να εξηγηθεί ο µηχανισµός δράσης των τροποποιήσεων των ιστονών. Σύµφωνα µε το πρώτο, η µεταβολή του ηλεκτρικού φορτίου των ιστονών µειώνει τις αλληλεπιδράσεις τους µε το DNA, δηµιουργεί µία πιο «χαλαρή» δοµή της χρωµατίνης και µ αυτό τον τρόπο διευκολύνεται η πρόσβαση των µεταγραφικών παραγόντων στο εκµαγείο του DNA [35]. Σύµφωνα µε το δεύτερο, το οποίο είναι γνωστό ως «υπόθεση του ιστονικού κώδικα», οι διαφορετικοί συνδιασµοί τροποποιήσεων στο αµινοτελικό άκρο µίας ιστόνης δηµιουργούν συγκεκριµένα µοτίβα, που πιθανόν να αποτελούν σηµεία αναγνώρισης, πρόσδεσης και αλληλεπίδρασης των διαφόρων παραγόντων που είναι απαραίτητοι για τις λειτουργίες της χρωµατίνης [36]. 35

50 Εικόνα Οι θέσεις των µετα-µεταφραστικών τροποποιήσεων στα άκρα των νουκλεοσωµικών ιστονών. Οι θέσεις µε αστερίσκο (*) έχει βρεθεί πως τροποποιούνται µόνο στους φυτικούς οργανισµούς. [Post-translational modification sites in core histone tail domains. Residues modified only in plant organisms are indicated with asterisks (*)] 36

51 1.3.1 Ακετυλίωση των ιστονών Η ακετυλίωση είναι η πλέον µελετηµένη µετα-µεταφραστική τροποποίηση των ιστονών. Από την ανακάλυψή της ακόµη, τη δεκαετία του 60, είχε συσχετισθεί µε τη ρύθµιση της γονιδιακής έκφρασης, δεδοµένου ότι οι µεταγραφικά ενεργές περιοχές της χρωµατίνης περιείχαν υπερ-ακετυλιωµένες ιστόνες ενώ οι µεταγραφικά ανενεργές υπο-ακετυλιωµένες [113]. Η σχέση µεταξύ ακετυλίωσης των ιστονών και µεταγραφικής ενεργοποίησης επιβεβαιώθηκε τη δεκαετία του 90, οπότε και ταυτοποιήθηκαν οι περισσότερες ακετυλοτρανσφεράσες, ορισµένες από τις οποίες προηγουµένως είχαν χαρακτηρισθεί ως συνενεργοποιητές της µεταγραφής [20]. Παράλληλα, ταυτοποιήθηκαν και οι περισσότερες απακετυλάσες των ιστονών, πολλές από τις οποίες είχε ήδη βρεθεί πως λειτουργούσαν ως συγκαταστολείς της µεταγραφής [21]. Στόχοι των παραπάνω ενζύµων είναι οι λυσίνες στις περιοχές των αµινοτελικών άκρων των νουκλεοσωµικών ιστονών, κυρίως της Η3 ( Lys9, Lys14, Lys18, Lys23) και της Η4 (Lys5, Lys8, Lys12, Lys16 και στα φυτά επιπλέον η Lys20), οι οποίες έχουν διατηρηθεί σε όλους σχεδόν τους ευκαρυωτικούς οργανισµούς. Στα ζώα και στους µύκητες κυριότερος στόχος της ακετυλίωσης είναι η ιστόνη Η4, ενώ στα φυτά κυριαρχεί η ακετυλίωση της Η3 [22,35]. O µηχανισµό δράσης της ακετυλίωσης των ιστονών µπορεί να εξηγηθεί και µε τα δύο γενικά µοντέλα που ισχύουν για τις τροποποιήσεις των ιστονών, δηλαδή τόσο µε βάση τη µεταβολή φορτίου που προκαλεί, όσο και µε την «υπόθεση του ιστονικού κώδικα» [35,36]. Επιπλέον, έχει προταθεί ότι η ευρείας κλίµακας ακετυλίωση των ιστονών σε µία περιοχή της χρωµατίνης, δεν σχετίζεται άµεσα µε την µεταγραφική ενεργοποίηση, αλλά πιθανόν να αποτελεί ένδειξη της δυνατότητας µεταγραφής των γονιδίων της συγκεκριµένης περιοχής, η έκφραση των οποίων πιθανόν να απαιτεί επιπλέον, στοχευµένη ακετυλίωση των ιστονών που βρίσκονται στις περιοχές των προαγωγέων [114]. 37

52 Ακετυλοτρανσφεράσες των ιστονών Το επίπεδο της ακετυλίωσης των ιστονών ρυθµίζεται από την συνδιασµένη δράση των ακετυλοτρανσφερασών και των απακετυλασών. Αυτές οι δύο οµάδες ενζύµων λειτουργούν σε πολυπρωτεϊνικά σύµπλοκα, τα οποία οι υπόλοιπες υποµονάδες καθοδηγούν στις κατάλληλες περιοχές της χρωµατίνης και ρυθµίζουν την δραστικότητα και την εξειδίκευσή τους [20]. Η λειτουργία των ακετυλοτρανσφερασών έγκειται στην µεταφορά µίας ακετυλοµάδας από το ακέτυλο-συνένζυµο Α στην ε-αµινοµάδα µίας πλευρικής αλυσίδας µίας λυσίνης [115]. Από τις αρχές της δεκαετίας του 70 είχαν αποµονωθεί και ταυτοποιηθεί διάφορες ακετυλοτρανσφεράσες των ιστονών, οι οποίες χωρίστηκαν σε δύο κατηγορίες, τις ακετυλοτρανσφεράσες τύπου Α, που βρίσκονται στον πυρήνα και τις ακετυλοτρανσφεράσες τύπου Β, που βρίσκονται στο κυτταρόπλασµα [116]. Οι ακετυλοτρανσφεράσες τύπου Β πιστεύεται ότι ακετυλιώνουν τις νεοσυντιθέµενες ιστόνες στο κυτταρόπλασµα για να µεταφερθούν έπειτα στον πυρήνα, να απακετυλιωθούν και να ενσωµατωθούν στην χρωµατίνη, ενώ οι ακετυλο-τρανσφεράσες τύπου Α από την άλλη, ακετυλιώνουν τις νουκλεοσωµικές ιστόνες στον πυρήνα του κυττάρου και συνδέονται µε την διαδικασία της µεταγραφής. Πρόσφατα δεδοµένα όµως δείχνουν ότι µερικές ακετυλοτρανσφεράσες µπορούν να λειτουργούν σε πολλά σύµπλοκα και θέσεις, συνεπώς δεν µπορούν να ανήκουν αποκλειστικά σε µία από τις δύο κατηγορίες [20]. Η πλέον µελετηµένη οµάδα ακετυλοτρανσφερασών είναι η οικογένεια GNAT, η οποία περιλαµβάνει µία µεγάλη ποικιλία ευκαρυωτικών και προκαρυωτικών ενζύµων που παρόλο που ακετυλιώνουν διαφορετικά υποστρώµατα, εµφανίζουν οµολογία σε πολλές περιοχές τους και κοινό µηχανισµό κατάλυσης. Οι κυριότερες ακετυλοτρανσφεράσες των ιστονών αυτής της οικογένειας είναι η Gcn5 της ζύµης και τα οµόλογά της στους άλλους οργανισµούς, η PCAF στον άνθρωπο και οι λιγότερο συγγενικές τους, Hat1, Elp3, Hpa2 [20]. Η πρώτη πυρηνική ακετυλοτρανσφεράση των ιστονών που ταυτοποιήθηκε ήταν µία πρωτεϊνη 55kDa στον Tetrahynema, η οποία βρέθηκε πως καταλύει την ακετυλίωση των ιστονών σε ελεύθερη µορφή in vitro. Η µελέτη της αλληλουχίας της έδειξε πως ήταν οµόλογο της πρωτεϊνης Gcn5 της ζύµης που είχε προηγουµένως χαρακτηριστεί συνενεργοποιητής της µεταγραφής [117]. Οµόλογα της Gcn5 έχουν βρεθεί και µελετηθεί σε πολλούς οργανισµούς, όπως τον άνθρωπο, τον ποντικό, την Drosophila, το καλαµπόκι, το Arabidopsis, τον 38

53 S.pombe και το T.gondi, γεγονός που δείχνει ότι η λειτουργία της είναι εξαιρετικά διατηρηµένη στους ευκαρυωτικούς οργανισµούς [20]. Η δοµή της περιλαµβάνει µία περιοχή bromodomain κοντά στο καρβοξυτελικό της άκρο, µία περιοχή αλληλεπίδρασης µε την πρωτεϊνη Ada2 και την περιοχή του ενεργού της κέντρου, η οποία βρέθηκε πως είναι απαραίτητη για τη λειτουργία της ως συνενεργοποιητή. Η ανασυνδιασµένη Gcn5 καταλύει την ακετυλίωση της της Lys14 της Η3 και σε µικρότερο βαθµό των Lys8 και Lys16 της Η4, όταν αυτές βρίσκονται σε ελεύθερη µορφή, όταν όµως αυτές βρίσκονται στα νουκλεοσώµατα, απαιτείται η παρουσία πολυπρωτεϊνικών συµπλόκων, όπως τα σύµπλοκα SAGA και ADA, καταλυτική υποµονάδα των οποίων είναι η Gcn5. Στα θηλαστικά η υποτάξη της Gcn5 αντιπροσωπεύεται από δύο στενά συγγενικές πρωτεϊνες, την GCN5 και την PCAF, οι οποίες εµφανίζουν εξαιρετικά υψηλό ποσοστό οµολογίας [20,118]. Η PCAF, που αρχικά ταυτοποιήθηκε στον άνθρωπο, µελετήθηκε in vitro και in vivo και βρέθηκε ότι αλληλεπιδρά µε τις p300/cbp, ενώ καταλύει την ακετυλίωση τόσο των ελεύθερων ιστονών, όσο και αυτών που βρίσκονται στα νουκλεοσώµατα, κυρίως την Η3 στη Lys14 και λιγότερο την Η4 στη Lys8 [121]. Έχει βρεθεί ότι η λειτουργία της PCAF ως ακετυλοτρανσφεράση των ιστονών και ως συνενεργοποιητής είναι απαραίτητη στην µυογένεση, στη ρυθµιζόµενη από πυρηνικούς υποδοχείς και επαγόµενη από αυξητικούς παράγοντες µεταγραφική ενεργοποίηση, καθώς και σε άλλες διαδικασίες [20]. Επιπλέον, βρέθηκε ότι η PCAF επιτελεί την λειτουργία της ως συνενεργοποιητής µέσω της δράσης της ως ακετυλοτρανσφεράσης των ιστονών [122]. Στον άνθρωπο η GCN5 και η PCAF συµµετέχουν σε ξεχωριστα σύµπλοκα, οι υποµονάδες των οποίων όµως είναι σε µεγάλο βαθµό ταυτόσηµες, ενώ και οι δύο προσδένονται στην p300/cbp [20]. Μελέτες στο καλαµπόκι έδειξαν την παρουσία οµολόγων της Gcn5, όπου επίσης έχουν ταυτοποιηθεί δύο πυρηνικές ακετυλοτρανσφεράσες των ιστονών, οι HATA1 και HATA2 [119]. Έχει προταθεί ότι η ZmGcn5 αποτελεί την καταλυτική υποµονάδα δύο διακριτών συµπλόκων, αναλόγων των συµπλόκων SAGA και ADA της ζύµης [120]. Η Hat1 της ζύµης ήταν η πρώτη ακετυλοτρανσφεράση που ταυτοποίηθηκε, αρχικά ως κυτοπλασµατική ακετυλοτρανσφεράση, υπεύθυνη για την ακετυλίωση των νεοσυντιθέµενων ιστονών πριν την είσοδό τους στον πυρήνα [123], όµως πρόσφατες µελέτες έδειξαν ότι δεν είναι αποκλειστικά κυτοπλασµατική [20]. Η Hat1 συνδέεται µε την Hat2, µία πρωτεϊνη µέλος οικογένειας που καθορίζεται από την RbAp48, η οποία απαιτείται 39

54 για την πρόσδεση στην Η4 και συµµετέχει στην εξειδίκευση υποστρώµατος. [124]. Βρέθηκε ότι η Hat1 καταλύει in vitro την ακετυλίωση της Lys12 της Η4 [123], το αµινοξύ που ακετυλιώνεται κυρίως στις νεοσυντιθέµενες ιστόνες. Η οµόλογη της Hat1 στο καλαµπόκι, κυτοπλασµατική ακετυλοτρανσφεράση HATB, βρέθηκε πως επιτελεί την ίδια λειτουργία καταλύοντας την ακετυλίωση της νεοσυντιθέµενης Η4 στις Lys5 και Lys12 [125]. Πρόσφατα βρέθηκε στον άνθρωπο ένα σύµπλοκο που περιέχει οµόλογα των Hat1 και Hat2 και παρουσιάζει εξειδίκευση παρόµοια µε αυτή του αντίστοιχου της ζύµης [20]. Η πυρηνική ακετυλοτρανσφεράση Elp3 στη ζύµη βρέθηκε πως σχετίζεται άµεσα µε την µεταγραφή, ως υποµονάδα του ολοενζύµου της RNA πολυµεράσης II και εµπλέκεται στην µεταγραφική επιµήκυνση. Η ανασυνδιασµένη Elp3 καταλύει την ακετυλίωση όλων των νουκλεοσωµικών ιστονών, όµως η ακριβής λειτουργία της in vivo δεν έχει διευκρινιστεί πλήρως. Τέλος, η Hpa2 της ζύµης βρέθηκε ότι µπορεί να ακετυλιώσει in vitro τις ιστόνες Η3 και Η4 όµως οι ιδιότητες και ο ρόλος της παραµένουν ακόµη αδιευκρίνιστες [20,126]. Μία άλλη οµάδα συγγενικών εξελικτικά πρωτεϊνων που περιλαµβάνει γνωστές ή δυνητικές ακετυλοτρανσφεράσες των ιστονών είναι η οικογένεια MYST, η οποία ονοµάστηκε έτσι από τα από τα αρχικά των πρώτων µελών της που ταυτοποίηθηκαν, δηλαδή των πρωτεϊνών MOZ, Ybf2/Sas3, Sas2, Tip60 ενώ αργότερα προστέθηκαν σ αυτή και η Esa1 της ζύµης, η MOF της Drosophila και οι HBO1 και MORF του ανθρώπου. Οι παραπάνω πρωτεϊνες παρόλο που ανήκουν στην ίδια οικογένεια εξαιτίας της υψηλής οµολογίας των αλληλουχιών τους και της παρουσίας σε όλες µίας ξεχωριστής περιοχής κατάλυσης, έχει βρεθεί πως συµµετέχουν σε ένα ευρύ φάσµα ρυθµιστικών λειτουργιών στους διάφορους οργανισµούς [20]. Οι πρωτεϊνες Sas2 και Sas3 της ζύµης βρέθηκε πως εµπλέκονται στην καταστολή της γονιδιακής έκφρασης. Παράλληλα, αποδείχθηκε ότι η Sas3 λειτουργεί ως ακετυλοτρανσφεράση και καταλύει in vitro την ακετυλίωση των ιστονών Η3 και Η4, ενώ αποτελεί και την καταλυτική υποµονάδα του συµπλόκου NuA3, το οποίο ακετυλιώνει την Η3 στα νουκλεοσώµατα [127]. Παρόµοια λειτουργία της Sas2 ως ακετυλοτρανσφεράση των ιστονών δεν έχει επιβεβαιωθεί ακόµη και είναι πιθανόν να απαιτούνται επιπλέον υποµονάδες για την ενζυµική της δράση [20]. Επιπλέον στη ζύµη ταυτοποιήθηκε µία ακόµη πρωτεϊνη-µέλος της οικογένειας MYST, η Esa1, η οποία αποδείχθηκε πως είναι ακετυλοτρανσφεράση των ιστονών, απαραίτητη για την πρόοδο του 40

55 κυτταρικού κύκλου. Η ανασυνδιασµένη Esa1 καταλύει την in vitro ακετυλίωση των ιστονών Η2Α, Η3 και H4 όταν βρίσκονται σε ελεύθερη µορφή, ενώ αποτελεί την καταλυτική υποµονάδα του συµπλόκου NuA4, το οποίο ακετυλιώνει τις ιστόνες στα νουκλεοσώµατα [128]. Στη Drosophila η πρωτεϊνη MOF, η οποία παίζει σηµαντικό ρόλο στο διπλασιασµό της έκφρασης των γονιδίων του χρωµοσώµατος X στα αρσενικά άτοµα, βρέθηκε πως είναι ακετυλοτρανσφεράση των ιστονών και ακετυλιώνει κυρίως την Η4 και σε µικρότερο βαθµό τις Η3 και Η2Α, ενώ το σύµπλοκο MSL που την περιέχει, έχει την ικανότητα να ακετυλιώνει επιλεκτικά την Lys16 της Η4 στα νουκλεοσώµατα [129]. Η πρώτη πρωτεϊνη της οικογένειας MYST που ανακαλύφθηκε στον άνθρωπο ήταν η Tip60 και βρέθηκε ότι η ανασυνδιασµένη Tip60 ακετυλιώνει in vitro τις ιστόνες Η2Α, Η3 και Η4 σε ελεύθερη µορφή, ενώ παρουσιάζει µικρή δραστικότητα έναντι των ιστονών στα νουκλεοσώµατα, οι οποίες όµως ακετυλιώνονται από το σύµπλοκο που την περιέχει. Έχει προταθεί ότι η Tip60, µέσω της ακετυλίωσης των ιστονών, συµµετέχει στην ενεργοποίηση της µεταγραφής µίας οµάδας γονιδίων, ενώ έχει συσχετισθεί και µε την επιδιόρθωση των βλαβών στη διπλή έλικα του DNA [130,131]. Η ΜΟΖ, µία άλλη πρωτεϊνη της οικογένειας MYST στον άνθρωπο, ανασυνδιάζεται µε την CBP και εµπλέκεται στις διαδικασίες που οδηγούν στη λευχαιµογένεση, όµως η λειτουργία της ως ακετυλοτρανσφεράση των ιστονών δεν έχει ακόµη επιβεβαιωθεί [20]. Η πρωτεϊνη MORF στον άνθρωπο ταυτοποιήθηκε εξαιτίας της εκπληκτικής οµολογίας της µε την ΜΟΖ, που εκτείνεται σ όλο το µήκος της και βρέθηκε ότι καταλύει την ακετυλίωση των ιστονών Η3 και Η4 σε ελεύθερη µορφή. Στην οικογένεια MYST ανήκει και η ΗΒΟ1 στον άνθρωπο, η οποία αλληλεπιδρά µε το ORC1, υποµονάδα του αρχικού αναγνωριστικού συµπλόκου ORC που επιτελεί σηµαντικό ρόλο στην έναρξη της αντιγραφής του DNA. Το σύµπλοκο που την περιέχει βρέθηκε πως καταλύει την ακετυλίωση των Η3 και Η4 σε ελεύθερη µορφή, ενώ η ανασυνδιασµένη ΗΒΟ1 ακετυλίωνει ελάχιστα τις ιστόνες στα νουκλεοσώµατα και καθόλου σε ελεύθερη µορφή [20]. Μία άλλη τάξη ακετυλοτρανσφερασών καθορίζεται από τους µεταγραφικούς συνενεργοποιητές p300 και CBP, οι οποίοι λόγω της δοµικής και λειτουργικής τους οµοιότητας συχνά αναφέρονται ως µία οντότητα (p300/cbp) και αποτελούν γενικά εκφραζόµενους µεταγραφικούς συν-ενεργοποιητές και παίζουν σηµαντικό ρόλο σε ποικίλες κυτταρικές διαδικασίες επάγοντας τη µεταγραφή µέσω της αλληλεπίδρασής τους µε 41

56 διάφορους µεταγραφικούς παράγοντες που προσδένονται στους προαγωγείς των γονιδίων [132]. Βρέθηκε ότι οι p300/cbp έχουν δράση ακετυλοτρανσφεράσης και καταλύουν ισχυρά την ακετυλίωση όλων των νουκλεοσωµικών ιστονών, χωρίς να εµφανίζουν ιδιαίτερη εξειδίκευση. Επιπλέον, καταλύουν στον ίδιο βαθµό την ακετυλίωση των ιστονών τόσο σε ελεύθερη µορφή, όσο και στα νουκλεοσώµατα, σε αντίθεση µε τις υπόλοιπες ακετυλοτρανσφεράσες [133]. Στο µόριο των p300/cbp υπάρχουν τουλάχιστον τέσσερις περιοχές αλληλεπίδρασης µε διάφορους παράγοντες, ενώ η κεντρική της περιοχή περιλαµβάνει µία περιοχή bromodomain [134]. Μεταλλάξεις στη περιοχή κατάλυσης των p300/cbp έδειξαν ότι η λειτουργία τους ως µεταγραφικοί συνενεργοποιητές εξαρτάται από τη δράση τους ως ακετυλοτρανσφεράσες των ιστονών. Οι p300/cbp αλληλεπιδρούν µε άλλες ακετυλοτρανσφεράσες καθώς και µε συνενεργοποιητές πυρηνικών υποδοχέων, ενώ εκτός από τις ιστόνες καταλύουν την ακετυλίωση και πολλών άλλων πρωτεϊνών που σχετίζονται µε τη µεταγραφή όπως π.χ. οι πρωτεϊνες HMG, οι ενεργοποιητές p53 και GATA-1, οι συνενεργοποιητές πυρηνικών υποδοχέων SRC-1, ACTR και TIF-2 και γενικοί µεταγραφικοί παράγοντες TFIIE και TFIIF. Οι p300/cbp εµφανίζουν την υψηλότερη δραστικότητα από όλες τις ακετυλοτρανσφεράσες, γεγονός που ταιριάζει µε τον ρόλο τους ως γενικοί συνενεργοποιητές της µεταγραφής [20]. Οι συνενεργοποιητές πυρηνικών υποδοχέων SRC-1 και ACTR καθορίζουν µία ακόµη τάξη ακετυλοτρανσφερασών και παράλληλα αποδεικνύουν τον ρόλο της ακετυλίωσης των ιστονών στη µεταγραφική ρύθµιση που σχετίζεται µε ορµονικά µηνύµατα. Ο συνενεργοποιητής SRC-1 στον άνθρωπο, γνωστός και ως p160, µπορεί να προάγει την εξαρτώµενη από τον συνδέτη ενεργοποίηση σε πολλούς πυρηνικούς υποδοχείς in vivo, ενώ ο ανασυνδιασµένος SRC-1 βρέθηκε ότι µπορεί να καταλύσει in vitro την ακετυλίωση των ιστονών Η3 και Η4 όταν βρίσκονται σε ελεύθερη µορφή [135]. Η περιοχή κατάλυσης του SRC- 1 εντοπίζεται στο καρβοξυτελικό του άκρο, ενώ αλληλεπιδρά µε τις p300/cbp και PCAF, γεγονός που υποδηλώνει ότι για τη ρύθµιση της µεταγραφής που σηµατοδοτείται από ορµονικά µηνύµατα επιστρατεύονται πολλες και διαφορετικές ακετυλοτρανσφεράσες. Επιπλέον, ο SRC-1 ακετυλιώνεται από τις p300/cbp, γεγονός που πιθανόν να σχετίζεται µε τη λειτουργία του ως συνενεργοποιητή πυρηνικών υποδοχέων [20]. Ο συνενεργοποιητής ACTR, ο οποίος εµφανίζει σηµαντικές δοµικές και λειτουργικές οµοιότητες µε τον SRC-1 42

57 και µαζί µε τους SRC-1 και TIF2 καθορίζουν την οικογένεια συνενεργοποιητών πυρηνικών υποδοχέων p160 ή οικογένεια SRC, βρέθηκε ότι καταλύει in vitro την ακετυλίωση των ιστονών Η3 και Η4 [136]. Το τρίτο µέλος της οικογένειας p160, ο TIF2, γνωστός και ως GRIP1, επάγει την µεταγραφική ενεργοποίηση αλληλεπιδρώντας µε πολλούς πυρηνικούς υποδοχείς, αλληλεπιδρά µε τις p300/cbp και µοιράζεται όλες τις περιοχές οµολογίας µε τους άλλους δύο συνενεργοποιητές-µέλη της οικογένειας p160, όµως η δράση του ως ακετυλοτρανσφεράση των ιστονών δεν έχει ακόµη αποδειχθεί [20]. Ένα ακόµη συνδετικό στοιχείο µεταξύ ακετυλίωσης και µεταγραφής αποτέλεσε η ανακάλυψη ότι µία από τις υποµονάδες του γενικού µεταγραφικού παράγοντα TFIID, που απαιτείται για το σχηµατισµό του προεναρκτηρίου συµπλόκου της RNA πολυµεράσης ΙΙ, είναι ταυτόχρονα και ακετυλοτρανσφεράση των ιστονών. Αποδείχθηκε ότι ο TAFII250 στον άνθρωπο και τα οµόλογά του TAFII230 και TafII145/130 στη Drosophila και στη ζύµη αντίστοιχα, µπορούν να καταλύσουν την ακετυλίωση των ιστονών in vitro [137]. Ο TAFII250 φέρει περιοχή bromodomain η οποία όµως δεν είναι απαραίτητη για τη δράση του ως ακετυλοτρανσφεράση. Η δράση του TAFII250 και των οµολόγων του οδηγεί σε ένα µοντέλο για την έναρξη της µεταγραφής, κατά το οποίο, ο TAFII250 ακετυλιώνοντας τις ιστόνες, διευκολύνει την πρόσδεση της ΤΒΡ και συνεπώς και του TFIID στην περιοχή του προαγωγέα, µε αποτέλεσµα την µετέπειτα δηµιουργία του µεταγραφικού συµπλόκου. Παρόµοιο µοντέλο πιθανόν να ισχύει και στις περιπτώσεις των γενικών µεταγραφικών παραγόντων Nut1 και TFIIIC, συνδέονται άµεσα µε τον µηχανισµό της RNA πολυµεράσης [20]. Σε αντίθεση µε όλες τις παραπάνω ακετυλοτρανσφεράσες, οι οποίες λειτουργούν κυρίως ως µεταγραφικοί συνενεργοποιητές που επιστρατεύονται στη χρωµατίνη από µεταγραφικούς παράγοντες που προσδένονται στο DNA, ο µεταγραφικός παράγοντας ATF-2, χαρακτηρίστηκε ως η πρώτη ακετυλοτρανσφεράση των ιστονών που προσδένεται κατευθείαν στο DNA. Βρέθηκε πως ο ανασυνδιασµένος ATF-2 καταλύει in vitrο την ακετυλίωση των Η2Β και Η4, τόσο σε ελεύθερη µορφή, όσο και σε νουκλεοσώµατα. Μεταλλάξεις στην περιοχή κατάλυσης, που βρίσκεται στην κεντρική περιοχή του, εµποδίζουν τη δράση του ATF-2 τόσο ως ακετυλοτρανσφεράση των ιστονών, όσο και ως µεταγραφικού παράγοντα [138]. 43

58 Έχει βρεθεί ότι το ενεργό κέντρο των ακετυλοτρανσφερασών της οικογένειας GNAT αποτελείται από περίπου 160 αµινοξέα, ενώ στην περιοχή του καρβοξυτελικού τους άκρου υπάρχει µία περιοχή bromodomain. Αντίθετα, το ενεργό κέντρο των ακετυλοτρανσφερασών της οικογένειας MYST αποτελείται από περίπου 250 αµινοξέα, ενώ πολλά από τα ένζυµα αυτά περιέχουν µία περιοχή πρόσδεσης Zn καθώς και µία περιοχή chromodomain στο αµινοτελικό τους άκρο. Τέλος, οι CBP/p300 έχουν µεγαλύτερο ενεργό κέντρο 500 περίπου αµινοξέων, ενώ φέρουν µία περιοχή bromodomain καθώς και άλλες περιοχές, απαραίτητες για αλληλεπιδράσεις µεταξύ πρωτεϊνών. Η σύγκριση των δοµών των ακετυλοτρανσφερασών που έχουν µελετηθεί, αποκάλυψε ότι οι διατηρηµένες περιοχές βρίσκονται στην κεντρική περιοχή του µορίου τους και συµµετέχουν στην πρόσδεση και αλληλεπίδραση µε το ακέτυλο-συνένζυµο Α, ενώ συσχέτιση της δοµής µε τη λειτουργία των ενζύµων έδειξε ότι οι περιοχές αυτές είναι απαραίτητες στον µηχανισµό κατάλυσης. Σύγκριση της δοµής των ygcn5, yesa1 και yhat1, οδήγησε στην υπόθεση ότι υπάρχει ένα συντηρηµένο πλαίσιο για την πρόσδεση των ιστονών στο ενεργό κέντρο των ενζύµων, ενώ η εξειδίκευσή τους µπορεί να ρυθµίζεται από διαφορές στην αλληλουχία αυτών των περιοχών. Σε αντίθεση µε τη διατηρηµένη δοµή της κεντρικής περιοχής του ενεργού κέντρου, οι αµινοτελικές και οι καρβοξυτελικές περιοχές των ακετυλοτρανσφερασών εµφανίζουν µεγάλη ποικιλοµορφία και πιθανόν να εµπλέκονται στην εξειδίκευση υποστρώµατος που παρουσιάζουν οι διάφορες ακετυλοτρανσφεράσες [20,139]. 44

59 Απακετυλάσες των ιστονών H ακετυλίωση των ιστονών αντιστρέφεται από τις απακετυλάσες των ιστονών, οι οποίες, όπως και οι ακετυλοτρανσφεράσες, συµµετέχουν σε πολυπρωτεϊνικά σύµπλοκα και επιφέρουν αλλαγές στην γονιδιακή έκφραση. Γονίδια απακετυλασών των ιστονών έχουν αποµονωθεί και ταυτοποιηθεί σε µία σειρά οργανισµών και τα ένζυµα που κωδικοποιούν έχουν χωριστεί σε τέσσερις οικογένειες. Η πρώτη και η δεύτερη οικογένεια περιλαµβάνουν τα οµόλογα των ρυθµιστών της µεταγραφής στη ζύµη, RPD3 και HDA1, στην τρίτη ανήκουν τα οµόλογα της SIR2, απακετυλάσης που η δράση της εξαρτάται από το NAD και στην τέταρτη ανήκουν αποκλειστικά απακετυλάσες που συναντώνται στα φυτα και είναι οµόλογα της HD2 του καλαµποκιού. Στην πρώτη οικογένεια απακετυλασών των ιστονών ανήκουν η RPD3 της ζύµης, και τα οµόλογά της στον άνθρωπο (HDAC1-3, -8 και -11), στη Drosophila (dhdac1-3), στο καλαµπόκι (HD1BI και HD1BII), στον S.pombe (Phd1) καθώς και σε άλλους φυτικούς και ζωίκούς οργανισµούς. Το ιδρυτικό µέλος της οικογένειας, η RPD3 της ζύµης, ανήκει σε ένα πολυπρωτεϊνικό σύµπλοκο 600kDa και βρέθηκε πως εµπλέκεται στην καταστολή της γονιδιακής έκφρασης [120,140,141]. Στο καλαµπόκι οι HD1BI και HD1BII, όπως και η ακετυλοτρανσφεράση HATB σχετίζονται µε πρωτεϊνες συγγενικές της RbAp48, που λειτουργεί ως «συνοδός» της Η4 [124], ενώ µόνο η HD1BI µπορεί να απακετυλιώσει την νεοσυντιθέµενη Η4, την οποία ακετυλιώνει η ΗΑΤΒ [142,143]. Με την RbAp48 επίσης σχετίζεται και η HDAC1 του ανθρώπου, γεγονός που οδηγεί στην υπόθεση ότι πιθανόν οι πρωτεϊνες αυτές να εµπλέκονται στην στόχευση των παραπάνω ενζύµων στην χρωµατίνη [140]. Τέλος, έχει βρεθεί ότι τα µέλη της οικογένειας HDAC/RPD3 παρουσιάζουν πολλές οµοιότητες µε προκαρυωτικά ένζυµα που επιτελούν παρόµοιες λειτουργίες στον µεταβολισµό ακετυλο-οµάδων [144]. Η δεύτερη οικογένεια απακετυλασών των ιστονών καθορίζεται από την HDA1 της ζύµης. Σ αυτήν ανήκουν οι HDAC4-7 και HDAC9-10 του ανθρώπου [141], οι mhda1-2 του ποντικού, η dhda2 της Drosophila, η HD1A του καλαµποκιού και η Clr3 του S.pombe [120]. Η HDA1 της ζύµης αποτελεί την καταλυτική υποµονάδα ενός συµπλόκου 350kDa, ενώ υπάρχουν στον οργανισµό αυτό και τρείς ακόµη συγγενικές της πρωτεϊνες, οι HOS1-3 [140]. Στον άνθρωπο, οι HDAC4, -5, -7 και -9 µοιράζονται µία συντηρηµένη περιοχή 420 αµινοξέων περίπου στο καρβοξυτελικό τους άκρο, η οποία αποτελεί και το ενεργό τους κέντρο, ενώ οι HDAC6 και -10 περιέχουν 45

60 δύο τέτοιες περιοχές [145]. Σε αντίθεση µε τα οµόλογα της RPD3, η έκφραση των οµόλογων της HDA1 είναι εξειδικευµένη, γεγονός που ίσως να υποδηλώνει πιθανή σχέση τους µε τη διαφοροποίηση και τις αναπτυξιακές διαδικασίες, ενώ έχουν την ικανότητα να µετακινούνται µεταξύ πυρήνα και κυτταροπλάσµατος, αποκρινώµενες στα ανάλογα κυτταρικά µηνύµατα [141]. Μία άλλη οικογένεια απακετυλασών των ιστονών, καθορίζεται από την SIR2 της ζύµης, οµόλογα της οποίας έχουν βρεθεί σε πολλούς ζωικούς και φυτικούς οργανισµούς. Οι SIR2, SIR3 και SIR4 συµµετέχουν στην καταστολή της γονιδιακής έκφρασης σε συγκεκριµένες χρωµοσωµικές περιοχές, ενώ υπερέκφραση της SIR2 στη ζύµη καθώς και στο ποντίκι είχε ως αποτέλεσµα ολική απακετυλίωση των ιστονών [140,146]. Εκτός από τη δράση της ως απακετυλάση, η SIR2 εµφανίζει και δράση ADP-ριβοσυλοτρανσφεράσης, ενώ βρέθηκε ότι η λειτουργία της ως απακετυλάση εξαρτάται από το NAD, γεγονός που ίσως να συσχετίζει τον µεταβολισµό του κυττάρου µε τις αλλαγές στη δοµή της χρωµατίνης. Σε αντίθεση µε τις υπόλοιπες απακετυλάσες των ιστονών, η δράση της SIR2 δεν αναστέλλεται από τους γνωστούς αναστολείς των απακετυλασών [140]. Τέλος, µία οικογένεια απακετυλασών των ιστονών, που συναντάται αποκλειστικά στα φυτά, καθορίζεται από την HD2 του καλαµποκιού και τα οµόλογά της [140]. Η HD2 είναι ένα ένζυµο 32kDa, το οποίο συνδέεται ισχυρά µε την χρωµατίνη, απ όπου αποµονώνεται ως σύµπλοκο περίπου 400kDa [147]. Η οµόλογη της HD2 στο Arabidopsis, η AtHD2A, µπορεί να καταστείλει την µεταγραφή in vivo, ενώ έχει προταθεί ότι τα αµινοξέα που απαιτούνται για την ενζυµική της δράση βρίσκονται στην περιοχή του αµινοτελικού άκρου. Εκτός από την AtHD2A, στο Arabidopsis έχουν βρεθεί τουλάχιστον άλλα τέσσερα οµόλογα της HD2 [148], ενώ σε πολλούς φυτικούς οργανισµούς έχουν βρεθεί απακετυλάσες αυτής της οικογένειας. Οµόλογα της HD2 δεν έχουν βρεθεί σε ζωϊκούς οργανισµούς, όµως συγγενικές της πρωτεϊνες έχουν ταυτοποιηθεί σε έντοµα, στη ζύµη και σε παρασιτικούς οργανισµούς [140]. Το ενεργό κέντρο των απακετυλασών των ιστονών αποτελείται από περίπου 390 συντηρηµένα αµινοξέα, ενώ η αποµάκρυνση της ακετυλοµάδας από µία λυσίνη συµβαίνει µέσω ενός συστήµατος µεταβίβασης φορτίου, αποτελούµενο από δύο γειτονικά αµινοξέα ιστιδίνης, δύο αµινοξέα ασπαρτικού οξέος και ένα αµινοξύ 46

61 τυροσίνης. Επιπλέον, η παρουσία ενός ιόντος Zn ++ θεωρείται απαραίτητη για τη λειτουργία του παραπάνω συστήµατος, ενώ πιστεύεται πως και άλλοι παράγοντες απαιτούνται για την δράση των απακετυλασών [149]. Η δράση των παραπάνω ενζύµων αναστέλλεται, σε µικρό ή µεγάλο βαθµό, από τους αναστολείς των απακετυλασών των ιστονών, ουσίες που όπως πιστεύεται παρεµποδίζουν, µόνιµα ή παροδικά, την πρόσδεση του υποστρώµατος στο ενεργό τους κέντρο. Σε αντίθεση µε τις ακετυλοτρασνφεράσες των ιστονών, για τις οποίες δεν έχουν βρεθεί ουσίες-αναστολείς, πολλές και διαφορετικές χηµικές ενώσεις αποδείχτηκε πως παρεµποδίζουν εκλεκτικά τη δράση των διαφόρων απακετυλασών [140,141]. Ο ισχυρότερος αναστολέας που έχει ανακαλυφθεί είναι η τριχοστατίνη Α, που ανήκει στην οµάδα των υδροξαµικών οξέων και παράγεται από τον µύκητα Streptomyces [150]. Μία άλλη οµάδα αναστολέων των απακετυλασών αποτελείται από λιπαρά οξέα µε µικρή ανθρακική αλυσίδα, όπως π.χ. το βουτυρικό οξύ, το φαινυλβουτυρικό οξύ και το βαλπροϊκό οξύ, η δράση τους όµως είναι σαφώς µικρότερη από αυτή των υδροξαµικών οξέων. Τα κυκλικά τετραπεπτίδια καθορίζουν την τρίτη οµάδα αναστολέων των απακετυλασών και σ αυτήν ανήκουν µικροβιακά προϊόντα όπως π.χ. η τραποξίνη, η χλαµυδοσίνη και η HC-τοξίνη, καθώς και συνθετικές ενώσεις, όπως π.χ. η απισιδίνη. Τέλος, ορισµένοι αναστολείς απακετυλασών ανήκουν στην κατηγορία των βενζαµιδίων, όπως π.χ. η Ν- ακετυλοδιναλίνη και εµφανίζουν ενδιάµεση δραστικότητα. Η δράση σχεδόν όλων των παραπάνω αναστολέων είναι αντιστρεπτή, µε εξαίρεση την τραποξίνη και την δεπουδεσίνη, οι οποίες προσδένονται µόνιµα στο ενεργό κέντρο των απακετυλασών [150,151]. Έχει βρεθεί πως η αναστολή της δράσης των απακετυλασών επάγει ποικίλες κυτταρικές λειτουργίες in vivo και in vitro, όπως ενεργοποίηση της µεταγραφής, διακοπή του κυτταρικού κύκλου, απόπτωση ή/και κυτταρική διαφοροποίηση, γεγονός που καθιστά τους αναστολείς των απακετυλασών δυνήτικα χρήσιµα εργαλεία στην πρόληψη και στη θεραπεία διαφόρων µορφών καρκίνου [152]. 47

62 Ακετυλίωση των ιστονών και µεταγραφή Ήδη από τη δεκαετία του 70 είχε προταθεί ότι η ακετυλίωση των ιστονών εµπλέκεται στη ρύθµιση της µεταγραφής των γονιδίων. Στη συνέχεια πολλά πειράµατα έδειξαν ότι η ενεργή µεταγραφικά χρωµατίνη περιέχει υπερακετυλιωµένες ιστόνες, ενώ η ανενεργή περιέχει υποακετυλιωµένες [153,154]. Όµως παρόλο που η ακετυλίωση των ιστονών Η3 και Η4 στις περιοχές των προαγωγέων σχετίζεται µε την γονιδιακή έκφραση, δεν περιορίζεται µόνο σ αυτές, γεγονός που υποδηλώνει ότι η ακετυλίωση των ιστονών µπορεί να έχει διαφορετικά αποτελέσµατα σε διαφορετικές περιοχές της χρωµατίνης [120]. Η επίδραση της ακετυλίωσης των ιστονών στη µεταγραφική ενεργοποίηση αρχικά είχε εξηγηθεί µέσω των αλλαγών στο βαθµό συµπύκνωσης της χρωµατίνης που αυτή επιφέρει. Η σύνδεση του DNA στο νουκλεόσωµα, καθώς και οι ανώτερες δοµές της χρωµατίνης που σχηµατίζονται έπειτα, δηµιουργούν ένα κατασταλτικό «περιβάλλον», το οποίο δυσχαιρένει την πρόσβαση και τη δράση των διαφόρων, απαραίτητων για την ενεργοποίηση της µεταγραφής, παραγόντων σ αυτό. Η προσθήκη µίας ακετυλοµάδας στην ε-αµινοµάδα µίας λυσίνης εξουδετερώνει ένα θετικό φορτίο, συνεπώς µειώνει τις ηλεκτροστατικές δυνάµεις που συνδέουν τις θετικά φορτισµένες ιστόνες και το αρνητικά φορτισµένο DNA. Αυτό έχει ως αποτέλεσµα τη «χαλάρωση» της δοµής της χρωµατίνης, διευκολύνοντας µ αυτό τον τρόπο την πρόσβαση των διαφόρων µεταγραφικών παραγόντων στο εκµαγείο του DNA [114] (Εικόνα 1.3.2). Η σύνδεση µεταξύ ακετυλίωσης των ιστονών και µεταγραφικής ενεργοποίησης ενισχύθηκε τη δεκαετία του 90 µε την ανακάλυψη ότι πολλοί συνενεργοποιητές έχουν ταυτόχρονα και δράση ακετυλοτρανσφεράσης των ιστονών, όπως π.χ. η Gcn5, η CBP, ο TAFII250 κ.α. Οι παραπάνω πρωτεϊνες βρέθηκε πως ρυθµίζουν τη µεταγραφή των γονιδίων µέσω της ακετυλίωσης τόσο των ιστονών, όσο και µη ιστονικών πρωτεϊνών που εµπλέκονται στη λειτουργία της χρωµατίνης [20]. Η ανακάλυψη της περιοχής bromodomain στο µόριο διαφόρων ακετυλοτρανσφερασών (π.χ. GCN5 και PCAF) αλλά και µεταγραφικών παραγόντων (π.χ. TAFII250), η οποία ευθύνεται για την αναγνώριση και πρόσδεση των παραπάνω σε ακετυλιωµένες λυσίνες στα αµινοτελικά άκρα των ιστονών, αποτέλεσε τη βάση για την υπόθεση του «ιστονικού κώδικα», σύµφωνα µε τον οποίο η ακετυλίωση των ιστονών πιθανόν να δηµιουργεί θέσεις αναγνώρισης και αλληλεπίδρασης των διαφόρων µεταγραφικών παραγόντων στη χρωµατίνη [36]. 48

63 Επιπλέον, πολλοί µεταγραφικοί παράγοντες επιστατεύουν στις περιοχές των προαγωγέων των γονιδίων συνενεργοποιητές µε δράση ακετυλοτρασνφεράσης των ιστονών, η λειτουργία των οποίων συνήθως εξαρτάται από τη συγκεκριµένη ενζυµική τους δράση [20]. Στη ζύµη βρέθηκε ότι τα πολυπρωτεϊνικά σύµπλοκα των ακετυλοτρανσφερασών των ιστονών µπορούν και συνδέονται, µέσω των πρωτεϊνών προσαρµογής που περιέχουν, στις περιοχές αλληλεπίδρασης ενεργοποιητών όπως π.χ. ο VP16, ο Gal4, ο Gcn4 και ο Hap4 [155]. Η επιστράτευση των διαφόρων συµπλόκων των ακετυλοτρανσφερασών των ιστονών µέσω πρωτεϊνών που προσδένονται στο DNA οδηγεί σε µεταγραφική ενεργοποίηση in vitro και in vivo, παρόλο που διαφορετικοί ενεργοποιητές µπορούν να επάγουν διαφορετικά πρότυπα ακετυλίωσης των ιστονών [156], Ενώ η ακετυλίωση των ιστονών σχετίζεται µε την ενεργοποίηση της µεταγραφής, η απακετυλίωσή τους βρέθηκε πως επιφέρει τα αντίθετα αποτελέσµατα. Η πρώτη απακετυλάση των ιστονών που ταυτοποιήθηκε, η RPD3 της ζύµης, ήταν γνωστή ως συγκαταστολέας της µεταγραφής [140], ενώ η καταστολή της γονιδιακής έκφρασης συνδέεται συνήθως µε την επιστράτευση πολυπρωτεϊνικών συµπλόκων, τα οποία περιέχουν ως υποµονάδες, εκτός των άλλων, µία ή και περισσότερες απακετυλάσες των ιστονών. εδοµένου ότι στα υποστρώµατα των παραπάνω ενζύµων περιλαµβάνονται και µη ιστονικές πρωτεϊνες που σχετίζονται µε τη χρωµατίνη, πιστεύεται ότι η απακετυλάσες συµµετέχουν στη ρύθµιση της µεταγραφής µέσω της απακετυλίωσης τόσο των ιστονών, όσο και των διαφόρων ρυθµιστικών πρωτεϊνων [157]. Έχει βρεθεί από µελέτες στη ζύµη ότι η χρωµατίνη, τόσο η ενεργή µεταγραφικά, όσο και η ανενεργή, χαρακτηρίζεται από ένα ενδιάµεσο επίπεδο ακετυλίωσης των ιστονών Η3 και Η4, αποτέλεσµα µη στοχευµένης δράσης ακετυλοτρανσφερασών και απακετυλασών των ιστονών [158], ενώ κάτι παρόµοιο συµβαίνει στα διαφοροποιηµένα κύτταρα των ανώτερων ευκαρυωτικών, όπου το γένωµα χαρακτηρίζεται κυρίως από υποακετυλιωµένη, ανενεργό χρωµατίνη. Η ευρεία ακετυλίωση των ιστονών πιστεύεται πως οδηγεί σε µερική αποσυµπύκνωση σε χρωµοσωµικές περιοχές, η οποία δεν συσχετίζεται άµεσα µε την µεταγραφική δραστηριότητα, αλλά πιθανόν να αποτελεί ένδειξη της δυνατότητας µεταγραφής των γονιδίων της συγκεκριµένης περιοχής. Η µεταγραφική ενεργοποίηση σε µία τέτοια περιοχή της χρωµατίνης συνδέεται µε µετέπειτα στοχευµένη ακετυλίωση των ιστονών που βρίσκονται στις περιοχές των προαγωγέων των γονίδιων 49

64 [159], αν και έχουν βρεθεί εξαιρέσεις και σ αυτόν τον κανόνα [156]. Τα δεδοµένα που έχουν συσσωρευθεί την τελευταία δεκαετία ενισχύσαν µία υπόθεση που είχε προταθεί από παλιά, ότι δηλαδή η µεταγραφή επάγεται από συγκεκριµένα πρότυπα ακετυλίωσης στα αµινοτελικά άκρα των ιστονών, παρά από την εξουδετέρωση ενός φορτίου µέσω της µη στοχευµένης ακετυλίωσής τους [160]. Τα συγκεκριµένα αυτά πρότυπα ακετυλίωσης, αποτέλεσµα της στοχευµένης ακετυλίωσης των ιστονών, πιθανόν να λειτουργούν ως θέσεις επιστράτευσης µεταγραφικών παραγόντων και άλλων ρυθµιστικών πρωτεϊνών, στη δράση των οποίων πιθανόν να οφείλονται οι αλλαγές στη δοµή της χρωµατίνης και η µετέπειτα µεταγραφική ενεργοποίηση και όχι στην άµεση επίδραση της ακετυλίωσης των ιστονών [114]. Εικόνα Σχηµατική αναπαράσταση της ενεργοποίησης της µεταγραφής µέσω πολυπρωτεϊνικού συµπλόκου που περιέχει ακετυλοτρανσφεράση των ιστονών και αναστολής της µεταγραφής µέσω πολυπρωτεϊνικού συµπλόκου που περιέχει απακετυλάση των ιστονών (το κίτρινο αντιστοιχεί στο οκταµερές των ιστονών, το κόκκινο στα αµινοτελικά άκρα των ιστονών και το µπλέ στο DNA). [Transcriptional activation by a multiprotein complex containing histone acetyltransferase and transcriptional repression by a multiprotein complex containing histone deacetylase (yellow: histone octamer; red: histone N-tail domains; blue: DNA)] 50

65 1.3.2 Φωσφορυλίωση των ιστονών Η φωσφορυλίωση των ιστονών ανακαλύφθηκε τη δεκαετία του 60 [161] και οι µελέτες τα επόµενα χρόνια έδειξαν πως η φωσφορυλίωση των ιστονών εµπλέκεται σε µία ποικιλία κυτταρικών λειτουργιών, όπως η συµπύκνωση των χρωµοσωµάτων κατά τη µίτωση, η µεταγραφική ενεργοποίηση, η επιδιόρθωση βλαβών του DNA και η απόπτωση [23,24]. Οι κυριώτερες θέσεις τροποποίησης στα αµινοτελικά άκρα των ιστονών βρέθηκε πως είναι η Ser1 της Η2Α, οι Ser14 και Ser32 της Η2Β, οι Ser10 και Ser28 της Η3 και η Ser1 της Η4, ενώ φωσφορυλίωση υφίσταται και η συνδετική ιστόνη Η1 [23]. Την τελευταία δεκαετία, η έρευνα έχει επικεντρωθεί στη φωσφορυλίωση της Ser10, η οποία παρουσιάζει και το µεγαλύτερο ενδιαφέρον, δεδοµένου ότι αρχικά συσχετίσθηκε µε τη µίτωση, όµως αργότερα βρέθηκε πως εµπλέκεται και στη µεταγραφική ενεργοποίηση που επάγεται από αυξητικούς παράγοντες [25]. Οι κυριώτερες κινάσες που καταλύουν την τροποποίηση του συγκεκριµένου αµινοξέος χωρίζονται αντίστοιχα στις µιτωτικές κινάσες και στις κινάσες που συµµετέχουν στα διάφορα µονοπάτια µεταγωγής µηνυµάτων και η δράση τους έχει ως αποτέλεσµα την µεταγραφική ενεργοποίηση [162]. Επίσης βρέθηκε ότι στη µίτωση εµπλέκεται και η φωσφορυλίωση της Η1, η φωσφορυλίωση της ισοµορφής H2A.X στη Ser139 σχετίζεται µε την επιδιόρθωση του DNA, ενώ η φωσφορυλίωση της Η2Β στη Ser32 µε την απόπτωση [23]. Με βάση τα παραπάνω, η φωσφορυλίωση των ιστονών µπορεί να θεωρηθεί ένας σηµαντικός ρυθµιστικός µηχανισµός που ελέγχει πολλές λειτουργίες της χρωµατίνης [19] Κινάσες και φωσφατάσες των ιστονών Σε αντίθεση µε την πληθώρα δεδοµένων που αφορούν τις ακετυλοτρανσφεράσες και τις απακετυλάσες, λίγα είναι γνωστά για τα ένζυµα που εµπλέκονται στη φωσφορυλίωση των ιστονών. Αρχικά είχε αναφερθεί πως µία εξαρτώµενη από το camp κινάση καταλύει την φωσφορυλίωση των ιστονών ενώ στη συνέχεια βρέθηκε ότι µία κινάση µη εξαρτώµενη απο το camp µπορεί να φωσφορυλιώσει in vivo την Η3 κατά την µετάφαση. Στις αρχές της δεκαετίας του 80 ταυτοποιήθηκε η πρώτη εξαρτώµενη από το camp κινάση που καταλύει in vitro την φωσφορυλίωση της Η3 στη Ser10 και από τότε έχουν αναφερθεί πολλές κινάσες που 51

66 καταλύουν την συγκεκριµένη τροποποίηση in vivo. Oι κινάσες αυτές χωρίζονται σε δύο κατηγορίες, αυτές που δρούν µέσω των διαφόρων µονοπατιών µεταγωγής µηνυµάτων και φωσφορυλιώνουν κυρίως την Η3 κατά την επαγόµενη από αυτά µεταγραφική ενεργοποίηση και τις µιτωτικές κινάσες, οι οποίες φωσφορυλιώνουν τις ιστόνες Η1 και Η3 στην έναρξη της µίτωσης [24]. Η πρώτη κινάση των ιστονών που σχετίστηκε µε τη µεταγραφική ενεργοποίηση ήταν µία κινάση ΜΑΡ, η Rsk-2 [23], έλλειψη της οποίας σε κύτταρα ασθενών µε σύνδροµο Cοffin-Lowry έχει ως συνέπεια τόσο την απώλεια της ικανότητας για φωσφορυλίωση της Ser10 της Η3, όσο και της έκφρασης του γονιδίου c-fos κατά την επίδραση του αυξητικού παράγοντα EGF [163]. Εκτός από την Rsk-2, η φωσφορυλίωση του συγκεκριµένου αµινοξέος κατά την µεταγραφική ενεργοποίηση των γονιδίων άµεσης απόκρισης βρέθηκε πως καταλύεται και από άλλες δύο κινάσες ΜΑΡ, την MSK1 και την MSK2, ενώ η πρωτεϊνική κινάση Α (ΡΚΑ) φωσφορυλιώνει την Η3 κατά την επαγωγή της µεταγραφής γονιδίων που εµπλέκονται σε ορισµένα µονοπάτια κυτταρικής διαφοροποίησης [164]. Στη Drosophila, η κινάση JIL-1, η οποία εµφανίζει πολλές οµοιότητες µε τις κινάσες MSK, πιστεύεται πως καταλύει τη φωσφορυλίωση της Ser10 της Η3 κατά την ενεργοποίηση της µεταγραφής των γονιδίων που κωδικοποιούν τις πρωτεϊνες θερµικού πλήγµατος. Μεταλλάξεις στην JIL-1 είχαν ως συνέπεια µείωση του επιπέδου φωσφορυλίωσης της Η3, ενώ βρέθηκε πως συνδέεται µε το σύµπλοκο ΜSL, το οποίο εµπλέκεται στον διπλασιασµό της µεταγραφής των γονιδίων του χρωµοσώµατος Χ στις αρσενικές µύγες [165]. Τέλος, βρέθηκε ότι η Ser10 της Η3 φωσφορυλιώνεται in vivo στις περιοχές προαγωγέων που ρυθµίζονται από τον NFκΒ και πρόσφατα ανακαλύφθηκε ότι η κινάση που καταλύει αυτή την τροποποίηση είναι η ΙΚΚα [166]. Η χρήση αναστολέων των κινασών έδειξε ότι οι κινάσες ΜΑΡ που συµµετέχουν στα διάφορα µονοπάτια µεταγωγής µηνυµάτων καταλύουν την φωσφορυλίωση της Η3 που σχετίζεται µε την µεταγραφική ενεργοποίηση, ενώ η κινάση που εµπλέκεται σε κάθε περίπτωση, εξαρτάται από τον παράγοντα που επιδρά στο κύτταρο και επάγει την εκάστοτε απόκριση [24]. Χρήση αναστολέων της φωσφατάσης ΡΡ2Α καθώς και µεταλλάξεις σ αυτή στη Drosophila, επηρέασαν την αποφωσφορυλίωση της Ser10 της Η3, οδηγώντας στην υπόθεση ότι το επίπεδο φωσφορυλίωσης του παραπάνω αµινοξέος πιθανόν να ρυθµίζεται από την ΡΡ2Α [25]. 52

67 Η φωσφορυλίωση της Ser10 της Η3 κατά τη µίτωση βρέθηκε πως καταλύεται από κινάσες που ανήκουν σε δύο δοµικά και εξελικτικά διαφορετικές οικογένειες, τις κινάσες της οικογένειας Aurora και αυτές που είναι οµόλογες µε την κινάση ΝΙΜΑ του A.nidulans [167]. Η οικογένεια κινασών Aurora καθορίζεται από την Ipl1 της ζύµης και τα οµόλογά της σε άλλους οργανισµούς, όπως η Ark1 στον S.pombe, οι Aurora A και B στον C.elegans και στη Drosophila και οι Aurora A, B και C στα θηλαστικά [24]. Η Ipl1 φωσφορυλιώνει την Ser10 της Η3 in vitro και µεταλλάξεις σ αυτήν οδηγούν σε µείωση του επιπέδου φωσφορυλίωσης του συγκεκριµένου αµινοξέος [168], ενώ ο φαινότυπος µεταλλαγµάτων από τα οποία απουσιάζει η Ipl1 µοιάζει µε τον φαινότυπο του Tetrahynema στον οποίο η Ser10 έχει αντικατασταθεί από Ala. Η κινάση Ark1 του S.pombe επίσης φωσφορυλιώνει κατά τη µίτωση την Η3 στη Ser10. Μελέτες στον S.pombe, στη Drosophila και στα θηλαστικά έδειξαν ότι η Aurora A και η Aurora B µπορούν και φωσφορυλιώνουν την Ser10 της Η3 in vitro και in vivo, αλλά πιθανόν µόνο η Aurora B είναι απαραίτητη για την τροποποίηση αυτή [ ]. Επιπλέον, ο διαφορετικός εντοπισµός των δύο ενζύµων στα χρωµοσώµατα ενισχύει τον ρόλο της Aurora B, η οποία συνδέεται µε την INCENP, µία πρωτεϊνη απαραίτητη για τη συµπύκνωση της χρωµατίνης. Παρόλο που απουσία της Aurora B και της INCENP δεν παρατηρούνται ανωµαλίες στη συµπύκνωση των χρωµοσωµάτων, το επίπεδο φωσφορυλίωσης της Ser10 της Η3 µειώνεται σηµαντικά [170]. Η κινάση ΝΙΜΑ αναφέρθηκε πως καταλύει in vitro τη φωσφορυλίωση της Ser10 της Η3 στον A.nidulans και η δράση της συσχετίστηκε µε την συµπύκνωση των χρωµοσωµάτων κατά τη µίτωση. Η ΝΙΜΑ εντοπίζεται σε περιοχές των χρωµοσωµάτων που περιέχουν φωσφορυλιωµένη στη Ser10 H3, ενώ απουσία της τα κύτταρα δεν µπορούν να εισέλθουν στη µίτωση, γεγονός που υποδηλώνει πως είναι απαραίτητη για την µιτωτική φωσφορυλίωση της Η3 [171]. Στα θηλαστικά έχουν βρεθεί πολλές κινάσες οµόλογες µε τη ΝΙΜΑ (Neks), όµως µόνο µία εµφανίζει λειτουργική οµοιότητα, η Nercc1, η οποία καταλύει αποκλειστικά την φωσφορυλίωση της Η3 σε αµινοξέα σερίνης και θρεονίνης, ωστόσο δεν έχει ακόµη αποδειχθεί ότι είναι πράγµατι µιτωτική κινάση της Ser10 [24]. Εκτός από την φωσφορυλίωση της Ser10, έχει αναφερθεί κατά τη µίτωση και φωσφορυλίωση της Ser28 και της Thr11 της Η3, οι οποίες καταλύονται in vitro από την Aurora B και Dlk/ZIP αντίστοιχα [172,173]. Σύµφωνα µε τα µέχρι σήµερα δεδοµένα, η φωσφατάση που αντιστρέφει τη δράση των κινασών της οικογένειας Aurora πιθανόν να 53

68 είναι η ΡΡ1 [24]. Σε όλους τους οργανισµούς που µελετήθηκαν, η ΡΡ1 των θηλαστικών και τα οµόλογά της, η Glc7 στη ζύµη και η CeGlc7 στον C. elegans, εντοπίζονται στα χρωµοσώµατα κατά τη µίτωση και αποφωσφορυλίωνουν την Ser10 της Η3 [174]. Σε ό,τι αφορά τις υπόλοιπες ιστόνες, έχει βρεθεί ότι οι κινάσες που ρυθµίζονται από τον κυτταρικό κύκλο, µε κυριώτερη τη cdc2, καταλύουν την φωσφορυλίωση της συνδετικής ιστόνης Η1 [175], µία τροποποίηση επίσης σηµαντική για την είσοδο του κυττάρου στη µίτωση, ενώ στη φωσφορυλίωση της ισοµορφής Η2ΑΧ της Η2Α στη Ser139, που σχετίζεται µε την επιδιόρθωση βλαβών στην έλικα του DNA, εµπλέκονται µέλη της οικογένειας κινασών PIKK [3] Φωσφορυλίωση των ιστονών και µεταγραφή Η φωσφορυλίωση των ιστονών έχει µελετηθεί σε σχέση µε τη µεταγραφική ενεργοποίηση στα κύτταρα των θηλαστικών και κατά την επαγωγή της µεταγραφής έπειτα από θερµικό πλήγµα στη Drosophila [176]. Ήδη από τις αρχές της δεκαετίας του 90 είχε παρατηρηθεί ότι η επάγωγη της έκφρασης των γονιδίων άµεσης απόκρισης c-fos και c-jun έπειτα από επίδραση αυξητικών παραγόντων, φορβολικών εστέρων και αναστολέων της πρωτεϊνοσύνθεσης, συνοδεύεται από φωσφορυλίωση της Η3, η οποία αργότερα βρέθηκε πως συµβαίνει στη Ser10 [163]. Επίδραση του επιδερµικού αυξητικού παράγοντα (EGF) σε µη διαιρούµενα κύτταρα ινοβλαστών έχει ως αποτέλεσµα την ταχεία φωσφορυλίωση της Ser10 της Η3 από την κινάση Rsk-2 και συµπίπτει µε την επαγωγή της έκφρασης των γονιδίων άµεσης απόκρισης. Η Ser10 της Η3 φωσφορυλιώνεται και κατά την επίδραση άλλων παραγόντων όπως π.χ. η υπεριώδης ακτινοβολία και στην περίπτωση αυτή η κινάση που εµπλέκεται είναι η MSK1 [164]. Επιπλέον, παρατηρήθηκε φωσφορυλίωση από την ίδια κινάση και της Ser28 της Η3, όµως ο ρόλος της συγκεκριµένης τροποποίησης παραµένει ακόµη άγνωστος. Στη ζύµη βρέθηκε ότι ορισµένα γονίδια που η έκφρασή τους ρυθµίζεται από την δράση της ακετυλοτρανσφεράσης Gcn5, ρυθµίζονται επίσης και από την φωσφορυλίωση της Ser10 της Η3, ενώ από την ίδια τροποποίηση ρυθµίζονται και τα επαγόµενα από θερµικό πλήγµα γονίδια στη Drosophila [176,177]. Περαιτέρω µελέτες έδειξαν ότι το πρότυπο της επαγόµενης από τους παραπάνω παράγοντες φωσφορυλίωσης της Ser10 της Η3 διαφέρει από αυτό που παρατηρείται σε διαιρούµενα κύτταρα. Συγκεκριµένα, η παραπάνω τροποποίηση δεν 54

69 εξαπλώνεται σε ολόκληρο το γονιδίωµα, όπως συµβαίνει κατά τη µίτωση, αλλά περιορίζεται στις περιοχές των γονιδίων άµεσης απόκρισης [40]. Το φωσφορυλιωµένο στη Ser10 αµινοτελικό άκρο της Η3 αποδείχθηκε καλό υπόστρωµα για µετέπειτα ακετυλίωση από τις ακετυλοτρανσφεράσες των ιστονών όπως η CBP που καταλύει την ακετυλίωση της Lys14, ενώ η ακετυλίωση της Lys9 και της Lys14 υποβοηθούν την φωσφορυλίωση της Ser10 [162,177]. Αντίθετα, η µεθυλίωση της Lys9 προκαλεί µείωση της φωσφορυλίωσης της Ser10, το επίπεδο της οποίας αυξάνεται σε περίπτωση απώλειας των ενζύµων που καταλύουν τη µεθυλίωση του συγκεκριµένου αµινοξέος [178]. Η συνδιασµένη δράση των παραπάνω τροποποιήσεων in vivo είναι προφανώς πιο περίπλοκη, δεδοµένου ότι η φωσφορυλίωση της Ser10 και η ακετυλίωση της Lys14 εξαρτώνται από την περιοχή του προαγωγέα και από τα ένζυµα που εµπλέκονται [24,25]. Ο ακριβής µηχανισµός µε τον οποίο η φωσφορυλίωση της Η3 συµµετέχει στην ενεργοποίηση της µεταγραφής δεν έχει ακόµη διευκρινιστεί. Πιθανόν η προσθήκη αρνητικά φορτισµένων φωσφορικών οµάδων στο αµινοτελικό άκρο των ιστονών προκαλεί µείωση του θετικού τους φορτίου και οδηγεί σε µία πιο «χαλαρή» δοµή της χρωµατίνης, διευκολύνοντας µ αυτό τον τρόπο την πρόσβαση των µεταγραφικών παραγόντων στο εκµαγείο του DNA [179]. Επιπλέον, η φωσφορυλίωση συµµετέχει στη µεταγραφική ενεργοποίηση υποβοηθώντας την αύξηση του επιπέδου ακετυλίωσης του αµινοτελικού άκρου της Η3. Έχει αποδειχθεί ότι κατά την ενεργοποίηση των γονιδίων c-jun και c-fos το αµινοτελικό άκρο της Η3 είναι ταυτόχρονα φωσφορυλιωµένο και ακετυλιωµένο [180]. Σύµφωνα µ αυτό το µοντέλο, κατά την επαγωγή της µεταγραφικής ενεργοποίησης από αυξητικούς παράγοντες η Ser10 της Η3 φωσφορυλιώνεται µε τη βοήθεια των κινασών ΜΑΡ και στη συνέχεια στο φωσφορυλιωµένο άκρο της Η3 προσδένεται µία ακετυλοτρανσφεράση, η οποία καταλύει την ακετυλίωση των γειτονικών λυσινών, προάγωντας την µεταγραφή των γονιδίων [42]. 55

70 Φωσφορυλίωση των ιστονών και µίτωση Η ανακάλυψη, τη δεκαετία του 70, της φωσφορυλίωσης της Η3 κατά τη µίτωση άνοιξε τον δρόµο για την κατανόηση των σχετιζόµενων µε τον κυτταρικό κύκλο τροποποιήσεων της χρωµατίνης και οι µελέτες που ακολούθησαν απέδειξαν τον σηµαντικό ρόλο της τροποποίησης αυτής στη συµπύκνωση των χρωµοσωµάτων κατά την κυτταρική διαίρεση σε όλους σχεδόν τους ευκαρυωτικούς οργανισµούς [ ]. Βρέθηκε ότι η φωσφορυλίωση της Ser10 της Η3 συµβαίνει ταυτόχρονα µε την έναρξη της συµπύκνωσης των χρωµοσωµάτων κατά τη µίτωση [183], ενώ αντικατάσταση της Ser10 από Ala στον Tetrahynema οδήγησε σε ανωµαλίες στη συµπύκνωση της χρωµατίνης και σε ατέλειες κατά των διαχωρισµό των χρωµοσωµάτων κατά την ανάφαση [182]. Η συγκεκριµένη τροποποίηση στα θηλαστικά είναι απαραίτητη για την έναρξη της συµπύκνωσης των χρωµοσωµάτων, όχι όµως και για την διατήρηση της συµπυκνωµένης δοµής της χρωµατίνης [181]. Αξίζει να σηµειωθεί ότι στη ζύµη η φωσφορυλίωση της Ser10 της Η3 δεν είναι απαραίτητη για την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου και έχει προταθεί ότι στην διαδικασία αυτή εµπλέκεται η φωσφορυλίωση της Η2Β [168]. Στα θηλαστικά η φωσφορυλίωση της Ser10 της Η3 αρχικά εµφανίζεται στο τέλος της φάσης G2, το επίπεδό της αυξάνεται στην πρόφαση, κατά την έναρξη της συµπύκνωσης των χρωµοσωµάτων, οι µέγιστες τιµές παρατηρούνται κατά τη µετάφαση, ενώ µειώνεται στο στάδιο της τελόφασης και στο τέλος της µίτωσης έχει ολοκληρωθεί η αποφωσφορυλίωσή της [181]. Επιπλέον παρατηρήθηκε ότι η συγκεκριµένη τροποποίηση εµφανίζεται πρώτα στην περικεντρική ετεροχρωµατίνη και στη συνέχεια εξαπλώνεται σε όλη τη χρωµατίνη κατά τη µετάβαση από τη φάση G2 στη φάση Μ [183] (Εικόνα 1.3.3). Αντίθετα, µελέτες στα φυτά έδειξαν ότι η τροποποίηση αυτή ξεκινάει στο τέλος της πρόφασης, δηλαδή µετά την έναρξη της συµπύκνωσης των χρωµοσωµάτων και έχει προταθεί ότι σχετίζεται κυρίως µε την συνοχή τους παρά µε τη συµπύκνωσή τους. Η φωσφορυλίωση της Ser10 της Η3 συµβαίνει επίσης κατά τη µείωση [182,183] και η κινητική της βρέθηκε πως είναι παρόµοια µε αυτή της µίτωσης. Εξαίρεση αποτελεί το καλαµπόκι, όπου η συγκεκριµένη τροποποίηση σχετίζεται µε τη διατήρηση της συνοχής των αδελφών χρωµατίδων και όχι µε τη συµπύκνωση των χρωµοσωµάτων [184] και ο C. elegans, όπου η συµπύκνωση των χρωµοσωµάτων µπορεί να συµβεί ακόµη και απουσία της φωσφορυλίωσης της Η3 [185]. 56

71 Εικόνα Φωσφορυλίωση της Ser10 της Η3 κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου. Με κόκκινο εικονίζεται η χρωµατίνη που περιέχει φωσφορυλιωµένη Η3, µε γκρι η χρωµατίνη που περιέχει µη φωσφορυλιωµένη Η3, µε µπλε τα κεντροσώµατα και µε πράσινο τα ινίδια της µιτωτικής ατράκτου. Η φωσφορυλίωση της Ser10 της Η3 εµφανίζεται κατά τη µετάβαση από τη φάση G2 στη Μ στην περικεντρική χρωµατίνη, φτάνει στο απόγειό της κατά την πρόφαση και µειώνεται στο τέλος της µίτωσης. [Histone H3 Ser10 phosphorylation during the cell cycle. The modification appears in pericentric chromatin during G2-M transition, peaks during prophase and disappears at the end of mitosis (red: chromatin containing phosphorylated H3; gray: chromatin containing non-phosphorylated H3; blue: centrosomes; green: mitotic spindle s fibers)] Έχουν προταθεί τρία µοντέλα σχετικά µε το ρόλο της φωσφορυλίωσης της Ser10 της Η3 στη συµπύκνωση των χρωµοσωµάτων. Σύµφωνα µε το πρώτο, η φωσφορυλίωση του αµινοτελικού άκρου της Η3 µειώνει την αλληλεπίδρασή της µε το DNA διευκολύνοντας την πρόσβαση των απαραίτητων παραγόντων για τη συµπύκνωση της χρωµατίνης, κατάσταση που αντιστρέφεται µε την αποφωσφορυλίωσή της [24]. Το δεύτερο µοντέλο προτείνει πως οι απαιτούµενοι για τη συµπύκνωση των χρωµοσωµάτων παράγοντες επιστρατεύονται 57

72 στη χρωµατίνη µέσω άµεσων αλληλεπιδράσεων µε το φωσφορυλιωµένο αµινοτελικό άκρο της Η3 ή γενικότερα µε τη χρωµατίνη που περιέχει φωσφορυλιωµένη Η3 [162,182]. Τέλος, έχει προταθεί ότι η φωσφορυλίωση της Ser10 της Η3 λειτουργεί ως «σηµάδι» των χρωµοσωµάτων κατά τη µετάβασή της από την µετάφαση στην ανάφαση. Αφού τα χρωµοσώµατα έχουν περάσει τα διάφορα στάδια ελέγχου και έχουν φτάσει στη µετάφαση, η φωσφορυλίωση της Η3 πιθανόν να αποτελεί µία ένδειξη ότι µπορούν να συνεχίσουν στα επόµενα στάδια του κυτταρικού κύκλου. Με το τέλος της ανάφασης, το «σηµάδι» δεν είναι πλέον απαραίτητο και η Η3 αποφωσφορυλιώνεται [167]. Εκτός από την φωσφορυλίωση της Ser10, έχει αναφερθεί κατά τη µίτωση και φωσφορυλίωση της Ser28 της Η3, η οποία καταλύεται in vitro επίσης από την Aurora-B [172] και η κινητική της διαφέρει ελάχιστα από την αντίστοιχη της φωσφορυλίωσης της Ser10, καθώς και της Thr11, η οποία καταλύεται από την κινάση Dlk/ZIP [173]. Παρόλο που η φωσφορυλίωση της Ser28 παρατηρείται µόνο κατά τη µίτωση, ο ρόλος της δεν έχει πλήρως διευκρινιστεί [172]. Επίσης, έχει βρεθεί ότι κατά την έναρξη της µίτωσης φωσφορυλίωνεται και η συνδετική ιστόνη Η1 από την κινάση cdc2 [175]. Παρόλα αυτά, µετέπειτα µελέτες έδειξαν ότι η συµπύκνωση των χρωµοσωµάτων µπορεί να συµβεί χωρίς να έχει προηγηθεί φωσφορυλίωση της Η1, αλλά και απουσία της ίδιας της Η1, γεγονός που θέτει σε αµφισβήτηση τον βιολογικό ρόλο της παραπάνω τροποποίησης [167]. 58

73 Φωσφορυλίωση των ιστονών και επιδιόρθωση του DNA Έχει παρατηρηθεί σε κύτταρα θηλαστικών ότι έπειτα από επίδραση παραγόντων που προκαλούν βλάβες στη διπλή έλικα του DNA, µία ισοµορφή της Η2Α, η Η2Α.Χ, υφίσταται φωσφορυλίωση στη Ser139. In vitro µελέτες έδειξαν ότι η συγκεκριµένη τροποποίηση της Η2Α.Χ καταλύεται από µέλη της οικογένειας κινασών PIKK. Η φωσφορυλιωµένη στη Ser139 Η2Α.Χ εντοπίζεται µαζί µε παράγοντες απαραίτητους για την επιδιόρθωση βλαβών της διπλής έλικας του DNA, όπως o Nbs1, η Rad51 και η BRCA1, ενώ βρέθηκε πως αλληλεπιδρά µε τον Nbs1. Πειράµατα µε µεταλλάξεις έδειξαν ότι η φωσφορυλίωση της Η2Α.Χ δεν είναι απλά αποτέλεσµα των βλαβών στο DNA, αλλά πιθανόν να είναι απαραίτητη για την επιδιόρθωσή του και έχει προταθεί ότι πιθανόν να συντελεί στην επιστράτευση των σχετιζόµενων µε την επιδιόρθωση του DNA παραγόντων στις περιοχές που έχουν υποστεί βλάβες [43-47]. Κατά τον αποπτωτικό θάνατο των κυττάρων παρατηρούνται µεταβολές στην οργάνωση της χρωµατίνης, για τις οποίες πιθανόν να απαιτούνται και συγκεκριµένες τροποποιήσεις των ιστονών, τοείδος των οποίων πιθανόν να εξαρτάται από τον κυτταρικό τύπο και τη φύση του παράγοντα που προκαλεί απόπτωση [23]. Έχει παρατηρηθεί ότι έπειτα από επίδραση µίας ποικιλίας αποπτωτικών παραγόντων επάγεται η φωσφορυλίωση τόσο της Ser139 της Η2Α.Χ, όσο και της Ser32 της Η2Β [47,186]. Οι παραπάνω τροποποιήσεις συµβαίνουν παράλληλα µε την κλασµάτωση του DNA, η οποία παρατηρείται κατά τα πρώτα στάδια της απόπτωσης. Έχουν αναφερθεί τροποποιήσεις και των υπολοίπων ιστονών κατά την απόπτωση, όπως φωσφορύλιωση της Ser10 της Η3 και φωσφορυλίωση των ιστονών Η1 και Η4, οι οποίες όµως παρατηρούνται µόνο κατά την επίδραση συγκεκριµένων παραγόντων [23]. 59

74 1.3.3 ΜΕΘΥΛΙΩΣΗ ΤΩΝ ΙΣΤΟΝΩΝ Η µεθυλίωση των ιστονών ανακαλύφθηκε τη δεκαετία του 60 όµως µέχρι πρόσφατα λίγα ήταν γνωστά σχετικά µ αυτή. Αυτό οφείλεται στο ότι η προσθήκη µεθυλοµάδων δεν µεταβάλλει το φορτίο, συνεπώς ούτε και την ηλεκτροφορετική κινητικότητα των πρωτεϊνών, δυσκολεύοντας την ανίχνευσή τους καθώς και στην έλλειψη κατάλληλων αντισωµάτων για τις µεθυλιωµένες ιστόνες. Εξαιτίας των παραπάνω, λίγα πράγµατα ήταν γνωστά π.χ. για τα ένζυµα που εµπλέκονται ή για το ρόλο της µεθυλίωσης των ιστονών στις λειτουργίες της χρωµατίνης. Κυριαρχούσε η πεποίθηση πως αντίθετα από την ακετυλίωση, η µεθυλίωση είναι µία µη αντιστρεπτή, στατική τροποποίηση των ιστονών. Αντίθετα, µελέτες που έγιναν την τελευταία πενταετία, οδήγησαν σε συσσώρευση στοιχείων σχετικά µε την µεθυλίωση των ιστονών: σε πολλούς οργανισµούς έχουν ταυτοποιηθεί τα ένζυµα που µεταφέρουν τις µεθυλοµάδες από την S-αδένοσυλο-L-µειθειονίνη στις ιστόνες, έχουν βρεθεί τα αµινοξέα που τροποποιούνται σε κάθε ιστόνη, έχει µελετηθεί η σχέση της µε τις διάφορες διαδικασίες που συµβαίνουν στη χρωµατίνη καθώς και η αλληλεπίδρασή της µε τις υπόλοιπες τροποποιήσεις των ιστονών. Η µεθυλίωση συµβαίνει σε αµινοξέα αργινίνης και λυσίνης των ιστονών Η3 και Η4. Συγκεκριµένα, οι αργινίνες που τροποποιούνται είναι οι Arg2, -17, -26 της Η3 και η Arg3 της Η4 ενώ οι λυσίνες είναι αντίστοιχα, οι Lys4, -9, -27, -36, -79 της Η3 και η Lys20 της Η4 [29]. Το πραπάνω πρότυπο µεταβάλλεται ελαφρώς στα φυτά, όπου έχει παρατηρηθεί µεθυλίωση και στις Lys14, -18 και -23 της Η3, ενώ δεν µεθυλιώνεται η Lys20 της Η4 [30]. Γενικά, η µεθυλίωση σε αµινοξέα αργινίνης έχει συσχετισθεί µε την µεταγραφική ενεργοποίηση, ενώ η µεθυλίωση σε αµινοξέα λυσίνης εµπλέκεται τόσο στην µεταγραφή, όπως η µεθυλίωση στη Lys4 της Η3, όσο και στην καταστολή της µεταγραφής και στο σχηµατισµό της ετεροχρωµατίνης, όπως η µεθυλίωση στη Lys9 της Η3 [26,27]. Η πεποίθηση ότι η µεθυλίωση είναι µία µη αντιστρεπτή τροποποίηση οδήγησε στην υπόθεση ότι ίσως να αποτελεί µέρος ενός µηχανισµού επιγενετικής ρύθµισης της γονιδιακής έκφρασης, όµως η ανακάλυψη ενζύµων και µηχανισµών που εµπλέκονται στην αποµεθυλίωση των ιστονών, έθεσε υπό αµφισβήτηση την παραπάνω υπόθεση [187,188]. 60

75 Μεθυλίωση των ιστονών σε αµινοξέα αργινίνης Η µεθυλίωση σε αµινοξέα αργινίνης συµβαίνει στις περιοχές των αµινοτελικών άκρων των ιστονών Η3 (Arg2, -7, -26) και Η4 (Arg3) [29] και είναι το αποτέλεσµα της πρόσδεσης µίας ή δύο µεθυλοµάδων στα δύο τελικά άτοµα αζώτου της αργινίνης. Μ αυτό τον τρόπο δηµιουργείται είτε µονοµεθυλοαργινίνη ή διµεθυλοαργινίνη, η οποία µπορεί να είναι ασύµµετρη ή συµµετρική, ανάλογα µε το αν η προσθήκη των δύο µεθυλοµάδων γίνεται αντίστοιχα στο ένα ή και στα δύο άτοµα αζώτου [189]. Η ανακάλυψη πως η CARM1 είναι ταυτόχρονα µεθυλοτρανσφεράση αργινίνης της Η3 και συνενεργοποιητής ορµονικών πυρηνικών υποδοχέων, οδήγησε στην υπόθεση ότι η τροποποίηση αυτή σχετίζεται µε την ενεργοποίηση της µεταγραφής, γεγονός που επιβεβαιώθηκε αργότερα µε τη χρήση αντισωµάτων. Επιπλέον βρέθηκε ότι η CARM1 λειτουργεί συνεργιστικά µε την ακετυλοτρανσφεράση p300 µε αποτέλεσµα την ενίσχυση της µεταγραφικής δραστηριότητας έπειτα από ενεργοποίηση πυρηνικών υποδοχέων [190]. Τα ένζυµα που καταλύουν τη µεθυλίωση των ιστονών σε αµινοξέα αργινίνης ανήκουν στην οικογένεια συνενεργοποιητών πυρηνικών υποδοχέων PRMT και µπορούν να χωριστούν σε δύο κατηγορίες, ανάλογα µε το αν από τη δράση τους προκύπτει συµµετρική ή ασύµµετρη διµεθυλίωση. Στην πρώτη κατηγορία ανήκουν οι µεθυλοτρανσφεράσες PRMT1, CARM1/PRMT4, PRMT3 και PRMT2, ενώ στη δεύτερη ανήκει η PRMT5 [191]. Η ανασυνδιασµένη PRMT1 καταλύει τη µεθυλίωση αργινινών πολλών πρωτείνών που προσδένονται στο RNA καθώς και τη µεθυλίωση της Η4 στην Arg3 in vitro, ενώ η δραστικότητά της επικεντρώνεται σε ένα πολυπεπτίδιο 43kDa το οποίο λειτουργεί σε ένα ολιγοµερές 350kDa [192]. Έχει βρεθεί ότι η PRMT1 εµπλέκεται στη ρύθµιση πολλών κυτταρικών λειτουργιών µέσω της µεθυλίωσης πρωτεϊνών που σχετίζονται µε την επικοινωνία πυρήνα-κυτταροπλάσµατος, την µεταγωγή µηνυµάτων και τη µεταγραφή [191]. Η CARM1/PRMT4 ανακαλύφθηκε ως πρωτεϊνη που αλληλεπιδρά µε τον GRIP1, µέλος της οικογένειας συνεργοποιητών p160. Παρουσιάζει εξαιρετική οµολογία µε τα µέλη της οικογένειας PRMT και αποδείχθηκε ότι καταλύει in vitro τη µεθυλίωση της Η3 στις Arg2, -17 και -26. Η CARM1 είναι παράλληλα και συνενεργοποιητής που συµµετέχει στη µεταγραφική ρύθµιση παρουσία των συνενεργοποιητών της οικογένειας p160 και πειράµατα µε µεταλλάξεις έδειξαν ότι η συµµετοχή της σ αυτή τη διαδικασία έγκειται στη δράση της ως 61

76 µεθυλοτρανσφεράση των ιστονών [193]. Η PRMT2 εµφανίζει υψηλή οµολογία µε τα µέλη της οικογένειας PRMT όµως ακόµη δεν έχει αποδειχθεί η δράση της ως µεθυλοτρανσφεράση αργινίνης, ενώ η PRMT3, που αρχικά ταυτοποιήθηκε στη ζύµη, έχει αποδειχθεί ότι εµφανίζει δράση µεθυλοτρανσφεράσης αργινίνης µε διαφορετική εξειδίκευση από την PRMT1. Η PRMT5 αρχικά ταυτοποιήθηκε ως το οµόλογο στον άνθρωπο της πρωτεϊνης Skb1 του S. pombe και αργότερα βρέθηκε πως προσδένεται στη κινάση Jak (JBP1). Η οµολογία της SKB1/JBP1 καθώς και του οµολόγου της στη ζύµη, HSL7, µε τα µέλη της οικογένειας PRMT αποτέλεσαν την ένδειξη για πιθανή λειτουργία τους ως µεθυλοτρανσφεράσες αργινίνης, η οποία και αποδείχθηκε στη συνέχεια, οπότε και η πρωτεϊνη µετονοµάστηκε σε PRMT5. Η PRMT5 εντοπίζεται κυρίως στο κυτταρόπλασµα και βρέθηκε ότι µπορεί να καταλύσει in vitro τη µεθυλίωση πολλών πρωτεϊνών, µεταξύ των οποίων και των ιστονών Η2Α και Η4. Επιπλέον, µελέτες έχουν δείξει ότι παίζει σηµαντικό ρόλο στη ρύθµιση του κυτταρικού κύκλου, χωρίς όµως να είναι πλήρως κατανοητός ο µηχανισµός µε τον οποίο εµπλέκεται σ αυτή τη διαδικασία [191]. Το τελευταίο µέλος της οικογένειας που έχει ανακαλυφθεί είναι η PRMT6, η οποία ανήκει στην πρώτη κατηγορία µεθυλοτρανσφερασών αργινίνης, όµως παρουσιάζει διαφορετική εξειδίκευση υποστρώµατος από τις PRMT1 και PRMT4. Επιπλέον, είναι το µοναδικό µέλος της οικογένειας που έχει την ικανότητα να αυτοµεθυλιώνεται [194]. Τα µέλη της οικογένειας PRMT διαφέρουν σηµαντικά µεταξύ τους σε ό,τι αφορά το µέγεθός τους, µοιράζονται όµως πολλά κοινά στοιχεία όπως την εξαιρετικά συντηρηµένη περιοχή του ενεργού κέντρου. Οι διαφορές που υπάρχουν ανάµεσα στα διάφορα ένζυµα αυτής της οικογένειας πιθανόν να έγκειται σε µη συντηρηµένες περιοχές των άκρων, οι οποίες ίσως και να καθορίζουν την εξειδίκευση του κάθε ενζύµου καθώς και την ικανότητά του να σχηµατίζει ολιγοµερή [191]. 62

77 Μεθυλίωση των ιστονών σε αµινοξέα λυσίνης Οι λυσίνες που τροποποιούνται µε πρόσδεση µεθυλοµάδων βρίσκονται στα αµινοτελικά άκρα των ιστονών Η3 (Lys4, -9, -27, -36 και επιπλέον στα φυτά, οι Lys14, -18, -23) και Η4 (Lys20, µε εξαίρεση τα φυτά) καθώς και στη κεντρική περιοχή της Η3 (Lys79) [30,195]. Ανάλογα µε τον αριθµό των µεθυλοµάδων που προστίθενται, οι παραπάνω λυσίνες µπορεί να είναι µόνο-, δι- ή και τρι-µεθυλιωµένες. Η πρόσδεση των µεθυλοµάδων αυξάνει την υδροφοβικότητα των ιστονών χωρίς να επηρεάζει το φορτίο τους [27]. Έχει βρεθεί ότι η χρωµατίνη σε περιοχές ενεργοποιηµένων γονιδίων είναι εµπλουτισµένη σε τρι-µεθυλιωµένη Η3 στη Lys4, ενώ η µεταγραφική δραστηριότητα σχετίζεται και µε την δι-µεθυλίωση της ίδιας θέσης [196]. Αντίθετα, η µεθυλίωση της Lys9 της Η3 συναντάται σε µεταγραφικά ανενεργές περιοχές της χρωµατίνης και έχει συσχετισθεί µε την καταστολή της γονιδιακής έκφρασης και τον σχηµατισµό της ετεροχρωµατίνης [29,197]. Με τη µεταγραφική καταστολή σχετίζεται επίσης και η µεθυλίωση των Lys27 της Η3 και Lys20 της Η4 [28]. Η µεθυλίωση των αµινοξέων λυσίνης των ιστονών καταλύεται από µεθυλοτρανσφεράσες που φέρουν στο µόριό τους µία εξαιρετικά συντηρηµένη περιοχή 130 αµινοξέων, την περιοχή SET. Το µοτίβο αυτό ταυτοποιήθηκε αρχικά σε τρείς πρωτεϊνες της Drosophila, τη Su(var)3-9, την Enhancer of zeste, µέλος της οικογένειας πρωτεϊνών Polycomb και την Trithorax, µέλος της οικογένειας Trithorax. Περισσότερες από 200 πρωτεϊνες, που επιτελούν ποικίλες λειτουργίες και που συναντώνται σε ευρή φάσµα οργανισµών, βρέθηκε πως περιέχουν την περιοχή SET και έχει προταθεί ότι ο κύριος ρόλος τους είναι η ρύθµιση της γονιδιακής έκφρασης. Η µελέτη πρωτεϊνών των φυτών που περιείχαν το παραπάνω µοτίβο και η ανακάλυψη ότι πολλές απ αυτές δρούν ως µεθυλοτρανσφεράσες λυσίνης, οδήγησε στο συµπέρασµα ότι πιθανόν η περιοχή SET να αποτελεί χαρακτηριστικό στοιχείο των µεθυλοτρανσφερασών [198]. Το πρώτο µέλος της οικογένειας που ταυτοποιήθηκε ήταν η πρωτεϊνη Su(var)3-9 της Drosophila, η οποία, όπως και τα οµόλογά της στον άνθρωπο, τον ποντικό, τον S. pombe, το Arabidopsis και τον N. crassa (SUV39H1, Suv39h1, Clr4, KYP και Dim5 αντίστοιχα), καταλύουν τη µεθυλίωση της Η3 στη Lys9. Για την κατάλυση απαιτούνται, εκτός από την περιοχή SET, άλλες δύο περιοχές πλούσιες σε κυστεϊνη, πριν και µετά από αυτήν. Πρωτεϊνες από τις οποίες απουσιάζει µία ή και οι δύο, όπως π.χ. η EZH2 και η TRX,δεν εµφανίζουν δράση µεθυλοτρανσφεράσης των 63

