ΟΔΗΓΟΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΩΝ ΑΣΚΗΣΕΩΝ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗΣ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ

Transcript

1 ΕΘΝΙΚΟ ΜΕΤΣΟΒΙΟ ΠΟΛΥΤΕΧΝΕΙΟ ΣΧΟΛΗ ΧΗΜΙΚΩΝ ΜΗΧΑΝΙΚΩΝ ΤΟΜΕΑΣ ΣΥΝΘΕΣΗΣ & ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΒΙΟΜΗΧΑΝΙΚΩΝ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΩΝ ΟΔΗΓΟΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΩΝ ΑΣΚΗΣΕΩΝ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗΣ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ 9 o Εξάμηνο Σπουδών Ευάγγελος Τόπακας Επικ. Καθηγητής ΕΜΠ Νικόλαος Τσουκιάς Αναπλ. Καθηγητής ΕΜΠ ΑΘΗΝΑ 2018

2

3 Πρόλογος Το παρόν εγχειρίδιο έχει ως σκοπό την υποστήριξη των Εργαστηριακών Ασκήσεων που πραγματοποιούνται στο πλαίσιο του μαθήματος Εφαρμοσμένη Βιοτεχνολογία του 9 ου Εξαμήνου του Προγράμματος Σπουδών της Σχολής Χημικών Μηχανικών του Ε.Μ.Π.. Το πρώτο μέρος του Οδηγού περιέχει μια συνοπτική εισαγωγή στον τρόπο με τον οποίο είναι σχεδιασμένο και λειτουργεί το υπολογιστικό πρόγραμμα Copasi. Οι οδηγίες που περιλαμβάνει σε συνδυασμό με τις επιμέρους ασκήσεις προσομοίωσης που παρατίθενται στη συνέχεια μπορούν να βοηθήσουν το φοιτητή να αξιοποιήσει ένα λογισμικό εργαλείο με το οποίο επιτυγχάνεται η μοντελοποίηση μεταβολικών οδών. Το δεύτερο μέρος του Οδηγού αφορά σε βασικές οδηγίες χρήσης του λογισμικού απεικόνισης μοριακών δομών PyMOL v0.99 της εταιρείας DeLano Scientific LLC. Το πρόγραμμα αυτό αξιοποιεί πλήρως τις υπολογιστικές δυνατότητες ενός προσωπικού υπολογιστή παρέχοντας την απεικόνιση πρωτεϊνικών αλλά και γενικότερα οργανικών μορίων σε τρεις διαστάσεις καθιστώντας το εργαλείο απαραίτητο στη σύγχρονη Βιοτεχνολογία και Δομική Βιολογία. Στο πλαίσιο των εργαστηριακών μαθημάτων οι φοιτητές θα μάθουν τις βασικές λειτουργίες του λογισμικού εστιάζοντας περισσότερο στην κατανόηση της δομής των πρωτεϊνών και ειδικότερα των ενζύμων τα οποία αποτελούν και βασικό κομμάτι της Εφαρμοσμένης Βιοτεχνολογίας. Στο τρίτο μέρος του Οδηγού, πραγματοποιείται μια σύντομη περιγραφή Βιοπληροφορικών εργαλείων όπως η ευθυγράμμιση/στοίχιση αλληλουχιών αλλά και της αξιοποίησης της βάσης δεδομένων του NCBI για τη αναζήτηση πληροφοριών σε γενωμικές βιβλιοθήκες, δημιουργία φυλογενετικών δένδρων αλλά και το σχεδιασμό εκκινητών για PCR. Το σύγγραμμα αυτό παρέχεται και σε ηλεκτρονική μορφή στην ιστοσελίδα του μαθήματος Εφαρμοσμένη Βιοτεχνολογία υπό τη μορφή αρχείου *.pdf για να είναι δυνατή η κατανόηση σχημάτων με χρώμα. Κάθε παρατήρηση σχετικά με το περιεχόμενο του οδηγού αυτού είναι ευπρόσδεκτη, έτσι ώστε να προσφέρουμε ένα συνεχώς βελτιωμένο σύγγραμμα που θα ανταποκρίνεται στις ανάγκες των σπουδαστών της Σχολής.