78 ιστονών [178]. Επιπλέον τα οµόλογα της Su(var)3-9 στα θηλαστικά και στον S. pombe συνδέονται µε την HP1 και την οµόλογή της Swi6 αντίστοιχα, δύο πρωτεϊνες που σχετίζονται µε τον σχηµατισµό της ετεροχρωµατίνης [27]. Ένα άλλο χαρακτηριστικό των πρωτεϊνών αυτών είναι η παρουσία µίας εξελικτικά συντηρηµένης περιοχής, της chromodomain, η οποία συναντάται σε πρωτεϊνες που σχετίζονται µε την χρωµατίνη, όπως π.χ. η HP1 και Clr4 και που απαιτείται για την αναγνώριση και πρόσδεση σε µεθυλιωµένες λυσίνες [199]. Στη συνέχεια ταυτοποιήθηκε άλλη µία µεθυλοτρανσφεράση της Lys9 της Η3 στον ποντικό, η Suv39h2, η οποία συσσωρεύεται στο απενεργοποιηµένο χρωµόσωµα Χ και έχει προταθεί, παρόλο που δεν έχει αποδειχτεί ακόµη, πως συµµετέχει στην συγκρότηση της µειωτικής ετεροχρωµατίνης κατά την µεταγραφική ανενεργοποίησή του. Παρόµοια δοµή µε τα παραπάνω ένζυµα έχει και η πρωτείνη G9a, η οποία αποδείχθηκε ότι είναι µεθυλοτρανσφεράση των ιστονών και καταλύει τη µεθυλίωση τόσο της Lys9, όσο και της Lys27 της Η3. Μια άλλη µεθυλοτρανσφεράση των ιστονών, η CLLD8, εκτός από την περιοχή SET και τις γειτονικές της, πλούσιες σε κυστεϊνη περιοχές, φέρει και µία περιοχή πρόσδεσης σε µεθυλιωµένες βάσεις CpG του DNA, η οποία πιθανόν να την κατευθύνει σε περιοχές µε µεθυλιωµένο DNA, ώστε να µεθυλιώσουν τις ιστόνες που βρίσκονται εκεί. Έχει προταθεί ότι η CLLD8 συµµετέχει στη λευχαιµογένεση όπως και η SETDB1 και η οµόλογή της στον ποντικό ESET, η οποία αλληλεπιδρά µε τον µεταγραφικό παράγοντα ERG και πιθανόν να ρυθµίζει τη δράση του µέσω της µεθυλίωσης των ιστονών [28]. Εκτός από τα οµόλογα της Su(var)3-9, η περιοχή SET έχει βρεθεί και σε άλλες πρωτεϊνες, όπως η yset1 της ζύµης, η οποία καταλύει τη µεθυλίωση της Lys4 της Η3, τα οµόλογά της στον άνθρωπο, οι hset1a και hset1b, η ενζυµική δράση των οποίων δεν έχει ακόµη επιβεβαιωθεί καθώς και πρωτεϊνες-µέλη των οµάδων Polycomb (π.χ. EZH1 και EZH2) και Trithorax (π.χ. MLL, MLL2), που σχετίζονται µε διάφορες λειτουργίες της χρωµατίνης. Αξίζει να σηµειωθεί ότι στη ζύµη δεν έχουν βρεθεί οµόλογα της Su(var)3-9 και της ΗΡ1 και δεν παρατηρείται µεθυλίωση της Lys9 της Η3. Η περιοχή SET των παραπάνω πρωτεϊνών βρίσκεται στο καρβοξυτελικό τους άκρο και ακολουθείται από την πλούσια σε κυστεϊνη περιοχή (µε εξαίρεση τις ΕΖΗ1 και ΕΖΗ2), ενώ δεν υπάρχει παρόµοια περιοχή πριν από αυτή. Αντίθετα, στη yset2 που µεθυλιώνει την Lys36 της Η3, και στα οµόλογά της, η περιοχή SET περιβάλλεται από δύο περιοχές πλούσιες σε κυστεϊνη, όπως και η Su(var)3-9. Παρόµοια δοµή έχει και η NSD1 64

79 στον ποντικό, η οποία επίσης µεθυλιώνει την Lys36 της Η3. Η Ash1 στη Drosophila, καθώς και τα οµόλογά της στα θηλαστικά, καταλύουν τη µεθυλίωση των Lys4 και Lys9 της Η3 και της Lys20 της Η4, αλληλεπιδρούν µε την ακετυλο-τρανσφεράση p300/cbp, ενώ η δοµή τους περιλαµβάνει και µία περιοχή bromodomain. Στον άνθρωπο η µεθυλίωση της Lys4 της Η3 καταλύεται από την SET7/SET9, από την οποία απουσιάζουν οι γετονικές, πλούσιες σε κυστεϊνη περιοχές της περιοχής SET και έχει αποδειχθεί ότι συµµετέχει στην µεταγραφική ενεργοποίηση in vitro [28,200]. Υπάρχουν όµως και µεθυλοτρανσφεράσες των ιστονών που η δοµή τους δεν περιλαµβάνει περιοχή SET. Τέτοια είναι η Dot1 της ζύµης, η οποία καταλύει τη µεθυλίωση της Lys79 της Η3, µία τροποποίηση που συναντάται σε ένα ευρύ φάσµα οργανισµών. Η λυσίνη αυτή βρίσκεται στην κεντρική περιοχή της Η3 και η µεθυλίωσή της σχετίζεται µε την καταστολή της µεταγραφής στην περιοχή του τελοµέρους, όπως έχουν δείξει πειράµατα µε µεταλλάξεις, τόσο στην Dot1, όσο και στη Lys79. Επιπλέον, έχει βρεθεί ότι για την µεθυλίωση της συγκεκριµένης θέσης απαιτείται προηγούµενη ουβικουιτίνωση της Η2Β στη Lys123 από την Rad6 γεγονός που αποτελεί ένα ακόµη παράδειγµα αλληλεπίδρασης και συνεργασίας µεταξύ δύο διαφορετικών τροποποιήσεων των ιστονών [201]. 65

80 Αποµεθυλίωση των ιστονών Όπως έχει ήδη αναφερθεί, η µεθυλίωση των ιστονών θεωρούταν για πολλά χρόνια µη αντιστρεπτή τροποποίηση, παρόλο που ενδείξεις για το αντίθετο υπήρχαν ήδη από τις αρχές τις δεκαετίας του 70. Πρόσφατες µελέτες οδήγησαν στην ανακάλυψη ενζύµων και µηχανισµών που µπορούν να αποµακρύνουν την µεθυλοµάδα από τα αµινοξέα λυσίνης και αργινίνης, καθιστώντας τον ρόλο της µεθυλίωσης των ιστονών ακόµη πιο περίπλοκο [187,188]. Βρέθηκε πως η LSD1 (επίσης γνωστή ως BHC110 ή p110b), που είχε ταυτοποιηθεί ως υποµονάδα πολλών κατασταλτικών συµπλόκων, µπορεί να αποµεθυλιώσει την µονο- και δι- µεθυλιωµένη Lys4 της Η3 [202]. Η LSD1 δεν µπορεί να αποµεθυλιώσει την τρι-µεθυλιωµένη µορφή της Lys4, για την οποία πιθανόν να απαιτούνται άλλα, παρόµοια ή µη, ένζυµα ή/και διαφορετικός µηχανισµός κατάλυσης. Η LSD1 δεν ανήκει σε κάποια µεγάλη οικογένεια ενζύµων, ούτε υπάρχουν πολλές οµόλογες µ αυτήν πρωτεϊνες, ενώ έχει προταθεί ότι η δράση της ρυθµίζεται από πρωτεϊνες που συνδέονται σ αυτήν. Για παράδειγµα, διαπιστώθηκε πως ο υποδοχέας των ανδρογόνων µπορεί και µεταβάλλει την εξειδίκευση της LSD1 έτσι ώστε αντί για την Lys4 να αποµεθυλιώνει την Lys9, βοηθώντας στην ενεργοποίηση της µεταγραφής των γονιδίων που ρυθµίζονται από τον παραπάνω υποδοχέα. Ο µηχανισµός της οξείδωσης της αµίνης, µε τον οποίο ένζυµα όπως η LSD1 καταλύουν την αποµεθυλίωση της λυσίνης πιθανόν να ισχύσει και στην περίπτωση της αργινίνης [187]. Επιπλέον, έχει προταθεί και ένα εναλλακτικό µονοπάτι, σύµφωνα µε το οποίο η αποµάκρυνση της µεθυλοµάδας από την αργινίνη γίνεται µέσω της µετατροπής της µεθυλοαργινίνης σε κιτρουλλίνη. Το ένζυµο που καταλύει την παραπάνω µετατροπή είναι η πεπτιδύλο-απιµινάση της αργινίνης 4 (PADI4), η οποία µετατρέπει µη τροποποιηµένα και µονο-µεθυλιωµένα αµινοξέα αργινίνης των ιστονών Η3 και Η4 σε κιτρουλλίνη. Έχει παρατηρηθεί ότι σε κύτταρα θηλαστικών το παραπάνω µοντέλο σχετίζεται µε την καταστολή της µεταγραφής του γονιδίου ps2 [203]. 66

81 Μεθυλίωση των ιστονών και µεταγραφή Μελέτες έχουν δείξει ότι τόσο η CARM1, όσο και η PRMT1 λειτουργούν ως συνενεργοποιητές πυρηνικών υποδοχέων, όµως µόνο όταν εκφράζονται µαζί µε συνενεργοποιητές-µέλη της οικογένειας p160, οπότε και ενισχύουν τη µεταγραφή των γονιδίων που ρυθµίζονται από τον αντίστοιχο υποδοχέα. Επιπλέον, δρούν συνεργιστικά µε ακετυλοτρανσφεράσες, όπως η p300, προάγοντας την µετέπειτα ακετυλίωση των ιστονών Η3 και Η4 αντίστοιχα από αυτές, ενώ για τη δράση τους απαιτείται η παρουσία του GRIP1, µέλους της οικογένειας p160. Mεταλλάξεις στην περιοχή πρόσδεσης της S-αδενυλοσυλ-L-µεθειονίνης, έδειξαν ότι η δράση των CARM1 και PRMT1 ως µεθυλοτρανσφεράσες των ιστονών είναι απαραίτητη για τη λειτουργία τους ως συνενεργοποιητές. Επίσης, έχει αποδειχθεί ότι οι CARM1 και PRMT1 δρούν συνεργιστικά µεταξύ τους για την ενίσχυση της µεταγραφής και η δράση τους αυτή εξαρτάται από την παρουσία συνεργοποιητών της οικογένειας p160 [192]. Τα παραπάνω δεδοµένα οδήγησαν σε ένα µοντέλο λειτουργίας σύµφωνα µε το οποίο η ενεργοποίηση του πυρηνικού υποδοχέα επιστρατεύει τον συνενεργοποιητή-µέλος της οικογένειας p160 στην περιοχή του προαγωγέα, στον οποίο προσδένονται µεθυλοτρανσφεράσες και ακετυλοτρανσφεράσες. Στη συνέχεια, µέσω της µεθυλίωσης και της µετέπειτα ακετυλίωσης των ιστονών Η3 και Η4 µεταβάλεται η δοµή της χρωµατίνης στην περιοχή αυτή και διευκολύνεται η έναρξη της µεταγραφής [26] (Εικόνα 1.3.4). Η µεθυλίωση των ιστονών σε αµινοξέα λυσίνης επηρεάζει την µεταγραφή τόσο θετικά όσο και αρνητικά και το αποτέλεσµά της εξαρτάται από τη θέση του αµινοξέως που τροποποιείται και τη µεθυλοτρανσφεράση που εµπλέκεται. Η δι-µεθυλιωµένη Lys4 της Η3 αποτελεί γενικό χαρακτηριστικό της ευχρωµατίνης, ενώ η τρι- µεθυλιωµένη, έχει συσχετισθεί µε την µεταγραφή [196]. Επιπλέον, η µεθυλίωση της λυσίνης αυτής αποτρέπει την πρόσδεση του κατασταλτικού συµπλόκου NuRD. Μελέτες στη ζύµη έδειξαν ότι δύο µεθυλοτρανσφεράσες των ιστονών, η Set1 και η Set2, που καταλύουν αντίστοιχα τη µεθυλίωση τις Lys4 και Lys36 της Η3, συνδέονται λειτουργικά µε τον µηχανισµό της RNA πολυµεράσης II. Πειράµατα έδειξαν ότι η τρι-µεθυλιωµένη Lys4 κυριαρχεί στις περιοχές του 5 -άκρου των µεταγραφόµενων γονιδίων, γεγονός που τη συνδέει µε την 67

82 Εικόνα Σχηµατικό µοντέλο της µεταγραφικής ενεργοποίησης που επάγεται από την επίδραση ορµονών. Το σύµπλοκο πυρηνικού υποδοχέα (NR) συνδέτη (L) προσδένεται στην κατάλληλη αλληλουχία απόκρισης (HRE) και επιστρατεύει συνενεργοποιητές (GRIP1, SRC-1, ACTR), οι οποίοι στη συνέχεια επιστρατεύουν δευτερεύοντες συνενεργοποιητές (CBP, p300, CARM1,PRMT1), οι οποίοι αντίστοιχα ακετυλιώνουν και µεθυλιώνουν τα αµινοτελικά άκρα των ιστονών προάγοντας τη µεταγραφή. [Transcriptional activation induced by hormone signals. The nuclear receptor (NR) - ligand (L) complex binds to the hormone response element (HRE) and recruits coactivators (GRIP1, SRC-1, ACTR) that recruit secondary coactivators (CBP, p300, CARM1, PRMT1) which acetylate or methylate histone tail domains] έναρξη της µεταγραφής, ενώ η µεθυλιωµένη Lys36 και η δι-µεθυλιωµένη Lys4 σχετίζονται κυρίως µε την επιµήκυνση της µεταγραφής [29]. Επιπλέον, πρόσφατα βρέθηκε ότι στην µεθυλιωµένη Lys4 της Η3 προσδένεται η CHD1, η οποία περιέχει chromodomain και αποτελεί υποµονάδα του συµπλόκου SAGA, ενώ στη δι- και τρι-µεθυλιωµένη Lys4 προσδένεται, ο ενεργοποιητής WDR5, µέσω µίας περιοχής επαναλήψεων WD40 [204,205]. Η Ash1 στη Drosophila, καθώς και τα οµόλογά της στα θηλαστικά, που καταλύουν τη µεθυλίωση των Lys4 και Lys9 της Η3 και της Lys20 της Η4, συνδέονται και αλληλεπιδρούν µε την p300/cbp. Έχει προταθεί ότι η ταυτόχρονη µεθυλίωση των Lys4 και Lys9 της Η3 αποτρέπει την πρόσδεση των πρωτεϊνών της οµάδας Polycomb, που συµµετέχουν στην καταστολή της µεταγραφής, ενώ αντίθετα βοηθά στη επιστράτευση των παραγόντων αναδιαµόρφωσης της χρωµατίνης που απαιτούνται για την ενεργοποίησή της [206]. Εκτός από την µεθυλίωση της Lys4, βρέθηκε ότι και η µεθυλίωση της Lys79 στην κεντρική περιοχή της Η3 από την Dot1, εµποδίζει τη σύνδεση στη χρωµατίνη των πρωτεϊνών Sir, οι οποίες σχετίζονται µε την καταστολή της µεταγραφής, αποτρέποντας έτσι την επέκταση της ετεροχρωµατίνης και βοηθώντας, µαζί µε τη µεθυλίωση της Lys4, στη διατήρηση των ενεργών µεταγραφικά περιοχών της χρωµατίνης [207]. Επιπλέον, βρέθηκε ότι στη µεθυλιωµένη Lys79 προσδένεται, µέσω της περιοχής Tudor, η πρωτεϊνη p53bp1, η οποία 68

83 σχετίζεται µε το µηχανισµό επιδιόρθωσης του DNA [208]. Παρόµοιο ρόλο επιτελεί η CRB2 στον S. pombe η οποία προσδένεται στη µεθυλιωµένη Lys20 της Η4 [209]. Αντίθετα µε τη µεθυλίωση της Lys4 της Η3, η µεθυλίωση των Lys9 και Lys27 της Η3 και της Lys20 της Η4 έχει συσχετισθεί µε την καταστολή της γονιδιακής έκφρασης [28]. Η τροποποίηση των Lys9 και Lys27 της Η3 σχετίζεται µε την µεταγραφική απενεργοποίηση του χρωµοσώµατος Χ. Επίσης, η µεθυλίωση της Lys20 της Η4 στη Drosophila, που καταλύεται από την PR-Set7 και κυριαρχεί στη συµπυκνωµένη χρωµατίνη των πολυταινικών χρωµοσωµάτων, εµποδίζει την ακετυλίωσή της στη Lys16, που αποτελεί χαρακτηριστικό της ενεργούς µεταγραφικά χρωµατίνης. Αξίζει να σηµειωθεί ότι το συγκεκριµένο αµινοξύ, όπως και η Lys9 και η Lys4 της Η3, µεθυλιώνεται επίσης από την Ash1, η οποία λειτουργεί και ως ενεργοποιητής της µεταγραφής, πιθανόν όµως η µεθυλίωση της Lys4 να παρεµποδίζει το κατασταλτικό αποτέλεσµα της µεθυλίωσης των άλλων δύο αµινοξέων. Επιπλέον, βρέθηκε ότι η PR-Set7 καταλύει την µονο-µεθυλίωση της Lys20 της Η4, η οποία µπορεί να βρεθεί και σε δι- και τρι-µεθυλιωµένη µορφή. Είναι πιθανό τα διάφορα ένζυµα, καταλύοντας διαφορετικά επίπεδα µεθυλίωσης της Lys20 της Η4, να επιφέρουν και διαφορετικά αποτελέσµατα [28,29]. Έχει προταθεί ότι οι µεθυλιωµένες Lys9 και Lys27 της Η3 και Lys20 της Η4 αποτελούν σηµεία αναγνώρισης και πρόσδεσης κατασταλτικών συµπλόκων, όπως π.χ. αυτών που περιέχουν πρωτεϊνες της οµάδας Polycomb. Οι πρωτεϊνες της οµάδας Polycomb περιέχουν chromodomain, και προσδένονται επιλεκτικά στη µεθυλιωµένη Lys27 της Η3. Επίσης βρέθηκε ότι η µεθυλίωση της Lys9 της Η3 από τη SETDB1 οδηγεί στην γονιδιακή καταστολή σε περιοχές της ευχρωµατίνης, µέσω της επιστράτευσης της HP1 [210]. Είναι ενδιαφέρον όµως και γεγονός ότι η Suv39h1 µέσω της µεθυλίωσης της Lys9 της Η3 συµβάλλει στην καταστολή της µεταγραφής στους προαγωγείς των γονιδίων που ελέγχουν τον κυτταρικό κύκλο επιστρατευόµενη από την ογκοκατασταλτική πρωτεϊνη Rb, η οποία αλληλεπιδρά µε την ρυθµιστική πρωτεϊνη E2F που προσδένεται σ αυτούς [211]. Εκτός από τα γονίδια που ρυθµίζονται από το Rb, µία άλλη οµάδα γονιδίων που η έκφρασή τους καταστέλεται µέσω της δράσης µεθυλοτρανσφερασών είναι αυτά που ρυθµίζονται από την πρωτεϊνη Ikaros, η οποία βρέθηκε πως ρυθµίζει τη µεταγραφή επιστρατεύοντας απακετυλάσες των ιστονών και εντοπίζεται µεζίµε την HP1 [212]. 69

84 Μεθυλίωση των ιστονών και ετεροχρωµατίνη Η σχέση µεταξύ µεθυλίωσης της Lys9 της Η3 και σχηµατισµού της ετεροχρωµατίνης προέκυψε από την ανακάλυψη ότι η συγκεκριµένη τροποποίηση, που καταλύεται από την Suv39h1 στα θηλαστικά και από την Clr4 στον S.pombe, σχετίζεται µε την επιστράτευση της HP1 και της Swi6 αντίστοιχα. Οι δύο τελευταίες ανήκουν σε µία οικογένεια πρωτεϊνών που απαιτούνται στο σχηµατισµό της ετεροχρωµατίνης και στην επιγενετική ρύθµιση της γονιδιακής έκφρασης. Βρέθηκε ότι οι HP1 και Swi6 εντοπίζονται µαζί µε τις Suv39h1 και Clr4 [663,718] και η παρουσία τους στην χρωµατίνη εξαρτάται από την ενζυµική δράση των µεθυλοτρανσφερασών αυτών. Τα παραπάνω δεδοµένα οδήγησαν στην υπόθεση ότι η µεθυλιωµένη Lys9 της Η3 πιθανόν να αποτελεί σηµείο αναγνώρισης και πρόσδεσης των πρωτεϊνών που σχετίζονται µε την ετεροχρωµατίνη, όπως είναι η HP1 και η Swi6 [27]. Για την αναγνώριση αυτή απαιτείται η περιοχή chromodomain των HP1 και Swi6, µία συντηρηµένη περιοχή, αποτελούµενη από 60 περίπου αµινοξέα. Μεταλλάξεις στην περιοχή chromodomain καθιστούν ανέφικτη την πρόσδεση των HP1 και Swi6 τους στην µεθυλιωµένη, από τις Suv39h1 και Clr4, Lys9 της Η3 [213]. Έχει προταθεί ένα µοντέλο σχηµατισµού της ετεροχρωµατίνης, σύµφωνα µε το οποίο η µεθυλίωση της Lys9 της Η3 από την Su(var)3-9 και τα οµόλογά της, οδηγεί στην επιστράτευση και πρόσδεση της HP1 και των οµόλογών της πρωτεϊνών στη χρωµατίνη. Η αναγνώριση επιτυγχάνεται µέσω των συντηρηµένων περιοχών chromodomain, που αναγνωρίζουν τη µεθυλιωµένη λυσίνη, µε τρόπο παρόµοιο µε αυτόν της αναγνώρισης της ακετυλιωµένης λυσίνης από την περιοχή bromodomain των διαφόρων µεταγραφικών παραγόντων [36]. Στη συνέχεια, οι HP1 και Swi6 ολιγοµερίζονται µέσω των περιοχών shadow chromodomain, µίας άλλης συντηρηµένης περιοχής αυτών των πρωτεϊνών που απαιτείται για τις αλληλεπιδράσεις τους µε άλλες πρωτεϊνες [27]. Επιπλέον, επειδή η ακετυλίωση της Lys9 (αλλά και της Lys14) της Η3 εµποδίζει τη µεθυλίωσή της [178], η απακετυλίωση των παραπάνω αµινοξέων αποτελεί προϋπόθεση για τη λειτουργία του µοντέλου αυτού. Ο χαρακτηρισµός γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεϊνες που σχετίζονται µε τον σχηµατισµό της ετεροχρωµατίνης στη Drosophila και στον S.pombe έδειξε ότι περιλαµβάνουν απακετυλάσες των ιστονών, µεθυλοτρανσφεράσες της Lys9 της Η3 καθώς και πρωτεϊνες όµοιες µε την ΗΡ1. Η ύπαρξη οµολόγων των πρωτεϊνών αυτών σε πολλούς 70

85 άλλους οργανισµούς δείχνει την εξελικτική διατήρηση του µονοπατιού σχηµατισµού της ετεροχρωµατίνης, ενώ η ταυτόχρονη παρουσία τους σε κατασταλτικά σύµπλοκα δείχνει ότι η δράση τους πιθανόν να είναι συνεργιστική. Οι απακετυλάσες αποµακρύνουν την ακετυλοµάδα από τη Lys9 της Η3, καθιστώντας εφικτή τη µεθυλίωσή της από τα οµόλογα της Su(var)3-9 και την µετέπειτα επιστράτευση των οµολόγων της HP1, που οδηγεί στον σχηµατισµό της ετεροχρωµατίνης [27] (Εικόνα 1.3.5). Πρόσφατες µελέτες έδειξαν ότι η µεθυλίωση της Lys9 της Η3 εµπλέκεται και σε άλλα µονοπάτια σχηµατισµού της ετεροχρωµατίνης, όπως φαίνεται π.χ. από τη σύνδεσή της µε τη µεθυλίωση του DNA. Η µεθυλίωση βάσεων κυτοσίνης σε επαναλήψεις CpG οδηγεί σε µόνιµη καταστολή της γονιδιακής έκφρασης σε περιοχές της ετεροχρωµατίνης των ανώτερων ευκαρυωτικών οργανισµών, ενώ οι πρωτεϊνες που προσδένονται σε µεθυλιωµένες βάσεις του DNA επιστρατεύουν κατασταλτικά σύµπλοκα που περιέχουν απακετυλάσες όπως π.χ. το σύµπλοκο NuRD. Η απακετυλίωση µέσω της δράσης του συµπλόκου NuRD πιθανόν να προετοιµάζει τη Lys9 για την µετέπειτα µεθυλίωσή της. Στον N.crassa βρέθηκε ότι το προϊόν του γονιδίου dim5, που απαιτείται για τη µεθυλίωση του DNA, είναι µία µεθυλοτρανσφεράση που φέρει περιοχή SET και καταλύει την τρι-µεθυλίωση της Lys9 της Η3. Παρά τις διαφορές που υπάρχουν σε ό,τι αφορά τις διαδικασίες αυτές ανάµεσα στον N.crassa και στα θηλαστικά, πιθανόν η µεθυλίωση της Lys9 να αποτελεί ένα γενικό σηµάδι για στοχευµένη µεθυλίωση του DNA. εδοµένου ότι οι µεθυλοτρανσφεράσες του DNA δεν εµφανίζουν εξειδίκευση, πιθανόν η µεθυλίωση της Lys9 από την Dim5 να επιστρατεύει µεθυλοτρανσφεράσες του DNA και να καθορίζει την περιοχή όπου πρέπει αυτές να δράσουν, ώστε να καταστεί ανενεργή και αυτή η κατάσταση να παραµείνει και µετά την αντιγραφή του DNA [214]. Κάτι παρόµοιο συµβαίνει και στο Arabidopsis, όπου η µεθυλοτρανσφεράση της Lys9, KYP, αλληλεπιδρά µε την µεθυλο-τρανσφεράση του DNA, DNMT3 και την επιστρατεύει σε περιοχές της χρωµατίνης όπου έχει προηγηθεί µεθυλίωση της Lys9 της Η3. Μετάλλαξη του γονιδίου Met1 στο Arabidopsis, που κωδικοποιεί µία µεθυλοτρανσφεράση του DNA, έχει ως αποτέλεσµα µειωµένη µεθυλίωση της Lys9 της Η3, ενώ έχει βρεθεί και ότι το οµόλογο της HP1 αλληλεπιδρά µε µεθυλοτρανσφεράσες του DNA [215]. Οι SETDB1 στον άνθρωπο και ESET στον ποντικό, που είναι µεθυλοτρανσφεράσες της Lys9 και φέρουν περιοχή πρόσδεσης σε µεθυλιωµένες βάσεις του DNA, 71

86 συµµετέχουν στη διατήρηση της ανενεργούς µεταγραφικά χρωµατίνης [28]. Επίσης, βρέθηκε ότι η πρωτεϊνη MeCP2 που προσδένεται σε µεθυλιωµένες βάσεις CpG συνδέεται µε µεθυλοτρανσφεράσες της Lys9 της Η3 [216]. Τέλος, µελέτες στον S.pombe συσχετίζουν τη µεθυλίωση της Lys9 της Η3 µε τον µηχανισµό σχηµατισµού της ετεροχρωµατίνης στον οποίο εµπλέκονται µικρά παρεµβαλλόµενα µόρια RNA (RNAi). Απώλεια συστατικών του µηχανισµού αυτού οδηγεί µεταξύ άλλων και σε απώλεια της µεθυλίωσης της Lys9 της Η3 και το σχηµατισµό της ετεροχρωµατίνης. [217]. Εικόνα Σχηµατική απεικόνιση του µοντέλου συγκρότησης της ετεροχρωµατίνης. Αρχικά απακετυλιώνεται η Lys9 της Η3 και στη συνέχεια µεθυλιώνεται από µεθυλοτρανσφεράση της οικογένειας Suvar39. Στη µεθυλιωµένη λυσίνη προσδένεται επιλεκτικά η ΗΡ1 µέσω της περιοχής chromodomain. Στη συνέχεια η συγκρότηση της ετεροχρωµατίνης επεκτείνεται µε την επιστράτευση από την ΗΡ1 επιπλέον µεθυλοτρανσφερασών που τροποποιούν τις Lys9 γειτονικών µορίων Η3. Σ αυτές προσδένονται επιπλέον µόρια ΗΡ1 και η παραπάνω διαδικασία επαναλαµβάνεται. [Histone methylation and heterochromatin assembly. Firstly, histone H3 Lys9 is deacetylated and afterwards is methylated by Suvar39 methyltransferase. Heterochromatin protein 1 binds to methylated Lys9 through the chromodomain and recruits methyltransferases to modify residues in nearby nucleosomes and thereby to create new HP1 binding sites and propagate heterochromatin] 72

87 1.3.4 ΟΥΒΙΚΟΥΙΤΙΝΩΣΗ ΤΩΝ ΙΣΤΟΝΩΝ Η ουβικουτίνωση είναι µία τροποποιήση των ιστονών που ο ακριβής ρόλος της παραµένει ακόµη αδιευκρίνιστος. Η ουβικουιτίνη είναι µία εξαιρετικά συντηρηµένη πρωτεϊνη αποτελούµενη από 76 αµινοξέα, συναντάται σε όλους τους ευκαρυωτικούς οργανισµούς και από την ανακάλυψή της έως σήµερα έχει συσχετισθεί µε διάφορες κυτταρικές διαδικασίες, όπως η αποικοδόµηση των πρωτεϊνών, ο έλεγχος του κυτταρικού κύκλου, η επιδιόρθωση βλαβών του DNA, η κυτταρική διαφοροποίηση, η ρύθµιση της µεταγραφής κ.α. Η πρόσδεση της ουβικουιτίνης γίνεται µέσω ενός ισοπεπτιδικού δεσµού µεταξύ της γλυκίνης που υπάρχει στο καρβοξυτελικό της άκρο (Gly76) και της ε-αµινοµάδας µίας λυσίνης της πρωτεϊνης-στόχου. Επιπλέον, στις λυσίνες που υπάρχουν στο µόριο της ήδη προσδεµένης ουβικουιτίνης (Lys11, -29, -48 και -63) µπορούν µε τον να συνδεθούν και άλλα µόρια ουβικουιτίνης, µε αποτέλεσµα την δηµιουργία µίας αλυσίδας πολυουβικουιτίνης. Έχει βρεθεί ότι η πρόσδεση µίας αλυσίδας τεσσάρων µορίων ουβικουιτίνης σε µία πρωτεϊνη είναι απαραίτητη για την αναγνώριση και αποικοδόµησή της από το πρωτεάσωµα [31]. Η ιστόνη Η2Α ήταν η πρώτη πρωτεϊνη που βρέθηκε πως τροποποιείται µε πρόσδεση της ουβικουιτίνης και αρχικά η ουβικουιτινωµένη µορφή της (uh2a) είχε ονοµαστεί «χρωµατινική πρωτεϊνη Α24» [218]. Η ουβικουιτίνη συνδέεται στην ε-αµινοµάδα της Lys119 της Η2Α, η οποία βρίσκεται στο καρβοξυτελικό της άκρο. Με εξαίρεση τη ζύµη, όπου δεν παρατηρείται ουβικουιτίνωση της Η2Α [219], η uh2a αντιπροσωπεύει το 10-15% της ολικής H2A στα ευκαρυωτικά κύτταρα, ενώ ένα ή δύο µόριά της µπορούν να αντικαταστήσουν τα αντίστοιχα µόρια της Η2Α στα νουκλεοσώµατα. Λίγα χρόνια αργότερα βρέθηκε ότι η ουβικουιτίνη προσδένεται και στο καρβοξυτελικό άκρο της Η2Β και ότι η uη2β αποτελεί περίπου το 1-2% της ολικής Η2Β στα κύτταρα των ανώτερων ευκαρυωτικών οργανισµών. Η ουβικουιτίνη προσδένεται στη Lys120 της Η2Β µε εξαίρεση τη ζύµη, όπου προσδένεται στη Lys123 και όπου η uη2β αποτελεί περίπου το 10% της ολικής [31]. Εκτός από τις παραπάνω ιστόνες, έχει αναφερθεί πρόσδεση της ουβικουιτίνης και στην Η3 σε επιµηκυνόµενες σπερµατίδες αρουραίου [32], ενώ πρόσφατα βρέθηκε ότι ο TAFII250 εµπλέκεται στην ουβικουιτίνωση της συνδετικής ιστόνης Η1 στη Drosophila [33]. Οι θέσεις πρόσδεσης της ουβικουιτίνης στις ιστόνες Η3 και Η1 καθώς και ο ρόλος αυτών των τροποποιήσεων δεν έχουν ακόµη διευκρινιστεί. 73

88 Η πρόσδεση της ουβικουιτίνης στις πρωτεϊνες αποτελεί µία περίπλοκη διαδικασία και περιλαµβάνει τρία στάδια που καταλύονται από τα αντίστοιχα ένζυµα. Αρχικά η ουβικουιτίνη ενεργοποιείται µέσω του ενζύµου Ε1 και µεταφέρεται στο ένζυµο Ε2, το οποίο είναι υπεύθυνο για την πρόσδεσή της στην πρωτεϊνη-στόχο, ενώ το ένζυµο Ε3 είναι απαραίτητο για την εξειδίκευση και την πρόσδεσή της στα διάφορα υποστρώµατα [31]. Έχει βρεθεί ότι δύο πρωτεϊνες της ζύµης, η Rad6/Ubc2 και η Cdc34 µπορούν να καταλύσουν την πρόσδεση της ουβικουιτίνης στην Η2Β in vitro ακόµη και απουσία ενζύµου Ε3 [220], όµως µόνο η Rad6 καταλύει την παραπάνω τροποποίηση in vivo [219]. Πρόσφατες µελέτες έδειξαν ότι η Rad6 συνδέεται µε την πρωτεϊνη Bre1, που πιθανόν να είναι το ένζυµο Ε3 που απαιτείται για την ουβικουιτίνωση της Η2Β [221]. Τα οµόλογα της Rad6 στα θηλαστικά, οι HR6A και HR6B, µπορούν επίσης να καταλύσουν την ουβικουιτίνωση των ιστονών in vitro [222], ενώ δύο πιθανά οµόλογα της Bre1 έχουν βρεθεί στον άνθρωπο [221], γεγονός που δείχνει τη συντήρηση του παραπάνω µηχανισµού. ιαπιστώθηκε ότι η Rad6 µπορεί να καταλύσει in vitro την ουβικουιτίνωση και των δύο ιστονών στον ίδιο βαθµό, ενώ κατά τη σπερµατογένεση στον ποντικό βρέθηκε µία ισχυρή συσχέτιση µεταξύ της HR6B και της ουβικουιτίνωσης της H2A [223]. Τέλος, η ανακάλυψη ότι ο TAFII250 καταλύει την ουβικουιτίνωση της Η1 παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον, δεδοµένου ότι για πρώτη φορά παρατηρείται στην ίδια πρωτεϊνη ενζυµική δράση Ε1 και Ε2 [32]. Η αποουβικουιτίνωση των πρωτεϊνών καταλύεται από τη δράση των ισοπεπτιδασών, οι οποίες καταλύουν την υδρόλυση του πεπτιδικού δεσµού της Gly76 του µορίου της ουβικουιτίνης. Τα ένζυµα αυτά χωρίζονται σε δύο κατηγορίες µε βάση το µέγεθος του ενεργού τους κέντρου, τις υδρολάσες του καρβοξυτελικού άκρου της ουβικουιτίνης (UCH) και τις εξειδικευµένες πρωτεάσες της ουβικουιτίνης (UBP) [224]. Κυριότερη από αυτές είναι η Ubp8 στη ζύµη, η οποία αποτελεί υποµονάδα του συµπλόκου SAGA και µετάλλαξή της έχει αποτέλεσµα τη συσσώρευση της uη2β. Οµόλογα της Ubp8 υπάρχουν σ όλους τους ευκαρυωτικούς οργανισµούς, όµως το αν κάποια από αυτά καταλύουν την αποουβικουιτίνωση της Η2Α δεν είναι ακόµη γνωστό [225]. Πειράµατα ανακατασκευής νουκλεοσωµάτων in vitro έδειξαν ότι η αντικατάσταση του ενός ή και των δύο µορίων της Η2Α από µόρια uh2a δεν επηρεάζουν το πρότυπο της πέψης µε DΝάση Ι, ενώ στη συνέχεια αποδείχθηκε ότι το νουκλεόσωµα µπορεί να ανακατασκευαστεί µε τις ουβικουιτινωµένες µορφές των Η2Α και 74

89 Η2Β χωρίς να διαταραχθεί η κανονική του δοµή. Εκτός από το επίπεδο του νουκλεοσώµατος, η ουβικουιτίνωση των ιστονών δεν επηρεάζει την δοµή της χρωµατίνης ούτε και σε σειρές ολιγονουκλεοσωµάτων, ίσως όµως να επηρεάζει τη δοµή της χρωµατίνης στο επίπεδο του ινιδίου των 30nm. Επίσης, δεδοµένου ότι η θέση ουβικουιτίνωσης της Η2Α, η Lys119, βρίσκεται πολύ κοντά στη συνδετική ιστόνη Η1, είναι πολύ πιθανό το ενδεχόµενο η ουβικουιτίνωση της Η2Α να επηρεάζει τις ανώτερες δοµές της χρωµατίνης επιδρώντας στη σύνδεση της Η1 µε το νουκλεόσωµα [226]. Πολλές µελέτες έχουν δείξει πως η ουβικουιτίνωση των ιστονών σχετίζεται µε την µεταγραφική δραστηριότητα. Για παράδειγµα, έχει βρεθεί ότι τα νουκλεοσώµατα των ενεργών µεταγραφικά γονιδίων hsp70 στη Drosophila περιέχουν σε ποσοστό 50% uh2a, ενώ αντίθετα στο µη µεταγραφόµενο δορυφορικό DNA η uh2a συναντάται µόνο στο 4% των νουκλεοσωµάτων. Επιπλέον, βρέθηκε ότι η χρωµατίνη στη περιοχή του 5 - άκρου των µεταγραφικά ενεργών γονιδίων DHFR στον ποντικό και της ιστόνης Η3 στον αχινό είναι εµπλουτισµένη σε uh2a. Αυξηµένο επίπεδο ουβικουιτίνωσης των Η2Α και Η2Β παρατηρήθηκε σε περιοχές µεταγραφικά ενεργών γονιδίων στο θύµο αδένα µοσχαριού, στα ερυθροκύτταρα του κοτόπουλου και στο µακροπυρήνα του Tetrahynema, ενώ πειράµατα παρεµπόδισης της µεταγραφής έδειξαν ότι το επίπεδο ουβικουιτίνωσης της Η2Β εξαρτάται από την εξέλιξη της µεταγραφής [ ]. Έχει προταθεί ότι η αναστολή της µεταγραφής που επάγεται από τον αναστολέα του πρωτεασώµατος συνδέεται µε την αποουβικουιτίνωση των ιστονών [230], ενώ η ενεργοποίηση ορισµένων γονιδίων στη ζύµη εξαρτάται εν µέρει από την ουβικουιτίνωση της Η2Β [225]. Παρόλα αυτά, υπάρχουν και µελέτες που αµφισβητούν τη σχέση µεταξύ ουβικουιτίνωσης των ιστονών και µεταγραφής, π.χ. βρέθηκε ότι τα νουκλεοσώµατα που περιέχουν µεταγραφικά ανενεργό δορυφορικό DNA στη Drosophila περιέχουν uh2a [231], ενώ στην περιοχή του ενεργού µεταγραφικά γονιδίου της αλυσίδας κ της ανοσοσφαιρίνης δεν υπάρχουν ουβικουιτινωµένες ιστόνες [232]. Επιπλέον, µελέτες διαχωρισµού της χρωµατίνης σε ενεργή και ανενεργή βάσει της ευαισθησίας της στη DNαση Ι έδειξαν τυχαία κατανοµή της uh2a στα διάφορα κλάσµατά της, ενώ έχει διαπιστωθεί η παρουσία των ουβικουιτινωµένων ιστονών στο µεταγραφικά ανενεργό µικροπυρήνα του Tetrahynema [228] καθώς και στις σπερµατίδες του ποντικού [223]. 75

90 Τέλος, πολλές µελέτες έχουν δείξει ότι η Rad6 εµπλέκεται στην καταστολή της γονιδιακής έκφρασης. Η καταστολή του γονιδίου ARG1 στη ζύµη απαιτεί την παρουσία και τη δράση του ενζύµου αυτού [234] ενώ η µεθυλίωση της Η3 στη Lys79 που σχετίζεται µε την αναστολή της γονιδιακής έκφρασης στην περιοχή του τελοµέρους, εξαρτάται από την ουβικουιτίνωση της Η2Β από τη Rad6 [201]. Πρόσφατα βρέθηκε πως η ουβικουιτίνωση της Η2Α στα θηλαστικά εµπλέκεται στην καταστολή της γονιδιακής έκφρασης κατά τη µείωση καθώς και στην απενεργοποίηση του χρωµοσώµατος Χ, στο οποίο παρατηρείται συσσώρευση της τροποποίησης αυτής [235,236]. Υπάρχουν τρείς υποθέσεις για τον τρόπο µε τον οποίο η ουβικουιτίνωση επηρεάζει τη µεταγραφή [237]. Σύµφωνα µε τη πρώτη, επηρεάζει τις ανώτερες δοµές της χρωµατίνης µε αποτέλεσµα τη χαλάρωση τους και τη διευκόλυνση της πρόσβασης του µηχανισµού της µεταγραφής. Σύµφωνα µε τη δεύτερη, οι ουβικουιτινωµένες µορφές των ιστονών πιθανόν να αποτελούν θέσεις επιστράτευσης διαφόρων παραγόντων που ρυθµίζουν τη µεταγραφή, όπως συµβαίνει και µε άλλες τροποποιήσεις των ιστονών. Επίσης, είναι πιθανό η ουβικουιτίνωση να επηρεάζει τη µεταγραφή µέσω τις αλληλεπίδρασής της µε άλλες τροποποιήσεις των ιστονών, δεδοµένου ότι π.χ. η ουβικουιτίνωση της Η2Β είναι απαραίτητη για τη µεθυλίωση της Η3 τόσο στη Lys4 από τη Set1, τροποποίηση που σχετίζεται µε την µεταγραφική ενεργοποίηση [238], όσο και στη Lys79 από τη Dot1, που σχετίζεται µε την καταστολή της µεταγραφής. Τέλος, πρόσφατα βρέθηκε στη ζύµη ότι η ουβικουιτίνωση της Η2Β από τη Rad6 και η αποουβικουιτίνωσή της από την Ubp8 επηρεάζουν αντίστοιχα τα επίπεδα µεθυλίωσης της Η3 στη Lys4 και στη Lys36, δύο τροποποιήσεις που σχετίζονται µε τη µεταγραφική ενεργοποίηση [237]. Έχει βρεθεί ότι το επίπεδο ουβικουιτίνωσης των ιστονών µεταβάλλεται κατά τις διάφορες φάσεις του κυτταρικού κύκλου. Συγκεκριµένα, οι ουβικουιτινωµένες µορφές των Η2Α και Η2Β εξαφανίζονται κατά τη µετάβαση από τη φάση G2 στη φάση Μ, παράλληλα µε τη συµπύκνωση της χρωµατίνης, απουσιάζουν από τα µεταφατικά χρωµοσώµατα και επανεµφανίζονται κατά την αποσυµπύκνωση της χρωµατίνης, που συµβαίνει στη µετάβαση από τη φάση Μ στη φάση G1 [239]. Στο Physarum polycephalum παρατηρήθηκε ότι τα επίπεδα των uh2a και uh2b στην αρχή της πρόφασης είναι υψηλά, στη συνέχεια µειώνονται συνεχώς και γίνονται µη ανιχνεύσιµα κατά την µετάφαση. Οι uh2a και uh2b εµφανίζονται πάλι κατά την ανάφαση και τα επίπεδά τους 76

91 αυξάνονται συνεχώς, µέχρι να φτάσουν στα αντίστοιχα των µεσοφασικών κυττάρων [240]. Εκτός από την απουσία της uη2α από τα νουκλεοσώµατα, ο ρυθµός σύνθεσης και πρόσδεσης της ουβικουιτίνης είναι εξαιρετικά χαµηλός κατά τη µετάφαση, ενώ αντίθετα αυξάνεται το ποσό της ισοπεπτιδάσης που βρίσκεται συνδεδεµένο µε την χρωµατίνη. Επιπλέον, η δράση της Ubp-M, µίας ισοπεπτιδάσης των θηλαστικών που αποουβικουιτινώνει τις ιστόνες in vitro είναι παράλληλη µε την πορεία της αποουβικουιτίνωσης των ιστονών κατά τη µίτωση, ενώ µετάλλαξη του ενεργού της κέντρου οδηγεί σε διακοπή της κυτταρικής διαίρεσης [241]. Παρόλο που πειράµατα µε µεταλλάξεις έχουν δείξει ότι πιθανόν η ουβικουιτίνωση των ιστονών να επηρεάζει το βαθµό συµπύκνωσης της χρωµατίνης, το γεγονός οτι η τροποποίηση αυτή δεν συµβαίνει σε όλα τα νουκλεοσώµατα αλλά µόνο σε ένα ποσοστό από αυτά, σε αντίθεση µε την φωσφορυλίωση των Η1 και Η3, όπου εξαπλώνεται σε όλο το χρωµόσωµα πριν τη συµπύκνωση της χρωµατίνης, καθιστά αµφιλεγόµενο τον ρόλο της κατά τη µίτωση [242]. Ωστόσο, πρόσφατες µελέτες στη ζύµη έδειξαν ότι µεταλλάξεις της Rad6 ή/και των θέσεων ουβικουιτίνωσης των Η2Α και Η2Β οδηγούν σε ανωµαλίες κατά την κυτταρική διαίρεση και την ανάπτυξη του οργανισµού [219]. Η πρώτη ένδειξη για µία πιθανή σχέση µεταξύ ουβικουιτίνωσης των ιστονών και επιδιόρθωσης του DNA προήλθε από την ανακάλυψη ότι η Rad6, ένα ένζυµο που σχετίζεται µε το µηχανισµό επιδιόρθωσης του DNA, καταλύει την πρόσδεση της ουβικουιτίνης στις ιστόνες [220]. Έπειτα, βρέθηκε ότι µεταλλάξεις του γονιδίου Rad6 στη ζύµη έχουν αποτέλεσµα αυξηµένη ευαισθησία σε µεταλλαξιγόνους παράγοντες που προκαλούν βλάβες στο DNA, όπως π.χ. η υπεριώδης ακτινοβολία, οι ακτίνες Χ, οι χηµικές µεταλλαξιγόνες ενώσεις κτλ. [243]. Παρόλο που µεταλλάξεις στις θέσεις ουβικουιτίνωσης των Η2Α και Η2Β δεν οδήγησαν σε αύξηση της ευαισθησίας στην υπεριώδη ακτινοβολία [219], πολλές µελέτες οδηγούν στην υπόθεση ότι η Rad6 και τα οµόλογα της, µέσω της ουβικουιτίνωσης των ιστονών, πιθανόν να επιφέρουν τοπικές αλλαγές στη δοµή της χρωµατίνης για να διευκολύνουν την πρόσβαση του µηχανισµού επιδιόρθωσης του DNA στα σηµεία όπου υπάρχουν βλάβες [244]. Κατά τη διαδικασία της σπερµατογένεσης συµβαίνουν πολλές αλλαγές στη δοµή της χρωµατίνης µε κυριότερες τη σύνθεση εξειδικευµένων ισοµορφών των ιστονών και την µετέπειτα αντικατάστασή τους από τις 77

92 πρωταµίνες, που οδηγεί στην ακόµη πιο συµπυκνωµένη δοµή της χρωµατίνης των σπερµατίδων και των σπερµατοζωαρίων. Βρέθηκε ότι η έκφραση του γονιδίου της mhr6b, του οµολόγου της Rad6 στα θηλαστικά, παρουσιάζεται αυξηµένη στον πυρήνα των σπερµατίδων του ποντικου, ενώ η αντικατάσταση του γονιδίου αυτού οδηγεί σε στειρότητα, πιθανόν λόγω ανωµαλιών κατά την αντικατάσταση των ιστονών. Μελέτες που έγιναν σε διάφορα σπονδυλωτά έδειξαν ότι το επίπεδο ουβικουιτίνωσης των ιστονών ποικίλλει στα διάφορα στάδια της διαδικασίας αυτής [223,245,246]. Υπάρχουν όµως και δεδοµένα που αµφισβητούν τον ρόλο της ουβικουιτίνωσης των ιστονών στη αντικατάστασή τους από τις πρωταµίνες, π.χ. δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στο επίπεδο της uh2a κατά τη σπερµατογένεση στην πέστροφα, ενώ το επίπεδο αυτό βρέθηκε πως µειώνεται στις επιµηκυνόµενες σπερµατίδες του αρουραίου, όπου παρατηρήθηκε για πρώτη φορά in vivo ουβικουιτίνωση της Η3 [32]. Παρόλο που η τροποποίηση αυτή δεν παρατηρήθηκε σε αντίστοιχες µελέτες στο ποντίκι [223], η παρουσία της κατά την επιµήκυνση των σπερµατίδων πιθανόν να υποδηλώνει έναν, άγνωστο προς το παρόν, ρόλο της κατά τη σπερµατογένεση ΣΟΥΜΟΫΛΙΩΣΗ ΤΩΝ ΙΣΤΟΝΩΝ Η SUMO είναι το πιο καλά χαρακτηρισµένο µέλος µίας συνεχώς αυξανόµενης οικογένειας πρωτεϊνών οι οποίες µοιάζουν µε την ουβικουιτίνη και εµπλέκονται στην µετα-µεταφραστική τροποποίηση πρωτεϊνών [247]. Η αλληλουχία της SUMO παρουσιάζει µόνο 19% οµολογία µε την ουβικουιτίνη, η τρισδιάστατη δοµή της όµως είναι παρόµοια. Στα θηλαστικά έχουν βρεθεί τρία µέλη της οικογένειας πρωτεϊνών SUMO, η SUMO-1 (SMT3C), η SUMO-2 (SMT3A) και η SUMO-3 (SMT3B), οι οποίες συµµετέχουν σε διάφορες κυτταρικές λειτουργίες. Η διαδικασία πρόσδεσης της SUMO στις πρωτεϊνες είναι παρόµοια µε αυτή της ουβικουιτίνης, συντελείται σε τρία στάδια και απαιτούνται τρία ένζυµα (Ε1, Ε2 και Ε3). Η ενεργοποίηση της SUMO καταλύεται από το ετεροδιµερές SAE1-SAE2, ενώ η πρόσδεσή της γίνεται µέσω της Ubc9, τα µόνα γνωστά µέχρι σήµερα ένζυµα Ε1 και Ε2 για τη σουµοϋλίωση. Αντίθετα, φαίνεται πως υπάρχουν πολλά και διαφορετικά ένζυµα Ε3 για τη SUMO στους ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισµούς, όπως τα µέλη της 78

93 οικογένειας πρωτεϊνών PIAS, η RanBP2 και η πρωτεϊνη Pc2, µέλος της οικογένειας Polycomb, ενώ η τροποποίηση αντιστρέφεται από τις πρωτεάσες Ulp1 και Ulp2 στη ζύµη και SuSP, SuPr και SENP1-9 στα θηλαστικά. Μέχρι σήµερα, ένας µεγάλος και συνεχώς αυξανόµενος αριθµός πρωτεϊνών έχει βρεθεί πως υφίστανται σουµοϋλίωση, συµπεριλαµβανοµένων πολλών µεταγραφικών παραγόντων, πυρηνικών υποδοχέων, συνενεργοποιητών της µεταγραφής, απακετυλασών των ιστονών, ρυθµιστικών πρωτεϊνών κ.α. Σε αντίθεση µε την ουβικουιτίνωση, η σουµοϋλίωση των πρωτεϊνών δεν συνδέεται µε την αποικοδόµησή τους αλλά πιθανόν να συµµετέχει σε άλλες λειτουργίες, όπως στη ρύθµιση των αλληλεπιδράσεων µεταξύ των πρωτεϊνών, στον εντοπισµό των πρωτεϊνών, στην παρεµπόδιση της αποικοδόµησης µέσω του µονοπατιού της ουβικουιτίνης και στη ρύθµιση της µεταγραφής [248]. Πρόσφατα βρέθηκε ότι η SUMO προσδένεται και στις ιστόνες. Συγκεκριµένα, αποδείχθηκε ότι η Η4 τροποποιείται in vitro και in vivo, ενώ σουµοϋλίωση παρατηρήθηκε σε µικρότερο βαθµό και στις υπόλοιπες νουκλεοσωµικές ιστόνες. Η SUMO προσδένεται στο αµινοτελικό άκρο της Η4 και απαιτούνται τα ένζυµα SAE1-SAE2 (Ε1) και Ubc9 (Ε2), ενώ η παρουσία της PIAS δεν επηρεάζει την σουµοϋλίωση, γεγονός που δείχνει ότι η παρουσία ενζύµου Ε3 δεν είναι απαραίτητη για την πρόσδεση της SUMO στο υπόστρωµά της. Η θέση σουµοϋλίωσης της Η4 δεν έχει ακοµή βρεθεί, όµως έχει µελετηθεί η πιθανή επίδρασή της στη µεταγραφή. Βρέθηκε ότι η σουµοϋλίωση της Η4 σχετίζεται µε την καταστολή της µεταγραφής και ταυτόχρονα µε αυτήν, παρατηρείται µείωση της ακετυλίωσης της Η3 και αύξηση της παρουσίας της ΗΡ1 στη χρωµατίνη. Έχει προταθεί ότι η επιστράτευση της Ubc9 και η αλληλεπίδρασή της µε διάφορους µεταγραφικούς παράγοντες, οδηγεί στη σουµοϋλίωση της Η4 η οποία µε τη σειρά της προάγει την απακετυλίωση της Η3 από την HDAC1 και την µετέπειτα πρόσδεση της ΗΡ1. Εκτός όµως από την επιστράτευση των HDAC1 και ΗΡ1, είναι πολύ πιθανόν η Ubc9 να καταλύει την πρόσδεση της SUMO και σε άλλες πρωτεϊνες της χρωµατίνης, µεταγραφικούς παράγοντες, απακετυλάσες των ιστονών κ.α., συνεπώς η σουµοϋλίωση να αποτελεί ένα γενικότερο µηχανισµό ρύθµισης της µεταγραφής [249]. 79

94 1.3.6 ΠΟΛΥ-ADP-ΡΙΒΟΣΥΛΙΩΣΗ ΤΩΝ ΙΣΤΟΝΩΝ Η πολυ-adp-ριβοσυλίωση αποτελεί την πλέον δραµατική µετα-µεταφραστική τροποποίηση τόσο των ιστονών όσο και πολλών άλλων πυρηνικών πρωτεϊνών λόγω της µεταβολής του φορτίου που επιφέρει. Κατά την τροποποίηση αυτή, µονοµερή ADP-ριβόζης από το NAD + µεταφέρονται ενζυµατικά στις πρωτεϊνες-στόχους και πολυµερίζονται σχηµατίζοντας απλές ή διακλαδιζόµενες αλυσίδες [34]. Έχει βρεθεί ότι το 99% της συνολικής πολυ-adp-ριβόζης προσδένεται σε µη-ιστονικές πρωτεϊνες, ενώ στις ιστόνες προσδένεται µόνο το 1%, µε κυριότερο αποδέκτη την συνδετική ιστόνη Η1 [250]. Η µεταβολή στη δοµή καθώς και η µείωση του φορτίου των πρωτεϊνών που προκαλεί η πρόσδεση της πολυ-adp-ριβόζης επηρεάζει τη λειτουργία τους και τις αλληλεπιδράσεις τους µε άλλες πρωτεϊνες και µε το DNA. Η πολυ-adp-ριβοσυλίωση των πρωτεϊνών καταλύεται από την πολυµεράση της πολυ-adp-ριβόζης (PARP), ένα ένζυµο συνδεδεµένο στη χρωµατίνη, το οποίο καταλύει τη µεταφορά των µονοµερών της ADPριβόζης από το NAD + στις πρωτείνες-δέκτες, όπως είναι διάφοροι µεταγραφικοί παράγοντες, οι νουκλεοσωµικές ιστόνες, η Η1 αλλά και η ίδια η PARP. Παρά την αφθονία της PARP στα κύτταρα, το συνολικό ποσό της πολυ-adp-ριβόζης που βρίσκεται συνδεδεµένο στις διάφορες πρωτεϊνες είναι σχετικά µικρό, γεγονός που υποδηλώνει ότι η δράση του ενζύµου αυτού ελέγχεται από αυστηρούς ρυθµιστικούς µηχανισµούς [251]. Η πυρηνική PARP καταλύει την πρόσδεση της ADP-ριβόζης σε καρβοξυλικές οµάδες και σχηµατίζει αλυσίδες πολυ-adp-ριβόζης, προσθέτοντας επιπλέον µονοµερή σε ήδη τροποποιηµένες θέσεις [34]. Η αποικοδόµηση της αλυσίδας αυτής επιτυγχάνεται µε τη δράση της γλυκοϋδρολάσης της πολυ-adp-ριβόζης, ενώ η λυάση της ADP-ριβόζης αποµακρύνει το τελευταίο µονοµερές από την τροποποιηµένη πρωτεϊνη [252]. Στην ανταγωνιστική δράση µεταξύ της PARP και των παραπάνω ενζύµων οφείλεται και ο µικρός χρόνος ηµιζωής της πολυ-adp-ριβόζης [253]. Ένα από τα κύρια αποτελέσµατα της πολυ-adp-ριβοσυλίωσης της Η1 είναι η δηµιουργία ενός διµερούς, το οποίο αποτελείται από δύο µόρια της ιστόνης αυτής που συνδέονται µέσω µίας αλυσίδας πολυ-adp-ριβόζης αποτελούµενης από 15 µονοµερή [34]. Βρέθηκε ότι τα αµινοξέα της Η1 που τροποποιούνται είναι τα δύο γλουταµικά οξέα στις θέσεις 2 και 14 του αµινοτελικού της άκρου και η λυσίνη που βρίσκεται στο καρβοξυτελικό της άκρο. Τα διµερή της Η1 πιθανόν να απαιτούνται για τη σύνδεση 80

95 συγκεκριµένων περιοχών της χρωµατίνης, στις οποίες συµβαίνουν διαδικασίες όπως π.χ. αντιγραφή ή επιδιόρθωση του DNA. Επίσης, έχει προταθεί ότι η σύνδεση µεταξύ µορίων της Η1, µέσω της πολυ-adpριβοσυλίωσής τους, πιθανόν να σχετίζεται µε τη διατήρηση των ανώτερων δοµών της χρωµατίνης, όπως π.χ. το ινίδιο των 30nm [254]. Το γεγονός ότι η δραστικότητα της PARP αυξάνεται µετά από βλάβες στην έλικα του DNA ενώ παραµένει ανενεργή κατά την απουσία τους πιθανόν να υποδηλώνει το ρόλο της στην επιδιόρθωση των βλαβών αυτών. Οι αιτίες των βλαβών αυτών µπορεί να είναι διάφορες, όπως π.χ. χηµικοί παράγοντες, υπεριώδης ακτινοβολία, ακτίνες Χ, επίδραση νουκλεασών κ.α [255]. Επίσης, βλάβες στην έλικα του DNA µπορεί να προκληθούν κατά την αντιγραφή, πρίν από την σύνδεση των κοµµατίων Okazaki καθώς και κατά τον ανασυνδιασµό. Υπάρχουν ενδείξεις για πιθανό ρόλο της πολυ-adp-ριβοσυλίωσης των ιστονών και στην αντιγραφή του DNA, όπως η αυξηµένη δραστικότητα της PARP σε διαιρούµενα κύτταρα σε ιστούς ποντικού σε σχέση µε µη διαιρούµενα καθώς και σε καρκινικά κύτταρα [256]. Το επίπεδο πολυ-adp-ριβοσυλίωσης των ιστονών έχει βρεθεί πως είναι µεγαλύτερο σε διαιρούµενα κύτταρα απ ότι σε µη διαιρούµενα, ενώ η δραστικότητα της PARP αυξάνεται κατά τη µετάβαση από τη φάση S στη φάση G2 του κυτταρικού κύκλου. Έχει προταθεί ότι οι βλάβες στην έλικα του DNA που προκαλούνται κατά την αντιγραφή του, ενεργοποιούν την PARP µε αποτέλεσµα την πολυ-adp-ριβοσυλίωση των ιστονών στην περιοχή του «πηρουνιού αντιγραφής» [257]. 81

96 1.4. ΦΥΤΟΟΡΜΟΝΕΣ Ο όρος «ορµόνη» χρησιµοποιήθηκε αρχικά από τους φυσιολόγους ζώων για να χαρακτηρίσει τις οργανικές ουσίες που παράγονται σ ένα ιστό και επιδρούν σε κάποια απόσταση από το σηµείο προέλευσής του. Οι ζωϊκές ορµόνες εκκρίνονται από τους αδένες, µεταφέρονται µέσω των αιµοφόρων αγγείων στο κατάλληλο σηµείο και ασκούν χαρακτηριστική επίδραση σε καθορισµένα όργανα του σώµατος. Αντίθετα, όσον αφορά τις φυτικές ορµόνες, είναι δύσκολο να διαχωριστεί µε ακρίβεια το όργανο στο οποίο συντίθεται από το σηµείο επίδρασής τους, αν και έχει αποδειχθεί ότι και αυτές ασκούν την δράση τους σε απόσταση από το όργανο στο οποίο παράγονται. Οι φυτοορµόνες µετακινούνται µέσα στο φυτό και ρυθµίζουν την ανάπτυξη και διαφοροποίησή των διαφόρων ιστών και οργάνων, προκαλώντας, σε αντίθεση µε τις ζωϊκές ορµόνες, µία ποικιλία αντιδράσεων, που εξαρτάται από το είδος του ιστού και του οργάνου στο οποίο εισέρχονται. Κοινό χαρακτηριστικό των φυτικών και ζωϊκών ορµονών είναι το ότι είναι ιδιαίτερα δραστικές σε εξαιρετικά µικρές συγκεντρώσεις. Επιπλέον, οι φυτοορµόνες δεν έχουν µόνο αυξητικό ρόλο, αλλά σε ορισµένες συγκεντρώσεις µπορεί να έχουν και ανασταλτική δράση στην ανάπτυξη του φυτού. Γι αυτό οι φυτικές ορµόνες θεωρούνται γενικά «ρυθµιστές της ανάπττυξης» που η συµπεριφορά τους εξαρτάται τόσο από τη χηµική τους δοµή, όσο και από την απόλυτη συγκέντρωσή τους στον ιστό ή στο όργανο που δέχεται την επίδρασή τους. Τέλος, πρέπει να τονιστεί ότι οι φυτοοορµόνες δεν δρούν ξεχωριστά η κάθε µία, αλλά αλληλεπιδρούν µεταξύ τους, είτε συνεργιστικά, είτε ανταγωνιστικά. 82

97 1.4.1 Αυξίνες Ήδη από τα τέλη του 19 ου αιώνα, ο Charles Darwin και ο υιός του Francis είχαν προτείνει την ύπαρξη µίας ουσίας που µετακινείται από την κορυφή προς τη βάση του φυτού και προκαλεί την κάµψη του αρτίβλαστου προς το φώς. Η ουσία αυτή αποµονώθηκε το 1926 από τον F. Went, αργότερα ονοµάστηκε «αυξίνη» και στη συνέχεια, µε την υπόθεση Cholodny-Went, προτάθηκε ότι η κάµψη του αρτίβλαστου και κάθε άλλου φυτικού οργάνου οφείλεται στην άνιση κατανοµή της αυξίνης στα διάφορα µέρη του. Σήµερα είναι γνωστό πως οι αυξίνες επιτελούν κρίσιµο ρόλο σε όλες σχεδόν τις διαδικασίες που σχετίζονται µε την ανάπτυξη και µορφογένεση των φυτών. Είναι απαραίτητες για την ανάπτυξη του εµβρύου, την διαφοροποίηση του φλοιώµατος και του ξυλώµατος, την κυριαρχία της κορυφής, την διακλάδωση της ρίζας και του βλαστού και για την απόκριση του φυτού σε περιβαλλοντικά ερεθίσµατα, όπως το φώς και η βαρύτητα (φωτοτροπισµός και γεωτροπισµός) [ ]. Συµµετέχουν στις διαδικασίες µορφογένεσης και οργανογένεσης του φυτού, επηρεάζοντας την προγραµµατισµένη διαφοροποίηση των κυττάρων στα µεριστώµατα, την κατανοµή της αύξησης µεταξύ κύριων και πλευρικών βλαστών και ριζών και τον σχηµατισµό των διαφόρων οργάνων. Οι αυξίνες συµβάλλουν στη ρύθµιση της διαίρεσης, της επιµήκυνσης, της πολικότητας και της διαφοροποίησης των κυττάρων, αφ ενός επιδρώντας άµεσα στις λειτουργίες της κυτταρικής µεµβράνης και του κυτταρικού σκελετού και αφ ετέρου ρυθµίζοντας την έκφραση πολλών γονιδίων, απαραίτητων για αυτές τις διαδικασίες [261,262]. Η επίδραση των αυξινών στις παραπάνω κυτταρικές διαδικασίες εξαρτάται µε τη σειρά της από το ρυθµό βιοσύνθεσης και αδρανοποίησης τους, την µεταφορά τους στα διάφορα µέρη του φυτού και την πρόσληψή τους στο σηµείο δράσης τους [263]. Έχει βρεθεί ότι η ίδια συγκέντρωση αυξίνης µπορεί να επιφέρει τελείως διαφορετικές αποκρίσεις, εξαρτώµενες από το είδος του φυτού, τον ιστό, το αναπτυξιακό στάδιο ή/και τις περιβαλλοντικές συνθήκες [264]. Αρχικά πιστευόταν ότι η αυξίνη συντίθεται αποκλειστικά στο µερίστωµα της κορυφής µέσω τροποποίησης της τρυπτοφάνης. Σήµερα είναι γνωστό ότι η βιοσύνθεση της αυξίνης µπορεί να συµβεί σε όλα τα νεαρά τµήµατα του φυτού, ενώ στα ανώτερα φυτά έχουν βρεθεί δύο κύρια µονοπάτια βιοσύνθεσης της αυξίνης, το ένα εξαρτώµενο από την τρυπτοφάνη και το άλλο ανεξάρτητο από αυτή. Επιπλέον, η σύνθεση της αυξίνης από 83

98 την τρυπτοφάνη µπορεί να γίνει µέσω τριών διαφορετικών µονοπατιών, κοινό στοιχείο των οποίων είναι ο σχηµατισµός της ινδολ-3-ακεταλδεϋδης, η οποία στη συνέχεια οξειδώνεται για να µετατραπεί σε ινδολ-3-οξικό οξύ. Έχει βρεθεί πως οι οξειδάσες της αλδεϋδης συµµετέχουν στη βιοσύνθεση και άλλων φυτοορµονών, όπως π.χ. του αµπσισικού οξέος, ενώ στο Arabidopsis έχουν ταυτοποιηθεί τα γονίδια που τις κωδικοποιούν. Αναφορικά µε το ανεξάρτητο από την τρυπτοφάνη µονοπάτι σύνθεσης της αυξίνης, υπάρχουν λίγες πληροφορίες που προέρχονται από µεταλλάγµατα µε ατέλειες στη σύνθεση της τρυπτοφάνης. Μελέτες των µεταλλαγµάτων αυτών έδειξαν ότι κεντρικό ρόλο σ αυτό το µονοπάτι παίζει το ινδολ-3-γλυκερολ-φωσφορικό οξύ, όµως ο µηχανισµός µετατροπής του σε ινδολ-3-οξικό οξύ και τα ένζυµα που συµµετέχουν παραµένουν άγνωστα. Έχει προταθεί ότι το ανεξάρτητο από την τρυπτοφάνη µονοπάτι παρέχει ένα συνεχές και σταθερό επίπεδο αυξίνης, ενώ το εξαρτώµενο από την τρυπτοφάνη µονοπάτι ενεργοποιείται όταν απαιτούνται υψηλότερα επίπεδα, όπως κατά την εµβρυογένεση ή τον τραυµατισµό του φυτού. Επίσης, είναι πιθανό τα δύο µονοπάτια να ενεργοποιούνται σε διαφορετικές χρονικές στιγµές [265]. Ο ρόλος της αυξίνης στην ανάπτυξη του φυτού προϋποθέτει αυστηρό έλεγχο της συγκέντρωσής της στους διάφορους φυτικούς ιστούς. Έχει βρεθεί ότι η υπερέκφραση των βιοσυνθετικών ενζύµων καθώς και η επίδραση εξωγενούς αυξίνης στο φυτό, οδηγούν σε αυξηµένη οξείδωσή της καθώς και σε ραγδαία συσσώρευση δεσµευµένων µορφών αυξίνης, διαδικασίες που αποτελούν και τα κύρια µονοπάτια αδρανοποίησής της. Πρέπει να σηµειωθεί ότι ο µηχανισµός αδρανοποίησης της αυξίνης δεν είναι ακόµη πλήρως γνωστός και τα γονίδια που εµπλέκονται σ αυτόν δεν έχουν ακόµη ταυτοποιηθεί [265]. Εκτός από τον ρόλο της στην αδρανοποίηση, η δέσµευση της αυξίνης έχει και αποθηκευτικό ρόλο. Έχει βρεθεί ότι το µεγαλύτερο ποσοστό της αυξίνης στα ανώτερα φυτά βρίσκεται σε ανενεργό µορφή, δεσµευµένο µε άλλες ενώσεις, οι οποίες µπορούν να µετακινούνται στο φυτό, ενώ η υδρόλυσή τους παρέχει ενεργή βιολογικά αυξίνη [266]. Η µεταφορά της αυξίνης από τις θέσεις όπου συντίθεται στις θέσεις όπου επιδρά παίζει σηµαντικό ρόλο στις αναπτυξιακές αποκρίσεις, τόσο στη ρίζα όσο και στο βλαστό [267]. Στο βλαστό η αυξίνη κινείται από την κορυφή προς τη βάση µέσω του φλοιώµατος, ενώ στη ρίζα µεταφέρεται τόσο ακροπεταλικά, δηλαδή κινείται 84

99 προς το µερίστωµα της ρίζας, µέσω του κεντρικού κυλίνδρου, όσο και βασιπεταλικά, δηλαδή από το µερίστωµα προς τα πάνω, µέσω των κυττάρων της επιδερµίδας [268]. Έχει βρεθεί ότι η ακροπεταλική µεταφορά της αυξίνης απαιτείται για τον σχηµατισµό των πλευρικών ριζών, ενώ η βασιπεταλική για την απόκριση στη βαρύτητα [267]. Η µεταφορά της αυξίνης διαµέσου των κυττάρων, γνωστή και ως «πολική µεταφορά», απαιτεί, σύµφωνα µε την χηµειοσµωτική θεωρία, την ύπαρξη ειδικών πρωτεϊνών-µεταφορέων στη βάση των κυττάρων από τα οποία διέρχεται [269,270]. Επιπλέον, ο τρόπος κατανοµής στην επιφάνεια των κυττάρων των µεταφορέων που συµµετέχουν στην έξοδο της αυξίνης από αυτά, καθορίζει την κατεύθυνση στην οποία θα κινηθεί η αυξίνη [261]. Στη µεταφορά της αυξίνης συµµετέχει µία ποικιλία πρωτεϊνών, όπως η AUX1 και οι πρωτεϊνες της οµάδας PIN [270]. Η AUX1, ήταν η πρώτη πρωτεϊνη-µεταφορέας της αυξίνης που ανακαλύφθηκε και βρέθηκε πως εµπλέκεται στην είσοδο της αυξίνης στα κύτταρα. Βρέθηκε ότι η AUX1 εκφράζεται στις αναπτυσσόµενες πλευρικές ρίζες και εντοπίζεται στην αντίθετη πλευρά του κυττάρου από τις πρωτεϊνες PIN [265]. Η πρώτη πρωτεϊνη που βρέθηκε πως εµπλέκεται στην έξοδο της αυξίνης από τα κύτταρα, ταυτοποιήθηκε στο Arabidopsis από τρείς διαφορετικές ερευνητικές οµάδες και ονοµάστηκε αντίστοιχα AtPIN2, EIR1, AGR. Η AtPIN2 είναι µία διαµεµβρανική πρωτείνη ο εντοπισµός της οποίας συνάδει µε το πρότυπο µεταφοράς της αυξίνης. Τα τελευταία χρόνια πολλές πρωτεϊνες όµοιες µε την AtPIN2 έχουν ταυτοποιηθεί και µελετηθεί [ ]. H πρωτεϊνη BIG βρέθηκε πως επηρεάζει αρνητικά την πολική µεταφορά της αυξίνης, µέσω της πρόσδεσή της στον κυτοσκελετό, που έχει ως συνέπεια τον ασύµµετρο εντοπισµό των πρωτεϊνών- µεταφορέων [271,276]. Η ασύµµετρη κατανοµή των αυξινών οδηγεί στο σχηµατισµό της διαβάθµισης που είναι απαραίτητη για ορισµένες χαρακτηριστικές αποκρίσεις, όπως π.χ. ο γεωτροπισµός [274]. Αντίστοιχα, στην πολική µεταφορά των δεσµευµένων µορφών της αυξίνης, η οποία είναι επίσης σηµαντική για την απόκριση του φυτού, θεωρείται πως συµµετέχουν οι πρωτεϊνες της οµάδας MRP [265]. Παρόλο που πολλές πρωτεϊνες µπορούν και προσδένονται στην αυξίνη, µόνο η ABP1, που αρχικά ανακαλύφθηκε ως µία πρωτεϊνη 22kDa στο καλαµπόκι, έχει συσχετισθεί µε εξαρτώµενες από την αυξίνη φυσιολογικές επιδράσεις και εµφανίζει τα απαραίτητα χαρακτηριστικά ενός υποδοχέα. Παρόλο που η απάλειψη και η υπερέκφρασή της έδειξαν ότι παίζει σηµαντικό ρόλο στη ρύθµιση της πρόσληψης της αυξίνης 85

100 από τα κύτταρα καθώς και το επίπεδο απόκρισης σ αυτή [277], η ABP1 δεν έχει συσχετιστεί µε την κυτταρική διαίρεση ή/και την µεταγραφική ρύθµιση που εξαρτώνται από την αυξίνη, γεγονός που υποδηλώνει ότι πιθανόν να υπάρχουν και άλλες πρωτεϊνες στα φυτικά κύτταρα που λειτουργούν ως υποδοχείς της αυξίνης [265]. Οι κύριοι παράγοντες απόκρισης στην αυξίνη ανήκουν στις οικογένειες µεταγραφικών παραγόντων, ARF και Aux/IAA, οι οποίες στο Arabidopsis αποτελούνται αντίστοιχα από 23 και 29 µέλη [258]. Οι ARF έχουν µία αµινοτελική περιοχή πρόσδεσης στο DNA, µε την οποία προσδένονται ως διµερή στις αλληλουχίες απόκρισης στην αυξίνη (AuxREs) και λειτουργούν είτε ως ενεργοποιητές, είτε ως καταστολείς της έκφρασης των γονιδίων που ρυθµίζονται από την αυξίνη [278]. Επίσης, φέρουν µία περιοχή που χρησιµεύει για ολιγοµερισµό, ενώ στο καρβοξυτελικό τους άκρο υπάρχουν δύο περιοχές αλληλεπίδρασης, οµόλογες µε περιοχές των πρωτεϊνών Aux/IAA. Παρόλο που οι περισσότεροι ARF εκφράζονται σε όλα τα κύρια όργανα του φυτού, ορισµένοι εµφανίζουν εξειδίκευση σε συγκεκριµένους ιστούς, που σε συνδιασµό µε διαφορική στόχευση στους προαγωγείς, οδηγεί στην υπόθεση ότι διαφορετικοί ARF µπορεί να έχουν και διακριτές λειτουργίες [258,279]. Οι Aux/IAA, που έχουν ταυτοποιηθεί σε πολλά δικοτυλίδονα και µονοκοτυλίδονα φυτά [262], είναι επίσης µεταγραφικοί παράγοντες οι οποίοι δεν προσδένονται στο DNA, αλλά σχηµατίζουν ετεροδιµερή µε τους ARF, µέσω των οµόλογων περιοχών που φέρουν, αποτρέποντας µ αυτό τον τρόπο την πρόσδεση των τελευταίων στο DNA. Η έκφραση των Aux/IAA ρυθµίζεται από την αυξίνη σε αντίθεση µε την έκφραση των ARF, ενώ οι προαγωγείς πολλών πρωτεϊνών Aux/IAA περιέχουν θέσεις πρόσδεσης των ARF [258]. Η λειτουργία των Aux/IAA ρυθµίζεται από την, επαγόµενη από την αυξίνη, ταχεία αποικοδόµησή τους µέσω του µονοπατιού της ουβικουιτίνης και του πρωτεασώµατος 26S [280]. Έχει προταθεί ότι σε χαµηλά επίπεδα αυξίνης, οι Aux/IAA προσδένονται στους ARF µε αποτέλεσµα την παρεµπόδιση της ρύθµισης των γονιδίων απόκρισης στην αυξίνη. Αύξηση της συγκέντρωσης της αυξίνης οδηγεί στην αποικοδόµηση των Aux/IAA και συνεπώς αποδιάταξη των παραπάνω συµπλόκων, οπότε οι ARF µπορούν να προσδεθούν στο DNA και να ενεργοποιήσουν ή να καταστείλουν την µεταγραφή των γονιδίων αυτών [281]. Μείωση των επιπέδων της αυξίνης, οδηγεί σε µείωση του ρυθµού αποικοδόµησης και στον επανασχηµατισµό των συµπλόκων ARF-Aux/IAA, λόγω της σύνθεσης των πρωτεϊνών αυτών και στην παρεµπόδιση του µονοπατιού 86

101 [278]. Στο µονοπάτι µεταγωγής σήµατος της αυξίνης είναι πιθανόν να εµπλέκονται και άλλοι µεταγραφικοί παράγοντες εκτός από τους ARF και Aux/IAA, όπως ο NAC1 στο Arabidopsis, η δράση του οποίου βρέθηκε πως προάγει τον σχηµατισµό πλευρικών ριζών [282] Γιββεριλλίνες Οι γιββεριλλίνες παίζουν σηµαντικό ρυθµιστικό ρόλο σε πολλές και ποικίλες αναπτυξιακές διαδικασίες των φυτών, όπως είναι η βλάστηση του σπόρου, η επιµήκυνση του βλαστού, ο σχηµατισµός του φύλλου, η αναστολή της αύξηση της ρίζας, η ανάπτυξη του άνθους και του καρπού [283]. Η ανακάλυψη των γιββεριλλινών, στις αρχές του περασµένου αιώνα, οφείλεται κυρίως στην ασθένεια «bakanae» του ρυζιού, η οποία είχε καταστρεπτικές συνέπειες στην παραγωγή σε περιοχές της Ν.Α. Ασίας και βρέθηκε πως προκαλείται από τον ασκοµύκητα Gibberella fujikuroi. Τα προσβεβληµένα φυτά παρουσίαζαν υπερβολικό ύψος και αδύναµο ριζικό σύστηµα, σε σύγκριση µε τα υγιή, συµπτώµατα που, όπως αποδείχθηκε στη συνέχεια, ήταν αποτέλεσµα της παραγόµενης από τον µύκητα, γιββεριλλίνης [284]. Στα χρόνια που ακολούθησαν, ταυτοποιήθηκε η χηµική δοµή και ερευνήθηκε ο µεταβολισµός των γιββεριλλινών καθώς και οι µηχανισµοί µε τους οποίους επιδρούν στην ανάπτυξη των φυτών. Μέχρι σήµερα έχουν γίνει γνωστές 126 ουσίες παρόµοιες µε την γιββεριλλίνη, σε ανώτερα φυτά και µύκητες και πιθανόν να ταυτοποιηθούν ακόµη περισσότερες. Παρόλα αυτά, µόνο µερικές από αυτές βρέθηκε πως είναι βιολογικά ενεργές [285]. Το πλέον χαρακτηριστικό αποτέλεσµα της δράσης των γιββεριλλινών είναι η επιµήκυνση του βλαστού, τόσο σε κανονικά φυτά, όσο και σε ποικιλίες φυτών «νάνων», τα οποία µε την επίδραση γιββεριλλινών, παίρνουν τη µορφή των κανονικών φυτών [284]. Αντίστοιχα, µεταλλάξεις σε γονίδια που σχετίζονται είτε µε τη βιοσύνθεση, είτε µε το µονοπάτι µεταγωγής σήµατος των γιββεριλλών, έχουν ως αποτέλεσµα «νάνα» φυτά, µε σκούρο πράσινο χρώµα και ατέλειες στην αύξηση του βλαστού και των φύλλων. Επιπλέον, σε πολλές περιπτώσεις παρατηρείται αναστολή της βλάστησης ή/και ελαττωµατική ανάπτυξη των διαφόρων οργάνων του φυτού [286]. Οι γιββεριλλίνες είναι επίσης απαραίτητες κατά τη βλάστηση των σπερµάτων στα 87

102 δηµητριακά, όπου επάγουν την έκφραση των γονιδίων που κωδικοποιούν υδρολυτικά ένζυµα, όπως η α- αµυλάση, που είναι απαραίτητα για την ανάπτυξη του εµβρύου [287,288]. Τέλος, οι γιββεριλλίνες προκαλούν διακοπή του ληθάργου των σπόρων και των οφθαλµών, ενώ συµµετέχουν και στον καθορισµό του φύλου των ανθέων, προάγωντας τον σχηµατισµό αρσενικών ανθέων, σε αντίθεση µε τις αυξίνες, τις κυτοκινίνες και το αιθυλένιο, που έχουν έχουν το αντίθετο αποτέλεσµα [283]. Oι γιββεριλλίνες ανήκουν στην κατηγορία των τετρακυκλικών διτερπενοϊδών και µπορούν να χωριστούν σε δύο µεγάλες κατηγορίες, ανάλογα µε το αν αποτελούνται από 19 ή 20 άτοµα άνθρακα. Οι χηµικές διαφορές µεταξύ των διαφόρων γιββεριλλινών εντοπίζονται κυρίως στον αριθµό και την διάταξη των υδροξυλικών οµάδων καθώς και στο βαθµό κορεσµού του δακτυλίου [288]. Η βιοσύνθεση των γιββεριλλινών µπορεί να χωριστεί σε τρία στάδια, το καθένα από τα οποία καταλύεται από διαφορετικά ένζυµα και πραγµατοποιείται σε διαφορετικό διαµέρισµα του κυττάρου [284]. Αρχικά, το ισοπεντανυλ-πυροφοσφωρικό οξύ µετατρέπεται σε ent-καυρίνη. Η µετατροπή αυτή γίνεται στα προπλαστίδια των µεριστωµατικών κυττάρων του βλαστού, όπου εντοπίζονται και τα αντίστοιχα ένζυµα. Στη συνέχεια, η ent-καυρίνη µετατρέπεται σε GA12-αλδεϋδη, µέσω µίας σειράς οξειδώσεων που πραγµατοποιούνται στο ενδοπλασµατικό δίκτυο. Τέλος, µε τη βοήθεια των διοξυγενασών του γιββεριλλικού οξέος, που συναντώνται στο κυτταρόπλασµα σχηµατίζονται οι διάφορες γιββεριλλίνες (GA20 ή/και GA19) των φυτών [289]. Η µελέτη µεταλλάξεων στο Arabidopsis και στα δηµητριακά, ο φαινότυπος των οποίων σχετίζεται µε τη δράση των γιββεριλλινών, οδήγησε στην ανακάλυψη πολλών παραγόντων του µονοπατιού µεταγωγής του σήµατός τους. Βρέθηκε ότι τα γονίδια GAI και RGA του Arabidopsis κωδικοποιούν δύο οµόλογες πρωτεϊνες, οι οποίες συµµετέχουν στη µεταγραφική ρύθµιση και αποτελούν αρνητικούς ρυθµιστές του µονοπατιού. Στο Arabidopsis έχουν βρεθεί άλλα τρία οµόλογα γονίδια, τα RGL1, RGL2 και RGL3, τα προϊόντα των οποίων, µαζί µε τις πρωτεϊνες GAI και RGA καθορίζουν την οµάδα πρωτεϊνών DELLA, τα µέλη της οποίας περιέχουν µία εξαιρετικά συντηρηµένη αµινοτελική περιοχή. Επιπλέον, αποδείχθηκε ότι εκτός από τις GAI και RGA, οι RGL1 και RGL2 επίσης λειτουργούν ως αρνητικοί ρυθµιστές του µονοπατιού των γιββεριλλινών. Η µελέτη του φαινοτύπου µεταλλάξεων των παραπάνω γονιδίων έδειξε ότι οι πρωτεϊνες αυτές έχουν τόσο 88

103 αλληλεπικαλυπτόµενους, όσο και εξειδικευµένους ρόλους στην ανάπτυξη του φυτού [286]. Βρέθηκε πως για να υπερβεί η γιββερίλλινη την αρνητική δράση των παραπάνω πρωτεϊνών επάγει την άµεση αποικοδόµησή τους και πειράµατα µε µεταλλάξεις έδειξαν ότι υπεύθυνη για τη διαδικασία αυτή είναι η περιοχή DELLA [290,291]. Συνεπώς, µεταλλάξεις στην περιοχή DELLA οδηγούν στην συνεχή παραγωγή των αρνητικών ρυθµιστών του µονοπατιού, οι οποίοι δεν αποικοδοµούνται από την επίδραση των γιββεριλλινών. Στη διαδικασία αποικοδόµησης των πρωτεϊνών της οµάδας DELLA εµπλέκεται η πρωτεϊνη SLY1, η οποία αποτελεί υποµονάδα του συµπλόκου SCF, που είναι υπεύθυνο για την πολυ-ουβικουιτίνωση και την µετέπειτα αποικοδόµησή τους από το πρωτεάσωµα. Μεταλλάξεις στο γονίδιο που κωδικοποιεί την SLY1 είχαν ως αποτέλεσµα αυξηµένα επίπεδα των πρωτεϊνών GAI και RGA, ανεξάρτητα από την επίδραση γιββεριλλινών, ενώ βρέθηκε επίσης, ότι η περιοχή DELLA δεν είναι απαραίτητη για την αλληλεπίδρασή τους µε την SLY1 [286]. Σύµφωνα µε τα παραπάνω, έχει προταθεί ένα µοντέλο για το µονοπάτι µεταγωγής του σήµατος των γιββεριλλινών, κατά το οποίο οι παραγόµενες από το φυτό γιββεριλλίνες εισέρχονται στο κύτταρο µέσω ενός υποδοχέα που βρίσκεται στην κυτταρική µεµβράνη και επιφέρουν µία σειρά γεγονότων, ένα από τα οποία είναι η απενεργοποίηση των αρνητικών ρυθµιστών του µονοπατιού, δηλαδή των πρωτεϊνών της οµάδας DELLA. Η γιββεριλλίνη επάγει την τροποποίηση της περιοχής DELLA των πρωτεϊνών αυτών, πιθανόν µέσω της ενεργοποίησης µίας κινάσης, και στη συνέχεια προσδένεται σ αυτές η υποµονάδα SLY1 του συµπλόκου SCF, µε αποτέλεσµα την αναγνώριση και αποικοδόµησή τους από το πρωτεάσωµα 26S. Η µείωση του επιπέδου των αρνητικών ρυθµιστών του µονοπατιού, επιτέπει την µετέπειτα έκφραση των ρυθµιζόµενων από την γιββεριλλίνη γονιδίων και την απόκριση του φυτού [286]. Οµόλογα των πρωτεϊνών της οµάδας DELLA έχουν βρεθεί και µελετηθεί σε πολλά άλλα φυτά. Κυρίαρχες µεταλλάξεις στα γονίδια που κωδικοποιούν τις πρωτεϊνες αυτές στα δηµητριακά έχουν ως αποτέλεσµα τη δηµιουργία, σε µικρό ή µεγάλο βαθµό, «νάνων» φυτών, τα οποία δίνουν υψηλότερες αποδόσεις και είναι περισσότερο ανθεκτικά στις καιρικές συνθήκες. Σε αυτά τα γονίδια οφείλεται η δηµιουργία και καθιέρωση αποδοτικών και ανθεκτικών ποικιλιών δηµητριακών την δεκαετία του 50, που οδήγησε στη ραγδαία αύξηση 89

104 της παγκόσµιας παραγωγής σιτηρών, γεγονός που ονοµάστηκε «πράσινη επανάσταση» [286]. Τέτοια γονίδια είναι το Rht στο σιτάρι, το D8 στο καλαµπόκι, το slr1 στο ρύζι, το sln1-d στη βρώµη καθώς και το dwf2 στο Brassica rapa και το Vvgai1 στο αµπέλι [292]. Πιστεύεται πως τα «νάνα» αλληλόµορφα των παραπάνω γονιδίων κωδικοποιούν πρωτεϊνες µε ατέλειες στην περιοχή DELLA και γι αυτό δεν είναι δυνατή, η επαγόµενη από τη γιββεριλλίνη, αποικοδόµησή τους, γεγονός που θα συνέβαινε αν η περιοχή διατηρούσε την συντηρηµένη, όπως στις πρωτείνες GAI και RGA του Arabidopsis, αλλληλουχία της. Από τα παραπάνω φαίνεται ότι το µονοπάτι µεταγωγής σήµατος των γιββεριλλινών είναι συντηρηµένο µεταξύ δικοτυλίδονων και µονοκοτυλίδονων φυτών [286]. Εκτός από τους αρνητικούς ρυθµιστές, έχουν βρεθεί και πρωτεϊνες που λειτουργούν ως θετικοί ρυθµιστές του µονοπατιού των γιββεριλλινών. Το γονίδιο D1 στο ρύζι, που κωδικοποιεί µία δυνητική υποµονάδα της ετεροτριµερούς πρωτεϊνης G, αποτελεί θετικό ρυθµιστή του µονοπατιού σήµατος της γιββεριλλίνης και µετάλλαξή του προκαλεί νανισµό στο φυτό. Μία άλλη πρωτεϊνη που θεωρείται θετικός ρυθµιστής είναι η PHOR1 στην πατάτα, η οποία πιθανόν να παίζει ρόλο στην αποικοδόµηση των πρωτεϊνών της οµάδας DELLA. Τέλος, στα κύτταρα της αλευρώνης των δηµητριακών, βρέθηκε ότι ο µεταγραφικός παράγοντας GAMYB προάγει την έκφραση των γονιδίων της α-αµυλάσης [286]. 90

105 1.4.3 Κυτοκινίνες Οι κυτοκινίνες επιτελούν σηµαντικό ρόλο σε πολλές φυσιολογικές και αναπτυξιακές διαδικασίες των φυτών, όπως η βλάστηση του σπόρου, η αύξηση και του βλαστού και της ρίζας, ο σχηµατισµός κλαδιών και πλευρικών ριζών, η κυριαρχία της κορυφής, η διαφοροποίηση του φλοιώµατος και του ξυλώµατος, η ανάπτυξη των ανθέων και των καρπών, η διαφοροποίηση των χλωροπλαστών και η απόκριση του φυτού σε προσβολές από παθογόνους οργανισµούς και σε περιβαλλοντικές καταπονήσεις. Οι κυτοκινίνες συµµετέχουν στις παραπάνω διαδικασίες λόγω της ικανότητάς τους να επάγουν τις κυτταρικές διαιρέσεις, η οποία ήταν και η αιτία της ανακάλυψής τους την δεκαετία του 50, οπότε είχαν ταυτοποιηθεί ως ουσίες που επάγουν τις κυτταροδιαιρέσεις σε ιστοκαλλιέργειες κάλλων. Στη συνέχεια παρατηρήθηκε ότι η σχετική αναλογία µεταξύ αυξίνης και κυτοκινίνης καθορίζει την µορφογένεση των αδιαφοροποίητων κυττάρων της ιστοκαλλιέγειας [ ]. Οι φυσικές κυτοκινίνες είναι παράγωγα της αδενίνης που φέρουν µία πλευρική αλυσίδα στη θέση 6 του δακτυλίου τους. Ανάλογα µε τη δοµή της πλευρικής αλυσίδας, µπορούν να χωριστούν σε ισοπρενοϊδείς ή αρωµατικές κυτοκινίνες. Επιπλέον, υπάρχουν και συνθετικές κυτοκινίνες, οι οποίες είναι παράγωγα της διφαινυλουρίας και η δοµή των οποίων είναι εντελώς διαφορετική από αυτή των φυσικών κυτοκινινών. Η δοµή και η διαµόρφωση της πλευρικής αλυσίδας παίζει σηµαντικό ρόλο στην δραστικότητα των διαφόρων κυτοκινινών. [294]. Υψηλά επίπεδα κυτοκινινών παρατηρούνται στο µεριστώµα της ρίζας, που πιστεύεται πως είναι το κύριο κέντρο σύνθεσής τους, καθώς και στην κορυφή του βλαστού και στους ανώριµους σπόρους, όπου επίσης συντίθενται κυτοκινίνες. Τα επίπεδα των κυτοκινινών εξαρτώνται από το στάδιο του κυτταρικού κύκλου καθώς και από τις περιβαλλοντικές συνθήκες [294]. Μέχρι πρόσφατα πιστευόταν ότι η βιοσύνθεση των κυτοκινινών συντελείται µε την προσθήκη της ισοπεντενυλικής αλυσίδας στο ΑΜΡ. Η ανακάλυψη όµως και η µελέτη των ενζύµων που εµπλέκονται σ αυτήν, των ισοπεντενυλοτρανσφερασών, έδειξε ότι η παραπάνω προσθήκη γίνεται επίσης στο ADP και το ATP [296,297]. Το µονοπάτι µεταγωγής σήµατος των κυτοκινινών έχει µελετηθεί εκτενώς και είναι το πρώτο µονοπάτι φυτοορµόνης που αποτελείται από σύστηµα δύο συστατικών, παρόµοιο µε τα αντίστοιχα των βακτηρίων 91

106 [298]. Αρχικά, είχε προταθεί ότι ο υποδοχέας των κυτοκινινών είναι το προϊόν του γονιδίου CKI1 του Arabidopsis, η µελέτη όµως των ιδιοτήτων του και το γεγονός ότι λειτουργεί ανεξάρτητα από αυτές, οδήγησαν στο συµπέρασµα ότι δεν επιτελεί αυτό τον ρόλο [295]. Πιο πρόσφατες µελέτες έδειξαν ότι ο CRE1/AHK4, ένας υποδοχέας µε δράση κινάσης ιστιδίνης, αλληλεπιδρά in vitro µε τις κυτοκινίνες και λειτουργεί µε τρόπο εξαρτώµενο από την παρουσία τους [299]. Ο CRE1/AHK4, όπως και οι ΑΗΚ2 και ΑΗΚ3, θεωρούνται οι πλέον πιθανοί υποδοχείς των κυτοκινινών στο Arabidopsis. Επιπλέον, έχει ταυτοποιηθεί ένας ακόµη παρόµοιος υποδοχέας, ο ΑΗΚ1, δεν έχει όµως ακόµη διευκρινιστεί αν σχετίζεται µε τη µεταγωγή του σήµατος των κυτοκινινών [295]. Στο Arabidopsis ταυτοποιήθηκαν επίσης έξι πρωτεϊνες, οι ΑΗΡ1-6, που µπορούν να µεταφέρουν τη φωσφορική οµάδα από του υποδοχείς στους υπόλοιπους παράγοντες του µονοπατιού [300]. Στο γονιδίωµα του Arabidopsis έχουν βρεθεί 23 γονίδια που κωδικοποιούν ρυθµιστές της απόκρισης στις κυτοκινίνες (ARRs), οι οποίοι ανάλογα µε τη δοµή και το ρόλο τους, µπορούν να χωριστούν σε δύο κατηγορίες, τους ρυθµιστές τύπου Α και τους ρυθµιστές τύπου Β [295]. Η επίδραση κυτοκινινών αυξάνει τα επίπεδα µεταγραφής των γονιδίων των ARR τύπου Α, ενώ τα προϊόντα τους βρέθηκε πως λειτουργούν ως ρυθµιστές στο µονοπάτι µεταγωγής του σήµατός τους. Αντίθετα, δεν επηρεάζει το επίπεδο µεταγραφής των ρυθµιστών τύπου Β, οι οποίοι εµφανίζουν ικανότητα πρόσδεσης στο DNA και θεωρούνται πιθανοί ενεργοποιητές της µεταγραφής [ ]. Τα παραπάνω δεδοµένα οδήγησαν σε ένα µοντέλο σύµφωνα µε το οποίο, το σήµα των κυτοκινινών προσλαµβάνεται από την αµινοτελική περιοχή των υποδοχέων CRE1/AHKs, οι οποίοι αυτοφωσφορυλιώνονται και έπειτα, µέσω της καρβοξυτελικής τους περιοχής και των πρωτεϊνών AHPs, η φωσφορική οµάδα µεταφέρεται στις ρυθµιστικές πρωτεϊνες ARR τύπου Β, που ενεργοποιούν την µεταγραφή των γονιδίων απόκρισης, συµπεριλαµβανοµένων και των ρυθµιστικών πρωτεϊνών ARR τύπου Α [295]. 92

107 1.4.4 Αµπσισικό οξύ Το αµπσισικό οξύ ανακαλύφθηκε στις αρχές της δεκαετίας του 60 και βρέθηκε πως συµµετέχει σε πολλές αναπτυξιακές διαδικασίες του φυτού, όπως η ωρίµανση, ο λήθαργος και η βλάστηση των σπόρων, η επιµήκυνση της ρίζας, το κλείσιµο των στοµάτων και η ρύθµιση της βλάστησης σε δυσµενείς περιβαλλοντικές συνθήκες, όπως ξηρασία, αυξηµένη αλατότητα και χαµηλές θερµοκρασίες [ ]. Αυξηµένα επίπεδα αµπσισικού οξέος παρατηρούνται κατά την ανάπτυξη του σπόρου όπου επάγουν την ωρίµανση του εµβρύου, την σύνθεση αποταµιευτικών ουσιών και την έναρξη της εισόδου του σπόρου σε λήθαργο [308]. Επίσης, τα επίπεδα του αµπσισικού οξέος αυξάνονται σε συνθήκες καταπόνησης του φυτού, λόγω αυξηµένης αλατότητας, ξηρασίας και σε µικρότερο βαθµό, χαµηλών θερµοκρασιών. Σε αυτή την περίπτωση, το αµπσισικό οξύ επάγει αφ ενός το κλείσιµο των στοµάτων και αφ ετέρου την έκφραση των γονιδίων που σχετίζονται µε την ανθεκτικότητα του φυτού στις παραπάνω καταπονήσεις [305]. Τέλος, απουσία καταπόνησης, το αµπσισικό οξύ διατηρείται σε χαµηλά επίπεδα, τα οποία όµως είναι απαραίτητα για την φυσιολογική ανάπτυξη του φυτού [308]. Το αµπσισικό οξύ σχηµατίζεται µέσω ενός πολύπλοκου µονοπατιού που περιλαµβάνει την διάσπαση ενός πρόδροµου καροτενοειδούς µε ανθρακική αλυσίδα 40 ατόµων, της ζεαξανθίνης, που συµβαίνει στα πλαστίδια και την µετέπειτα µετατροπή, µε µία διαδικασία δύο σταδίων, του ενδιάµεσου προϊόντος, της ξανθοξίνης σε αµπσισικό οξύ, που συµβαίνει στο κυτταρόπλασµα. Οι παραπάνω διαδικασίες καθώς και τα ένζυµα που τις καταλύουν βρέθηκαν σε εξαιρετικό βαθµό συντηρηµένα σε όσα φυτά έχουν µελετηθεί [308]. Εκτός από το παραπάνω κύριο µονοπάτι βιοσύνθεσης, το αµπσισικό οξύ µπορεί να σχηµατιστεί άµεσα µε διάσπαση του φαρνεσυλοπυροφωσφορικού οξέος, µίας πρόδροµης ένωσης µε 15 άτοµα άνθρακα [309]. Έχει βρεθεί ότι η βιοσύνθεση του αµπσισικού οξέος κατά την ανάπτυξη του σπόρου υφίσταται αυστηρό αναπτυξιακό έλεγχο και επάγεται από τα διαλυτά σάκχαρα, το οσµωτικό δυναµικό και το αµπσισικό οξύ που προέρχεται από τους µητρικούς ιστούς. Το τελευταίο είναι απαραίτητο στα πρώτα στάδια της ωρίµανσης και πιστεύεται πως αποτελεί το «σήµα» για την de novo σύνθεση αµπσισικού οξέος στον σπόρο [308]. Η βιοσύνθεση του αµπσισικού οξέος επάγεται δραµατικά από την ξηρασία και την αλατότητα και αυτό γίνεται µε ενεργοποίηση 93

108 της µεταγραφής των γονιδίων που κωδικοποιούν τα ένζυµα του βιοσυνθετικού του µονοπατιού. Έχει βρεθεί τέλος ότι, απουσία καταπόνησης, το αµπσισικό οξύ επάγει την αποικοδόµησή του µέσω µεταγραφικής ενεργοποίησης των γονιδίων που κωδικοποιούν καταβολικά ένζυµα [310]. Παρά τη µεγάλη σηµασία του αµπσισικού οξέος στην ανάπτυξη των φυτών, το µονοπάτι µεταγωγής του σήµατός του δεν είναι ακόµη πλήρως κατανοητό. Για παράδειγµα, δεν έχει προταθεί ακόµη υποψήφιος υποδοχέας του αµπσισικού οξέος, ούτε είναι γνωστή η θέση πρόσληψής του. Η µελέτη του κλεισίµατος των στοµάτων, το οποίο επάγεται από το αµπσισικό οξύ, έδειξε ότι αυτό επιτυγχάνεται µε την ενεργοποίηση ενός καναλιού ασβεστίου, η λειτουργία του οποίου ρυθµίζεται στη συνέχεια από δευτερογενείς µηνύτορες, όπως είναι το cadpr και το cgmp, η τριφωσφορική ινοσιτόλη, το Η2Ο2, οι φωσφατάσες PP1 και PP2A κ.α. τα οποία διαπιστώθηκε πως εµπλέκονται και στο µονοπάτι του αµπσισικού οξέος [311,312]. Στους ρυθµιστές της απόκρισης στο αµπσισικό οξύ συµπεριλαµβάνονται επίσης κινάσες, όπως οι εξαρτώµενες από το ασβέστιο κινάσες (CDPKs) και οι κινάσες τύπου SNF-1, καθώς και οι φωσφατάσες ΑΒΙ1 και ΑΒΙ2, που λειτουργούν ως αρνητικοί ρυθµιστές του µονοπατιού [313,314]. Οι ΑΒΙ1 και ΑΒΙ2 εµφανίζουν υψηλό ποσοστό οµολογίας και εµπλέκονται σε αποκρίσεις εξαρτώµενες από το αµπσισικό οξύ, όπως το κλείσιµο των στοµάτων, η αναστολή της βλάστησης και ο λήθαργος του σπόρου, ενώ οι φωσφατάσες AtPPC2A και AtP2CHA εµπλέκονται στην απόκριση στις χαµηλές θερµοκρασίες [315]. Αντίθετα, οι κινάσες PKABA1 στο σιτάρι και AAPK στο Vicia, που ανήκουν στην οικογένεια κινασών που καθορίζεται από την SNF-1, αποτελούν θετικούς ρυθµιστές του µονοπατιού του αµπσισικού οξέος [316]. Η κινάση OST/SRK2E του Arabidopsis που ενεργοποιείται από το αµπσισικό οξύ, πιθανόν να είναι οµόλογη της ΑΑΡΚ και πειράµατα µε µεταλλάξεις έδειξαν ότι είναι απαραίτητη για το κλείσιµο των στοµάτων, δεν επηρεάζει όµως τον λήθαργο του σπόρου [317]. Στο Arabidopsis έχουν ταυτοποιηθεί πάνω από 1300 γονίδια που ρυθµίζονται από αµπσισικό οξύ. Η ρύθµιση της έκφρασης της πλειοψηφίας των παραπάνω γονιδίων από το αµπσισικό οξύ παρεµποδίζεται από την µετάλλαξη abi1-1, γεγονός που δείχνει τον κεντρικό ρόλο του παραπάνω γονιδιακού τόπου στη µεταγωγή του σήµατός του [318]. Στη ρύθµιση της γονιδιακής έκφρασης από το αµπσισικό οξύ συµµετέχουν ο µεταγραφικός παράγοντας VP1/ABI3, µεταγραφικοί παράγοντες τύπου bzip και µεταγραφικοί παράγοντες της οµάδας AP2 [305]. Οι 94

109 µεταγραφικοί παράγοντες τύπου bzip αλληλεπιδρούν µε τις αλληλουχίες απόκρισης ABRE στους προαγωγείς των ρυθµιζόµενων από το αµπσισικό οξύ γονιδίων. Συνήθως η απόκριση στο αµπσισικό οξύ απαιτεί µία ακόµη cis αλληλουχία, την CE, που ειναι όµοια µε το ABRE ή µία αλληλουχία DRE, µε τις οποίες αλληλεπιδρούν οι παράγοντες τύπου bzip και τύπου AP2 αντίστοιχα [319,320] Αιθυλένιο Το αιθυλένιο είναι η απλούστερη, µικρότερη και πλέον ευδιάχυτη φυτοορµόνη. Επηρεάζει σχεδόν όλες τις αναπτυξιακές διαδικασίες του φυτού καθώς και την απόκρισή του σε ποικίλους περιβαλλοντικούς παράγοντες. Το αιθυλένιο παίζει σηµαντικό ρόλο στην βλάστηση του σπόρου, στον καθορισµό του φύλου των ανθέων, στη γήρανση και αποκοπή των φύλλων και των ανθέων καθώς και στην ωρίµανση και αποκοπή των καρπών. Επιπλέον, βοηθά το φυτό να ανταποκριθεί σε δυσµενείς περιβαλλοντικές συνθήκες και προσβολές από παθογόνα, όπου η επαγόµενη από την καταπόνηση σύνθεση αιθυλενίου έχει ως αποτέλεσµα την επιβράδυνση της ανάπτυξης του φυτού όσο αυτή διαρκεί. Σε φυτά που βλαστάνουν στο σκοτάδι παρουσία αιθυλενίου προκαλείται ο φαινότυπος της «τριπλής απόκρισης», δηλαδή αναστολή της επιµήκυνσης της ρίζας και του υποκότυλου και υπερβολική κάµψη του αρτίβλαστου [321]. Το αιθυλένιο είναι ένας απλός υδρογονάνθρακας, ο οποίος κάτω από φυσιολογικές συνθήκες είναι σε αέριο µορφή. Έχει βρεθεί ότι η βιοσύνθεση του αιθυλενίου επάγεται από µία ποικιλία αναπτυξιακών και περιβαλλοντικών παραγόντων και η πρόδροµη ουσία για τον σχηµατισµό του είναι η µεθειονίνη, η οποία µετατρέπεται αρχικά σε S-αδενοσυλοµεθειονίνη και στη συνέχεια σε µεθυλοθειοαδενοσίνη και 1- αµινοκυκλοπροπανο-1-καρβοξυλικό οξύ (ACC). Έπειτα, το ACC οξειδώνεται σε HCN, CO2 και αιθυλένιο. Η µεθυλοθειοαδενοσίνη χρησιµοποιείται για την εκ νέου σύνθεση µεθειονίνης µέσω ενός άλλου βιοσυνθετικού µονοπατιού και έτσι επιτυγχάνεται η ανακύκλωση της οµάδας CH3S. Τα σηµαντικότερα ένζυµα που συµµετέχουν στο µονοπάτι βιοσύνθεσης του αιθυλενίου είναι η συνθάση και η οξειδάση του ACC τα οποία 95

110 κωδικοποιούνται από πολυγονιδιακές οικογένειες και η έκφρασή τους ρυθµίζεται από µία ποικιλία αναπτυξιακών και περιβαλλοντικών παραγόντων καθώς και από την επίδραση άλλων φυτοορµονών [322,323]. Η γενετική και µοριακή ανάλυση µεταλλαγµένων φυτών Arabidopsis που είτε δεν εµφάνιζαν τον φαινότυπο της «τριπλής απόκρισης» υπό την επίδραση αιθυλενίου, είτε τον εµφάνιζαν ακόµη και απουσία αιθυλενίου, οδήγησε στον καθορισµό του µονοπατιού του αιθυλενίου [323]. Βρέθηκε ότι το αιθυλένιο προσλαµβάνεται από τα µέλη µίας οικογένειας µεµβρανικών υποδοχέων (ETR1, ETR2, ERS1, ERS2 και EIN4), τα οποία εµφανίζουν πολλές οµοιότητες µε τους υποδοχείς των συστηµάτων δύο συστατικών των βακτηρίων [324,325]. Το επόµενο συστατικό του µονοπατιού είναι η CTR1, µία κινάση Ser/Thr η οποία εµφανίζει πολλές οµοιότητες µε τις MAPKKK. Πειράµατα µε µεταλλάξεις έδειξαν ότι, τόσο οι υποδοχείς, όσο και η CTR1, αποτελούν αρνητικούς ρυθµιστές του µονοπατιού του αιθυλενίου [325,326]. Στη συνέχεια, το µήνυµα του αιθυλενίου µεταβιβάζεται στον ΕΙΝ2, ο οποίος αποτελεί ένα θετικό ρυθµιστή του µονοπατιού [327]. Στη συνέχεια, υπάρχει µία οικογένεια µεταγραφικών παραγόντων που καθορίζεται από τον ΕΙΝ3, ο οποίος επάγει τη µεταγραφή των µεταγραφικών παραγόντων της οικογένειας ERF, γνωστής και ως οικογένεια EREBP, οι οποίοι ρυθµίζουν, θετικά ή αρνητικά την έκφραση των γονιδίων απόκρισης στο αιθυλένιο [328]. Σύµφωνα µε τα παραπάνω, πιστεύεται ότι οι υποδοχείς, απουσία του αιθυλενίου, ενεργοποιούν την CTR1, οι οποία καταστέλλει τη δράση των επόµενων στοιχείων του µονοπατιού, όπως ο ΕΙΝ2 και οι µεταγραφικοί παράγοντες EIN3/EIL. Αντίθετα, παρουσία αιθυλενίου, οι υποδοχείς δεν µπορούν να ενεργοποιήσουν την CTR1, οπότε ενεργοποιείται ο ΕΙΝ2 και στη συνέχεια οι EIN3/EIL, που µε τη σειρά τους επάγουν τη µεταγραφή των µεταγραφικών παραγόντων της οικογένειας ERF, οι οποίοι ρυθµίζουν την µεταγραφή των γονιδίων απόκρισης του φυτού στο αιθυλένιο [323]. Τα βασικά συστατικά και ο µηχανισµός του παραπάνω µονοπατιού είναι διατηρηµένα σε πολλά µονοκοτυλίδονα και δικοτυλίδονα φυτά [329,330]. 96

111 1.4.6 Μπρασσινοστεροειδή Στους ζωικούς οργανισµούς, οι στεροειδείς ορµόνες παίζουν σηµαντικό ρόλο στη ρύθµιση της µεταγραφής των γονιδίων, µέσω της πρόσδεσής τους στους πυρηνικούς υποδοχείς, ενώ επιδρούν και σε πολλές άλλες κυτταρικές λειτουργίες, οι οποίες ρυθµίζονται από τους µεµβρανικούς υποδοχείς τους. Τα φυτά επίσης χρησιµοποιούν στεροειδή για τη µεταβίβαση µηνυµάτων, τα οποία παρουσιάζουν πολλές οµοιότητες στη δοµή τους µε τις στεροειδείς ορµόνες των σπονδυλωτών και των εντόµων, αλλά και σηµαντικές διαφορές αναφορικά µε τη µεταγωγή του σήµατός τους [331]. Βρέθηκε ότι οργανικά εκχυλίσµατα της γύρης του Brassica napus επάγουν ισχυρά την κυτταρική επιµήκυνση και διαίρεση. Το ενεργό συστατικό του εκχυλίσµατος βρέθηκε πως ήταν ένα στεροειδές µε 28 άτοµα άνθρακα και ονοµάστηκε brassinolide. Μέχρι σήµερα έχουν ανακαλυφθεί πολλές παρόµοιες χηµικές ενώσεις σε µία ποικιλία φυτών που συνολικά ονοµάζονται µπρασσινοστεροειδή [332]. Τα µπρασσινοστεροειδή προκαλούν ποικίλες φυσιολογικές αποκρίσεις στα φυτά και θεωρούνται απαραίτητα σε πολλές αναπτυξιακές διαδικασίες, όπως η βλάστηση του σπόρου, η επιµήκυνση του βλαστού, η διαφοροποίηση του ξυλώµατος, η µορφολογία του φύλλου, η ανθεκτικότητα σε ασθένειες και η αντοχή σε καταπονήσεις [333,334]. Μεταλλάξεις που σχετίζονται µε τη βιοσύνθεση ή τη µεταγωγή σήµατος των µπρασσινοστεροειδών έχουν ως αποτέλεσµα µειωµένη ικανότητα βλάστησης, νανισµό, ανώµαλη µορφολογία των φύλλων, καθυστέρηση της ανάπτυξης αναπαραγωγικών οργάνων καθώς και άλλες αναπτυξιακές ατέλειες [331]. Παρόµοιος φαινότυπος προκαλείται από τον αναστολέα της βιοσύνθεσης των µπρασσινοστεροειδών, το brassinazole [335], ενώ υπερέκφραση των βιοσυνθετικών τους ενζύµων οδηγεί σε αυξηµένη ανάπτυξη του φυτού [336]. Έχει προταθεί ότι τα µπρασσινοστεροειδή συµβάλλουν στην κυτταρική επιµήκυνση επηρεάζοντας, µέσω γενωµικών και µη γενωµικών µονοπατιών, τις µηχανικές ιδιότητες του κυτταρικού τοιχώµατος. Η επίδρασή τους στην κυτταρική διαίρεση δεν είναι πλήρως γνωστή, αλλά η επαγωγή της έκφρασης του γονιδίου CycD3 από το brassinolide ίσως να αποτελεί στοιχείο ενός σχετικού µηχανισµού [337]. Η χρήση των µπρασσινοστεροειδών προκαλεί αύξηση της παραγωγής, ενώ η δράση τους είναι µεγαλύτερη όταν τα φυτά αναπτύσσονται σε συνθήκες καταπόνησης [332]. Τα µπρασσινοστεροειδή παράγονται από την 97

112 καµπεστερόλη, µία µεµβρανική στερόλη, µε µία σειρά αναγωγών, υδροξυλιώσεων, επιµερισµών και οξειδώσεων. Τα περισσότερα ένζυµα που συµµετέχουν στη βιοσύνθεση των µπρασσινο-στεροειδών έχουν κλωνοποιηθεί στο Arabidopsis, στο µπιζέλι και στη ντοµάτα [332,334]. Έχει βρεθεί ότι τα µπρασσινοειδή, σε αντίθεση µε τις στεροειδείς ορµόνες των ζωϊκών οργανισµών, η δράση των οποίων ρυθµίζεται από τους πυρηνικούς υποδοχείς [338], εισέρχονται στο κύτταρο µέσω ενός υποδοχέα που βρίσκεται στην κυτταρική µεµβράνη, του BRI1 [339]. Έχει προταθεί ότι ο BRI1 δεσµεύει τα µπρασσινοστεροειδή µέσω της εξωκυτταρικής του περιοχής και στη συνέχεια, µε τη βοήθεια της κυτταροπλασµατικής του περιοχής, ξεκινά τη µεταγωγή του σήµατος, φωσφορυλιώνοντας τα µετέπειτα στοιχεία του µονοπατιού [336,340]. Επιπλέον ο BRI1 αλληλεπιδρά in vivo µε τον BAK1, έναν όµοιο µε αυτόν υποδοχέα, γεγονός που οδήγησε στην υπόθεση ότι ο BAK πιθανόν να λειτουργεί ως συν-υποδοχέας του BRI1 [341]. Η δράση του υποδοχέα βρέθηκε πως αντιστρέφεται από τη φωσφατάση ΚΑΡΡ, η οποία βρέθηκε ότι αλληλεπιδρά µαζί της in vitro [342]. Πειράµατα µε µεταλλάξεις στο Arabidopsis οδήγησαν στην ανακάλυψη των υπόλοιπων στοιχείων του µονοπατιού των µπρασσσινοστεροειδών, των πρωτεϊνών BZR1 και BZR2/BES1, που ρυθµίζουν την έκφραση των γονιδίων απόκρισης και της BIN2, µίας κινάσης, που λειτουργεί ως αρνητικός ρυθµιστής του µονοπατιού. [ ]. Eχει προταθεί ένα µοντέλο αναφορικά µε την µεταγωγή σήµατος των µπρασσινοειδών σύµφωνα µε το οποίο, η ενεργοποίηση του συµπλόκου BRI1-BAK από την πρόδεση της ορµόνης, µέσω ενός αγνώστου ακόµη µηχανισµού, οδηγεί στην απενεργοποίηση της κινάσης BIN2, επιτρέποντας την συσσώρευση των BZR1 και BZR2/BES1, οι οποίες µε την σειρά τους ρυθµίζουν την έκφραση των γονιδίων-στόχων των µπρασσινοστεροειδών. Απουσία της ορµόνης, η BIN2 φωσφορυλιώνει τις BZR1 και BZR2/BES1, µε αποτέλεσµα την αποικοδόµησή τους και την αναστολή του µονοπατιού [331]. Αξίζει να σηµειωθεί ότι οµόλογα των BRI1 και BIN2 έχουν ταυτοποιηθεί και σε πολλούς άλλους φυτικούς οργανισµούς, όπως στο ρύζι, στο µπιζέλι, στη βρώµη και στη ντοµάτα [331,339]. 98

113 1.4.7 Ιασµονικό οξύ Το ιασµονικό οξύ είναι µία από τις πολλές πτητικές ουσίες που παράγονται στους φυτικούς ιστούς και είναι απαραίτητες στην «επικοινωνία» τους µε το περιβάλλον. Αρχικά ταυτοποιήθηκε στα άνθη του Jasminum grandiflorum και στη συνέχεια αποδείχθηκε ότι είναι ευρύτατα διαδεδοµένο στο φυτικό βασίλειο [346]. Το ιασµονικό οξύ και τα παράγωγά του αποτελούν σηµαντικούς ρυθµιστές της απόκρισης στα φυτά και εµπλέκονται σε πολλές αναπτυξιακές διαδικασίες, όπως η βλάστηση του σπόρου, η ανάπτυξη της ρίζας, η γονιµότητα, η ωρίµανση των καρπών και η γήρανση. Επιπλέον βρέθηκε πως επάγουν τους διάφορους µηχανισµούς άµυνας κατά την προσβολή των φυτών από έντοµα και παθογόνους µικροοργανισµούς καθώς σε περιβαλλοντικές καταπονήσεις, όπως η ξηρασία, η αλατότητα και οι χαµηλές θερµοκρασίες [347]. Το ιασµονικό οξύ σχηµατίζεται στα φυτά µέσω του µονοπατιού σύνθεσης των οκταδεκανοϊδών και στη συνέχεια, µέσω τροποποιήσεών του, όπως υδροξυλίωση, γλυκοσυλίωση κ.α. σχηµατίζει τα διάφορα παράγωγά του, σηµαντικότερο των οποίων είναι το µέθυλο-ιασµονικό οξύ (MeJA), η σύνθεση του οποίου καταλύεται από την µεθυλοτρανσφεράση του ιασµονικού οξέος (JMT) και αποτελεί την πτητική µορφή του ιασµονικού οξέος. Οι χλωροπλάστες και τα περοξεισωµατια θεωρούνται τα κύρια κέντρα βιοσύνθεσης του ιασµονικού οξέος, δεδοµένου ότι εκεί έχουν βρεθεί τα απαραίτητα ένζυµα για τα πρώτα στάδια της σύνθεσής του. Βρέθηκε ότι το γονίδιο που κωδικοποιεί την JMT εκφράζεται στο αναπτυσσόµενο άνθος και η έκφρασή του επάγεται, τόσο τοπικά, όσο και συστηµικά, από τραυµατισµούς του φυτού καθώς και από την επίδραση µεθυλο-ιασµονικού οξέος [348]. Το ιασµονικό οξύ επάγει την έκφραση γονιδίων που εµπλέκονται στη βιοσύνθεσή του, τον δευτερογενή µεταβολισµό του κυττάρου, τον σχηµατισµό του κυτταρικού τοιχώµατος και στους αµυντικούς µηχανισµούς του φυτού, ενώ αναστέλλει την έκφραση των γονιδίων που σχετίζονται µε την φωτοσύνθεση [346]. Πειράµατα µε µεταλλάξεις στο Arabidopsis οδήγησαν στην ανακάλυψη του γονιδίου COI1, το οποίο είναι απαραίτητο για την ανάπτυξη της γύρης και για την άµυνα του φυτού κατά την προσβολή από έντοµα και παθογόνα. Με βάση τη δοµή του, έχει προταθεί ότι το COI1 αποτελεί συστατικό ενός συµπλόκου υπεύθυνου για την πρόσδεση της ουβικουιτίνης και την µετέπειτα αποικοδόµηση ενός ανασταλτικού παράγοντα του µονοπατιού, πιθανόν µίας 99

114 απακετυλάσης των ιστονών, µε αποτέλεσµα την ενεργοποίηση της µεταγραφής των επαγόµενων από το ιασµονικό οξύ γονιδίων. Άλλες µελέτες έδειξαν ότι η µεταγωγή σήµατος του ιασµονικού οξέος πιθανόν να περιλαµβάνει ένα ή περισσότερα στάδια φωσφορυλίωσης των διαφόρων παραγόντων [349]. Επιπλέον, η δράση της κινάσης MPK4, µίας κινάσης τύπου MAP στο Arabidopsis, είναι απαραίτητη για την έκφραση των γονιδίων απόκρισης [350]. Έχουν ταυτοποιηθεί πολλές αλληλουχίες απόκρισης στους προαγωγείς των γονιδίων που επάγονται από το ιασµονικό οξύ, όπως το στοιχείο JERE στο Catharanthus roseus, µε το οποίο αλληλεπιδρούν οι µεταγραφικοί παράγοντες ORCA2 και ORCA3. Οι παραπάνω παράγοντες ανήκουν στην οικογένεια µεταγραφικών παραγόντων ERF, µέλη της οποίας συµµετέχουν σε πολλές αποκρίσεις των φυτών, όπως π.χ. στο αιθυλένιο, στην ξηρασία και στο ψύχος [351]. Πρόσφατα βρέθηκε ότι ο µεταγραφικός παράγοντας ERF1 ρυθµίζει την έκφραση ενός µεγάλου αριθµού γονιδίων απόκρισης, τόσο του αιθυλενίου, όσο και του ιασµονικού οξέος, γεγονός που υποδηλώνει τη συνεργιστική δράση των δύο αυτών φυτοορµονών στην επαγωγή των µηχανισµών άµυνας του φυτού [352]. εδοµένης της αέριας φύσης του, που διευκολύνει την διάχυσή του στα διάφορα µέρη του φυτού, το µεθυλο-ιασµονικό οξύ θεωρείται πιθανό να συµµετέχει στη συστηµική µεταγωγή µηνυµάτων στα φυτά. Επιπλέον, µπορεί να µετακινείται και µέσω του φλοιώµατος, ενώ αντίθετα, το απλό ιασµονικό οξύ, λόγω της όξινης φύσης του, πιθανόν να απαιτεί την ύπαρξη πρωτεϊνης-µεταφορέα [353]. Έχει προταθεί ότι ορισµένα µηνύµατα κατά τα αρχικά στάδια διαφόρων αναπτυξιακών διαδικασιών ή/και αµυντικών αποκρίσεων, επάγουν την έκφραση της JMT και τον µετέπειτα σχηµατισµό του µεθυλο-ιασµονικού οξέος, το οποίο στη συνέχεια διαχέεται στα γειτονικά κύτταρα και ενεργοποιεί την έκφραση του ίδιου γονιδίου, πολλαπλασιάζοντας, στο επίπεδο ολόκληρου του φυτού, τις ρυθµιζόµενες από αυτό αποκρίσεις [346]. 100

115 1.4.8 Πεπτίδια Εκτός από τις φυτοορµόνες,, τα φυτά χρησιµοποιούν ορισµένα πεπτίδια για την µεταγωγή µηνυµάτων, που µε τη σειρά τους, επηρεάζουν τις διάφορες αναπτυξιακές διαδικασίες. Τα πεπτίδια, που στους ζωϊκούς οργανισµούς είναι τα πλέον χρησιµοποιούµενα µέσα για την µετάδοση µηνυµάτων εξαιτίας της µεγάλης ποικιλίας στο µέγεθος και στην αλληλουχία τους, ανακαλύφθηκαν στα φυτά την τελευταία δεκαετία [354]. Τα κυριότερα πεπτίδια που έχουν βρεθεί στα φυτά µέχρι σήµερα είναι η συστεµίνη, που εµπλέκεται στην µεταγραφική ενεργοποίηση γονιδίων σχετικών µε τους αµυντικούς µηχανισµούς των φυτών, η φυτοσουλφοκίνη, που επάγει τις κυτταρικές διαιρέσεις, το πεπτίδιο που κωδικοποιεί το γονίδιο CLAVATA, που παίζει ρόλο στη ρύθµιση της άυξησης των µεριστωµάτων και το προϊόν του γονιδίου SP11/SCR, που ελέγχει την αυτοασυµβατότητα κατά την γονιµοποίηση [355]. Η συστεµίνη αποτελείται από 18 αµινοξέα, αποµονώθηκε από τραυµατισµένα φύλλα ντοµάτας και βρέθηκε πως επάγει την έκφραση των γονιδίων που κωδικοποιούν τους αναστολείς των πρωτεασών. Η συστεµίνη µετακινείται µέσω του φλοιώµατος σε µεγάλες αποστάσεις από την περιοχή της προσβολής ή του τραύµατος µέσα στο φυτό. Η συστεµίνη προέρχεται από το καρβοξυτελικό άκρο της προσυστεµίνης, ενός πεπτιδίου 200 αµινοξέων, οµόλογα του οποίου έχουν ταυτοποιηθεί σε πολλά φυτά, όπως η πατάτα και ο καπνός [356]. Η φυτοσουλφοκίνη είναι ένα µικρό πεπτίδιο αποτελούµενο από πέντε µόνο αµινοξέα και βρέθηκε πως προάγει, σε µικρές συγκεντρώσεις, τις κυτταρικές διαιρέσεις στα φυτικά κύτταρα, καθώς και άλλες διαδικασίες όπως τη διαφοροποίηση των αποταµιευτικών ιστών. Αρχικά αποµονώθηκε από καλλιέργειες κυττάρων µεσόφυλλου σπαραγγιού όπου λειτουργούσε ως αυξητικός παράγοντας και στη συνέχεια ανιχνεύτηκε στο θρεπτικό µέσο τουλάχιστον 12 κυτταρικών σειρών, δικότυλων και µονοκότυλων φυτών. Η φυτοσουλφοκίνη, η οποία συναντάται σε δύο ισοµορφές (PSK-α και PSK-β) που αποτελούνται από πέντε και τέσσερα αµινοξέα αντίστοιχα, προέρχεται από το αµινοτελικό άκρο ενός πεπτιδίου 89 αµινοξέων και έχει σουλφοριωµένες τις τυροσίνες που βρίσκονται στις θέσεις 1 και 3 [357]. Ο σχηµατισµός των διαφόρων φυτικών οργάνων εξαρτάται από τη σωστή λειτουργία των µεριστωµάτων, η οποία απαιτεί µία ισορροπία µεταξύ κυτταρικών διαιρέσεων και διαφοροποίησης. Η ισορροπία αυτή ελέγχεται 101

116 από τα προϊόντα των γονιδίων CLAVATA (CLV1, CLV2 και CLV3), µεταλλάξεις των οποίων στο Arabidopsis προκαλούν αύξηση των κυτταροδιαιρέσεων και σταδιακή διόγκωση των µεριστωµάτων. Το CLV1 κωδικοποιεί µία διαµεµβρανική πρωτεϊνη, η εσωκυτταρική περιοχή της οποίας λειτουργεί ως κινάση σερίνης. Το γονίδιο CLV2 κωδικοποιεί µία παρόµοια πρωτεϊνη η οποία ετεροδιµερίζεται µε την CLV1. Στο σύµπλοκο αυτό προσδένονται η φωσφατάση ΚΑΡΡ, η οποία αποτελεί αρνητικό ρυθµιστή του µονοπατιού, παρουσία της CLV3 [358]. Έχει προταθεί ότι το CLV3 εκκρίνεται από τα εξωτερικά κύτταρα του µεριστώµατος και αλληλεπιδρά µε το σύµπλοκο CLV1- CLV2, µε σχέση συνδέτη-υποδοχέα [359], σε κύτταρα που βρίσκονται στο εσωτερικό του µεριστώµατος, µε τελικό αποτέλεσµα τη ρύθµιση των κυτταροδιαιρέσεων σ αυτό [355,356]. Ο κυριότερος µηχανισµός µε τον οποίο παρεµποδίζεται η αυτογονιµοποίηση στα φυτά είναι η ασυµβατότητα της γύρης µε το στίγµα του ίδιου φυτού. Η γύρη ενός φυτού αναγνωρίζεται από το στίγµα των ανθέων του εξαιτίας µοριακών αλληλεπιδράσεων των καθοριστών που κωδικοποιούνται από τον γονιδιακό τόπο S και συγκεκριµένα από τα γονίδια SRK και SP11/SCR [355]. Το προϊόν του πρώτου είναι µία διαµεµβρανική πρωτεϊνη που η κυτταροπλασµατική της περιοχή έχει δράση υποδοχέα κινάσης, ενώ το δεύτερο κωδικοποιεί πολύµορφα πεπτίδια, που περιέχουν µία ποικιλόµορφη και υδρόφιλη καρβοξυτελική περιοχή [360]. Το γονίδιο SP11/SCR εκφράζεται στα µικροσπόρια και πιθανόν να αποτελεί τον καθοριστικό παράγοντα που εκκρίνεται από τους γυρεοκόκκους και αλληλεπιδρά µε τον SRK, που πιθανόν να παίζει τον ρόλο του υποδοχέα και εκφραζεται στο στίγµα. Η πρόσδεση αυτή είναι εξειδικευµένη και οδηγεί σε αυτοφωσφορυλίωση και ενεργοποίηση του υποδοχέα και στην µεταγωγή του µηνύµατος [361]. 102

117 1.5. ΤΟ ΡΙΖΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ Η ρίζα αποτελεί το κατώτερο τµήµα του φυτικού άξονα. Είναι το υπόγειο όργανο µε το οποίο τα φυτά εδράζονται στο έδαφος και προσλαµβάνουν από αυτό νερό και θρεπτικά στοιχεία. Χαρακτηριστικό της ρίζας είναι η αύξηση προς την κατεύθυνση του ακραίου µεριστώµατος η θετική απόκριση στον γεωτροπισµό, δηλαδή η ανάπτυξή της προς την κατεύθυνση της βαρύτητας. Οι σηµαντικότερες λειτουργίες που επιτελεί το ριζικό σύστηµα των φυτών είναι η στήριξη του φυτού στο έδαφος και η πρόσληψη νερού και θρεπτικών στοιχείων από αυτό. Για την επίτευξη των παραπάνω λειτουργικών απαιτήσεων του φυτού, είναι απαραίτητη προϋπόθεση η κατάλληλη, για κάθε περίπτωση, διαµόρφωση του ριζικού συστήµατος, η οποία καθορίζεται αφ ενός από ένα ενδογενές γενετικό πρόγραµµα, αφ ετέρου από εξωγενείς παράγοντες προερχόµενους από το βιοτικό ή/και αβιοτικό περιβάλλον της ρίζας. Η δοµή και η µορφολογία της ρίζας εµφανίζει αξιόλογη παραλλακτικότητα και πιστεύεται πως κάθε τύπος ρίζας συνεπάγεται και αντίστοιχο λειτουργικό ρόλο. Με βάση τη προέλευσή τους, οι ρίζες διακρίνονται σε πρωτογενείς, οι οποίες προέρχονται από την ανάπτυξη του ριζιδίου του εµβρύου και σε επιγενείς, οι οποίες αναπτύσσονται από το κατώτερο τµήµα του βλαστού. Η ανάπτυξη της ρίζας διαφέρει µεταξύ των δικοτυλίδονων και µονοκοτυλίδονων φυτών. Στα δικοτυλίδονα φυτά, η κύρια ρίζα αναπτύσσεται κατακόρυφα µέσα στο έδαφος και διακλαδίζεται µέσω του σχηµατισµού πλευρικών ριζών, δηµιουργώντας ένα πασσαλώδες ριζικό σύστηµα. Αντίθετα, στα µονοκοτυλίδονα φυτά, κύρια ρίζα είναι σηµαντική µόνο στα πρώτα στάδια της ανάπτυξης του φυτού, ενώ στη συνέχεια αναπτύσσονται πολλές επιγενείς ρίζες από το βλαστό, οι οποίες αποτελούν το κύριο τµήµα ενός θυσανώδους ριζικού συστήµατος. Το µέγεθος του ριζικού συστήµατος ενός φυτού είναι συνάρτηση πολλών παραγόντων, µε κυριότερους την υγρασία και τη σύσταση του εδάφους. Σε ένα νεαρό φυτό η επιφάνεια του ριζικού συστήµατος είναι πολύ µεγαλύτερη από αυτή του υπέργειου τµήµατος, καθώς όµως το φυτό αναπτύσσεται, επιτυγχάνεται µία ισορροπία µεταξύ των δύο τµηµάτων[362,363]. 103

118 1.5.1 Ανατοµία, µορφολογία και ανάπτυξη της ρίζας Παραδοσιακά, η κατά µήκος δοµή της ρίζας διακρίνεται σε αναπτυξιακές ζώνες, οι οποίες καθορίζονται από τα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά των κυττάρων που τις αποτελούν. Με βάση το είδος, την φυσιολογική κατάσταση και τη λειτουργία των κυττάρων κατά µήκος της ρίζας, από την άκρη προς τη βάση, διακρίνονται η καλύπτρα, η µεριστωµατική ζώνη, η ζώνη επιµήκυνσης και η ζώνη διαφοροποίησης. Αξίζει να σηµειωθεί ότι οι παραπάνω αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας δεν είναι αυστηρά διαχωρισµένες µεταξύ τους, αλλά τις περισσότερες φορές υπάρχει µερική επικάλυψη µεταξύ δύο διαδοχικών ζωνών [364]. Εικόνα Σχηµατική απεικόνιση των αναπτυξιακών ζωνών της ρίζας και των κυριότερων ιστολογικών περιοχών της [The developmental zones of plant root and their main tissues] 104

119 Η καλύπτρα αποτελείται από µία µάζα παρεγχυµατικών κυττάρων και ο ρόλος της είναι να προστατεύει το µερίστωµα της ρίζας. Επιπλέον, τα περιφερειακά της κύτταρα εκκρίνουν µία βλεννώδη ουσία, η οποία λειτουργεί ως λιπαντικό µέσο που διευκολύνει τη διείσδυση της ρίζας στο έδαφος. Καθώς η ρίζα αναπτύσσεται, τα περιφερειακά κύτταρα της καλύπτρας καταστρέφονται και αντικαθίστανται από άλλα, προερχόµενα από το µερίστωµα. Επίσης, έχει βρεθεί ότι η καλύπτρα παίζει ρόλο στον γεωτροπισµό της ρίζας, δηλαδή την ανταπόκριση και ανάπτυξη της ρίζας προς τη κατεύθυνση της βαρύτητας. Το µερίστωµα της ρίζας αποτελείται από σχετικά µικρά ταχυδιαιρούµενα κύτταρα, µε πυκνό κυτταρόπλασµα και µεγάλους πυρήνες. Τα συνεχώς διαιρούµενα κύτταρα του µεριστώµατος της ρίζας παράγουν ακροπετελικά την καλύπτρα και βασιπεταλικά τους πρόδροµους ιστούς του στύλου, του φλοιού και της επιδερµίδας [365]. Εκτός από τον υψηλό ρυθµό κυτταρικών διαιρέσεων, ένα επιπλέον χαρακτηριστικό της µεριστωµατικής ζώνης είναι η διάταξη των κυττάρων σε κατακόρυφες σειρές. Η εξωτερική σειρά κυττάρων αποτελεί το πρωτόδερµα και σχηµατίζει την µετέπειτα επιδερµίδα, οι περιφερειακές σειρές αποτελούν το θεµελιώδες µερίστωµα και σχηµατίζουν τον φλοιό και οι κεντρικές σειρές αποτελούν τις προκαµβιακές ζώνες, που σχηµατίζουν τον κεντρικό κύλινδρο. Τα µεριστώµατα της ρίζας, µε βάση την οργάνωση των κυττάρων, διακρίνονται σε δύο κατηγορίες, τα µεριστώµατα κλειστού τύπου και τα µεριστώµατα ανοικτού τύπου. Χαρακτηριστικό της πρώτης περίπτωσης είναι ότι τόσο η καλύπτρα, όσο και οι ζώνες των µητρικών κυττάρων απ όπου προέρχονται οι διάφοροι ιστοί είναι σαφώς ευδιάκριτες. Επιπλέον, είναι διακριτή και µία οµάδα κεντρικών κυττάρων, τα οποία λειτουργούν ως προµερίστωµα και από τα οποία παράγονται τα κύτταρα των παραπάνω ζωνών. Στη δεύτερη περίπτωση, τόσο τα κύτταρα, όσο και οι µετέπειτα ιστοί προέρχονται από µία κοινή οµάδα αρχικών κυττάρων. Στο κέντρο της µεριστωµατικής ζώνης υπάρχει µία περιοχή, το κέντρο ηρεµίας, όπου ο ρυθµός των κυτταρικών διαιρέσεων µειώνεται στο ελάχιστο. Πιστεύεται πως ο ρόλος των κυττάρων αυτών είναι να διατηρούν την µεριστωµατική κατάσταση των γειτονικών τους κυττάρων, αποτρέποντας την διαφοροποίησή τους [366]. Η ζώνη επιµήκυνσης αποτελεί τη συνέχεια της µεριστωµατικής ζώνης, χωρίς όµως να είναι επακριβώς οριοθετηµένη από αυτή. Για παράδειγµα, υψηλός ρυθµός κυτταροδιαιρέσεων παρατηρείται και στο κατώτερο τµήµα της ζώνης επιµήκυνσης [364]. Παρόλα αυτά, το κυριότερο χαρακτηριστικό τη ζώνης αυτής είναι η 105

120 επιµήκυνση των κυττάρων, γεγονός στο οποίο οφείλεται η κατά µήκος αύξηση της ρίζας. Ουσιαστικά, η αύξηση της ρίζας οφείλεται στην επιµήκυνση ενός µικρού τµήµατός της, το οποίο την ωθεί συνεχώς µέσα στο έδαφος. Στη ζώνη διαφοροποίησης ο ρυθµός των κυτταροδιαιρέσεων µειώνεται στο ελάχιστο και τα κύτταρα αποκτούν τα απαραίτητα χαρακτηριστικά ώστε να σχηµατίσουν τους διάφορους ιστούς. Χαρακτηριστικό της γνώρισµα είναι η παρουσία των ριζικών τριχιδίων, µε τα οποία γίνεται η πρόσληψη νερού και θρεπτικών στοιχείων από το έδαφος. Σε µία εγκάρσια τοµή της ρίζας στη ζώνη διαφοποποίησης, διακρίνονται τρείς ιστολογικές περιοχές. Εξωτερικά υπάρχει η επιδερµίδα, κάτω από αυτή βρίσκεται ο φλοιός, ο οποίος αποτελείται από παρεγχυµατικά κύτταρα και εσωτερικά του φλοιού υπάρχει ο κεντρικό κύλινδρος, όπου βρίσκεται ο αγωγός ιστός. Σε αντίθεση µε τον βλαστό, ο κεντρικός κύλινδρος της ρίζας περιβάλλεται από δύο οµόκεντρους κυτταρικούς δακτυλίους, οι οποίοι τον διαχωρίζουν από τον φλοιό. Ο εξωτερικός δακτύλιος είναι η ενδοδερµίδα, η οποία αποτελεί το εσωτερικό όριο του φλοιού και ο εσωτερικός είναι το περικύκλιο, που αποτελεί το εξωτερικό όριο του κεντρικού κυλίνδρου [365,367] (Εικόνα 1.5.2). Εικόνα Εγκάρσια τοµή της ρίζας µονοκοτυλίδονου φυτού στην περιοχή της ζώνης διαφοροποίησης. [Transversal section of differentiation zone of a monocot s root] 106

121 Η επιδερµίδα της ρίζας αποτελείται συνήθως από ένα στρώµα κυττάρων στενά συνδεδεµένων µεταξύ τους. Χαρακτηριστικό γνώρισµα της επιδερµίδας είναι ο σχηµατισµός των ριζικών τριχιδίων, τα οποία είναι προεκβολές των επιδερµικών κυττάρων που αυξάνουν σε µεγάλο βαθµό την απορροφητική επιφάνεια της ρίζας. Ο σχηµατισµός ενός ριζικού τριχιδίου αρχίζει µε µία ασύµµετρη διαίρεση ενός επιδερµικού κυττάρου από την οποία προκύπτει ένα µεγάλο κύτταρο, ο ατριχοβλάστης και ένα µικρότερο, ο τριχοβλάστης, ο οποίος θα εξελιχθεί σε τριχίδιο. Κατά την ανάπτυξη του τριχιδίου, ο πυρήνας µεταναστεύει στην περιοχή της προεκβολής, όπου και παρατηρούνται υψηλοί ρυθµοί, αντιγραφής, µεταγραφής και πρωτεϊνοσύνθεσης σε σχέση µε τα γειτονικά κύτταρα του τριχοβλάστη. Σχετικά µε τη θέση σχηµατισµού των ριζικών τριχιδίων έχει προταθεί ότι πιθανόν αυτή να καθορίζεται από µηνύµατα που προέρχονται από τα υποκείµενα κύτταρα του φλοιού, ενώ πιστεύεται ότι το πρώτο στάδιο της µετατροπής ενός επιδερµικού κυττάρου σε ριζικό τριχίδιο περιλαµβάνει και την διακοπή της συµπλαστικής επικοινωνίας του µε τα γειτονικά του κύτταρα [368]. Ο φλοιός αποτελείται από λεπτότοιχα, παρεγχυµατικά κύτταρα, ο ρόλος των οποίων συνήθως είναι η αποταµίευση αµύλου και άλλων θρεπτικών ουσιών. Επιπλέον, σε φυτά που δεν εµφανίζουν δευτερογενή αύξηση της ρίζας, όπως τα µονοκοτυλίδονα, σχηµατίζονται στον φλοιό πολλές σκληρεγχυµατικές ίνες, που βοηθούν στην στηρικτική λειτουργία της ρίζας. Τα κύτταρα του φλοιού συνδέονται µεταξύ τους µε πολλές πλασµοδέσµες, οι οποίες διευκολύνουν την κίνηση του νερού και των θρεπτικών στοιχείων από τα ριζικά τριχίδια προς τα αγγεία. Το εσωτερικό όριο του φλοιού, ακριβώς πάνω από τον κεντρικό κύλινδρο, είναι η ενδοδερµίδα, τα κύτταρα της οποίας περιβάλλονται από την ταινία caspary. Η ταινία caspary σχηµατίζεται από τη συσσώρευση της σουβερίνης, µίας λιπόφιλης ουσίας και ο ρόλος της είναι να αποτρέπει την κίνηση του εισερχόµενου νερού µέσω των κυτταρικών τοιχωµάτων και το εξαναγκάζει να περάσει από το κυτταρόπλασµα, όπου υφίσταται ένα είδος «ελέγχου». Ένα αντίστοιχο ιστολογικό στρώµα, η εξωδερµίδα, σχηµατίζεται συνήθως κάτω από την επιδερµίδα της ρίζας. Τα κύτταρα της εξωδερµίδας επίσης περιβάλλονται από ταινία caspary και παίζουν παρόµοιο ρόλο µε αυτά της ενδοδερµίδας στον «έλεγχο» του εισερχόµενου νερού. Κάτω από τον φλοιό βρίσκεται ο κεντρικός κύλινδρος, ο οποίος περιέχει τα αγωγά στοιχεία της ρίζας, δηλαδή τα αγγεία, µέσω των οποίων το νερό και τα θρεπτικά στοιχεία µεταφέρονται στα υπόλοιπα µέρη του 107

122 φυτού και τους ηθµοσωλήνες, που µεταφέρουν τα προϊόντα της φωτοσύνθεσης από τα υπέργεια µέρη του φυτού στο ριζικό σύστηµα. Ανάλογα µε τη διάταξη των αγωγών στοιχείων, οι ρίζες διακρίνονται σε διαρχικές και τριαρχικές, που συναντώνται στα συνήθως στα δικοτυλίδονα φυτά ή πολυαρχικές, όπως είναι οι ρίζες των περισσότερων µονοκοτυλίδονων [365]. Στο εσωτερικό του κεντρικού κυλίνδρου υπάρχει η εντεριώνη, που αποτελείται από αποταµιευτικά, παρεγχυµατικά κύτταρα. Το εξωτερικό όριο του κεντρικού κυλίνδρου είναι το περικύκλιο, το οποίο στα δικοτυλίδονα φυτά αποτελείται συνήθως από ένα στρώµα κυττάρων, ενώ στα µονοκοτυλίδονα είναι πολύστρωµο. Το περικύκλιο αποτελείται από παρεγχυµατικά κύτταρα τα οποία όµως διατηρούν τις µεριστωµατικές τους ιδιότητες. Ο ρόλος του περικυκλίου είναι αφ ενός ο σχηµατισµός του καµβιακού δακτυλίου στα φυτά που υφίστανται δευτερογενή αύξηση και αφ ετέρου ο σχηµατισµός των πλευρικών ριζών [369]. Ο σχηµατισµός των πλευρικών ριζών αρχίζει µε επανειληµµένες διαιρέσεις των κυττάρων του περικυκλίου, οι οποίες δηµιουργούν µία προεκβολή που καθώς αναπτύσσεται, µετατοπίζει τα διαδοχικά στρώµατα των κυττάρων του φλοιού. Σε πολλά φυτά η ανάπτυξη των πλευρικών ριζών συνοδεύεται και από διαιρέσεις των κυττάρων της ενδοδερµίδας, µε αποτέλεσµα την αύξηση της επιφάνειάς της. Όταν η πλευρική ρίζα αναδύεται από την κύρια ρίζα, είναι ήδη διαµορφωµένα η καλύπτρα, το µερίστωµα και οι πρωτογενείς της ιστοί, ενώ µέσω της διαφοροποίησης ορισµένων παρεγχυµατικών κυττάρων, η ενδοδερµίδα της συνδέεται µε αυτή της κύριας ρίζας. Αρχικά, οι κεντρικοί κύλινδροι της κύριας και της πλευρικής ρίζας είναι ανεξάρτητοι και συνδέονται αργότερα, µέσω της διαφοροποίησης ορισµένων παρεγχυµατικών κυττάρων σε αγγεία και ηθµοσωλήνες [370]. Τα σηµεία του περικυκλίου όπου θα σχηµατιστούν οι πλευρικές ρίζες προσδιορίζονται σε σχέση µε τους πόλους των αγωγών στοιχείων της κύριας ρίζας, ενώ σε ό,τι αφορά την κατακόρυφη κατεύθυνση, σχηµατίζονται σε επίπεδα κατά µήκος της κύριας ρίζας, σε καθένα από τα οποία υπάρχουν δύο ή περισσότερες πλευρικές ρίζες, ανάλογα µε τη διαµόρφωση του εδάφους που περιβάλλει τη ρίζα. Aδιευκρίνιστες παραµένουν ακόµη οι µεταβολές που σχετίζονται µε το βαθµό διαφοροποίησης των κυττάρων του περικυκλίου κατά το σχηµατισµό των πλευρικών ριζών [371,372]. Τέλος, αξίζει να σηµειωθεί πως η παραδοσιακή αυτή περιγραφή της δοµής της ρίζας, παρόλο που είναι πολύ χρήσιµη για την κατανόηση της ανατοµίας και της µορφολογίας της, αδυνατεί εν 108

123 µέρει να αποτυπώσει τη δυναµική κατάσταση που επικρατεί κατά το σχηµατισµό και την ανάπτυξη της ρίζας στο χώρο και στο χρόνο και τις ακριβείς µεταβολές στη θέση και στη φυσιολογική κατάσταση των κυττάρων σε κάθε περίπτωση, οι οποίες εξαρτώνται από ένα δίκτυο αλληλεπιδρώντων αναπτυξιακών µηνυµάτων και σχετίζονται µε συγκεκριµένα πρότυπα γονιδιακής έκφρασης [373]. Εικόνα Σχηµατική απεικόνιση της τρισδιάστατης δοµής της ρίζας. ιακρίνονται οι αναπτυξιακές ζώνες και οι κυριότερες ιστολογικές περιοχές [The three-dimensional structure of the root. The developmental zones and the main tissues are indicated] 109

124 1.5.2 Φυτοορµόνες και ανάπτυξη της ρίζας Όπως έχει ήδη αναφερθεί, η ανάπτυξη του ριζικού συστήµατος ενός φυτού εξαρτάται αφ ενός από το γενετικό του πρόγραµµα και αφ ετέρου από εξωγενείς παράγοντες, όπως είναι η σύσταση και η υγρασία του εδάφους στο οποίο αναπτύσσεται. Επιπλέον, σηµαντικό ρυθµιστικό ρόλο επιτελούν οι φυτοορµόνες, οι οποίες άλλωστε σχετίζονται και µε πολλές άλλες αναπτυξιακές διαδικασίες των φυτών, όπως η κυριαρχία της κορυφής, η επιµήκυνση του βλαστού, η ανθοφορία, η γήρανση κ.α. Έχει βρεθεί ότι οι διάφορες φυτοορµόνες συµµετέχουν στη ρύθµιση των κυτταροδιαιρέσεων στο µερίστωµα, της κυτταρικής επιµήκυνσης, της διαφοροποίησης των κυττάρων της ρίζας και του σχηµατισµού των πλευρικών ριζών [365]. Μελέτες του µεταλλάγµατος stp1 έδειξαν ότι η επιµήκυνση των κυττάρων της ρίζας επάγεται από την πρωτεϊνη STP, η οποία ρυθµίζεται αρνητικά από τη δράση των κυτοκινινών. Συνεπώς, οι κυτοκινίνες µπορούν να θεωρηθούν αρνητικοί ρυθµιστές της κυτταρικής επιµήκυνσης [374]. Από την άλλη, αναστολή της βιοσύνθεσης του αιθυλενίου έχει ως αποτέλεσµα µειωµένη κατά πλάτος αύξηση των κυττάρων, γεγονός που σχετίζει την συγκεκριµένη ορµόνη µε την παραπάνω διαδικασία. Επιπλέον, έχει προταθεί ότι η πρωτεϊνη SAB δρα ανταγωνιστικά προς το αιθυλένιο κατά την κυτταρική επιµήκυνση [375]. Ήδη από τη δεκαετία του 50 είναι γνωστός ο ρόλος της αυξίνης στη διαφοροποίηση των αγωγών στοιχείων της ρίζας [376]. Μελέτη της ανάπτυξης µεριστωµάτων σε θρεπτικό µέσο παρουσία ή απουσία αυξίνης έδειξε ότι η αυξίνη προκαλεί αύξηση της διαµέτρου της αναγεννόµενης ρίζας και σχηµατισµό µεγαλύτερου κεντρικού κυλίνδρου, που περιέχει περισσότερες ηθµαγγειώδεις δεσµίδες. Με βάση τις παραπάνω παρατηρήσεις έχει προταθεί πως κατά την ανάπτυξη της ρίζας, η ενδογενής αυξίνη καθορίζει το πρότυπο του αγωγού ιστού, ρυθµίζοντας τη συχνότητα και τον προσανατολισµό των κυτταροδιαιρέσεων στο µερίστωµα [365]. Παρόµοια πειράµατα έδειξαν πως η αυξίνη εκτός από την επαγωγή του σχηµατισµού των αγωγών στοιχείων, ρυθµίζει αρνητικά την αύξηση του µεγέθους των κυττάρων. Επιπλέον, βρέθηκε ότι η αυξίνη επάγει τη διαφοροποίηση των παρεγχυµατικών κυττάρων του φλοιού προς το σχηµατισµό αγγείων [377]. Πιστεύεται πως το µήνυµα για την δηµιουργία του ξυλώµατος στη ρίζα προέρχεται από το βλαστό, µέσω της βασιπεταλικής µεταφοράς της αυξίνης και το ξύλωµα σχηµατίζεται κατά µήκος της «διαδροµής» της αυξίνης [365]. 110

125 Σε ό,τι αφορά τον σχηµατισµό των ριζικών τριχιδίων, πειράµατα µε µεταλλάξεις έδειξαν ότι τα πρώτα στάδια της διαδικασίας αυτής ελέγχονται από τα γονίδια TTG και GL2, ενώ στη συνέχεια η αύξηση του τριχιδίου ρυθµίζεται από τις αλληλεπιδράσεις των φυτοορµονών, µε κυριότερες την αυξίνη και το αιθυλένιο [378]. Το αιθυλένιο βρέθηκε πως είναι θετικός ρυθµιστής του σχηµατισµού ριζικών τριχιδίων, δεδοµένου ότι αύξηση της συγκέντρωσής του ή αναστολή της βιοσύνθεσής του προκαλούν αντίστοιχα επαγωγή ή αναστολή της ανάπτυξης τριχιδίων [379]. εδοµένου ότι το αιθυλένιο είναι µία ευδιάχυτη ορµόνη, έχει προταθεί πως το πρότυπο σχηµατισµού των ριζικών τριχιδίων είναι εξαρτάται από τη θέση των κυττάρων, που έχει ως αποτέλεσµα την διαφορετική έκθεσή τους στο αιθυλένιο [365]. Τέλος, µελέτες σε πολλά φυτά έδειξαν ότι η επίδραση εξωγενούς αυξίνης επάγει το σχηµατισµό πλευρικών ριζών [ ]. Η επίδραση της αυξίνης στην παραπάνω διαδικασία βρέθηκε πως ρυθµίζεται από παράγοντες προερχόµενους από τη βάση της ρίζας καθώς και από το φως [1095]. Πειράµατα µε µεταλλάξεις έδειξαν πως η αυξίνη εµπλέκεται στην επαγωγή των διαιρέσεων των κυττάρων του περικυκλίου και τη συνέχισή των διαιρέσεων αυτών κατά την ανάπτυξη της πλευρικής ρίζας [383]. Με βάση τα παραπάνω είναι προφανές πως οι φυτοορµόνες παίζουν σηµαντικό ρόλο σε όλες τις διαδικασίες που συντελούνται στη ρίζα, ρυθµίζοντας µε ποικίλους τρόπους κάθε πτυχή της ανάπτυξης και της διαφοροποίησής της. Επηρεάζοντας τις λειτουργίες των κυττάρων, οι φυτοορµόνες καθορίζουν την αύξηση της ρίζας, την διαφοροποίηση των αγωγών στοιχείων, το σχηµατισµό πλευρικών ριζών και ριζικών τριχιδίων. Η επίδραση των φυτοορµονών στη ρίζα, σε συνδιασµό µε τις επιδράσεις τους στα υπέργεια όργανα του φυτού, τις καθιστούν τους κυριότερους µορφογενετικούς παράγοντες κατά την ανάπτυξη των φυτών. 111

126 1.5.3 Το ριζικό σύστηµα του καλαµποκιού Το καλαµπόκι ανήκει στην οικογένεια Poaceae, παλιότερα γνωστή ως οικογένεια Gramineae. Τα µέλη της οικογένειας αυτής, γνωστά και ως δηµητριακά, θεωρούνται φυτά εξαιρετικά µεγάλης οικονοµικής σηµασίας, δεδοµένου ότι από αυτά προέρχεται το 70% της διατροφής του παγκόσµιου πληθυσµού [384]. Η χαρακτηριστική διαµόρφωση του αρτίβλαστου της οικογένειας αυτής διαφέρει τόσο πολύ από την αντίστοιχη άλλων οικογενειών µονοκοτυλίδονων φυτών, ώστε έχει εισαχθεί µία σειρά εξειδικευµένων όρων για την περιγραφή της [385]. Το ριζικό σύστηµα των δηµητριακών, συµπεριλαµβανοµένων του καλαµποκιού και του ρυζιού, εµφανίζει µία πολύπλοκη δοµή, αποτελούµενο από πολλούς ριζικούς τύπους ενώ παρατηρούνται πολλές βασικές διαφορές µε το σαφώς απλούστερο του Arabidopsis. Το ριζικό σύστηµα του καλαµποκιού µπορεί να χωριστεί σε δύο κατηγορίες, το εµβρυϊκό ριζικό σύστηµα, που αποτελείται από µία κύρια ρίζα και τις υπόλοιπες πρωτογενείς ρίζες και το µετα-εµβρυϊκό ριζικό σύστηµα που αποτελείται από τις επιγενείς ρίζες, οι οποίες χωρίζονται σε δύο κατηγορίες, τις στεφανιαίες και τις βραχιόνιες ρίζες (Εικόνα 1.5.4). Σε αντίθεση µε τα περισσότερα αγγειόσπερµα, όπου η κύρια ρίζα σχηµατίζεται από τα εξωτερικά στρώµατα του εµβρύου, η κύρια ρίζα του καλαµποκιού σχηµατίζεται στο εσωτερικό του και στη συνέχεια, διαπερνώντας τους υπόλοιπους ιστούς του εµβρύου, εξέρχεται και γίνεται διακριτό περίπου δύο εβδοµάδες µετά την επικονίαση, δηλαδή δύο µε τρείς ηµέρες µετά τη βλάστηση του σπόρου. Ο ιστός που καταστρέφεται κατά την έξοδο της ρίζας από το έµβρυο σχηµατίζει την κολεόριζα, η οποία περικλείει τη βάση της αναπτυσσόµενης ρίζας. Ο σχηµατισµός της κύριας ρίζας στο εσωτερικό του εµβρύου είναι ένα χαρακτηριστικό που συναντάται αποκλειστικά στην οικογένεια Gramineae. Οι υπόλοιπες πρωτογενείς ρίζες (seminal roots), ένας ριζικός τύπος που δεν συναντάται στο ρύζι, σχηµατίζονται επίσης στο εσωτερικό του εµβρύου, εξέρχονται από το σηµείο σύνδεσης βλαστού και ρίζας (scutellar node) και γίνονται εµφανής περίπου τρείς εβδοµάδες µετά την επικονίαση. Ο αριθµός των πρωτογενών ριζών ποικίλει και εξαρτάται από το γενετικό υπόβαθρο του σπόρου, ενώ δεν σχηµατίζουν κολεόριζα, δεδοµένου ότι τη στιγµή της εξόδου τους οι επιφανεικοί ιστοί του σπόρου είναι εύκολο να διαπεραστούν [385]. Παρόλο που έχει προταθεί ότι οι πρωτογενείς ρίζες παύουν να λειτουργούν µετά τον σχηµατισµό των επιγενών ριζών, είναι πλέον γνωστό ότι παραµένουν λειτουργικές σε όλο τον κύκλο ζωής του φυτού [386]. Η µελέτη του µεταλλάγµατος rtcs, το οποίο 112

127 σχηµατίζει µόνο µία κύρια ρίζα και κανένα άλλο ριζικό τύπο, έδειξε ότι η κύρια ρίζα επαρκεί για το σχηµατισµό ενός αναπαραγωγικά ώριµου φυτού [387]. Έχει προταθεί ότι η µετα-εµβρυακή ανάπτυξη του ριζικού συστήµατος του καλαµποκιού µπορεί να υποδιαιρεθεί σε δύο φάσεις, οι οποίες ρυθµίζονται από διαφορετικά γονίδια. Κατά τις δύο πρώτες εβδοµάδες της ανάπτυξης, η κύρια ρίζα και οι υπόλοιπες πρωτογενείς ρίζες συγκοτούν το σηµαντικότερο ποσοστό του ριζικού συστήµατος του καλαµποκιού(εικόνα 1.5.4Α και Β). Στη συνέχεια, οι επιγενείς ρίζες γίνονται το κυρίαρχο στοιχείο του ριζικού συστήµατος. Η πρώτη φάση της µετα-εµβρυακής ανάπτυξης της ρίζας χαρακτηρίζεται από δύο τύπους ριζών, τις πλευρικές ρίζες, που προέρχονται από την κύρια ρίζα και εµφανίζονται µία εβδοµάδα περίπου µετά τον σχηµατισµό της και τις στεφανιαίες επιγενείς ρίζες (crown roots) που σχηµατίζονται στην περιοχή του κολεόπτυλου, δύο εβδοµάδες περίπου µετά τη βλάστηση του σπόρου (Εικόνα 1.5.4C). Οι πλευρικές ρίζες, µέσω της περεταίρω διακλάδωσής τους, καθορίζουν σε µεγάλο βαθµό τη διαµόρφωση του ριζικού συστήµατος, ενώ παράλληλα αποτελούν τα κύρια όργανα για την απορρόφηση νερού και θρεπτικών στοιχείων. Οι πλάγιες ρίζες διαφέρουν από την κύρια ρίζα στο µέγεθος, στην ευαισθησία στην ξηρασία, στη δραστηριότητα του µεριστώµατός τους και στη δοµή του ξυλώµατός τους [367]. Η δεύτερη φάση της µετα-εµβρυικής ανάπτυξης της ρίζας χαρακτηρίζεται από την περαιτέρω ανάπτυξη των στεφανιαίων ριζών και την εµφάνιση του ενός άλλου τύπου επιγενών ριζών, των βραχιόνιων ριζών (brace roots). Συνολικά. κατά τη διάρκεια του κύκλου ζωής του καλαµποκιού αναπτύσσονται περίπου 70 επιγενείς ρίζες, οι οποίες είναι οργανωµένες σε έξι υπόγειους κόµβους από στεφανιαίες και δύο ή τρείς επίγειους κόµβους από βραχιόνιες ρίζες. Η µετάβαση από την πρώτη στη δεύτερη φάση της µετα-εµβρυικής ανάπτυξης του ριζικού συστήµατος ξεκινά περίπου ένα µήνα µετά τη βλάστηση µε τον σχηµατισµό των πρώτων υπόγειων κόµβων στεφανιαίων ριζών αρχικά στον δεύτερο κόµβο και στη συνέχεια στους επόµενους, µε βαθµιαία αύξηση τόσο της διαµέτρου, όσο και του αριθµού των επιγενών ριζών σε κάθε κόµβο. εδοµένων των µικρών µεσογονατίων διαστηµάτων µεταξύ των πρώτων κόµβων, οι στεφανιαίες ρίζες αναπτύσσονται πολύ κοντά µεταξύ τους µε αποτέλεσµα τη δηµιουργία ενός πυκνού ριζικού συστήµατος, το οποίο αποτελεί το κύριο τµήµα του ριζικού συστήµατος του ενήλικου φυτού. Οι βραχιόνιες ρίζες αναπτύσσονται από τους επόµενους, επίγειους κόµβους 113

128 του βλαστού περίπου έξι εβδοµάδες µετά τη βλάστηση του σπόρου και όσες απ αυτές εισχωρήσουν στο έδαφος, σχηµατίζουν πλάγιες ρίζες και παρέχουν επιπλέον στηρικτική και απορροφητική ικανότητα στο φυτό (Εικόνα 1.5.4D). Κοινό χαρακτηριστικό όλων των ριζικών τύπων που συναντώνται στα δηµητριακά, είναι ο σχηµατισµός πλευρικών ριζών και ριζικών τριχιδίων [367,385]. Εκτός από τους παραπάνω ριζικούς τύπους, οι οποίοι καθορίζονται από το ενδογενές αναπτυξιακό πρόγραµµα του φυτού, µπορούν να σχηµατιστούν και επίκτητες ρίζες σε ασυνήθη µέρη του φυτού, όπως π.χ. στο µεσοκοτύλιο, εξαιτίας διαφόρων εξωγενών παραγόντων, όπως τραυµατισµός του φυτού ή εξωγενής επίδραση φυτοορµονών [388]. Ανεξάρτητα από τον τύπο στον οποίο ανήκουν, όλες ρίζες του καλαµποκιού εµφανίζουν πολυαρχική οργάνωση, δηλαδή στο εσωτερικό τους υπάρχει ένας κεντρικός κύλινδρος που περιέχει πολλές ηθµαγγειώδεις δεσµίδες. Στην εξωτερική πλευρά του κεντρικού κυλίνδρου βρίσκονται το περικύκλιο και η ενδοδερµίδα [389], ενώ στη συνέχεια υπάρχουν πολλά στρώµατα παρεγχυµατικών κυττάρων, τα οποία συνολικά αποτελούν τον φλοιό. Ο πλέον εξωτερικός ιστός της ρίζας είναι η επιδερµίδα, τα κύτταρα της οποίας διακρίνονται σε τριχοβλάστες και ατριχοβλάστες, µε βάση την ικανότητά τους να σχηµατίζουν ριζικά τριχίδια. Στο καλαµπόκι, όπως και στα περισσότερα µονοκοτυλίδονα φυτά, δεν παρατηρείται δευτερογενής αύξηση της ρίζας. Η επιµήκης οργάνωση της ρίζας του καλαµποκιού διακρίνεται παραδοσιακά σε τρείς αναπτυξιακές ζώνες, την µεριστωµατική ζώνη, τη ζώνη επιµήκυνσης και τη ζώνη διαφοροποίησης [364]. Στη µεριστωµατική ζώνη, αρχικά διακρίνεται η καλύπτρα, η οποία περιβάλλει τη µεριστωµατική ζώνη. Στο εσωτερικό της µεριστωµατικής ζώνης υπάρχει το κέντρο ηρεµίας, µία περιοχή που αποτελείται από πολλά ( ) µη διαιρούµενα κύτταρα [390]. Το κέντρο ηρεµίας περιβάλλεται από πολλές εκατοντάδες µεριστωµατικά κύτταρα, που συγκροτούν, ανάλογα µε τη θέση τους, το ανώτερο και κατώτερο µερίστωµα της ρίζας. Μετά το ανώτερο µερίστωµα βρίσκεται το κατώτερο τµήµα της ζώνης επιµήκυνσης, που αποτελεί µία µεταβατική περιοχή µεταξύ µεριστωµατικής ζώνης και ζώνης επιµήκυνσης, όπου συνυπάρχουν οι κυτταρικές διαιρέσεις και η κυτταρική αύξηση. Πιστεύεται πως η περιοχή αυτή παίζει σηµαντικό 114

129 Εικόνα Οι ριζικοί τύποι που σχηµατίζονται κατά τα διάφορα στάδια ανάπτυξης του ριζικού συστήµατος του καλαµποκιού (PR: κύρια ρίζα, SR: υπόλοιπες πρωτογενείς ρίζες, CR: στεφανιαίες ρίζες, BR: βραχιόνιες ρίζες, co: κολεόριζα,c: κολεόπτυλο, m: µεσοκοτύλιο, s: σηµείο σύνδεσης βλαστού-ρίζας [The various root types present in the distinct developmental stages of maize root system (PR: primary root; SR: seminal roots; CR: crown roots; BR: brace roots; co: coleorhizae; c: coleoptile; m: mesocotyl, s: scutellar node)] σηµαντικό ρόλο στην απόκριση της ρίζας σε µία ποικιλία περιβαλλοντικών σηµάτων. Στη συνέχεια, βρίσκεται η κυρίως ζώνη επιµήκυνσης, όπου οι κυτταρικές διαιρέσεις ελαχιστοποιούνται και παρατηρείται αύξηση του µεγέθους των κυττάρων και τέλος, η ζώνηδιαφοροποίησης, όπου πραγµατοποιείται η τελική διαφοροποίηση των κυττάρων και ο σχηµατισµός των διαφόρων ιστών [364]. Σε αντίθεση µε τα δηµητριακά, όπου οι επιγενείς ρίζες αποτελούν το κύριο τµήµα του ριζικού συστήµατος, στο Arabidopsis η εµβρυική κύρια ρίζα παραµένει κυρίαρχη σε όλη τη ζωή του φυτού ενώ δεν παρατηρούνται άλλοι ριζικοί τύποι εκτός από τις πλευρικές ρίζες που σχηµατίζονται από αυτή [370,391]. Σε ό,τι αφορά τα ανατοµικά τους χαρακτηριστικά, ο φλοιός στη ρίζα των δηµητριακών αποτελείται από 8-15 στιβάδες παρεγχυµατικών κυττάρων ενώ στο Arabidopsis από µία µόνο στιβάδα, οκτώ παρεγχυµατικών κυττάρων [367]. ιαφορές υπάρχουν επίσης και στην κατά µήκος οργάνωση των ριζών, πέρα από τον κοινό διαχωρισµό σε καλύπτρα, µεριστωµατική ζώνη, ζώνη επιµήκυνσης και ζώνη διαφοροποίησης [364]. Για παράδειγµα, το κέντρο ηρεµίας 115

130 στα δηµητριακά αποτελείται από κύτταρα και περιβάλλεται από πολλές εκατοντάδες µεριστωµατικών κυττάρων, που σχηµατίζουν το κατώτερο και το ανώτερο µερίστωµα [390], ενώ στο Arabidopsis το κέντρο ηρεµίας αποτελείται από τέσσερα µόνο κύτταρα που περιβάλλονται από ένα περιορισµένο αριθµό µεριστωµατικών κυττάρων [392]. Μία άλλη διαφορά έγκειται στο σχηµατισµό των πλάγιων ριζών, οι οποίες στα δηµητριακά σχηµατίζονται από τις διαιρέσεις των κυττάρων του περικυκλίου και της ενδοδερµίδας, ενώ στο Arabidopsis αποκλειστικά από τις διαιρέσεις των κυττάρων του περικυκλίου [369,371]. Εικόνα Συγκριτική απεικόνιση της ρίζας ενός µονοκοτυλίδονου (Zea mays-b και d) και ενός δικοτυλίδονου φυτού (Arabidopsis thaliana-a και c), όπου διακρίνονται οι διαφορές σε ό,τι αφορά τις διάφορες ιστολογικές περιοχές της ρίζας. [Comparative representation of a monocot (Zea mays b and d) and a dicot (Arabidopsis thaliana a and c) root. The differences in the various tissues are indicated] 116

131 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Όπως φαίνεται από όσα αναφέρθηκαν στην Εισαγωγή, η µελέτη τόσο της χρωµατίνης γενικά, όσο και των ιστονών ειδικότερα, παρουσιάζει εξαιρετικό ενδιαφέρον και µπορεί να συµπεριληφθεί σε πολλά και διαφορετικά ερευνητικά πεδία των βιολογικών επιστηµών. Η µελέτη των ισοµορφών των ιστονών παρουσιάζει µεγάλο ενδιαφέρον δεδοµένων των διακριτών αλλά και ορισµένες φορές αλληλεπικαλυπτόµενων, ρόλων τους στη δοµή και λειτουργία της χρωµατίνης. Αντίστοιχο ενδιαφέρον παρουσιάζει και η µελέτη των µετα- µεταφραστικών τροποποιήσεών τους, δεδοµένου του ρόλου που αυτές επιτελούν, συνεργιστικά ή ανταγωνιστικά, στη ρύθµιση της γονιδιακής έκφρασης αλλά και σε κάθε άλλη λειτουργία που συντελείται στον πυρήνα του κυττάρου. Ανάλογα µε την προσέγγιση που χρησιµοποιείται κατά την µελέτη τους, οι ιστόνες αποτελούν ενδιαφέροντα αντικείµενα της βιοχηµείας, της µοριακής βιολογίας, της γενετικής, της φυσιολογίας, της κυτταρικής και της αναπτυξιακής βιολογίας. Μέχρι και την δεκαετία του 80, η έρευνα της χρωµατίνης είχε επικεντρωθεί στον άνθρωπο και γενικότερα στους ζωϊκούς οργανισµούς. Οι δηµοσιευµένες εργασίες αναφορικά µε τις ιστόνες των φυτικών οργανισµών αποτελούσαν λιγότερο από το 3% των συνολικών εργασιών που αφορούν τις ιστόνες (Πηγή: Η παραπάνω κατάσταση άλλαξε ως ένα βαθµό τη δεκαετία του 90 και πλέον τα φυτά αποτελούν ενδιαφέρον αντικείµενο για έρευνες σχετικά µε τη δοµή και λειτουργία της χρωµατίνης (Εικόνα 1.6.1). Πολλές ανακαλύψεις αναφορικά µε τις ισοµορφές και τις τροποποιήσεις των ιστονών που είχαν γίνει αρχικά σε ζωϊκούς οργανισµούς, στη συνέχεια επιβεβαιώθηκε πως ισχύουν σε µικρό ή µεγάλο βαθµό και στα φυτά, δεδοµένου και της υψηλής συντήρησης που εµφανίζουν οι ιστόνες µεταξύ των οργανισµών. Φυσικά, έχει βρεθεί ότι πολλά στοιχεία της χρωµατίνης των φυτών έχουν ιδιαίτερα χαρακτηριστικά, τα οποία και τα διαχωρίζουν από τους ζωϊκούς οργανισµούς, ενώ ορισµένες διεργασίες της χρωµατίνης παρατηρήθηκαν αρχικά σε φυτικούς οργανισµούς και αργότερα σε ζωϊκούς. Για τους παραπάνω λόγους η µελέτη των ιστονών σε φυτικούς οργανισµούς αποτελεί ένα ακόµη πιο ενδιαφέρον πεδίο έρευνας για τις βιολογικές επιστήµες. 117

132 Ένας άλλο πεδίο στο οποίο η έρευνα αναφορικά µε τις ιστόνες ξεκίνησε σχετικά πρόσφατα είναι η αναπτυξιακή βιολογία. Είναι γνωστό ότι κατά την ανάπτυξη των οργανισµών και τη διαφοροποίηση των κυττάρων επέρχονται σηµαντικές αλλαγές στη δοµή και στη λειτουργία της χρωµατίνης, οι οποίες περιλαµβάνουν και µεταβολές στις αναλογίες µεταξύ των ισοµορφών των ιστονών και στις τροποποιήσεις που συναντώνται σ αυτές. Παρά το µεγάλο ενδιαφέρον όµως που παρουσιάζει η αναπτυξιακή προσέγγιση των χαρακτηριστικών της χρωµατίνης, οι σχετικές µελέτες, µέχρι τις αρχές της δεκαετίας του 90, αποτελούσαν µόλις το 5% των συνολικών µελετών που αφορούσαν τις ιστόνες (από την ίδια πηγή). Εικόνα Οι δηµοσιευµένες µελέτες αναφορικά µε τις ιστόνες από τη δεκαετία του 50 µέχρι το 2000 (κόκκινη γραµµη). Παράλληλα εικονίζονται οι µελέτες για τις ιστόνες σε φυτικούς οργανισµούς (πράσινη γραµµή), οι µελέτες για τις ιστόνες σε σχέση µε τη διαφοροποίηση του κυττάρου (µπλέ γραµµή) και ο συνδιασµός των παραπάνω (µαύρη γραµµή). Συγκεντρωτικά, οι µελέτες για τις ιστόνες στα φυτά αποτελούν το 3,5% περίπου των συνολικών, οι µελέτες για τις ιστόνες σε σχέση µε τη διαφοροποίηση του κυττάρου αποτελούν το 6,5% περίπου των συνολικών και οι µελέτες για τις ιστόνες σε σχέση µε τη διαφοροποίηση του κυττάρου σε φυτικούς οργανισµούς αποτελούν το 0,2% των συνολικών. [Published studies regarding histones in general since 1950 (red line), histones in plant organisms (green line), histones during cell differentiation (blue line) and histones during plant cell differentiation (black line). Studies regarding plant histones are approximately 3,5% of total studies about histones, studies regarding histones and cell differentiation are approximately 6,5% while studies about histones and plant cell differentiation are approximately 0,2% of total studies] 118

133 Λαµβάνοντας υπόψη α) ότι η αναπτυξιακή προσέγγιση των ισοµορφών και των τροποποιήσεων των ιστονών σε φυτικούς οργανισµούς παρουσιάζει εξαιρετικό ενδιαφέρον και β) ότι οι µελέτες που έχουν γίνει αναφορικά µε τις ιστόνες των φυτών, αλλά και σε σχέση µε τη διαφοροποίηση των κυττάρων αποτελούν ένα πολύ µικρό ποσοστό της συνολικής έρευνας που αφορά τις ιστόνες, αποφασίσαµε να µελετήσουµε το πρότυπο κατανοµής των ισοµορφών και τροποποιηµένων µορφών των ιστονών κατά τη διαφοροποίηση των φυτικών κυττάρων. Η κύρια υπόθεση εργασίας που χρησιµοποιήθηκε στην παρούσα µελέτη είναι ότι το πρότυπο κατανοµής των ιστονών µεταβάλλεται κατά τη διαφοροποίηση των φυτικών κυττάρων, µε άλλα λόγια, ότι η ποσοστιαία συµµετοχή κάθε ισοµορφής και τροποποιηµένης µορφής µίας κύριας τάξης ιστονών σε µεριστωµατικά κύτταρα διαφέρει από την αντίστοιχη συµµετοχή σε διαφοροποιηµένα κύτταρα. Για να διερευνηθεί η παραπάνω υπόθεση εργασίας χρησιµοποιήθηκε ως πειραµατικό υλικό η ρίζα του καλαµποκιού (Zea mays L.). Η ρίζα του καλαµποκιού αποτελεί ένα κατάλληλο βιολογικό σύστηµα για αναπτυξιακές µελέτες, δεδοµένου ότι οι τρείς αναπτυξιακές ζώνες της µπορούν εύκολα να διαχωριστούν. Η µεριστωµατική ζώνη, η ζώνη επιµήκυνσης και η ζώνη διαφοροποίησης διαφέρουν µεταξύ τους τόσο µορφολογικά, όσο και αναφορικά µε τη φυσιολογική κατάσταση και το βαθµό διαφοροποίησης των κυττάρων που τις αποτελούν. Συνεπώς, σύµφωνα µε την αρχική υπόθεση εργασίας, κάθε αναπτυξιακή ζώνη της ρίζας πρέπει να εµφανίζει και διαφορετικό πρότυπο κατανοµής των ιστονών. Για να αποκτήσουµε µία πληρέστερη εικόνα για τις µεταβολές στο πρότυπο κατανοµής των ιστονών κατά τη διαφοροποίηση, αποφασίσαµε να διερευνήσουµε την ίδια υπόθεση κατά την αποδιαφοροποίηση των φυτικών κυττάρων. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιήθηκαν ιστο-καλλιέργειες κάλλων, οι οποίες δηµιουργήθηκαν από τµήµατα της ρίζας, που αντιστοιχούν στις αναπτυξιακές της ζώνες. Στις ιστοκαλλιέργειες κάλλων, τα ήδη διαφοροποιηµένα κύτταρα της ρίζας ανακτούν τις µεριστωµατικές τους ιδιότητες και συµπεριφέρονται ως µεριστωµατικά κύτταρα. Σ αυτή την περίπτωση, η υπόθεση εργασίας είναι ότι το πρότυπο κατανοµής των ιστονών στις ιστοκαλλιέργειες κάλλων είναι παρόµοιο µε αυτό της µεριστωµατικής ζώνης των µαρτύρων. 119

134 Παράλληλα, αποφασίσαµε να διερευνήσουµε την αρχική υπόθεση εργασίας σε δύο ακόµη περιπτώσεις και συγκεκριµένα, κατά την επαγωγή και κατά την αναστολή της διαφοροποίησης της ρίζας. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποιήθηκαν φυτά που αναπτύχθηκαν παρουσία αυξίνης και φυτά που αναπτύχθηκαν παρουσία γιββεριλλίνης. Είναι γνωστό πως η επίδραση εξωγενούς αυξίνης επάγει την διαφοροποίηση του ριζικού συστήµατος των φυτών, προάγοντας τόσο τη διαφοροποίηση των αγωγών στοιχείων της ρίζας, όσο και την προγραµµατισµένη διαφοροποίηση των µεριστωµατικών κυττάρων. Αντίθετα, η επίδραση εξωγενούς γιββεριλλίνης προάγει την επιµήκυνση της ρίζας και αναστέλλει την διαφοροποίησή της. Τόσο τα φυτά που αναπτύσσονται παρουσία αυξίνης, όσο και τα φυτά που αναπτύσσονται παρουσία γιββεριλλίνης, εµφανίζουν σηµαντικές µορφολογικές και φυσιολογικές διαφορές σε σχέση µε τα φυτά-µάρτυρες, οι οποίες πιθανόν να αντανακλούνται και στο πρότυπο κατανοµής των ιστονών στην κάθε περίπτωση. Οι υποθέσεις εργασίας στα πειράµατα µε τις παραπάνω φυτοορµόνες είναι ότι στην περίπτωση της αυξίνης το πρότυπο κατανοµής των ιστονών είναι παρόµοιο µε το αντίστοιχο της ζώνης διαφοροποίησης των µαρτύρων, ενώ στην περίπτωση της γιββεριλλίνης το πρότυπο κατανοµής των ιστονών διαφέρει από το αντίστοιχο της ζώνης διαφοροποίησης των µαρτύρων. 120

135 2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ 2.1. Φυτικό υλικό και χηµικά αντιδραστήρια Το φυτικό υλικό που χρησιµοποιήθηκε στην παρούσα εργασία (Zea mays L., cv. Polaris) ήταν της εταιρείας Nickerson. Τα χηµικά αντιδραστήρια που χρησιµοποιήθηκαν ήταν καθαρότητας αναλυτικού βαθµού από τις εταιρείες Sigma, Merck, Pharmacia και Fluka. Οι ηλεκτροφορήσεις πραγµατοποιήθηκαν σε συσκευές ηλεκτροφόρησης Owl, η ηλεκτροµεταφορά των πρωτεϊνών σε µεµβράνη PVDF της εταιρείας Perkin Elmer, έγινε σε συσκευή ηλεκτροµεταφοράς BioRad. Η προέλευση των αντισωµάτων που χρησιµοποιήθηκαν περιγράφεται στην αντίστοιχη παράγραφο, ενώ το αποτέλεσµα της ανοσοανίχνευσης των πρωτεϊνών αποτυπώθηκε σε φωτογραφικό φιλµ της εταιρείας Kodak. Το φυτικό υλικό µπορεί να χωριστεί σε τέσσερις κατηγορίες, η κάθε µία από τις οποίες, χαρακτηρίζεται από τα ιδιαίτερα µορφολογικά χαρακτηριστικά της: - τα φυτά-µάρτυρες, που χρησιµοποιήθηκαν για την µελέτη του προτύπου κατανοµής των ιστονών κατά τη διαφοροποίηση των φυτικών κυττάρων στη ρίζα του καλαµποκιού όταν αυτή αναπτύσσεται σε φυσιολογικές συνθήκες - τις ιστοκαλλιέργειες κάλλων (πρωτογενών, δευτερογενών και τριτογενών), που αναπτύχθηκαν από τµήµατα της ρίζας που αντιστοιχούν στις τρείς αναπτυξιακές ζώνες και χρησιµοποιήθηκαν για την µελέτη του προτύπου κατανοµής των ιστονών κατά την αποδιαφοροποίηση των φυτικών κυττάρων - τα φυτά που αναπτύχθηκαν παρουσία αυξίνης και χρησιµοποιήθηκαν για την µελέτη του προτύπου κατανοµής των ιστονών κατά τη διαφοροποίηση των φυτικών κυττάρων παρουσία µίας φυτοορµόνης που επάγει τη διαφοροποίηση της ρίζας - τα φυτά που αναπτύχθηκαν παρουσία γιββεριλλίνης και χρησιµοποιήθηκαν για την µελέτη του προτύπου κατανοµής των ιστονών κατά τη διαφοροποίηση των φυτικών κυττάρων παρουσία µίας φυτοορµόνης που αναστέλλει τη διαφοροποίηση της ρίζας 121

136 2.1.1 Φυτά-µάρτυρες Σπόροι καλαµποκιού (Zea mays L., cv. Polaris), πλένονται σχολαστικά µε νερό βρύσης, απολυµαίνονται µε εµβάπτιση σε διάλυµα χλωρίνης 10% για 5 λεπτά και ξεπλένονται µε απεσταγµένο νερό, στο οποίο και παραµείνουν για περίπου 24 ώρες. Στη συνέχεια, επιστρώνονται ανάµεσα σε ενυδατωµένα φύλλα διηθητικού χαρτιού και αφήνονται να βλαστήσουν στο σκοτάδι, σε θερµοκρασία περίπου 28 ο C, ενώ η υγρασία διατηρείται σταθερή µε την καθηµερινή προσθήκη αποσταγµένου νερού. Όταν το µήκος των ριζών, έπειτα από περίπου 72 ώρες, φτάσει τα 3-5cm, αποκόβονται και συλλέγονται ξεχωριστά, σε προζυγισµένα τριβλία, οι τρείς αναπτυξιακές ζώνες κάθε ρίζας, η µεριστωµατική ζώνη (2mm), η ζώνη επιµήκυνσης (2mm-6mm) και η ζώνη διαφοροποίησης (6mm-2cm) [393]. Αφού προσδιοριστεί το βάρος του φυτικού υλικού που συλλέχθηκε από κάθε αναπτυξιακή ζώνη, καταψύχεται µε υγρό άζωτο και αποθηκεύεται στους 70 ο C In vitro ιστοκαλλιέργεια κάλλων Για την ιστοκαλλιέργεια κάλλων χρησιµοποιείται το θρεπτικό µέσο MS [394], η σύσταση του οποίου φαίνεται στον Πίνακα 1. Τα διαλύµατα των µακροστοιχείων, των ιχνοστοιχείων και του χηλικού σιδήρου, τα οποία παρασκευάζονται ξεχωριστά, αναµιγνύονται και προστίθεται 0,0002% (w/v) αυξητική ορµόνη 2,4-διχλωρο-φαινοξυ-οξικό οξύ (2,4-D) και το ph του µίγµατος ρυθµίζεται στο 5.8. Στη συνέχεια, προστίθενται σουκρόζη και agar-gel σε τελικούς όγκους 3% (w/v) και 0,5% (w/v) αντίστοιχα, το µίγµα αποστειρώνεται, προστίθεται διάλυµα βιταµινών, η σύσταση του οποίου φαίνεται στον Πίνακα 2, σε τελικό όγκο 0.1% (v/v) και το θρεπτικό µέσο µοιράζεται σε αποστειρωµένους γυάλινους δοκιµαστικούς σωλήνες. Σπόροι καλαµποκιού, αφού πλυθούν και απολυµανθούν όπως έχει ήδη περιγραφεί, τοποθετούνται σε γυάλινους δοκιµαστικούς σωλήνες που περιέχουν αποστειρωµένο και στερεοποιηµένο διάλυµα agar-gel 0,5% (w/v) όπου αναπτύσσονται στους 28 o C, µέχρι η ρίζα να αποκτήσει το επιθυµητό µέγεθος, δηλαδή 3-5cm. Τότε, υπό αυστηρά ασηπτικές συνθήκες, αποκόβονται οι αναπτυξιακές ζώνες κάθε ρίζας και µεταφέρονται ξεχωριστά σε δοκιµαστικούς σωλήνες που περιέχουν αποστειρωµένο και στερεοποιηµένο θρεπτικό µέσο. Οι κάλλοι αναπτύσσονται στο σκοτάδι, στους 28 o C, για περίπου δύο µήνες και στη συνέχεια το υλικό συλλέγεται, 122

137 καταψύχεται µε υγρό άζωτο και αποθηκεύεται στους 70 o C. Ένα µικρό µέρος από κάθε καλλιέργεια µεταφέρεται, υπό ασηπτικές συνθήκες, σε νέους δοκιµαστικούς σωλήνες µε θρεπτικό µέσο, για τη δηµιουργία δευτερογενών, τριτογενών κ.ο.κ. υποκαλλιεργειών. Πίνακας 1 Σύσταση του µίγµατος µακροστοιχείων, ιχνοστοιχείων και χηλικού σιδήρου που αποτελούν το θρεπτικό µέσο MS (mg/lt). [MS medium composition (macronutrients, micronutrients and Fe chelate, given in mg/lt] Ιχνοστοιχεία Μακροστοιχεία KI 0,83 NH4NO H3BO3 6,2 KNO MnSO4.4H2O 22,3 MgSO4.7H2O 370 ZnSO4.7H2O 8,6 KH2PO4 170 Na2MoO4. 2H2O 0,25 CaCl22H2O 440 CuSO4.5H2O 0,025 Χηλικός σίδηρος CoCl2.6H2O 0,025 FeSO4.7H2O 27,8 Na2EDTA.7H2O 37,3 Πίνακας 2 Σύσταση του µίγµατος βιταµινών που προστίθενται στο θρεπτικό µέσο MS (mg/lt). [Mixture of vitamins (mg/lt) which are added in MS medium] Thiamine-HCl (B1) 0,1 Pyridoxine-HCl (B6) 0,5 Niacin/Nicotinamide (PP) 0,5 Glycine, ph=

138 2.1.3 Φυτά που αναπτύχθηκαν υπό την επίδραση φυτοορµονών Για να µελετηθεί η κατανοµή των ισοµορφών και των τροποποιηµένων µορφών των ιστονών σε ρίζες που αναπτύσσονται υπό την επίδραση φυτοορµονών, η διαδικασία είναι ίδια µε αυτή που ακολουθείται για τα φυτά-µάρτυρες, µε µόνη διαφορά ότι κατά την βλάστηση των σπόρων και την ανάπτυξη των ριζών δεν χρησιµοποιείται απεσταγµένο νερό, αλλά υδατικά διαλύµατα φυτοορµονών, στις κατάλληλες συγκεντρώσεις. Συγκεκριµένα, γίνεται προσθήκη διαλύµατος 3-ινδολ-οξικού οξέος 0,01mΜ και διαλύµατος γιββεριλλικού οξέος 0,01mΜ. Στη συνέχεια, όπως και στα φυτά-µάρτυρες, όταν το µήκος των ριζών, φτάσει τα 3-5cm, αποκόβονται και συλλέγονται ξεχωριστά, σε προζυγισµένα τριβλία, οι τρείς αναπτυξιακές ζώνες κάθε ρίζας και αφού προσδιοριστεί το βάρος του φυτικού υλικού που συλλέχθηκε από κάθε αναπτυξιακή ζώνη, καταψύχεται µε υγρό άζωτο και αποθηκεύεται στους 70 ο C. Εικόνα Αντιπροσωπευτική εικόνα ρίζας καλαµποκιού, που έχει αναπτυχθεί για 72 ώρες περίπου στους 28 0 C. Τα βέλη δείχνουν τις θέσεις διαχωρισµού των τριών αναπτυξιακών ζωνών. [A longitudinal view of a maize root developed for 72 hours at 28 0 C. Arrows indicate the regions of sectioning] 124

139 Εικόνα Αντιπροσωπευτική εικόνα ρίζας από φυτό-µάρτυρα, ρίζας από φυτό που αναπτύχθηκε παρουσία 0,01mM ινδολ-οξικού οξέος και ρίζας από φυτό που αναπτύχθηκε παρουσία 0,01mM γιββεριλλικού οξέος. Τα φυτά αναπτύχθηκαν κάτω από τις ίδιες συνθήκες (σκοτάδι, 28 0 C, για 72 ώρες). [Morphological differences between a representative root developed in the dark at 28 o C on paper sheets soaked with 0.01mM indole-acetic acid, a root developed in the dark at 28 o C on paper sheets soaked with 0.01mM gibberellic acid and a root developed under the same conditions on paper sheets soaked with distilled water] Εικόνα Χαρακτηριστική εικόνα ιστοκαλλιέργειας κάλλου που αναπτύχθηκε από τµήµα της ρίζας µέσα σε θρεπτικό µέσο MS, στο σκοτάδι και στους 28 0 C. [Representative view of callus culture derived from root segment and propagated in MS medium, in the dark at 28 o C] 125

140 2.2 ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΠΥΡΗΝΩΝ ΚΑΙ ΙΣΤΟΝΩΝ Αποµόνωση των πυρήνων Η αποµόνωση των πυρήνων γίνεται σύµφωνα µε τη µέθοδο των Muller et al. [395] και η σύσταση των ρυθµιστικών διαλυµάτων που χρησιµοποιούνται φαίνεται στον Πίνακα 3. Το φυτικό υλικό κάθε αναπτυξιακής ζώνης της ρίζας ξεχωριστά (καθώς και κάθε υποκαλλιέργειας κάλλου) οµογενοποιείται µηχανικά µε σύνθλιψη, παρουσία ρυθµιστικού διαλύµατος Α (50mM Tris-HCl, ph 8.0, 4mM (CH3COOH)2Mg.4H20, 0,25M σουκρόζη, 2% (w/v) αραβικό κόµµι, 0,5% (v/v) Triton X-100, 1% (v/v) PMSF, 0,5% (v/v) DMSO, 5mM β- µερκαπτοαιθανόλη). Κατά την οµογενοποίηση χρησιµοποιούνται γυάλινα σφαιρίδια διαµέτρου 106µ για αποφευχθεί η θραύση των πυρήνων. Το οµογενοποίηµα διηθείται µέσα από φίλτρο Nylon Screen Mesh 25µ. και φυγοκεντρείται σε 900g για 30 λεπτά. Στη συνέχεια το ίζηµα, το οποίο περιέχει τους πυρήνες, αιωρείται σε ρυθµιστικό διάλυµα C (διάλυµα Α χωρίς αραβικό κόµµι), επιστοιβάζεται σε διπλάσια ποσότητα ρυθµιστικού διαλύµατος Β (50mM Tris-HCl, ph 8.0, 4mM (CH3COOH)2Mg.4H20, 1,2M σουκρόζη, 1% (v/v) PMSF, 0,5% (v/v) DMSO, 5mM β-µερκαπτοαιθανόλη) και ακολουθεί νέα φυγοκέντρηση σε 900g για 30 λεπτά. Έπειτα, το ίζηµα αιωρείται σε ρυθµιστικό διάλυµα D (διάλυµα Α χωρίς αραβικό κόµµι και Triton X-100) και φυγοκεντρείται σε 900g για 30 λεπτά και τέλος, σε διάλυµα TBS (10mM Tris-HCl, ph 7.5, 150mM NaCl) και φυγοκεντρείται σε g για 30 λεπτά. Το υπερκείµενο της πρώτης φυγοκέντρησης του αρχικού οµογενοποιήµατος, φυγοκεντρείται σε 4.000g για 30 λεπτά, ώστε να αποµονωθεί η χρωµατίνη που πιθανόν να υπάρχει διασκορπισµένη στο κυτταρόπλασµα από πυρήνες που έχουν σπάσει κατά την οµογενοποίηση. 126

141 Πίνακας 3 Σύσταση των ρυθµιστικών διαλυµάτων που χρησιµοποιούνται κατά την αποµόνωση των πυρήνων. [Buffers used in nuclei isolation] ιάλυµα Α ιάλυµα Β ιάλυµα C ιάλυµα D Tris-HCl, ph mM 50mM 50mM 50mM (CH3COOH)2Mg.4H20 4mM 4mM 4mM 4mM Σουκρόζη 0,25M 1,2M 0,25M 0,25M Αραβικό κόµµι 2% (w/v) Triton X-100 0,5% (v/v) 0,5% (v/v) PMSF 1% (v/v) 1% (v/v) 1% (v/v) 1% (v/v) DMSO 0,5% (v/v) 0,5% (v/v) 0,5% (v/v) 0,5% (v/v) β-µερκαπτοαιθανόλη 5mM 5mM 5mM 5mM 127

142 2.2.2 Εκχύλιση και καθαρισµός των ιστονών Η εκχύλιση των ιστονών γίνεται σύµφωνα µε τη µέθοδο των Murray και Key [396]. Οι πυρήνες που έχουν αποµονωθεί, αιωρούνται σε διάλυµα 0,4Ν H2SO4 και αναδεύονται για µία ώρα. Στη συνέχεια, φυγοκεντρούνται σε g για 30 λεπτά, συλλέγεται το υπερκείµενο κάθε δείγµατος σε γυάλινο σωλήνα και προστίθεται σ αυτό αιθανόλη σε αναλογία 1:4 (v/v). Έπειτα, τα δείγµατα αποθηκεύονται στους -20 ο C και οι ιστόνες καθιζάνουν µετά από περίπου 48 ώρες. Τότε, το ίζηµα από κάθε σωλήνα µεταφέρεται σε σωλήνες eppendorf και ακολουθεί φυγοκέντρηση σε g για 30 λεπτά. Ο καθαρισµός των ιστονών περιλαµβάνει αρχικά αιώρηση του ιζήµατος σε διάλυµα αιθανόλης 70% (v/v), έπειτα σε διάλυµα αιθανόλης-αιθέρα σε αναλογία 3:1 (v/v) και τέλος σε ακετόνη, µε ενδιάµεσες φυγοκεντρήσεις σε g για 30 λεπτά κάθε φορά. Τα παραπανώ στάδια του καθαρισµού γίνονται στους 4 o C και συνήθως γίνονται εις διπλούν. Μετά την ολοκλήρωση της διαδικασίας, τα δείγµατα τοποθετούνται σε αντλία κενού για περίπου 30 λεπτά για να στεγνώσουν και έπειτα αποθηκεύονται στους 20 o C Ποσοτικός προσδιορισµός πρωτεϊνης Ο ποσοτικός προσδιορισµός της πρωτείνης γίνεται µε τη µέθοδο Lowry [397] και για τον σχεδιασµό της πρότυπης καµπύλης, βάσει της οποίας υπολογίζεται η συγκέντρωση της πρωτεϊνης των δειγµάτων, χρησιµοποιείται διάλυµα BSA γνωστής συγκέντρωσης. 128

143 2.3 ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΤΙΚΟΣ ΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Ηλεκτροφόρηση παρουσία SDS Ο διαχωρισµός των ιστονών γίνεται αρχικά µε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαµιδίου παρουσία SDS (SDS-PAGE), σύµφωνα µε τη µέθοδο που περιγράφηκε από τον Laemmli [398]. Xρησιµοποιείται πηκτή διαχωρισµού, διαστάσεων 10x10x0,5mm, µε συγκέντρωση ακρυλαµίδης 15%, η σύσταση της οποίας καθώς και της πηκτής επιστοίβαξης φαίνονται στον Πίνακα 4, ενώ τα δείγµατα διαλύονται στο διάλυµα κατεργασίας, το οποίο περιέχει 50mM Tris-HCl, ph=6.8, 100mM DTT, 2% (w/v) SDS, 1% (w/v) κυανό της βρωµοφαινόλης και 10% (v/v) γλυκερόλη. Κατά την ηλεκτροφόρηση χρησιµοποιείται ρυθµιστικό διάλυµα που περιέχει 25mM Tris-HCl, ph=8.3, 192mM γλυκίνη, 0,1% (w/v) SDS, και στα άκρα της συσκευής εφαρµόζεται σταθερή τάση 100Volt, η οποία αυξάνεται στα 200Volt όταν τα δείγµατα περάσουν από την πηκτή επιστοίβαξης στην πηκτή διαχωρισµού. Η ηλεκτροφόρηση ολοκληρώνεται όταν η χρωστική φτάνει στο κάτω µέρος της πηκτής. Οι πρωτεϊνες διαχωρίζονται σύµφωνα µε το µοριακό τους βάρος, για τον προσδιορισµό του οποίου χρησιµοποιείται µίγµα πρωτεϊνών µε γνωστό µοριακό βάρος(protein prestained markers, New England Biolabs). Πίνακας 4 Σύσταση της πηκτής διαχωρισµού και της πηκτής επιστοίβαξης που χρησιµοποιούνται κατά ηλεκτροφόρηση παρουσία SDS. [Separating and stacking gel used in SDS-PAGE] Πηκτή ιαχωρισµού Πηκτή Επιστοίβαξης Ακρυλαµίδη 15% (w/v) Ακρυλαµίδη 5% (w/v) Tris-HCl, ph= mM Tris-HCl, ph= mM SDS 1% (w/v) SDS 1% (w/v) APS 1% (w/v) APS 1% (w/v) TEMED 0.04% (v/v) TEMED 0.1% (v/v) 129

144 2.3.2 Όξινη ηλεκτροφόρηση Ο διαχωρισµός των ισοµορφών και των τροποποιηµένων µορφών των ιστονών γίνεται µε όξινη ηλεκτροφόρηση, κατά την οποία οι πρωτεϊνες διαχωρίζονται σύµφωνα µε τον λόγο φορτίου/µάζα καθώς και µε την ικανότητα πρόσδεσής τους σε µη ιοντικά απορρυπαντικά. Κατά την ηλεκτροφόρηση σε όξινες συνθήκες η πολικότητα του ηλεκτρικού ρεύµατος αντιστρέφεται [37]. Η ηλεκτροφόρηση γίνεται σε πηκτή πολυακρυλαµιδίου, διαστάσεων 10x10x0,5mm, η σύσταση της οποίας φαίνεται στον Πίνακα 5, ενώ τα δείγµατα διαλύονται σε διάλυµα κατεργασίας το οποίο περιέχει 1Μ οξικό οξύ, 6Μ ουρία, 45mM NH4OH και 15mM β-µερκαπτοαιθανόλη. Για να επιτευχθεί καλύτερος διαχωρισµός των ισοµορφών των διαφόρων ιστονών χρησιµοποιούνται διαφορετικές συγκεντρώσεις ακρυλαµίδης και ουρίας στην πηκτή διαχωρισµού, ενώ µπορεί να απουσιάζει το Triton X-100, όταν πρόκειται να µελετηθεί ο διαχωρισµός των ισοµορφών αποκλειστικά µε βάση τον λόγο φορτίο/µάζα. Το διάλυµα ηλεκτροφόρησης περιέχει 1Μ οξικό οξύ και 0,1Μ γλυκίνη και στα άκρα της συσκευής εφαρµόζεται σταθερή τάση 210Volt, µέχρι η χρωστική να φτάσει στο κάτω µέρος της πηκτής. Πίνακας 5 Σύσταση της πηκτής διαχωρισµού και της πηκτής επιστοίβαξης που χρησιµοποιούνται κατά την όξινη ηλεκτροφόρηση. Η συγκέντρωση της ουρίας στην πηκτή διαχωρισµού µπορεί εναλλακτικά να είναι 8Μ. [Separating and stacking gel used in acetic acid-urea polyacrylamide gel. Alternatively, urea s concentration can be 8M] Πηκτή ιαχωρισµού Πηκτή Επιστοίβαξης Ακρυλαµίδη 16.5% (w/v) Ακρυλαµίδη 3.3% (w/v) ισ-ακρυλαµίδη 0.1% (w/v) ισ-ακρυλαµίδη 0.16% (w/v) Οξικό οξύ 1Μ Οξικό οξύ 1Μ Ουρία 6Μ Ουρία 6Μ Triton X % (v/v) NH4OH 45mΜ NH4OH 45mΜ TEMED 0.5% (v/v) TEMED 0.5% (v/v) Ριβοφλαβίνη 0.027% (w/v) Ριβοφλαβίνη 0.027% (w/v) 130

145 2.3.3 Όξινη δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση Ο διαχωρισµός των ισοµορφών και των τροποποιηµένων µορφών των ιστονών σε όξινη δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση σε σύστηµα οξικού οξέος-ουρίας-triton X-100/οξικού οξέος-ουρίας-ctab (AUT/AUC-PAGE) γίνεται σύµφωνα µε τη µέθοδο των Bonner et al. [399]. Κατά την πρώτη διάσταση χρησιµοποιείται πηκτή πολυακρυλαµιδίου, διαστάσεων 10x10x0,5mm, µε συγκέντρωση ακρυλαµίδης 12% και παρουσία Triton X- 100, η σύσταση της οποίας φαίνεται στον Πίνακα 6, ενώ το διάλυµα κατεργασίας των δειγµάτων και το διάλυµα ηλεκτροφόρησης έχουν ήδη περιγραφεί στην προηγούµενη παράγραφο. Η ηλεκτροφόρηση πραγµατοποιείται µε σταθερή τάση 210Volt και όταν ολοκληρωθεί, αποκόβονται οι λωρίδες, κατά µήκος των οποίων έχουν διαχωριστεί τα δείγµατα. Οι λωρίδες αρχικά εµβαπτίζονται για 5 λεπτά σε διάλυµα που περιέχει 0,1% (w/v) Coomasie Brilliant Blue R-250, 40% (v/v) αιθανόλη, 5% (v/v) οξικό όξυ, 0,1% (w/v) κυστεαµίνη, στη συνέχεια για 10 λεπτά σε διάλυµα αποχρωµατισµού που περιέχει 20% (v/v) αιθανόλη, 5% (v/v) οξικό οξύ, 0,1% (w/v) κυστεαµίνη και τέλος για 20 λεπτά σε διάλυµα που περιέχει 1Μ οξικό οξυ, 5mM ΝΗ4ΟΗ και 0,5% (w/v) κυστεαµίνη. Έπειτα, η λωρίδα τοποθετείται οριζόντια στο πάνω µέρος της πηκτής πολυακρυλαµιδίου της δεύτερης διάστασης, η οποία έχει διαστάσεις 10x10x0.75mm, συγκέντρωση ακρυλαµίδης 16.5% και η συστασή της φαίνεται στον Πίνακα 7. Οι συνθήκες της ηλεκτροφόρησης παραµένουν ίδιες µε αυτές της πρώτης διάστασης, µε µόνη διαφορά ότι στο διάλυµα της πάνω δεξαµενής της συσκευής προστίθεται 0.15% (w/v/) CTAB και η ηλεκτροφόρηση ολοκληρώνεται όταν το µέτωπο της χρωστικής φτάσει στο κάτω µέρος της πηκτής. 131

146 Πίνακας 6 Σύσταση της πηκτής διαχωρισµού και της πηκτής επιστοίβαξης που χρησιµοποιούνται κατά την πρώτη διάσταση όξινης ηλεκτροφόρησης (σε σύστηµα οξικού οξέος-ουρίας-triton X-100) [Separating and stacking gel used in 1 st dimension of AUT/AUC-PAGE] Πηκτή ιαχωρισµού Πηκτή Επιστοίβαξης Ακρυλαµίδη 12% (w/v) Ακρυλαµίδη 3.3% (w/v) ισ-ακρυλαµίδη 0.1% (w/v) ισ-ακρυλαµίδη 0.16% (w/v) Οξικό οξύ 1Μ Οξικό οξύ 1Μ Ουρία 6Μ Ουρία 6Μ Triton X % (v/v) NH4OH 45mΜ NH4OH 45mΜ TEMED 0.5% (v/v) TEMED 0.5% (v/v) Ριβοφλαβίνη 0.027% (w/v) Ριβοφλαβίνη 0.027% (w/v) Πίνακας 7 Σύσταση της πηκτής διαχωρισµού και της πηκτής επιστοίβαξης που χρησιµοποιούνται κατά την δεύτερη διάσταση όξινης ηλεκτροφόρησης (σε σύστηµα οξικού οξέος-ουρίας-ctab) [Separating and stacking gel used in 2 nd dimension of AUT/AUC-PAGE] Πηκτή ιαχωρισµού Πηκτή Επιστοίβαξης Ακρυλαµίδη 16.5% (w/v) Ακρυλαµίδη 3.3% (w/v) ισ-ακρυλαµίδη 0.1% (w/v) ισ-ακρυλαµίδη 0.16% (w/v) Οξικό οξύ 1Μ Οξικό οξύ 1Μ Ουρία 6Μ Ουρία 6Μ NH4OH 45mΜ NH4OH 45mΜ TEMED 0.5% (v/v) TEMED 0.5% (v/v) Ριβοφλαβίνη 0.027% (w/v) Ριβοφλαβίνη 0.027% (w/v) 132

147 2.3.4 Χρώση των πηκτών Η χρώση των πηκτών πολυακρυλαµιδίου µπορεί να γίνει µε δύο µεθόδους. Σύµφωνα µε την πρώτη, µετά το τέλος της ηλεκτροφόρησης η πηκτή εµβαπτίζεται σε διάλυµα χρώσης που περιέχει 0.1% (w/v) Coomasie Brilliant Blue R-250, 45% (v/v) µεθανόλη και 10% (v/v) οξικό οξύ, στο οποίο παραµένει τουλάχιστον για µία ώρα, µε ελαφρά ανάδευση. Στη συνέχεια, µεταφέρεται σε διάλυµα αποχρωµατισµού, το οποίο περιέχει 45% (v/v) µεθανόλη και 10% (v/v) οξικό οξύ, στο οποίο παραµένει και αναδεύεται µέχρι οι πρωτεϊνες να γίνουν εµφανείς και η εικόνα της πηκτής να θεωρηθεί ικανοποιητική. Σύµφωνα µε την δεύτερη µέθοδο [400], η πηκτή τοποθετείται σε διάλυµα 50% (v/v) µεθανόλης και αναδεύεται για τουλάχιστον µία ώρα. Έπειτα, το διάλυµα αντικαθίσταται µε νέο και η πηκτή παραµένει σ αυτό για άλλη µία ώρα. Στη συνέχεια, η πηκτή εµβαπτίζεται στο διάλυµα χρώσης, το οποίο αποτελείται από 0.8% (w/v) AgNO3, 0.02Μ ΝαΟΗ και 250mM ΝΗ4ΟΗ και παραµένει σ αυτό για 20 λεπτά µε ελαφρά ανάδευση. Ακολουθούν τρείς πλύσεις µε απεσταγµένο νερό, διάρκειας 10 λεπτών η κάθε µία και µετά η πηκτή εµβαπτίζεται στο διάλυµα εµφάνισης, που αποτελείται από 0.005% (w/v) κιτρικό οξύ και 0.05% (v/v) φορµαλδεϋδη (από αρχικό διάλυµα συγκέντρωσης 37%). Η πηκτή παραµένει στο διάλυµα εµφάνισης µέχρι η εικόνα της να θεωρηθεί ικανοποιητική, οπότε η χρώση διακόπτεται µε την προσθήκη διαλύµατος που περιέχει 45% (v/v) µεθανόλη και 1-3% (v/v) οξικό οξύ. Μετά την χρώση, οι πηκτές µπορούν να φωτογραφηθούν, να σαρωθούν σε Η/Υ ή να αποθηκευτούν στους 4 0 C. Η µέθοδος που χρησιµοποιείται σε κάθε περίπτωση εξαρτάται από την ποσότητα της πρωτεϊνης του δείγµατος, δεδοµένου ότι η χρώση µε νιτρικό άργυρο είναι περισσότερο ευαίσθητη από την χρώση µε Coomasie Brilliant Blue R-250. Επιπλέον, πηκτή που έχει βαφεί µε Coomasie Brilliant Blue R-250, εφόσον η εικόνα δεν θεωρηθεί ικανοποιητική, µπορεί να βαφεί στη συνέχεια µε τη µέθοδο του νιτρικού αργύρου. Σε αυτή την περίπτωση, η αποχρωµατίζεται και στη συνέχεια µεταφέρεται σε διάλυµα 50% (v/v) µεθανόλης, όπου παραµένει για µία νύχτα µε ελαφρά ανάδευση. Στη συνέχεια ακολουθεί η διαδικασία της χρώσης µε νιτρικό άργυρο που περιγράφεται πιο πάνω. 133

148 2.4 ΑΝΟΣΟΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Ηλεκτροµεταφορά πρωτεϊνων Μετά την ηλεκτροφόρηση γίνεται ηλεκτροµεταφορά των πρωτεϊνών σε µεµβράνη PVDF. Στην περίπτωση που η πηκτή προέρχεται από SDS-PAGE, το ρυθµιστικό διάλυµα περιέχει 25mM Tris-HCI, ph=8.3, 192 mμ γλυκίνη και 20% (v/v) µεθανόλη, και η συσκευσή ηλεκτροµεταφοράς συναρµολογείται όπως φαίνεται στην Εικόνα Στα άκρα της συσκευής εφαρµόζεται σταθερή τάση 100Volts ή εναλλακτικά σταθερή ένταση 350mA και η ηλεκτροµεταφορά διαρκεί µία ώρα. Στην περίπτωση που η πηκτή προέρχεται από όξινη ηλεκτροφόρηση, το διάλυµα ηλεκτροµεταφοράς περιέχει 0.7% (v/v) οξικό οξύ και 20% (v/v) µεθανόλη ενώ κατά την συναρµολόγηση της συσκευής αντιστρέφεται η πολικότητα [401]. Στα άκρα της συσκευής εφαρµόζεται σταθερή τάση 60Volts και η ηλεκτροµεταφορά διαρκεί µία ώρα. Μετά το τέλος της ηλεκτροµεταφοράς, η µεµβράνη PVDF µπορεί να χρησιµοποιηθεί για ανοσοανίχνευση την ίδια ηµέρα, ή αφού στεγνώσει ανάµεσα σε δύο φύλλα χαρτιού Whatman, να αποθηκευτεί στους 4 0 C για µελλοντική χρήση. Εικόνα Σχηµατική απεικόνιση του τρόπου συναρµολόγησης της συσκευής ηλεκτροµεταφοράς όταν η πηκτή προέρχεται από SDS-PAGE. Στην περίπτωση που η πηκτή προέρχεται από όξινη ηλεκτροφόρηση, αντιστρέφεται η πολικότητα της συσκευής. [Transfer apparatus assembly after SDS-PAGE. In the case of acetic acid-urea PAGE the polarity is reversed] 134

149 2.4.2 Ανοσοανίχνευση κατά Western Η µεµβράνη PVDF εµβαπτίζεται για ένα λεπτό σε µεθανόλη, ξεπλένεται για 5 λεπτά µε απεσταγµένο νερό και ακολουθούν δύο πλύσεις, διάρκειας 5 λεπτών η κάθε µία, µε διάλυµα PBS (140mΜ NaCl, 3mM KCl, 10mM Na2HPO4, 5mM KH2PO4, ph=7,4) που περιέχει 0,1% (v/v) Tween 20 (PBST). Στη συνέχεια, ακολουθεί επώαση σε διάλυµα PBST παρουσία 3% (w/v) BSA, ώστε να καλυφθούν οι µη ειδικές θέσεις που υπάρχουν στην µεµβράνη. Έπειτα, η µεµβράνη επωάζεται µε το αντίσωµα, το οποίο έχει προηγουµένως διαλυθεί στο παραπάνω διάλυµα, στην κατάλληλη αραίωση. Η αραίωση του αντισώµατος, ο χρόνος επώασης της µεµβράνης και η ακριβής σύσταση του διαλύµατος στο οποίο αυτό αραιώνεται, εξαρτώνται από τις οδηγίες που δίνονται κάθε φορά από τον παρασκευστή του. Την επώαση, που συνήθως διαρκεί µία ή δύο ώρες σε θερµοκρασία δωµατίου ή εναλλακτικά, µία νύχτα στους 4 0 C ακολουθούν τουλάχιστον τρείς, επαναλαµβανόµενες, πεντάλεπτες, πλύσεις της µεµβράνης µε PBST και τουλάχιστον δύο πλύσεις µε PBS. Στη συνέχεια, η µεµβράνη επωάζεται µε το δευτεροταγές αντίσωµα, το οποίο είναι είναι συζευγµένο µε ένζυµο που δίνει χρωµογόνο αντίδραση, συνήθως αλκαλική φωσφατάση ή υπεροξειδάση, ενώ η αραίωση του ποικίλει, όπως και του πρωτοταγούς αντισώµατος. Μετά το τέλος και της δεύτερης επώασης, η οποία διαρκεί συνήθως όσο και η πρώτη, ακολουθούν οι πλύσεις της µεµβράνης που περιγράφηκαν προηγουµένως και έπειτα ξεκινάει η διαδικασία εµφάνισης του αποτελέσµατος. Η διαδικασία εµφάνισης εξαρτάται από το ένζυµο µε το οποίο είναι συζευγµένο το δευτεροταγές αντίσωµα. - Αν το δευτεροταγές αντίσωµα είναι συζευγµένο µε αλκαλική φωσφατάση, τότε για την αντίδραση εµφάνισης χρησιµοποιείται ρυθµιστικό διάλυµα που περιέχει 100mM Tris-HCl, ph=9.2, 100mM NaCl και 50mM MgCl2, στο οποίο προστίθεται µίγµα NBT/BCIP σε τελική συγκέντρωση 2% (v/v). Η µεµβράνη επωάζεται µε το παραπάνω υπόστρωµα µέχρι η εικόνα της ανοσοανίχνευσης να θεωρηθεί ικανοποιητική, οπότε η αντίδραση διακόπτεται µε απεσταγµένο νερό. - Αν το δευτεροταγές αντίσωµα είναι συζευγµένο µε υπεροξειδάση, τότε η εµφάνιση µπορεί να γίνει µε δύο µεθόδους. Στην πρώτη µέθοδο χρησιµοποιείται µίγµα διαλύµατος DAB ( % (w/v) DAB διαλυµένο σε PBS) και διαλύµατος H2O2 (0.0504% (v/v) H2O2), σε αναλογία 50:1 (v/v), στο οποίο επωάζεται η µεµβράνη 135

150 µέχρι η εικόνα της ανοσοανίχνευσης να θεωρηθεί ικανοποιητική, οπότε η αντίδραση διακόπτεται µε απεσταγµένο νερό. Σύµφωνα µε τη δεύτερη µέθοδο, που είναι γνωστή ως χηµειοφωταύγεια, το αποτέλεσµα της ανοσοανίχνευσης αποτυπώνεται σε φωτογραφικό φίλµ. Χρησιµοποιείται µίγµα διαλύµατος p-κουµαρικού οξέος (11,12% (w/v) p-κουµαρικό οξύ διαλυµένο σε DMSO), διαλύµατος 3% (v/v) H2O2 και διαλύµατος λουµινόλης (0.0222% (w/v) λουµινόλη διαλυµένη σε 0,1Μ Tris-HCl, ph=8.5), σε αναλογία 1:3:1000 (v/v/v), µε το οποίο καλύπτεται η επιφάνεια της µεµβράνης. Η επώαση γίνεται µε ελαφρά ανάδευση για 1-5 λεπτά, έπειτα η µεµβράνη PVDF καλύπτεται µε πλαστική µεµβράνη και τοποθετείται µε φωτογραφικό φίλµ, µέσα στην κασέτα εµφάνισης. Μετά από έκθεση που διαρκεί 1-5 λεπτά, ακολουθεί η εµφάνιση και η µονιµοποιήση του φίλµ. Όλη η παραπάνω διαδικασία γίνεται µε µεγάλη προσοχή και σε σκοτεινό θάλαµο. Το πλεονέκτηµα αυτής της µεθόδου είναι ότι η µεµβράνη µπορεί να επαναχρησιµοποιηθεί µετά την εµφάνιση, αφού προηγουµένως πλυθεί, αρχικά µε PBS και στη συνέχεια για 45 λεπτά µε διάλυµα που περιέχει 25mM γλυκίνη, ph=2.5, 1% (w/v) SDS και 1% (v/v) Triton X

151 Για την ανοσοανίχνευση των διαφόρων ισοµορφών και τροποποιηµένων µορφών των ιστονών στην παρούσα εργασία, χρησιµοποιήθηκαν τα παρακάτω αντισώµατα: - πολυκλωνικά αντισώµατα που αναγνωρίζουν τη συνδετική ιστόνη Η1, τις κύριες ισοµορφές της Η1(Α+Β) και την ισοµορφή Η1 0, ευγενική προσφορά της Dr. L. Srebreva [402] - πολυκλωνικό αντίσωµα που αναγνωρίζει την ιστόνη Η2Α, ευγενική προσφορά του Αναπ. Καθ. Χρ. Παναγιωτίδη - µονοκλωνικό αντίσωµα που αναγνωρίζει την ουβικουιτινωµένη µορφή της ιστόνης Η2Α, ευγενική προσφορά του Dr. J. E. Celis [403] - µονοκλωνικό αντίσωµα που αναγνωρίζει την ιστόνη Η3, ευγενική προσφορά της ρ. Ε. Βρεττού [404] - πολυκλωνικό αντίσωµα που αναγνωρίζει την ιστόνη Η2Β, ευγενική προσφορά της ρ. Κ. Σέκερη [405] - πολυκλωνικό αντίσωµα που αναγνωρίζει την ακετυλιωµένη µορφή της ιστόνης Η4 (Serotek). - πολυκλωνικό αντίσωµα που αναγνωρίζει την ακετυλιωµένη µορφή της ιστόνης Η3 (Upstate Biotechnology). - πολυκλωνικά αντισώµατα που αναγνωρίζουν τις ακετυλιωµένες µορφές των νουκλεοσωµικών ιστονών (Acetyl-Histone Antibody Sampler Kit, Cell Signaling Technology). - πολυκλωνικά αντισώµατα που αναγνωρίζουν τις ακετυλιωµένες και φωσφορυλιωµένες µορφές της ιστόνης Η3 (Acetyl-Histone H3 Antibody Sampler Kit, Cell Signaling Technology). 137

152 2.5 ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ ΠΗΚΤΩΝ Μετά την ταυτοποίηση των ισοµορφών και των τροποποιηµένων µορφών των ιστονών, ακολουθεί η ποσοτική ανάλυση των πηκτών, η οποία γίνεται µε τη βοήθεια Η/Υ και του λογισµικού Gel Pro Analyzer 3.1 (Media Cybernetics). Οι πηκτές σαρώνονται στον Η/Υ και ακολουθεί η επεξεργασία της εικόνας στο παραπάνω λογισµικό, µε τη βοήθεια του οποίου µετράται η οπτική πυκνότητα κάθε ισοµορφής ή τροποποιηµένης µορφής όπως αυτή απεικονίζεται πάνω στην πηκτή, δηλαδή είτε ως µία ζώνη, σε πηκτή µίας διάστασης, είτε ως µία κηλίδα σε πηκτή που προκύπτει από δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση (Εικόνα 2.5.1). Με τη µέτρηση της οπτικής πυκνότητας κάθε ισοµορφής ή τροποποιηµένης µορφής µίας πρωτεϊνης είναι εφικτός ο έµµεσος υπολογισµός της ποσοστιαίας συµµετοχής της στην συνολική ποσότητα της πρωτεΐνης. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 2.5.2, η µέτρηση της οπτικής πυκνότητας είναι ανάλογη της ποσότητας της πρωτεϊνης, συνεπώς και αξιόπιστη, όταν η ποσότητα της πρωτεΐνης κυµαίνεται από 0,1-2µg. Επιπλέον, µε το παραπάνω λογισµικό µπορεί να υπολογιστεί το µοριακό βάρος µίας πρωτεΐνης εφόσον υπάρχει στην πηκτή µίγµα πρωτεϊνών γνωστού µοριακού βάρους (Εικόνα 2.5.3). Για να ελεγχεί η επαναληψιµότητα των αποτελεσµάτων, τα δείγµατα από κάθε αναπτυξιακή ζώνη ή ιστοκαλλιέργεια κάλλου, αναλύθηκαν σε τρία ανεξάρτητα πειράµατα, δηλαδή η καλλιέργεια φυτών-µαρτύρων, φυτών υπό την επιδραση φυτοορµονών καθώς και η δηµιουργία ιστοκαλλιεργειών κάλλων (πρωτογενών, δευτερογενών και τριτογενών) πραγµατοποιήθηκαν σε τρείς επαναλήψεις. Σε κάθε περίπτωση έγινε ξεχωριστά συλλογή του φυτικού υλικού, εκχύλιση και καθαρισµός των ιστονών και ηλεκτροφορητικός διαχωρισµός τους µε όξινη δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση. Συνεπώς από κάθε αναπτυξιακή ζώνη ή ιστοκαλλιέργεια κάλλου (πρωτογενούς, δευτερογενούς, τριτογενούς) προήλθαν τρείς πηκτές, οι οποιές σαρώθηκαν και αναλύθηκαν µε τη βοήθεια Η/Υ. Η τιµή της ποσοστιαίας συµµετοχής κάθε ισοµορφής ή τροποποιηµένης µορφής µίας τάξης ιστονών, όπως αυτή υπολογίστηκε έµµεσα από την µέτρηση της οπτικής της πυκνότητας, αποτελεί τον µέσο όρο τριών ανεξάρτητων πειραµάτων, ενώ υπολογίστηκε και η τυπική απόκλιση των µετρήσεων. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσµάτων της επεξεργασίας των πηκτών έγινε µε το κριτήριο t της κατανοµής Student, για δείγµατα µε διαφορετικούς µέσους όρους και διαφορετικές διακυµάνσεις. Μ αυτό τον τρόπο προσδιορίστηκαν 138

153 οι περιπτώσεις όπου υπάρχουν στατιστικά σηµαντικές µεταβολές στη ποσοστιαία συµµετοχή µίας ισοµορφής ή µίας τροποποιηµένης µορφής µίας ιστόνης µεταξύ δύο ή περισσοτέρων δειγµάτων. Εικόνα Η µέτρηση της οπτικής πυκνότητας (IOD) κάθε ισοµορφής ή/και τροποποιηµένης µορφής έγινε µε τη βοήθεια Η/Υ και του λογισµικού Gel Pro Analyzer 3.1 και στη συνέχεια υπολογίστηκε έµµεσα η ποσοστιαία συµµετοχή της στην τάξη ιστονών που ανήκει. [The optical density of each histone variant and modified form was measured by means of Gel Pro Analyzer 3.1 software and its ratio to the total histone class was indirectly estimated] 139

154 Εικόνα οκιµή της αξιοπιστίας του λογισµικού Gel Pro Analyzer 3.1. Γνωστές ποσότητες πρωτεϊνης (0,1µg-5µg) διαχωρίστηκαν µε SDS-PAGE και αφού η πηκτή σαρώθηκε σε Η/Υ υπολογίστηκε η οπτική πυκνότητα (IOD) κάθε ζώνης και σχεδιάστηκε η πρότυπη καµπύλη IOD/IOD(0,1µg) (η πρωτεϊνη που χρησιµοποιήθηκε στη δοκιµή ήταν histone II-A της Sigma). [Certain amounts (0,1µg-5µg) of protein (histone II-A, Sigma) were separated by SDS-PAGE, the gel was scanned and each band s optical density (IOD) was measured. Afterwards, the ratio IOD/IOD(0,1µg) was estimated in order to examine the reliability of Gel Pro Analyzer 3.1 software] Εικόνα Προσδιορισµός του Μοριακού Βάρους κάθε τάξης ιστονών. Για τον προσδιορισµό του Μ.Β χρησιµοποιήθηκε, ως πρότυπο, µίγµα πρωτεϊνών γνωστού Μ.Β. (rotein prestained markers, New England Biolabs) και ο υπολογισµός έγινε µε τη βοήθεια Η/Υ και του λογισµικού Gel Pro Analyzer 3.1. [Histone molecular mass determination after SDS-PAGE by means of protein prestained markers and Gel Pro Analyzer 3.1 software] 140

155 2.6 ΑΝΟΣΟΪΣΤΟΧΗΜΙΚΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Επεξεργασία των ιστών και λήψη τοµών Οι ρίζες αναπτύσσονται όπως έχει ήδη περιγραφεί και όταν αποκτούν το επιθυµητό µήκος (3-5 εκ.) αποκόβονται και τοποθετούνται σε φιαλίδια στα οποία προστίθεται διάλυµα µονιµοποίησης, η σύσταση του οποίου φαίνεται στον Πίνακα 8 [406]. Οι ρίζες παραµένουν στο διάλυµα µονιµοποίησης για µία ώρα υπό συνθήκες κενού αέρα και έπειτα το διάλυµα αντικαθίσταται µε νέο, στο οποίο παραµένουν για µία νύχτα στους 4 0 C. Στη συνέχεια, το διάλυµα αντικαθίσταται µε νέο, που δεν περιέχει παραφορµαλδεϋδη και γλουταραλδεϋδη και στο οποίο οι ρίζες παραµένουν για 30 λεπτά. Ακολουθεί η διαδικασία αφυδάτωσης των ιστών, µε διαδοχική τοποθέτησή τους σε διαλύµατα αυξανόµενων συγκεντρώσεων αιθανόλης (10%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90% και τρείς φορές 100%). Οι ιστοί παραµένουν για 20 λεπτά στο διάλυµα κάθε συγκέντρωσης, µε εξαίρεση το διάλυµα 50% (v/v) αιθανόλης, που περιέχει 5% (w/v) σαφρανίνη και όπου παραµένουν για µία νύχτα, όποτε γίνεται και η χρώση των ιστών, καθώς και στην καθαρή αιθανόλη, στην οποία παραµένουν για µία ώρα κάθε φορά. Αµέσως µετά την αφυδάτωση, οι ιστοί διαφανοποιούνται µε την τοποθέτησή τους σε διαλύµατα αυξανόµενων συγκεντρώσεων ξυλενίου/αιθανόλης (25%, 50%, 75% και τρείς φορές σε 100% ξυλένιο), όπου παραµένουν από µία ώρα στο διάλυµα κάθε συγκέντρωσης. Έπειτα, στα φιαλίδια που περιέχουν τις ρίζες µέσα σε ξυλένιο, προστίθεται παραφίνη, µέχρι να καταστεί κορεσµένο, αρχικά σε θερµοκρασία δωµατίου και στη συνέχεια στους 42 ο C. Τότε το µίγµα ξυλενίου/παραφίνης αντικαθίσταται µε λιωµένη (στους 60 ο C) και φιλτραρισµένη παραφίνη και τα φιαλίδια διατηρούνται σε σταθερή θερµοκρασία 60 ο C. Η παραφίνη αντικαθίσταται µε νέα κάθε 12 ώρες περίπου για τις επόµενες 10 µέρες. Έπειτα, το περιεχόµενο των φιαλιδίων µεταφέρεται σε τριβλία, οι ρίζες προσανατολίζονται κατά τον επιθυµητό τρόπο και αφού στερεοποιηθεί η παραφίνη, τα τριβλία αποθηκεύονται στους 4 ο C. Η λήψη των τοµών, πάχους 10µm, γίνεται µε χειροκίνητη ή αυτόµατη µικροτόµο και στη συνέχεια, οι τοµές τοποθετούνται σε αντικειµενοφόρους, οι οποίες έχουν προηγουµένως προετοιµαστεί κατάλληλα. Η προετοιµασία των αντικειµενοφόρων περιλαµβάνει τοποθέτηση σε διάλυµα 5%(w/v) SDS για τέσσερις ώρες, ξέπλυµα µε συνεχή ροή νερού βρύσης για δύο ώρες, τοποθέτηση σε διάλυµα HCl 10% (v/v) για τέσσερις ώρες, ξέπλυµα µε 141

156 αποσταγµένο νερό, αποστείρωση, επώαση µε διάλυµα 0.01% (w/v) πολυ-l-λυσίνης (Μ.Β , Sigma) σε 10mM Tris-HCl, ph=8 για 10λεπτά, πριν προλάβουν να στεγνώσουν, στέγνωµα σε θερµοκρασία δωµατίου και τέλος αποθήκευση στους 20 ο C. Μετά την λήψη των τοµών, οι αντικειµενοφόροι τοποθετούνται σε σε θερµή πλάκα, θερµοκρασίας 42 ο C, όπου παραµένουν τουλάχιστον για µία νύχτα. Στη συνέχεια εµβαπτίζονται διαδοχικά σε ξυλενίο για 30 λεπτά, διάλυµα ξυλενίου-αιθανόλης σε αναλογία 1:1 (v/v) για 20 λεπτά και σε αιθανόλη για 10 λεπτά, ώστε να αποµακρυνθεί η παραφίνη, αφήνονται να στεγνώσουν και αποθηκεύονται στους 20 ο C. Πίνακας 8 Σύσταση του διαλύµατος µονιµοποίησης των ιστών που πρόκειται να εγκλεισθούν σε παραφίνη [Fixation solution used in immunohistochemistry] Na2HPO4, ph=6,8 NaH2PO4, ph=6,8 NaCl 68,4mM 31,6mM 100mM Παραφορµαλδεϋδη 4% Γλουταραλδεϋδη 0,25% 142

157 2.6.2 Ανοσοϊστοχηµική ανίχνευση πρωτεϊνων Οι αντικειµενοφόροι µε τις τοµές τοποθετούνται σε δίσκους, η επιφάνειά τους καλύπτεται µε διάλυµα που αποτελείται από 3% (w/v) BSA διαλυµένο σε TBST και ακολουθεί επώαση για µία ώρα σε θερµοκρασία δωµατίου. Με τον ίδιο τρόπο προστίθεται στη συνέχεια το αντίσωµα, διαλυµένο στην κατάλληλη αραίωση σε TBST που περιέχει 1% (w/v) BSA και ακολουθεί επώαση για δύο ώρες σε θερµοκρασία δωµατίου ή εναλλακτικά, για µία νύχτα στους 4 ο C. Οι αντικειµενοφόροι ξεπλένονται για 15 λεπτά µε TBST, προστίθεται, µε τον ίδιο τρόπο, το δευτεροταγές αντίσωµα, το οποίο είναι συζευγµένο µε αλκαλική φωσφατάση, στην κατάλληλη αραίωση και ακολουθεί επώαση για δύο ώρες. Έπειτα, οι αντικειµενοφόροι ξεπλένονται για 15 λεπτά µε TBST και η επιφάνειά τους καλύπτεται µε το διάλυµα εµφάνισης, το όποιο έχει ήδη περιγραφεί στην προηγούµενη ενότητα. Η αντίδραση ελέγχεται ανά τακτά χρονικά διαστήµατα στο στερεοσκόπιο και διακόπτεται µε την προσθήκη απεσταγµένου νερού. Μετά το τέλος της εµφάνισης, οι τοµές αφυδατώνονται µε διαδοχική εµβάπτιση για ένα λεπτό σε διαλύµατα αυξανόµενων συγκεντρώσεων αιθανόλης (10%, 30%, 50%, 70%, 90% και 100%) και αφήνονται να στεγνώσουν. Στη συνέχεια, οι πλέον ευκρινείς τοµές φωτογραφίζονται µε τη βοήθεια ψηφιακής κάµερας και αποθηκεύονται σε θερµοκρασία δωµατίου. Για την ανοσοϊστοχηµική ανίχνευση των διαφόρων ισοµορφών και τροποποιηµένων µορφών των ιστονών στην παρούσα εργασία, χρησιµοποιήθηκαν τα παρακάτω αντισώµατα: - πολυκλωνικά αντισώµατα που αναγνωρίζουν τη συνδετική ιστόνη Η1, τις κύριες ισοµορφές της Η1(Α+Β) και την ισοµορφή Η1 0 [402] - µονοκλωνικό αντίσωµα που αναγνωρίζει την ουβικουιτινωµένη µορφή της ιστόνης Η2Α [403] - πολυκλωνικό αντίσωµα που αναγνωρίζει την ακετυλιωµένη µορφή της ιστόνης Η4 (Serotek) - πολυκλωνικό αντίσωµα που αναγνωρίζει την ακετυλιωµένη µορφή της ιστόνης Η3 (Upstate Biotechnology) - πολυκλωνικό αντίσωµα που αναγνωρίζει τη φωσφορυλιωµένη µορφή της ιστόνης Η3 (Acetyl-Histone H3 Sampler Kit, Cell Signaling Technology) 143

158 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 3.1 ΦΥΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ & ΕΚΧΥΛΙΣΗ ΤΩΝ ΙΣΤΟΝΩΝ Η ρίζα του καλαµποκιού αποτελεί ένα κατάλληλο βιολογικό σύστηµα για αναπτυξιακές µελέτες, δεδοµένου ότι οι τρείς αναπτυξιακές ζώνες της, η µεριστωµατική ζώνη, η ζώνη επιµήκυνσης και η ζώνη διαφοροποίησης, µπορούν εύκολα να διαχωριστούν. Το φυτικό υλικό που χρησιµοποιήθηκε στην παρούσα εργασία, όπως έχει ήδη αναφερθεί, µπορεί να χωριστεί σε τέσσερις κατηγορίες, τα φυτά-µάρτυρες, όπου η ρίζα αναπτύχθηκε υπό φυσιολογικές συνθήκες, οι ιστοκαλλιέργειες κάλλων, που δηµιουργήθηκαν από τµήµατα της ρίζας που αντιστοιχούν στις τρείς αναπτυξιακές ζώνες και αναπτύχθηκαν σε κατάλληλο θρεπτικό µέσο και από φυτά που αναπτύχθηκαν παρουσία αυξίνης και γιββεριλλίνης, φυτοορµονών που αντίστοιχα επάγουν ή αναστέλλουν την ανάπτυξη της ρίζας. Μετά τον διαχωρισµό των τρίων αναπτυξιακών ζωνών της ρίζας από φυτά-µάρτυρες και από φυτά που αναπτύχθηκαν παρουσία των φυτοορµονών και τη συλλογή ικανής ποσότητας από κάθε αναπτυξιακή ζώνη, καθώς και από κάθε ιστοκαλλιέργεια κάλλου (πρωτογενούς, δευετρογενούς, τριτογενούς) ακολούθησε η αποµόνωση των πυρήνων και στη συνέχεια η εκχύλιση των ιστονών µε 0,4Ν Η2SO4. 144

159 3.2 ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΚΑΙ ΑΝΟΣΟΑΝΊΧΝΕΥΣΗ ΤΩΝ ΙΣΤΟΝΩΝ Οι ιστόνες που εκχυλίστηκαν από κάθε αναπτυξιακή ζώνη της ρίζας και κάθε ιστοκαλλιέργεια κάλλου διαχωρίστηκαν ηλεκτροφορητικά µε τρείς διαφορετκούς τρόπους. Αρχικά ο διαχωρισµός έγινε µε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαµιδίου παρουσία SDS (SDS-PAGE). Με την παραπάνω µέθοδο, οι πρωτεϊνες διαχωρίζονται µε βάση το µοριακό τους βάρος, ο οποίος έγινε εφικτός µε τη βοήθεια του λογισµικού Gel Pro Analyzer 3.1 και χρησιµοποιώντας ως πρότυπο µίγµα πρωτεϊνών γνωστού µοριακού βάρους (protein prestained markers, New England Biolabs). Ακολούθησε ηλεκτροµεταφορά των πρωτεϊνών σε µεµβράνη PVDF και ανοσοανίχνευση των ιστονών µε τη βοήθεια των κατάλληλων αντισωµάτων (όπως έχει ήδη περιγραφεί στο Κεφάλαιο Υλικά και Μέθοδοι). Με βάση της παραπάνω µεθόδους ο διαχωρισµός και η ταυτοποίηση των ιστονών έγινε όπως φαίνεται στην Εικόνα 3.2.1A, δηλαδή: - οι συνδετικές ιστόνες Η1 διαχωρίζονται ως τρείς ζώνες, που τα µοριακά τους βάρη προσδιορίστηκαν σε 43-, 39- και 37 kda. Και οι τρείς αυτές ζώνες, αναγνωρίζονται από το αντίσωµα εναντίον της ολικής Η1. Επιπλέον, οι δύο πρώτες από αυτές αντιδρούν επίσης και µε το αντίσωµα εναντίον των ισοµορφών Η1(Α+Β) ενώ η τρίτη µε το αντίσωµα που αναγνωρίζει την ισοµορφή Η1 0 - οι ιστόνες Η2Α και Η2Β διαχωρίζονται ως µία διπλή ζώνη µε µοριακό βάρος περίπου 21 kda, όπως έδειξε η ανοσοανίχνευση µε τα αντίστοιχα αντισώµατα. Επιπλέον, το αντίσωµα εναντίον της Η2Α αναγνωρίζει και µία ζώνη µε µοριακό βάρος περίπου 30 kda, µε την οποία αντιδρά και το αντίσωµα εναντίον της ουβικουιτινωµένης µορφής της Η2Α - η ιστόνη Η3 ανιχνεύεται από το αντίστοιχο αντίσωµα ως µία ζώνη που το µοριακό της βάρος ανέρχεται σε 17 kda περίπου - και τέλος η ιστόνη Η4 ανιχνεύεται ως µία ζώνη µοριακού βάρους περίπου 13 kda. 145

160 Στη συνέχεια, οι ιστόνες διαχωρίστηκαν µε όξινη ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαµιδίου παρουσία οξικού οξέος και ουρίας, µέθοδο κατά την οποία οι πρωτεϊνες διαχωρίζονται µε βάση το λόγο φορτίο/µάζα. Όπως και στην προηγούµενη περίπτωση, ακολούθησε ηλεκτροµεταφορά των πρωτεϊνών σε µεµβράνη PVDF και ανοσοανίχνευση των ιστονών µε τη βοήθεια των κατάλληλων αντισωµάτων. Με βάση τις παραπάνω µεθόδους ο διαχωρισµός και η ταυτοποίηση των ιστονών έγινε όπως φαίνεται στις Εικόνες 3.2.1Β, δηλαδή: - οι συνδετικές ιστόνες Η1 διαχωρίζονται ως δύο ζώνες, οι οποίες αναγνωρίζονται από το αντίσωµα ενάντια στην ολική Η1. Η µία από αυτές τις ζώνες αντιδρά επίσης και µε το αντίσωµα ενάντια στις ισοµορφές Η1(Α+Β) ενώ η δεύτερη µε το αντίσωµα που αναγνωρίζει την ισοµορφή Η οι ιστόνες Η2Α και Η2Β διαχωρίζονται ως µία διπλή ζώνη, όπως και στην περίπτωση της SDS-PAGE. Επιπλέον, το αντίσωµα εναντίον της Η2Α αναγνωρίζει και µία ζώνη µε σαφώς µικρότερη κινητικότητα, που αντιστοιχεί στην ουβικουιτινωµένη µορφή της Η2Α. - οι ισοµορφές της ιστόνης Η3 διαχωρίζονται ως δύο ζώνες, µία εκ των οποίων, συγκεκριµένα αυτή µε τη µικρότερη κινητικότητα, είναι τριπλή, οι οποίες αντιδρούν µε το αντίσωµα εναντίον της ολικής Η3 και αντιστοιχούν στις δύο ισοµορφές της, Η3.1 και Η3.2. Από τις δύο επιπλέον ζώνες που υπάρχουν στην ισοµορφή Η3.2, η µία αναγνωρίζεται από το αντίσωµα ενάντια στην ακετυλιωµένη Η3, ενώ και οι δύο αντιδρούν µε το αντίσωµα ενάντια στη φωσφορυλιωµένη στη Ser10 H3. - και τέλος η ιστόνη Η4 ανιχνεύεται ως µία διπλή ζώνη, η οποία αποτελείται από τη µη τροποποιηµένη και την ακετυλιωµένη της µορφή. 146

161 Εικόνα Α. Ηλεκτροφορητικός διαχωρισµός των ιστονών σε πηκτή πολυακρυλαµιδίου παρουσία SDS (SDS-PAGE). Τα δείγµατα προέρχονται από τις τρείς αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας, ενώ µίγµα πρωτεϊνών γνωστού Μ.Β. (markers) χρησιµοποιείται για τον προσδιορισµό του Μ.Β. των ιστονών. Β. Ηλεκτροφορητικός διαχωρισµός των ιστονών σε πηκτή πολυακρυλαµιδίου παρουσία οξικού οξέος και ουρίας 6M (AU-PAGE). Τα δείγµατα προέρχονται από τις τρείς αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας. (Μ: µεριστωµατική ζώνη, Ε: ζώνη επιµήκυνσης, : ζώνη διαφοροποίησης). [Α. Histone separation in SDS containing polyacrylamide gel (SDS-PAGE). Samples are derived from each of the three developmental zones of the root and prestained protein markers are used in order to determine the molecular mass of each histone class B. Histone separation in acetic acid-urea polyacrylamide gel (AU- PAGE). Samples are derived from each of the three developmental zones of the root] 147

162 Εικόνα Α. Συγκρητική εικόνα της ανοσοανίχνευσης των ιστονών έπειτα από ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαµιδίου παρουσία SDS (SDS-PAGE). Κατά την ανοσοανίχνευση χρησιµοποιήθηκαν αντισώµατα που αναγνωρίζουν τις συνδετικές (ολική Η1, ισοµορφές Η1Α και Η1Β και ισοµορφή Η1 0 ) και τις νουκλεοσωµικές ιστόνες (Η2Α, Η2Β, Η3 και Η4). Β. Συγκρητική εικόνα της ανοσοανίχνευσης των ιστονών έπειτα από ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαµιδίου παρουσία οξικού οξέος και ουρίας 6Μ (AU-PAGE). Κατά την ανοσοανίχνευση χρησιµοποιήθηκαν αντισώµατα που αναγνωρίζουν τις συνδετικές ιστόνες (ολική Η1, ισοµορφές Η1Α και Η1Β και ισοµορφή Η1 0 ), τις νουκλεοσωµικές ιστόνες (Η2Α, Η2Β, Η3 και Η4) καθώς και τις τροποποιηµένες µορφές των ιστονών Η3 (φωσφορυλιωµένη και ακετυλιωµένη) και Η4 (ακετυλιωµένη). [A. Histone separation in SDS containing polyacrylamide gel (SDS-PAGE) and immunodetection of linker histones (total H1, H1A+B and H1 0 ) and core histones (H2A, H2B, H3 and H4) B. Histone separation in acetic acid-urea polyacrylamide gel (AU-PAGE) and immunodetection of linker histones (total H1, H1A+B and H1 0 ), core histones (H2A, H2B, H3 and H4) and modified forms of histone H3 (phosphorylated and acetylated) and histone H4 (acetylated)] 148

163 Για τον περαιτέρω διαχωρισµό των ισοµορφών και των τροποποιηµένων µορφών των ιστονών χρησιµοποιήθηκε δισδιάσταση ηλεκτροφόρηση σε σύστηµα οξικού οξέος-ουρίας-triton X-100/οξικού οξέοςουρίας-ctab (AUT/AUC -PAGE). Με την παραπάνω µέθοδο οι πρωτεϊνες διαχωρίζονται µε βάση τόσο τον λόγο φορτίο/µάζα, όσο και την ικανότητα πρόσδεσής τους σε µη ιοντικά απορρυπαντικά, όπως είναι το Triton X-100, που υπάρχει στην πηκτή της πρώτης διάστασης. Με αυτό τον τρόπο, δηλαδή µε τη χρήση δύο διαφορετικών ιδιοτήτων, επιτυγχάνεται ακόµη και ο διαχωρισµός πρωτεϊνών που σε πηκτή µίας διάστασης θα εµφανιζόταν ως µία ζώνη, επειδή π.χ. έχουν ίδιο λόγο φορτίου/µάζας. Και σε αυτή την περίπτωση, ακολούθησε ηλεκροµεταφορά των πρωτεϊνών σε µεµβράνη PVDF και ανοσοανίχνευση µε τη βοήθεια των κατάλληλων ανισωµάτων. Με βάση της παραπάνω µεθόδους ο διαχωρισµός και η ταυτοποίηση των ιστονών έγινε όπως φαίνεται στις Εικόνες και 3.2.4, δηλαδή: - οι συνδετικές ιστόνες ανιχνεύονται στην κεντρική περιοχή της πηκτής, στη θέση της νοητής διαγωνίου της πηκτής, πάνω από τις νουκλεοσωµικές ιστόνες (Εικόνα Β) - πάνω στη νοητή διαγώνιο της πηκτής και χαµηλότερα από τις συνδετικές ιστόνες, εντοπίζονται οι δύο ισοµορφές της ιστόνης Η2Β ( D) - κάτω από τη νοητή διαγώνιο της πηκτής εντοπίζονται οι κύριες ισοµορφές της ιστόνης Η2Α καθώς και η ουβικουιτινωµένη της µορφή, η οποία εµφανίζει σαφώς µικρότερη ηλεκτροφορητική κινητικότητα (Εικόνα C) - στην ίδια περιοχή της πηκτής ανιχνεύονται και οι δύο ισοµορφές της ιστόνης Η3, η µία από τις οποίες περιέχει και δύο τροποποιηµένες µορφές (Εικόνα Ε) - τέλος, στο κατώτατο άκρο της πηκτής ανιχνεύεται η ιστόνη Η4 και η τροποποιηµένη της µορφή (Εικόνα F). 149

164 Α. uη2α Η1 Η2B.1 Η2Α 1 2 Η3.2 Η3.1 Η2B.2 H4 B. Εικόνες Α. Αντιπροσωπευτική εικόνα ηλεκτροφορητικού διαχωρισµού των ιστονών µε δισδιάσταστη ηλεκτροφόρηση σε σύστηµα οξικού οξέος-ουρίας-triton X-100 / οξικού οξέος-ουρίας-ctab (AUT/AUC-PAGE). Β. Αντιπροσωπευτική λεπτοµερής εικόνα του διαχωρισµού των ισοµορφών και τροποποιηµένων µορφών των νουκλεοσωµικών ιστονών σε δείγµατα που προέρχονται από τη µεριστµατική ζώνη και τη ζώνη διαφοροποίησης. Οι ιστόνες Η2Α και Η2Β αποτελούνται από δύο ισοµορφές η κάθε µία (H2A.1, H2A.2 και H2B.1, H2B.2 αντίστοιχα). Η ιστόνη H3 έχει επίσης δύο ισοµορφές (H3.1 και H3.2) καθώς και δύο τροποποιηµένες µορφές που εντοπίζονται στην ισοµορφή Η3.2 (οι µη τροποποιηµένες, οι φωσφορυλιωµένες και οι φωσφο-ακετυλιωµένες µορφές της Η3 αποδίδονται στην εικόνα µε 0, 1 και 2 αντίστοιχα). Τέλος, η ιστόνη H4 αποτελείται από την µη τροποποιηµένη και την ακετυλιωµένη µορφή της (ach4). [A. A representative two-dimensional acetic acid-urea-triton X-100 / acetic acid-urea-ctab polyacrylamide gel (AUT/AUC-PAGE). B. Representative two-dimensional separation of each core histone s variants in samples derived from either meristematic (upper panel) or differentiation zone (lower panel). Histones H2A and H2B have two variants each (H2A.1, H2A.2 and H2B.1, H2B.2 respectively). Histone H3 has also two variants (H3.1 and H3.2) and two modified forms in H3.2 variant (unmodified, phosphorylated and phospho-acetylated forms of H3 are indicated by 0, 1 and 2 respectively). Finally, histone H4 has the unmodified and the acetylated form (indicated as ach4)] 150

165 Εικόνα Συγκρητική εικόνα της ανοσοανίχνευσης των ιστονών έπειτα από όξινη δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση (AUT/AUC-PAGE). Κατά την ανοσοανίχνευση χρησιµοποιήθηκαν αντισώµατα που αναγνωρίζουν τη συνδετική ιστόνη Η1 και τις νουκλεοσωµικές ιστόνες Η2Α, Η2Β, Η3 και Η4. [A representative two-dimensional AUT/AUC-PAGE gel and immunoblotting detection of histone H1, H2A, H2B, H3 and H4] 151

166 3.3 ΠΟΣΟΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ ΠΗΚΤΩΝ Μετά τον ηλεκτροφορητικό διαχωρισµό, την ανοσοανίχνευση και την ταυτοποίηση των ιστονών, ακολούθησε η επεξεργασία των πηκτών, η οποία έγινε µε τη βοήθεια Η/Υ και του λογισµικού Gel Pro Analyzer 3.1 (Media Cybernetics). Κάθε πηκτή, µετά τη χρώση, σαρώθηκε στον Η/Υ και η εικόνα της αναλύθηκε από το παραπάνω λογισµικό. Με τη βοήθεια του Gel Pro Analyzer 3.1 και χρησιµοποιώντας ως πρότυπο µίγµα πρωτεϊνών γνωστού Μοριακού Βάρους (protein prestained markers, New England Biolabs), έγινε εφικτός ο προσδιορισµός του Μοριακού Βάρους των πρωτεϊνών που είχαν διαχωριστεί µε SDS-PAGE, που περιγράφηκε αναλυτικά στην προηγούµενη ενότητα. Ακολούθησε η επεξεργασία των πηκτών που προερχόταν από όξινη δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση, κατά την οποία, µε τη βοήθεια του παραπάνω λογισµικού µετράται η οπτική πυκνότητα κάθε ισοµορφής ή τροποποιηµένης µορφής και επιτυγχάνεται ο έµµεσος υπολογισµός της ποσοστιαίας συµµετοχής της στην συνολική ποσότητα της πρωτεϊνης. Όπως έχει ήδη περιγραφεί αναλυτικά στο Κεφάλαιο Υλικά και Μέθοδοι, κάθε δείγµα στην παρούσα εργασία αναλύθηκε σε τρία ανεξάρτητα πειράµατα (δηλαδή συλλογή φυτικού υλικού, αποµόνωση ιστονών, δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση, ανάλυση πηκτής) και για κάθε ισοµορφή και τροποποιηµένη µορφή υπολογίστηκε ο µέσος όρος και η τυπική απόκλιση των τριών µετρήσεων. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσµάτων έγινε µε τη βοήθεια του κριτηρίου t της κατανοµής Student (Student s t-test) για δείγµατα µε διαφορετικούς µέσους και διακυµάνσεις. 152

167 3.3.1 Κατανοµή των ισοµορφών της ιστόνης Η1 Ο ηλεκτροφορητικός διαχωρισµός των ιστονών και η ανοσοανίχνευση, µε τη βοήθεια των κατάλληλων αντισωµάτων, που ακολούθησε, οδήγησαν στην ταυτοποίηση των ισοµορφών της συνδετικής ιστόνης Η1. Συγκεκριµένα, ανοσοανίχνευση έπειτα από SDS-PAGE έδειξε ότι τρείς ζώνες, που το µοριακό τους βάρος προσδιορίστηκε σε 43-, 40- και 37 kda αντίστοιχα, αντιδρούν µε το αντίσωµα που αναγνωρίζει την ολική Η1. Οι δύο πρώτες αντιδρούν επίσης µε το αντίσωµα ενάντια στις ισοµορφές της Η1(Α+Β), ενώ η τρίτη ζώνη αντιδρά µε το αντίσωµα που αναγνωρίζει την ισοµορφή Η1 0 (Εικόνα ). Αντίστοιχα, σε όξινη ηλεκτροφόρηση οι συνδετικές ιστόνες ανιχνεύονται δύο ζώνες, από τις οποίες η µία αντιδρά µε το αντίσωµα που αναγνωρίζει τις κύριες ισοµορφές της Η1, Η1(Α+Β), και η άλλη µε αυτό που αναγνωρίζει την ισοµορφή Η1 0, ενώ και οι δύο αναγνωρίζονται από το αντίσωµα ενάντια στην ολική Η1 (Εικόνα ). Τέλος, ανοσοανίχνευση µε το αντίσωµα ενάντια στην ολική Η1 έπειτα από όξινη δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση έδειξε πως οι συνδετικές ιστόνες εντοπίζονται στη θέση της νοητής διαγωνίου, στην κεντρική περιοχή της πηκτής, πάνω από τις νουκλεοσωµικές ιστόνες (Εικόνα ). Η ανάλυση, µε τη βοήθεια Η/Υ, των πηκτών όξινης δισδιάστατης ηλεκτροφόρησης από δείγµατα που προήλθαν από τις τρείς αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας και η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσµάτων που ακολούθησε, οδήγησαν στον έµµεσο προσδιορισµό των ποσοστιαίων συµµετοχών των ισοµορφών της συνδετικής ιστόνης Η1 σε κάθε αναπτυξιακή ζώνη. Σύµφωνα µε τον Πίνακα 3.3.1, στα δείγµατα από τη µεριστωµατική ζώνη οι κύριες ισοµορφές Η1Α και Η1Β αποτελούν περίπου το 42% και 32% αντίστοιχα της ολικής Η1, ενώ η ισοµορφή Η1 0 αποτελεί περίπου το 26%. Το παραπάνω πρότυπο, µε ελάχιστες µεταβολές, διατηρείται και στη ζώνη επιµήκυνης, όπου οι ισοµορφές Η1Α, Η1Β και Η1 0 αποτελούν αντίστοιχα το 41%, το 34% και το 25% περίπου της ολικής Η1. Αντίθετα, στα δείγµατα από τη ζώνη διαφοροποίησης, η ποσοστιαία συµµετοχή της ισοµορφής Η1Α µειώνεται στο 35%, η συµµετοχή της ισοµορφής Η1Β παραµένει σταθερή στο 31% περίπου, ενώ η συµµετοχή της ισοµορφής Η1 0 αυξάνεται στο 34% της ολικής Η1. Συνοπτικά, κατά τη διαφοροποίηση των φυτικών κυττάρων στις αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας του καλαµποκιού, αυξάνεται σηµαντικά η ποσοστιαία συµµετοχή της ισοµορφής Η1 0, ενώ µειώνεται η συµµετοχή της ισοµορφής Η1Α. 153

168 Η ανάλυση των πηκτών από δείγµατα ιστοκαλλιεργειών κάλλων (πρωτογενών, δευτερογενών και τριτογενών) που προήλθαν από τις τρείς αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας, έδειξε ότι η κατανοµή των ισοµορφών της συνδετικής ιστόνης Η1 µεταβάλλεται επίσης και κατά την αποδιαφοροποίηση των φυτικών κυττάρων. Συγκεκριµένα, στα δείγµατα από ιστοκαλλιέργειες που προήλθαν από την µεριστωµατική ζώνη, οι κύριες ισοµορφές Η1Α και Η1Β αποτελούν το 41% και 33% ενώ η ισοµορφή Η1 0 το 26% περίπου της ολικής Η1. Το παραπάνω πρότυπο κατανοµής παραµένει σταθερό τόσο στα δείγµατα από ιστοκαλλιέργειες που προήλθαν από τη ζώνη επιµήκυνσης, όσο και στα δείγµατα από ιστοκαλλιέργειες που προήλθαν από τη ζώνη διαφοροποίησης. Με άλλα λόγια, το πρότυπο κατανοµής των συνδετικών ιστονών στις ιστοκαλλιέργειες κάλλων είναι παρόµοιο µε το αντίστοιχο της µεριστωµατικής ζώνης της ρίζας των φυτών-µαρτύρων, ανεξάρτητα από την αναπτυξιακή ζώνη από την οποία προήλθαν οι ιστοκαλλιέργειες κάλλων. Η ανάλυση των πηκτών από δείγµατα που προήλθαν από τις τρείς αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας φυτών που αναπτύχθηκαν παρουσία αυξίνης, σε σύγκριση µε αυτά που αναπτύχθηκαν υπό φυσιολογικές συνθήκες, έδειξε ότι η κατανοµή των ισοµορφών της συνδετικής ιστόνης Η1 µεταβάλλεται σηµαντικά και σε αυτή την περίπτωση. Συγκεκριµένα, στα δείγµατα που προέρχονται από τη µεριστωµατική ζώνη, η ποσοστιαία συµµετοχή της ισοµορφής Η1Α εµφανίζεται µειωµένη σε σχέση µε τους µάρτυρες, δεδοµένου ότι αποτελεί το 36% της ολικής Η1, η συµµετοχή της ισοµορφής Η1Β διατηρείται στο 34%, ενώ η συµµετοχή της ισοµορφής Η1 0 ξεπερνά το 30% της ολικής Η1, συµµετοχή παρόµοια µε αυτή που εµφανίζει στα δείγµατα από τη ζώνη διαφοροποίησης των µαρτύρων. Με µικρές διακυµάνσεις στις αναλογίες των ισοµορφών Η1Α και Η1Β, το παραπάνω πρότυπο κατανοµής διατηρείται και στα δείγµατα από τη ζώνη επιµήκυνσης και τη ζώνη διαφοροποίησης, µε τη ποσοστιαία συµµετοχή της ισοµορφής Η1 0 να υπερβαίνει σταθερά το 30% της ολικής Η1. Μεταβολές στο πρότυπο κατανοµής της ιστόνης Η1 παρατηρήθηκαν επίσης κατά την ανάλυση των πηκτών από δείγµατα που προήλθαν από τις τρείς αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας φυτών που αναπτύχθηκαν παρουσία γιββεριλλίνης. Συγκεκριµένα, στα δείγµατα από τη µεριστωµατική ζώνη οι κύριες ισοµορφές Η1Α και Η1Β και η ισοµορφή Η1 0 αποτελούν περίπου το 45%, το 30% και το 25% της ολικής Η1. Το παραπάνω πρότυπο, µε 154

169 µικρές διακυµάνσεις, διατηρείται σταθερό στη ζώνη επιµήκυνσης, και µεταβάλλεται στη ζώνη διαφοροποίησης, όπου η ποσοστιαία συµµετοχή της ισοµορφής Η1Α µειώνεται στο 40%, η συµµετοχή της Η1Β αυξάνεται στο 32% και η συµµετοχή της Η1 0 στο 28% της ολικής Η1. Συνοπτικά θα µπορούσαµε να πούµε πως, σύµφωνα µε την ανάλυση των πηκτών, κατά τη διαφοροποίηση των φυτικών κυττάρων στις τρείς αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας του καλαµποκιού, αυξάνεται σηµαντικά η ποσοστιαία συµµετοχή της ισοµορφής Η1 0, ενώ µειώνεται η συµµετοχή της ισοµορφής Η1Α. Κατά την αποδιαφοροποίηση των φυτικών κυττάρων στις ιστοκαλλιέργειες κάλλων, το πρότυπο κατανοµής των συνδετικών ιστονών είναι παρόµοιο µε το αντίστοιχο της µεριστωµατικής ζώνης των µαρτύρων, ανεξάρτητα από την αναπτυξιακή ζώνη από την οποία προήλθαν οι κάλλοι. Αντίθετα, το πρότυπο κατανοµής των ισοµορφών της ιστόνης Η1 κατά την διαφοροποίηση των φυτικών κυττάρων παρουσία αυξίνης είναι παρόµοιο µε το πρότυπο κατανοµής της ζώνης διαφοροποίησης των µαρτύρων. Τέλος, κατά την διαφοροποίηση των φυτικών κυττάρων παρουσία γιββεριλλίνης, το πρότυπο κατανοµής των ισοµορφών της Η1 εµφανίζει οµοιότητες µε αυτό της µεριστωµατικής ζώνης και της ζώνης επιµήκυνσης των µαρτύρων. Εικόνα Χαρακτηριστική εικόνα πηκτής από όξινη ηλεκτροφόρηση και ανοσοανίχνευση της συνδετικής ιστόνης Η1, των κύριων ισοµορφών Η1Α και Η1Β και της ισοµορφής Η1 0. [A representative acetic acid-urea polyacrylamide gel and immunoblotting detection of total histone H1, main linker histone variants H1A and H1B and linker histone variant H1] 155

170 Εικόνα Χαρακτηριστική εικόνα πηκτής από SDS-PAGE (Α) και ανοσοανίχνευση της συνδετικής ιστόνης Η1 (B), των κύριων ισοµορφών Η1Α και Η1Β (C) και της ισοµορφής Η1 0 (D). [A representative SDS-PAGE gel (A) and immunoblotting detection of total histone H1 (B), main linker histone variants H1A and H1B (C) and linker histone variant H1 0 (D)] Εικόνα Χαρακτηριστική εικόνα πηκτής από όξινη δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση (AUT/AUC-PAGE) και ανοσοανίχνευση της συνδετικής ιστόνης Η1. [A representative two-dimensional AUT/AUC-PAGE gel and immunoblotting detection of linker histone H1] 156

171 Πίνακας Ποσοστιαία συµµετοχή των κύριων ισοµορφών Η1Α, Η1Β και της ισοµορφής Η1 0 της συνδετικής ιστόνης Η1 σε κάθε µία από τις τρείς αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας του καλαµποκιού σε δείγµατα που προέρχονται από φυτά-µάρτυρες, από ιστοκαλλιέργειες κάλλων (µέσοι όροι των τιµών των πρωτογενών, δευτερογενών και τριτογενών κάλλων) και από φυτά που αναπτύχθηκαν παρουσία αυξίνης και παρουσία γιββεριλλίνης. Κάθε τιµή είναι ο µέσος όρος των µετρήσεων τριών ανεξάρτητων πειραµάτων και συνυπολογίζεται η τυπική απόκλιση. Με αστερίσκο επισηµαίνονται οι τιµές που διαφέρουν σηµαντικά (τιµή P<0,05 µε βάση το κριτήριο t της κατανοµής Student) σε σχέση µε αυτές της µεριστωµατικής ζώνης των µαρτύρων. [Linker histone variants H1A, H1B and H1 0 ratio to total H1 in samples derived from the developmental zones of maize root, callus cultures derived from each zone and from the developmental zones of roots treated with auxin and gibberellins. Each value is the average of three independent experiments and bars indicate the standard deviation of the measurement. Values significantly different at p<0.05 from corresponding values measured in samples derived from the meristematic zone of control roots are indicated by asterisks] Μάρτυρες Μ Ε Η1A 41,5% ,5% + 1,5 35,5% + 1,5 * H1B 31,5% % + 1,5 31% + 0,5 H1 0 27% + 0,5 25,5% + 0,5 33,5% + 1 * Κάλλοι Μ Ε Η1A 40,5% + 0,5 40% + 0,5 40% + 0,5 H1B 34% + 0,5 34,5% + 1,5 34% + 0,5 H1 0 25,5% + 0,5 25,5% + 1,5 26% + 1 Αυξίνη Μ Ε Η1A 36% + 1,5 * 38% + 1,5 * 38% + 1,5 * H1B 34% + 3,5 30% + 3,5 28% + 3 H1 0 30% + 2,5 32% + 2,5 * 34% + 2,5 * Γιββεριλλίνη Μ Ε Η1A 46% + 2,5 * 48,5% + 3 * 39,5% + 3,5 H1B 30% ,5% % + 2 H1 0 24% + 2,5 23% + 2,5 28,5%

172 Εικόνα Συγκριτική απεικόνιση της ποσοστιαίας συµµετοχής των κύριων ισοµορφών Η1Α και Η1Β και της ισοµορφής Η1 0 της συνδετικής ιστόνης Η1 σε κάθε µία από τις τρείς αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας του καλαµποκιού σε δείγµατα που προέρχονται από φυτά-µάρτυρες, από ιστοκαλλιέργειες κάλλων (πρωτογενείς, δευτερογενείς και τριτογενείς κάλλοι απεικονίζονται συνολικά στο ίδιο ραβδόγραµµα) και από φυτά που αναπτύχθηκαν παρουσία αυξίνης και παρουσία γιββεριλλίνης. Κάθε τιµή είναι ο µέσος όρος των µετρήσεων τριών ανεξάρτητων πειραµάτων και συνυπολογίζεται η τυπική απόκλιση. Με αστερίσκο επισηµαίνονται οι τιµές που διαφέρουν σηµαντικά (τιµή P<0,05 µε βάση το κριτήριο t της κατανοµής Student) σε σχέση µε αυτές της µεριστωµατικής ζώνης των µαρτύρων. [Linker histone variants H1A, H1B and H10 ratio to total H1 in samples derived from the developmental zones of maize root, callus cultures derived from each zone and from the developmental zones of roots treated with auxin and gibberellins. Each value is the average of three independent experiments and bars indicate the standard deviation of the measurement. Values significantly different at p<0.05 from corresponding values measured in samples derived from the meristematic zone of control roots are indicated by asterisks] 158

173 3.3.2 Κατανοµή των ισοµορφών της ιστόνης Η2Α Με τον ίδιο τρόπο, δηλαδή µε ηλεκτροφόρηση και ανοσοανίχνευση, διαχωρίστηκαν και ταυτοποιήθηκαν οι ισοµορφές της ιστόνης Η2Α καθώς και η ουβικουιτινωµένη µορφή της. Συγκεκριµένα, ανοσοανίχνευση έπειτα από SDS-PAGE έδειξε ότι δύο ζώνες, µε µοριακό βάρος 21- και 30 kda αντίστοιχα, αντιδρούν µε το αντίσωµα που αναγνωρίζει την ιστόνη Η2Α, ενώ η ζώνη µε µοριακό βάρος 30 kda αντιδρά επίσης µε το αντίσωµα που αναγνωρίζει την ουβικουιτινωµένη µορφή της Η2Α (Εικόνα ). Η ανοσοανίχνευση έπειτα από όξινη δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση έδειξε πως η ιστόνη Η2Α εντοπίζεται κάτω από τη νοητή διαγώνιο της πηκτής, ενώ η ουβικουιτινωµένη µορφή της εντοπίζεται πάνω από τις κύριες ισοµορφές (Εικόνα ). Η ανάλυση των πηκτών δισδιάστατης ηλεκτροφόρησης από δείγµατα που προήλθαν από τις τρείς αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας και η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσµάτων που ακολούθησε, οδήγησαν στον έµµεσο προσδιορισµό των ποσοστιαίων συµµετοχών των ισοµορφών της ιστόνης Η2Α και της ουβικουιτινωµένης µορφής της σε κάθε αναπτυξιακή ζώνη. Σύµφωνα µε αποτελέσµατα που παρουσιάζονται στον Πίνακα 3.3.2, στα δείγµατα από τη µεριστωµατική ζώνη οι κύριες ισοµορφές Η2Α.1 και Η2Α.2 αποτελούν αντίστοιχα το 48% και 32% της ολικής Η2Α, ενώ η ουβικουιτινωµένη µορφή της Η2Α (uη2α) αποτελεί το 20% περίπου της ολικής Η2Α. Το παραπάνω πρότυπο, µε µικρές διακυµάνσεις, διατηρείται και στα δείγµατα από τη ζώνη επιµήκυνσης, όπου οι συµµετοχές των Η2Α.1 και Η2Α.2 ανέρχονται σε 46% και 32% αντίστοιχα, ενώ της uη2α σε 22%. Αντίθετα, στα δείγµατα από τη ζώνη διαφοροποίησης η ποσοστιαία συµµετοχή της ουβικουιτινωµένης µορφής της Η2Α µειώνεται στο 12% περίπου και αντίστοιχα αυξάνεται ελαφρώς η συµµετοχή των Η2Α.1 και Η2Α.2, οι οποίες στη ζώνη αυτή αποτελούν αντίστοιχα το 52% και 36% περίπου της ολικής Η2Α. Η ανάλυση των πηκτών από δείγµατα που προήλθαν από ιστοκαλλιέργειες κάλλων που αντιπροσωπεύουν τις τρείς αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας, έδειξε ότι η κατανοµή των ισοµορφών της ιστόνης Η2Α µεταβάλλεται επίσης και κατά την αποδιαφοροποίηση των φυτικών κυττάρων. Συγκεκριµένα, στα δείγµατα από πρωτογενείς ιστοκαλλιέργειες κάλλων που προήλθαν από τη µεριστωµατική ζώνη και τη ζώνη επιµήκυνσης, οι ισοµορφές Η2Α.1 και Η2Α.2 αποτελούν περίπου το 46% και 34% της ολικής Η2Α, ενώ η uh2a 159

174 αποτελεί το 20% περίπου της ολικής Η2Α, δηλαδή το πρότυπο κατανοµής είναι παρόµοιο µε αυτό της µεριστωµατικής ζώνης των µαρτύρων. Το παραπάνω πρότυπο µεταβάλλεται σε δείγµατα από ιστοκαλλιέργειες κάλλων που προήλθαν από τη ζώνη διαφοροποίησης, όπου η συµµετοχή της ισοµορφής Η2Α.1 µειώνεται στο 39% περίπου της ολικής Η2Α, η συµµετοχή της ισοµορφής Η2Α.2 παραµένει σταθερή στο 34%, ενώ η συµµετοχή της uη2α αυξάνεται στο 27% της ολικής Η2Α. Σε αντίθεση µε τις πρωτογενείς ιστοκαλλιέργειες κάλλων, στα δείγµατα από τις δευτερογενείς και τριτογενείς ιστοκαλλιέργειες κάλλων το πρότυπο κατανοµής των ισοµορφών και της ουβικουιτινωµένης µορφής της Η2Α, µε µικρές διακυµάνσεις, είναι παρόµοιο µε αυτό των δειγµάτων από τη µεριστωµατική ζώνη των µαρτύρων, δηλαδή οι κύριες ισοµορφές Η2Α.1 και Η2Α.2 και η uη2α αποτελούν αντίστοιχα το 48%, το 32% και το 20% της ολικής Η2Α. Η ανάλυση των πηκτών από δείγµατα που προήλθαν από τις τρείς αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας φυτών που αναπτύχθηκαν παρουσία αυξίνης, έδειξε ότι η κατανοµή των ισοµορφών ιστόνης Η2Α µεταβάλλεται και σε αυτή την περίπτωση. Συγκεκριµένα, στα δείγµατα από τη µεριστωµατική ζώνη η ποσοστιαία συµµετοχή της ισοµορφής Η2Α.1 είναι αυξηµένη σε σχέση µε τους µάρτυρες και ανέρχεται στο 64% της ολικής Η2Α, η συµµετοχή της ισοµορφής Η2Α.2 µειώνεται, σε σχέση µε τους µάρτυρες, στο 23%, ενώ η συµµετοχή της ουβικουιτινωµένης µορφής της Η2Α βρίσκεται στα επίπεδα της ζώνης διαφοροποίησης των µαρτύρων, δηλαδή αποτελεί το 13% περίπου της ολικής Η2Α. Το παραπάνω πρότυπο διατηρείται τόσο στα δείγµατα από τη ζώνη επιµήκυνσης, όσο και στα δείγµατα από τη ζώνη διαφοροποίησης. Τέλος, µεταβολές στην κατανοµή των ισοµορφών της ιστόνης Η2Α παρατηρήθηκαν και κατά την ανάλυση των πηκτών από δείγµατα που προήλθαν από τις τρείς αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας φυτών που αναπτύχθηκαν παρουσία γιββεριλλίνης. Συγκεκριµένα, όπως και στην περίπτωση των φυτών που αναπτύχθηκαν παρουσία αυξίνης, η ποσοστιαία συµµετοχή της ισοµορφής Η2Α.1 ανέρχεται στο 60% της ολικής Η2Α σε όλες τις αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας. Η συµµετοχή της ισοµορφής Η2Α.2 εµφανίζεται µειωµένη σε σχέση µε τους µάρτυρες και αποτελεί στη µεριστωµατική ζώνη το 21% περίπου της ολικής Η2Α, ενώ στη ζώνη επιµήκυνσης και στη ζώνη διαφοροποίησης το 26% της ολικής Η2Α. Τέλος, η συµµετοχή της ουβικουιτινωµένης µορφής της Η2Α στη µεριστωµατική ζώνη κυµαίνεται στο επίπεδο των µαρτύρων, δηλαδή 160

175 αποτελεί το 19% περίπου της ολικής Η2Α, ενώ στη ζώνη επιµήκυνσης και στη ζώνη διαφοροποίησης κυµαίνεται στα επίπεδα της ζώνης διαφοροποίησης των µαρτύρων, δεδοµένου ότι αποτελεί το 13% της ολικής Η2Α. Συνοπτικά θα µπορούσαµε να πούµε πως, σύµφωνα µε την ανάλυση των πηκτών, κατά τη διαφοροποίηση των φυτικών κυττάρων στις τρείς αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας του καλαµποκιού, µειώνεται σηµαντικά η ποσοστιαία συµµετοχή της ουβικουιτινωµένης µορφής της Η2Α, ενώ αυξάνεται ελαφρά η συµµετοχή της ισοµορφής Η2Α.1. Κατά την αποδιαφοροποίηση των φυτικών κυττάρων στις ιστοκαλλιέργειες κάλλων, το πρότυπο κατανοµής των συνδετικών ιστονών είναι παρόµοιο µε το αντίστοιχο της µεριστωµατικής ζώνης των µαρτύρων, ανεξάρτητα από την αναπτυξιακή ζώνη από την οποία προήλθαν οι κάλλοι, µε εξαίρεση τις πρωτογενείς ιστοκαλλιέργειες που προέρχονται από τη ζώνη διαφοροποίησης, όπου παρατηρείται σηµαντική αύξηση της συµµετοχής της uh2a. Κατά την διαφοροποίηση των φυτικών κυττάρων τόσο παρουσία αυξίνης, όσο και παρουσία γιββεριλλίνης, παρατηρείται σηµαντική αύξηση της ποσοστιαίας συµµετοχής της ισοµορφής Η2Α.1 και αντίστοιχη µείωση των συµµετοχών της Η2Α.2 και της uh2a. 161

176 Εικόνα Χαρακτηριστική εικόνα πηκτής από SDS-PAGE (Α) και ανοσοανίχνευση της ουβικουιτινωµένης µορφής της ιστόνης Η2Α (B) και της ολικής ιστόνης Η2Α (C). [A representative SDS-PAGE gel (A) and immunoblotting detection of ubiquitinated form of histone H2A (B) and total histone H2A (C)] Εικόνα Χαρακτηριστική εικόνα πηκτής από όξινη δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση (AUT/AUC-PAGE) και ανοσοανίχνευση της ιστόνης Η2Α. [A representative two-dimensional AUT/AUC-PAGE gel and immunoblotting detection of histone H2A] 162

177 Πίνακας Ποσοστιαία συµµετοχή των κύριων ισοµορφών Η2Α.1 και Η2Α.2 και της ουβικουιτινωµένης µορφής της ιστόνης Η2Α σε κάθε µία από τις τρείς αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας του καλαµποκιού σε δείγµατα που προέρχονται από φυτά-µάρτυρες, από ιστοκαλλιέργειες κάλλων και από φυτά που αναπτύχθηκαν παρουσία αυξίνης και παρουσία γιββεριλλίνης. Κάθε τιµή είναι ο µέσος όρος των µετρήσεων τριών ανεξάρτητων πειραµάτων και συνυπολογίζεται η τυπική απόκλιση. Με αστερίσκο επισηµαίνονται οι τιµές που διαφέρουν σηµαντικά (τιµή P<0,05 µε βάση το κριτήριο t της κατανοµής Student) σε σχέση µε αυτές της µεριστωµατικής ζώνης των µαρτύρων. [Histone H2A variants H2A.1 and H2A.2 and ubiquitinated H2A ratio to total H2A in samples derived from the developmental zones of maize root, callus cultures derived from each zone and from the developmental zones of roots treated with auxin and gibberellins. Each value is the average of three independent experiments and bars indicate the standard deviation of the measurement. Values significantly different at p<0.05 from corresponding values measured in samples derived from the meristematic zone of control roots are indicated by asterisks] Μάρτυρες Μ Ε Η2A.1 48% % + 2,5 52% + 4 H2A.2 32% + 3,5 31,5% ,5% + 1,5 uh2a 20% + 0,5 22,5% + 1,5 12,5% + 2 * Πρωτογενείς Κάλλοι Μ Ε Η2A.1 45% ,5% + 2,5 39,5% + 2,5 * H2A.2 36% + 1,5 32% ,5% + 2 uh2a 19% + 0,5 21,5% + 2,5 27% + 0,5 * ευτερογενείς και τριτογενείς Κάλλοι Μ Ε Η2A.1 50% ,5% + 2,5 46,5% +1,5 H2A.2 31% + 1,5 32,5% ,5% + 0,5 uh2a 19% % % + 0,5 Αυξίνη Μ Ε Η2A.1 64,5% + 2 * 64% + 3 * 64% + 3 * H2A.2 23% + 2 * 23% + 3 * 22% + 2,5 * uh2a 12,5% + 2,5 * 13% + 0,5 * 14% + 1,5 * Γιββεριλλίνη Μ Ε Η2A.1 60,5% + 2 * 61% + 1 * 60% + 0,5 * H2A.2 21% + 1 * 25,5% + 1 * 26,5% + 1,5 * uh2a 18,5% + 1,5 13,5% + 1 * 13,5% + 1,5 * 163

178 Εικόνα Συγκριτική απεικόνιση της ποσοστιαίας συµµετοχής των κύριων ισοµορφών Η2Α.1 και Η2Α.2 και της ουβικουιτινωµένης µορφής (uh2a) της ιστόνης Η2Α σε κάθε µία από τις τρείς αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας του καλαµποκιού σε δείγµατα που προέρχονται από φυτά-µάρτυρες, από ιστοκαλλιέργειες κάλλων (στο ραβδόγραµµα απεικονίζονται οι δευτερογενείς και οι τριτογενείς κάλλοι) και από πού αναπτύχθηκαν παρουσία αυξίνης και παρουσία γιββεριλλίνης. (Κάθε τιµή είναι ο µέσος όρος των µετρήσεων τριών ανεξάρτητων πειραµάτων και συνυπολογίζεται η τυπική απόκλιση. Με αστερίσκο επισηµαίνονται οι τιµές που διαφέρουν σηµαντικά σε σχέση µε αυτές της µεριστωµατικής ζώνης των µαρτύρων). [Histone H2A variants H2A.1 and H2A.2 and ubiquitinated H2A ratio to total H2A in samples derived from the developmental zones of maize root, callus cultures derived from each zone and from the developmental zones of roots treated with auxin and gibberellins. Each value is the average of three independent experiments and bars indicate the standard deviation of the measurement. Values significantly different at p<0.05 from corresponding values measured in samples derived from the meristematic zone of control roots are indicated by asterisks] 164

179 3.3.3 Κατανοµή των ισοµορφών της ιστόνης Η2Β Σε ότι αφορά την ιστόνη Η2Β, η ανοσοανίχνευση, µε τη βοήθεια του κατάλληλου αντισώµατος, έδειξε µία ζώνη µοριακού βάρους 21 kda, έπειτα από SDS-PAGE και δύο ζώνες µε παρόµοια κινητικότητα, έπειτα από όξινη ηλεκτροφόρηση (Εικόνα ). Αντίστοιχα, ανοσοανίχνευση έπειτα από όξινη δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση, έδειξε πως οι ισοµορφές της Η2Β εντοπίζονται πάνω στη νοητή διαγώνιο της πηκτής, κάτω από τις συνδετικές ιστόνες (Εικόνα ). Η ανάλυση, µε τη βοήθεια Η/Υ, των πηκτών όξινης δισδιάστατης ηλεκτροφόρησης από δείγµατα που προήλθαν από τις τρείς αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας και η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσµάτων που ακολούθησε, οδήγησαν στον έµµεσο προσδιορισµό των ποσοστιαίων συµµετοχών των ισοµορφών της ιστόνης Η2Β σε κάθε αναπτυξιακή ζώνη. Σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα που παρουσίαζονται στον Πίνακα 3.3.3, στα δείγµατα από τη µεριστωµατική ζώνη η ισοµορφή Η2Β.1 αποτελεί το 60% περίπου της ολικής Η2Β, ενώ η ισοµορφή Η2Β.2 το 40%. Η παραπάνω σχετική αναλογία µεταξύ των ισοµορφών της Η2Β διατηρείται και στη ζώνη επιµήκυνσης. Αντίθετα, στη ζώνη διαφροοποποιήσης η συµµετοχή της ισοµορφής Η2Β.1 µειώνεται στο 53% ενώ η συµµετοχή της ισοµορφής Η2Β.2 αυξάνεται στο 47% της ολικής Η2Β. Αντίστοιχα, η ανάλυση των πηκτών από δείγµατα που προήλθαν από τις ιστοκαλλιέργειες κάλλων, έδειξε ότι η κατανοµή των ισοµορφών της Η2Β µεταβάλλεται επίσης και κατά την αποδιαφοροποίηση των φυτικών κυττάρων. Συγκεκριµένα, οι ισοµορφές Η2Β.1 και Η2Β.2 αποτελούν το 57% και 43% περίπου της ολικής Η2Β, ανεξάρτητα από την αναπτυξιακή ζώνη από την οποία σχηµατίστηκε η ιστοκαλλιέργεια. Με άλλα λόγια, το πρότυπο κατανοµής των ισοµορφών της Η2Β στις ιστοκαλλιέργειες κάλλων είναι παρόµοιο µε το αντίστοιχο της µεριστωµατικής ζώνης των µαρτύρων. Η ανάλυση των πηκτών από δείγµατα που προήλθαν από τις τρείς αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας φυτών που αναπτύχθηκαν παρουσία αυξίνης, έδειξε ότι η κατανοµή των ισοµορφών της ιστόνης Η2Β µεταβάλλεται και σε αυτή την περίπτωση. Συγκεκριµένα, στα δείγµατα από τη µεριστωµατική ζώνη η ποσοστιαία συµµετοχή των ισοµορφών Η2Β.1 και Η2Β.2 είναι αντίστοιχα 53% και 47% περίπου της ολικής Η2Β, αναλογία που παρατηρείται στα δείγµατα από τη ζώνη διαφοροποίησης των µαρτύρων. Στα δείγµατα από τη ζώνη 165

180 επιµήκυνσης δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στη συµµετοχή των δύο ισοµορφών, που είναι παρόµοια µε αυτή της ζώνης επιµήκυνσης των µαρτύρων, δηλαδή 60% και 40% αντίστοιχα. Τέλος, στη ζώνη διαφοροποίησης η συµµετοχή της Η2Β.1 και της Η2Β.2 είναι αντίστοιχα περίπου 60% και 40%, αναλογία που παρατηρείται στα δείγµατα από τη µεριστωµατική ζώνη των µαρτύρων. Τέλος, ανάλυση των πηκτών από δείγµατα που προήλθαν από τις τρείς αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας φυτών που αναπτύχθηκαν παρουσία γιββεριλλίνης, έδειξε ότι και σε αυτή την περίπτωση µεταβάλλεται η κατανοµή των ισοµορφών της ιστόνης Η2Β. Συγκεκριµένα, στα δείγµατα από τη µεριστωµατική ζώνη οι ισοµορφές Η2Β.1 και Η2Β.2 αποτελούν το 65% και 35% αντίστοιχα της ολικής Η2Β. Αντίθετα, στη ζώνη επιµήκυνσης, κάθε µία από τις δύο ισοµορφές αποτελεί το 50% της ολικής Η2Β. Τέλος στα δείγµατα από τη ζώνη διαφοροποίησης, η συµµετοχή της ισοµορφής Η2Β.1 αυξάνεται στο 57% περίπου της ολικής Η2Β, ενώ η συµµετοχή της ισοµορφής Η2Β.2 µειώνεται στο 43% και είναι παρόµοια µε αυτή της µεριστωµατικής ζώνης και της ζώνης επιµήκυνσης της ρίζας των φυτών-µαρτύρων. Συνοπτικά θα µπορούσαµε να πούµε πως κατά τη διαφοροποίηση των φυτικών κυττάρων στις τρείς αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας του καλαµποκιού, µειώνεται η ποσοστιαία συµµετοχή της ισοµορφής Η2Β.1 και αυξάνεται η συµµετοχή της ισοµορφής Η2Β.2. Κατά την αποδιαφοροποίηση των φυτικών κυττάρων στις ιστοκαλλιέργειες κάλλων, οι συµµετοχές των ισοµορφών της ιστόνης Η2Β είναι παρόµοιες µε την αντίστοιχη της µεριστωµατικής ζώνης των µαρτύρων, ανεξάρτητα από την αναπτυξιακή ζώνη από την οποία προήλθαν οι κάλλοι. Κατά την διαφοροποίηση των φυτικών κυττάρων παρουσία αυξίνης, παρατηρείται αύξηση της συµµετοχής της ισοµορφής Η2Β.1 στις ζώνες επιµήκυνσης και διαφοροποίησης και αντίστοιχη µείωση της συµµετοχής της Η2Β.2, σε αντίθεση µε ό,τι συµβαίνει στα φυτά-µάρτυρες. Τέλος, κατά την διαφοροποίηση των φυτικών κυττάρων παρουσία γιββεριλλίνης παρατηρείται υψηλή συµµετοχή της ισοµορφής Η2Β.1 στη µεριστωµατική ζώνη, ενώ στη ζώνη επιµήκυνσης κάθε µία από τις δύο ισοµορφές αποτελεί το 50% περίπου της ολικής Η2Β. 166

181 Εικόνα Χαρακτηριστική εικόνα πηκτής από όξινη ηλεκτροφόρηση και ανοσοανίχνευση της ιστόνης Η2B [A representative acetic acid-urea polyacrylamide gel and immunoblotting detection of histone H2B] Εικόνα Χαρακτηριστική εικόνα πηκτής από όξινη δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση (AUT/AUC-PAGE) και ανοσοανίχνευση της ιστόνης Η2B. [A representative two-dimensional AUT/AUC-PAGE gel and immunoblotting detection of histone H2B] 167

182 Πίνακας Ποσοστιαία συµµετοχή των κύριων ισοµορφών Η2Β.1 και Η2Β.2 της ιστόνης Η2Β σε κάθε µία από τις τρείς αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας του καλαµποκιού σε δείγµατα που προέρχονται από φυτά-µάρτυρες, από ιστοκαλλιέργειες κάλλων (οι τιµές είναι οι µέσοι όροι των πρωτογενεών, δευτερογενών και τριτογενών κάλλων) και από φυτά που αναπτύχθηκαν παρουσία αυξίνης και παρουσία γιββεριλλίνης. Κάθε τιµή είναι ο µέσος όρος των µετρήσεων τριών ανεξάρτητων πειραµάτων και συνυπολογίζεται η τυπική απόκλιση. Με αστερίσκο επισηµαίνονται οι τιµές που διαφέρουν σηµαντικά (τιµή P<0,05 µε βάση το κριτήριο t της κατανοµής Student) σε σχέση µε αυτές της µεριστωµατικής ζώνης των µαρτύρων. [Histone H2B variants H2B.1 and H2B.2 ratio to total H2B in samples derived from the developmental zones of maize root, callus cultures derived from each zone and from the developmental zones of roots treated with auxin and gibberellins. Each value is the average of three independent experiments and bars indicate the standard deviation of the measurement. Values significantly different at p<0.05 from corresponding values measured in samples derived from the meristematic zone of control roots are indicated by asterisks] Μάρτυρες Μ Ε H2B.1 59% % + 1,5 H2B.2 41% % + 1,5 Κάλλοι 53% + 2,5 * 47% + 2,5 * Μ Ε H2B.1 56,5% % + 2,5 56,5% + 1,5 H2B.2 43,5% % + 2,5 43,5% + 1,5 Αυξίνη Μ Ε H2B.1 H2B.2 53,5% + 1 * 46,5% + 1 * 59,5% + 0,5 59,5% ,5% + 0,5 40,5% + 2 Γιββεριλλίνη Μ Ε Η2B.1 H2B.2 64% + 1,5 * 50,5% + 0,5 * 36% + 1,5 * 49,5% + 0,5 * 57,5% + 0,5 42,5% + 0,5 168

183 Εικόνα Συγκριτική απεικόνιση της ποσοστιαίας συµµετοχής των κύριων ισοµορφών Η2B.1 και Η2B.2 της ιστόνης Η2B σε κάθε µία από τις τρείς αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας του καλαµποκιού σε δείγµατα που προέρχονται από φυτά-µάρτυρες, από ιστοκαλλιέργειες κάλλων (πρωτογενείς, δευτερογενείς και τριτογενείς κάλλοι απεικονίζονται συνολικά στο ίδιο ραβδόγραµµα) και από φυτά που αναπτύχθηκαν παρουσία αυξίνης και παρουσία γιββεριλλίνης. Κάθε τιµή είναι ο µέσος όρος των µετρήσεων τριών ανεξάρτητων πειραµάτων και συνυπολογίζεται η τυπική απόκλιση. Με αστερίσκο επισηµαίνονται οι τιµές που διαφέρουν σηµαντικά (τιµή P<0,05 µε βάση το κριτήριο t της κατανοµής Student) σε σχέση µε αυτές της µεριστωµατικής ζώνης των µαρτύρων. [Histone H2B variants H2B.1 and H2B.2 ratio to total H2B in samples derived from the developmental zones of maize root, callus cultures derived from each zone and from the developmental zones of roots treated with auxin and gibberellins. Each value is the average of three independent experiments and bars indicate the standard deviation of the measurement. Values significantly different at p<0.05 from corresponding values measured in samples derived from the meristematic zone of control roots are indicated by asterisks] 169

184 3.3.4 Κατανοµή των ισοµορφών και τροποποιηµένων µορφών της ιστόνης Η3 Η ταυτοποίηση των ισοµορφών της Η3 έγινε, όπως και στην περίπτωση των υπολοίπων ιστονών, βάσει της διαφορετικής ηλεκτροφορητικής τους κινητικότητας σε όξινη ηλεκροφόρηση και µε ανοσοανίχνευση χρησιµοποιώντας τα κατάλληλα αντισώµατα. Συγκεκριµένα, ανοσοανίχνευση έπειτα από όξινη ηλεκτροφόρηση παρουσία οξικού οξέος και ουρίας έδειξε πως µε το αντίσωµα που αναγνωρίζει την ιστόνη Η3 αντιδρούν µία απλή ζώνη και µία τριπλή ζώνη, µικρότερης κινητικότητας. Από τη δεύτερη, οι δύο ζώνες µε την ελαφρώς µικρότερη κινητικότητα αντιδρούν επίσης µε το αντίσωµα που ενάντια στη φωσφορυλιωµένη Η3, ενώ η µία από αυτές, η οποία εµφανίζει και την µικρότερη κινητικότητα, αντιδρά και µε το αντίσωµα ενάντια στην ακετυλιωµένη Η3 (Εικόνα ). Η ανοσοανίχνευση της Η3 έπειτα από όξινη δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση έδειξε πως οι δύο ισοµορφές της εντοπίζονται στην κεντρική περιοχή της πηκτής, κάτω από τη νοητή διαγώνιο, ενώ η µία από αυτές φέρει και δύο τροποποιηµένες µορφές (Εικόνα ). Σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα από την ανάλυση των πηκτών της δισδιάστατης ηλεκτροφόρησης που παρουσιάζονται στον Πίνακα 3.3.4, στα δείγµατα από τη µεριστωµατική ζώνη οι ισοµορφές Η3.1 και Η3.2 αποτελούν αντίστοιχα το 30% και 70% περίπου της ολικής Η3. Οι τροποποιηµένες µορφές της Η3, οι οποίες συναντώνται στην ισοµορφή Η3.2, αποτελούν συνολικά το 55% της ολικής Η3, µε τη συµµετοχή της φωσφορυλιωµένης και της φωσφο-ακετυλιωµένης µορφής να ανέρχονται αντίστοιχα στο 37% και στο 18% της ολικής Η3. Το παραπάνω πρότυπο διατηρείται σταθερό στα δείγµατα από τη ζώνη επιµήκυνσης. Στα δείγµατα από τη ζώνη διαφοροποίησης η συµµετοχή της ισοµορφής Η3.1 µειώνεται στο 18% περίπου και της ισοµορφής Η3.2 αυξάνεται στο 82% της ολικής Η3. Επιπλέον, στη ζώνη διαφοροποίησης παρατηρείται και µικρή αύξηση της συµµετοχής των τροποποιηµένων µορφών της Η3, η οποίες φτάνουν στο 60% της ολικής Η3, µε την φωσφορυλιωµένη µορφή να αποτελεί το 41% και την φωσφο-ακετυλιωµένη µορφή το 18% της ολικής Η3, χωρίς όµως οι παραπάνω µεταβολές να είναι στατιστικώς σηµαντικές. Η ανάλυση των πηκτών από δείγµατα που προήλθαν από ιστοκαλλιέργειες κάλλων, έδειξε ότι η κατανοµή των ισοµορφών της Η3 µεταβάλλεται επίσης και κατά την αποδιαφοροποίηση των φυτικών κυττάρων. 170

185 Συγκεκριµένα, µε µικρές διακυµάνσεις µεταξύ των δειγµάτων, οι ισοµορφές Η3.1 και Η3.2 αποτελούν αντίστοιχα το 25% και 75% περίπου της ολικής Η3, ανεξάρτητα από την αναπτυξιακή ζώνη από την οποία προήλθαν οι ιστοκαλλιέργειες κάλλων. Επιπλέον, οι τροποποιηµένες µορφές της Η3 αποτελούν συνολικά το 53% περίπου της ολικής Η3, δηλαδή η συµµετοχή τους είναι παρόµοια µε αυτή της µεριστωµατικής ζώνης και της ζώνης επιµήκυνσης των µαρτύρων. Σε όλα τα δείγµατα, η συµµετοχή της φωσφορυλιωµένης µορφής ανέρχεται στο 37% και η συµµετοχή της φωσφο-ακετυλιωµένης µορφής στο 16% της ολικής Η3. Η ανάλυση των πηκτών από δείγµατα που προήλθαν από τις τρείς αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας σε φυτά που αναπτύχθηκαν παρουσία αυξίνης, έδειξε ότι η κατανοµή των ισοµορφών ιστόνης Η3 µεταβάλλεται και σε αυτή την περίπτωση. Συγκεκριµένα, η ποσοστιαία συµµετοχή της ισοµορφής Η3.1 στα δείγµατα από τη µεριστωµατική ζώνη αυξάνεται σηµαντικά σε σχέση µε τους µάρτυρες και φτάνει στο 37% περίπου της ολικής Η3, ενώ η συµµετοχή της ισοµορφής Η3.2 µειώνεται στο 63%. Στα δείγµατα από τη ζώνη επιµήκυνσης η συµµετοχή της ισοµορφής Η3.1 αυξάνεται ακόµη περισσότερο, φτάνοντας στο 43% περίπου της ολικής Η3, ενώ η συµµετοχή της ισοµορφής Η3.2 µειώνεται ακόµη περισσότερο, στο 56%. Τέλος, στα δείγµατα από τη ζώνη διαφοροποίησης οι ισοµορφές Η3.1 και Η3.2 αποτελούν αντίστοιχα το 36% και το 64% περίπου της ολικής Η3. Σε ό,τι αφορά τη συµµετοχή των τροποποιηµένων µορφών της Η3, εµφανίζεται µειωµένη σε σχέση µε τα φυτά-µάρτυρες ανεξάρτητα από την αναπτυξιακή ζώνη από την οποία προήλθαν τα δείγµατα. Συγκεκριµένα, στα δείγµατα από τη µεριστωµατική ζώνη, αποτελούν συνολικά το 51%, στα δείγµατα από τη ζώνη επιµήκυνσης το 47% και στα δείγµατα από τη ζώνη διαφοροποίησης το 53% της ολικής Η3. Μεταβολές σε σχέση µε τους µάρτυρες παρατηρούνται στις ποσοστιαίες συµµετοχές των τροποποιηµένων µορφών της Η3 και συγκεκριµένα, ενώ η συµµετοχή της φωσφορυλιωµένης µορφής σε όλα τα δείγµατα κυµαίνεται στα επίπεδα του 40%, η συµµετοχή της φωσφο-ακετυλιωµένης µορφής δεν ξεπερνά το 10% της ολικής Η3. Τέλος, η κατανοµή των ισοµορφών της ιστόνης Η3 µεταβάλλεται και στην περίπτωση των φυτών που αναπτύχθηκαν παρουσία γιββεριλλίνης, όπως έδειξε η ανάλυση των πηκτών από τα αντίστοιχα δείγµατα. Συγκεκριµένα, οι ισοµορφές Η3.1 και Η3.2 αποτελούν, µε µικρές διακυµάνσεις, αντίστοιχα το 30% και το 70% περίπου της ολικής Η3 ανεξάρτητα από την αναπτυξιακή ζώνη από την οποία προήλθαν τα δείγµατα. Με άλλα 171

186 λόγια, το πρότυπο κατανοµής των ισοµορφών της ιστόνης Η3 κατά τη διαφοροποίηση των φυτικών κυττάρων παρουσία γιββεριλλίνης είναι παρόµοιο µε αυτό της µεριστωµατικής ζώνης των µαρτύρων. Σε ό,τι αφορά τις τροποποιηµένες µορφές της Η3, η συµµετοχή τους φτάνει στο 55% περίπου της ολικής Η3, ανεξάρτητα από την αναπτυξιακή ζώνη από την οποία προήλθαν τα δείγµατα, δηλαδή το συνολικό πρότυπο κατανοµής τους είναι παρόµοιο µε αυτό της µεριστωµατικής ζώνης και της ζώνης επιµήκυνσης των µαρτύρων. ιαφορές σε σχέση µε τους µάρτυρες εµφανίζουν οι ποσοστιαίες συµµετοχές της φωσφορυλιωµένης και της φωσφοακετυλιωµένης µορφής της Η3, οι οποίες αντίστοιχα ανέρχονται στο 42% και στο 13% περίπου της ολικής Η3, ανεξάρτητα από την αναπτυξιακή ζώνη από την οποία προήλθαν τα δείγµατα. Συνοπτικά θα µπορούσαµε να πούµε πως κατά τη διαφοροποίηση των φυτικών κυττάρων στις τρείς αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας του καλαµποκιού, µειώνεται η ποσοστιαία συµµετοχή της ισοµορφής Η3.1, ενώ αυξάνεται η συµµετοχή της ισοµορφής Η3.2 και των τροποποιηµένων µορφών της Η3. Κατά την αποδιαφοροποίηση των φυτικών κυττάρων στις ιστοκαλλιέργειες κάλλων, οι ισοµορφές Η3.1 και Η3.2 αποτελούν περίπου το 25% και το 75% της ολικής Η3, ενώ η κατανοµή των τροποποιηµένων µορφών της Η3 είναι παρόµοια µε την αντίστοιχη της µεριστωµατικής ζώνης των µαρτύρων. Κατά την διαφοροποίηση των φυτικών κυττάρων παρουσία αυξίνης, παρατηρείται αύξηση της συµµετοχής της ισοµορφής Η3.1 σε όλες τις αναπτυξιακές ζώνες καθώς και αύξηση της µη τροποποιηµένης και φωσφορυλιωµένης µορφής της Η3 σε βάρος της φωσφο-ακετυλιωµένης µορφής. Τέλος, παρουσία γιββεριλλίνης, παρατηρείται αυξηµένη συµµετοχή της ισοµορφής Η3.1 στη ζώνη διαφοροποίησης ενώ σε όλες τις αναπτυξιακές ζώνες παρατηρείται αύξηση της συµµετοχής της φωσφορυλιωµένης µορφής της Η3 και αντίστοιχη µείωση της συµµετοχής της φωσφοακετυλιωµένης µορφής. 172

187 Εικόνα Χαρακτηριστική εικόνα πηκτής από όξινη ηλεκτροφόρηση και ανοσοανίχνευση της ολικής Η3, της φωσφορυλιωµένης και της ακετυλιωµένης µορφής της. [A representative acetic acid-urea polyacrylamide gel and immunoblotting detection of histone H3 and the phosphorylated and acetylated forms of H3] Εικόνα Χαρακτηριστική εικόνα πηκτής από όξινη δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση (AUT/AUC-PAGE) και ανοσοανίχνευση της ιστόνης Η3. [A representative two-dimensional AUT/AUC-PAGE gel and immunoblotting detection of histone H3] 173

188 Πίνακας Ποσοστιαία συµµετοχή των κύριων ισοµορφών Η3.1 και Η3.2 καθώς και των τροποποιηµένων µορφών της ιστόνης Η3 σε κάθε µία από τις τρείς αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας του καλαµποκιού σε δείγµατα που προέρχονται από φυτά-µάρτυρες, από ιστοκαλλιέργειες κάλλων (µέσοι όροι των πρωτογενών, δευτερογενών και τριτογενών κάλλων) και από φυτά που αναπτύχθηκαν παρουσία αυξίνης και παρουσία γιββεριλλίνης. Κάθε τιµή είναι ο µέσος όρος των µετρήσεων τριών ανεξάρτητων πειραµάτων και συνυπολογίζεται η τυπική απόκλιση. Με αστερίσκο επισηµαίνονται οι τιµές που διαφέρουν σηµαντικά (τιµή P<0,05 µε βάση το κριτήριο t της κατανοµής Student) σε σχέση µε αυτές της µεριστωµατικής ζώνης των µαρτύρων. [Histone H3 variants H3.1 and H3.2 and modified forms ratio to total H3 in samples derived from the developmental zones of maize root, callus cultures derived from each zone and from the developmental zones of roots treated with auxin and gibberellin. Each value is the average of three independent experiments and bars indicate the standard deviation of the measurement. Values significantly different at p<0.05 from corresponding values measured in samples derived from the meristematic zone of control roots are indicated by asterisks] 174 Μάρτυρες Μ Ε H3.1 29,5% ,5% % + 0,5 * H3.2 15,5% ,5% % + 0,5 * H3.2 (1) 37% % ,5% + 1 H3.2(2) 18% % + 1,5 18,5% + 0,5 Κάλλοι Μ Ε H3.1 24% + 0,5 * 24,5% + 1,5 * 23,5% + 1 * H3.2 23% + 0,5 * 22,5% + 1,5 * 22,5% + 1 * H3.2 (1) 37% % % + 1,5 H3.2(2) 16% % + 1,5 17% + 2 Αυξίνη Μ Ε H3.1 37,5% + 1,5 * 42,5% + 1 * 36% + 1 * H3.2 11,5% + 1,5 * 10,5% + 1 * 10,5% + 1 * H3.2 (1) 41% ,5% ,5% + 1 H3.2(2) 10% + 1,5 * 8,5% + 0,5 * 10% + 1 * Γιββεριλλίνη Μ Ε H3.1 30% + 3,5 28% ,5% + 2,5 H3.2 15% + 3,5 15,5% ,5% + 2,5 H3.2 (1) 43% + 2,5 43% ,5% + 1 H3.2(2) 12% + 1,5 * 13,5% + 1 * 12,5% + 2 *

189 Εικόνα Συγκριτική απεικόνιση της ποσοστιαίας συµµετοχής των κύριων ισοµορφών Η3.1 και Η3.2 και των τροποποιηµένων µορφών της ισοµορφής Η3.2 της ιστόνης Η3 σε κάθε µία από τις τρείς αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας του καλαµποκιού σε δείγµατα που προέχονται από φυτά-µάρτυρες, από ιστοκαλλιέργειες κάλλων (πρωτογενείς, δευτερογενείς και τριτογενείς κάλλοι απεικονίζονται συνολικά στο ίδιο ραβδόγραµµα) και από φυτά που αναπτύχθηκαν παρουσία αυξίνης και παρουσία γιββεριλλίνης. Κάθε τιµή είναι ο µέσος όρος των µετρήσεων τριών ανεξάρτητων πειραµάτων και συνυπολογίζεται η τυπική απόκλιση. Με αστερίσκο επισηµαίνονται οι τιµές που διαφέρουν σηµαντικά (τιµή P<0,05 µε βάση το κριτήριο t της κατανοµής Student) σε σχέση µε αυτές της µεριστωµατικής ζώνης των µαρτύρων. [Histone H3 variants H3.1 and H3.2 and modified forms ratio to total H3 in samples derived from the developmental zones of maize root, callus cultures derived from each zone and from the developmental zones of roots treated with auxin and gibberellin. Each value is the average of three independent experiments and bars indicate the standard deviation of the measurement. Values significantly different at p<0.05 from corresponding values measured in samples derived from the meristematic zone of control roots are indicated by asterisks] 175

190 3.3.5 Κατανοµή της ακετυλιωµένης µορφής της ιστόνης Η4 Τέλος, µε τον ίδιο τρόπο, δηλαδή µε ηλεκτροφορητικό διαχωρισµό και ακόλουθη ανοσοανίχνευση, έγινε και η ταυτοποίηση της ιστόνης Η4 καθώς και της ακετυλιωµένης µορφής της. Συγκεκριµένα, ανοσοανίχνευση έπειτα από όξινη ηλεκτροφόρηση παρουσία οξικού οξέος και ουρίας, έδειξε ότι δύο ζώνες µε σχεδόν όµοια κινητικότητα αντιδρούν µε το αντίσωµα που ενάντια στην ιστόνη Η4. Η µία από τις δύο αυτές ζώνες, η οποία έχει ελαφρώς µικρότερη κινητικότητα, αντιδρά επίσης και µε το αντίσωµα ενάντια στην ακετυλιωµένη Η4 (Εικόνα ). Η ανοσοανίχνευση της ιστόνης Η4 έπειτα από όξινη δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση έδειξε πως εντοπίζεται στην κάτω δεξιά περιοχή της πηκτής, δηλαδή η Η4 εµφανίζει τη µεγαλύτερη ηλεκτροφορητική κινητικότητα από όλες τις ιστόνες (Εικόνα ). Η ανάλυση των πηκτών όξινης δισδιάστατης ηλεκτροφόρησης από δείγµατα που προήλθαν από τις τρείς αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας και η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσµάτων που ακολούθησε, οδήγησαν στον έµµεσο προσδιορισµό της ποσοστιαίας συµµετοχής της ακετυλιωµένης µορφής της ιστόνης Η4 σε κάθε αναπτυξιακή ζώνη. Σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα που παρουσιάζονται στον Πίνακα 3.3.5, στα δείγµατα από τη µεριστωµατική ζώνη η ακετυλιωµένη µορφή αποτελεί το 42% περίπου της ολικής Η4, η συµµετοχή της όµως µειώνεται ελαφρώς στα δείγµατα από τη ζώνη επιµήκυνσης και τη ζώνη διαφοροποίησης, όπου αποτελεί το 37% περίπου της ολικής Η4. Η ανάλυση των πηκτών από δείγµατα που προήλθαν από τις ιστοκαλλιέργειες κάλλων, έδειξε ότι η συµµετοχή της ακετυλιωµένης µορφής της ιστόνης Η4 µεταβάλλεται και κατά την αποδιαφοροποίηση των φυτικών κυττάρων. Συγκεκριµένα, η ακετυλιωµένη µορφή αποτελεί το 43% περίπου της ολικής Η4, ανεξάρτητα από τη ζώνη από την οποία σχηµατίστηκαν οι ιστοκαλλιέργειες κάλλων. Με άλλα λόγια, η συµµετοχή της ακετυλιωµένης µορφής της ιστόνης Η4 στα δείγµατα από κάλλους είναι παρόµοια µε αυτή των δειγµάτων από τη µεριστωµατική ζώνη των µαρτύρων. Η ανάλυση των πηκτών από δείγµατα που προήλθαν από τις τρείς αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας φυτών που αναπτύχθηκαν παρουσία αυξίνης, έδειξε ότι η συµµετοχή της ακετυλιωµένης µορφής της ιστόνης Η4 µεταβάλλεται και σε αυτή την περίπτωση. Συγκεκριµένα, η ποσοστιαία συµµετοχή της ανέρχεται στο 38% της 176

191 ολικής Η4, ανεξάρτητα από την αναπτυξιακή ζώνη από την οποία προέρχονται τα δείγµατα. Παρόµοια συµµετοχή παρατηρείται και στα δείγµατα από την ζώνη επιµήκυνσης και τη ζώνη διαφοροποίησης των µερτύρων, όπου η ακετυλιωµένη µορφή της Η4 αποτελεί το 37% της ολικής Η4. Τέλος, µεταβολή στην συµµετοχή της ακετυλιωµένης µορφής της ιστόνης Η4 παρατηρήθηκε και κατά την ανάλυση των πηκτών από δείγµατα που προήλθαν από τις τρείς αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας φυτών που αναπτύχθηκαν παρουσία γιββεριλλίνης. Συγκεκριµένα, σε αυτή την περίπτωση, η συµµετοχή της ακετυλιωµένης µορφής ανέρχεται στο 33% περίπου της ολικής Η4, ανεξάρτητα από την αναπτυξιακή ζώνη από την οποία προέρχονται τα δείγµατα. Συνοπτικά θα µπορούσαµε να πούµε πως, σύµφωνα µε την ανάλυση των πηκτών, κατά τη διαφοροποίηση των φυτικών κυττάρων στις τρείς αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας του καλαµποκιού, µειώνεται σηµαντικά η ποσοστιαία συµµετοχή της ακετυλιωµένης µορφής της Η4, ενώ κατά την αποδιαφοροποίησή τους σε ιστοκαλλιέργειες κάλλων, η συµµετοχή της είναι παρόµοια µε αυτή της µεριστωµατικής ζώνης των µαρτύρων, ανεξάρτητα από την αναπτυξιακή ζώνη από την οποία προήλθαν οι κάλλοι. Κατά την διαφοροποίηση των φυτικών κυττάρων τόσο παρουσία αυξίνης, όσο και παρουσία γιββεριλλίνης, παρατηρείται σηµαντική µείωση της ποσοστιαίας συµµετοχής της ακτυλιωµένης µορφής της Η4. 177

192 Εικόνα Χαρακτηριστική εικόνα πηκτής από όξινη ηλεκτροφόρηση και ανοσοανίχνευση της ολικής Η4 και της ακετυλιωµένης µορφής της. [A representative acetic acid-urea polyacrylamide gel and immunoblotting detection of histone H4 and the acetylated form of H4] Εικόνα Χαρακτηριστική εικόνα πηκτής από όξινη δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση (AUT/AUC- PAGE) και ανοσοανίχνευση της ιστόνης Η2Α. [A representative two-dimensional AUT/AUC-PAGE gel and immunoblotting detection of histone H4] 178

193 Πίνακας Ποσοστιαία συµµετοχή της µη τροποποιηµένης µορφής και της ακετυλιωµένης µορφής της ιστόνης Η4 σε κάθε µία από τις τρείς αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας του καλαµποκιού σε δείγµατα που προέρχονται από φυτά- µάρτυρες, από ιστοκαλλιέργειες κάλλων (µέσοι όροι των πρωτογενών, δευτερογενών και τριτογενών κάλλων) και από φυτά που αναπτύχθηκαν παρουσία αυξίνης και παρουσία γιββεριλλίνης. Κάθε τιµή είναι ο µέσος όρος των µετρήσεων τριών ανεξάρτητων πειραµάτων και συνυπολογίζεται η τυπική απόκλιση. Με αστερίσκο επισηµαίνονται οι τιµές που διαφέρουν σηµαντικά (τιµή P<0,05 µε βάση το κριτήριο t της κατανοµής Student) σε σχέση µε αυτές της µεριστωµατικής ζώνης των µαρτύρων. [Histone H4 and acetylated H4 ratio to total H4 in samples derived from the developmental zones of maize root, callus cultures derived from each zone and from the developmental zones of roots treated with auxin and gibberellin. Each value is the average of three independent experiments and bars indicate the standard deviation of the measurement. Values significantly different at p<0.05 from corresponding values measured in samples derived from the meristematic zone of control roots are indicated by asterisks] Μάρτυρες Μ Ε Η4 58% + 0,5 63% + 1,5 * 63% + 1 * ach4 42% + 0,5 37% + 1,5 * 37% + 1 * Κάλλοι Μ Ε Η4 58% % % + 1,5 ach4 42% % % + 1,5 Αυξίνη Μ Ε Η4 61,5% + 2,5 * 62% + 1 * 63,5% + 0,5 * ach4 38,5% + 2,5 * 38% + 1 * 36,5% + 0,5 * Γιββεριλλίνη Μ Ε Η4 66% + 0,5 * 67,5% + 1 * 67% + 1,5 * ach4 34% + 0,5 * 32,5% + 1 * 33% + 1,5 * 179

194 Εικόνα Συγκριτική απεικόνιση της ποσοστιαίας συµµετοχής της µη τροποποιηµένης µορφής και της ακετυλιωµένης µορφής της ιστόνης Η4 σε κάθε µία από τις τρείς αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας του καλαµποκιού σε δείγµατα που προέρχονται από φυτά-µάρτυρες, από ιστοκαλλιέργειες κάλλων (πρωτογενείς, δευτερογενείς και τριτογενείς κάλλοι απεικονίζονται συνολικά στο ίδιο ραβδόγραµµα) και από φυτά που αναπτύχθηκαν παρουσία αυξίνης και παρουσία γιββεριλλίνης. Κάθε τιµή είναι ο µέσος όρος των µετρήσεων τριών ανεξάρτητων πειραµάτων και συνυπολογίζεται η τυπική απόκλιση. Με αστερίσκο επισηµαίνονται οι τιµές που διαφέρουν σηµαντικά (τιµή P<0,05 µε βάση το κριτήριο t της κατανοµής Student) σε σχέση µε αυτές της µεριστωµατικής ζώνης των µαρτύρων. [Histone H4 and acetylated H4 ratio to total H4 in samples derived from the developmental zones of maize root, callus cultures derived from each zone and from the developmental zones of roots treated with auxin and gibberellin. Each value is the average of three independent experiments and bars indicate the standard deviation of the measurement. Values significantly different at p<0.05 from corresponding values measured in samples derived from the meristematic zone of control roots are indicated by asterisks] 180

195 3.4 ΑΝΟΣΟΪΣΤΟΧΗΜΙΚΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΩΝ ΙΣΤΟΝΩΝ Όπως έχει ήδη αναφερθεί, οι τρεις αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας εµφανίζουν σηµαντικές µορφολογικές και φυσιολογικές διαφορές µεταξύ τους. Οι διαφορές αυτές αντανακλώνται και στο επίπεδο των κυττάρων και των ιστών που κυριαρχούν στην κάθε µία από αυτές. Συγκεκριµένα, η µεριστωµατική ζώνη αποτελείται από διαιρούµενα κύτταρα, στη ζώνη επιµήκυνσης συναντώνται οι πρωτογενείς ιστοί της ρίζας ενώ στη ζώνη διαφοροποίησης κυριαρχούν τα παρεγχυµατικά, µη διαιρούµενα κύτταρα. Επιπλέον, σε αντίθεση µε τις άλλες δύο ζώνες, τα κύτταρα της ζώνης διαφοροποίησης είναι οργανωµένα σε διακριτούς ιστούς, όπως φαίνεται και στην Εικόνα Τα κύτταρα της εντεριώνης, του περικυκλίου, του φλοιού και της επιδερµίδας εµφανίζουν επίσης διαφορές µεταξύ τους, δεδοµένων και των διακριτών ρόλων που επιτελούν στη λειτουργία της ρίζας (Εικόνα 3.4.2). Η ανοσοϊστοχηµική µελέτη που έγινε σε τοµές της ρίζας µε τη βοήθεια των κατάλληλων αντισωµάτων που αναγνωρίζουν τις ισοµορφές Η1Α, Η1Β και Η1 0 της συνδετικής ιστόνης Η1, την ουβικουιτινωµένη µορφή της ιστόνης Η2Α, την φωσφορυλιωµένη στη Ser10 καθώς και την ακετυλιωµένη µορφή της ιστόνης Η3 και τέλος την ακετυλιωµένη µορφή της ιστόνης Η4, είχε ως σκόπο τον προσδιορισµό των κυττάρων και των ιστών της ρίζας όπου εντοπίζεται η κάθε ισοµορφή ή/και η κάθε τροποποιηµένη µορφή και το µετέπειτα συσχετισµό της µε τη φυσιολογική κατάσταση και το βαθµό διαφοροποίσης των κυττάρων της ρίζας σε κάθε περίπτωση. 181

196 Εικόνα Αντιπροσωπευτικές εγκάρσιες τοµές της ρίζας του καλαµποκιού σε κάθε µία από τις τρείς αναπτυξιακές της ζώνες (Μ: µεριστωµατική ζώνη, Ε: ζώνη επιµήκυνσης, : ζώνη διαφοροποίησης) [Representative transversal sections of meristematic, elongation and differentiation zone of the root] Εικόνα Χαρακτηριστική εγκάρσια τοµή από τη ζώνη διαφοροποίησης της ρίζας του καλαµποκιού στην οποία σηµειώνονται οι κυριότεροι ιστοί που συναντώνται στη ζώνη αυτή. [Representative transversal section of differentiation zone of maize root. The main root tissues are indicated] 182

197 Σύµφωνα µε την ανοσοϊστοχηµική µελέτη, οι κύριες ισοµορφές Η1Α και Η1Β συναντώνται σε όλες τις αναπτυξιακές ζώνες και σε όλους τους ιστούς της ρίζας, ανεξάρτητα από τη φυσιολογική κατάσταση των κυττάρων τους (Εικόνα C και G). Αντίθετα, η ισοµορφή Η1 0 εντοπίζεται κυρίως στα διαφοροποιηµένα, παρεγχυµατικά κύτταρα του φλοιού και της εντεριώνης, σχεδόν απουσιάζει από τα κύτταρα του περικυκλίου, ενώ τα κύτταρα της µεριστωµατικής ζώνης εµφανίζουν σαφώς µικρότερης έντασης αντίδραση µε το αντίσωµα που αναγνωρίζει την Η1 0 (Εικόνα D και H). Επιπλέον, έγινε ανοσοανίχνευση µε το αντίσωµα που αναγνωρίζει την ολική Η1, καθώς και ανοσοανίχνευση χωρίς πρωτοταγές αντίσωµα, για να χρησιµοποιηθούν αντίστοιχα ως θετικός και ως αρνητικός µάρτυρας (Εικόνα B, F και Α, Ε αντίστοιχα). Σε ότι αφορά τις τροποποιηµένες µορφές των ιστονών, η ανοσοανίχνευση έδειξε πως εµφανίζουν παρόµοιο πρότυπο κατανοµής. Συγκεκριµένα, η ουβικουιτινωµένη µορφή της Η2Α (Εικόνα C και F), η φωσφορυλιωµένη και η ακετυλιωµένη µορφή της Η3 (Εικόνα C, G και D, H αντίστοιχα) και η ακετυλιωµένη µορφή της Η4 (Εικόνα C και F) συναντώνται σε όλα τα κύτταρα της µεριστωµατικης ζώνης, ενώ στη ζώνη διαφοροποίησης εντοπίζονται σχεδόν αποκλειστικά στα κύτταρα του περικυκλίου και της επιδερµίδας και σχεδόν απουσιάζει από τα παρεγχυµατικά κύτταρα του φλοιού και της εντεριώνης. Σε όλες τις παραπάνω περιπτώσεις έγινε παράλληλα ανοσοανίχνευση χωρίς πρωτοταγές αντίσωµα για να χρησιµοποιηθεί ως αρνητικός µάρτυρας (Εικόνα A και D, Εικόνα A και E, Εικόνα A και E), καθώς και µε τα αντισώµατα που αναγνωρίζουν την ολική Η2Α (Εικόνα Β και Ε), την ολική Η3 (Εικόνα B και F) και την ολική Η4 (Εικόνα B και F) για να χρησιµοποιηθούν ως θετικοί µάρτυρες. 183

198 Εικόνα Ανοσοϊστοχηµική ανίχνευση της ολικής συνδετικής ιστόνης Η1 (B, F), των κύριων ισοµορφών της Η1Α και Η1Β (C, G) και της ισοµορφής Η1 0 (D, H) σε τοµές της ρίζας που προέρχονται από τη µεριστωµατική ζώνη (A-D) και τη ζώνη διαφοροποίησης (E-H). Οι κύριες ισοµορφές Η1Α και Η1Β συναντώνται σε όλες τις αναπτυξιακές ζώνες και σε όλους τους ιστούς της ρίζας, ανεξάρτητα από τη φυσιολογική κατάσταση των κυττάρων τους (τοµές C και G). Αντίθετα, η ισοµορφή Η1 0 εντοπίζεται κυρίως στα διαφοροποιηµένα, παρεγχυµατικά κύτταρα του φλοιού και της εντεριώνης, σχεδόν απουσιάζει από τα κύτταρα του περικυκλίου, ενώ τα κύτταρα της µεριστωµατικής ζώνης εµφανίζουν σαφώς µικρότερης έντασης αντίδραση µε το αντίσωµα που αναγνωρίζει την Η1 0 (τοµές D και H). Οι τοµές Α, Ε και B, F χρησιµοποιήθηκαν ως αρνητικός (ανοσοανίχνευση χωρίς πρωτοταγές αντίσωµα) και θετικός µάρτυρας (ανοσοανίχνευση µε το αντίσωµα που αναγνωρίζει την ολική Η1) αντίστοιχα (ep: επιδερµίδα, co: φλοιός, pe: περικύκλιο, pi: εντεριώνη). [Immunohistochemical detection of linker histones in maize root sections from meristematic (sections A-D) and differentiation zone (sections Ε-Η). The main histone H1 variants are present in every cell of the root (sections C and G) while H1 0 is detected mainly in differentiated cells, like the parenchymatic cells of cortex and pith. However, a less intense H1 0 signal is also observed in sections from the meristematic and elongation zone (sections D and H). Detection without primary antibody and with total H1 antibody were performed in maize root sections as negative and positive controls (sections A, E and B, F respectively) (ep: epidermis; co: cortex; pe: pericycle; pi: pith)] 184

199 Εικόνα Ανοσοϊστοχηµική ανίχνευση της ουβικουιτινωµένης µορφής της ιστόνης Η2Α (C, F) σε τοµές της ρίζας που προέρχονται από τη µεριστωµατική ζώνη (A-C) και τη ζώνη διαφοροποίησης (D-F). Οι τοµές A, D και B,E χρησιµοποιήθηκαν ως µάρτυρες Η ουβικουιτινωµένη µορφή της Η2Α (τοµές C και F) συναντάνται σε όλα τα κύτταρα της µεριστωµατικης ζώνης, ενώ στη ζώνη διαφοροποίησης εντοπίζεται σχεδόν αποκλειστικά στα κύτταρα του περικυκλίου και της επιδερµίδας και σχεδόν απουσιάζει από τα παρεγχυµατικά κύτταρα του φλοιού και της εντεριώνης. Οι τοµές Α, D και B, Ε χρησιµοποιήθηκαν ως αρνητικός (ανοσοανίχνευση χωρίς πρωτοταγές αντίσωµα) και θετικός µάρτυρας (ανοσοανίχνευση µε το αντίσωµα που αναγνωρίζει την ολική Η2Α) αντίστοιχα (ep: επιδερµίδα, co: φλοιός, pe: περικύκλιο, pi: εντεριώνη). [Immunohistochemical detection of histone H2A ubiquitinated form in maize root sections from meristematic (sections A- C) and differentiation zone (sections D-F). The ubiquitinated form of H2A (sections C and F) is present in every cell of meristematic zone, while in differentiation zone are localized only in pericycle and epidermis cells while they are absent in parenchymatic cells, e.g. cortex and pith. Detection without primary antibody and with total H2A antiboby were performed in maize root sections as negative and positive controls (sections A, D and B, E) (ep: epidermis; co: cortex; pe: pericycle; pi: pith)] 185

200 Εικόνα Ανοσοϊστοχηµική ανίχνευση της φωσφορυλιωµένης και της ακετυλιωµένης µορφής της ιστόνης Η3 (C, G και D, H αντίστοιχα) σε τοµές της ρίζας που προέρχονται από τη µεριστωµατική ζώνη (A-D) και τη ζώνη διαφοροποίησης (E-H). Η φωσφορυλιωµένη και η ακετυλιωµένη µορφή της Η3 (τοµές C, G και D, H αντίστοιχα) συναντώνται σε όλα τα κύτταρα της µεριστωµατικης ζώνης, ενώ στη ζώνη διαφοροποίησης εντοπίζονται σχεδόν αποκλειστικά στα κύτταρα του περικυκλίου και της επιδερµίδας και σχεδόν απουσιάζουν από τα παρεγχυµατικά κύτταρα του φλοιού και της εντεριώνης. Οι τοµές Α, Ε και B, F χρησιµοποιήθηκαν ως αρνητικός (ανοσοανίχνευση χωρίς πρωτοταγές αντίσωµα) και θετικός µάρτυρας (ανοσοανίχνευση µε το αντίσωµα που αναγνωρίζει την ολική Η3) αντίστοιχα (ep: επιδερµίδα, co: φλοιός, pe: περικύκλιο, pi: εντεριώνη). [Immunohistochemical detection of histone H3 modified forms in maize root sections from meristematic (sections A-D) and differentiation zone (sections E-H). The phosphorylated (sections C and G) and the acetylated form of histone H3 (sections D and H) are present in every cell of meristematic zone, while in differentiation zone are localized only in pericycle and epidermis cells while they are absent in parenchymatic cells, e.g. cortex and pith. Detection without primary antibody and with total H3 antibody were performed in maize root sections as negative and positive controls (sections A, E and B, F). (ep: epidermis; co: cortex; pe: pericycle; pi: pith)] 186

201 Εικόνα Ανοσοϊστοχηµική ανίχνευση της ακετυλιωµένης µορφής της ιστόνης Η4 (C και F) σε τοµές της ρίζας που προέρχονται από τη µεριστωµατική ζώνη (A-C) και τη ζώνη διαφοροποίησης (D-F). Οι τοµές Α, D και B, E χρησιµοποιήθηκαν ως µάρτυρες (ep: επιδερµίδα, co: φλοιός, pe: περικύκλιο, pi: εντεριώνη). Η ακετυλιωµένη µορφή της Η4 (τοµές C και F) συναντάνται σε όλα τα κύτταρα της µεριστωµατικης ζώνης, ενώ στη ζώνη διαφοροποίησης εντοπίζεται σχεδόν αποκλειστικά στα κύτταρα του περικυκλίου και της επιδερµίδας και σχεδόν απουσιάζει από τα παρεγχυµατικά κύτταρα του φλοιού και της εντεριώνης. Οι τοµές Α, D και B, Ε χρησιµοποιήθηκαν ως αρνητικός (ανοσοανίχνευση χωρίς πρωτοταγές αντίσωµα) και θετικός µάρτυρας (ανοσοανίχνευση µε το αντίσωµα που αναγνωρίζει την ολική Η4) αντίστοιχα (ep: επιδερµίδα, co: φλοιός, pe: περικύκλιο, pi: εντεριώνη). [Immunohistochemical detection of histone H4 acetylated form in maize root sections from meristematic (sections A-D) and differentiation zone (sections D-F). The acetylated form of histone H4 (sections C and F) is present in every cell of meristematic zone, while in differentiation zone are localized only in pericycle and epidermis cells while they are absent in parenchymatic cells, e.g. cortex and pith. Detection without primary antibody and with total H4 antibody were performed in maize root sections as negative and positive controls respectively (sections A, D and B, E). (ep: epidermis; co: cortex; pe: pericycle; pi: pith)] 187

202 3.5 ΣΥΓΚΡΙΤΙΚΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Μεταβολή του προτύπου κατανοµής των ιστονών κατά την διαφοροποίηση των φυτικών κυττάρων Η ανάλυση, µε τη βοήθεια Η/Υ, των πηκτών όξινης δισδιάστατης ηλεκτροφόρησης από δείγµατα που προήλθαν από τις τρείς αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας του καλαµποκιού και η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσµάτων που ακολούθησε, οδήγησαν στον έµµεσο προσδιορισµό των ποσοστιαίων συµµετοχών των ισοµορφών και των τροποποιηµένων µορφών των ιστονών στην κάθε αναπτυξιακή ζώνη. Σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα της παραπάνω ανάλυσης, τα οποία έχουν ήδη αναφερθεί, και σε συνδιασµό µε τα δεδοµένα από την ανοσοϊστοχηµική ανάλυση, φαίνεται πως το πρότυπο κατανοµής των ιστονών µεταβάλλεται µεταξύ των αναπτυξιακών ζωνών. Σε ό,τι αφορά τις συνδετικές ιστόνες, στα δείγµατα που προέρχονται από τη µεριστωµατική ζώνη κυριαρχεί η ισοµορφή Η1Α, η οποία ξεπερά το 40% της ολικής Η1, ενώ η ισοµορφή Η1 0 αποτελεί περίπου το 27%. Το πρότυπο αυτό διατηρείται σταθερό και στη ζώνη επιµήκυνσης, ενώ στα δείγµατα που προέρχονται από τη ζώνη διαφοροποίησης, η συµµετοχή της Η1 0 αυξάνεται στο 33% και αυτή της Η1Α µειώνεται στο 35%. Η ποσοστιαία συµµετοχή της ισοµορφής Η1Β διατηρείται σταθερή (περίπου 32% της ολικής Η1) σε όλες τις αναπτυξιακές ζώνες. Επιπλέον, η ανοσοϊστοχηµική ανίχνευση των συνδετικών ιστονών έδειξε πως οι ισοµορφές Η1Α και Η1Β συναντώνται σε όλους τους ιστούς της ρίζας, ενώ η ισοµορφή Η1 0 εντοπίζεται κυρίως στα παρεγχυµατικά κύτταρα του φλοιού και της εντεριώνης. Αναφορικά µε την ιστόνη Η2Α, στα δείγµατα που προέρχονται από τη µεριστωµατική ζώνη οι κύριες ισοµορφές Η2Α.1 και Η2Α.2 αποτελούν αντίστοιχα το 48% και το 32% της ολικής Η2Α και η ποσοστιαία συµµετοχή της ουβικουιτινωµένης µορφής της Η2Α (uη2α) ξεπερνά το 20%. Το παραπάνω πρότυπο διατηρείται και στη ζώνη επιµήκυνσης, ενώ στα δείγµατα που προέρχονται από τη ζώνη διαφοροποίησης η συµµετοχή της uη2α µειώνεται στο 12% της ολικής Η2Α και αντίστοιχα αυξάνεται η συµµετοχή των κύριων ισοµορφών. Η ανοσοϊστοχηµική ανίχνευση της uη2α έδειξε πως αυτή εντοπίζεται στα κύτταρα της µεριστωµατικής ζώνης καθώς και στα κύτταρα του περικυκλίου και της επιδερµίδας στη ζώνη διαφοροποίησης, ενώ απουσιάζει από τα κύτταρα του φλοιού και της εντεριώνης. Σε ότι 188

203 αφορά την ιστόνη Η2Β, στα δείγµατα που προέρχονται από τη µεριστωµατική ζώνη και τη ζώνη επιµήκυνσης, κυριαρχεί η ισοµορφή Η2Β.1, η ποσοστιαία συµµετοχή της οποίας ανέρχεται στο 60% περίπου της ολικής Η2Β, ενώ η ισοµορφή Η2Β αποτελεί το 40% της ολικής. Στα δείγµατα που προέρχονται από τη ζώνη διαφοροποίησης παρατηρείται σχετική µείωση της ποσοστιαίας συµµετοχής της Η2Β.1 και αύξηση της συµµετοχής της Η2Β.2 (53% και 47% αντίστοιχα της ολικής Η2Β). Στα δείγµατα που προέρχονται από τη µεριστωµατική ζώνη οι ισοµορφές Η3.1 και Η3.2 αποτελούν αντίστοιχα το 30% και το 70% περίπου της ολικής Η3, ενώ οι τροποποιηµένες µορφές της, οι οποίες εντοπίζονται στην ισοµορφή Η3.2, αποτελούν το 55% περίπου της ολικής. Το παραπάνω πρότυπο διατηρείται, µε ελάχιστες µεταβολές, και στη ζώνη επιµήκυνης, ενώ στα δείγµατα που προέρχονται από τη ζώνη διαφοροποίησης παρατηρείται αύξηση της ποσοσταίας συµµετοχής της ισοµορφής Η3.2, η οποία ξεπερνά το 80% της ολικής Η3, καθώς και σχετική αύξηση των τροποποιηµένων µορφών της Η3, η συµµετοχή των οποίων φτάνει στο 60% της ολικής. Οι τροποποιηµένες µορφές της Η3, σύµφωνα µε την ανοσοϊστοχηµική ανίχνευση, εντοπίζονται στα κύτταρα της µεριστωµατικής ζώνης και στα κύτταρα του περικυκλίου και της επιδερµίδας στη ζώνη διαφοροποίησης, ενώ απουσιάζουν από τον φλοιό και την εντεριώνη. Τέλος, η ακετυλιωµένη µορφή της ιστόνης Η4 στα δείγµατα που προέρχονται από τη µεριστωµατική ζώνη αποτελεί το 42% περίπου της ολικής Η4, ενώ στα δείγµατα που προέρχονται από τη ζώνη επιµήκυνσης και τη ζώνη διαφοροποίησης παρατηρείται σχετική µείωση της συµµετοχής της στο 37% της ολικής Η4. Ο εντοπισµός της ακετυλιωµένης µορφής της Η4 στους ιστούς της ρίζας είναι παρόµοιος µε τον αντίστοιχο των τροποποιηµένων µορφών των ιστονών Η2Α και Η3. Συνοπτικά, οµαδοποιώντας τα παραπάνω αποτελέσµατα για κάθε αναπτυξιακή ζώνη της ρίζας, όπως φαίνεται και στον Πίνακα 5.1, θα µπορούσαµε να πούµε πως στα δείγµατα που προέρχονται από τη µεριστωµατική ζώνη, στις κύριες τάξεις ιστονών κυριαρχούν οι ισοµορφές Η1Α (41% της Η1), Η2Α.1 (48% της Η2Α), Η2Β.1 (60% της Η2Β) και Η3.2 (70% της Η3). Οι ισοµορφές Η1Β, Η1 0 (αντίστοιχα 32% και 27% της Η1), Η2Α.2 (32% της Η2Α), Η2Β.2 (40% της Η2Β) και Η3.1 (30% της Η3) εµφανίζουν µειωµένη συµµετοχή, ενώ σε ό,τι αφορά τις τροποποιηµένες µορφές των ιστονών, η uη2α αποτελεί το 20% της Η2Α, η ακετυλιωµένη Η4 αποτελεί το 42% της ολικής Η4 και οι τροποποιηµένες µορφές της Η3 αποτελούν το 55% της ολικής. Το 189

204 παραπάνω πρότυπο ελάχιστα µεταβάλλεται στα δείγµατα που προέρχονται από τη ζώνη επιµήκυνσης. Η µόνη αξιοσηµείωτη µεταβολή µπορεί να θεωρηθεί η µείωση της συµµετοχής της ακετυλιωµένης Η4 στο 37% της ολικής. Αντίθετα, το πρότυπο κατανοµής των ιστονών µεταβάλλεται σηµαντικά στα δείγµατα που προέρχονται από τη ζώνη διαφοροποίησης. Συγκεκριµένα, µειώνεται η ποσοστιαία συµµετοχή των ισοµορφών Η1Α (35% της Η1), Η2Β.1 (53% της Η2Β) και Η3.1 (20% της Η3), και αντίστοιχα αυξάνεται η συµµετοχή των ισοµορφών Η1 0 (33% της Η1), Η2Β.2 (47% της Η2Β) και Η3.2 (80% της Η3). Επίσης, παρατηρείται µικρή αύξηση της συµµετοχής των κύριων ισοµορφών της Η2Α, ενώ η συµµετοχή της Η1Β διατηρείται σταθερή. Η ποσοστιαία συµµετοχή της uη2α µειώνεται σηµαντικά (12% της Η2Α), η συµµετοχή των τροοποιηµένων µορφών της Η3 εµφανίζει σχετική αύξηση (60% της Η3) ενώ η συµµετοχή της ακετυλιωµένης µορφής της Η4 παραµένει στα επίπεδα της ζώνης επιµήκυνσης (37% της Η4). 190

205 Πίνακας Ποσοστιαία συµµετοχή των ισοµορφών και τροποποιηµένων µορφών των ιστονών στις τρείς αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας φυτών-µαρτύρων. Κάθε τιµή είναι ο µέσος όρος των µετρήσεων τριών ανεξάρτητων πειραµάτων και µε αστερίσκο επισηµαίνονται οι τιµές που διαφέρουν σηµαντικά (τιµή P<0,05 µε βάση το κριτήριο t της κατανοµής Student) σε σχέση µε αυτές της µεριστωµατικής ζώνης των µαρτύρων. [Histone variants and modified forms distribution in samples derived from the developmental zones of control roots. Each value is the average of three independent experiments and bars indicate the standard deviation of the measurement. Values significantly different at p<0.05 from corresponding values measured in samples derived from the meristematic zone of control roots are indicated by asterisks] Μεριστωµατική Ζώνη Ζώνη Επιµήκυνσης Ζώνη ιαφοροποίησης Η1Α 41,5% 40,5% 35,5% * Η1Β 31% 34,5% 31% Η1 0 27% 25,5% 33,5% * Η2Α.1 48% 46% 52% * Η2Α.2 32% 31,5% 35,5% uh2a 20% 22,5% 12,5% * Η2Β.1 59% 58% 53% * Η2Β.2 41% 42% 47% * Η3.1 30% 30% 18% * Η3.2 (0) 15% 17% 22% * Η3.2 (1) 37% 36% 41,5% * Η3.2 (2) 18% 17% 18,5% Η4 58% 63% * 63% * ach4 42% 37% * 37% * 191

206 3.5.2 Μεταβολή του προτύπου κατανοµής των ιστονών κατά την αποδιαφοροποίηση των φυτικών κυττάρων Η ανάλυση των πηκτών όξινης δισδιάστατης ηλεκτροφόρησης από δείγµατα που προήλθαν από ιστοκαλλιέργειες κάλλων (πρωτογενών, δευτερογενών και τριτογενών) που σχηµατίστηκαν από τις τρείς αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας του καλαµποκιού και η µετέπειτα στατιστική επεξεργασία των αποτελεσµάτων έδειξαν πως σε γενικές γραµµές, η ποσοστιαία συµµετοχή των διαφόρων ισοµορφών και τροποποιηµένων µορφών των ιστονών είναι παρόµοια, σε µικρό ή µεγάλο βαθµό, µε την αντίστοιχη των δειγµάτων που προέρχονται από τη µεριστωµατική ζώνη των µαρτύρων, ανεξάρτητα από την αναπτυξιακή ζώνη από την οποία προήλθαν οι ιστοκαλλιέργειες κάλλων. Αναφορικά µε τις συνδετικές ιστόνες, η ποσοστιαία συµµετοχή των ισοµορφών Η1Α, Η1Β και Η1 0 είναι αντίστοιχα 40%, 34% και 26% της ολικής Η1, ανεξάρτητα από την αναπτυξιακή ζώνη από την αποία προήλθαν οι ιστοκαλλιέργειες κάλλων. Αξίζει να σηµειωθεί ότι παρόµοιο πρότυπο κατανοµής παρατηρείται και στα δείγµατα που προέρχονται από τη µεριστωµατική ζώνη και τη ζώνη επιµήκυνσης των µαρτύρων, όπου οι ισοµορφές Η1Α, Η1Β και Η1 0 αποτελούν αντίστοιχα το 41%, 32% και 27% της ολικής Η1. Στην περίπτωση της ιστόνης Η2Α, στα δείγµατα από πρωτογενείς ιστοκαλλιέργειες κάλλων που προήλθαν από τη ζώνη διαφοροποίησης της ρίζας παρατηρείται σηµαντική αύξηση της συµµετοχής της uh2a (27% της ολικής Η2Α), ενώ στα δείγµατα των ιστοκαλλιεργειών που προήλθαν από τις άλλες δύο ζώνες της ρίζας, το πρότυπο κατανοµής των ισοµορφών της Η2Α και της uh2a είναι παρόµοιο µε αυτό της µεριστωµατικής ζώνης των µαρτύρων. Στα επόµενα στάδια των κάλλων (δευτερογενείς και τριτογενείς ιστοκαλλιέργειες κάλλων) το πρότυπο κατανοµής των ισοµορφών της Η2Α είναι παρόµοιο µε αυτό της µεριστωµατικής ζώνης των µαρτύρων, δηλαδή η Η2Α.1, η Η2Α.2 και η uh2a αποτελούν περίπου 48%, 33% και 19% της ολικής Η2Α. Το πρότυπο κατανοµής των ισοµορφών της Η2Β µπορεί επίσης να θεωρηθεί παρόµοιο µε αυτό της µεριστωµατικής ζώνης των µαρτύρων. Συγκεκριµένα, οι ισοµορφές Η2Β.1 και Η2Β.2 αποτελούν αντίστοιχα το 57% και το 43% περίπου της ολικής Η2Β, ανεξάρτητα από την αναπτυξιακή ζώνη από την οποία προήλθαν οι ιστοκαλλιέργειες κάλλων. Υπενθυµίζεται ότι στα δείγµατα που προέρχονται από τη µεριστωµατική ζώνη των 192

207 µαρτύρων, οι ποσοστιαίες συµµετοχές των παραπάνω ισοµορφών ήταν αντίστοιχα 60% και 40% της ολικής Η2Β. Αντίθετα, το πρότυπο κατανοµής των ισοµορφών της Η3 δεν µπορεί να θεωρηθεί παρόµοιο µε αυτό της µεριστωµατικής ζώνης των µαρτύρων. Οι ισοµορφές Η3.1 και Η3.2 αποτελούν αντίστοιχα το 25% και 75% της ολικής Η3, ανεξάρτητα από την αναπτυξιακή ζώνη από την οποία προήλθαν οι κάλλοι, ενώ στα δείγµατα από τη µεριστωµατική ζώνη των µαρτύρων οι ποσοστιαίες συµµετοχές των παραπάνω ισοµορφών ήταν αντίστοιχα 30% και 70% της ολικής Η3. Αντίθετα, η ποσοστιαία συµµετοχή των τροποποιηµένων µορφών της Η3 στις ιστοκαλλιέργειες κάλλων ανέρχεται στα επίπεδα των δειγµάτων που προέρχονται από τη µεριστωµατική ζώνη και τη ζώνη επιµήκυνσης των µαρτύρων. Τέλος, η ακετυλιωµένη µορφή της Η4 αποτελεί το 43% περίπου της ολικής Η4 αναξάρτητα από τη ζώνη από την οποία προήλθαν οι ιστοκαλλιέργειες κάλλων, ποσοστιαία συµµετοχή παρόµοια µε αυτή που παρατηρείται και στα δείγµατα που προέρχονται από τη µεριστωµατική ζώνη των µαρτύρων (42% της ολικής Η4). Συνοπτικά, οµαδοποιώντας τα παραπάνω αποτελέσµατα για κάθε αναπτυξιακή ζώνη της ρίζας από την οποία σχηµατίστηκαν οι κάλλοι, όπως φαίνεται και στον Πίνακα 5.2, θα µπορούσαµε να πούµε πως στα δείγµατα από ιστοκαλλιέργειες κάλλων που προήλθαν από την µεριστωµατική ζώνη της ρίζας το πρότυπο κατανοµής των ισοµορφών και των τροποποιηµένων µορφών των ιστονών είναι, σε γενικές γραµµές, παρόµοιο µε αυτό των δειγµάτων από τη µεριστωµατική ζώνη των µαρτύρων. Εξαίρεση αποτελούν οι ισοµορφές της της ιστόνης Η3, όπου η συµµετοχή της ισοµορφής Η3.1 µειώνεται στο 25% και η συµµετοχή της Η3.2 αυξάνεται στο 75% περίπου της ολικής Η3, ενώ στη µεριστωµατική ζώνη των µαρτύρων οι συµµετοχές τους ήταν αντίστοιχα 30% και 70%. Το παραπάνω πρότυπο διατηρείται, µε ελάχιστες µεταβολές, και στα δείγµατα από ιστοκαλλιέργειες κάλλων που προήλθαν από τη ζώνη επιµήκυνσης της ρίζας, δηλαδή είναι παρόµοιο µε αυτό της µεριστωµατικής ζώνης των µαρτύρων, µε εξαίρεση, όπως προηγουµένως, τις ισοµορφές της ιστόνης Η3. Στα δείγµατα από ιστοκαλλιέργειες κάλλων που προήλθαν από τη ζώνη διαφοροποίησης της ρίζας το πρότυπο κατανοµής των ισοµορφών και των τροποποιηµένων µορφών των ιστονών είναι επίσης πάροµοιο µε αυτό των δειγµάτων από τη µεριστωµατική ζώνη των µαρτύρων µε εξαίρεση τις οι ισοµορφές της ιστόνης Η3 και την uη2α στα δείγµατα από πρωτογενείς ιστοκαλλιέργειες κάλλων. 193

208 Πίνακας Συγκριτική απεικόνιση της ποσοστιαίας συµµετοχής των ισοµορφών και τροποποιηµένων µορφών των ιστονών σε δείγµατα από ιστοκαλλιέργειες κάλλων (µέσοι όροι των πρωτογενών, δευτερογενών και τριτογενών κάλλων) που προήλθαν από τις τρείς αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας του καλαµποκιού. Κάθε τιµή είναι ο µέσος όρος των µετρήσεων τριών ανεξάρτητων πειραµάτων και µε αστερίσκο επισηµαίνονται οι τιµές που διαφέρουν σηµαντικά (τιµή P<0,05 µε βάση το κριτήριο t της κατανοµής Student) σε σχέση µε αυτές της µεριστωµατικής ζώνης των µαρτύρων. [Histone variants and modified forms distribution in callus cultures derived from each zone of the root. Each value is the average of three independent experiments and bars indicate the standard deviation of the measurement. Values significantly different at p<0.05 from corresponding values measured in samples derived from the meristematic zone of control roots are indicated by asterisks]. Μεριστωµατική Ζώνη Ζώνη Επιµήκυνσης Ζώνη ιαφοροποίησης Η1Α 40,5% 40% 40% Η1Β 34% 34,5% 34% Η1 0 25,5% 25,5% 26% Η2Α.1 50% 48,5% 46,5% Η2Α.2 31% 32,5% 34,5% uh2a 19% 19% 19% Η2Β.1 56,5% 56% 56,6% Η2Β.2 43,5% 44% 43,5% Η3.1 24% * 24,5% * 23,5% * Η3.2 (0) 23% * 22,5% * 22,5% * Η3.2 (1) 37% 36% 37% Η3.2 (2) 16% 17% 17% Η4 58% 57% 57% ach4 42% 43% 43% 194

209 3.5.3 Μεταβολή του προτύπου κατανοµής των ιστονών κατά την διαφοροποίηση των φυτικών κυττάρων παρουσία αυξίνης Η ανάλυση των πηκτών όξινης δισδιάστατης ηλεκτροφόρησης από δείγµατα που προήλθαν από τις τρείς αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας φυτών που αναπτύχθηκαν παρουσία αυξίνης και η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσµάτων που ακολούθησε έδειξαν ότι το πρότυπο κατανοµής των ιστονών είναι διαφορετικό κατά την διαφοροποίηση των φυτικών κυττάρων στα παραπάνω φυτά και κατά την διαφοροποίησή τους στους µάρτυρες. Σε ό,τι αφορά τις συνδετικές ιστόνες, το πρότυπο κατανοµής τους είναι παρόµοιο µε αυτό της ζώνης διαφοροποίησης των µαρτύρων, ανεξάρτητα από την αναπτυξιακή ζώνη από την οποία προέρχονται τα δείγµατα. Συγκεκριµένα, παρατηρείται αύξηση της συµµετοχής της ισοµορφής Η1 0, η οποία ξεπερνά το 30% της Η1 σε όλες τις αναπτυξιακές ζώνες, ενώ η συµµετοχή των κύριων ισοµορφών Η1Α και Η1Β µειώνεται αντίστοιχα στο 38% και 31% περίπου της ολικής Η1. Σηµαντικές διαφορές σε σχέση µε τους µάρτυρες παρατηρούνται στο πρότυπο κατανοµής των ισοµορφών της ιστόνης Η2Α. Σε όλες τις αναπτυξιακές ζώνες η ποσοστιαία συµµετοχή της ισοµορφής Η2Α.1 αυξάνεται σηµαντικά, υπερβαίνοντας το 60% της ολικής Η2Α, ενώ η συµµετοχή της ισοµορφής Η2Α.2 µειώνεται περίπου στο 23%. Η συµµετοχή των παραπάνω ισοµορφών στους µάρτυρες είναι αντίστοιχα 48% και 32% περίπου της ολικής Η2Α. Η ποσοστιαία συµµετοχή της uh2a ανέρχεται στο 13% περίπου της ολικής Η2Α, σε όλες τις αναπτυξιακές ζώνες, όπως συµβαίνει και στα δείγµατα από τη ζώνη διαφοροποίησης των µαρτύρων. Σηµαντικές διαφορές σε σχέση µε τους µάρτυρες παρατηρούνται επίσης και στο πρότυπο κατανοµής των ισοµορφών της Η2Β, όπου η ισοµορφή Η2Β.1 αποτελεί το 53% της ολικής Η2Β στη µεριστωµατική ζώνη και το 60% περίπου στις ζώνες επιµήκυνσης και διαφοροποίησης, αντίστροφα µε ό,τι συµβαίνει στους µάρτυρες, όπου η Η2Β.1 στη µεριστωµατική ζώνη και στη ζώνη επιµήκυνσης αποτελεί το 60% περίπου της ολικής Η2Β και η συµµετοχή της µειώνεται στο 53% της ολικής Η2Β στα δείγµατα που προέρχονται από τη ζώνη διαφοροποίησης. Το πρότυπο κατανοµής των ισοµορφών της ιστόνης Η3 επίσης διαφέρει σηµαντικά από το αντίστοιχο των φυτών-µαρτύρων, δεδοµένου ότι σε όλες τις αναπτυξιακές ζώνες αυξάνεται σηµαντικά η συµµετοχή της ισοµορφής Η3.1, η οποία αποτελεί το 195

210 37% περίπου της ολικής Η3 στη µεριστωµατική ζώνη και στη ζώνη διαφοροποίησης και ξεπερνά το 40% στη ζώνη επιµήκυνσης, ενώ αντίστοιχα µειώνεται η συµµετοχή της ισοµορφής Η3.2. Παράλληλα, εµφανίζεται µειωµένη και η ποσοστιαία συµµετοχή των τροποποιηµένων µορφών της Η3, οι οποίες αποτελούν το 50% περίπου της ολικής Η3 σε όλες τις αναπτυξιακές ζώνες, ενώ στους µάρτυρες η συµµετοχή τους ξεπερνούσε το 55%. Ειδικότερα, παρατηρείται σηµαντική αύξηση της συµµετοχής της µη τροποποιηµένης και της φωσφορυλιωµένης Η3 και µείωση της φωσφο-ακετυλιωµένης µορφής. Τέλος, η ακετυλιωµένη µορφή της ιστόνης Η4 αποτελεί το 38% περίπου της ολικής Η4 σε όλες τις αναπτυξιακές ζώνες, όπως και στα δείγµατα από τις ζώνες επιµήκυνσης και διαφοροποίησης των µαρτύρων. Συνοπτικά, οµαδοποιώντας τα παραπάνω αποτελέσµατα για κάθε αναπτυξιακή ζώνη της ρίζας, όπως φαίνεται και στον Πίνακα 5.3, θα µπορούσαµε να πούµε πως στα δείγµατα που προέρχονται από τη µεριστωµατική ζώνη αυξάνεται, σε σχέση µε τους µάρτυρες, η ποσοστιαία συµµετοχή των ισοµορφών Η1 0 (30% της Η1), Η2Α.1 (64% της Η2Α), Η2Β.2 (47% της Η2Β) και Η3.1 (37% της Η3), ενώ µειώνεται η συµµετοχή των ισοµορφών Η1Α (38% της Η1), Η2Α.2 (23% της Η2Α), Η2Β.1 (53% της Η2Β) και Η3.2 (63% της Η3). Σε ό,τι αφορά τις τροποποιηµένες µορφές των ιστονών, παρατηρείται µείωση της συµµετοχής της uη2α (13% της Η2Α) και της ακετυλιωµένης Η4 (38% της Η4) στα επίπεδα της ζώνης διαφοροποίησης των µαρτύρων, ενώ µειωµένη είναι και η συµµετοχή των τροποιηµένων µορφών της Η3. Για τα δείγµατα που προέρχονται από τη ζώνη επιµήκυνσης ισχύουν, σε µικρό ή µεγάλο βαθµό, οι παραπάνω µεταβολές σε σχέση µε τους µάρτυρες. Τέλος, στα δείγµατα που προέρχονται από τη ζώνη διαφοροποίησης, το πρότυπο κατανοµής των ισοµορφών και τροποποιηµένων µορφών των ιστονών εµφανίζει πολλές οµοιότητες µε αυτό της αντίστοιχης ζώνης των µαρτύρων. Εξαίρεση αποτελούν οι ισοµορφές των ιστονών Η2Β και Η3, το πρότυπο κατανοµής των οποίων είναι αντίστροφο από των δειγµάτων που προέρχονται από τη ζώνη διαφοροποίησης των µαρτύρων. 196

211 Πίνακας Συγκριτική απεικόνιση της ποσοστιαίας συµµετοχής των ισοµορφών και τροποποιηµένων µορφών των ιστονών στις τρείς αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας φυτών που αναπτύχθηκαν παρουσία αυξίνης. Κάθε τιµή είναι ο µέσος όρος των µετρήσεων τριών ανεξάρτητων πειραµάτων και µε αστερίσκο επισηµαίνονται οι τιµές που διαφέρουν σηµαντικά (τιµή P<0,05 µε βάση το κριτήριο t της κατανοµής Student) σε σχέση µε αυτές της µεριστωµατικής ζώνης των µαρτύρων. [Histone variants and modified forms distribution in samples derived from the developmental zones of roots treated with auxin. Each value is the average of three independent experiments and bars indicate the standard deviation of the measurement. Values significantly different at p<0.05 from corresponding values measured in samples derived from the meristematic zone of control roots are indicated by asterisks]. Μεριστωµατική Ζώνη Ζώνη Επιµήκυνσης Ζώνη ιαφοροποίησης Η1Α 36% * 38% * 38% * Η1Β 34% 30% 28% Η1 0 30% * 32% * 34% * Η2Α.1 64,5% * 64% * 64% * Η2Α.2 23% * 23% * 22% * uh2a 12,5% * 13% * 14% * Η2Β.1 53,5% * 59,5% 59,5% Η2Β.2 46,5% * 40,5% 40,5% Η3.1 37,5% * 42,5% * 36% * Η3.2 (0) 11,5% * 10,5% * 10,5% * Η3.2 (1) 41% * 38,5% 43,5% * Η3.2 (2) 10% * 8,5% * 10% * Η4 61,5% * 62% * 63,5% * ach4 38,5% * 38% * 36,5% * 197

212 3.5.4 Μεταβολή του προτύπου κατανοµής των ιστονών κατά την διαφοροποίηση των φυτικών κυττάρων παρουσία γιββεριλλίνης Η ανάλυση των πηκτών όξινης δισδιάστατης ηλεκτροφόρησης από δείγµατα που προήλθαν από τις τρείς αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας φυτών που αναπτύχθηκαν παρουσία γιββεριλλίνης και η µετέπειτα στατιστική επεξεργασία των αποτελεσµάτων έδειξαν ότι το πρότυπο κατανοµής των ιστονών µεταβάλλεται κατά την διαφοροποίηση των φυτικών κυττάρων στα παραπάνω φυτά και κατά την διαφοροποίησή τους σε φυτά µάρτυρες. Σε ό,τι αφορά τις συνδετικές ιστόνες, παρατηρείται στη µεριστωµατική ζώνη και στη ζώνη επιµήκυνσης αυξηµένη σε σχέση µε τους µάρτυρες συµµετοχή της ισοµορφής Η1Α, η οποία ξεπερνά το 45% περίπου της ολικής Η1, η συµµετοχή της ισοµορφής Η1Β διατηρείται στο 30% περίπου, ενώ µειώνεται η συµµετοχή της ισοµορφής Η1 0 (κάτω από το 25% της ολικής Η1). Στα δείγµατα που προέρχονται από τη ζώνη διαφοροποίησης η συµµετοχή της ισοµορφής Η1Α µειώνεται στο 40% περίπου της ολικής Η1, η συµµετοχή της ισοµορφής Η1Β διατηρείται σχετικά σταθερή στο 30%, ενώ η συµµετοχή της ισοµορφής Η1 0 ανέρχεται περίπου στο 30%, δηλαδή το πρότυπο κατανοµής είναι παρόµοιο µε αυτό της ζώνης διαφοροποίησης των µαρτύρων. Μεταβολές παρατηρούνται και στο πρότυπο κατανοµής της ιστόνης Η2Α, όπου η συµµετοχή της ισοµορφής Η2Α.1 ξεπερνά το 60% της ολικής σε όλες τις αναπτυξιακές ζώνες, ενώ η συµµετοχή της ισοµορφής Η2Α.2 και της uη2α εµφανίζονται µειωµένες σε σχέση µε τους µάρτυρες τόσο στη µεριστωµατική ζώνη, όπου αποτελούν η κάθε µία αντίστοιχα το 20% περίπου της ολικής Η2Α, όσο και στις ζώνες επιµήκυνσης και διαφοροποίησης, όπου η συµµετοχή της uη2α είναι παρόµοια µε αυτή της ζώνης διαφοροποίησης των µαρτύρων, δηλαδή αποτελεί περίπου το 13% της ολικής Η2Α. Σε ό,τι αφορά τις ισοµορφές της ιστόνης Η2Β, η ποσοστιαία συµµετοχή της Η2Β.1 εµφανίζεται αυξηµένη στη µεριστωµατική ζώνη, όπου αποτελεί το 64% της ολικής, µειώνεται στο 50% στη ζώνη επιµήκυνσης και αυξάνεται στο 57% στη ζώνη διαφοροποποίησης, ενώ το αντίστροφο ισχύει για τη συµµετοχή της ισοµορφής Η2Β.2. Το πρότυπο κατανοµής των ισοµορφών της Η3, σε ό,τι αφορά τα δείγµατα από την µεριστωµατική ζώνη και τη ζώνη επιµήκυνσης, είναι παρόµοιο µε αυτό των µαρτύρων, δηλαδή η ισοµορφές Η3.1 και Η3.2 αποτελούν αντίστοιχα το 30% και το 70% περίπου της ολικής 198

213 Η3. Στα δείγµατα από τη ζώνη διαφοροποίησης η συµµετοχή της ισοµορφή Η3.1 ξεπερνά το 33% της ολικής Η3, σε αντίθεση µε τους µάρτυρες, όπου στη ζώνη διαφοροποίησης η συµµετοχή της Η3.1 ήταν κάτω από το 20% της ολικής Η3. Οι τροποποιηµένες µορφές της Η3 αποτελούν το 55% περίπου της Η3 στα δείγµατα από τη µεριστωµατική ζώνη και στη ζώνη επιµήκυνσης, ενώ στα δείγµατα από τη ζώνη διαφοροποίησης, η συµµετοχή τους, που ανέρχεται στο 53% της ολικής Η3, δηλαδή είναι µειωµένη σε σχέση µε την αντίστοιχη της ζώνης διαφοροποίησης των µαρτύρων όπου αποτελεί το 60% της Η3. Επιπλέον, παρατηρείται σηµαντική αύξηση της συµµετοχής της φωσφορυλιωµένης µορφής της Η3 και αντίστοιχη µείωση της συµµετοχής της φωσφο-ακετυλιωµένης µορφής. Τελος, η ακετυλιωµένη µορφή της ιστόνης Η4 σε όλες τις αναπτυξιακές ζώνες αποτελεί περίπου το 33% της ολικής Η4, δηλαδή η συµµετοχή της είναι µειωµένη σηµαντικά σε σχέση µε τους µάρτυρες. Συνοπτικά, οµαδοποιώντας τα παραπάνω αποτελέσµατα για κάθε αναπτυξιακή ζώνη της ρίζας, όπως φαίνεται και στην Εικ. 5.4, θα µπορούσαµε να πούµε πως στα δείγµατα που προέρχονται από τη µεριστωµατική ζώνη παρατηρείται αυξηµένη συµµετοχή των ισοµορφών Η1Α (45% της Η1), Η2Α.1 (60% της Η2Α) και Η2Β.1 (64% της Η2Β), ενώ µειωµένη εµφανίζεται η συµµετοχή των ισοµορφών Η1 0 (25% της Η1) και Η2Α.2 (20% της Η2Α) και σταθερή σε σχέση µε τους µάρτυρες η συµµετοχή των ισοµορφών της Η3. Σε ό,τι αφορά τις τροποποιηµένες µορφές των ιστονών, η συµµετοχή της uη2α κυµαίνεται στα επίπεδα της µεριστωµατικής ζώνης των µαρτύρων (20% της Η2Α), όπως και η συµµετοχή των τροποποιηµένων µορφών της Η3 (55% της Η3), ενώ η συµµετοχή της ακετυλιωµένης Η4 είναι µειωµένη σε σχέση µε τους µάρτυρες (33% της Η4). Στα δείγµατα από τη ζώνη επιµήκυνσης διατηρείται σε µικρό ή µεγάλο βαθµό το παραπάνω πρότυπο, µε εξαίρεση τις ισοµορφές της Η2Β, όπου η κάθε µία αποτελεί το 50% της ολικής Η2Β και την uη2α, η συµµετοχή της οποίας µειώνεται στα επίπεδα της ζώνης διαφοροποίησης των µαρτύρων (13% της ολικής Η2Α). Τέλος. στα δείγµατα από τη ζώνη διαφοροποίησης το πρότυπο κατανοµής των ισοµορφών της Η1 είναι παρόµοιο µε αυτό της µεριστωµατικής ζώνης των µαρτύρων, δεδοµένου ότι οι ισοµορφές Η1Α, Η1Β και Η1 0 αποτελούν αντίστοιχα το 40%, το 32% και το 28% της ολικής Η1, οι ισοµορφές Η2Α.1 και Η2Α.2 αποτελούν αντίστοιχα το 60% και 27% της ολικής Η2Α, η συµµετοχή της Η2Β.1 αυξάνεται στο 58% της ολικής 199

214 Η2Β και η συµµετοχή της ισοµορφής Η3.1 ξεπερνά το 33% της ολικής Η3. Τέλος, οι ποσοστιαίες συµµετοχές των τροποποιηµένων µορφών των ιστονών διατηρούνται στα επίπεδα της ζώνης επιµήκυνσης. Πίνακας Συγκριτική απεικόνιση της ποσοστιαίας συµµετοχής των ισοµορφών και τροποποιηµένων µορφών των ιστονών στις τρείς αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας φυτών που αναπτύχθηκαν παρουσία γιββεριλλίνης. Κάθε τιµή είναι ο µέσος όρος των µετρήσεων τριών ανεξάρτητων πειραµάτων και µε αστερίσκο επισηµαίνονται οι τιµές που διαφέρουν σηµαντικά (τιµή P<0,05 µε βάση το κριτήριο t της κατανοµής Student) σε σχέση µε αυτές της µεριστωµατικής ζώνης των µαρτύρων. [Histone variants and modified forms distribution in samples derived from the developmental zones of roots treated with gibberellin. Each value is the average of three independent experiments and bars indicate the standard deviation of the measurement. Values significantly different at p<0.05 from corresponding values measured in samples derived from the meristematic zone of control roots are indicated by asterisks] Μεριστωµατική Ζώνη Ζώνη Επιµήκυνσης Ζώνη ιαφοροποίησης Η1Α 46% * 48,5% * 39,5% Η1Β 30% 28,5% 32% Η1 0 24% 23% 28,5% * Η2Α.1 60,5% * 61% * 60% * Η2Α.2 21% * 25,5% * 26,5% * uh2a 18,5% 13,5% * 13,5% * Η2Β.1 64% * 50% * 57,5% Η2Β.2 36% * 50% * 42,5% Η3.1 30% 28% 33,5% * Η3.2 (0) 15% 15,5% 13,5% * Η3.2 (1) 43% * 43% * 40,5% * Η3.2 (2) 12% * 13,5% * 12,5% * Η4 66% * 67,5% * 67% * ach4 34% * 32,5% * 33% * 200

215 3.5.5 Γενικά Συµπεράσµατα Συνοψίζοντας τα παραπάνω δεδοµένα, όπως αυτά προέκυψαν από την ανάλυση των πηκτών και τις ανοσοϊστοχηµικές µελέτες και λαµβάνοντας πάντα υπόψη τις αρχικές υποθέσεις εργασίας, µπορούµε να καταλήξουµε στα παρακάτω συµπεράσµατα: - Κατά τη διαφοροποίηση των φυτικών κυττάρων στις αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας του καλαµποκιού παρατηρούνται µεταβολές του προτύπου κατανοµής των ιστονών κυρίως µεταξύ της µεριστωµατικής ζώνης και της ζώνης διαφοροποίησης. Οι ποσοστιαίες συµµετοχές πολλών ισοµορφώνείναι διαφορετικές σ αυτές τις δύο αναπτυξιακές ζώνες, όπως και οι συµµετοχές των τροποποιηµένων µορφών των ιστονών. Παράλληλα, η ανοσοϊστοχηµική ανίχνευση των τροποποιηµένων µορφών των ιστονών έδειξε διαφορικό εντοπισµό σε σχέση µε το βαθµό διαφοροποίησης των κυττάρων της ρίζας. Αντίθετα, ελάχιστες και αµελητέες ήταν οι µεταβολές που παρατηρήθηκαν µεταξύ µεριστωµατικής ζώνης και ζώνης επιµήκυνσης. - Κατά την αποδιαφοροποίηση των φυτικών κυττάρων σε ιστοκαλλιέργειες κάλλων το πρότυπο κατανοµής των ιστονών εµφανίζει πολλές οµοιότητες µε το αντίστοιχο της µεριστωµατικής ζώνης των µαρτύρων, ανεξάρτητα από την αναπτυξιακή ζώνη από την οποία προήλθαν οι ιστοκαλλιέργειες των κάλλων. Παρόλα αυτά, οι ποσοστιαίες συµµετοχές ορισµένων ισοµορφών είναι διαφορετικές από τις αντίστοιχες της µεριστωµατικής ζώνης των µαρτύρων. - Το πρότυπο κατανοµής των ιστονών στις αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας παρουσία αυξίνης σε πολλές περιπτώσεις είναι παρόµοιο µε το αντίστοιχο της ζώνης διαφοροποίησης των µαρτύρων. Φυσικά, οι ποσοστιαίες συµµετοχές ορισµένων ισοµορφών και τροποποιηµένων µορφών εµφανίζουν διαφορές από τις αντίστοιχες των µαρτύρων. - Ακόµη πιο περίπλοκο είναι το πρότυπο κατανοµής των ιστονών στις αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας παρουσία γιββεριλλίνης. Σε αυτή την περίπτωση, οι ποσοστιαίες συµµετοχές των περισσότερων ισοµορφών των ιστονών διαφέρουν σηµαντικά από τις αντίστοιχες των µαρτύρων, ενώ σηµαντική µείωση εµφανίζουν οι συµµετοχές όλων σχεδόν των τροποποιηµένων µορφών των ιστονών. 201

216 4. ΣΥΖΗΤΗΣΗ 4.1 Φυτικό Υλικό και Μεθοδολογία Όπως έχει ήδη αναφερθεί, το κίνητρο για την εκπόνηση της παρούσας εργασίας ήταν αφ ενός το εξαιρετικό ενδιαφέρον που παρουσιάζει µία αναπτυξιακή προσέγγιση του προτύπου κατανοµής των ιστονών και αφ ετέρου το ότι οι µελέτες που έχουν γίνει αναφορικά µε τις ιστόνες σε φυτικούς οργανισµούς σε σχέση µε τη διαφοροποίηση των κυττάρων, αποτελούν ένα πολύ µικρό ποσοστό της συνολικής έρευνας που αφορά τις ιστόνες (βλ. Σκοπός της Εργασίας). Το πειραµατικό υλικό, δηλαδή η ρίζα του καλαµποκιού, επιλέχθηκε ως ένα κατάλληλο βιολογικό σύστηµα για αναπτυξιακές µελέτες, δεδοµένου ότι αποτελείται από τρείς αναπτυξιακές ζώνες, που διακρίνονται τόσο µε µορφολογικά όσο και µε φυσιολογικά κριτήρια και µπορούν εύκολα να διαχωριστούν [364,393]. Μελετήθηκαν επίσης και δείγµατα από ιστοκαλλιέργειες κάλλων (πρωτογενών, δευτερογενών και τριτογενών), που προέρχονταν από τις αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας, µε σκοπό τη µελέτη του προτύπου κατανοµής των ιστονών κατά την αποδιαφοροποίηση των φυτικών κυττάρων. Επιπλέον, αναλύθηκαν µε τον ίδιο τρόπο και δείγµατα από τις αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας φυτών που αναπτύχθηκαν παρουσία αυξίνης, καθώς και δείγµατα από τις αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας φυτών που αναπτύχθηκαν παρουσία γιββεριλλίνης, µε σκοπό την µελέτη του προτύπου κατανοµής των ιστονών κατά την επίδραση εξωγενών φυτοορµονών. Για τη µελέτη του προτύπου κατανοµής των ιστονών αποµονώθηκαν ιστόνες ξεχωριστά από κάθε αναπτυξιακή ζώνη ή ιστοκαλλιέργεια κάλλου και διαχωρίστηκαν ηλεκτροφορητικά, αρχικά µε SDS-PAGE, έπειτα µε όξινη ηλεκτροφόρηση σε σύστηµα οξικού οξέος-ουρίας και τέλος µε όξινη δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση, µία µέθοδο µε την οποία διαχωρίζονται οι ισοµορφές και οι τροποποιηµένες µορφές των ιστονών [399]. Στη συνέχεια, κάθε κύρια τάξη ιστόνων καθώς και οι κυριότερες τροποποιηµένες µορφές τους ταυτοποιήθηκαν µε ανάλυση κατά Western και τη βοήθεια των κατάλληλων αντισωµάτων. Η ανάλυση των πηκτών έγινε µε τη βοήθεια Η/Υ και του κατάλληλου λογισµικού και υπολογίστηκε έµµεσα η ποσοστιαία συµµετοχή κάθε ισοµορφής και τροποποιηµένης µορφής στην κύρια τάξη ιστονών που ανήκει. Κάθε δείγµα αναλύθηκε σε τρία ανεξάρτητα πειράµατα (δηλ. συλλογή φυτικού υλικού/καλλιέργεια κάλλου, εκχύλιση 202

217 πρωτεϊνών, ηλεκτροφόρηση, ανάλυση της πηκτής) για ελεγχθεί η επαναληψιµότητα των αποτελεσµάτων. Για να προσδιοριστούν οι σηµαντικές διαφορές στις ποσοστιαίες συµµετοχές των ισοµορφών στα δείγµατα έγινε στατιστική ανάλυση των αποτελεσµάτων των µετρήσεων µε τη βοήθεια του κριτηρίου t της κατανοµής Student για δείγµατα µε διαφορετικούς µέσους όρους και διαφορετικές διακυµάνσεις (βλ. Υλικά και Μέθοδοι). Επιπλέον, έγινε in situ ανοσοανίχνευση ορισµένων τροποποιηµένων µορφών των ιστονών σε εγκάρσιες τοµές της ρίζας ώστε να διαπιστωθούν οι ιστοί όπου αυτές εντοπίζονται. Στη συνέχεια θα συζητηθεί ο διαχωρισµός και η ταυτοποίηση των ιστονών στο καλαµπόκι που έγινε στην παρούσα εργασία και θα γίνει σύγκριση των αποτελεσµάτων µε παλιότερες µελέτες σε άλλους φυτικούς οργανισµούς. Έπειτα, θα συζητηθούν οι µεταβολές στο πρότυπο κάθε κύριας τάξης ιστονών σε κάθε µία από τις παραπάνω περιπτώσεις, δηλαδή σε κάθε µία από τις αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας, σε ιστοκαλλιέργειες κάλλων και στις αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας φυτών που αναπτύχθηκαν παρουσία φυτοορµονών. Τέλος, θα παρατεθούν τα γενικά συµπεράσµατα που εξήχθησαν από την εργασία αναφορικά µε το πρότυπο κατανοµής των ιστονών κατά τη διαφοροποίηση των φυτικών κυττάρων σε κάθε µία από τις περιπτώσεις που µελετήθηκαν και θα αναφερθούν ορισµένες µελλοντικές αναπτυξιακές µελέτες που µπορούν να γίνουν έχοντας ως βάση το σκοπό και το αντικείµενο της παρούσας εργασίας. 203

218 4.2 Ταυτοποίηση των ιστονών στο καλαµπόκι (Zea mays L.) Η ταυτοποίηση των ιστονών του καλαµποκιού, των ισοµορφών τους και των τροποποιηµένων µορφών τους στην παρούσα εργασία στηρίχτηκε στην διαφορετική ηλεκτροφορητική κινητικότητά τους σε ηλεκτροφόρηση παρουσία οξικού οξέος και ουρίας και στην µετέπειτα ανοσοανίχνευσή τους µε τα κατάλληλα αντισώµατα. Επιπλέον, έγινε σύγκριση των γνωστών αλληλουχιών των ισοµορφών των ιστονών µε αντίστοιχες άλλων φυτικών οργανισµών µε σκοπό τον σωστό προσδιορισµό της κάθε µίας. Οι ισοµορφές της συνδετικής ιστόνης Η1 σε ηλεκτροφόρηση παρουσία SDS διαχωρίζονται ως τρείς ζώνες µε µοριακά βάρη 43, 39 και 37kDa, οι οποίες αντιδρούν µε το αντίσωµα ενάντια στην ολική Η1. Επιπλέον, οι δύο πρώτες αντιδρούν µε το αντίσωµα που αναγνωρίζει τις κύριες ισοµορφές Η1Α και Η1Β, ενώ η τρίτη µε το αντίσωµα ενάντια στην ισοµορφή Η1 0. Κατά την ανοσοανίχνευση έπειτα από όξινη ηλεκτροφόρηση το αντισώµα για την Η1 αναγνωρίζει δύο ζώνες, ενώ από µία αναγνωρίζουν τα αντισώµατα για την Η1Α+Β και για την Η1 0. Τα παραπάνω αποτελέσµατα της ανοσοανίχνευσης έρχονται σε συµφωνία µε παλιότερες µελέτες που είχαν γίνει αναφορικά µε τις ισοµορφές της Η1 στο καλαµπόκι και σε άλλους φυτικούς οργανισµούς [402,411]. Όπως είναι γνωστό, η συνδετική ιστόνη Η1 εµφανίζει τη µεγαλύτερη ετερογένεια από όλες τις κύριες τάξεις ιστονών. Πολλές ισοµορφές της Η1 έχουν βρεθεί και µελετηθεί τόσο σε ζωϊκούς [1,72] όσο και σε φυτικούς οργανισµούς [69,402,410] και εκτός από τις κύριες ισοµορφές, ο αριθµός των οποίων ποικίλλει µεταξύ των διαφόρων ειδών, έχουν βρεθεί και ισοµορφές που η σύνθεσή τους εξαρτώνται από το αναπτυξιακό στάδιο του οργανισµού, από τον βαθµό διαφοροποίησης του κυττάρου, από εξωκυτταρικά µηνύµατα ή που συναντώνται σε συγκεκριµένους κυτταρικούς τύπους [7]. Με τον ίδιο τρόπο, δηλαδή µε ηλεκτροφόρηση και ανοσοανίχνευση, ταυτοποιήσαµε δύο ισοµορφές της ιστόνης Η2Α καθώς και την ουβικουιτινωµένη µορφή της. Έπειτα από ηλεκτροφόρηση παρουσία SDS, το αντίσωµα ενάντια στην Η2Α αναγνωρίζει δύο ζώνες µεγέθους 21 και 30kDa περίπου, ενώ το αντίσωµα ενάντια στην ουβικουιτινωµένη µορφή της Η2Α αναγνωρίζει µόνο τη δεύτερη. Οι δύο ισοµορφές της Η2Α διαχωρίζονται µε όξινη ηλεκτροφόρηση παρουσία ουρίας 8Μ καθώς και µε όξινη δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση. Μελέτες σε άλλους οργανισµούς αναφορικά µε τη συγκεκριµένη ιστόνη Η2Α έδειξαν πως στα κύτταρα των 204

219 ζωϊκών οργανισµών υπάρχουν δύο κύριες ισοµορφές της ιστόνης Η2Α και δύο δευτερεύουσες, οι οποίες αργότερα βρέθηκαν και σε ορισµένους φυτικούς οργανισµούς [1,3]. Αντίστοιχες µελέτες που έγιναν στο σιτάρι έδειξαν πως υπάρχουν δύο διαφορετικές ισοµορφές της Η2Α. Από αυτές, η µία φέρει στο καρβοξυτελικό της άκρο το συντηρηµένο µοτίβο SPKK, συντίθεται παράλληλα µε την αντιγραφή του DNA και συσσωρεύεται σε διαιρούµενα κύτταρα, ενώ η άλλη, η οποία εµφανίζει 75% οµολογίας µε την πρώτη, δεν φέρει το παραπάνω µοτίβο και συναντάται κυρίως σε µη διαιρούµενα κύτταρα [412]. Η σύγκριση των αλληλουχιών των Η2Α του σιταριού µε τις αλληλουχίες των προϊόντων των 16 γονιδίων που κωδικοποιούν τις ιστόνες Η2Α στο καλαµπόκι δείχνει ότι το παραπάνω πρότυπο πιθανόν ισχύει και σε αυτό το µονοκοτυλήδονο φυτό (βλ. Παράρτηµα). Συγκεκριµένα, η πρώτη ισοµορφή, που φέρει το µοτίβο SPKK εµφανίζει οµολογία πάνω από 80% µε τα προϊόντα 7 γονιδίων του καλαµποκιού, ενώ η δεύτερη, από την οποία απουσιάζει το µοτίβο αυτό, εµφανίζει οµολογία πάνω από 90% µε τα προϊόντα των υπολοίπων 9 γονιδίων. Σε ότι αφορά την ιστόνη Η2Β, µε τη βοήθεια του κατάλληλου αντισώµατος και της διαφορετικής ηλεκτροφορητικής κινητικότητάς τους σε όξινη ηλεκτροφόρηση, ταυτοποιήσαµε δύο ισοµορφές. Αντίθετα, σε ηλεκτροφόρηση παρουσία SDS, το αντίσωµα αντιδρά µε µία ζώνη µε µοριακό βάρος περίπου 21kDa. Μελέτες σε άλλους οργανισµούς έδειξαν πως η Η2Β στους περισσότερους ζωικούς οργανισµούς αποτελείται από τουλάχιστον δύο κύριες ισοµορφές, ενώ στον άνθρωπο και σε ορισµένα θηλαστικά έχει βρεθεί και µία επιπλέον δευτερεύουσα ισοµορφή, που εκφράζεται ανεξάρτητα από την αντιγραφή του DNA [1]. Αντίστοιχα, στους περισσότερους φυτικούς οργανισµούς έχουν βρεθεί δύο ισοµορφές της Η2Β, οι οποίες διαφέρουν σηµαντικά, τόσο µεταξύ τους, όσο και µε τις αντίστοιχες ισοµορφές των ζώων [54]. Στο καλαµπόκι, από τα 13 γονίδια που κωδικοποιούν τις ιστόνες Η2Β, τα 11 παράγουν όµοια πολυπεπτίδια, τα οποία εµφανίζουν οµολογία πάνω από 85% µε την Η2Β του ανθρώπου, ενώ η αλληλουχία του προϊόντος των άλλων δύο γονιδίων διαφέρει κατά 20% περίπου από το προϊόν των υπολοίπων (βλ. Παράρτηµα). Η ιστόνη Η3 κατά την ηλεκτροφόρηση παρουσία SDS δίνει µία ζώνη µε µοριακό βάρος 17kDa περίπου, ενώ µε όξινη ηλεκτροφόρηση παρουσία ουρίας 6Μ δύο ζώνες, µία εκ των οποίων, συγκεκριµένα αυτή µε τη µικρότερη κινητικότητα, είναι τριπλή, που αντιδρούν µε το αντίσωµα εναντίον της ολικής Η3 και αντιστοιχούν 205

220 σε δύο ισοµορφές. Από τις δύο επιπλέον ζώνες, η µία αναγνωρίζεται από το αντίσωµα ενάντια στην ακετυλιωµένη Η3, ενώ και οι δύο αντιδρούν µε το αντίσωµα ενάντια στη φωσφορυλιωµένη στη Ser10 H3. Μελέτες σε ζωϊκούς οργανισµούς έδειξαν πως η ιστόνη Η3 αποτελείται από τρείς ισοµορφές. Από αυτές, οι δύο θεωρούνται κύριες ισοµορφές και η σύνθεσή τους εξαρτάται από την αντιγραφή του DNA, ενώ η τρίτη συντίθεται και ενσωµατώνεται στη χρωµατίνη καθ όλη τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου [1,4]. Αντίστοιχα, σε πολλά µονοκοτυλήδονα και δικοτυλήδονα φυτά, όπως το σιτάρι, το καλαµπόκι, η βρώµη, το ρύζι και η µηδική, έχουν βρεθεί δύο ισοµορφές της Η3, η µία από τις οποίες συµπεριφέρεται όπως η Η3.3 των ζωϊκών οργανισµών, δηλαδή συντίθεται ανεξάρτητα από την αντιγραφή του DNA, ενώ χαρακτηρίζεται και από υψηλό επίπεδο τροποποιήσεων [4,5,22,55-57]. Στο καλαµπόκι έχουν βρεθεί 14 γονίδια που κωδικοποιούν τις ιστόνες Η3, από τα οποία τα 13 κωδικοποιούν όµοια πολυπεπτίδια, τα οποία εµφανίζουν 100% οµολογία µε την ισοµορφή Η3.2 της µηδικής ενώ το προϊόν ενός γονιδίου διαφέρει σηµαντικά από τα υπόλοιπα (βλ. Παράρτηµα). Το προϊόν αυτού του γονιδίου έχει µεγαλύτερο µέγεθος από τις υπόλοιπες Η3 (αποτελείται από 157 αµινοξέα έναντι 136), εµφανίζει ποσοστό οµολογίας περίπου 85% µε αυτές και αντιστοιχεί στην κεντροµερική Η3 του καλαµποκιού. Οι συγκεκριµένες ισοµορφές της Η3 (CenH3s) έχουν µε µελετηθεί σε ένα ευρύ φάσµα ζωικών και φυτικών οργανισµών και έχει βρεθεί πως υπάρχουν στη χρωµατίνη του κεντροµέρους των µεταφασικών χρωµοσωµάτων, όπου αντικαθιστούν την Η3. Επιπλέον, το αµινοτελικό άκρο τους χαρακτηρίζεται από µεγάλο βαθµό ετερογένειας, ενώ απουσιάζουν από αυτό οι γνωστές θέσεις τροποποίησης της Η3, όπως π.χ. η Ser10 [413,414]. Τέλος, µε τη βοήθεια των κατάλληλων αντισωµάτων, ενάντια στην ολική και την ακετυλιωµένη Η4, έγινε και η ταυτοποίηση της ιστόνης Η4 καθώς και της µονοακετυλιωµένης µορφής της. Έπειτα από ηλεκτροφόρηση παρουσία SDS, η Η4 εµφανίζεται ως µία ζώνη µε µοριακό βάρος περίπου 13kDa, ενώ σε όξινη ηλεκτροφόρηση διαχωρίζεται και η ακετυλιωµένη µορφή της. Η ιστόνη Η4 είναι γνωστό πως αποτελεί την εξαίρεση στην ετερογένεια των ιστονών, δεδοµένου πως σε όσους τους οργανισµούς, φυτικούς και ζωϊκούς, που έχει µελετηθεί δεν έχουν βρεθεί ισοµορφές [1]. Στο καλαµπόκι, υπάρχουν 15 γονίδια της Η4 και όλα κωδικοποιούν το ίδιο πολυπεπτίδιο, το οποίο αποτελείται από 103 αµινοξέα (βλ. Παράρτηµα) και εµφανίζει 206

221 υψηλό βαθµό οµολογίας τα αντίστοιχα άλλων φυτικών αλλά και ζωικών οργανισµών. Για παράδειγµα, η ιστόνη Η4 του καλαµποκιού εµφανίζει 100% οµολογία µε αυτή του ανθρώπου. Επιπλέον, από µελέτες σε άλλους φυτικούς οργανισµούς βρέθηκε πως η Η4 χαρακτηρίζεται από υψηλό επίπεδο ακετυλίωσης, η οποία µπορεί να πραγµατοποιηθεί σε ένα έως πέντε αµινοξέα του αµινοτελικού της άκρου, τα οποία είναι εξαιρετικά διατηρηµένα σε όλους τους ευκαρυωτικούς οργανισµούς. Με άλλα λόγια, µπορούν να υπάρξουν µέχρι και πέντε διαφορετικά επίπεδα ακετυλίωσης της ιστόνης Η4, γεγονός που εξαρτάται από την µεταγραφική ενεργότητα κάθε περιοχής της χρωµατίνης. Παρόλα αυτά έχει διαπιστωθεί πως κυριότερος στόχος της ακετυλίωσης στα φυτά είναι η ιστόνη Η3, ενώ η ακετυλίωση της ιστόνης Η4 κυριαρχεί στα ζώα και στους µύκητες [22,35]. Τέλος, σε ότι αφορά τον αριθµό των αµινοξέων της Η4 που τροποποιούνται, βρέθηκε σε ιστοκαλλιέργειες κάλλων µηδικής πως η Η4 αποτελείται κατά 25% από τη µη τροποποιηµένη µορφή της και κατά 75% από την µονοακετυλιωµένη µορφή της [415]. 207

222 4.3 Το πρότυπο κατανοµής των ιστονών στις αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας Ήδη από προηγούµενες µελέτες ήταν γνωστό πως η σύσταση της χρωµατίνης και ειδικότερα, το πρότυπο κατανοµής των ιστονών παρουσιάζει σηµαντικές µεταβολές µεταξύ µεριστωµατικών και διαφοροποιηµένων φυτικών κυττάρων [393]. Το γεγονός αυτό είναι σε µεγάλο βαθµό αναµενόµενο, δεδοµένου πως η διαφορετική φυσιολογική κατάσταση των κυττάρων στις παραπάνω περιπτώσεις συνεπάγεται και διαφορές στη δοµή και στη λειτουργία της χρωµατίνης. Γι αυτό το λόγο επιλέξαµε να µελετήσουµε τις παραπάνω µεταβολές στις τρείς αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας του καλαµποκιού, οι οποίες αφ ενός είναι εύκολο να διαχωριστούν και αφ ετέρου εµφανίζουν ευδιάκριτες διαφορές, όσο αφορά τη µορφολογία τους και τη φυσιολογική κατάσταση των κυττάρων που τις αποτελούν. Συγκεκριµένα, η µεριστωµατική ζώνη αποτελείται από ταχυδιαιρούµενα, µεριστωµατικά κύτταρα και εκεί συντελούνται οι κυτταροδιαιρέσεις από τις οποίες σχηµατίζονται όλοι οι ιστοί της ρίζας. Στη ζώνη επιµήκυνσης ελαττώνεται ο αριθµός των κυτταροδιαιρέσεων, συντελείται η επιµήκυνση των κυττάρων και σχηµατίζονται οι πρόδροµοι ιστοί της ρίζας. Αξίζει να σηµειωθεί πως στην περιοχή µεταξύ των δύο παραπάνω ζωνών συνυπάρχουν οι κυτταρικές διαιρέσεις και η επιµήκυνση των κυττάρων, όµως οι ρυθµοί µε τους οποίους συµβαίνουν σταδιακά µειώνονται και αυξάνονται αντίστοιχα [364]. Τέλος, στη ζώνη διαφοροποίησης τα κύτταρα βρίσκονται στο τελικό στάδιο διαφοροποίησής τους και συγκροτούν τους διάφορους ιστούς της ρίζας. Οι κυριότεροι ιστοί που συναντώνται στη ζώνη διαφοροποίησης είναι ο κεντρικός κύλινδρος που αποτελείται από τα αγωγά στοιχεία της ρίζας και την εντεριώνη, το περικύκλιο και την ενδοδερµίδα που περιβάλλουν τον κεντρικό κύλινδρο, τον φλοιό, την εξωδερµίδα και τέλος την επιδερµίδα, που είναι ο εξωτερικός ιστός της ρίζας. Εκτός από τις µορφολογικές διαφορές υπάρχουν και διαφορές στη φυσιολογική κατάσταση των κυττάρων των διαφόρων ιστών. Για παράδειγµα, η εντεριώνη και ο φλοιός αποτελούνται από µη διαιρούµενα, παρεγχυµατικά κύτταρα, τα κύτταρα του περικυκλίου είναι γνωστό πως διατηρούν τις µεριστωµατικές τους ιδιότητες, ενώ τέλος στα κύτταρα της επιδερµίδας παρατηρείται υψηλός ρυθµός αντιγραφής, µεταγραφής και πρωτεϊνοσύνθεσης κατά τον σχηµατισµό των ριζικών τριχιδίων [ ]. 208

223 Οι παραπάνω διαφορές στη φυσιολογική κατάσταση των κυττάρων των τριών αναπτυξιακών ζωνών συνεπάγονται και διαφορές στη δοµή και λειτουργία της χρωµατίνης, συνεπώς και στη κατανοµή των ισοµορφών και στο βαθµό τροποποίησης των ιστονών. Σε γενικές γραµµές θα µπορούσαµε να πούµε πως µε βάση τα αποτελέσµατα τόσο από την ανάλυση των πηκτών, όσο και από την ανοσοϊστοχηµική ανίχνευση, το πρότυπο κατανοµής των ιστονών µεταβάλλεται µεταξύ των αναπτυξιακών ζωνών της ρίζας, και η µεταβολή είναι πιο εµφανής όταν συγκρίνονται η µεριστωµατική ζώνη και η ζώνη διαφοροποίησης. Η ποσοστιαία συµµετοχή ορισµένων ισοµορφών, όπως π.χ. της H1 0, της H2A.1, H2B.2 και της H3.2 είναι αυξηµένη στα δείγµατα από τη ζώνη διαφοροποίησης, ενώ αντίθετα, οι συµµετοχές π.χ. της ουβικουιτωµένης H2A και της ακετυλιωµένης H4 εµφανίζονται µειωµένες σε σχέση µε τα δείγµατα από τις δύο άλλες ζώνες. Παρόµοιες µεταβολές έχουν µελετηθεί και σε άλλους φυτικούς και ζωικούς οργανισµούς και έχουν συσχετισθεί µε τη φυσιολογική κατάσταση των κυττάρων. Για παράδειγµα, η ισοµορφή Η1 0 έχει συσχετιστεί µε τη διαφοροποίηση των κυττάρων σε όσους οργανισµούς, ζωικούς και φυτικούς, έχει µελετηθεί [9], ενώ η ισοµορφή Η3.2 σχετίζεται µε τη διαφοροποίηση των φυτικών κυττάρων [5]. Αντίθετα, ορισµένες τροποποιήσεις των ιστονών, όπως η ουβικουιτίνωση, η φωσφορυλίωση της Η3 και η ακετυλίωση της Η4 έχουν συσχετισθεί µε την κυτταρική διαίρεση, τόσο σε ζωικά όσο και σε φυτικά κύτταρα [219,176,418]. Επιπλέον, οι αυξηµένες, σύµφωνα µε την ανάλυση των πηκτών, ποσοστιαίες συµµετοχές των τροποποιηµένων µορφών των ιστονών στα δείγµατα από τη µεριστωµατική ζώνη, έρχονται σε συµφωνία µε την ανοσοϊστοχηµική ανίχνευσή τους στις τοµές της ρίζας, η οποία έδειξε πως ανιχνεύονται σε όλα τα κύτταρα της µεριστωµατικής ζώνης, ενώ αντίθετα στη ζώνη διαφοροποίησης, µόνο στα κύτταρα που διατηρούν τις µεριστωµατικές τους ιδιότητες, δηλαδή στο περικύκλιο και την επιδερµίδα [385] και σχεδόν απουσιάζουν από τα διαφοροποιηµένα, παρεγχυµατικά κύτταρα του φλοιού και της εντεριώνης. Το γεγονός αυτός θα µπορούσε να αποτελέσει ένα ακόµη στοιχείο, µαζί µε την αυξηµένη συµµετοχή τους στα δείγµατα από τη µεριστωµατική ζώνη, που να συνδέει τις τροποποιήσεις που µελετήθηκαν, δηλαδή την ουβικουιτίνωση της Η2Α, τη φωσφορυλίωση της Η3 και την ακετυλίωση των Η3 και Η4 µε την κυτταρική διαίρεση. Η εικόνα αυτή αντιστρέφεται κατά την ανίχνευση της ισοµορφής Η1 0, η οποία εντοπίζεται στα κύτταρα του φλοιού και της εντεριώνης και σχεδόν απουσιάζει από τα 209

224 µεριστωµατικά κύτταρα, ένα στοιχείο πουσυνάδει µε το ήδη γνωστό ρόλο της στη διαφοροποίηση των κυττάρων. Στη συνέχεια, θα συζητηθούν αναλυτικότερα οι παρατηρούµενες µεταβολές ξεχωριστά σε κάθε κύρια τάξη ιστονών στις τρείς αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας. Σε ότι αφορά τη συνδετική ιστόνη Η1, η ανάλυση των πηκτών έδειξε ότι στα δείγµατα που προέρχονται από τη µεριστωµατική ζώνη των µαρτύρων κυριαρχεί η ισοµορφή Η1Α (πάνω από 40%), ενώ η ισοµορφή Η1 0 αποτελεί το 25% της ολικής Η1. Το πρότυπο αυτό διατηρείται σταθερό και στη ζώνη επιµήκυνσης, ενώ στα δείγµατα που προέρχονται από τη ζώνη διαφοροποίησης, η συµµετοχή της Η1Α µειώνεται στο 35% ενώ αυτή της Η1 0 αυξάνεται στο 33%. Η ποσοστιαία συµµετοχή της ισοµορφής Η1Β διατηρείται σταθερή (περίπου 32% της ολικής Η1) σε όλες τις αναπτυξιακές ζώνες. Παράλληλα, η ανοσοϊστοχηµική µελέτη που έγινε σε τοµές της ρίζας µε τη βοήθεια αντισωµάτων που αναγνωρίζουν τις συνδετικές ιστόνες έδειξε ότι οι κύριες ισοµορφές Η1Α και Η1Β συναντώνται σε όλους τους ιστούς της ρίζας, ανεξάρτητα από τη φυσιολογική τους κατάσταση, ενώ η ισοµορφή Η1 0 εντοπίζεται κυρίως σε διαφοροποιηµένα, παρεγχυµατικά κύτταρα του φλοιού και της εντεριώνης. Αντίθετα, τα κύτταρα της µεριστωµατικής ζώνης εµφανίζουν σαφώς µικρότερης έντασης αντίδραση µε το αντίσωµα της Η1 0. Το παρατηρούµενο πρότυπο κατανοµής των ισοµορφών της ιστόνης Η1 ήταν σε µεγάλο βαθµό αναµενόµενο, δεδοµένου ότι η ισοµορφή Η1 0 έχει ήδη συσχετισθεί µε τη διαφοροποίηση των κυττάρων [7-9]. Η συγκεκριµένη ισοµορφή αρχικά είχε ανακαλυφθεί σε ζωϊκά κύτταρα µε χαµηλό ρυθµό διαιρέσεων και βρέθηκε πως συσσωρεύεται σε κύτταρα που είχαν φτάσει στο τελικό στάδιο της διαφοροποίησής τους. Στη συνέχεια βρέθηκε και σε φυτικούς οργανισµούς, όπου επίσης συσχετίστηκε µε τη µετάβαση των κυττάρων στη διαφοροποίηση [9]. Η παρατηρούµενη αύξηση της ποσοστιαίας συµµετοχής της Η1 0 στα δείγµατα από τη ζώνη διαφοροποίησης καθώς και ο εντοπισµός της στα παρεγχυµατικά κύτταρα του φλοιού και της εντεριώνης, τα οποία είναι διαφοροποιηµένα κύτταρα και η λειτουργία τους κυρίως συνίσταται στην αποθήκευση θρεπτικών ουσιών, έρχονται σε πλήρη συµφωνία µε τα παραπάνω δεδοµένα. Ενδιαφέρον παρουσιάζει η παρουσία της Η1 0 στα δείγµατα από τη µεριστωµατική ζώνη, όπου αποτελεί και το 1/4 περίπου της ολικής Η1, παρουσία η οποία επιβεβαιώνεται και από την ανοσοαντίδραση, έστω και µειωµένης έντασης, των µεριστωµατικών κυττάρων µε το αντίσωµα της Η1 0. Είναι γνωστό πως οι συνδετικές ιστόνες παίζουν 210

225 σηµαντικό ρόλο στη δοµή της χρωµατίνης [11], ενώ έχει προταθεί ότι συµµετέχουν στη ρύθµιση της µεταγραφής επιτρέποντας ή αποτρέποντας την πρόσβαση των µεταγραφικών παραγόντων στο εκµαγείο του DNA [71], ενώ είναι πιθανόν κάθε µία ισοµορφή της Η1 να επιτελεί και ξεχωριστή λειτουργία [7]. Συνεπώς, η ανεξάρτητη από τον κυτταρικό κύκλο σύνθεση της Η1 0 και η ικανότητά της να αντικαθιστά τις άλλες ισοµορφές της Η1, µεταβάλλοντας µε αυτό τον τρόπο τη δοµή της χρωµατίνης σε συγκεκριµένες περιοχές του γονιδιώµατος, να την καθιστά απαραίτητη στη λειτουργία και των µεριστωµατικών κυττάρων. Αναφορικά µε τη ιστόνη Η2Α, η ανάλυση των πηκτών έδειξε ότι στα δείγµατα που προέρχονται από τη µεριστωµατική ζώνη των µαρτύρων οι κύριες ισοµορφές Η2Α.1 και Η2Α.2 αποτελούν αντίστοιχα το 50% και το 30% περίπου της ολικής Η2Α ενώ η ποσοστιαία συµµετοχή της ουβικουιτινωµένης µορφής της Η2Α (uη2α) ξεπερνά το 20%. Το παραπάνω πρότυπο διατηρείται και στη ζώνη επιµήκυνσης, ενώ στα δείγµατα που προέρχονται από τη ζώνη διαφοροποίησης η συµµετοχή της uη2α µειώνεται στο 12% της ολικής Η2Α και αντίστοιχα αυξάνεται η συµµετοχή των ισοµορφών Η2Α.1 και Η2Α.2. Παράλληλα, η ανοσοϊστοχηµική µελέτη που έγινε σε τοµές της ρίζας µε τη βοήθεια αντισωµάτων που αναγνωρίζουν την uη2α έδειξε ότι η τροποποίηση αυτή συναντάται σε όλα τα κύτταρα της µεριστωµατικης ζώνης, ενώ στη ζώνη διαφοροποίησης εντοπίζεται στα κύτταρα του περικυκλίου και της επιδερµίδας, ενώ σχεδόν απουσιάζει από τα κύτταρα του φλοιού και της εντεριώνης. Από παλιότερες µελέτες στη ζύµη, στο Physarum, στον ποντικό, στον άνθρωπο καθώς και σε άλλους οργανισµούς, είναι γνωστό ότι η ουβικουιτίνωση των ιστονών σχετίζεται µε τη µίτωση, ενώ το επίπεδό της µειώνεται κατά τη διαφοροποίηση των ζωικών κυττάρων [218,240,403,413,414]. Σε συµφωνία µε τα παραπάνω δεδοµένα έρχεται η παρατηρούµενη µείωση της ποσοστιαίας συµµετοχής της uη2α στα δείγµατα από τη ζώνη διαφοροποίησης, καθώς και ο ανοσοϊστοχηµικός εντοπισµός της στα κύτταρα του περικυκλίου, τα οποία είναι γνωστό πως διατηρούν τις µεριστωµατικές τους ιδιότητες [367,407] και η απουσία της από τα παρεγχυµατικά κύτταρα του φλοιού και της εντεριώνης. Η κατανοµή της ιστόνης Η2Β επίσης µεταβάλλεται κατά τη διαφοροποίηση των φυτικών κυττάρων. Σύµφωνα µε την ανάλυση των πηκτών, στα δείγµατα που προέρχονται από τη µεριστωµατική ζώνη και τη ζώνη επιµήκυνσης των µαρτύρων, κυριαρχεί η ισοµορφή Η2Β.1, η ποσοστιαία συµµετοχή της οποίας 211

226 ανέρχεται στο 60% περίπου της ολικής Η2Β, ενώ η ισοµορφή Η2Β.2 αποτελεί το υπόλοιπο 40%. Στα δείγµατα που προέρχονται από τη ζώνη διαφοροποίησης παρατηρείται σχετική µείωση της ποσοστιαίας συµµετοχής της Η2Β.1 και αύξηση της συµµετοχής της Η2Β.2 (53% και 47% αντίστοιχα). Οι παρατηρούµενες µεταβολές στην ποσοστιαία συµµετοχή των παραπάνω ισοµορφών είναι πιθανό να σχετίζονται µε τις διαφορές στη φυσιολογική κατάσταση µεταξύ των κυττάρων της µεριστωµατικής ζώνης και της ζώνης διαφοροποίησης. Στον άνθρωπο, καθώς και σε άλλα θηλαστικά, έχουν βρεθεί τρείς ισοµορφές της Η2Β, µία από τις οποίες συντίθεται ανεξάρτητα από την αντιγραφή του DNA [2]. Αν το παραπάνω πρότυπο σύνθεσης των ισοµορφών της Η2Β ισχύει και στα φυτά, όπου υπάρχουν δύο ισοµορφές της Η2Β [54], τότε είναι πιθανό η παρατηρούµενη µεταβολή να οφείλεται στην ανεξάρτητη από τον κυτταρικό κύκλο σύνθεση της µίας ισοµορφής που οδηγεί στην αυξηµένη παρουσία της στα διαφοροποιηµένα κύτταρα. ιαφορές παρατηρήθηκαν και σε ότι αφορά τις ισοµορφές και τροποποιηµένες µορφές της ιστόνης Η3. Με βάση την ανάλυση των πηκτών, στα δείγµατα που προέρχονται από τη µεριστωµατική ζώνη των µαρτύρων οι ισοµορφές Η3.1 και Η3.2 αποτελούν αντίστοιχα το 30% και το 70% περίπου της ολικής Η3, ενώ οι τροποποιηµένες µορφές της Η3, οι οποίες εντοπίζονται στην ισοµορφή Η3.2, αποτελούν συνολικά το 55% περίπου της ολικής Η3. Το παραπάνω πρότυπο διατηρείται, µε ελάχιστες µεταβολές, και στη ζώνη επιµήκυνης, ενώ στα δείγµατα που προέρχονται από τη ζώνη διαφοροποίησης παρατηρείται αύξηση της ποσοστιαίας συµµετοχής της ισοµορφής Η3.2, η οποία ξεπερνά το 80% της ολικής Η3, ενώ η συµµετοχή των τροποποιηµένων µορφών της Η3 διατηρείται σχετικά σταθερή. Η συµµετοχή της ισοµορφής Η3.1 µειώνεται δραµατικά και πέφτει κάτω από το 20% της συνολικής Η3. Από µελέτες σε φυτικούς οργανισµούς έχει βρεθεί ότι η ισοµορφή Η3.2 σχετίζεται µε την διαφοροποίηση των κυττάρων και θεωρείται αντίστοιχη της, ανεξάρτητης από την αντιγραφή, ισοµορφής Η3.3 των ζωικών οργανισµών [4,5,22,55-57]. Συνεπώς, η σχετική αύξηση της ποσοστιαίας συµµετοχής της ισοµορφής Η3.2 στα δείγµατα από τη ζώνη διαφοροποίησης έρχεται σε συµφωνία µε τα παραπάνω δεδοµένα. Αντίθετα, η αµετάβλητη συµµετοχή των τροποποιηµένων µορφών της Η3 δεν µπορεί να θεωρηθεί ως αναµενόµενη, δεδοµένου ότι σε ευρύ φάσµα ζωικών και φυτικών οργανισµών η φωσφορυλίωση της Η3 έχει συσχετισθεί µε τη µίτωση [24,25], ενώ η ακετυλίωσή της µε τη µεταγραφική 212

227 ενεργοποίηση [22,35]. Παρόλα αυτά, είναι πιθανό ένα επίπεδο τροποποίησης των ιστονών στη χρωµατίνη των διαφοροποιηµένων κυττάρων είναι απαραίτητο για τη λειτουργία της. Η ανοσοϊστοχηµική µελέτη που έγινε σε τοµές της ρίζας µε τη βοήθεια αντισωµάτων που αναγνωρίζουν την φωσφορυλιωµένη στη Ser10 µορφή της ιστόνης Η3 καθώς και την ακετυλιωµένη Η3, έδειξε ότι οι τροποποιήσεις αυτές συναντώνται σε όλα τα κύτταρα της µεριστωµατικής ζώνης, ενώ στη ζώνη διαφοροποίησης εντοπίζονται στα κύτταρα του περικυκλίου και της επιδερµίδας και απουσιάζουν από τα κύτταρα του φλοιού και της εντεριώνης. Το παραπάνω αποτέλεσµα αναφορικά µε τον ανοσοϊστοχηµικό εντοπισµό των τροποποιηµένων µορφών στα κύτταρα της ρίζας, µπορεί να θεωρηθεί αναµενόµενο, δεδοµένου του ρόλου τους στη µίτωση [24,25], και στη µεταγραφική ενεργοποίηση [22,35]. Η ανάλυση των πηκτών έδειξε ότι η ακετυλιωµένη µορφή της ιστόνης Η4 στα δείγµατα που προέρχονται από τη µεριστωµατική ζώνη των µαρτύρων υπερβαίνει το 40% περίπου της ολικής Η4, ενώ στα δείγµατα που προέρχονται από τη ζώνη επιµήκυνσης και τη ζώνη διαφοροποίησης η συµµετοχή της µειώνεται στο 35% περίπου. Η ανοσοϊστοχηµική µελέτη που έγινε σε τοµές της ρίζας µε τη βοήθεια αντισωµάτων που αναγνωρίζουν την ακετυλιωµένη µορφή της ιστόνης Η4 έδειξε ότι η τροποποίηση αυτή συναντάται σε όλα τα κύτταρα της µεριστωµατικης ζώνης, ενώ στη ζώνη διαφοροποίησης εντοπίζεται κυρίως στα κύτταρα του περικυκλίου και της επιδερµίδας, ενώ απουσιάζει από τα κύτταρα του φλοιού και της εντεριώνης. Από παλιότερες µελέτες η ακετυλίωση της Η4 στους φυτικούς οργανισµούς έχει συσχετισθεί µε την κυτταρική διαίρεση και σε µικρότερο βαθµό µε την ενεργοποίηση της µεταγραφής [418, 419]. Τόσο στη βρώµη, όσο και στα κουκιά, δηλαδή σε ένα µονοκοτυλήδονο και σε ένα δικοτυλήδονο φυτό, βρέθηκε πως το πρότυπο ακετυλίωσης της Η4, σε αντίθεση µε αυτό της Η3, µεταβάλλεται κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου ενώ η τροποποίηση συµβαίνει κυρίως σε περιοχές όπου παρατηρείται αντιγραφή του DNA [418,419]. Επιπλέον, µείωση του επιπέδου της ακετυλίωσης της Η4 παρατηρήθηκε κατά τη διαφοροποίηση των ανθοφόρων οφθαλµών στην αζαλέα, σε συνδυασµό µε αύξηση της µεθυλίωσης του DNA [420]. Η αυξηµένη ποσοστιαία συµµετοχή της ακετυλιωµένης Η4 που παρατηρείται στα δείγµατα από τη µεριστωµατική ζώνη σε σχέση µε τη ζώνη διαφοροποίησης καθώς και ο ανοσοϊστοχηµικός εντοπισµός της στα κύτταρα της ζώνης αυτής καθώς και 213

228 στα κύτταρα της ζώνης διαφοροποίησης όπου παρατηρείται αντιγραφή του DNA, δηλαδή στα κύτταρα του περικυκλίου και της επιδερµίδας, έρχονται σε πλήρη συµφωνία µε τα δεδοµένα από τις παραπάνω µελέτες. 4.4 Το πρότυπο κατανοµής των ιστονών σε in vitro ιστοκαλλιέργειες κάλλων Είναι γνωστό ότι στις ιστοκαλλιέργειες κάλλων, τα µέχρι πρότινος διαφοροποιηµένα φυτικά κύτταρα ανακτούν τις µεριστωµατικές τους ιδιότητες, συµπεριλαµβανοµένου του υψηλού ρυθµού κυτταροδιαιρέσεων και συµπεριφέρονται σαν τυπικά µεριστωµατικά κύτταρα [408], µία µεταβολή που συνεπάγεται σηµαντικές µεταβολές στη δοµή και στη λειτουργία της χρωµατίνης, επηρεάζοντας µεταξύ άλλων το πρότυπο κατανοµής των ιστονών καθώς και το βαθµό τροποποίησής τους [409]. Για παράδειγµα, κατά την αποδιαφοροποίηση των κυττάρων στον καπνό παρατηρήθηκαν σηµαντικές µεταβολές στη χρωµατίνη, που περιλάµβαναν τροποποιήσεις της ιστόνης Η3, ανακατανοµή της ΗΡ1 και ενεργοποίηση των γονιδίων που ρυθµίζονται από τον µεταγραφικό παράγοντα E2F [409]. Κατά την ανάλυση των πηκτών των δειγµάτων από ιστοκαλλιέργειες κάλλων (πρωτογενών, δευτερογενών και τριτογενών) παρατηρήθηκαν οµοιότητες στo πρότυπο κατανοµής των ιστονών µε το αντίστοιχο των δειγµάτων από την µεριστωµατική ζώνη των µαρτύρων, ανεξάρτητα από την αναπτυξιακή ζώνη από την οποία προήλθαν οι κάλλοι, γεγονός που συνάδει µε τις ιδιότητες και τη φυσιολογική κατάσταση των κυττάρων των κάλλων. Οι εξαιρέσεις στον παραπάνω κανόνα ήταν το ποσοστό της ισοµορφής Η3.1 που µειώνεται σε σχέση µε το αντίστοιχο της µεριστωµατικής ζώνης των µαρτύρων και το ποσοστό της uh2a στα δείγµατα από πρωτογενείς κάλλους που προήλθαν από τη ζώνη διαφοροποίησης. Το παραπάνω, µη αναµενόµενο γεγονός, έρχεται σε συµφωνία µε συµπεράσµατα παλιότερων µελετών, σύµφωνα µε τα οποία παρά την οµοιότητα που εµφανίζουν µορφολογικά τα αποδιαφοροποιηµένα φυτικά κύτταρα στις ιστοκαλλιέργειες των κάλλων, ορισµένες βιοχηµικής φύσεως διαφορές εξακολουθούν να υπάρχουν [408]. Στη συνέχεια, θα συζητηθούν αναλυτικότερα οι παρατηρούµενες µεταβολές ξεχωριστά σε κάθε κύρια τάξη ιστονών στις ιστοκαλλιέργειες κάλλων που προήλθαν από τις τρείς αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας. 214

229 Σύµφωνα µε την ανάλυση των πηκτών, στα δείγµατα από ιστοκαλλιέργειες κάλλων η ποσοστιαία συµµετοχή των ισοµορφών Η1Α, Η1Β και Η1 0 είναι αντίστοιχα 40%, 35% και 25% περίπου της ολικής Η1, ανεξάρτητα από την αναπτυξιακή ζώνη από την αποία προήλθαν οι κάλλοι, δηλαδή το πρότυπο κατανοµής της ιστόνης Η1 είναι παρόµοιο µε αυτό της µεριστωµατικής ζώνης και τη ζώνης επιµήκυνσης των µαρτύρων. Το γεγονός αυτό έρχεται σε πλήρη συµφωνία µε τη διαδικασία της αποδιαφοροποίησης των φυτικών κυττάρων όπως αυτή περιγράφηκε παραπάνω. Για την παρουσία της ισοµορφής Η1 0 στα αποδιαφοροποιηµένα, µεριστωµατικά πλέον, κύτταρα των ιστοκαλλιεργειών, µπορεί να εξηγηθεί όπως και η παρουσία της στα κύτταρα της µεριστωµατικής ζώνης της ρίζας, δηλαδή πιθανόν να απαιτείται λόγω της ανεξάρτητης από τον κυτταρικό κύκλο σύνθεσής της και της ικανότητά της να αντικαθιστά τις άλλες ισοµορφές της Η1, µεταβάλλοντας µε αυτό τον τρόπο τη δοµή της χρωµατίνης σε συγκεκριµένες περιοχές του γονιδιώµατος. Στα δείγµατα από πρωτογενείς ιστοκαλλιέργειες κάλλων που προήλθαν από τη ζώνη διαφοροποίησης της ρίζας παρατηρείται σηµαντική αύξηση της συµµετοχής της uh2a, που φτάνει στο 27% της ολικής Η2Α, ενώ στα δείγµατα των ιστοκαλλιεργειών που προήλθαν από τις άλλες δύο ζώνες της ρίζας, το πρότυπο κατανοµής των ισοµορφών της Η2Α και της uh2a είναι παρόµοιο µε αυτό της µεριστωµατικής ζώνης των µαρτύρων. Στα δείγµατα από δευτερογενείς και τριτογενείς ιστοκαλλιέργειες κάλλων το πρότυπο κατανοµής των ισοµορφών της Η2Α είναι παρόµοιο µε αυτό της µεριστωµατικής ζώνης των µαρτύρων. Ενδιαφέρον παρουσιάζει η σηµαντική αύξηση της συµµετοχής της uη2α στα δείγµατα των πρωτογενών κάλλων που προήλθαν από τη ζώνη διαφοροποίησης και η οποία ξεπερνά ακόµη και την αντίστοιχη της µεριστωµατικής ζώνης των µαρτύρων. Η αύξηση αυτή είναι πιθανό να σχετίζεται µε την ξαφνική µεταβολή της φυσιολογικής κατάστασης των διαφοροποιηµένων κυττάρων της ζώνης αυτής, τα οποία «εξαναγκάζονται» να συµπεριφερθούν ως µεριστωµατικά. Η ξαφνική αύξηση του ρυθµού κυτταροδιαιρέσεων ίσως να προκαλεί αύξηση των βλαβών κατά την αντιγραφή του DNA, η επιδιόρθωση των οποίων πιθανόν να απαιτεί αυξηµένο επίπεδο ουβικουιτίνωσης των ιστονών. Η συγκεκριµένης τροποποίηση των ιστονών έχει ήδη συσχετιστεί µε την επιδιόρθωση βλαβών σε άλλους οργανισµούς. Για παράδειγµα, τα ένζυµα που καταλύουν την πρόσδεση της ουβικουιτίνης στις ιστόνες, όπως είναι το Rad6 στη ζύµη, σχετίζονται ταυτόχρονα και µε τον µηχανισµό επιδιόρθωσης του DNA, 215

230 ενώ µεταλλάξεις τους οδηγούν σε αυξηµένη ευαισθησία σε παράγοντες που προκαλούν βλάβες στο DNA [219,220,243]. Έχει προταθεί ότι η ουβικουιτίνωση των ιστονών µεταβάλλει τη δοµή της χρωµατίνης και διευκολύνει την πρόσβαση των παραγόντων επιδιόρθωσης στο DNA [244]. Σε αντίθεση µε τις πρωτογενείς ιστοκαλλιέργειες κάλλων, τα κύτταρα των δευτερογενών και τριτογενών ιστοκαλλιεργειών έχουν ήδη «προσαρµοστεί» στη νέα φυσιολογική κατάσταση, το αυξηµένο επίπεδο ουβικουιτίνωσης δεν είναι πλέον απαραίτητο και το πρότυπο κατανοµής της Η2Α είναι παρόµοιο µε αυτό της µεριστωµατικής ζώνης. Σε ότι αφορά τις ισοµορφές της ιστόνης Η2Β, στα δείγµατα από ιστοκαλλιέργειες κάλλων βρέθηκε πως αποτελούν αντίστοιχα το 57% και το 43% της ολικής Η2Β, ανεξάρτητα από την αναπτυξιακή ζώνη από την οποία προήλθαν οι ιστοκαλλιέργειες κάλλων. Λαµβάνοντας υπόψη την τυπική απόκλιση των µετρήσεων, το πρότυπο κατανοµής των ισοµορφών της Η2Β µπορεί να θεωρηθεί παρόµοιο µε αυτό της µεριστωµατικής ζώνης των µαρτύρων, που είναι κάτι το αναµενόµενο δεδοµένου ότι τα κύτταρα των ιστοκαλλιεργειών, όπως έχει ήδη αναφερθεί, ανεξάρτητα από την αναπτυξιακή ζώνη από την οποία προέρχονται, συµπεριφέρονται ως µεριστωµατικά. Όπως έχει προαναφερθεί, το πρότυπο κατανοµής των ισοµορφών της Η3 στα δείγµατα από ιστοκαλλιέργειες κάλλων αποτελεί µία εξαίρεση στον κανόνα, δεδοµένου εµφανίζει σηµαντική απόκλιση από το αντίστοιχο πρότυπο της µεριστωµατικής ζώνης των µαρτύρων, µε το οποίο αναµενόταν να είναι παρόµοιο. Συγκεκριµένα, οι ισοµορφές Η3.1 και Η3.2 αποτελούν αντίστοιχα το 25% και 75% της ολικής Η3, ανεξάρτητα από την αναπτυξιακή ζώνη από την οποία προήλθαν οι κάλλοι. Με άλλα λόγια, το ποσοστό της Η3.1 είναι µειωµένο σε σχέση µε αυτό της µεριστωµατικής ζώνης των µαρτύρων, όπου αποτελούσε περίπου το 30%, ενώ αντίστοιχα το ποσοστο της Η3.2, η οποία όπως έχει ήδη αναφερθεί σχετίζεται µε τα διαφοροποιηµένα φυτικά κύτταρα [5], είναι αυξηµένο σε σχέση µε τους µάρτυρες. Το γεγονός ότι παρά την µορφολογική οµοιότητα που εµφανίζουν τα αποδιαφοροποιηµένα φυτικά κύτταρα, ορισµένες βιοχηµικές διαφορές, εξακολουθούν να υπάρχουν, όπως π.χ. συµβαίνει στη συγκεκριµένη περίπτωση µε τις ισοµορφές της Η3, έχει παρατηρηθεί και σε παλιότερες εργασίες [408]. Η αυξηµένη συµµετοχή της ισοµορφής Η3.2 στα ταχυδιαιρούµενα κύτταρα των κάλλων θα µπορούσε ίσως να εξηγηθεί µε παρόµοιο τρόπο µε την παρουσία της ισοµορφής Η1 0, η οποία 216

231 επίσης σχετίζεται µε τα διαφοροποιηµένα κύτταρα. ηλαδή, η ανεξάρτητη από τον κυτταρικό κύκλο σύνθεση της Η3.2 και η ικανότητά της να αντικαθιστά τις άλλες ισοµορφές της Η3 και να µεταβάλλει τη δοµή της χρωµατίνης σε συγκεκριµένες περιοχές του γονιδιώµατος, πιθανόν να την καθιστούν απαραίτητη για τη σωστή λειτουργία των κυττάρων αυτών. Αντίθετα µε τις ισοµορφές της Η3, η ποσοστιαία συµµετοχή των τροποποιηµένων µορφών της στις ιστοκαλλιέργειες κάλλων ανέρχεται περίπου στο 53% της ολικής Η3, βρίσκεται δηλαδή σε παρόµοια επίπεδα µε αυτά της µεριστωµατικής ζώνης και τη ζώνης επιµήκυνσης των µαρτύρων. Τέλος, η ακετυλιωµένη µορφή της Η4 στα δείγµατα από ιστοκαλλιέργειες κάλλων αποτελεί το 43% περίπου της ολικής Η4 ανεξάρτητα από τη ζώνη από την οποία προήλθαν οι κάλλοι, ποσοστιαία συµµετοχή παρόµοια δηλαδή µε αυτή που παρατηρείται και στα δείγµατα που προέρχονται από τη µεριστωµατική ζώνη των µαρτύρων. Η αυξηµένη ανεξάρτητα από την αναπτυξιακή ζώνη, ποσοστιαία συµµετοχή της ακετυλιωµένης µορφής της Η4 µπορεί να θεωρηθεί αναµενόµενη δεδοµένης της φυσιολογικής κατάστασης των κυττάρων των ιστοκαλλιεργειών, τα οποία συµπεριφέρονται ως µεριστωµατικά κύτταρα και της σχέσης της συγκεκριµένης τροποποίησης µε την αντιγραφή του DNA και την κυτταρική διαίρεση [418,419]. 217

232 4.5 Το πρότυπο κατανοµής των ιστονών στις αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας παρουσία φυτοορµονών Είναι γνωστό πως οι φυτοορµόνες αυξίνη και γιββεριλλίνη παίζουν σηµαντικό ρόλο στην ανάπτυξη της ρίζας, επηρεάζοντας θετικά και αρνητικά αντίστοιχα τη διαφοροποίηση των κυττάρων. Οι µορφολογικές διαφορές που παρατηρούνται µεταξύ ριζών που αναπτύχθηκαν υπό φυριολογικές συνθήκες και ριζών που αναπτύχθηκαν παρουσία αυξίνης ή γιββεριλλίνης, αντανακλούν και βιοχηµικές διαφορές που είναι αποτέλεσµα της επίδρασης των παραπάνω ορµονών στη φυσιολογική κατάσταση των κυττάρων της ρίζας [365]. Είναι γνωστό πως η επίδραση αυξίνης προάγει την ανάπτυξη και διαφοροποίηση της ρίζας, κυρίως µέσω του σχηµατισµού των φλοιώµατος και του ξυλώµατος καθώς και µέσω της προγραµµατισµένης διαφοροποίησης των µεριστωµατικών κυττάρων [ ]. Από την άλλη, η γιββεριλλίνη, αν και είναι απαραίτητη για την φυσιολογική ανάπτυξη και την επιµήκυνση της ρίζας, είναι γνωστό πως σε γενικές γραµµές παρεµποδίζει την ανάπτυξη και την διαφοροποίηση του ριζικού συστήµατος των φυτών [ ]. Βρέθηκε στο µπιζέλι πως η χορήγηση εξωγενούς γιββεριλλίνης στο φυτό αποτρέπει την επιµήκυνση της ρίζας, η οποία αναπτύσσεται κανονικά µόνο αν έχει προηγηθεί επεξεργασία µε κάποιο αναστολέα της βιοσύνθεσης της γιββεριλλίνης [418]. Τα δεδοµένα αυτά, που δείχνουν τον ανασταλτικό ρόλο της εξωγενούς γιββεριλλίνης στην ανάπτυξη της ρίζας, έρχονται σε συµφωνία µε τις διαφορές που παρατηρούνται στη µορφολογία ριζών που αναπτύχθηκαν υπό φυσιολογικές συνθήκες και ριζών που αναπτύχθηκαν παρουσία γιββεριλλίνης. Οι διαφορετικές αποκρίσεις του φυτού στις δύο αυτές φυτοορµόνες είναι προφανές πως αντανακλώνται και στη λειτουργία της χρωµατίνης στην κάθε µία περίπτωση, συνεπώς και στο πρότυπο κατανοµής των ιστονών. Υπάρχουν στοιχεία από προηγούµενες µελέτες σύµφωνα µε τα οποία οι ορµόνες επηρρεάζουν το πρότυπο των ισονών, τόσο σε ζωικά όσο και σε φυτικά κύτταρα. Για παράδειγµα, παρατηρήθηκαν µεταβολές στην κατανοµή της συνδετικής ιστόνης Η1 σε κύτταρα ποντικού, τόσο κατά την επαγωγή, µέσω ορµονών, του πολλαπλασιασµού όσο και κατά την επαγωγή της διαφοροποίησης [422]. Αντίστοιχες επιπτώσεις έχουν παρατηρηθεί και σε µελέτες σε φυτικούς οργανισµούς. Για παράδειγµα, βρέθηκε πως η έκφραση µίας ισοµορφής της Η3 στο ρύζι, καθώς και µίας ισοµορφής της Η1 και τριών ισοµορφών της Η2Β στη ντοµάτα 218

233 ενισχύονται από τη γιββεριλλίνη [423,424]. Επιπλέον, µεταβολή του επιπέδου τροποποίησης των ιστονών παρατηρήθηκαν κατά την επίδραση αµπσισικού οξέος σε κύτταρα καπνού και Arabidopsis [425,426]. Έχει προταθεί πως οι ανακατατάξεις που συµβαίνουν στη χρωµατίνη στις παραπάνω περιπτώσεις γίνονται µε σκοπό να αποκτήσει το κύτταρο την ικανότητα να αποκριθεί στη επίδραση της ορµόνης και πιθανόν να αποτελούν συστατικά ενός µηχανισµού που είναι κοινός µεταξύ ζωικών και φυτικών κυττάρων [426]. Σε γενικές γραµµές, το πρότυπο κατανοµής των ιστονών στα δείγµατα από ρίζες που αναπτύχθηκαν παρουσία αυξίνης εµφανίζει πολλές οµοιότητες µε το αντίστοιχο της ζώνης διαφοροποίησης των ριζών που αναπτύχθηκαν υπό φυσιολογικές συνθήκες. Συγκεκριµένα, σε όλες τις αναπτυξιακές ζώνες η συµµετοχή της ισοµορφής Η1 0 υπερβαίνει το 30% ενώ παρατηρούνται µειωµένα ποσοστά της ουβικουιτινωµένης Η2Α και της ακετυλιωµένης Η4, όπως δηλαδή συµβαίνει στη ζώνη διαφοροποίησης των µαρτύρων. Εξαίρεση στον παραπάνω κανόνα αποτελεί το ποσοστό της ισοµορφής Η3.1, η οποία σε όλα τα δείγµατα φτάνει στο 37% της ολικής Η3, ξεπερνώντας κατά πολύ όχι µόνο το ποσοστό της στη ζώνη διαφοροποίησης (κάτω από 20%), αλλά ακόµη και αυτό στη µεριστωµατική ζώνη των µαρτύρων (30%). Αντίθετα, στα δείγµατα από τις ρίζες που αναπτύχθηκαν παρουσία γιββεριλλίνης το πρότυπο κατανοµής των ιστονών είναι πολύ πιο περίπλοκο, εµφανίζοντας οµοιότητες άλλοτε µε αυτό της µεριστωµατικής ζώνης και άλλοτε µε αυτό της ζώνης διαφοροποίησης. Σε γενικές γραµµές, παρατηρείται µείωση στη συµµετοχή των τροποποιηµένων µορφών των ιστονών καθώς και της ισοµορφής Η1 0,ενώ το ποσοστό της ισοµορφής Η3.1 είναι παρόµοιο µε αυτό της µεριστωµατικής ζώνης. Στη συνέχεια, θα συζητηθούν αναλυτικότερα οι παρατηρούµενες µεταβολές ξεχωριστά σε κάθε κύρια τάξη ιστονών στις τρείς αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας φυτών που αναπτύχθηκαν παρουσία των παραπάνω φυτοορµονών. Σε ότι αφορά την συνδετική ιστόνη Η1, στα δείγµατα που προέρχονται από φυτά που αναπτύχθηκαν παρουσία αυξίνης παρατηρείται αυξηµένη συµµετοχή της ισοµορφής Η1 0, η οποία ξεπερνά το 30% της ολικής Η1 σε όλες τις αναπτυξιακές ζώνες, ενώ η συµµετοχή των κύριων ισοµορφών Η1Α και Η1Β µειώνεται αντίστοιχα στο 38% και 30% περίπου. Με άλλα λόγια, το πρότυπο είναι παρόµοιο µε αυτό της ζώνης διαφοροποίησης των µαρτύρων. Είναι γνωστό πως η αυξίνη ως φυτοορµόνη προάγει την διαφοροποίηση της 219

234 ριζας, το σχηµατισµό των αγωγών στοιχείων και τη δηµιουργία πλευρικών ριζών και την προγραµµατισµένη διαφοροποίηση των µεριστωµατικών κυττάρων [258,259,261,365]. Οι µορφολογικές διαφορές µεταξύ των µαρτύρων και των φυτών που αναπτύχθηκαν παρουσία αυξίνης, προϋποθέτουν διαφορές στη φυσιολογική κατάσταση και το βαθµό διαφοροποίησης των κυττάρων, συνέπεια της επαγωγής της διαφοροποίησής τους λόγω της επίδρασης της αυξίνης. Το γεγονός ότι το πρότυπο κατανοµής των ισοµορφών της ιστόνης Η1 παρόµοιο µε αυτό τη ζώνης διαφοροποίησης των µαρτύρων, σε όλες τις αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας, έρχεται σε συµφωνία µε τις ανάγκες του κυτάρου για τις παραπάνω διαδικασίες. Στα δείγµατα που προέρχονται από φυτά που αναπτύχθηκαν παρουσία γιββεριλλίνης παρατηρείται στη µεριστωµατική ζώνη και στη ζώνη επιµήκυνσης αυξηµένη σε σχέση µε τους µάρτυρες συµµετοχή της ισοµορφής Η1Α, η οποία αποτελεί το 47% περίπου της ολικής Η1, η συµµετοχή της ισοµορφής Η1Β διατηρείται στο 30%, ενώ η συµµετοχή της ισοµορφής Η1 0 µειώνεται στο 23%. Στα δείγµατα που προέρχονται από τη ζώνη διαφοροποίησης η συµµετοχή της ισοµορφής Η1Α µειώνεται στο 40% περίπου της ολικής Η1, η συµµετοχή της ισοµορφής Η1Β διατηρείται σχετικά σταθερή στο 32%, ενώ η συµµετοχή της ισοµορφής Η1 0 ανέρχεται στο 28%, δηλαδή το πρότυπο κατανοµής είναι παρόµοιο µε αυτό της µεριστωµατικής ζώνης των µαρτύρων. Αξίζει να αναφερθεί πως η επίδραση της γιββεριλλίνης στο πρότυπο των ιστονών έχει µελετηθεί και σε άλλα φυτά και βρέθηκε ότι σε µεταλλάγµατα ντοµάτας ενισχύει την έκφραση µίας ισοµορφής της Η1 και τριών ισοµορφών της Η2Β, των leh1 και leh2b1-3 αντίστοιχα. Η αυξηµένη, λόγω της εξωγενούς γιββεριλλίνης, έκφραση των παραπάνω ισοµορφών πραγµατοποιείται κυρίως σε ιστούς που περιέχουν ταχυδιαιρούµενα, µεριστωµατικά κύτταρα [424]. Σε ότι αφορά τις ισοµορφές της ιστόνης Η2Α, στα δείγµατα που προέρχονται από φυτά που αναπτύχθηκαν παρουσία αυξίνης, η ποσοστιαία συµµετοχή της ισοµορφής Η2Α.1 αυξάνεται σηµαντικά, φτάνοντας στο 65% της ολικής Η2Α, ενώ η συµµετοχή της ισοµορφής Η2Α.2 µειώνεται στο 23%, σε όλες τις αναπτυξιακές ζώνες. Η ποσοστιαία συµµετοχή της uh2a ανέρχεται στο 12% περίπου της ολικής Η2Α, σε όλες τις αναπτυξιακές ζώνες, όπως συµβαίνει και στα δείγµατα από τη ζώνη διαφοροποίησης των µαρτύρων. Η µειωµένη συµµετοχή της uη2α σε όλες τις αναπτυξιακές ζώνες είναι αναµενόµενη, αφού το επίπεδο της συγκεκριµένης τροποποίησης 220

235 είναι γνωστό πως µειώνεται στα διαφοροποιηµένα κύτταρα [416,417] και η επίδραση της αυξίνης επάγει τη διαφοροποίηση των κυττάρων. Στην παραπάνω διαδικασία, δηλαδή την επαγόµενη διαφοροποίηση της ρίζας και τις αλλαγές στη δοµή της χρωµατίνης που αυτή επιφέρει πιθανόν να είναι απαραίτητη και η αυξηµένη συµµετοχή της ισοµορφής Η2Α.1. Στα δείγµατα που προέρχονται από φυτά που αναπτύχθηκαν παρουσία γιββεριλλίνης η συµµετοχή της ισοµορφήςη2α.1 επίσης είναι αυξηµένη σε σχέση µε τα φυτά-µάρτυρες και ξεπερνά το 60% της ολικής σε όλες τις αναπτυξιακές ζώνες, ενώ η συµµετοχή της ισοµορφής Η2Α.2 και της uη2α εµφανίζονται µειωµένες σε σχέση µε τους µάρτυρες τόσο στη µεριστωµατική ζώνη, όπου αποτελούν αντίστοιχα το 22% και 18% της ολικής Η2Α, όσο και στις ζώνες επιµήκυνσης και διαφοροποίησης, όπου η συµµετοχή της uη2α είναι παρόµοια µε αυτή της ζώνης διαφοροποίησης των µαρτύρων. Στα δείγµατα που προέρχονται από φυτά που αναπτύχθηκαν παρουσία αυξίνης η ισοµορφή Η2Β.1 αποτελεί το 53% της ολικής Η2Β στη µεριστωµατική ζώνη και το 60% περίπου στις ζώνες επιµήκυνσης και διαφοροποίησης (η Η2Β.2 αντίστοιχα αποτελεί το 47% και 40%) αντίστροφα µε ότι συµβαίνει στους µάρτυρες. εδοµένων των αλλαγών στη φυσιολογική κατάσταση των κυττάρων που επιφέρει η επαγόµενη από την αυξίνη διαφοροποίηση, η µείωση της συµµετοχής της ισοµορφής Η2Β.1 στα δείγµατα από τη µεριστωµατική ζώνη φαίνεται φυσιολογική. Αντίθετα, ενδιαφέρον παρουσιάζει το πρότυπο κατανοµής των ισοµορφών της Η2Β στη ζώνη επιµήκυνσης και στη ζώνη διαφοροποίηση, όπου αντί να είναι παρόµοιο µε αυτό της ζώνης διαφοροποίησης των µαρτύρων, βρέθηκε πως είναι παρόµοιο µε αυτό της µεριστωµατικής ζώνης. Στα δείγµατα που προέρχονται από φυτά που αναπτύχθηκαν παρουσία γιββεριλλίνης η ποσοστιαία συµµετοχή της Η2Β.1 εµφανίζεται αυξηµένη στη µεριστωµατική ζώνη, όπου αποτελεί το 65% της ολικής Η2Β, µειώνεται στο 50% στη ζώνη επιµήκυνσης και αυξάνεται στο 57% στη ζώνη διαφοροποποίησης, ενώ το αντίστροφο ισχύει για τη συµµετοχή της ισοµορφής Η2Β.2. Όπως έχει ήδη αναφερθεί στην περίπτωση της Η1, βρέθηκε στη ντοµάτα πως η επίδραση γιββεριλλίνης ενισχύει την έκφραση τριών ισοµορφών της Η2Β, κυρίως σε ιστούς που περιέχουν µεριστωµατικά κύτταρα [424]. Εκτός από τη γιββεριλλίνη, βρέθηκε πως κι άλλες φυτοορµόνες µπορούν να επηρεάσουν την έκφραση ισοµορφών της Η2Β, όπως για παράδειγµα το ιασµονικό 221

236 οξύ, το οποίο στους ανθοφόρους οφθαλµούς της πιπεριάς όπου µελετηθεί, επάγει την έκφραση της ισοµορφής CaH2B [427]. Οι ισοµορφές της ιστόνης Η3 αποτελούν την εξαίρεση στον κανόνα και στην περίπτωση των φυτών που αναπτύχθηκαν παρουσία αυξίνης. Συγκεκριµένα, η συµµετοχή της ισοµορφής Η3.1 αυξάνεται σηµαντικά και ανέρχεται στο 37% περίπου της ολικής Η3 στη µεριστωµατική ζώνη και στη ζώνη διαφοροποίησης και το 43% στη ζώνη επιµήκυνσης, ενώ αντίστοιχα µειώνεται η συµµετοχή της ισοµορφής Η3.2. Παράλληλα, εµφανίζεται µειωµένη και η ποσοστιαία συµµετοχή των τροποποιηµένων µορφών της Η3, οι οποίες αποτελούν το 52% περίπου της ολικής Η3 στη µεριστωµατική ζώνη και στη ζώνη διαφοροποίησης και το 47% στη ζώνη επιµήκυνσης. εδοµένου ότι η αυξίνη επάγει την διαφοροποίηση της ρίζας και ότι η ισοµορφή Η3.2 αυξάνεται κατά την διαφοροποίηση των φυτικών κυττάρων [5], αναµενόταν αύξηση της συµµετοχής της συγκεκριµένης ισοµορφής στα δείγµατα από τα φυτά που αναπτύχθηκαν παρουσία αυξίνης. Αντίθετα, βρέθηκε σηµαντική αύξηση της συµµετοχής της ισοµορφής Η3.1, η οποία ξεπέρασε το επίπεδο της µεριστωµατικής ζώνης των µαρτύρων. Σηµαντική µείωση παρατηρήθηκε και στη ποσοστιαία συµµετοχή των τροποποιηµένων µορφών της Η3, κυρίως της φωσφο-ακετυλιωµένης της µορφής. Στα δείγµατα που προέρχονται από φυτά που αναπτύχθηκαν παρουσία γιββεριλλίνης το πρότυπο κατανοµής των ισοµορφών της Η3, σε ό,τι αφορά τα δείγµατα από την µεριστωµατική ζώνη και τη ζώνη επιµήκυνσης, είναι παρόµοιο µε αυτό των µαρτύρων, δηλαδή η ισοµορφές Η3.1 και Η3.2 αποτελούν αντίστοιχα το 30% και το 70% περίπου της ολικής Η3. Στα δείγµατα από τη ζώνη διαφοροποίησης η συµµετοχή της ισοµορφή Η3.1 ξεπερνά το 33% της ολικής Η3, σε αντίθεση µε τους µάρτυρες, όπου στη ζώνη διαφοροποίησης το ποσοστό της Η3.1 ήταν µικρότερο του 20% της ολικής Η3. Όπως έχει ήδη αναφερθεί πιο πάνω, η επίδραση εξωγενούς γιββεριλλίνης στο φυτό µπορεί να επιφέρει αλλαγές στην έκφραση των ιστονών. Εκτός από τις ισοµορφές των Η1 και Η2Β στη ντοµάτα, βρέθηκε και στο ρύζι πως η επίδραση γιββεριλλίνης οδηγεί σε αύξηση κατά δέκα φορές της έκφρασης µίας ισοµορφής της Η3 [423]. Οι τροποποιηµένες µορφές της Η3 αποτελούν το 55% περίπου της Η3 στα δείγµατα από τη µεριστωµατική ζώνη και στη ζώνη επιµήκυνσης, ενώ στα δείγµατα από τη ζώνη διαφοροποίησης, η συµµετοχή τους, που ανέρχεται στο 53%, δηλαδή είναι µειωµένη σε σχέση µε την αντίστοιχη της ζώνης διαφοροποίησης 222

237 των µαρτύρων όπου αποτελεί το 60% της Η3. Μελέτες που έχουν γίνει στον καπνό και στο Arabidopsis έδειξαν πως η τροποποίηση των ιστονών αποτελεί σηµαντικό µέρος του µηχανισµού απόκρισης των φυτικών κυττάρων στις φυτοορµόνες. Συγκεκριµένα παρατηρήθηκε πως η επίδραση αµπσισικού οξέος, όπως και της καταπόνησης, έχει ως αποτέλεσµα την αύξηση των επιπέδων της φωσφορυλίωσης και της ακετυλίωσης της Η3 καθώς και της ακετυλίωσης της Η4 [425,426]. Τέλος, η ακετυλιωµένη µορφή της ιστόνης Η4 στα φυτά που αναπτύχθηκαν παρουσία αυξίνης αποτελεί το 37% περίπου της ολικής Η4, όπως συµβαίνει και στα δείγµατα που προέρχονται από τις ζώνες επιµήκυνσης και διαφοροποίησης των µαρτύρων. Όπως έχει ήδη αναφερθεί, η επίδραση της αυξίνης επάγει την διαφοροποίηση της ρίζας και δεδοµένου ότι η ακετυλίωση της Η4 σχετίζεται µε την αντιγραφή του DNA [418,419], είναι αναµενόµενο η ποσοστιαία συµµετοχή της ακετυλιωµένης µορφής της Η4 να είναι µειωµένη σε όλες τις αναπτυξιακές ζώνες. Από την άλλη, στα δείγµατα που προέρχονται από φυτά που αναπτύχθηκαν παρουσία γιββεριλλίνης, η ακετυλιωµένη µορφή της ιστόνης Η4 σε όλες τις αναπτυξιακές ζώνες αποτελεί περίπου το 33% της ολικής Η4, δηλαδή η συµµετοχή της είναι µειωµένη σε σχέση µε τους µάρτυρες, σε όλες τις αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας. 223

238 4.6 Γενικά Συµπεράσµατα και Μελλοντικές Προοπτικές Κατά τη διαφοροποίηση των φυτικών κυττάρων στις αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας του καλαµποκιού παρατηρούνται σηµαντικές µεταβολές του προτύπου κατανοµής των ιστονών κυρίως µεταξύ της µεριστωµατικής ζώνης και της ζώνης διαφοροποίησης. Οι ποσοστιαίες συµµετοχές πολλών ισοµορφών, τόσο των συνδετικών όσο και των νουκλεοσωµικών ιστονών, είναι διαφορετικές σε αυτές τις δύο αναπτυξιακές ζώνες, όπως και οι συµµετοχές των τροποποιηµένων µορφών των ιστονών. Παράλληλα, η ανοσοϊστοχηµική ανίχνευση των τροποποιηµένων µορφών των ιστονών έδειξε διαφορικό εντοπισµό σε σχέση µε το βαθµό διαφοροποίησης των κυττάρων της ρίζας. Οι παραπάνω διαφορές είναι πιθανό να οφείλονται στη διαφορετική φυσιολογική κατάσταση των κυττάρων των ζωνών αυτών, που συνεπάγονται και διαφορές στη δοµή και λειτουργία της χρωµατίνης. Αντίθετα, ελάχιστες και αµελητέες ήταν οι µεταβολές στο πρότυπο των ιστονών που παρατηρήθηκαν µεταξύ µεριστωµατικής ζώνης και ζώνης επιµήκυνσης, γεγονός που ίσως να οφείλεται στη µερική επικάλυψη στα όρια των δύο αυτών ζωνών, όπου συνυπάρχουν οι κυτταρικές διαιρέσεις και η επιµήκυνση των κυττάρων. Κατά την αποδιαφοροποίηση των φυτικών κυττάρων σε ιστοκαλλιέργειες κάλλων το πρότυπο κατανοµής των ιστονών εµφανίζει πολλές οµοιότητες µε το αντίστοιχο της µεριστωµατικής ζώνης των µαρτύρων, ανεξάρτητα από την αναπτυξιακή ζώνη από την οποία προήλθαν οι ιστοκαλλιέργειες των κάλλων. Το παρατηρούµενο πρότυπο ήταν αναµενόµενο δεδοµένου ότι κατά τον σχηµατισµό του κάλλου τα φυτικά κύτταρα ανακτούν τις µεριστωµατικές τους ιδιότητες και συµπεριφέρονται σαν µεριστωµατικά ανεξάρτητα από την προηγούµενή τους φυσιολογική κατάσταση. Παρόλα αυτά, οι ποσοστιαίες συµµετοχές ορισµένων ισοµορφών και τροποποιηµένων µορφών των ιστονών είναι διαφορετικές από τις αντίστοιχες της µεριστωµατικής ζώνης των µαρτύρων, γεγονός που δείχνει πως παρά τις µορφολογικές οµοιότητες των κυττάρων των ιστοκαλλιεργειών που προέρχονται από διαφορετικές αναπτυξιακές ζώνες, ορισµένες βιοχηµικές διαφορές υφίστανται παρά τη µορφολογική αποδιαφοροποίησή τους. Το πρότυπο κατανοµής των ιστονών στις αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας παρουσία αυξίνης σε πολλές περιπτώσεις είναι παρόµοιο µε το αντίστοιχο της ζώνης διαφοροποίησης των µαρτύρων, γεγονός που ως ένα 224

239 βαθµό ήταν αναµενόµενο δεδοµένου ότι η αυξίνη επάγει την διαφοροποίηση της ρίζας. Ακόµη πιο περίπλοκο είναι το πρότυπο κατανοµής των ιστονών στις αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας παρουσία γιββεριλλίνης, το οποίο σε ελάχιστες περιπτώσεις µπορεί να θεωρηθεί όµοιο µε αυτό των µαρτύρων, ενώ η παρατηρούµενη µείωση της συµµετοχή των τροποποιηµένων µορφών πιθανόν να οφείλεται στον ανασταλτικό ρόλο που έχει η γιββεριλλίνη στην ανάπτυξη της ρίζας. Και στις δύο περιπτώσεις, οι µεταβολές στις ποσοστιαίες συµµετοχές των ισοµορφών και των τροποποιηµένων µορφών των ιστονών πιθανόν να συνδέονται µε την απόκριση των φυτικών κυττάρων στις εξωγενώς παρεχόµενες φυτοορµόνες, µία διαδικασία που περιλαµβάνει σηµαντικές αλλαγές στη λειτουργία της χρωµατίνης και στη γονιδιακή έκφραση. Είναι γνωστό πως η ετερογένεια των ιστονών, τόσο σε επίπεδο ισοµορφών, όσο και σε επίπεδο τροποποιήσεων, παίζει σηµαντικό ρόλο στη δοµή και στη λειτουργία της χρωµατίνης και έχει προταθεί ότι οι διαφορετικές ισοµορφές των ιστονών πιθανόν να σχετίζονται και µε διαφορετικές διαδικασίες που συµβαίνουν στη χρωµατίνη. Σε αυτή την περίπτωση, είναι πιθανό οι σχετικές αναλογίες µεταξύ των ισοµορφών κάθε κύριας τάξης ιστονών να µεταβάλλονται κατά τη διάρκεια διαδικασιών που επιφέρουν µεταβολές στη δοµή και λειτουργία της χρωµατίνης. Σε κάθε µία από τις τέσσερις περιπτώσεις που µελετήθηκαν στην παρούσα εργασία και αναφέρονται παραπάνω, δηλαδή στις τρείς αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας, σε ιστοκαλλιέργειες κάλλων που προέρχονται από αυτές και στις αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας φυτών που αναπτύχθηκαν παρουσία αυξίνης και παρουσία γιββεριλλίνης, τα φυτικά κύτταρα βρίσκονται σε διαφορετικό βαθµό διαφοροποίησης και συνεπώς σε διαφορετική φυσιολογική κατάσταση. Οι παραπάνω διαδικασίες προϋποθέτουν µεταβολή του ρυθµού κυτταρικών διαιρέσεων και του προτύπου γονιδιακής έκφρασης, συνεπώς αλλαγές στη δοµή και λειτουργία της χρωµατίνης. Είναι πιθανό οι αλλαγές αυτές να καθιστούν απαραίτητη τη µεταβολή των σχετικών αναλογιών µεταξύ των ισοµορφών των ιστονών καθώς και του επιπέδου τροποποίησής τους, έτσι ώστε τα φυτικά κύτταρα να ανταποκριθούν σε κάθε περίπτωση. Μελλοντικά, θα µπορούσαν να γίνουν παρόµοιες αναπτυξιακές µελέτες αναφορικά µε το πρότυπο κατανοµής των ιστονών και σε άλλες περιπτώσεις που απαιτείται µεταβολή της δοµής και λειτουργίας της χρωµατίνης. Μία τέτοια περίπτωση θα µπορούσε να είναι η επίδραση και άλλων φυτοορµονών, πέρα από την 225

240 αυξίνη και τη γιββεριλλίνη, που ρυθµίζουν, θετικά ή αρνητικά, την ανάπτυξη της ρίζας και τη διαφοροποίηση των κυττάρων. Για παράδειγµα, θα είχε ενδιαφέρον η µελέτη του προτύπου των ιστονών κατά την επίδραση κυτοκινινών, που είναι γνωστό πως επάγουν τις κυτταρικές διαιρέσεις, καθώς και κατά την επίδραση αιθυλενίου ή/και αµπσισικού οξέος, που θεωρούνται παρεµποδιστές της ανάπτυξης. Επίσης,ενδιαφέρον θα παρουσίαζε η µελέτη του προτύπου κατανοµής των ιστονών στις αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας κατά την επίδραση παραγόντων που προκαλούν βλάβες στη διπλή έλικα του DNA, όπως είναι π.χ. τα βαρέα µέταλλα, καθώς και κατά την επίδραση στο φυτό συνθηκών καταπόνησης, όπως π.χ. η ξηρασία, η αλατότητα και οι ακραίες θερµκρασίες, καταστάσεις που επίσης προκαλούν αλλαγές στη λειτουργία της χρωµατίνης. Παρόµοια µε την παρούσα εργασία, αναπτυξιακή προσέγγιση του προτύπου κατανοµής των ιστονών θα µπορούσε να γίνει σε άλλους φυτικούς ιστούς, µονοκοτυλίδονων και δικοτυλίδονων φυτών, που περιέχουν µεριστωµατικά κύτταρα, όπως είναι τα ακραία µεριστώµατα των βλαστών και οι οφθαλµοί, ή που αποτελούνται από διαφοροποιηµένα κύτταρα, όπως είναι το µεσόφυλλο. Τέλος, εξαιρετικό ενδιαφέρον θα παρουσίαζε η µελέτη των κυριότερων τροποποιήσεων των ιστονών σε σχέση πάντα µε την ανάπτυξη του φυτού και την διαφοροποίηση των κυττάρων. 226

241 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Οι ιστόνες είναι µικρές, βασικές και εξαιρετικά συντηρηµένες πρωτεϊνες, απαραίτητες για τη συµπύκνωση του DNA στην χρωµατίνη των ευκαρυωτικών κυττάρων. Το πρώτο επίπεδο συµπύκνωσης του DNA είναι το νουκλεόσωµα, το οποίο αποτελείται από ένα οκταµερές των ιστονών Η2Α, Η2Β, Η3 και Η4, στο οποίο περιελίσσονται περίπου 146bp DNA, ενώ η δοµή του ολοκληρώνεται µε την πρόσδεση της συνδετικής ιστόνης Η1. Κάθε τάξη ιστονών, µε εξαίρεση την Η4, µπορεί να θεωρηθεί ως µία οικογένεια δοµικά όµοιων πολυπεπτιδίων, που ονοµάζονται ισοµορφές. Οι ισοµορφές των ιστονών συντίθενται σε διαφορετικές ποσότητες κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου και έχει προταθεί πως είναι απαραίτητες στις διάφορες λειτουργίες της χρωµατίνης. Επιπλέον, οι µετα-µεταφραστικές τροποποιήσεις των ιστονών, όπως η ακετυλίωση, η φωσφορυλίωση, η µεθυλίωση και η ουβικουιτίνωση, δηµιουργούν ένα ακόµη επίπεδο ετερογένειας των πρωτεϊνών αυτών και έχει αποδειχθεί πως παίζουν σηµαντικό ρόλο σε όλες τις λειτουργίες της χρωµατίνης. Παρόλο που οι ισοµορφές και οι τροποποιήσεις των ιστονών έχουν µελετηθεί σε φυτικούς οργανισµούς, λίγα είναι γνωστά για το πρότυπο κατανοµής τους κατά την διαφοροποίηση και την αποδιαφοροποίηση των φυτικών κυττάρων, διαδικασίες που περιλαµβάνουν πολλές µεταβολές στη δοµή και λειτουργία της χρωµατίνης. Ακόµη λιγότερα είναι γνωστά για την επίδραση που επιφέρουν στο παραπάνω πρότυπο οι φυτοορµόνες, ουσίες που ρυθµίζουν όλες σχεδόν τις διαδικασίες κατά την ανάπτυξη του φυτού. Σκοπός της εργασίας είναι η µελέτη του προτύπου κατανοµής των ισοµορφών και τροποποιηµένων µορφών των ιστονών κατά την διαφοροποίηση των φυτικών κυττάρων. Η ρίζα του καλαµποκιού (Zea mays L.) αποτελεί ένα κατάλληλο βιολογικό σύστηµα για αναπτυξιακές µελέτες, δεδοµένου αποτελείται από τρείς ευδιάκριτες αναπτυξιακές της ζώνες. Η µεριστωµατική ζώνη αποτελείται από ταχυδιαιρούµενα κύτταρα, στη ζώνη επιµήκυνσης οι κυτταροδιαιρέσεις ελαττώνονται, ενώ η ζώνη διαφοροποίησης αποτελείται κυρίως από παρεγχυµατικά, µη διαιρούµενα κύτταρα. Αντίθετα, σε ιστοκαλλιέργειες κάλλων τα φυτικά κύτταρα επανακτούν τις µεριστωµατικές τους ιδιότητες ανεξάρτητα από το προηγούµενο βαθµό διαφοροποίησής τους. Τέλος, είναι γνωστό πως οι φυτοορµόνες, όπως η αυξίνη και η γιββεριλλίνη παίζουν σηµαντικό ρόλο στην ανάπτυξη της ρίζας, προάγοντας ή αναστέλλοντας αντίστοιχα τη διαφοροποίηση των κυττάρων. 227

242 Αρχικά έγινε αποµόνωση και καθαρισµός ιστονών ξεχωριστά από κάθε αναπτυξιακή ζώνη της ρίζας, από φυτά-µάρτυρες, από φυτά που αναπτύχθηκαν παρουσία αυξίνης και γιββεριλλίνης καθώς και από ιστοκαλλιέργειες κάλλων που αναπτύχθηκαν σε θρεπτικό µέσο MS. Ακολούθησε ηλεκτροφορητικός διαχωρισµός των ιστονών, αρχικά µε ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE, έπειτα µε όξινη ηλεκτροφόρηση σε σύστηµα οξικού οξέος-ουρίας και τέλος µε δισδιάσταση όξινη ηλεκτροφόρηση AUT/AUC-PAGE. Στη συνέχεια έγινε ηλεκτροµεταφορά των πρωτεϊνών σε µεµβράνη PVDF και ανοσοανίχνευση κατά Western. Με τα κατάλληλα αντισώµατα µπορέσαµε να εντοπίσουµε τις κύριες τάξεις των ιστονών, τις ισοµορφές της ιστόνης Η1, την ουβικουτινωµένη µορφή της Η2Α, την ακετυλιωµένη και την φωσφορυλιωµένη µορφή της Η3 και την ακετυλιωµένη µορφή της Η4. Η επεξεργασία των πηκτών που ακολούθησε, έγινε µε τη βοήθεια Η/Υ και του προγράµµατος Gel Pro Analyzer 3.1 και προσδιορίστηκε η ποσοστιαία αναλογία κάθε ισοµορφής και τροποποιηµένης µορφής σε κάθε µία από τις τάξεις των ιστονών. Τέλος, έγινε ανοσοϊστοχηµική µελέτη σε τοµές της ρίζας για τον εντοπισµό των τροποποιηµένων µορφών των ιστονών καθώς και των ισοµορφών της ιστόνης Η1. Σύµφωνα µε την ανάλυση των πηκτών και την ανοσοϊστοχηµική µελέτη, κατά τη διαφοροποίηση των φυτικών κυττάρων στις αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας του καλαµποκιού παρατηρούνται σηµαντικές µεταβολές του προτύπου κατανοµής των ιστονών κυρίως µεταξύ της µεριστωµατικής ζώνης και της ζώνης διαφοροποίησης. Οι µεταβολές αυτές πιθανόν να οφείλονται στη διαφορετική φυσιολογική κατάσταση των κυττάρων των ζωνών αυτών, που συνεπάγονται και διαφορές στη δοµή και λειτουργία της χρωµατίνης. Κατά την αποδιαφοροποίηση των φυτικών κυττάρων σε ιστοκαλλιέργειες κάλλων το πρότυπο κατανοµής των ιστονών εµφανίζει πολλές οµοιότητες µε το αντίστοιχο της µεριστωµατικής ζώνης των µαρτύρων, ανεξάρτητα από την αναπτυξιακή ζώνη από την οποία προήλθαν οι ιστοκαλλιέργειες των κάλλων, γεγονός αναµενόµενο δεδοµένου ότι στις ιστοκαλλιέργειες κάλλων τα φυτικά κύτταρα ανακτούν τις µεριστωµατικές τους ιδιότητες και συµπεριφέρονται σαν µεριστωµατικά. Το πρότυπο κατανοµής των ιστονών στις αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας παρουσία αυξίνης σε πολλές περιπτώσεις είναι παρόµοιο µε το αντίστοιχο της ζώνης διαφοροποίησης των µαρτύρων ενώ είναι πιο περίπλοκο στις αναπτυξιακές ζώνες της ρίζας παρουσία γιββεριλλίνης, όπου οι 228

243 συµµετοχές όλων σχεδόν των τροποποιηµένων µορφών των ιστονών εµφανίζουν σηµαντική µείωση. Οι παραπάνω µεταβολές πιθανόν να συνδέονται µε την απόκριση των φυτικών κυττάρων στις εξωγενώς παρεχόµενες φυτοορµόνες, µία διαδικασία που περιλαµβάνει σηµαντικές αλλαγές στη λειτουργία της χρωµατίνης και στη γονιδιακή έκφραση. Είναι γνωστό πως η ετερογένεια των ιστονών, τόσο σε επίπεδο ισοµορφών, όσο και σε επίπεδο τροποποιήσεων, παίζει σηµαντικό ρόλο στη δοµή και στη λειτουργία της χρωµατίνης και έχει προταθεί ότι οι διαφορετικές ισοµορφές των ιστονών πιθανόν να σχετίζονται και µε διαφορετικές διαδικασίες που συµβαίνουν στη χρωµατίνη. Σ αυτή την περίπτωση, είναι πιθανό οι σχετικές αναλογίες µεταξύ των ισοµορφών κάθε κύριας τάξης ιστονών να µεταβάλλονται κατά τη διάρκεια διαδικασιών που επιφέρουν µεταβολές στη δοµή και λειτουργία της χρωµατίνης, όπως η διαφοροποίηση, η αποδιαφοροποίηση και η απόκριση σε εξωγενείς φυτοορµόνες. Οι παραπάνω διαδικασίες έχουν ως αποτέλεσµα µεταβολή της φυσιολογικής κατάστασης του κυττάρου και συνεπώς αλλαγές στη δοµή και λειτουργία της χρωµατίνης, οι οποίες είναι πιθανό να καθιστούν απαραίτητη τη µεταβολή των σχετικών αναλογιών µεταξύ των ισοµορφών των ιστονών καθώς και του επιπέδου τροποποίησής τους, έτσι ώστε τα φυτικά κύτταρα να ανταποκριθούν σε κάθε περίπτωση. 229

244 SUMMARY Histones are small, basic and highly cornserved proteins, necessary in DNA compaction into the chromatin of eukaryotic cells. The primary level of chromatin formation is the nucleosome, where 146bp of DNA are wrapped around a histone octamer core, comprised of two of each core histones, H2A, H2B, H3 and H4, while its structure is completed with the association of H1 linker histone. Each histone class, with the exception of H4, is represented by a family of structurally similar polypeptides called histone variants. Histone variants are synthesized in different relative amounts during the cell cycle and it has been proposed that they could be necessary in distinct chromatin functions. On the other hand, histone post-translational modifications such as acetylation, phosphorylation, methylation and ubiquitination, provide another level of heterogeneity to these proteins and is well established that they also play important roles in all chromatin functions. Although histone variants and modifications have been identified and studied in plants, little is known about their spacial distribution during plant cell differentiation and dedifferentiation, processes that involve several alterations in chromatin structure and function. Even less is known about the effect of exogenous applied plant hormones, compounds known to regulate almost all aspects of plant development, on histone variants distribution. In this study we examined the distribution of histone variants and modified forms during plant cell differentiation. Maize root is an appropriate biological system for developmental studies since it consists of three zones, which can be easily separated. Meristematic and elongation zones contain proliferating cells and the primary root tissues respectively, whereas differentiation zone consists mainly of parenchymatic, nonproliferating cells. On the other hand, it is well established that during callus formation, previously differentiated plant cells restore their maristematic properties, including the ability for rapid proliferation. Finally, plant hormones like auxin and gibberellin are known to play significant roles in root growth by promoting or inhibiting root differentiation. Histones were extracted from each of the three developmental zones of maize root from control plants, from plants treated with auxin and gibberellins and also from callus cultures developed in MS medium. They were separated initially in SDS containing and subsequently in acetic acid-urea containing polyacrylamide gels, and 230

245 finally in two-dimensional AUT/AUC-PAGE. By means of specific antibodies, we identified the five histone classes, the linker histone H1 variants, the ubiquitinated form of H2A, the acetylated and the phosphorylated forms of H3 and the acetylated form of H4. After identifying histone classes, two-dimensional gels were scanned and analyzed by means of Gel Pro Analyzer 3.1 software, in order to estimate each histone variant s ratio in maize root developmental zones. Finally, immunohistochemical analysis was used in order to directly define the root tissues containing linker histone variants and the modified forms of core histones. According to gel analysis and to immunohistochemical studies, the distribution of histone variants were altered during plant cell differentiation in maize root, particularly among meristematic and differentiation zone. These alterations maybe due to the diverse physiological state of the plant cells in each zone, which results in differences in chromatin structure and function. On the other hand, histone variants distribution during plant cell dedifferentiation in callus culture were similar to meristematic zone, regardless the developmental zone from which calli were derived. These similarity was expected because it is known that during callus formation, previously differentiated plant cells restore their meristematic properties, especially the ability for rapid proliferation. Finally, histone distribution pattern in the developmental zones of roots treated with auxin was similar to differentiation zone, whereas it was more complicated in the developmental zones of roots treated with gibberellin. These alterations are probably correlated with plant cell response to exogenous applied plant hormones, a process that implies several alterations to chromatin function. The remarkable heterogeneity of histones suggests an important role in chromatin function, considering that individual variants and covalent modifications might participate in distinct processes. If this is the case, the relative amounts of histone variants will be altered during processes that imply changes in chromatin function, such as cell differentiation, either programmed or regulated by plant hormones, and dedifferentiation. These processes result in alterations in the physiological state of the cell and consequently in chromatin function that probably necessitate distinct variants ratios and modification level during each process. 231

246 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Hnilica LS, Stein GS, Stein JL. Histones and other basic nuclear proteins. 1989, CRC Press, Boca Raton, Florida 2. Alvelo-Ceron D et al. Growth regulation of human variant histone genes and acetylation of the encoded proteins. Mol. Biol. Reps. 2000; 27: Redon C et al. Histone H2A variants H2A.X and H2A.Z. Curr. Opin. Genet. Dev. 2002; 12: Ahmad K, Henikoff S. The histone variant H3.3 marks active chromatin by replication-independent nucleosome assembly. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002; 99: Waterborg JH. Histone synthesis and turnover in Alfalfa. J. Biol. Chem. 1993; 268: Henikoff S et al. Histone variants, nucleosome assembly and epigenetic inheritance. Trends Genet. 2004; 20: Khochbin S. Histone H1 diversity: bridging regulatory signals to linker histone function. Gene 2001; 271: Khochbin S, Wolffe AP. Developmentally regulated expression of linker histone variants in vertebrates. Eur. J. Biochem. 1994; 225: Zlatanova J, Doenecke D. Histone H1 0 : a major player in cell differentiation? FASEB J. 1994; 8: Scippa GS et al. The H1 histone variant of tomato, H1-S, is targeted to the nucleus and accumulates in chromatin in response to waterdeficit stress. Planta 2000; 211: Wolffe AP, Guschin D. Chromatin structural features and targets that regulate transcription. J. Struct. Biol. 2000; 129: Carruthers LM, Hansen JC. The core histone N-termini function independently of linker histones during chromatin condensation. J. Biol. Chem. 2000; 275: Brownell JE, Allis CD. Special HATs for special occasions: linking histone acetylation to chromatin assembly and gene activation. Curr. Opin. Genet. Dev. 1996; 6: Verreault A. De novo nucleosome assembly: new pieces in an old puzzle. Genes Dev. 2000; 14: Krude T, Keller C. Chromatin assembly during S phase: contributions from histone deposition, DNA replication and the cell division cycle. Cell. Mol. Life Sci. 2001; 58: Loyola A, Almouzni G. Histone chaperones, a supporting role in the limelight. Biochim. Biophys. Acta 2004; 1677: Muchardt C, Yaniv M. ATP-dependent chromatin remodeling: SWI/SNF and Co. are on the job. J. Mol. Biol. 1999; 293: Langst G, Becker PB. Nucleosome mobilization and positioning by ISWI-containing chromatin-remodeling factors. J. Cell Sci. 2001; 114: Berger SL. An embarrassment of niches: the many covalent modification sof histones in transcriptional regulation. Oncogene 2001; 20: Sterner DE, Berger SL. Acetylation of histones and transcription-related factors. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2000; 64:

247 21. Khochbin S et al. Functional significance of histone deacetylase diversity. Curr. Opin. Genet. Dev. 2001; 11: Waterborg JH et al. Dynamic histone acetylation in alfalfa cells. Butyrate interference with acetate labeling. Biochim. Biophys. Acta 1990; 1049: Loury R, Sassone-Corsi P. Histone phosphorylation: how to proceed. Methods 2003; 31: Prigent C, Dimitrov S. Phosphorylation of serine 10 in histone H3, what for? J. Cell Sci. 2003; 116: Nowak SJ, Corces VG. Phosphoryltion of histone H3: a balancing act between chromosome condensation and transcriptional activation. Trends Genet. 2004; 20: Stallcup MR. Role of protein methylation in chromatin modeling and transcriptional regulation. Oncogene 2001; 20: Rice JD, Allis CD. Histone methylation versus histone acetylation: new insides into epigenetic regulation. Curr. Opin. Cell Biol. 2001; 13: Sims RJ et al. Histone lysine methylation: a signature for chromatin function. Trends in Genetics 2003; 19: Kouzarides T. Histone methylation in transcriptional control. Curr. Opin. Genet. Devel. 2002; 12: Loidl P. A plant dialect of the histone language. Trends Plant Sci. 2004; 9: Jason LJ et al. Histone ubiquitination: a tagging tail unfolds? Bioessays 2002; 24: Chen HY et al. Ubiquitination of histone H3 in elongating spermatids of rat testes. J. Biol. Chem. 1998; 273: Pham AD, Sauer F. Ubiquitin-activating/conjugating activity of TAFII250, a mediator of activation of gene expression in Drosophila. Science 2000; 289: Miwa M et al. The branching and linear portion of poly(adp-ribose) have the same alpha (1 lead to 2) ribose-ribose linkage. J. Biol. Chem. 1981; 256: Spencer VA, Davie JR. Role of covalent modifications of histones in regulating gene expression. Gene 1999; 240: Strahl BD, Allis CD. The language of covalent histone modifications. Nature 2000; 403: Zweidler A. Resolution of histones by polyacrylamide gel electrophoresis in presence of nonionic detergents. Methods Cell Biol. 1978; 17: Brown DT. Histone variants: are they functionally heterogeneous? Genome Biol. 2001; 2: Pehrson JR, Fried VA. MacroH2A, a core histone containing a large nonhistone region. Science 1992; 257: Costanzi C, Pehrson JR. MACROH2A2, a new member of the MACROH2A core histone family. J. Biol. Chem. 2001; 276: Chadwick BP, Willard HF. A novel chromatin protein, distantly related to histone H2A, is largely excluded from the inactive X chromosome. J. Cell Biol. 2001; 152: Ausio J, Abbott D. The many tales of a tail: Carboxyl-terminal tail heterogeneity specializes histone H2A variants for defined chromatin function. Biochemistry 2002; 41:

248 43. Rogakou EP et al. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J. Biol. Chem. 1998; 273: Rogakou EP et al. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 1999; 146: Paull TT et al. A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage. Curr. Biol. 2000; 10: Burma S et al. ATM phosphorylates histone H2AX in response to DNA double-strand breaks. J. Biol. Chem. 2001; 276: Rogakou EP et al. Initiation of DNA fragmentation during apoptosis induces phosphorylation of H2AX histone at serine 139. J. Biol. Chem. 2000; 275: Faast R et al. Histone variant H2A.Z is required for early mammalian development. Curr. Biol. 2001; 11: Stargell LA et al. Temporal and spatial association of histone H2A variant hv1 with transcriptionally competent chromatin during nuclear development in Tetrahynema thermophila. Genes Dev. 1993; 7: Abbott DW et al. Characterization of the stability and folding of H2A.Z chromatin particles. Implications for transcriptional activation. J. Biol. Chem. 2001; 276: Clarkson MJ et al. Regions of variant histone His2AvD required for Drosophila development. Nature 1999; 399: Pehrson JR, Fuji RN. Evolutionary conservation of histone macroh2a subtypes and domains. Nucleic Acids Res. 1998; 26: Mermoud JE et al. Histone macroh2a relocates to the inactive X chromosome after initiation and propagation of X-inactivation. J. Cell Biol. 1999; 147: Joanin P, Gigot C. Nucleotide sequence and expression of two histone H2B variants of maize. Plant Mol Biol 1992; 20: Waterborg JH et. al. Histone variants and acetylated species from the alfalfa plant Medicago sativa. Arch Biochem Biophys. 1987; 256: Waterborg JH. Sequence analysis of acetylation and methylation in two histone H3 variants in alfalfa. J. Biol. Chem. 1990; 265: Kapros T et al. Histone H3 transcript stability in alfalfa. Plant Mol. Biol. 1995; 28: Choo KHA. Centromerization. Trends Cell Biol. 2000; 10: Sullivan KF. A solid foundation: functional specialization of centromeric chromatin. Curr. Opin. Genet. Dev. 2001; 11: Ahmad K, Henikoff S. Centromeres are specialized replication domains in heterochromatin. J. Cell Biol. 2001; 153: Smith MM. Centromeres and variant histones: what, where, when and why? Curr. Opin. Cell Biol. 2002; 14: Wolffe AP. Centromeric chromatin. Histone deviants. Curr Biol. 1995; 5: Wang ZF et al. The mouse histone H1 genes: gene organization and differential regulation. J. Mol. Biol. 1997; 271: Mandl B et al. The five cleavage-stage (CS) histones of the sea urchin are encoded by a maternally expressed family of replacement histone genes: functional equivalence of the CS H1 and frog H1M (B4) proteins. Mol. Cell. Biol. 1997; 17:

249 65. Ohsumi K, Katagiri C. Occurrence of H1 subtypes specific to pronuclei and cleavage-stage cell nuclei of anuran amphibians. Dev. Biol. 1991; 147: Tanaka M et al. A mammalian oocyte-specific linker histone gene H1oo: homology with the genes for the oocyte-specific cleavage stage histone (cs-h1) of sea urchin and the B4/H1M histone of the frog. Development 2001; 128: Doenecke D et al. Histone gene expression and chromatin structure during spermatogenesis. Adv. Exp. Med. Biol. 1997; 424: Przewloka MR et al. The `drought-inducible' histone H1s of tobacco play no role in male sterility linked to alterations in H1 variants. Planta 2002; 215: Scippa GS et al. The histone-like protein H1-S and the response of tomato leaves to water deficit. J. Exp. Bot. 2004; 55: Ascenzi R, Gantt JS. A drought-stress-inducible histone gene in Arabidopsis thaliana is a member of a distinct class of plant linker histone variants. Plant Mol. Biol. 1997; 34: Zlatanova J et al. Linker histone binding and displacement: versatile mechanisms for transcriptional regulation. FASEB J. 2000; 14: Cole RD. Microheterogeneity in H1 histones and its consequences. Int. J. Pept. Protein Res. 1987; 30: Talasz H et al. In vivo phosphorylation of histone H1 variants during the cell cycle. Biochemistry 1996; 35: Crane-Robinson C. How do linker histones mediate differential gene expression? BioEssays 1999; 21: Dasso M et al. Nuclear assembly is independent of linker histones. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994; 91: Lin Q et al. Normal spermatogenesis in mice lacking the testis-specific linker histone H1t. Mol. Cell. Biol. 2000; 20: Rabini S et al. Spermatogenesis in mice is not affected by histone H1.1 deficiency. Exp. Cell Res. 2000; 255: Sirotkin AM et al. Mice develop normally without the HI(0) linker histone. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995; 92: Prymakowska-Bosak M et al. Linker histones play a role in male meiosis and the development of pollen grains in tobacco. Plant Cell 1999; 11: Misteli T et al. Dynamic binding of histone H1 to chromatin in living cells. Nature 2000; 408: Tanaka I et al. A novel histone variant localized in nucleoli of higher plant cells. Chromosoma 1999; 108: Tabata T, Iwabuchi M. Molecular cloning and nucleotide sequence of a variant wheat histone H4 gene. Gene 1984; 31: Philipps G et al. Genomic organization and nucleotide sequences of two corn histone H4 genes. Gene 1986; 42: Wu SC et al. The nucleotide sequences of two rice histone H3 genes. Nucleic Acids Res. 1989; 17: Chaboute M et al. Histones and histone genes in higher plants: structure and genomic organization. Biochimie 1993; 75: Ausio J. Histone H1 and evolution of sperm nuclear basic proteins. J. Biol. Chem. 1999; 274: Lewis JD et al. A walk though vertebrate and invertebrate protamines. Chromosoma 2003; 111: Pruss D et al. Nucleosomal anatomy where are the histones? BioEssays 1995; 17:

250 89. Langst G, Becker PB. Nucleosome remodeling: one mechanism, many phenomena? Biochim. Biophys. Acta 2004; 1677: Wolffe AP, Hayes JJ. Chromatin disruption and modification. Nucleic Acids Res. 1999; 27: Luger K et al. Crystal structure of a nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature 1997; 389: Wolffe AP. Histone H1. Int. J. Biochem. Cell Biol. 1997; 29: Kasinsky et. al. Origin of H1 linker histones. FASEB J. 2001; 15: Krude T. Chromatin assembly during DNA replication in somatic cells. Eur. J. Biochem. 1999; 263: Philpott A et al. Nuclear chaperones. Semin. Cell Dev. Biol. 2000; 11: Smith S, Stillman B. Purification and characterization of CAF-1, a human cell factor required for chromatin assembly during DNA replication in vitro. Cell 1989; 58: Tyler JK. Chromatin assembly. Eur. J. Biochem. 2002; 269: Verreault A et al. Nucleosome assembly by a complex of CAF-1 and acetylated histones H3/H4. Cell 1996; 87: Shibahara K et al. The N-terminal domains of histones H3 and H4 are not necessary for chromatin assembly factor-1-mediated nucleosome assembly onto replicated DNA in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000; 97: Kaya H et al. FASCIATA genes for chromatin assembly factor-1 in Arabidopsis maintain the cellular organization of apical meristems. Cell 2001; 104: Ito T et al. Drosophila NAP-1 is a core histone chaperone that functions in ATP-facilitated assembly of regularly spaced nucleosomal arrays. Mol. Cell Biol. 1996; 16: Rodriguez P et al. Functional characterization of human nucleosome assembly protein-2 (NAP1L4) suggests a role as a histone chaperone. Genomics 1997; 44: Akey CW, Luger K. Histone chaperones and nucleosome assembly. Curr. Opin. Struct. Biol. 2003; 13: Luger K, Richmond TJ. DNA binding within the mucleosome core. Curr. Opin. Struct. Biol. 1998; 8: Becker PB. Nucleosome sliding: facts and fiction. EMBO J. 2002; 21: Becker PB, Horz W. ATP-dependent nucleosome remodeling. Annu. Rev. Biochem. 2002; 71: Hamiche A et al. Histone tails modulate nucleosome mobility and regulate ATP-dependent nucleosome sliding by NURF. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001; 98; Vignali M et al. ATP-dependent chromatin-remodeling complexes. Mol. Cell. Biol. 2000; 20: Peterson CL, Logie C. Recruitmant of chromatin remodeling machines. J. Cell. Biochem. 2000; 78: Agresti A, Bianchi ME. HMGB proteins and gene expression. Curr. Opin. Genet. Dev. 2003; 13: Reeves R, Beckerbauer L. HMGI/Y: flexible regulators of transcription and chromatin structure. Biochim. Biophys. Acta 2001; 1519: Grasser KD. Plant chromosomal high mobility group proteins. Plant J. 1995; 7: Reeves R. Structure and function of the HMGI(Y) family of architectural transcription factors. Environ. Health Perspect. 2000; 108:

251 113. Allfrey VG et al. Acetylation and methylation of histones and their possible role in the regulation of RNA synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1964; 51: Eberharter A, Becker PB. Histone acetylation: a switch between repressive and permissive chromatin. EMBO Rep. 2002; 31: Loidl P. Histone acetylation: facts and questions. Chromosoma 1994; 103: Brownell JE, Allis CD. Special HATs for special occasions: linking histone acetylation to chromatin assembly and gene activation. Curr. Opin. Genet. Dev. 1996; 6: Brownell JE et al. Tetrahynema histone acetyltransferase A: a transcriptional co-activator linking gene expression to histone acetylation. Cell 1996; 84: Smith ER et al. Cloning of Drosophila GCN5: conserved features among metazoan GCN5 family members. Nucleic Acids Res. 1998; 26: Lusser A et al. Analysis of the histone acetyltransferase B complex of maize embryos. Nucleic Acids Res. 1999; 27: Lusser A et al. Histone acetylation: lessons from the plant kingdom. Trends Plant Sci 2001; 6: Schiltz RL et al. Overlapping but distinct patterns of histone acetylation by the human coactivators p300 and PCAF within nucleosomal substrates. J. Biol. Chem. 1999; 274: Krumm A et al. Long-distance transcriptional enhancement by the histone acetyltransferase PCAF. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998; 95: Kleff S et al. Identification of a gene encoding a yeast histone H4 acetyltransferase. J. Biol. Chem. 1995; 270: Roth SY, Allis CD. Histone acetylation and chromatin assembly: a single escort, multiple dances? Cell 1996; 87: Kolle D et al. Substrate and sequential site specifity of cytoplasmic histone acetyltransferases of maize and rat liver. FEBS Lett. 1998; 421: Wittschieben B et al. A novel histone acetyltransferase is an integral subunit of elongating RNA polymerase II holoenzyme. Mol. Cell 1999; 4: Takechi S, Nakayama T. Sas3 is a histone acetyltransferase and requires a zinc finger motif. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999; 266: Clarke AS et al. Esa1p is an essential histone acetyltransferase required for cell cycle progression. Mol. Cell Biol. 1999; 19: Smith ER et al. The Drosophila MSL complex acetylates histone H4 at lysine 16, a chromatin modification linked to dosage compensation. Mol. Cell Biol. 2000; 20: Kimura A, Horikoshi M. Tip60 acetylates six lysines of a specific class in core histones in vitro. Genes Cells 1998; 3: Ikura T et al. Involvement of the TIP60 histone acetylase complex in DNA repair and apoptosis. Cell 2000; 102: Shikama N et al. The p300/cbp family: intergrating signals with transcription factors and chromatin. Trends Cell Biol. 1997; 7:

252 133. Ogryzko VV et al. The transcriptional coactivators p300 and CBP are histone acetyltransferases. Cell 1996; 87: Jeanmougin F et al. The bromodomain revisited. Trends Biochem. Sci. 1997; 22: Spencer TE et al. Steroid receptor coactivator-1 is a histone acetyltransferase. Nature 1997; 389: Chen H et al. Nuclear receptor coactivator ACTR is a novel histone acetyltransferase and forms a multimeric activation complex with PCAF and CBP/p300. Cell 1997; 90: Mizzen CA et al. The TAFII250 subunit of TFIID has histone acetyltransferase activity. Cell 1996; 87: Kawasaki H et al. ATF-2 has intrinsic histone acetyltransferase activity which is modulated by phosphorylation. Nature 2000; 405: Marmorstein R. Structure of histone acetyltransferases. J. Mol. Biol. 2001; 311: Graessle S et al. Histone acetylation: plants and fungi as model systems for the investigation of histone deacetylases. Cell Mol. Life Sci. 2001; 58: De Ruijter AJM et al. Histone deacetylases (HDACs): characterization of the classical HDAC family. Biochemistry J. 2003; 370: Lechner T et al. RPD3-type histone deacetylases in maize embryos. Biochemistry 2000; 39: Kolle D et al. Different types of maize histone deacetylases are distinguished by a high complex substrate and site specifity. Biochemistry 1999; 38: Khochbin S, Wolffe AP. The origin and utility of histone deacetylases. FEBS Lett. 1997; 419: Verdin E et al. Class II histone deacetylases: versatile regulators. Trends Genet. 2003; 19: Imai S et al. Transcriptional silencing and longevity protein Sir2 is an NAD-dependent histone deacetylase. Nature 2000; 403: Brosch G et al. Purification and characterization of a highy molecular weight histone deacetylase complex (HD2) of maize embryos. Biochemistry 1996; 35: Dangl M et al. Comparative analysis of HD2 type histone deacetylases in higher plants. Planta 2001; 213: Bertos NR et al. Class II histone deacetylases: structure, function and regulation. Biochem. Cell Biol. 2001; 79: Kramer OH et al. Histone deacetylase as a therapeutic target. Trends Endocrinol. Metab. 2001; 12: Gottlicher M et al. Valproic acid defines a novel class of HDAC inhibitors inducing differentiation of transformed cells. EMBO J. 2001; 20: Archer SY, Hodin RA. Histone acetylation and cancer. Curr. Opin. Genet. Dev. 1999; 9: Grunstein M. Histone acetylation and chromatin structure and transcription. Nature 1997; 389: Kornberg RD, Lorch Y. Twenty-five years of the nucleosome, fundamental particle of the eukaryotic chromosome. Cell 1999; 98: Utley RT et al. Transcriptional activators direct histone acetyltransferases complexes to nucleosomes. Nature 1998; 394: Deckert J, Struhl K. Histone acetylation at promoters is differentially affected by specific activators and repressors. Mol. Cell Biol. 2001; 21:

253 157. Cress WD, Seto E. Histone deacetylases, transcriptional control and cancer. J. Cell Physiol. 2000; 184: Vogelauer M et al. Global histone acetylation and deacetylation in yeast. Nature 2000; 408: Forsberg EC, Bresnick EH. Histone acetylation beyond promoters: long-range acetylation patterns in the chromatin world. BioEssays 2001; 23: Turner BM. Decoding the nucleosome. Cell 1993; 75: Gutierrez RM, Hnilica LS. Tissue specifity of histone phosphorylation. Science 1967; 157: Cheung P et al. Synergistic coupling of histone H3 phosphorylation and acetylation in response to epidermal growth factor stimulation. Mol. Cell 2000; 5: Sassone-Corsi P et al. Requirement of Rsk-2 for epidermal growth factor-activated phosphorylation of histone H3. Science 1999; 285: Soloaga A et al. MSK2 and MSK1 mediate the mitogen- and stress-induced phosphorylation of histone H3 and HMG-14. EMBO J. 2003; 22: Wang Y et al. The JIL-1 tandem kinase mediates histone H3 phosphorylation and is required for maintenance of chromatin structure in Drosophila. Cell 2001; 105: Yamamoto Y et al. Histone H3 phosphorylation by IKK-alpha is critical for cytokine-induced gene expression. Nature 2003; 423: Hans F, Dimitrov S. Histone H3 phosphorylation and cell division. Oncogene 2001; 20: Hsu JY et al. Mitotic phosphorylation of histone H3 is governed by Ipl1/aurora kinase and Glc7/PPl phosphatase in budding yeast and nematodes. Cell 2000; 102: Crosio C et al. Mitotic phosphorylation of histone H3: spatio-temporal regulation by mammalian Aurora kinases. Mol. Cell Biol. 2002; 22: Bolton et al. Aurora B kinase exists in a complex with survivin and INCENP and its kinase activity is stimulated by survivin binding and phosphorylation. Mol. Biol. Cell 2002; 13: De Souza CP et al. Mitotic histone H3 phosphorylation by the NIMA kinase in Aspergillus nidulans. Cell 2000; 102: Goto H et al. Aurora B phosphorylates histone H3 at serine 28 with regard to the mitotic chromosome condensation. Genes Cells 2002; 7: Preuss U et al. Novel mitosis-specific phosphorylation of histone H3 at Thr11 mediated by Dlk/ZIP kinase. Nucleic Acids Res. 2003; 31: Murnion ME et al. Chromatin-associated protein phosphatase 1 regulates aurora-b and histone H3 phosphorylation. J. Biol. Chem. 2001; 276:

254 175. Langan TA et al. Mammalian growth-associated H1 histone kinase: a homolog of cdc2+/cdc28 protein kinases controlling mitotic entry in yeast and frog cells. Mol. Cell Biol. 1989; 9: Nowak SJ, Corces VG. Phosphorylation of histone H3 correlates with transcriptionally active loci. Genes Dev. 2000; 14: Lo WS et al. Phosphorylation of serine 10 in histone H3 is functionally linked in vitro and in vivo to Gcn5-mediated acetylation at lysine 14. Mol. Cell 2000; 5: Rea S et al. Regulation of chromatin structure by site-specific histone H3 methyltransferases. Nature 2000; 406: Grant PA. A tale of histone modifications. Gen. Biol. 2001; 2: Clayton AL et al. Phosphoacetylation of histone H3 on c-fos- and c-jun-associated nucleosomes upon gene activation. EMBO J. 2000; 19: van Hooser A et al. Histone H3 phosphorylation is required for the initiation, but not maintenance, of mammalian chromosome condensation. J. Cell Sci. 1998; 111: Wei Y et al. Phosphorylation of histone H3 is required for proper chromosome condensation and segregation. Cell 1999; 97: Hendzel MJ et al. Mitosis-specific phosphorylation of histone H3 initiates primary within pericentromeric heterochromatin during G2 and spreads in an ordered fashion coincident with mitotic chromosome condensation. Chromosoma 1997; 106: Kaszas E, Cande WZ. Phosphorylation of histone H3 is correlated with changes in the maintenance of sister chromatin cohesion during meiosis in maize, rather than the condensation of the chromatin. J. Cell Sci. 2000; 113: Speliotes EK et al. The survin-like C. elegans BIR-1 protein acts with the Aurora-like kinase AIR-2 to affect chromosomes and the spindle midzone. Mol. Cell 2000; 6: Ajiro K. Histone H2B phosphorylation in mammalian apoptotic cells. An association with DNA fragmentation. J. Biol. Chem. 2000; 275: Bannister AJ, Kouzarides T. Reversing histone methylation. Nature 2005; 436: Martin C, Zhang Y. The diverse functions of histone lysine methylation. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2005; 6: Gary JD, Clarke S. RNA and protein interactions modulated by protein arginine methylation. Prog. Nucleic Acids Res. Mol. Biol. 1998; 61: Ma H et al. Hormone-dependent, CARM1-directed arginine-specific methylation of histone H3 on a steroid regulated promoter. Curr. Biol. 2001; 11: Zhang Y, Reinberg D. Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent histone modifications of the core histone tails. Genes & Devel 2001; 15: Wang H et al. Methylation of histone H4 at arginine 3 facilitating transcriptional activation by nuclear hormone receptor. Science 2001; 293:

255 193. Schurter B et al. Methylation of histone H3 by coactivator-associated arginine methyltransferase. Biochemistry 2001; 40: Frankel A et al. The novel human protein arginine N-methyltransferase PRMT6 is a nuclear enzyme displaying unique substrate specifity J. Biol. Chem. 2002; 277: Lachner M et al. An epigenetic road map for histone lysine methylation. J. Cell Sci. 2003; 116: Santos-Rosa H et al. Active genes are tri-methylated at K4 of histone H3. Nature 2002; 419: Lachner M, Jenuwein T. The many faces of histone lysine methylation. Curr. Opin. Cell Biol. 2002; 14: Jenuwein T et al. SET domain proteins modulate chromatin domains in eu- and heterochromatin. Cell Mol. Life Sci. 1998; 54: Koonin EV et al. The chromo superfamily: New members, duplication of chromodomain and possible role in delivering transcription regulators to chromatin. Nucleic Acids Res. 1995; 23: Marmorstein R. Structure of SET domain proteins: a new twist on histone methylation. Trends Biochem. Sci. 2003; 28: Ng HH et al. Lysine methylation within the globular domain of histone H3 by Dot1 is important for telomeric silencing and Sir protein association. Genes Dev. 2002; 16: Shi Y et al. Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1. Cell 2004; 119: Cuthbert GL et al. Histone deimination antagonizes arginine methylation. Cell 2004; 118: Pray-Grant MG et al. Chd1 chromodomain links histone H3 methylation with SAGA- and SLIK-dependent acetylation. Nature 2005; 433: Wysocka J et al. WDR5 associates with histone H3 methylated at K4 and is essential for H3 K4 methylation and vertebrate development. Cell 2005; 121: Beisel C et al. Histone methylation by the Drosophila epigenetic transcriptional regulator Ash1. Nature 2002; 419: Ng HH et al. Lysine-79 of histone H3 is hypomethylated at silenced loci in yeast and mammalian cells: a potential mechanism for positioneffect variegation. Proc. Natl. Acad. Sci. 2003; 100: Huyen Y et al. Methylated lysine 79 of histone H3 targets p53bp1 to DNA double-strand breaks. Nature 2004; 432: Sanders SL et al. Methylation of histone H4 lysine 20 controls recruitment of Crb2 to sites of DNA damage. Cell 2004; 119: Cao R et al. Role of histone H3 lysine 27 methylation in Polycomb group silencing. Science 2002; 298: Vandel L et al. Transcriptional repression by the Retinoblastoma protein through the recruitment of a histone methyltransferase. Mol. Cell Biol. 2001; 21: Koipally K et al. Repression by Ikaros and Aiolos is mediated through deacetylase complexes. EMBO J. 1999; 18: Lachner M et al. Methylation of histone H3 lysine 9 creates a binding site for HP1 proteins. Nature 2001; 410: Tamaru H, Selker EU. A histone H3 methyltransferase controls DNA methylation in Neurospora crassa. Nature 2001; 414:

256 215. Soppe WJ et al. DNA methylation controls histone H3 lysine 9 methylation and heterochromatin assembly in Arabidopsis. EMBO J. 2002; 21: Fuks F et al. The methyl-cpg-binding protein MeCP2 links DNA methylation to histone methylation. J. Biol. Chem. 2003; 278: Volpe T et al. Regulation of heterochromatin silencing and histone H3 lysine 9 methylation by RNAi. Science 2002; 297: Goldknopf IL et al. Isolation and characterization of protein A24, a histone-like, non-histone chromosomal protein. J. Biol. Chem. 1975; 250: Rozbyk K et al. Rad6 dependent ubiquitination of histone H2B in yeast. Science 2000; 287: Jentsch S et al. The yeast DNA repair gene RAD6 encodes a ubiquitin-conjugating enzyme. Nature 1987; 329: Hwang WW et al. A conserved RING finger protein required for histone H2B mono-ubiquitination and cell size control. Mol. Cell 2003; 11: Koken MH et al. Structural and functional conservation of two human homologs of the yeast DNA repair gene RAD6. Proc. Natl. Acad. Sci. 1991; 88: Baarends WM et al. Histone ubiquitination and chromatin remodeling in mouse spermatogenesis. Dev. Biol. 1999; 207: D Andrea A, Pellman D. Deubiquitinating enzymes: A new class of biological regulators. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 1998; 33: Henry KW et al. Transcriptional activation via sequential histone H2B ubiquitylation and deubiquitylation, mediated by SAGA-associated Ubp8. Genes & Dev. 2003; 17: Hayes JJ, Hansen JC. Nucleosomes and the chromatin fiber. Curr. Opin. Genet. Dev. 2001; 11: Barsoum J, Varshavsky A. Preferential localization of variant nucleosomes near the 5 -end of the mouse dihydrofolate reductase gene. J. Biol. Chem. 1985; 260: Nickel BE et al. Ubiquitinated histone H2B is preferentially located in transcriptionally active chromatin. Biochemistry 1989; 28: Davie JR, Murphy LC. Level of ubiquitinated histone H2B is coupled to ongoing transcription. Biochemistry 1990; 29: Mimnaugh EG et al. Rapid deubiquitination of nucleosomal histones in human tumour cells caused by proteasome inhibitors and stress response inducers: effects on replication, transcription, translation and cellular stress response. Biochemistry 1997; 36: Levinger L. Nucleosomal structure of two Drosophila melanogaster simple satellites. J. Biol. Chem. 1985; 260: Huang et al. The active immunoglobulin kappa chain gene is packaged by non-ubiquitin-conjugated nuleosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986; 83: 233. Nickel BE et al. Ubiquitinated histone H2B is preferentially located in transcriptionally active chromatin. Biochemistry 1989; 28: Turner SD et al. The E2 ubiquitin conjugase Rad6 is required for the ArgR/Mcm1 repression of ARG1 transcription. Mol. Cell Biol. 2002; 22:

257 235. Baarends WM et al. Silencing of unpaired chromatin and histone H2A ubiquitination in mammalian meiosis. Mol. Cell. Biol. 2005; 25: Smith KP et al. Ubiquitinated proteins including uh2a on the human and mouse inactive X chromosome: enrichment in gene rich bands. Chromosoma 2004; 113: Zhang Y. Transcriptional regulation by histone ubiquitination and deubiquitination. Genes & Dev. 2003; 17: Sun ZW, Allis CD. Ubiquitination of histone H2B regulates H3 methylation and gene silencing in yeast. Nature 2002; 418: Wu RS et al. Metabolism of ubiquitinated histones. J. Biol. Chem. 1981; 256: Mueller RD et al. Identification of ubiquitinated histones 2A and 2B in Physarum polycephalum. Disappearance of these proteins in metaphase and reappearance in anaphase. J. Biol. Chem. 1985; 260: Cai SY et al. A mutant deubiquitinating enzyme (Ubp-M) associates with mitotic chromosomes and blocks cell division. Proc. Natl. Acad. Sci. 1999; 96: Bradbury EM. Reversible histone modifications and the chromosome cell cycle. Bioessays 1992; 14: Lawrence C. The RAD6 DNA repair pathway in Saccharomyces cerevisiae: what does it do, and how does it do it? Bioessays 1994; 16: Mimnaugh EG et al. Prevention of cisplatin DNA adduct repair and potentiation of cisplatin-induced apoptosis in ovarian carcinoma cells by proteasome inhibitors. Biochem Pharm 2000; 60: Koken et al. Expression of the ubiquitin-conjugating DNA repair enzymes HHR6A and B suggests a role in spermatogenesis and chromatin modification. Dev. Biol. 1996; 173: Roest HP et al. Inactivation of the HR6B ubiquitin conjugating DNA repair enzyme in mice causes male sterility associated with chromatin modification. Cell 1996; 86: Hay RT. Protein modification by SUMO. Trends Biochem. Sci. 2001; 26: Sternsdorf T et al. Sumo. Curr. Biol. 2003; 13: Shiio Y, Eisenman RN. Histone sumoylation is associated with transcriptional repression. Proc. Natl. Acad. Sci 2003; 100: Minaga T et al. The in vitro distribution of immunoreactive larger than tetrameric poly(adp-ribose) in histone and nonhistone protein fractions of rat liver. J. Biol. Chem. 1979; 254: Buki KG et al. Identification of domains of poly(adp-ribose) polymerase for protein binding and self-association. J. Biol. Chem. 1995; 270: Miwa M et al. Purification and properties of glycohydrolase from calf-thymus splitting ribose-ribose linkages of poly(adp-ribose). J. Biol. Chem. 1974; 249:

258 253. Benjamin RC, Gill MD. Poly(ADP-ribose) synthesis in vitro programmed by damaged DNA. A comparison of DNA molecules containing different types of strand breaks. J. Biol. Chem. 1980; 255: Ogata N et al. ADP-ribosylation of histone H1. Identification of glutamic acids 2, 14 and the COOH-terminal lysine as modification sites. J. Biol. Chem. 1980; 255: Boulikas T. DNA strand breaks alter histone ADP-ribosylation. Proc. Natl. Acad. Sci. 1989; 86: Boulikas T. Poly (ADP-ribosylated) histones in chromatin replication. J. Biol. Chem. 1990; 265: Boulikas T. Relation between carcinogenesis, chromatin structure and poly (ADP-ribosylation). Anticancer Res. 1991; 2: Guilfoyle TJ, Hagen G. Auxin response factors. J. Plant Growth Regul. 2001; 20: Leyser O. Auxin signaling: the beginning, the middle and the end. Curr. Opin. Plant Biol. 2001; 4: Berleth T et al. Auxin signals-turning genes on and turning cells around. Curr. Opin. Plant Biol. 2004; 7: Friml J. Auxin transport-shaping the plant. Curr. Opin. Plant Biol. 2003; 6: Reed JW. Roles and activities of Aux/IAA proteins in Arabidopsis. Trends Plant Sci. 2001; 6: Eckardt NA. New insights into auxin biosynthesis. Plant Cell 2001; 13: Leyser O, Berleth T. A molecular basis for auxin action. Semin. Cell Dev. Biol. 1999; 10: Zazimalova E, Napier RM. Points of regulation for auxin action. Plant Cell Rep. 2003; 21: Sztein AE et al. Evolutionary patterns in the auxin metabolism of green plants. Int. J. Plant Sci. 2000; 161: Reed RC et al. Inhibition of auxin movement from the shoot to the root inhibits lateral root development in Arabidopsis. Plant Physiol. 1998; 118: Jones AM. Auxin transport: down and out and up again. Science 1998; 282: Rubery PH, Sheldrake AR. Carrier-mediated auxin transport. Planta 1974; 118: Benfey PN. Auxin action: slogging out of the swamp. Curr. Biol. 2002; 12: Muday GK, DeLong A. Polar auxin transport: controlling where and how much. Trends Plant Sci. 2001; 6: Muday GK, Murphy AS. An emerging model of auxin transport regulation. Plant Cell 2002; 14: Friml J, Palme K. Polar auxin transport-old questions and new concepts? Plant Mol. Biol. 2002; 49: Friml J et al. Lateral relocation of auxin efflux regulator PIN3 mediates tropism in Arabidopsis. Nature 2002; 415: Benjamins R et al. The PINOID protein kinase regulates organ development in Arabidopsis by enhancing polar auxin transport. Development 2001; 128: Luschnig C. Auxin transport: why plants like to think BIG. Curr. Biol. 2001; 11: Timpte C. Auxin binding protein: curiouser and curiouser. Trends Plant Sci. 2001; 12: Ulmassov T et al. Activation and repression of transcription by auxin response factors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999; 96:

259 279. Vogler H, Kuhlemeier C. Simple hormones but complex signaling. Curr. Opin. Plant Biol. 2003; 6: Dharmasiri S, Estelle M. The role of regulated protein degradation in auxin response. Plant Mol. Biol. 2002; 49: Rogg LE, Bartel B. Auxin signaling: derepression through regulated proteolysis. Dev. Cell 2001; 1: Xie Q et al. Araidopsis NAC1 transduces auxin signal downstream of TIR1 to promote lateral root development. Genes Dev. 2000; 14: Fleet CM, Sun TP. A DELLAcate balance: the role of gibberillin in plant morphogenesis. Curr. Opin. Plant Biol. 2005; 8: Lange T. Molecular biology of gibberillin synthesis. Planta 1998; 204: Hedden P, Phillips AL. Gibberillin metabolism: new insights revealed by the genes. Trends Plant Sci. 2000; 5: Thomas SG, Sun TP. Update on gibberillin signaling. A tale of the tall and the short. Plant Physiol. 2004; 135: Lovegrove A, Hooley R. Gibberillin and abscisic acid signaling in aleurone. Trends Plant Sci. 2000; 5: Olszewski N et al. Gibberillin signaling: biosynthesis, catabolism and response pathways. Plant Cell 2002; 14: MacMillan J. Biosynthesis of the gibberillin plant hormones. Nat. Prod. Rep. 1997; 14: Silverstone AL et al. Repressing a repressor: gibberillin-induced rapid reduction of the RGA protein in Arabidopsis. Plant Cell 2001; 13: Dill A et al. The DELLA motif is essential for gibberillin-induced degradation of RGA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001; 98: Peng JR et al. Green revolution genes encode mutant gibberillin response modulators. Nature 1999; 400: Mok DW, Mok MC. Cytokinin metabolism and action. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 2001; 52: Kakimoto T. Biosynthesis of cytokinins. J. Plant Res. 2003; 116: Aoyama T, Oka A. Cytokinin signal transduction in plant cells. J. Plant Res. 2003; 116: Kakimoto T. Identification of plant cytokinin biosynthetic enzymes as dimethylallyl diphosphate: ATP/ADP isopentenyl-transferases. Plant Cell Physiol. 2001; 42: Takei K et al. Identification of genes encoding adenylate isopentenyltransferase, a cytokinin biosynthesis enzyme, in Arabidopsis thaliana. J. Biol. Chem. 2001; 276: Hutchison CE, Kieber JJ. Cytokinin signaling in Arabidopsis. Plant Cell 2002; 14: Inoue T et al. Identification of CRE1 as a cytokinin receptor from Arabidopsis. Nature 2001; 409: Hwang I, Sheen J. Two-component circuitry in Arabidopsis cytokinin signal transduction. Nature 2001; 413: Imamura A et al. Compilation and characterization of Arabidopsis thaliana response regulators implicated in His-Asp phosphorelay signal transduction. Plant Cell Physiol. 1999; 40: Che P et al. Global and hormone-induced gene expression changes during shoot development in Arabidopsis. Plant Cell 2002; 14:

260 303. D Agostino IB et al. Characterization of the response of the Arabidopsis response regulator gene family to cytokinin. Plant Physiol. 2000; 124: Bewley JD. Seed germination and dormancy. Plant Cell 1997; 9: Finkelstein RR et al. Abscisic acid signaling in seeds and seedlings. Plant Cell 2002; 14: Hetherington AM. Guard cell signaling. Cell 2001; 107: Xiong L et al. Cell signaling during cold, drought and salt stresses. Plant Cell 2002; 14: Xiong L, Zhu JK. Regulation of abscisic acid biosynthesis. Plant Physiol. 2003; 133: Taylor IB et al. Control of abscisic acid synthesis J. Exp. Bot. 2000; 51: Cutler AJ, Crochko JE. Formation and breakdown of ABA. Trends Plant Sci. 1999; 4: Himmelbach et al. Relay and control of abscisic acid signaling. Curr. Opin. Plant Biol. 2003; 6: Schroeder JI et al. Guard cell abscisic acid signalling and engineering drought hardiness in plants. Nature 2001; 410: Garcia-Mata C, Lamattina L. Nitric oxide and abscisic acid cross talk in guard cells. Plant Physiol. 2002; 128: Coursol S et al. Sphingolipid signalling in Arabidopsis guard cells involves heterotrimeric G proteins. Nature 2003; 423: Merlot S et al. The ABI1 and ABI2 protein phosphatases 2C act in a negative feedback regulatory loop of the abscisic acid signalling pathway. Plant J. 2001; 25: Johnson RR et al. The abscisic acid-responsive kinase PKABA1 interacts with a seed-specific abscisic acid response element-binding factor, TaABF, and phosphorylates TaABF peptide sequences. Plant Physiol. 2002; 130: Yoshida et al. ABA-activated SnRK2 protein kinase is required for dehydration stress signaling in Arabidopsis.Plant Cell Physiol. 2002; 43: Hoth S et al. Genome-wide gene expression profiling in Arabidopsis thaliana reveals new targets of abscisic acid and largely impaired gene regulation in the abi1-1 mutant. J. Cell Sci. 2002; 115: Narusaka Y et al. Interaction between two cis-acting elements, ABRE and DRE, in ABA-dependent expression of Arabidopsis rd29a gene in response to dehydration and high-salinity stresses. Plant J. 2003; 34: Niu X et al. Maize ABI4 binds coupling element1 in abscisic acid and sugar response genes. Plant Cell 2002; 14: Bleecker AB, Kende H. Ethylene: agaseous signal molecule in plants. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2000; 16: Zarembinski T, Theologis A. Ethylene biosynthesis and action: a case of conservation. Plant Mol. Biol. 1994; 26: Chen YF et al. Ethylene signal transduction. Annals Bot. 2005; 95: Bleecker AB. Ethylene perception and signalling: an evolutionary perspective. Trends Plant Sci. 1999; 4: Hua J, Meyerowitz EM. Ethylene responses are negatively regulated by a receptor gene family in Arabidopsis thaliana. Cell 1998; 94:

261 326. Huang Y et al. Biochemical and functional analysis of CTR1, a protein kinase that negatively regulates ethylene signalling in Arabidopsis. Plant J. 2003; 33: Alonso JM et al. EIN2, a bifunctional transducer of ethylene and stress responses in Arabidopsis. Science 1999; 284: Roman G et al. Genetic analysis of ethylene signal transduction in Arabidopsis thaliana: five novel mutant loci integrated into a stress response pathway. Genetics 1995; 139: Adams-Phillips L et al. Signal transduction systems regulating fruit ripening. Trends Plant Sci. 2004; 9: Klee HJ. Ethylene signal transduction. Moving beyond Arabidopsis.Plant Physiol. 2004; 135: Wang Z-Y, He J-H. Brassinosteroid signal transduction-choices of signal and receptors. Trends Plant Sci. 2004; 9: Clouse S. Brassinosteroids. Curr. Biol. 2001; 11: Yokota T. The structure, biosynthesis and function of brassinosteroids. Trends Plant Sci. 1997; 2: Bishop GJ, Yokota T. Plants steroid hormones, brassinosteroids: current highlights of molecular aspects on their synthesis/metabolism, transport, perception and response. Plant Cell Physiol. 2001; 42: Asami T et al. Characterization of brassinazole, a triazole-type brassinosteroid biosynthesis inhibitor. Plant Physiol. 2000; 123: Wang Z-Y et al. BRI1 is a critical component of a plasma-membrane receptor for plant steroids. Nature 2001; 410: Hu Y et al. Promotive effect of brassinosteroids on cell division involves a distinct CycD3-induction pathway in Arabidopsis. Plant J. 2000; 24: Aranda A, Pascual A. Nuclear hormone receptors and gene expression. Physiol. Rev. 2001; 81: Bishop GJ, Koncz C. Brassinosteroids and plant steroid hormone signaling. Plant Cell 2002; 14: Li J. Brassinosteroids signal through two receptor-like kinases. Curr. Opin Plant Biol. 2003; 6: Nam KH, Li J. BRI1/BAK1, a receptor kinase pair mediating brassinosteroid signaling. Cell 2002; 110: Li J, Chory J. Brassinosteroid actions in plants. J. Exp. Bot. 1999; 50: Wang Z-Y et al. Nuclear localized BZR1 mediates brassinosteroid-induced growth and feedback suppression of brassinosteroid biosynthesis. Dev. Cell 2002; 2: Yin Y et al. BES accumulates in the nucleus in response to brassinosteroids to regulate gene expression and promote stem elongation. Cell 2002; 109: Zhao J et al. Two putative BIN2 substrates are nuclear components of brassinosteroid signaling. Plant Physiol. 2002; 130: Cheong Choi Methyl jasmonate as a vital substance in plants. Trends Genet. 2003; 19: Wasternack C, Parthier B. Jasmonate-signaled plant gene expression. Trends Plant Sci. 1997; 2: Seo HS et al. Jasmonic acid carboxyl methyltransferase: a key enzyme for jasmonate-regulated plant responses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001; 98:

262 349. Devoto A et al. COI1 links jasmonate signaling and fertility to the SCF ubiquitin ligase complex in Arabidopsis. Plant J. 2002; 32: Petersen et al. Arabidopsis map kinase 4 negatively regulates systemic acquired resistance.cell. 2000; 103: Memelink J et al. ORCAnization of jasmonate-responsive gene expression in alkaloid metabolism. Trends Plant Sci. 2001; 6: Lorenzo O et al. Ethylene response factor 1 integrates signal from ethylene and jasmonate pathways in plant defense. Plant Cell 2003; 15: Schilmiller AL, Howe GA. Systemic signaling in the wound response. Curr. Opin. Plant Biol. 2005; 8: Lindsey K. Plant peptide hormones: the long and the short of it. Curr. Biol. 2001; 11: Matsubayashi Y et al. Peptide signals and and their receptors in higher plants. Trends Plant Sci. 2001; 6: Lindsey K et al. Peptides: new signaling molecules in plants. Trends Plant Sci. 2002; 7: Yang HP et al. Phytosulfikine-alpha, a peptide growth factor found in higher plants: its structure, functions, precursors and receptors. Plant Cell Physiol. 2000; 41: Trotochaud A et al. The CLAVATA1 receptor-like kinase requires CLAVATA3 for its assembly into a signaling complex that includes KAPP and a Rho-related protein. Plant Cell 1999; 11: Trotochaud AM et al. CLAVATA3, a multigenic ligand for the CLAVATA1 receptor-kinase. Science 2000; 289: Schopfer CR, Nasrallah JB. Self-imcompatibility. Prospects for a novel putative peptide signaling molecule. Plant Physiol. 2000; 124: Kachroo A et al. Allele-specific receptor-ligand interaction in Brassica self-imcompatibility. Science 2001; 293: McCully ME. How do real roots work? Plant Physiol. 1995; 109: McCully ME. Roots in soil: unearthing the complexities of roots and their rhizospheres. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1999; 50: Ishikawa H, Evans ML. Specialized zones of development in roots. Plant Physiol. 1995; 109: Raghavan V. Deveolpmental Biology of Flowering Plants, 1999, Springer-Verlag, New York 366. Van den Berg C et al. Short-range control of cell differentiation in the Arabidopsis root meristem. Nature 1997; 390: Hochholdinger F et al. From weeds to crops: genetic analysis of root development in cereals. Trends Plant Sci. 2004; 9: Duckett CM et al. Dye-coupling in the root epidermis of Arabidopsis is progressively reduced during development. Development 1994; 120: Beeckman T, Burssens S, Inze D. The peri-cell-cycle in Arabidopsis. J. Exp. Bot. 2001; 52: Malamy JE, Benfey PN. Organization and cell differentiation of in lateral roots of Arabidopsis thaliana. Development 1997; 124: Dubrowsky JG et al. Pericycle cell proliferation and lateral root initiation in Arabidopsis. Plant Physiol. 2000; 124: Casimiro I et al. Dissecting Arabidopsis lateral root development. Trends Plant Sci. 2003; 8:

263 373. Rost TL, Bryant JA. Root organization and gene expression patterns. J. Exp. Bot. 1996; 47: Baskin TI et al. STUNTED PLANT 1, a gene required for expansion in rapidly elongating but not in dividing cells and mediating root growth responses to applied cytokinin. Plant Physiol. 1995; 107: Aeschbacher RA et al. The SABRE gene is required for normal cell expsansion in Arabidopsis. Genes Dev. 1995; 9: Torrey JG. Auxin control of vascular pattern formation in regenerating pea root meristems grown in vitro. Am. J. Bot. 1957: 44: Sachs T. On the determination of the pattern of vascular tissue in peas. Ann. Bot. 1968; 32: Masucci JD, Schiefelbein JW. Hormones act downstream of TTG and GL2 to promote root hair outgrowth during epidermis development in the Arabidopsis root. Plant Cell 1996; 8: Tanimoto M et al. Ethylene is a positive regulator of the root hair development in Arabidopsis thaliana. Plant J. 1995; 8: Goldacre PL. Potentiation of lateral root induction by root initials in isolated flax roots. Aust. J. Biol. Sci. 1959; 12: Hinchee MAW, Rost TL. The control of lateral root development in cultured pea seedlings I. The role of seedling organs and plant growth regulators. Bot. Gaz. 1986; 147: Blakely LM et al. Experimental studies on lateral root formation in radish seedling roots II. Analysis of the dose-resonse to exogenous auxin. Plant Physiol. 1988; 87: Celenza JL et al. A pathway for lateral root formation in Arabidopsis thaliana. Genes Dev. 1995; 9: Chandler VL, Brendel V. The maize genome sequencing project. Plant Physiol. 2002; 130: Hochholdinger F, Woll K, Sauer M, Dembinsky D. Genetic dissection of root formation in maize (Zea mays) reveals root-type specific developmental programmes. Ann. Bot. (Lond) 2004; 93: McCully ME, Canny MJ. Localization of translocated 14 C in roots and root exudates of field-grown maize. Physiol. Plant. 1985; 65: Hetz W et al. Isolation and characterization of rtcs, a mutant deficient in the formation of nodal roots. Plant J. 1996; 10: Takahashi F et al. Sugar-induced adventitious roots in Arabidopsis seedlings. J. Plant Res. 2003; 116: Hose E et al. The exodermis: a variable apoplastic barrier. J. Exp. Bot. 2001; 52: Jiang K et al. Quiescent center formation in maize roots is associated with an auxin-regulated oxidizing environment. Development 2003; 130: Laskowski MJ et al. Formation of lateral root meristem is a two stage process. Development 1995; 121: Schiefelbein JW et al. Building a root: the control of patterning and morphogenesis uring root development. Plant Cell 1999; 9: Burkhanova E et al. Some characteristics of chromatin from meristematic and differentiated cells of maize root. Cell Differentiation 1975; 4: Murashige T, Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiol Plant 1962; 15: Muller A et al. Properties of condensed chromatin in Barley nuclei. Planta 1980; 149:

264 396. Murray MG, Key JL. 2,4-dichlorophenoxyacetic acid enhanced phosphorylation of soybean nuclear proteins. Plant Physiol 1978; 61: Lowry OH et al. Protein measurement with the folin phenol reagent. J Biol Chem 1951; 193: Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970; 227: Bonner WM et al. Two-dimensional gel analysis of histones in acid extracts of nuclei, cells and tissues. Eur J Biochem 1980; 109: Wray W et al. Silver staining of proteins in polyacrylamide gels. Anal Biochem 1981; 118: Towbin H et al. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. PNAS 1979; 76: Ivanchenko M et al. A study on the heterogeneity of histone H1 from dry maize embryos. Eur J Biochem 1987; 162: Vassilev A.P. et al. The levels of ubiquitinated histone H2A are highly upregulated in transformed human cells: Partial colocalization of uh2a clusters and PCNA/cyclin foci in a fraction of cells in S-phase. J. Cell Sci. 1995; 108: Sourlingas T.G. et al. Lymphocytes from bipolar and schizophrenic patients share common biochemical markers related to histone synthesis and histone cell membrane localization characteristic of an activated state. Psychiatry Res. 2003; 118: Muller S et al. Characterization of a monoclonal antibody reacting with histone H3. FEBS letters 1985; 182: Yang WC et al. In situlocalization of Rhizobium mrnas in pea root nodules: nifa and nifh localization. Mol Plant-Microbe Interact 1991; 4: Ueda M. et al. Stepwise understanding of root development. Curr. Opin. Plant Biol. 2005; 8: Koleva S. et al. Acid-soluble chromosomal proteins in maize root and callus cells and after rhizogenesis induction in callus tissues. Biol. Plant. 1982; 24: Williams L. et al. Chromatin reorganization accompanying cellular dedifferentiation is associated with modifications of histone H3, redistribution of HP1, and activation of E2F-target genes. Dev. Dynamics 2003; 228: Jerzmanowski A. et al. Linker histones and HMG1 proteins of higher plants. Plant Biol 2000; 2: Srebreva L. et al. Occurrence of histone H1 0 -related fraction in differentiated maize roots. Biochim Biophys Acta 1989; 1008: Huh G.H. et al. Structural characteristics of two wheat histone H2A genes encoding distinct types of variants and functional differences in their promoter activity. Plant Mol. Biol. 1997; 33: Zhong C.X. et al. Centromeric retroelements and satellites interact with maize kinetochore protein CENH3. Plant Cell, 2002; 14: Zhang X. et al. Phosphoserines on maize CENTROMERIC HISTONE H3 and histone H3 demarcate the centromere and pericentromere during chromosome segregation. Plant Cell, 2005; 17:

265 415. Waterborg et al. Histone variants and acetylated species from the alfalfa plant Medicago sativa. Arch. Biochem. Biophys. 1987; 256: Goldknopf IL. et al. Chromatin conjugate protein A24 is cleaved and ubiquitin is lost during chicken erythropoiesis J. Biol. Chem. 1980; 255: Wunsch A.M. et al. Synthesis and ubiquitination of histones during myogenesis, Dev. Biol. 1987; 119: Jasencakova Z. et al. Histone H4 acetylation of euchromatin and heterochromatin is cell cycle dependent and correlated with replication rather than with transcription Plant Cell 2000; 12: Jasencakova Z. et al. Chromatin organization and itsrelation to replication and histone during the cell cycle in barley Chromosoma 2001; 110: Meijon M. et al. Epigenetic characterization of the vegetative and floral stages of azalea buds: Dynamics of DNA methylation and histone H4 acetylation J. Plant Physiol. 2009, in press 421. Yaxley J.R. et al. Gibberellin biosynthesis mutations and root development in pea Plant Physiol 2001; 125: Wurtz T. Events in glucocorticoid hormone action: A correlation of histone H1 variant pattern changes, hormone binding to cell nuclei and induction of mouse mammary tumor virus RNA. Eur. J. Biochem. 1985; 152: Van der Knaap E., Kende H. Identification of a gibberellin-induced gene in deepwater rice using differential display of mrna Plant Mol. Biol. 1995; 28: Van den Heuvel K.L. et al. Isolation and molecular characterization of gibberellin-regulated H1 and H2B histone cdnas in the leaf of the gibberellin-deficient tomato Plant Mol. Biol. 1999; 39: Chinnusamy V. et al. Abscisic acid-mediated epigenetic processes in plant development and stress responses J. Integr. Plant Biol. 2008; 50: Sokol A. et al. Up-regulation of stress-inducible genes in tobacco and Arabidopsis cells in response to abiotic stresses and ABA treatment correlates with dynamic changes in histone H3 and H4 modifications Planta 2007; 227: Kim S.A. et al. Induction of reproductive organ-preferential histone genes by wounding or methyl jasmonate Mol. Cells 1998; 8:

266 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Πρωτεϊνικες αλληλουχίες των ιστονών του Zea mays L. (Πηγή: ΙΣΤΟΝΗ Η1: ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΕΣ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ >HON101 Zea mays protein sequence Histone H1 linker protein MPALAKPASRTAKPAAAPKPKPAAAKPKAATAGASHPPYFEMIKEAITALKERTGSSSQA IAKYVGDKHGASLPANFKKMLSIQLRGSAAKGKLVKVKASYKLSDAAKKASPKTKAKPAK AAAAKTTAPKPGQGRRRQVKEGSGCQAKEGRCCWDQAQSAREEGRGEAEEVPRRQGQGQA EDREVPCLQEGTEGLRMRWVALGLSSDCGWCQLGTVQTKCVPKVSQAVCYVLSKFYLSEC FSLTMVLPLAFVVRFLKSLFSRSLNF >HON102 Zea mays protein sequence Histone H1 linker protein MSTEEAVVAEVPVTEVPAEVPAAQVAEAPKAKKAPKEKKAPKEKKLSAAKKPAAHPPYAE MIVEAIAALKERKGSSSVAISKYVEGKHGGKLPTNFRKQLTVQLKKLAAAGKLTRVKNSF KLPATDAKPKAAKPKAPKAAPKPKPSPKAKAKTAAKPKAASPKPKAKAKAKPVAPAAASP KPRGRPPKVAKTSAKASPAKAAKKAAAPAKKGKAAAAPKKVATPKKAAAAAAPARKGVAR KAKK >HON103 Zea mays protein sequence Histone H1 linker protein MATDVAETPAPLVDAAPEAPADAPAAPAADAKPAKAKKATAPKKRASPTHPPYAEMVSEA ITSLKERTGSSSYAIAKFVEDKHKDKLPPNFRKLLNVQLKKLVAGGKLTKVKNSYKLSSA ATKPNPKPKAAPKKPKTGAKKPKAAAKTKAKTPAKAKPATKPKPAAKPKAVVKPKTPAKP KAKPAAKAKPKTAGAKPKPLAKKAGRPAKAAKTSAKDTPGKKAPVAKKSAAAAKKAPAKK AAPSKKAATPVRKAPSRKAKK >HON104 Zea mays protein sequence Histone H1 linker protein MATVTEEVAPVVTVSEEPAPEAAKEVVEKPEEGKKPDEEGDERKKADPAAEKEKKADPAA EKEKKARKPRSRKPKSAGLHHPPYFEMIKEAILSQDGGKVGASPYAIAKHMGEKHRDVLP PNYRKVLAVQLRGFAAKGRLVKVKASFKLAAAEERKPSAAAKAKKKASAGMAKRKRAAAP AKMKPAAAASAPSREARKVRAKRARKVAPAPAQPKPKPARAAASGAGKKVNKASA >HON106 Zea mays protein sequence Histone H1 linker protein MATDVAETPAPLVDAAPEAPADTPAAPAVDAKPAKAKKATAPKKRASPTHPPYAEMVSEA IASLKERTGSSSFAIAKFLEDKHKDKLPPNFRKLLNVQLKKLVAGGKLTKVKNSYKLSSA TKPKAAPKKTKTGVKKPKAAAKPKAKSPAKPKPATKPKAAAKPASKPKAAAKPKAPAKPK AKPAAKAKPKAAGAKPKPAAKKAGRPAKAAKTSAKATPGKKAPVAKKPAAAAKKAPVAKK AAPAKKAAAPARKAPSRKAKK >HON110 Zea mays protein sequence Histone H1 linker protein MATEVAETPAPLAEAVPETPAEAPAAPAAEAKPTKAKKASAPKKRANPTHPPYAEMISEA VTSLKERTGSSQYAIAKFVEDKHKDKLPPNFRKLLLGQLKKLVAGGKLTKVKNSYKLPAR APAAAKPKPKSKTAVKKPKAGAKKPKAATKPKPKPKAKSPAKAKPAAKPKAAAKPAAKPK PAAAKPKAAAKPKAKPAAKAKPKAAAAKPKPAAKKAGRPAKAAKTSAKDTPGKKAAPAKK PAAAAKKAPAKKAAPAKKAATPSRKVPSRKAKK 252

267 ΙΣΤΟΝΗ Η2A: ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΕΣ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ >HTA101 Zea mays protein sequence Histone Variants MAGKGGKGLLAAKTTAAKSAEKDKGKKAPISRSSRAGLQFPVGRIHRQLKQRTQANGRVG ATAAVYSAAILEYLTAEVLELAGNASKDLKVKRITPRHLQLAIRGDEELDTLIKGTIAGG GVIPHIHKSLINKSSKE >HTA109 Zea mays protein sequence Histone Variants MAGKGGKGLLAAKTTAAKSTDKDKDRKKAPVSRSSRAGLQFPVGRIHRQLKSRASAHGRV GATAAVYSAAILEYLTAEVLELAGNASKDLKVKRITPRHLQLAIRGDEELDTLIKGTIAG GGVIPHIHKSLINKTAKE >HTA102 Zea mays protein sequence Core MDASGAGSKAKKGAAGRKAGGPRKKSVSRSVKAGLQFPVGRIGRYLKKGRYAQRVGTGAP VYLAAVLEYLAAEVLELAGNAAKDNKKTRIVPRHVLLAIRNDVELGKLLAGVTIAHGGVL PNINPVLLPKKVAEKASSGGSKESKSPKKAAKSPKKAAKSPKKA >HTA103 Zea mays protein sequence Core MDASAAGAGGKAKKGAAGRKAGGPRKKSVTRSVKAGLQFPVGRIGRYLKKGRYAQRVGTG APVYLAAVLEYLAAEVLELAGNAAKDNKKTRIIPRHVLLAIRNDEELGKLLSGVTIAHGG VLPNINPVLLPKKTAEKAAAKEAKSPKKAAKSPKKA >HTA104 Zea mays protein sequence Core MDSTGTGAGGKGKKGAAGRKVGGPRKKSVSRSVKAGLQFPVGRIGRYLKKGRYAQRVGTG APVYLAAVLEYLAAEVLELAGNAARDNKKTRIIPRHVLLAIRNDEELGKLLGGVTIAHGG VLPNINPVLLPKKTAEKASSGGSKEAKSPKKAAKSPKKA >HTA105 Zea mays protein sequence Core MDATGPGSKGKKGAAGRKAGGPRKKSVTRSVKAGLQFPVGRIGRYLKKGRYAQRVGTGAP VYLAAVLEYLAAEVLELAGNAAKDNKKTRIIPRHVLLAIRNDEELGKLLAGVTIAHGGVL PNIHSVLLPKKAAEKAASGGSKEPKSPKKGAKSPKKA >HTA106 Zea mays protein sequence Core MAGRGKAIGAGAAKKATSRSSKAGLQFPVGRIARFLKAGKYAERVGAGAPVYLAAVLEYL AAEVLELAGNAARDNKKTRIVPRHIQLAVRNDEELTKLLGGATIASGGVMPNIHQHLLPK KAGSSKASTVDDDDN >HTA107 Zea mays protein sequence Core MSSTGGGGRGKAKPATKSVSRSSKAGLQFPVGRIARYLKAGKYAERVGAGAPVYLSAVLE YLAAEVLELAGNAARDNKKNRIVPRHIQLAVRNDEELSKLLGTVTIAAGGVMPNIHQTLL PKKAGQKGDIGSASQEF >HTA110 Zea mays protein sequence Core MDAGAKVVKKAAAGRRGGGGPKKKPVSRSVKAGLQFPVGRIGRYLKQGRYSQRVGTGAPV YLAAVLEYLAAELLELAGNAARDNKKNRIIPRHVLLAIRNDEELGKLLAGVTIAHGGVLP NINPVLLPKKTAVAAAKEGKEKKSPKKAAAAKSPKKVAAS >HTA111 Zea mays protein sequence Core MAGRGKAIGSGAAKKATSRSSKAGLQFPVGRIARFLKAGKYAERVGAGAPVYLAAVLEYL AAEVLELAGNAARDNKKTRIVPRHIQLAVRNDEELSRLLGTVTIASGGVMPNIHNLLLPK KAGGGSAKAAAGDED >HTA112 Zea mays protein sequence Core MSSGGGRGKPKGSKALSRSTKAGLQFPVGRIARYLKAGKYAERVGGGAPVYLSAVLEYLA AEVLELAGNAARDNKKNRIVPRHIQLAVRNDEELSKLLGAVTIAAGGVLPNIHQTLLPKK AGGKGKADIGSASQEF >HTA114 Zea mays protein sequence Core MAGRGKAIGAGAAKKATSRSSKAGLQFPVGRIARFLKAGKYAERVGAGAPVYLAAVLEYL AAEVLELAGNAARDNKKTRIVPRHIQLAVRNDEELTKLLGGATIASGGVMPNIHQHLLPK KAASSKASVDDDDN 253

268 >HTA115 Zea mays protein sequence Core MAGRGKAIGSGAAKKAMSRSSKAGLQFPVGRIARFLKAGKYAERVGAGAPVYLAAVLEYL AAEVLELAGNAARDNKKTRIVPRHIQLAVRNDEELSRLLGTVTIASGGVMPNIHNLLLPK KSGGGSAKAAAGDED >HTA116 Zea mays protein sequence Core MDVSGAGGKAKKGAAGRKAGGPTKKSVSRSSRAGLQFPVSRVGRYLKKGRYAQRVGTGAP VYLAAVLEYLAAEVLELAGNAARDNKKTRIIPRHVLLAIRNDEELGKLLAGVTIAHGGVL PNIHTVLLPKKVAEKAAKEPKKAAKSPKKA >HTA108 Zea mays protein sequence H2A variant MDATGTGAGGKAKKGAAGRKAGGPRKKSVTRSVKAGLQFPVGRIGRYLKKGRYAQRVGSG APVYLAAVLEYLAAEVLELAGNAAKDNKKTRIVPRHVLLAIRNDEELGKLLTGVTIAHGG VLPNINPVLLPKKTAEKASSGGSKEAKSPKKAAKSPKKA ΙΣΤΟΝΗ Η2B: ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΕΣ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ >HTB101 Zea mays protein sequence Histone H2B MAPKAEKKPAEKKPTEEKAEKKPRAEKRVPGKEGGEKKGKKKAKKSVETYKIYIFKVLKQ VHPDIGISSKAMSIMNSFINDIFEKLAAEAAKLARYNKKPTITSREIQTSVRLVLPGELA KHAVSEGTKAVTKFTSS >HTB102 Zea mays protein sequence Histone H2B MAPKAEKKPAAKKPAEEEPAAEKATAGKKPKAEKRLPAGKSAGKEGGEKKGKKKAKKSVE TYKIYIFKVLKQVHPDIGISSKAMSIMNSFINDIFEKLAAEAAKLARYNKKPTITSREIQ TSVRLVLPGELAKHAVSEGTKAVTKFTSS >HTB103 Zea mays protein sequence Histone H2B MAPKAEKKPAEKKPAAEEKAEKTTAGKKPKAEKRLPASKSSGKEGGEKKGKKKAKKSVET YKIYIFKVLKQVHPDIGISSKAMSIMNSFINDIFEKLAGEAAKLARYNKKPTITSREIQT SVRLVLPGELAKHAVSEGTKAVTKFTSN >HTB104 Zea mays protein sequence Histone H2B MAPKAEKKPAAKKVAEEEPSEKAAPAEKAPAGKKPKAEKRLPAGKSAGKEGGDKKGRKKA KKSVETYKIYIFKVLKQVHPDIGISSKAMSIMNSFINDIFEKLAAEAAKLARYNKKPTIT SREIQTSVRLVLPGELAKHAVSEGTKAVTKFTSS >HTB105 Zea mays protein sequence Histone H2B MAPKAEKKPAAKKPAEEEPAAEKTTAGKKPKAEKRVPAGKSAGKEGGEGKRGKKKGKKSV ETYKIYIFKVLKQVHPDIGISSKAMSIMNSFINDIFEKLAGEAAKLARYNKKPTITSREI QTSVRLVLPGELAKHAVSEGTKAVTKFTSS >HTB106 Zea mays protein sequence Histone H2B MAPKAEKKPAAKKPAEEEPAAEKAPAGKKPKAEKRVPAGKSAGKEGGEGKRGRKKGKKSV ETYKIYIFKVLKQVHPDIGISSKAMSIMNSFINDIFEKLAAEAAKLARYNKKPTITSREI QTSVRLVLPGELAKHAVSEGTKAVTKFTSS >HTB107 Zea mays protein sequence Histone H2B MAPKAEKKPAAKKPAEEEPATEKAEKAPAGKKPKAEKRLPAGKSGAGEGKKGKKKAKKSV ETYKIYIFKVLKQVHPDIGISSKAMSIMNSFINDIFEKLAAEAAKLARYNKKPTITSREI QTSVRLVLPGELAKHAVSEGTKAVTKFTSS >HTB108 Zea mays protein sequence Histone H2B MAPKAEKKPAAKKPAEEEPAAAKAPAGKKPKAEKRLPAAKSSGKEGGDKKGKKKAKKSVE TYKIYIFKVLKQVHPDIGISSKAMSIMNSFINDIFEKLAGEAAKLARYNKKPTITSREIQ TSVRLVLPGELAKHAVSEGTKAVTKFTSS 254

269 >HTB109 Zea mays protein sequence Histone H2B MAPKAEKKPAAKKPAEEEPATEKVEKAPAGKKPKAEKRLPAGKSKEGGEGKKGKKKAKKS VETYKIYIFKVLKQVHPDIGISSKAMSIMNSFINDIFEKLAAESAKLARYNKKPTITSRE IQTSVRLVLPGELAKHAVSEGTKAVTKFTSS >HTB113 Zea mays protein sequence Histone H2B MAPKAEKKPAEKKPAEEKAEKKPRAEKRVPSKEGGEKKGKKKAKKSVETYKIYIFKVLKQ VHPDIGISSKAMSIMNSFINDIFEKLAAEAAKLARYNKKPTITSREIQTSVRLVLPGELA KHAVSEGTKAVTKFTSS >HTB114 Zea mays protein sequence Histone H2B MAPKAEKKPAAKKPAEEEPAAEKAPAGKKPKAEKRVPAGKSAAKEGGEGKRGKKKGKKSV ETYKIYIFKVLKQVHPDIGISSKAMSIMNSFINDIFEKLAAEAAKLARYNKKPTITSREI QTSVRLVLPGELAKHAVSEGTKAVTKFTSA >HTB116 Zea mays protein sequence Histone H2B MAPKAEKKPAAKKPAEEEPAAPAEKAPAGKKPKAEKRLPAGKSAGKEGGVDKKGRKKAKK SVETYKIYIFKVLKQVHPDIGISSKAMSIMNSFINDIFEKLAGEAAKLARYNKKPTITSR EIQTSVRLVLPGELAKHAVSEGTKAVTKFTSS >HTB115 Zea mays protein sequence Histone H2B MAPKADKKPAAKKPAEEPATEKAEKAPAGKKPKAEKRLPAGKSAGKEGGEGKKGKKKAKK SVETYKIYIFKVLKQVHPDIGISSKAMSIMNSFINDIFEKLAAESAKLARYNKKPTVTSR EIQTSVRLVLPGELAKHAVSEGTKAVTKFTSS ΙΣΤΟΝΗ Η3: ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΕΣ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ >HTR101 Zea mays protein sequence Core MARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAPTTGGVKKPHRYRPGTVALREIRKYQKSTE LLIRKLPFQRLVREIAQDFKTDLRFQSHAVLALQEAAEAYLVGLFEDTNLCAIHAKRVTI MPKDIQLARRIRGERA >HTR102 Zea mays protein sequence Core MARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAPTTGGVKKPHRYRPGTVALREIRKYQKSTE LLIRKLPFQRLVREIAQDFKTDLRFQSHAVLALQEAAEAYLVGLFEDTNLCAIHAKRVTI MPKDIQLARRIRGERA >HTR103 Zea mays protein sequence Core MARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAPATGGVKKPHRFRPGTVALREIRKYQKSTE LLIRKLPFQRLVREIAQDFKTDLRFQSSAVAALQEASEAYLVGLFEDTNLCAIHAKRVTI MPKDIQLARRIRVERA >HTR104 Zea mays protein sequence Core MARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAPTTGGVKKPHRYRPGTVALREIRKYQKSTD LLIRKLPFQRLVREIAQDFKTDLRFQSHAVLALQEAAEAYLVGLFEDTNLCAIHAKRVTI MPKDIQLARRIRGERA >HTR105 Zea mays protein sequence Core MARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAPATGGVKKPHRFRPGTVALREIRKYQKSTE LLIRKLPFQRLVREIAQDFKTDLRFQSSAVAALQEAAEAYLVGLFEDTNLCAIHAKRVTI MPKDIQLARRIRGERA 255

270 >HTR106 Zea mays protein sequence Core MARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAPATGGVKKPHRFRPGTVALREIRKYQKSTE LLIRKLPFQRLVREIAQDFKTDLRFQSSAVAALQEAAEAYLVGLFEDTNLCAIHAKRVTI MPKDIQLARRIRGERA >HTR107 Zea mays protein sequence Core MARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAPATGGVKKPHRFRPGTVALREIRKYQKSTE LLIRKLPFQRLVREIAQDFKTDLRFQSSAVAALQEAAEAYLVGLFEDTNLCAIHAKRVTI MPKDIQLARRIRGERA >HTR108 Zea mays protein sequence Core MARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAPATGGVKKPHRFRPGTVALREIRKYQKSTE LLIRKLPFQRLVREIAQDFKTDLRFQSSAVAALQEAAEAYLVGLFEDTNLCAIHAKRVTI MPKDIQLARRIRGERA >HTR109 Zea mays protein sequence Core MARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAPATGGVKKPHRFRPGTVALREIRKYQKSTE LLIRKLPFQRLVREIAQDFKTDLRFQSSAVAALQEAAEAYLVGLFEDTNLCAIHAKRVTI MPKDIQLARRIRGERA >HTR112 Zea mays protein sequence Core MARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAPATGGVKKPHRFRPGTVALREIRKYQKSTE LLIRKLPFQRLVREIAQDFKTDLRFQSSAVSALQEAAEAYLVGLFEDTNLCAIHAKRVTI MPKDIQLARRIRGERA >HTR110 Zea mays protein sequence Core MARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAPTTGGVKKPHRYRPGTVALREIRKYQKSTE LLIRKLPFQRLVREIAQDFKTDLRFQSHAVLALQEAAEAYLVGLFEDTNLCAIHAKRVTI MPKDIQLARRIRGERA >HTR111 Zea mays protein sequence Core MARMKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAPATGGVKKPHRFRPGTVALREIRKYQKSTE LLIRKLPFQLLVREIAQDFKTDLRFQSSAVAALQEAAEAYLVGLFEDTNLCAIHAKRVTI MPKDIQLARRIRGERA >HTR113 Zea mays protein sequence Core MARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAPTTGGVKKPHRYRPGTVALREIRKYQKSTE LLIRKLPFQRLVREIAQDFKTDLRFQSHAVLALQEAAEAYLVGLFEDTNLCAIHAKRVTI MPKDIQLARRIRGERA >HTR114 Zea mays protein sequence Centromeric Histone H3 MARTKHQAVRKTAEKPKKKLQFERSGGASTSATPERAAGTGGRAASGGDSVKKTKPRHRW RPGTVALREIRKYQKSTEPLIPFAPFVREVGELTNFVTNGKVERYTAEALLALQEAAEFH LIELFEMANLCAIHAKRVTIMQKDIQLARHIGGRRWA 256

271 ΙΣΤΟΝΗ Η4: ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΕΣ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ >HFO101 Zea mays protein sequence Histone H4 MSGRGKGGKGLGKGGAKRHRKVLRDNIQGITKPAIRRLARRGGVKRISGLIYEETRGVLKIF LENVIRDAVTYTEHARRKTVTAMDVVYALKRQGRTLYGFGG >HFO102 Zea mays protein sequence Histone H4 MSGRGKGGKGLGKGGAKRHRKVLRDNIQGITKPAIRRLARRGGVKRISGLIYEETRGVLKIF LENVIRDAVTYTEHARRKTVTAMDVVYALKRQGRTLYGFGG >HFO103 Zea mays protein sequence Histone H4 MSGRGKGGKGLGKGGAKRHRKVLRDNIQGITKPAIRRLARRGGVKRISGLIYEETRGVLKIF LENVIRDAVTYTEHARRKTVTAMDVVYALKRQGRTLYGFGG >HFO104 Zea mays protein sequence Histone H4 MSGRGKGGKGLGKGGAKRHRKVLRDNIQGITKPAIRRLARRGGVKRISGLIYEETRGVLKIF LENVIRDAVTYTEHARRKTVTAMDVVYALKRQGRTLYGFGG >HFO105 Zea mays protein sequence Histone H4 MSGRGKGGKGLGKGGAKRHRKVLRDNIQGITKPAIRRLARRGGVKRISGLIYEETRGVLKIF LENVIRDAVTYTEHARRKTVTAMDVVYALKRQGRTLYGFGG >HFO106 Zea mays protein sequence Histone H4 MSGRGKGGKGLGKGGAKRHRKVLRDNIQGITKPAIRRLARRGGVKRISGLIYEETRGVLKIF LENVIRDAVTYTEHARRKTVTAMDVVYALKRQGRTLYGFGG >HFO107 Zea mays protein sequence Histone H4 MSGRGKGGKGLGKGGAKRHRKVLRDNIQGITKPAIRRLARRGGVKRISGLIYEETRGVLKIF LENVIRDAVTYTEHARRKTVTAMDVVYALKRQGRTLYGFGG >HFO109 Zea mays protein sequence Histone H4 MSGRGKGGKGLGKGGAKRHRKVLRDNIQGITKPAIRRLARRGGVKRISGLIYEETRGVLKIF LENVIRDAVTYTEHARRKTVTAMDVVYALKRQGRTLYGFGG >HFO111 Zea mays protein sequence Histone H4 MSGRGKGGKGLGKGGAKRHRKVLRDNIQGITKPAIRRLARRGGVKRISGLIYEETRGVLKIF LENVIRDAVTYTEHARRKTVTAMDVVYALKRQGRTLYGFGG >HFO112 Zea mays protein sequence Histone H4 MSGRGKGGKGLGKGGAKRHRKVLRDNIQGITKPAIRRLARRGGVKRISGLIYEETRGVLKIF LENVIRDAVTYTEHARRKTVTAMDVVYALKRQGRTLYGFGG >HFO113 Zea mays protein sequence Histone H4 MSGRGKGGKGLGKGGAKRHRKVLRDNIQGITKPAIRRLARRGGVKRISGLIYEETRGVLKIF LENVIRDAVTYTEHARRKTVTAMDVVYALKRQGRTLYGFGG >HFO115 Zea mays protein sequence Histone H4 MSGRGKGGKGLGKGGAKRHRKVLRDNIQGITKPAIRRLARRGGVKRISGLIYEETRGVLKIF LENVIRDAVTYTEHARRKTVTAMDVVYALKRQGRTLYGFGG >HFO116 Zea mays protein sequence Histone H4 MSGRGKGGKGLGKGGAKRHRKVLRDNIQGITKPAIRRLARRGGVKRISGLIYEETRGVLKIF LENVIRDAVTYTEHARRKTVTAMDVVYALKRQGRTLYGFGG 257

272 >HFO117 Zea mays protein sequence Histone H4 MSGRGKGGKGLGKGGAKRHRKVLRDNIQGITKPAIRRLARRGGVKRISGLIYEETRGVLKIF LENVIRDAVTYTEHARRKTVTAMDVVYALKRQGRTLYGFGG >HFO118 Zea mays protein sequence Histone H4 MSGRGKGGKGLGKGGAKRHRKVLRDNIQGITKPAIRRLARRGGVKRISGLIYEETRGVLKIF LENVIRDAVTYTEHARRKTVTAMDVVYALKRQGRTLYGFGG Όνοµα Γονιδίου Αριθµός Αµινοξέων Τάξη Ιστονών HFO Η4 HFO Η4 HFO Η4 HFO Η4 HFO Η4 HFO Η4 HFO Η4 HFO Η4 HFO Η4 HFO Η4 HFO Η4 HFO Η4 HFO Η4 HFO Η4 HFO Η4 HON Η1 HON Η1 HON Η1 HON Η1 HON Η1 HON Η1 HTA Η2Α HTA Η2Α HTA Η2Α HTA Η2Α HTA Η2Α HTA Η2Α HTA Η2Α HTA Η2Α 258

273 HTA Η2Α HTA Η2Α HTA Η2Α HTA Η2Α HTA Η2Α HTA Η2Α HTA Η2Α HTA Η2Α HTB Η2Β HTB Η2Β HTB Η2Β HTB Η2Β HTB Η2Β HTB Η2Β HTB Η2Β HTB Η2Β HTB Η2Β HTB Η2Β HTB Η2Β HTB Η2Β HTB Η2Β HTR Η3 HTR Η3 HTR Η3 HTR Η3 HTR Η3 HTR Η3 HTR Η3 HTR Η3 HTR Η3 HTR Η3 HTR Η3 HTR Η3 HTR Η3 HTR Η3 259

274 Plant Science 171 (2006) Distribution of ubiquitinated histone H2A during plant cell differentiation in maize root and dedifferentiation in callus culture Anastasios Alatzas, Athina Foundouli * Laboratory of Developmental Biology, School of Biology, Aristotle University of Thessaloniki, Thessaloniki 54124, Greece Received 23 December 2005; received in revised form 7 May 2006; accepted 15 May 2006 Available online 9 June 2006 Abstract Although histone ubiquitination is known to associate with various chromatin functions, the precise role and mechanism of this modification remains still unknown. In this study, we identified the ubiquitinated form of H2A and estimated its ratio to total H2A in each of the three developmental zones of maize (Zea mays L.) root and in callus cultures derived from them, in order to define possible alterations, either during plant cell differentiation or during their dedifferentiation. Immunohistochemical detection was used to identify the root tissues that contain ubiquitinated H2A and correlate this histone modification with the physiological status of the plant cells. According to the results presented in this study, H2A ubiquitination level is increased in meristematic and elongation zone when compared to differentiation zone, where it is observed only in pericycle and epidermis cells. In contrast, an increase of the ubiquitinated fraction of H2A was found in callus culture derived from differentiation zone compared to cultures derived from the other two zones. We propose that these results support the correlation between histone ubiquitination and cell division. # 2006 Elsevier Ireland Ltd. All rights reserved. Keywords: Histone ubiquitination; Zea mays; Plant cell differentiation; Callus culture 1. Introduction The primary level of DNA compaction into the chromatin of eukaryotic cells is the nucleosome, where 146 bp of DNA are wrapped around a histone octamer core, comprised of two of each histones, H2A, H2B, H3 and H4, while its structure is completed with the association of H1 linker histone [1]. Apart from their structural role, histones also participate, mainly through their post-translational modifications, in various chromatin functions. A great amount of data has been accumulated correlating histone acetylation with transcriptional activation [2], while histone phosphorylation was found to be involved both in chromosome condensation during mitosis and early response gene transcriptional activation Abbreviations: BCIP, 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate; CTAB, cetyltrimethylammonium bromide; DMSO, dimethyl sulfoxide; NBT, nitro blue tetrazolium; SDS, sodium dodecylsulfate; TEMED, N,N,N 0,N 0 -tetramethyl-ethylenediamine; PMSF, phenylmethylsulfonyl fluoride; PBS, phosphate buffer saline * Corresponding author. address: fount@bio.auth.gr (A. Foundouli). during stimulation by growth factors [3]. Recently, histone methylation was found to participate both in transcriptional activation and heterochromatin assembly [4] and H4 was found to be modified both in vitro and in vivo by sumoylation [5]. Additionally, an increasing amount of evidence supports the hypothesis that modified residues in histone N-terminal tails function as recognition sites for the various factors involved in chromatin processes, creating a histone code [6]. In contrast to other histone modifications, the role of histone ubiquitination in chromatin function was poorly characterized so far. Ubiquitin, a highly conserved protein of 76 amino acids, has been associated with various cellular processes, like protein degradation, DNA repair, transcription, cellular differentiation, cell cycle control, stress response, etc. [7]. Histone H2A was the first protein found to be post-translationally modified by covalent ligation to ubiquitin, originally identified as chromatin protein A24 [8] and the ubiquitinated forms of histones, mainly H2A and H2B, are the most abundant ubiquitin conjugates in higher eukaryotes. In most eukaryotic cells ubiquitinated H2A represents 10 15% of total H2A [9], but it has also been reported that this ratio can increase up to 50% in transcriptionally active chromatin [10]. Apart from H2A and H2B, /$ see front matter# 2006 Elsevier Ireland Ltd. All rights reserved. doi: /j.plantsci

275 482 A. Alatzas, A. Foundouli / Plant Science 171 (2006) histones H3 and H1 were also found to be modified by ubiquitin conjugation but ubiquitination sites of these histones and the role of their modification are presently unknown [11,12]. Histone ubiquitination has been correlated with mitosis, transcriptional control, DNA repair, spermatogenesis and cellular stress response [9]. Considering that ubiquitinated histones were observed in either transcriptionally active [10,13] or inactive chromatin [14,15], it is obvious that the precise role of this modification is still elusive. Even less are known about ubiquitinated histone distribution pattern during cell differentiation and/or dedifferentiation, particularly in plant organisms. In this study, we estimated the uh2a ratio to total H2A in each of the three developmental zones of maize (Zea mays) root, in order to define possible alterations primarily during plant cell differentiation and subsequently during dedifferentiation in callus culture. Finally, we used immunohistochemical analysis to directly define which cells contain uh2a in order to correlate this histone modification with the physiological status of the plant cells. 2. Methods 2.1. Plant material Maize seeds (Z. mays L., cv. Polaris) were germinated in the dark at 28 8C on paper sheets soaked with distilled water, until root s length reached approximately 3 5 cm. At this time, the three developmental zones (meristematic zone, elongation zone and differentiation zone) were separately collected and stored at 70 8C In vitro callus culture Root segments, representing the three developmental zones, were placed under aseptic conditions in glass tubes containing sterilized Murashige and Skoog medium [16] to which 1 mg l 1 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (Sigma) was added, enriched with 3% (w/v) sucrose and solidified with 0.5% (w/v) agar. Calli were developed in the dark, at 28 8C for approximately 2 months and then were collected separately and stored at 70 8C, while part of each callus was placed in new tubes containing MS medium to generate the second or third subculture Nuclei isolation and histone extraction Nuclei isolation was performed according to Muller et al. [17] Plant material from each zone or callus was homogenized with five volumes of Buffer A (50 mm Tris HCl ph 8.0, 4 mm (CH 3 COOH) 2 Mg4H 2 O, 0.25 M sucrose, 2% (w/v) Arabic gum, 0.5% (v/v) Triton X-100, 1 mm PMSF, 0.5% (v/v) DMSO and 5 mm b-mercaptoethanol), filtered through Nylon Screen Mesh 25 m filter and centrifuged at 900 g for 30 min. The pellet was suspended in Buffer A (without Arabic gum), placed over Buffer B (50 mm Tris HCl ph 8.0, 4 mm (CH 3 COOH) 2 Mg4H 2 O, 1.2 M sucrose, 1 mm PMSF, 0.5% (v/v) DMSO and 5 mm b-mercaptoethanol) and centrifuged at 900 g for another 30 min. Nuclei were washed with Buffer A (without Arabic gum and Triton X-100), followed by a wash with TBS (10 mm Tris HCl ph 7.5, 150 mm NaCl) and centrifugation at 20,000 g for 30 min. Histones were extracted as described by Murray and Key [18]. The pellet was suspended in 0.4N H 2 SO 4, stirred for 1 h and centrifuged at 20,000 g for 30 min. Four volumes cold ethanol were added to the supernatant and histones precipitated in approximately 48 h at 20 8C. The precipitant was washed twice with 70% ethanol, ethanol/ether (3/1, v/v) and acetone and vacuum dried. The amount of protein was determined with the method described by Lowry et al. [19] Histone electrophoresis Histones were initially separated in SDS-PAGE as described by Laemmli [20]. Approximately 10 mg of total protein were analyzed in 15% SDS-PAGE gels and their molecular masses were determined by means of prestained protein markers (New England Biolabs). Histone variants and modified forms were separated in two-dimensional AUT/AUC-PAGE (acetic acidurea-triton X-100/acetic acid-urea-ctab) as described by Bonner et al. [21]. First dimension was performed in gel consisting of 12% (w/v) acrylamide, 0.1% (w/v) bis-acrylamide, 1 M acetic acid, 6 M urea, 0.625% (v/v) Triton X-100, 45 mm NH 4 OH, 0.5% (v/v) TEMED and 0.027% (v/v) riboflavin, running buffer containing 1 M acetic acid and 0.1 M glycine and the samples were diluted in loading buffer consisting of 1 M acetic acid, 6 M urea, 45 mm NH 4 OH and 15 mm b- mercaptoethanol. Approximately 50 mg of total protein were loaded on the gel and electrophoresis was performed at 210 V for approximately 1 h. Afterwards, strips containing the samples were cut, stained with 0.1% Coomasie Brilliant Blue R-250 in 40% ethanol, 5% acetic acid and 0.1% (w/v) cysteamine for 5 min, destained in 20% ethanol, 5% acetic acid and 0.1% (w/v) cysteamine for 10 min and soaked in 1 M acetic acid, 5 mm NH 4 OH and 0.5% (w/v) cysteamine for 20 min. Each strip was placed on the top of a second dimension gel, consisting of 16.5% (w/v) acrylamide, 0.1% (w/v) bis-acrylamide, 1 M acetic acid, 6 M urea, 45 mm NH 4 OH, 0.5% (v/v) TEMED and 0.027% (v/v) riboflavin and 0.15% (w/v) CTAB was added in upper tank s running buffer. The electrophoresis was performed at 210 V for approximately 2 h. Afterwards, gels were stained with Coomasie Brilliant Blue R-250 or alternatively with silver nitrate [22], scanned and analyzed by means of Gel Pro Analyser 3.1 software. Each sample was derived from an individual extraction and three independent experiments (i.e. histone extraction, electrophoresis and gel analysis) were performed for each of the developmental zones and callus subcultures in order to examine the reproducibility of the results and to estimate the standard deviation of the quantification analysis. Statistical analysis by means of the Student s t-test was performed in order to define significant differences among the results Western blotting Protein transfer onto PVDF membrane was performed according to Towbin et al. [23] Proteins from SDS-PAGE gels

276 A. Alatzas, A. Foundouli / Plant Science 171 (2006) were transferred using buffer containing 25 mm Tris HCl ph 8.3, 192 mm glycine, 20% methanol at 100 V for 1 h, while proteins from AUT/AUC-PAGE gels were transferred using buffer containing 0.7% (v/v) acetic acid, 20% methanol at 60 V for 1 h. Afterwards, membranes were washed twice in PBST (0.1% (v/v) Tween 20 in PBS) and then incubated in blocking solution (5% (w/v) non-fat dry milk in PBST) for 2 h. Membranes were incubated with anti-uh2a antibody (monoclonal, a generous gift by Celis and co-workers [24]) or anti- H2A antibody (polyclonal, raised against human H2A, a generous gift by Dr. C. Panagiotidis), diluted 1:100 and 1:1000, respectively, in 0.5% (w/v) non-fat dry milk in PBST, for another 2 h and then washed three times with PBST and twice with PBS. After the washes, they were incubated with the second antibody (horseradish peroxidase labeled goat antimouse and goat anti-rabbit, respectively, diluted 1:1000 in 0.5% (w/v) non-fat dry milk in PBST) for 2 h, washed in the same way and detection was performed using enhanced chemiluminescense Immunohistochemistry Maize roots were embedded in paraffin according Yang et al. [25]. Firstly, roots were fixed in phosphate solution ph 6.8 containing 100 mm NaCl, 4% (w/v) paraformaldehyde and 0.25% (v/v) glutaraldehyde. Afterwards, they were dehydrated and cleared in increasing concentration solutions of ethanol and xylene, respectively, and stained with 5% (w/v) safranin in 50% ethanol. Xylene was saturated with paraffin at RT, then at 42 8C and finally the vials were transferred at 60 8C, were the mixture (xylene and paraffin) was replaced by melted and filtred paraffin. Paraffin was refreshed twice a day for the next 10 days and after this, vials content (roots and paraffin) was transferred onto cold templates and stored at 4 8C. Ten micrometers sections were taken by means of a microtome and placed onto glass slides which previously had been washed extensively, sterilized and coated with poly-l-lysine solution (0.01% (w/v) poly-l-lysine (mol. wt. 30,000 70,000, Sigma) in 10 mm Tris HCl, ph 8). They were placed overnight onto a 42 8C surface and then in xylene, xylene/ethanol (1/1, v/v) and ethanol and were stored at 20 8C. Immunodetection of uh2a was performed in the same way as PVDF membranes, except that the second antibody was alkaline phosphatase labeled and NBT and BCIP solutions diluted in alkaline phosphatase buffer (10 mm Tris HCl ph 9.2, 100 mm NaCl, 50 mm MgCl 2 ), were used for detection. After detection, sections were dehydrated in increasing concentration solutions of ethanol, photographed by means of a digital camera and stored at RT. Fig. 1. A schematic representation of the developmental zones of maize root: meristematic zone (2 mm), elongation zone (2 6 mm) and differentiation zone (6 mm 2 cm). Arrowheads indicate the regions of sectioning. whereas, differentiation zone consists mainly of parenchymatic, non-proliferating cells (Fig. 1) [26]. Histones were extracted from each of the three developmental zones in order to define possible alterations in H2A ubiquitination level during plant cell differentiation. They were separated in 15% SDS- PAGE gels and western blotting was performed with an antiuh2a monoclonal antibody [24] and an anti-h2a polyclonal antibody. Ubiquitinated H2A was identified as a single band, with molecular mass of approximately 30 kda (Fig. 2). Twodimensional AUT/AUC-PAGE (acetic acid-urea-triton X-100/ acetic acid-urea-ctab), where protein mobility is based on the charge/mass ratio and their binding to non-ionic detergents, like Triton X-100, which is present in first dimension s gel [21], was used in order to separate histone variants and their posttranslational modified forms (Fig. 3A). After separating histones in AUT/AUC-PAGE gels, western blotting was performed with the same antibodies and uh2a was identified as a single spot above H2A isoforms (Fig. 3) Histone H2A ubiquitination in the developmental zones of maize root After identifying uh2a and H2A, two-dimensional gels were scanned and analyzed by means of Gel Pro Analyser 3.1 software, in order to indirectly estimate H2A ubiquitination level in maize root developmental zones. The optical density of 3. Results 3.1. Histone separation and immunodetection Maize root is an appropriate biological system for developmental studies since it consists of three zones, which can be easily separated. Meristematic and elongation zones contain proliferating cells and the primary root tissues, respectively, Fig. 2. A representative SDS-PAGE gel (A) immunoblotting detection of uh2a (B) and H2A (C). Prestained protein markers were used to determine the molecular mass of each histone protein. The sample presented was derived from meristematic zone.

277 484 A. Alatzas, A. Foundouli / Plant Science 171 (2006) Fig. 4. Ubiquitinated H2A ratio to total H2A in samples derived from the developmental zones of maize root (A) and from first (B), second (C) and third (D) callus subcultures derived from each zone (meristematic zone, elongation zone, differentiation zone). Each value is the average of three independent experiments and bars indicate the standard deviation of the measurement. Statistical analysis by means of the Student s t-test was performed in order to define significant differences among the results. According to gel analysis, approximately 20% of total H2A is conjugated to ubiquitin in samples derived from meristematic and elongation zone, but this ratio decreases to 12% in samples derived from differentiation zone (Fig. 4A) Immunohistochemical detection of uh2a in maize root sections We used immunohistochemical detection in maize root sections in order to localize the cells containing uh2a. In contrast to meristematic and elongation zones, the cells within differentiation zone are known to form distinct tissues. Vascular cylinder, containing xylem, phloem and pith, is surrounded by pericycle, endodermis and cortex, while exodermis and epidermis are the exterior root tissues [27,28]. We observed that ubiquitinated H2A is present in every cell within the meristematic and elongation zones while in differentiation zone is localized only in pericycle and epidermis cells. These cells are known to retain their meristematic properties, contrary to the parenchymatic, non-proliferating cells of cortex and pith [27,28], where almost no uh2a was detected (Fig. 5A, C and E). Detection without primary antibody was also performed in maize root sections in order to define any non-specific staining (Fig. 5B, D and F) Histone H2A ubiquitination in callus culture cells Fig. 3. A representative two-dimensional AUT/AUC-PAGE gel (A) immunoblotting detection of uh2a (B) and H2A (C). The sample presented was derived from differentiation zone. each spot representing H2A isoforms and uh2a, respectively, was measured and the uh2a portion of total H2A in each sample was estimated. Each sample was derived from an independent experiment and three samples from each of the developmental zones were analyzed in order to estimate the average and the standard deviation of the measurements. During callus formation, previously differentiated cells regain meristematic properties, including rapid proliferation ability [29,30]. Callus cultures were developed from root segments representing the three developmental zones and subsequently second and third subcultures were developed from part of each first culture, in order to study uh2a distribution during plant cell dedifferentiation. Histones were extracted from each subculture, separated in two-dimensional gels and H2A and uh2awere identified. Gels were scanned and the uh2a ratio to H2A was estimated in three independent

278 A. Alatzas, A. Foundouli / Plant Science 171 (2006) Fig. 5. Immunohistochemical detection of uh2a in maize root sections: uh2a is localized in every cell of meristematic zone (section A), while in differentiation zone is localized only in pericycle (pe) and epidermis (ep) cells (sections C and E) and is absent in parenchymatic cells, e.g. cortex and pith (co, pi). Sections B, D and F were used as controls (detection without primary antibody) for meristematic (B) and differentiation (D and F) zone, respectively. experiments as described in Section 3.2. According to gel analysis, ubiquitinated H2A represents approximately 20% of total H2A in first callus cultures derived from meristematic and elongation zones, indicating a similar ubiquitination level to the controls, while the ratio increases up to approximately 27% in cultures derived from differentiation zone (Fig. 4B). In all samples from second callus subcultures, approximately 20% of H2A is conjugated to ubiquitin (Fig. 4C) and this ratio remains constant in third callus subcultures (Fig. 4D). 4. Discussion According to the results presented in Fig. 4, H2A ubiquitination level is increased in meristematic and elongation zone of maize root, compared to differentiation zone. Decreased histone ubiquitination levels have been also observed during cell differentiation in animals [31,32]. The increased uh2a ratio in meristematic zone, taken together with uh2a localization in pericycle and epidermis cells within the

279 486 A. Alatzas, A. Foundouli / Plant Science 171 (2006) differentiation zone, as shown by immunohistochemical detection (Fig. 5), could be an evidence correlating this modification to cell division, considering that pericycle and epidermis cells are the only that retain their meristematic properties among the cells present in this zone [27,28]. Histone ubiquitination has been already associated with mitosis in other biological systems, like Physarum [33], mouse cell lines [24] and yeast [34]. Histone H2A ubiquitination level is also altered during plant cell dedifferentiation, according to uh2a ratio to H2A in distinct calli subcultures (Fig. 4). These data concur with the fact that, despite morphological similarity observed in calli derived from divergent developmental stages, differences in biochemical properties continue to exist during plant cell dedifferentiation [29], which in the case of H2A ubiquitination seem to be eliminated only in the second callus subculture. Increased ubiquitination level observed in first callus culture derived from differentiation zone could be due to the sudden change in the physiological state of these cells. During callus formation, previously differentiated, non-proliferating cells (e.g. parenchymatic cells) are forced to divide and conformational changes in chromatin, including histone modifications, are necessary to this process [30]. Increased proliferation rate and consequently, DNA replication rate in these cells, could result to increased DNA damage during replication. The increased H2A ubiquitination level that we observed in these cells could also be a feature related with DNA repair process. Histone ubiquitination has already been associated with DNA repair in other biological systems. Ubiquitin conjugation to H2A and H2B in yeast is mediated by Rad6 protein, an enzyme involved in DNA post-replicative repair [35] and Rad6 mutants were found to be sensitive to factors causing DNA damage [36]. Although the precise role of this modification remains still elusive, it has been suggested that histone ubiquitination triggers changes upon chromatin structure in order to gain access for DNA repair machinery to the sites of damage [37]. In contrast to first callus culture cells, second and third calli subculture cells are already habituated to the new physiological state and behave like typical meristematic cells. The increase in cell division rate, resulting from dedifferentiation process, was completed during the first culture stage, DNA damage during replication could be leveled and consequently, increased H2A ubiquitination level may be not necessary and uh2a fraction is similar to that of meristematic cells. The results presented in this study indicate that H2A ubiquitination occurs in the meristematic cells of maize root, i.e. meristematic and elongation zone cells and pericycle and epidermis cells of differentiation zone, supporting the correlation between histone ubiquitination and cell division. This correlation could be also examined in other tissues containing meristematic cells, like the shoot apex. The increased H2A ubiquitination level in first callus culture derived from differentiation zone may associate with DNA damage due to the sudden change in proliferation rate during plant cell dedifferentiation. The distribution of uh2a in the developmental zones of maize root after treatment with factors causing DNA damage could be useful to examine a potential role of histone ubiquitination in DNA repair. Future studies in this field will probably enrich our knowledge about the role of histone ubiquitination in these processes and the precise function of this modification. Acknowledgments We thank Dr. J.E. Celis and Dr. C. Panagiotidis for providing the anti-uh2a and anti-h2a antibodies, respectively. References [1] A.P. Wolffe, D. Guschin, Review: chromatin structural features and targets that regulate transcription, J. Struct. Biol. 129 (2000) [2] D.E. Sterner, S.L. Berger, Acetylation of histones and transcription-related factors, Microb. Mol. Biol. Rev. 64 (2000) [3] F. Hans, S. Dimitrov, Histone H3 phosphorylation and cell division, Oncogene 20 (2001) [4] T. Kouzarides, Histone methylation in transcriptional control, Curr. Opin. Genet. Dev. 12 (2002) [5] Y. Shiio, R.N. Eisenman, Histone sumoylation is associated with transcriptional repression, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (2003) [6] B.D. Strahl, C.D. Allis, The language of covalent histone modifications, Nature 403 (2000) [7] C.M. Pickart, Mechanisms underlying ubiquitination, Annu. Rev. Biochem. 70 (2001) [8] N.R. Ballal, Y.J. Kang, M.O. Olson, H. Busch, Changes in nucleolar proteins and phosphorylation patterns during liver regeneration, J. Biol. Chem. 250 (1975) [9] L.J.M. Jason, S.C. Moore, J.D. Lewis, G. Lindsey, J. Ausio, Histone ubiquitination: a tagging tail unfolds? BioEssays 24 (2002) [10] L. Levinger, A. Varshavsky, Selective arrangement of ubiquitinated and D1 protein-containing nucleosomes within the Drosophila genome, Cell 28 (1982) [11] H.Y. Chen, J.M. Sun, Y. Zhang, J.R. Davie, M.L. Meistrich, Ubiquitination of histone H3 in elongating spermatids of rat testes, J. Biol. Chem. 273 (1998) [12] A.-D. Pham, F. Sauer, Ubiquitin-activating/conjugating activity of TAF II 250, a mediator of activation of gene expression in Drosophila, Science 289 (2000) [13] J. Barsoum, A. Varshavsky, Preferential localization of variant nucleosomes near the 5 0 -end of the mouse dihydrofolate reductase gene, J. Biol. Chem. (1985) [14] W.M. Baarends, E. Wassenaar, R. van der Laan, J. Hoogerbrugge, E. Sleddens-Linkels, J.H. Hoeijmakers, P. de Boer, J.A. Grootegoed, Silencing of unpaired chromatin and histone H2A ubiquitination in mammalian meiosis, Mol. Cell. Biol. 25 (2005) [15] K.P. Smith, M. Byron, C.M. Clemson, J.B. Lawrence, Ubiquitinated proteins including uh2a on the human and mouse inactive X chromosome: enrichment in gene rich bands, Chromosoma 113 (2004) [16] T. Murashige, F. Skoog, A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture, Physiol. Plant. 15 (1962) [17] A. Muller, G. Philips, C. Gigot, Properties of condensed chromatin in Barley nuclei, Planta 149 (1980) [18] M.G. Murray, J.L. Key, 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid enhanced phosphorylation of soybean nuclear proteins, Plant. Physiol. 61 (1978) [19] O.H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Farr, R.J. Randall, Protein measurement with the folin phenol reagent, J. Biol. Chem. 193 (1951) [20] U.K. Laemmli, Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature 227 (1970) [21] W.M. Bonner, M.H. West, J.D. Stedman, Two-dimensional gel analysis of histones in acid extracts of nuclei, cells and tissues, Eur. J. Biochem. 109 (1980) [22] W. Wray, T. Boulikas, V.P. Wray, R. Hancock, Silver staining of proteins in polyacrylamide gels, Anal. Biochem. 118 (1981)

280 A. Alatzas, A. Foundouli / Plant Science 171 (2006) [23] H. Towbin, T. Staehelin, J. Gordon, Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76 (1979) [24] A.P. Vassilev, H.H. Rasmussen, E.I. Christensen, S. Nielsen, J.E. Celis, The levels of ubiquitinated histone H2A are highly upregulated in transformed human cells: partial colocalization of uh2a clusters and PCNA/cyclin foci in a fraction of cells in S-phase, J. Cell Sci. 108 (1995) [25] W.C. Yang, B. Horvath, J. Hontelez, A. van Kammen, T. Bisseling, In situ localization of Rhizobium mrnas in pea root nodules: nifa and nifh localization, Mol. Plant-Microb. Interact. 4 (1991) [26] E. Burkhanova, D.Z. Staynov, S. Koleva, R. Tsanev, Some characteristics of chromatin from meristematic and differentiated cells of maize root, Cell Different. 4 (1975) [27] F. Hochholdinger, W.J. Park, M. Sauer, K. Woll, From weeds to crops: genetic analysis of root development in cereals, Trends Plant Sci. 9 (2004) [28] M. Ueda, Y. Koshino-Kimura, K. Okada, Stepwise understanding of root development, Curr. Opin. Plant Biol. 8 (2005) [29] S. Koleva, E. Marinova, S. Varadinova, E. Tsikova, A. Atanassov, Acidsoluble chromosomal proteins in maize root and callus cells and after rhizogenesis induction in callus tissues, Biol. Plant. 24 (1982) [30] L. Williams, J. Zhao, N. Morozova, Y. Li, Y. Avivi, J. Grafi, Chromatin reorganization accompanying cellular dedifferentiation is associated with modifications of histone H3, redistribution of HP1, and activation of E2Ftarget genes, Dev. Dynam. 228 (2003) [31] I.L. Goldknopf, J. Wilson, N.R. Ballal, H. Busch, Chromatin conjugate protein A24 is cleaved and ubiquitin is lost during chicken erythropoiesis, J. Biol. Chem. 255 (1980) [32] A.M. Wunsch, A.L. Haas, J. Lough, Synthesis and ubiquitination of histones during myogenesis, Dev. Biol. 119 (1987) [33] R.D. Mueller, H. Yasuda, C.L. Hatch, W.M. Bonner, E.M. Bradbury, Identification of ubiquitinated histones 2A and 2B in Physarum polycaphalum, J. Biol. Chem. 260 (1985) [34] K. Rozbyk, J. Recht, M.A. Osley, Rad6 dependent ubiquitination of histone H2B in yeast, Science 287 (2000) [35] S. Jentsch, J.P. McGrath, A. Varshavsky, The yeast DNA repair gene RAD6 encodes an ubiquitin-conjugating enzyme, Nature 329 (1987) [36] C. Lawrence, The RAD6 DNA repair pathway in Saccharomyces cerevisiae: what does it do, and how does it do it? Bioessays 16 (1994) [37] E.G. Mimnaugh, M.K. Yunmbam, Q. Li, P. Bonvini, S.-G. Hwang, J. Trepel, E. Reed, L. Neckers, Prevention of cisplatin DNA adduct repair and potentiation of cisplatin-induced apoptosis in ovarian carcinoma cells by proteasome inhibitors, Biochem. Pharm. 60 (2000)

281 Biol Res 41: , 2008 ALATZAS ET AL. Biol Res 41, 2008, BR 205 Distribution of linker histone variants during plant cell differentiation in the developmental zones of the maize root, dedifferentiation in callus culture after auxin treatment ANASTASIOS ALATZAS 1*, LJUBA SREBREVA 2 and ATHINA FOUNDOULI 1 1 Laboratory of Developmental Biology, School of Biology, Aristotle University of Thessaloniki, Thessaloniki, Greece and 2 Institute of Molecular Biology, Bulgarian Academy of Science, Sofia 1113, Bulgaria ABSTRACT Although several linker histone variants have been studied in both animal and plant organisms, little is known about their distribution during processes that involve alterations in chromatin function, such as differentiation, dedifferentiation and hormone treatment. In this study, we identified linker histone variants by using specific anti-histone H1 antibodies. Each variant s ratio to total H1 in the three developmental zones of maize (Zea mays L.) root and in callus cultures derived from them was estimated in order to define possible alterations either during plant cell differentiation or during their dedifferentiation. We also evaluated linker histone variants ratios in the developmental zones of maize roots treated with auxin in order to examine the effects of exogenous applied auxin to linker histone variant distribution. Finally, immunohistochemical detection was used to identify the root tissues containing each variant and correlate them with the physiological status of the plant cells. According to the results presented in this study, linker histone variants ratios are altered in the developmental zones of maize root, while they are similar to the meristematic zone in samples from callus cultures and to the differentiation zone in samples from roots treated with auxin. We propose that the alterations in linker histone variants ratios are correlated with plant cell differentiation and dedifferentiation. Key terms: callus culture, linker histone, plant cell differentiation, plant hormone; Zea mays INTRODUCTION The primary level of DNA compaction into the chromatin of eukaryotic cells is the nucleosome, where 146bp of DNA are wrapped around a histone octamer core, comprised of two of each histones, H2A, H2B, H3 and H4, while its structure is completed with the association of H1 linker histone (Wolffe and Guschin, 2000). Each histone class, with the exception of H4, is represented by a family of structurally similar polypeptides called histone variants. Histone variants are synthesized in different relative amounts during the cell cycle, depending on the physiological status of the cell. It has been proposed that they could be necessary in distinct chromatin functions (Gabrielli, 1989, Brown, 2001). Linker H1 histones have been found to display greater variability when compared to core histones (Brown, 2001). This heterogeneity is conserved between eukaryotes, suggesting that individual H1 variants may have unique properties, resulting in specific roles in chromatin function (Cole, 1987, Zlatanova et al., 2000). Several H1 variants have been studied in both animal and plant organisms and most of them are considered tissue- or stage-specific, while others are accumulated during cell differentiation or in response to specific environmental signals (Jerzmanowski et al., 2000, Khochbin, 2001). For instance, in * Corresponding Author: Anastasios Alatzas ( aalatzas@bio.auth.gr) Received: December 13, In Revised form: May 30, Accepted: June 23, 2008

282 206 ALATZAS ET AL. Biol Res 41, 2008, several liliaceous plants specific histone H1 variants appear during male meiosis (Ueda and Tanaka, 1995), other variants expressed during water deficit have been identified in several monocots and dicots (Scippa et al., 2004) whereas a specific H1 variant has been found to localize in nucleoli of higher plant cells (Tanaka et al., 1999). Although linker histones have been studied in several plant species (Ivanchenko et al., 1987, Srebreva et al., 1989, Tanaka et al., 1999, Jerzmanowski et al., 2000, Scippa et al., 2004), little is known about their spacial distribution during plant cell differentiation and dedifferentiation, processes that involve several alterations in chromatin structure and function. Even less is known about the effect of exogenous applied hormones on linker histone distribution, although there is evidence about alterations in histone H1 patterns after hormone treatment of animal cells ( Wurtz, 1985). Plant hormones are compounds known to regulate almost all aspects of plant development while auxin was the first plant hormone discovered (Berleth et al., 2004, Chow and McCourt, 2004). Auxin is known to play a significant role in plant growth, apex domination, root and shoot branching, xylem and ploem differentiation and plant response to environmental signals like gravity and light (Went, 1974, Friml, 2003). Auxin regulates cell division, elongation, polarity and differentiation through the control of several response genes expression (Guilfoyle & Hagen, 2001, Leyser, 2001). In order to define possible alterations in linker histone H1 distribution primarily during plant cell differentiation and subsequently during dedifferentiation, we estimated the ratios of each histone H1 variant to total linker histone in each of the three developmental zones of maize (Zea mays L.) root and in callus cultures derived from them. We also estimated the above ratios in samples derived from roots treated with auxin in order to define alterations during auxin treatment. Finally, we used immunohistochemical analysis to directly define the tissues containing each linker histone variant in order to correlate them with the physiological status of the plant cells. METHODS Plant material, auxin treatment and in vitro callus culture Maize seeds (Zea mays L., cv. Polaris) were germinated in the dark at 28 o C on paper sheets soaked with distilled water, until root s length reached approximately 3-5 cm. At this time, the three developmental zones (meristematic zone, 2 mm; elongation zone, 2-6 mm; differentiation zone, 6 mm-2 cm; also see Fig. 1) were separately collected and stored at -70 o C (Burkhanova et al., 1975). Maize seeds were also germinated under the same conditions on paper sheets soaked with 0.01mM indoleacetic acid and were collected the same way. Callus cultures were developed from root segments, representing the three developmental zones, which were placed under aseptic conditions in glass tubes containing sterilized Murashige and Skoog medium (Murashige and Skoog, 1962) that was supplemented with 1 mg.l -1 2,4- dichlorophenoxyacetic acid (Sigma) and 3% (w/v) sucrose and solidified with 0.5% (w/v) agar. Calli were developed in the dark at 28 o C for approximately two months and then were collected separately and stored at -70 o C. Nuclei isolation and histone extraction Nuclei isolation was performed according to Muller et al. (1980). Plant material from each zone or callus culture was homogenized with five volumes of Buffer A ( 50 mm Tris- HCl ph 8. 0, 4 mm (CH3COOH) 2 Mg.4H 2 0, 0.25 M sucrose, 2% (w/v) Arabic gum, 0.5% (v/v) Triton X- 100, 1 mm phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 0.5% (v/v) dimethyl sulfoxide (DMSO) and 5 mm -mercaptoethanol), filtered through Nylon Screen Mesh 25 filter and centrifuged at 900g for 30 min. The pellet was suspended in Buffer A (without Arabic gum), placed over Buffer B ( 50 mm Tris- HCl ph 8. 0, 4 mm (CH3COOH) 2 Mg.4H 2 0, 1.2 M sucrose, 1 mm PMSF, 0.5% (v/v) DMSO and 5 mm -mercaptoethanol) and centrifuged at 900g for another 30 min. Nuclei were washed

283 ALATZAS ET AL. Biol Res 41, 2008, with Buffer A (without Arabic gum and Triton X-100), centrifuged at 900g and afterwards were suspended in TBS (10 mm Tris-HCl ph 7.5, 150 mm NaCl) and centrifuged at 20,000g for 30 min. Histones were extracted as described by Murray and Key (1978). The pellet was suspended in 0.4 N H 2 SO 4, stirred for 1h and centrifuged at 20,000g for 30 min. Four volumes of cold ethanol were added to the supernatant and histones precipitated in approximately 48 h at -20 o C. The precipitant was washed with 70% ethanol, ethanol/ether (3/1, v/v) and acetone. Each step was followed by centrifugation at 20,000g for 30 min and was performed twice. The samples were vacuum dried and stored at -20 o C. The amount of protein was determined with the method described by Lowry et al. (1951). Electrophoretic analysis of histone preparations Extracted proteins were initially analyzed on SDS-containing 15% polyacrylamide gels as described by Laemmli (1970). Approximately 10 g of total protein was loaded on each lane and prestained protein markers (New England Biolabs) were used to determine their molecular masses. Histone variants and modified forms were separated in two-dimensional AUT/AUC- PAGE (acetic acid-urea-triton X-100/ acetic acid-urea-cetyltrimethylammonium bromide [CTAB]) as described by Bonner et al. ( 1980). First dimension was performed in gel consisting of 12% (w/v) acrylamide, 0.1% (w/v) bis-acrylamide, 1 M acetic acid, 6 M urea, 0.625% (v/v) Triton X-100, 45 mm NH 4 OH, 0.5% (v/v) N,N,N,N -tetramethyl-ethylenediamine (TEMED) and 0.027% (v/v) riboflavin, running buffer containing 1 M acetic acid and 0.1 M glycine and the samples were diluted in loading buffer consisting of 1 M acetic acid, 6 M urea, 45 mm NH 4 OH and 15 mm -mercaptoethanol. Approximately 50 g of total protein were loaded on the gel and electrophoresis was performed at 210 V for approximately 1 h. Afterwards, Figure 1: A longitudinal view of maize root: meristematic zone (2mm), elongation zone (2mm- 6mm) and differentiation zone (6mm-2cm). The regions of sectioning are indicated, while (M), (E) and (D) are representative transversal sections of meristematic, elongation and differentiation zone respectively.

284 208 ALATZAS ET AL. Biol Res 41, 2008, strips containing the samples were cut, stained with 0.1% Coomasie Brilliant Blue R-250 in 40% ethanol, 5% acetic acid and 0.1% (w/v) cysteamine for 5 min, destained in 20% ethanol, 5% acetic acid and 0.1% (w/v) cysteamine for 10 min and soaked in 1 M acetic acid, 5 mm NH 4 OH and 0.5% (w/v) cysteamine for 20 min. Each strip was placed on the top of a second dimension gel, consisting of 16.5% (w/v) acrylamide, 0.1% (w/v) bis-acrylamide, 1 M acetic acid, 6 M urea, 45 mm NH 4 OH, 0.5% (v/v) TEMED and 0.027% (v/v) riboflavin and 0.15% (w/v) CTAB was added in upper tank s running buffer. The electrophoresis was performed at 210 V for approximately 2 h. Two-dimensional gels were stained with Coomasie Brilliant Blue R-250 or alternatively with silver nitrate (Wray et al., 1981). Western blotting Histone H1 immunodetection was performed after electrophoresis and western blotting according to Towbin et al. (1979). Proteins from SDS- PAGE gels were transferred onto PVDF membranes using buffer containing 25 mm Tris-HCl ph 8.3, 192 mm glycine, 20% methanol at 100 V for 1 h, while proteins from AUT/AUC- PAGE gels were transferred using buffer containing 0.7% (v/v) acetic acid, 20% methanol at 60 V for 1 h. Afterwards, membranes were washed twice in PBST (0.1% (v/v) Tween20 in PBS) and then incubated for 2 h in blocking solution (5% (w/v) non-fat dry milk in PBST). The polyclonal antibodies used in this study were raised against mouse total histone H1, the H1 main variants H1(A+B) and H1 0 variant and were diluted 1:1000. The specificity of the antibodies and their immunoreactivity with plant linker histones have been described in detail elsewhere (Ivanchenko et al., 1987, Srebreva et al., 1989). The reaction was carried out at room temperature for 2 h. Following removal of excess antibody by washing three times with PBST, the membranes were incubated with the second antibody (horseradish peroxidase labeled goat anti-rabbit, diluted 1:2000). After the washes as above, the immunoblots were visualized using enhanced chemiluminescense. Densitometry and statistical analysis After identifying linker histone variants, the stained gels were scanned and analyzed by means of Gel Pro Analyzer 3.1 software (Media Cybernetics). The optical density of each spot representing histone H1 variant was measured and its portion of total linker histone in each sample was evaluated. Each sample was derived from an individual extraction and three independent experiments ( i. e. histone extraction, electrophoresis and gel analysis) were performed for each of the developmental zones and callus cultures in order to examine the reproducibility of the results and to estimate the average and the standard deviation of the quantification analysis. A Student s t-test, suitable for groups of data having different averages and variations, with an error probability of less than 5%, was applied in order to assess the statistical significance of the differences among the results. Immunohistochemistry Maize roots were embedded in paraffin according to Yang et al. (1991). Firstly, roots were fixed in phosphate solution ph=6.8 containing 100 mm NaCl, 4% (w/v) paraformaldehyde and 0. 25% ( v/ v) glutaraldehyde. Afterwards, they were dehydrated and cleared in increasing concentration solutions of ethanol and xylene respectively and stained with 5% (w/ v) safranin in 50% ethanol. Xylene was saturated with paraffin at RT, then at 42 o C and finally the vials were transferred at 60 o C and the mixture (xylene and paraffin) was replaced by melted and filtred paraffin. Paraffin was refreshed twice a day for the next ten days and after this, vials content (roots and paraffin) was transferred onto cold templates and stored at 4 o C. Tenmicrometer sections were taken by means of a microtome and placed onto glass slides which had previously been washed extensively, sterilized and coated with poly- L-lysine solution (0.01% (w/v) poly-l-

285 ALATZAS ET AL. Biol Res 41, 2008, lysine (Mol. Wt. 30,000-70,000, Sigma) in 10 mm Tris-HCl, ph=8). They were placed overnight onto a 42 o C surface and then in xylene, xylene/ethanol (1/1, v/v) and ethanol and were stored at -20 o C. Immunodetection of linker histones was performed in the same way as PVDF membranes, except that the second antibody was alkaline phosphatase labeled and that nitro blue tetrazolium (NBT) and 5-bromo- 4- chloro- 3- indolyl phosphate ( BCIP) solutions diluted in alkaline phosphatase buffer (10 mm Tris-HCl ph 9.2, 100 mm NaCl, 50 mm MgCl 2 ) were used for detection. After detection, sections were dehydrated in increasing concentration solutions of ethanol, photographed by means of a digital camera and stored at RT. RESULTS Histone separation and immunodetection Maize root is an appropriate biological system for developmental studies since it consists of three zones, which can be easily separated ( Fig. 1). Meristematic and elongation zones contain proliferating cells and the primary root tissues respectively, whereas differentiation zone consists mainly of parenchymatic, non-proliferating cells (Burkhanova et al., 1975). Histones were extracted from each of the three developmental zones in order to define possible alterations in linker histone variants distribution during plant cell differentiation. They were separated in 15% SDS-PAGE gels and western blotting was performed with polyclonal antibodies against total histone H1, the H1 main variants H1(A+B) and H1 0 variant (Ivanchenko et al., 1987, Srebreva et al., 1989). Linker histones were identified as three bands (Fig. 2B), with molecular masses of approximately 43-, 39- and 37kDa. The 43- and 39kDa bands were also recognized by the H1(A+B) antibody (Fig. 2C) and the 37kDa band was recognized by the H1 0 antibody (Fig. 2D). At the same time no reaction was observed with any other protein in the preparation, suggesting that the fractions that gave a positive reaction represent molecules belonging to the H1 family. Two-dimensional AUT/ AUC-PAGE was used in order to separate histone variants and their posttranslational modified forms ( Fig. 3A) and immunodetection was performed with the anti-histone H1 antiserum. As shown in Figure 3B, the antiserum only stained the H1 histones, which were identified in the central region of the gel, above the core histones. Figure 2: A representative SDS-PAGE gel (A) and immunoblotting detection of total H1 (B), H1(A+B) (C) and H1 0 (D). Prestained protein markers were used to determine the molecular mass of each histone protein. The sample presented was derived from meristematic zone.

286 210 ALATZAS ET AL. Biol Res 41, 2008, Figure 3: A representative two-dimensional AUT/AUC-PAGE gel (A) and immunoblotting detection of histone H1 (B). The sample presented was derived from differentiation zone. Linker histone variant distribution in the developmental zones of maize root After identifying linker histones, twodimensional gels were scanned and analyzed by means of Gel Pro Analyzer 3.1 software, in order to indirectly estimate each histone H1 variant s ratio in maize root developmental zones. The optical density of each spot representing the histone H1 variants was measured and each variant s portion of total histone H1 in each sample was evaluated. Each sample was derived from an independent experiment and three samples from each of the developmental zones and callus cultures were analyzed in order to estimate the average and the standard deviation of the measurement. A Student t-test was applied to assess the statistical significance of the differences between the variants ratios. According to gel analysis, in samples derived from meristematic and elongation zone, the two main histone H1 variants represented approximately 41% and 34% of total histone H1, while H1 0 variant represented approximately 25%. This ratio was altered in samples derived from differentiation zone, where H1 0 ratio was increased up to 34% and the ratios of the main variants were decreased to 35% and 31% respectively (Fig. 4A). Linker histone variants distribution in callus culture cells In order to study linker histone variants distribution during plant cell dedifferentiation, callus cultures were developed from root segments representing the three developmental zones. Histones were extracted from each culture, separated in two-dimensional gels and linker histones were identified. Two-dimensional gels were scanned and each variant s ratio to total histone H1 was estimated in three independent experiments as described above. According to gel analysis, the linker histone variants ratios in callus cultures were similar to those derived from meristematic zone (as is shown in Fig. 4A), i.e. the two main histone H1 variants represented approximately 41% and 34% while H1 0 variant represented approximately 25% of total histone H1, regardless of the developmental zone from which calli were derived (Fig. 4B). Linker histone variants distribution in maize root zones after auxin treatment We also wished to probe any possible deviation in linker histone variant distribution in each of the three developmental zones upon exogenous

287 ALATZAS ET AL. Biol Res 41, 2008, applied auxin. As shown in Figure 6, roots developed on paper sheets soaked with 0.01mM indole-acetic acid are significantly different in length and diameter from roots developed on paper sheets soaked with distilled water. Histones were extracted from each of the three developmental zones from roots treated with auxin and each variant s ratio to total histone H1 was estimated in three independent experiments as described above. According to gel analysis (Fig. 4C) after auxin treatment the H1 0 ratio in samples derived from meristematic and elongation zone was increased to above 30%, and the main variants ratios were decreased by comparison with untreated roots (see Figure 4A). In contrast, there were no significant differences between samples derived from the differentiation zone of controls and roots treated with auxin (Fig. 4C). Immunohistochemical detection of histone H1 in maize root sections Figure 4: Histone H1 variants (H1A; H1B; H1 0 ) ratio to total H1 in samples derived from the developmental zones (M: meristematic zone; E: elongation zone; D: differentiation zone) of maize root (A), callus cultures derived from each zone (B) and from the developmental zones of roots treated with auxin (C). Each value is the average of three independent experiments and bars indicate the standard deviation of the measurement. Values significantly different at p<0. 05 from corresponding values measured in samples derived from the meristematic zone of control roots are indicated by asterisks. Finally, we used immunohistochemical detection in maize root sections in order to identify the tissues containing the linker histone variants. In contrast to meristematic and elongation zones, the cells within differentiation zone are known to form distinct structures. Vascular cylinder, containing xylem, phloem and pith is surrounded by pericycle, endodermis and cortex, while exodermis and epidermis are the exterior root tissues (Hochholdinger et al. 2004). After staining with anti-histone H1 antibodies, histone H1 immunoreactivity was always nuclear and the staining intensity was usually high and uniform. We observed that the main histone H1 variants were present in every cell of the root, regardless of their tissue-type, physiological state or proliferation rate (Fig. 5C, G, K and O). In contrast to main histone H1 variants, H1 0 was localized mainly in differentiated cells, like the parenchymatic cells of cortex and pith or epidermal cells, displaying strong immunostaining, while it was absent in pericycle cells (Fig. 5L and P). However, a faint immunoreaction was obtained in sections from meristematic and elongation

288 212 ALATZAS ET AL. Biol Res 41, 2008, zones treated with anti-h1 0 antibodies (Fig. 5D and H) compared to those treated with total H1 and H1(A+B) antibodies (Fig. 5B, C, F and G). Detection without primary antibody (Fig. 5A, E, I and M) and with total H1 antibody (Fig. 5B, F, J and N) was also performed in maize root sections as negative and positive controls. Figure 5: Immunohistochemical detection of linker histones in maize root sections from meristematic (sections A-D), elongation (sections E-H) and differentiation zone (sections I-P). Detection without primary antibody and with total H1 antibody were performed in maize root sections as negative and positive controls (sections A, E, I, M and B, F, J, N respectively). The main histone H1 variants are present in every cell of the root (sections C, G, K and O) while H1 0 is detected mainly in differentiated cells, like the parenchymatic cells of cortex and pith (sections L and P). However, a less intense H1 0 signal is also observed in sections from the meristematic and elongation zone (sections D and H). The sections from the meristematic zone presented were taken at approximately at 1mm from the root tip while the sections from elongation and differentiation zone were taken at approximately 3mm and 1cm from the root tip, respectively (ep: epidermis; co: cortex; pe: pericycle; pi: pith).

289 ALATZAS ET AL. Biol Res 41, 2008, DISCUSSION The biochemical and immunological analysis of the distribution of linker histones in the developmental zones of maize root was performed by two types of electrophoresis and by using specific antihistone H1 antibodies. An important result of these experiments was the occurrence of histone H1 0 variant in samples isolated from meristematic zone (Fig. 2D), a fact that was also supported by the immunohistochemical analysis that showed positive H1 0 -immunoreactivity of the meristematic cells (Fig. 5D). The relative amounts of histone H1 variants in the maize root s developmental zones were determined by densitometry of the stained gels and found to be altered during plant cell differentiation. The quantitative estimations presented in Figure 4A show that the H1 0 variant ratio was 25% in meristematic and elongation zone and increased in samples derived from differentiation zone up to 34%. At the same time, the ratios of the main histone variants (H1A and H1B) were decreased during plant cell differentiation. The H1 0 linker histone variant was originally discovered in tissues of low proliferation rate in mammals and shown to accumulate in terminally differentiated cells. The protein was later found in all classes of animals as well as in plant organisms and it is now widely accepted that its accumulation is correlated with the transition of the cells to the state of terminal differentiation (Zlatanova and Doenecke, 1994). It is known that during callus formation, differentiated plant cells can be transformed into callus culture cells, which restore their meristematic properties, especially the ability for rapid proliferation (Koleva et al., 1982, Williams et al., 2003). According to the results presented in Figure 4B, the linker histone variants ratios during plant cell dedifferentiation in callus culture were similar to meristematic zone, regardless of the developmental zone from which calli were derived. The main H1 variants, H1A and H1B, represent approximately 41% and 34% while H1 0 variant represent 25% of total histone H1. The occurrence of the differentiation-related H1 0 variant in the proliferating cells of callus cultures might be necessary in the proper function of cells due to its cell cycle-independent expression and ability to replace other linker histone variants, a process that is possible to alter chromatin structures in specific regions. In contrast to callus formation, auxin treatment is known to promote the opposite process, i.e. root differentiation, which results in both morphological (e.g. longer and thicker roots, as shown in Figure 6) and physiological differences among auxin treated and control plants (Raghavan, 1999). Auxin is known to play a significant role in phloem and xylem differentiation and also in patterned differentiation of cells in meristems (Berleth et al., 2004). According to the results presented in Figure 4C, the linker histone variants ratios in samples from roots treated with auxin were similar to that obtained in differentiation zone. In particular, the H1 0 linker histone variant s levels were increased to above 30% of the total H1, regardless of the developmental zone from which the samples were derived. Alterations in histone H1 pattern have been observed during hormoneinduced cell proliferation in mouse mammary glands as well as during hormone-induced differentiation of mouse myeloid leukemia cells. Histone H1 variants ratios exhibited differences in samples from hormone-treated and nontreated cells and it has been suggested that the alterations observed could be due to rearrangements of chromatin that take place during hormone stimulation (Wurtz, 1985) Linker histones are known to play an important role in chromatin structure by stabilising the higher order structure of chromatin fiber (Wolffe and Guschin, 2000) and it has been proposed that they also participate in transcriptional regulation of specific genes by allowing or preventing the access of transcription factors to DNA template (Zlatanova et al., 2000). The remarkable heterogeneity of linker histones suggests an important role in chromatin

290 214 ALATZAS ET AL. Biol Res 41, 2008, function, considering that individual variants might participate in distinct processes, although evidence for the opposite has been also reported (Khochbin, 2001). If this is the case, the relative amounts of H1 variants would be altered during processes that imply changes in chromatin function, such as cell differentiation and/or dedifferentiation. Both plant cell differentiation, either programmed or induced by plant hormones, and dedifferentiation result in alterations in the physiological state of the cell and consequently in chromatin function that probably necessitate distinct variants ratios during each process. Figure 6: Morphological differences between a representative root developed in the dark at 28 C o on paper sheets soaked with 0.01mM indole-acetic acid and a representative root developed under the same conditions on paper sheets soaked with distilled water. The results presented in this study indicate that linker histone variant distribution is altered during plant cell differentiation and dedifferentiation. The variants ratios in each case probably depend on the physiological state of plant cells and are similar to meristematic cells during callus formation while they resemble differentiated cells during auxin treatment. Future studies in this field will probably enrich our knowledge about the precise role of linker histone variants in these processes. REFERENCES BERLETH T, KROGAN NT, SCARPELLA E (2004) Auxin signals-turning genes on and turning cells around. Curr Opin Plant Biol 7: BONNER WM, WEST MH, STEDMAN JD (1980) Twodimensional gel analysis of histones in acid extracts of nuclei, cells and tissues. Eur J Biochem 109: BROWN DT (2001) Histone variants: are they functionally heterogeneous? Gen Biol 2: 1-6 BURKHANOVA E, STAYNOV DZ, KOLEVA S, TSANEV R (1975) Some characteristics of chromatin from meristematic and differentiated cells of maize root. Cell Differentiation 4: CHOW B, MCCOURT P (2004) Hormone signaling from a developmental context. J Exp Bot 55: COLE RD (1987) Microheterogeneity in H1 histones and its consequences. Int J Pept Protein Res 30: FRIML J (2003) Auxin transport-shaping the plant. Curr Opin Plant Biol 6: 7-12 GABRIELLI F (1989) Human Histone Variants. In: HNILICA LS, STEIN GS, STEIN JL (Eds) Histones and Other Basic Nuclear Proteins. Boca Raton, Florida: CRC Press, Inc. pp: 3-16 GUILFOYLE TJ, HAGEN G (2001) Auxin response factors. J Plant Growth Reg 20: HOCHHOLDINGER F, PARK WJ, SAUER M, WOLL K (2004) From weeds to crops: genetic analysis of root development in cereals. Trends Plant Sci 9: IVANCHENKO M, GEORGIEVA E, USCHEWA A, AVRAMOVA Z (1987) A study on the heterogeneity of histone H1 from dry maize embryos. Eur J Biochem 162: JERZMANOWSKI A, PRZEWLOKA M, GRASSER KD (2000) Linker histones and HMG1 proteins of higher plants. Plant Biol 2: KHOCHBIN S (2001) Histone H1 diversity: bridging regulatory signals to linker histone function. Gene 271: 1-12 KOLEVA S, MARINOVA E, VARADINOVA S, TSIKOVA E, Atanassov A (1982) Acid-soluble chromosomal proteins in maize root and callus cells and after rhizogenesis induction in callus tissues. Biol Plant 24: LAEMMLI UK (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: LEYSER O (2001) Auxin signaling: the beginning, the middle and the end. Curr Opin Plant Biol 4: LOWRY OH, ROSEBROUGH NJ, FARR AL, RANDALL RJ (1951) Protein measurement with the folin phenol reagent. J Biol Chem 193: MULLER A, PHILIPS G, GIGOT C (1980) Properties of condensed chromatin in barley nuclei. Planta 149: MURASHIGE T, SKOOG F (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiol Plant 15: MURRAY MG, KEY JL (1978) 2,4-dichlorophenoxyacetic acid enhanced phosphorylation of soybean nuclear proteins. Plant Physiol 61: RAGHAVAN V (1999) Developmental Biology of Flowering Plants. New York: Springer-Verlag SCIPPA GS, DIMICHELE M, ONELLI E, PATRIGNANI G, CHIATANTE D, BRAY EA (2004) The histone-like protein H1-S and the response of tomato leaves to water deficit. J Exp Bot 55: SREBREVA L, IOSIFIDU M, CHIMSHIROVA K, ZLATANOVA J (1989) Occurrence of histone H1 0 -

291 ALATZAS ET AL. Biol Res 41, 2008, related fraction in differentiated maize roots. Biochim Biophys Acta 1008: TANAKA I, AKAHORI Y, GOMI K, SUZUKI T, UEDA K (1999) A novel histone variant localized in nucleoli of higher plant cells. Chromosoma 108: TOWBIN H, STAEHELIN T, GORDON J (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci USA 76: UEDA K, TANAKA I (1995) Male gametic nucleusspecific H2B and H3 histones, designated gh2b and gh3, in Lilium longiflorum. Planta 197: WENT F (1974) Reflections and speculations. Ann Rev Plant Physiol 25: 1-2 WILLIAMS L, ZHAO J, MOROZOVA N, LI Y, AVIVI Y, GRAFI J (2003) Chromatin reorganization accompanying cellular dedifferentiation is associated with modifications of histone H3, redistribution of HP1, and activation of E2F-target genes. Dev. Dynamics 228: WOLFFE AP, GUSCHIN D (2000) Chromatin structural features and targets that regulate transcription. J Struct Biol 129: WRAY W, BOULIKAS T, WRAY VP, HANCOCK R (1981) Silver staining of proteins in polyacrylamide gels. Anal Biochem 118: WURTZ T (1985) Events in glucocorticoid hormone action: A correlation of histone H1 variant pattern changes, hormone binding to cell nuclei and induction of mouse mammary tumor virus RNA. Eur J Biochem 152: YANG WC, HORVATH B, HONTELEZ J, VANKAMMEN A, BISSELING T (1991) In situ localization of Rhizobium mrnas in pea root nodules: nifa and nifh localization. Mol Plant-Microbe Interact 4: ZLATANOVA J, DOENECKE D (1994) Histone H1 0 : a major player in cell differentiation? FASEB J 8: ZLATANOVA J, CAIAFA P, VAN HOLDE K (2000) Linker histone binding and displacement: versatile mechanism for transcriptional regulation. FASEB J 14:

292 216 ALATZAS ET AL. Biol Res 41, 2008,

293 Biol Res 42: , 2009 ALATZAS & FOUNDOULI Biol Res 42, 2009, BR 445 Alterations in core histone variant ratios during maize root differentiation, callus formation and in response to plant hormone treatment ANASTASIOS ALATZAS * and ATHINA FOUNDOULI Laboratory of Developmental Biology, School of Biology, Aristotle University of Thessaloniki, Thessaloniki, Greece ABSTRACT Although several histone variants have been studied in both animal and plant organisms, little is known about their distribution during processes that involve alterations in chromatin function, such as differentiation, dedifferentiation and hormone treatment. In this study we evaluated the ratio of each histone variant in each of the four core histone classes in the three developmental zones of maize (Zea mays L.) root and in callus cultures derived from them, in order to define possible alterations either during plant cell differentiation or dedifferentiation. We also evaluated core histone variant ratios in the developmental zones of roots treated with auxin and gibberellin in order to examine the effects of exogenously applied plant hormones to histone variant distribution. Finally, immunohistochemical detection was used to identify the root tissues containing modified forms of core histones and correlates them with the physiological status of the plant cells. According to the results presented in this study, histone variant ratios are altered in all the cases examined, i.e. in the developmental zones of maize root, in callus cultures derived from them and in the developmental zones of roots treated either with auxin or gibberellin. We propose that the alterations in linker histone variant ratios are correlated with plant cell differentiation and physiological status in each case. Key terms: callus culture, histone variant, plant cell differentiation, plant hormone, Zea mays INTRODUCTION The primary level of DNA compaction into the chromatin of eukaryotic cells is the nucleosome, where 146bp of DNA are wrapped around a histone octamer core, comprised of two of each core histones, H2A, H2B, H3 and H4, while its structure is completed with the association of H1 linker histone (Wolffe and Guschin, 2000). Each histone class, with the exception of H4, is represented by a family of structurally similar polypeptides called histone variants. Histone variants are synthesized in different relative amounts during the cell cycle and it has been proposed that they could be necessary in distinct chromatin functions (Gabrielli, 1989, Brown, 2001). On the other hand, histone covalent modifications, such as acetylation, phosphorylation, methylation and ubiquitination, provide another level of heterogeneity to these proteins and it is well established that they also play important roles in all chromatin functions (Strahl and Allis, 2000, Berger, 2001). Although histone variants and modifications have been identified and studied in plants (Waterborg, 1993, Jermanowski et al., 2000, Loild, 2004), little is known about their spatial distribution during plant cell differentiation and dedifferentiation, processes that involve several alterations in chromatin structure and function. However, alterations in chromatin composition between meristematic and differentiated plant cells and during callus formation have been observed in previous studies (Burkhanova et al., 1975, Koleva et al., 1982, Williams et al. 2003). Corresponding Author: Anastasios Alatzas. Laboratory of Developmental Biology, School of Biology, Aristotle University of Thessaloniki, Thessaloniki, Greece. aalatzas@bio.auth.gr Received: October 19, In Revised form: July 12, Accepted: August 27, 2009.

294 446 ALATZAS & FOUNDOULI Biol Res 42, 2009, Even less is known about the effect of exogenously applied hormones on histone variant distribution, although there is evidence about alterations in histone pattern after hormone treatment of animal cells (Wurtz, 1985). Expression of distinct histone variants induced by plant hormone treatment, as well as alterations in histone modification level have been also reported in plants (van der Knaap and Kende, 1995, van den Heuvel et al., 1999, Sokol et al., 2007, Chinnusamy et al., 2008). Plant hormones are compounds known to regulate almost all aspects of plant development (Berleth et al., 2004, Chow and McCourt, 2004). Auxin was the first plant hormone discovered and is known to play a significant role in plant growth, apex domination, root and shoot branching, xylem and phloem differentiation and plant response to environmental signals, such as gravity and light (Friml, 2003). Auxin regulates cell division, elongation, polarity and differentiation through controlling the expression of several response genes (Guilfoyle and Hagen, 2001, Leyser, 2001). Gibberellins, a large family of over one hundred diterpenoid compounds, have also been associated with several developmental processes. It is well established that gibberellins are necessary in seed germination, root and shoot elongation, flowering and fruit development, acting through a complicated signaling pathway and the regulation of several response genes (Gomi and Matsuoka, 2003, Fleet and Sun, 2005). In order to define possible alterations in histone variant distribution, primarily during plant cell differentiation and subsequently during dedifferentiation, we estimated the ratio of each histone variant in each histone class in the three developmental zones of maize (Zea mays L.) root and in callus cultures derived from them. We also estimated the above ratios in samples derived from roots treated either with auxin or gibberellin in order to define the effect of exogenous applied plant hormones on histone variant distribution. Finally, we used immunohistochemical analysis to directly define root tissues containing the modified forms of core histones in order to correlate them with the physiological status of plant cells. METHODS Plant material, plant hormone treatment and in vitro callus culture Maize seeds (Zea mays L., cv. Polaris) were germinated in darkness at 28 o C on paper sheets soaked with distilled water, until root length reached approximately 3-5 cm. At that point, the three developmental zones (meristematic zone, 2 mm; elongation zone, 2-6 mm; differentiation zone, the rest of the root; also see Fig. 1) were separately collected and stored at 70 o C (Burkhanova et al., 1975). Maize seeds were also germinated under the same conditions on paper sheets soaked either with 0.01mM indole-acetic acid (auxin-treated roots) or 0.01 mm gibberellic acid (gibberellin-treated roots) and were collected the same way. Callus cultures were developed from root segments representing the three developmental zones, which were placed under aseptic conditions in glass tubes containing sterilized Murashige and Skoog medium (Murashige and Skoog, 1962) that was supplemented with 1 mg.l -1 2,4- dichlorophenoxyacetic acid (Sigma) and 3% (w/v) sucrose and solidified with 0.5% (w/v) agar. Calli were developed in darkness at 28 o C for approximately two months and were then collected separately and stored at 70 o C, while part of each callus was placed in new tubes containing MS medium to generate the second or third subculture. Nuclei isolation and histone extraction Nuclei isolation was performed according to Muller et al. (1980). Plant material from each zone or callus culture was homogenized with five volumes of Buffer A (50 mm Tris- HCl ph 8.0, 4 mm (CH3COOH) 2 Mg.4H 2 0, 0.25 M sucrose, 2% (w/v) gum arabic, 0.5% (v/v) Triton X-100, 1 mm phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 0.5% (v/v) dimethyl sulfoxide (DMSO) and 5 mm β-mercaptoethanol), filtered through Nylon Screen Mesh 25μ filter and

295 ALATZAS & FOUNDOULI Biol Res 42, 2009, centrifuged at 900g for 30 min. The pellet was suspended in Buffer A (without gum arabic), placed over Buffer B (50 mm Tris- HCl ph 8.0, 4 mm (CH3COOH) 2 Mg.4H 2 0, 1.2 M sucrose, 1 mm PMSF, 0.5% (v/v) DMSO and 5 mm β-mercaptoethanol) and centrifuged at 900g for another 30 min. Nuclei were washed with Buffer A (without gum arabic and Triton X-100), centrifuged at 900g and afterwards suspended in TBS (10 mm Tris-HCl ph 7.5, 150 mm NaCl) and centrifuged at 20,000g for 30 min. Histones were extracted as described by Murray and Key (1978). The pellet was suspended in 0.4 N H 2 SO 4, stirred for 1h and centrifuged at 20,000g for 30 min. Four volumes of cold ethanol were added to the supernatant and histones precipitated in approximately 48 h at 20 o C. The precipitant was washed with 70% ethanol, ethanol/ether (3/1, v/v) and acetone. Each step was followed by centrifugation at 20,000g for 30 min and was performed twice. The samples were vacuum dried and stored at 20oC. The amount of protein was determined with the method described by Lowry et al. (1951). Electrophoretic analysis of histone preparations Extracted proteins were initially analyzed on acetic acid-urea-containing polyacrylamide gels. Approximately 10 μg of total protein, diluted in loading buffer consisting of 1 M acetic acid, 6 M urea, 45 mm NH 4 OH and 15 mm β-mercaptoethanol, was loaded on the gel consisting of 16.5% (w/v) acrylamide, 0.1% (w/v) bis-acrylamide, 1 M acetic acid, 6 M urea, 45 mm NH 4 OH, 0.5% (v/v) TEMED and 0.027% (v/v) riboflavin and electrophoresis was performed at 210 V for approximately 1 h. Subsequently, histone variants and modified forms were separated in two-dimensional AUT/AUC-PAGE Figure 1: A longitudinal view of maize root: meristematic zone (2mm), elongation zone (2mm- 6mm) and differentiation zone (the rest of the root). The regions of sectioning are indicated, while (M), (E) and (D) are representative transversal sections of the meristematic, elongation and differentiation zones, respectively.

296 448 ALATZAS & FOUNDOULI Biol Res 42, 2009, (acetic acid-urea-triton X-100/acetic acidurea-cetyltrimethylammonium bromide [CTAB]) as described by Bonner et al. (1980). Approximately 50 μg of total protein was loaded on the first dimension gel, consisting of 12% (w/v) acrylamide, 0.1% (w/v) bis-acrylamide, 1 M acetic acid, 6 M urea, 0.625% (v/v) Triton X-100, 45 mm NH 4 OH, 0.5% (v/v) N,N,N,N -tetramethylethylenediamine (TEMED) and 0.027% (v/ v) riboflavin, the running buffer was 1 M acetic acid and 0.1 M glycine and electrophoresis was performed at 210 V for approximately 1 h. Afterwards, strips containing the samples were cut, stained with 0.1% Coomasie Brilliant Blue R-250 in 40% ethanol, 5% acetic acid and 0.1% (w/v) cysteamine for 5 min, destained in 20% ethanol, 5% acetic acid and 0.1% (w/v) cysteamine for 10 min and soaked in 1 M acetic acid, 5 mm NH 4 OH and 0.5% (w/v) cysteamine for 20 min. Each strip was placed on the top of a second dimension gel, consisting of 16.5% (w/v) acrylamide, 0.1% (w/v) bis-acrylamide, 1 M acetic acid, 6 M urea, 45 mm NH 4 OH, 0.5% (v/v) TEMED and 0.027% (v/v) riboflavin and 0.15% (w/v) CTAB was added to upper running buffer. The electrophoresis was performed at 210 V for approximately 2 h. Two-dimensional gels were stained with Coomasie Brilliant Blue R-250 or alternatively with silver nitrate (Wray et al., 1981). Western blotting Histone immunodetection was performed after electrophoresis and western blotting according to Towbin et al. (1979). Proteins from acetic acid-urea containing gels and two dimensional AUT/AUC-PAGE gels were transferred using buffer containing 0.7% (v/v) acetic acid, 20% methanol at 60 V for 1 h. Afterwards, membranes were washed twice in PBST (0.1% (v/v) Tween20 in PBS) and then incubated for 2 h in blocking solution (5% (w/v) non-fat dry milk in PBST). The antibodies employed were against histone H3 (monoclonal, a generous gift by Jockers-Wretou and co-workers, diluted 1: 5000) (Muller et al., 1985), histone H2B (polyclonal, a generous gift by Sekeri-Pataryas and co-workers, diluted 1: 100) (Sourlingas et al., 2003), histone H4 (polyclonal, Cell Signaling Technology, diluted 1: 2000), the phosphorylated and the acetylated forms of histone H3 (Cell Signaling Technology and Upstate Biotechnology respectively, both diluted 1: 2000) and the acetylated form of histone H4 (Serotek, diluted 1: 2000). Immunodetection of histone H2A and histone H1 have been described in detail elsewhere (Alatzas & Foundouli, 2006, Alatzas et al., 2008). The reaction was carried out at room temperature for 2 h. Following removal of excess antibody by washing three times with PBST, the membranes were incubated with the second antibody (horseradish peroxidase labeled goat anti-rabbit, diluted 1: 2000). After the washings as above, the immunoblots were visualized using enhanced chemiluminescence. Densitometry and statistical analysis After identifying histone variants by western blotting, the Coomasie- or silver nitratestained gels were scanned and analyzed by means of Gel Pro Analyzer 3.1 software (Media Cybernetics) as described elsewhere (Alatzas et al., 2008). The optical density of each spot representing histone variant was measured and its portion of total histone class in each sample was evaluated. Each sample was derived from an individual extraction and three independent experiments (i.e. plant material collection, histone extraction, electrophoresis and gel analysis) were performed for each of the developmental zones and callus cultures in order to examine the reproducibility of the results and to estimate the average and standard deviation of the quantification analysis. A Student s t-test, suitable for groups of data having different averages and variations, with an error probability of less than 5%, was applied in order to assess the statistical significance of the differences among the results. Immunohistochemistry Maize roots were embedded in paraffin according to Yang et al. (1991). Firstly, roots were fixed in phosphate solution

297 ALATZAS & FOUNDOULI Biol Res 42, 2009, ph=6.8 containing 100 mm NaCl, 4% (w/v) paraformaldehyde and 0.25% (v/v) glutaraldehyde. Afterwards, they were dehydrated and cleared in increasing concentration solutions of ethanol and xylene, respectively, and stained with 5% (w/v) safranin in 50% ethanol. Xylene was saturated with paraffin at RT, then at 42 o C and finally the vials were transferred at 60 o C and the mixture (xylene and paraffin) was replaced by melted and filtered paraffin. Paraffin was refreshed twice a day for the next ten days and after this, the vial contents (roots and paraffin) were transferred onto cold templates and stored at 4 o C. Ten-micrometer sections were taken by means of a microtome and placed onto glass slides which had previously been washed extensively, sterilized and coated with poly-l-lysine solution (0.01% (w/v) poly-l-lysine (Mol. Wt. 30,000-70,000, Sigma) in 10 mm Tris-HCl, ph=8). They were placed overnight onto a 42 o C surface and then in xylene, xylene/ethanol (1/1, v/ v) and ethanol and stored at 20 o C. Immunodetection of modified histone forms was performed in the same way as with PVDF membranes, except that the second antibody was alkaline phosphatase-labeled and that nitro blue tetrazolium (NBT) and 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) solutions diluted in alkaline phosphatase buffer (10 mm Tris-HCl ph 9.2, 100 mm NaCl, 50 mm MgCl 2 ) were used for detection. The antibodies employed were against the phosphorylated and the acetylated form of histone H3 (Cell Signaling Technology and Upstate Biotechnology, respectively) and the acetylated form of histone H4 (Serotek), all diluted 1: After detection, sections were dehydrated in increasing concentration solutions of ethanol, photographed by means of a digital camera and stored at RT. RESULTS Histone separation and immunodetection Histones were extracted from each of the three developmental zones of maize root in order to define possible alterations in histone variant distribution during plant cell differentiation. They were separated in acetic acid-urea containing polyacrylamide gels, where protein mobility is based on the mass/charge ratio and western blotting was performed with polyclonal antibodies against each histone class (Fig. 2). By means of specific antibodies, we identified two variants and two modified forms of histone H3, two variants of histone H2B, histone H4 and the acetylated form of H4. Linker histones were identified as two bands, one of them also recognized by the H1(A+B) antibody and the other by the H1 0 antibody, while two bands were recognized by the H2A antibody. Twodimensional AUT/AUC-PAGE (acetic acid-urea-triton X-100/acetic acid-urea- CTAB), as described by Bonner et al. (1980), was performed in order to separate histone variants and modified forms (Fig. Figure 2: A representative acetic acid-urea polyacrylamide gel and immunoblotting detection of the five histone classes and the modified forms of histone H3 and histone H4. The sample presented was derived from meristematic zone.

298 450 ALATZAS & FOUNDOULI Biol Res 42, 2009, A) and immunodetection was performed with antibodies recognizing the core histones H2B, H3 and H4. By means of these antibodies, we identified two variants of histone H2B (Fig. 3D), two variants of histone H3 and the modified forms in variant H3.2 (Fig. 3E) and histone H4 and the acetylated form of H4 (Fig. 3F). Immunodetection of linker histone H1 (Fig. 3B), histone H2A and the ubiquitinated form of H2A (Fig. 3C) has been described in detail elsewhere (Alatzas & Foundouli, 2006, Alatzas et al., 2008). A more detailed and representative twodimensional separation of each core histone variant in samples derived from either meristematic or differentiation zones is presented in Figure 4. Gel densitometry and quantification analysis After identifying histone classes, twodimensional gels were scanned and Figure 3: A representative two-dimensional acetic acid-urea-triton X-100/acetic acid-urea-ctab polyacrylamide gel (A) and immunoblotting detection of histone H1 (B), H2A (C), H2B (D), H3 (E) and H4 (F). The sample presented was derived from the differentiation zone of the root.

299 ALATZAS & FOUNDOULI Biol Res 42, 2009, analyzed by means of Gel Pro Analyzer 3.1 software, in order to indirectly estimate the ratio of each histone variant in maize root developmental zones. The optical density of each spot representing a histone variant or modified form was measured and its portion of total histone class in each sample was evaluated. Each sample was derived from an independent experiment and three samples from each of the developmental zones and callus cultures were analyzed in order to estimate the average and the standard deviation of the measurement. A Student t-test was applied to assess the statistical significance of the differences among the variant ratios. According to gel analysis, the distribution of histone H2A was altered in the developmental zones of maize root (see Fig. 5). A slight increase in the H2A.1 ratio and a significant decrease in the ubiquitinated H2A ratio were observed in samples from the differentiation zone, compared to samples from the two other zones. Histone H2A distribution pattern in callus cultures, with the exception of first callus culture, resembled the pattern of the meristematic zone; i.e. the H2A.1 and H2A.2 variants and the uh2a represented approximately 48%, 33% and 19%, respectively. In samples from first callus cultures derived from the differentiation zone, an increase in uh2a to above 27% was observed, which decreased to 19% of total H2A in the second and third callus subcultures, an observation discussed in detail elsewhere (Alatzas & Foundouli, 2006). The distribution of histone H2A was also altered in samples from roots treated with plant hormones. A significant increase, compared to samples from controls, was observed in main variant H2A.1 ratio to almost 65% in roots treated with auxin and to above 60% in roots treated with gibberellin, while the other variant H2A.2 ratio decreased to below 25% in both cases. The ubiquitinated H2A ratio decreased to approximately 13% regardless of the zone from which samples were derived, similar to the percentage of samples from the differentiation zone of untreated roots, with the exception of the meristematic zone of gibberellin-treated roots, where it remained at the level of controls i.e. approximately 20% of total H2A. Figure 4: Representative two-dimensional separation of each core histone variant in samples derived from either the meristematic (upper panel) or differentiation zone (lower panel). Histones H2A and H2B have two variants each (H2A.1, H2A.2 and H2B.1, H2B.2, respectively). Histone H3 also has two variants (H3.1 and H3.2) and two modified forms in H3.2 variant (unmodified, phosphorylated and phospho-acetylated forms of H3 are indicated by 0, 1 and 2, respectively). Finally, histone H4 has the unmodified and the acetylated form (indicated as ach4).

300 452 ALATZAS & FOUNDOULI Biol Res 42, 2009, Histone variants H2B.1 and H2B.2 represented approximately 60% and 40% of total H2B in samples from the meristematic and elongation zones, but these ratios changed to 53% and 47%, respectively, in the differentiation zone. In callus cultures, the H2B variant ratios were similar to the ratios observed in samples from the meristematic zone. Histone variant H2B.1 represented approximately 53% of total H2B in samples derived from the meristematic zone of roots treated with auxin and 60% in samples from the two other zones. In samples derived from the meristematic and differentiation zones of roots treated with gibberellin, the histone variant H2B.1 ratio also increased, compared to controls, while in samples derived from the elongation zone, each of H2B variants represented approximately 50% of total H2B (Fig. 6). According to gel analysis, histone H3 variant distribution is also altered during plant cell differentiation. A dramatic decrease in the H3.1 ratio was observed in the differentiation zone, where it represented only 18% of total H3, while in the meristematic and elongation zones, the ratio was approximately 30%. On the other hand, an increase in the H3.2 ratio, accompanied by a slight increase in the modified form ratio was observed in samples from the differentiation zone, compared to samples from the meristematic and elongation zones. Histone H3 variant distribution in callus cultures, in contrast to the other histone classes, was considerably different from that of the meristematic zone Figure 5: Histone H2A variants and ubiquitinated H2A ratio to total H2A in samples derived from the developmental zones of maize root (M: meristematic zone; E: elongation zone; D: differentiation zone), callus cultures derived from each zone (average of second and third callus subcultures) and from the developmental zones of roots treated with auxin and gibberellin. Each value, expressed as a percentage of total H2A, is the average of three independent experiments and bars indicate the standard deviation of the measurement. Values significantly different at p<0.05 from corresponding values measured in samples derived from the meristematic zone of control roots are indicated by asterisks.

301 ALATZAS & FOUNDOULI Biol Res 42, 2009, of controls. In samples derived from callus cultures, histone variant H3.1 represented approximately 25% of total H3, while in the meristematic and differentiation zones of the root the above ratio was 30% and 20%, respectively. On the other hand, the histone H3 modification levels in samples from callus cultures were similar to the levels obtained in the meristematic zone of controls. The histone variant H3.1 ratio increased in samples from roots treated with auxin compared to samples from control roots. According to Fig. 7, H3.1 variant represented 37% of total H3 in meristematic and differentiation zones, and more than 40% in the elongation zone, while this ratio was only 30% in the meristematic and elongation zones and below 20% in the differentiation zone of controls. A significant increase in the H3.1 ratio to approximately 33% was also observed in samples from the differentiation zone of roots treated with gibberillin compared to the differentiation zone of control roots, where it represented only 18% of total H3. In samples from the two other zones, The H3.1 variant ratio was similar to that of controls. On the other hand, the histone H3 modification level was also altered in samples derived from auxin- and gibberellin-treated roots, compared to controls. In particular, the phosphorylated H3 ratio increased slightly to approximately 40%, while the phosphoacetylated H3 ratio decreased significantly to approximately 10% in both cases, compared to almost 20% in samples from control roots. Figure 6: Histone H2B variant ratios to total H2B in samples derived from the developmental zones of maize root (M: meristematic zone; E: elongation zone; D: differentiation zone), callus cultures derived from each zone (average of first, second and third callus subcultures) and from the developmental zones of roots treated with auxin and gibberellin. Each value, expressed as a percentage of total H2B, is the average of three independent experiments and bars indicate the standard deviation of the measurement. Values significantly different at p<0.05 from corresponding values measured in samples derived from the meristematic zone of control roots are indicated by asterisks.

302 454 ALATZAS & FOUNDOULI Biol Res 42, 2009, Finally, the acetylated form of histone H4 represented approximately 42% of total H4 in samples derived from the meristematic zone and the portion decreased to 37% in samples from the two other zones. In samples from callus cultures, the acetylated H4 ratio was similar to the meristematic zone, regardless of the developmental zone calli were derived from. The distribution of acetylated histone H4 also changed during plant cell differentiation after both auxin and gibberellins treatment. According to gel analysis, in roots treated with auxin, acetylated, H4 ratio was approximately 37%, regardless of the developmental zone from which samples were derived, a pattern similar to the elongation and differentiation zone of control roots. In samples derived from gibberellin-treated roots, the acetylated H4 ratio decreased even more, to approximately 33% of total histone H4 (Fig. 8). Immunohistochemical detection of histone modified forms in maize root sections We used immunohistochemical detection in maize root sections in order to localize the cells containing the modified forms of core histones. In contrast to the meristematic and elongation zones, the cells within differentiation zone are known to form distinct tissues. Vascular cylinder, containing xylem, phloem and pith, are surrounded by pericycle, endodermis and Figure 7: Histone H3 variants and modified form ratios to total H3 in samples derived from the developmental zones of maize root (M: meristematic zone; E: elongation zone; D: differentiation zone), callus cultures derived from each zone (average of first, second and third callus subcultures) and from the developmental zones of roots treated with auxin and gibberellin. Each value, expressed as a percentage of total H3, is the average of three independent experiments and bars indicate the standard deviation of the measurement. Values significantly different at p<0.05 from corresponding values measured in samples derived from the meristematic zone of control roots are indicated by asterisks.

303 ALATZAS & FOUNDOULI Biol Res 42, 2009, cortex, while exodermis and epidermis are the exterior root tissues (Hochholdinger et al., 2004). We observed that histone modified forms examined in this study, the phosphorylated and the acetylated form of histone H3 and the acetylated form of histone H4, were present in every cell within the meristematic and elongation zones, while they were located only in pericycle and epidermis cells in the differentiation zone. These cells are known to retain their meristematic properties, contrary to the parenchymatic, nonproliferating cells of the cortex and pith (Hochholdinger et al., 2004), where almost no modified forms were detected (Fig. 9 E- L). The same pattern was also observed after immunodetection of the ubiquitinated H2A, as presented and discussed elsewhere (Alatzas and Foundouli, 2006). Detection without primary antibody was also performed in maize root sections in order to define any non-specific staining (Fig. 9 A, E and I). DISCUSSION Maize root is an appropriate biological system for developmental studies since it consists of three zones, which can be easily separated. The meristematic and elongation zones contain proliferating cells and primary root tissues respectively, whereas the differentiation zone consists mainly of parenchymatic, non-proliferating cells Figure 8: Histone H4 and acetylated H4 ratio to total H4 in samples derived from the developmental zones of maize root (M: meristematic zone; E: elongation zone; D: differentiation zone), callus cultures derived from each zone (average of first, second and third callus subcultures) and from the developmental zones of roots treated with auxin and gibberellin. Each value, expressed as a percentage of total H4, is the average of three independent experiments and bars indicate the standard deviation of the measurement. Values significantly different at p<0.05 from corresponding values measured in samples derived from the meristematic zone of control roots are indicated by asterisks.

304 456 ALATZAS & FOUNDOULI Biol Res 42, 2009, (Hochholdinger et al., 2004). On the other hand, it is well established that during callus formation, differentiated plant cells are transformed into callus culture cells that regain the ability for rapid proliferation (Koleva et al., 1982, Williams et al., 2003). It is also known that plant hormones like auxin and gibberellin play significant roles in root growth by promoting or inhibiting root differentiation. Apart from morphological differences observed between control roots and roots treated with auxin or gibberellin (see Figure 10), physiological and biochemical differences also exist, induced by exogenous applied plant hormones (Raghavan, 1999). According to the results presented in this study and elsewhere (Alatzas and Foundouli, 2006, Alatzas et al., 2008), histone variant distribution is altered among developmental root zones, particularly between the meristematic and differentiation zones. There are variants like H10 (Alatzas et al., 2008), H2A.1 (Fig. 5), H2B.2 (Fig. 6) and Figure 9: Immunohistochemical detection of core histone modified forms in maize root sections from the meristematic (sections A-D) and differentiation zones (sections E-L). Detection without primary antibody was performed in maize root sections as negative controls (sections A, E and I). The phosphorylated (sections B, F and J) and the acetylated forms of histone H3 (sections C, G and K) and the acetylated form of histone H4 (sections D, H and L) are present in every cell of the meristematic zone, while in the differentiation zone they are only located in pericycle and epidermis cells and absent in parenchymatic cells, e.g. cortex and pith. The sections from the meristematic zone presented were taken at approximately at 1mm from the root tip, while the sections from the differentiation zone were taken at approximately 1cm from the root tip (ep: epidermis; co: cortex; pe: pericycle; pi: pith).