4

5 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ 2 ΟΔΗΓΟΣ ΠΡΟΣΟΜΟΙΩΣΕΩΝ ΓΙΑ ΤΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ COPASI 3 1. ΣΥΝΟΠΤΙΚΗ ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ 4 2. ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΤΟΥ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΟΣ 5 ΓΕΝΙΚΕΣ ΡΥΘΜΙΣΕΙΣ ΜΟΝΤΕΛΟΥ 6 ΔΙΑΜΕΡΙΣΜΑΤΑ (COMPARTMENTS) 8 ΕΙΔΗ (SPECIES) 11 ΑΝΤΙΔΡΑΣΕΙΣ (REACTIONS) 15 ΠΡΟΒΟΛΗ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ (PARAMETER VIEW) 19 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΕΣ ΚΑΘΟΡΙΣΜΕΝΕΣ ΑΠΟ ΤΟ ΧΡΗΣΤΗ (USER DEFINED PARAMETERS) 20 ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ 22 ΠΡΟΚΑΘΟΡΙΣΜΕΝΕΣ ΑΝΑΦΟΡΕΣ (PREDEFINED REPORTS) 22 ΒΟΗΘΟΣ ΕΞΑΓΩΓΗΣ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ (OUTPUT ASSISTANT) 23 ΑΝΑΦΟΡΕΣ (REPORTS) 24 ΕΡΓΑΣΙΕΣ (TASKS) 26 ΑΝΑΛΥΣΗ ΣΤΑΘΕΡΗΣ ΚΑΤΑΣΤΑΣΗΣ (STEADY-STATE ANALYSIS) 26 ΠΡΟΣΟΜΟΙΩΣΗ ΜΕΛΕΤΗΣ ΧΡΟΝΟΥ (TIME COURSE SIMULATION) 26 ΔΟΥΛΕΥΟΝΤΑΣ ΜΕ ΓΡΑΦΗΜΑΤΑ (PLOTS) 28 ΑΝΑΛΥΣΗ ΜΕΤΑΒΟΛΙΚΟΥ ΕΛΕΓΧΟΥ (METABOLIC CONTROL ANALYSIS, MCA) 29 1Η ΑΣΚΗΣΗ 32 ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΒΙΟΜΕΤΑΤΡΟΠΗ ΑΠΟ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ 32 2Η ΑΣΚΗΣΗ 36 ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΜΕ ΚΙΝΗΤΙΚΗ MICHAELIS-MENTEN 36 3Η ΑΣΚΗΣΗ 40 ΣΥΝΑΓΩΝΙΣΤΙΚΗ ΚΑΙ ΜΗ ΣΥΝΑΓΩΝΙΣΤΙΚΗ ΠΑΡΕΜΠΟΔΙΣΗ ΤΗΣ ΔΡΑΣΗΣ ΕΝΖΥΜΩΝ 40 4Η ΑΣΚΗΣΗ 44 ΚΥΚΛΟΣ ΤΟΥ ΓΛΥΟΞΥΛΙΚΟΥ ΟΞΕΟΣ 44 ΒΑΣΙΚΕΣ ΟΔΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ PYMOL ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΔΥΝΑΤΟΤΗΤΕΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΟΣ ΕΓΚΑΤΑΣΤΑΣΗ ΣΕ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝ MS WINDOWS ΤΑ ΠΑΡΑΘΥΡΑ ΤΟΥ PYMOL ΧΕΙΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΕΙΚΟΝΑΣ ΧΕΙΡΙΣΜΟΣ ΒΑΣΙΚΩΝ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΩΝ ΤΟΥ PYMOL ΜΕΣΩ ΕΣΩΤΕΡΙΚΟΥ GUI ΕΝΤΟΛΕΣ ΤΟΥ ΜΕΝΟΥ COLOR ΧΡΗΣΙΜΕΣ ΕΝΤΟΛΕΣ ΕΞΩΤΕΡΙΚΟΥ GUI ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΚΑΙ ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ ΥΨΗΛΗΣ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ ΕΙΚΟΝΩΝ 80 ΔΡΑΣΤΗΡΙΟΤΗΤΑ 1 Η 81 ΑΠΕΙΚΟΝΙΣΗ Α-ΑΜΥΛΑΣΗΣ, ΞΥΛΑΝΑΣΗΣ ΚΑΙ ΕΣΤΕΡΑΣΗΣ ΤΟΥ ΦΕΡΟΥΛΙΚΟΥ ΟΞΕΟΣ 81 ΔΡΑΣΤΗΡΙΟΤΗΤΑ 2 Η 84 1

6 ΑΠΕΙΚΟΝΙΣΗ ΞΥΛΑΝΑΣΩΝ GH10 ΚΑΙ GH11 ΚΑΙ ΑΡΑΒΙΝΟΦΟΥΡΑΝΟΖΙΔΑΣΗΣ GH54 84 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ ΒΙΟΠΛΗΡΟΦΟΡΙΚΗΣ ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΕΥΘΥΓΡΑΜΜΙΣΗ/ΣΤΟΙΧΙΣΗ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΩΝ (SEQUENCE ALIGNMENT) ΦΥΛΟΓΕΝΕΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Η ΠΡΩΤΕΪΝΗ ΤΗΣ ΑΙΜΟΓΛΟΒΙΝΗΣ ΟΙ ΒΑΣΕΙΣ ΔΕΔΟΜΕΝΩΝ ΤΟΥ NCBI 92 ΔΡΑΣΤΗΡΙΟΤΗΤΑ 1 Η 93 ΕΥΡΕΣΗ ΓΟΝΙΔΙΩΝ/ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΑΠΟ ΒΑΣΕΙΣ ΔΕΔΟΜΕΝΩΝ 93 ΔΡΑΣΤΗΡΙΟΤΗΤΑ 2 Η 99 ΕΥΘΥΓΡΑΜΜΙΣΗ ΚΑΙ ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΓΟΝΙΔΙΩΝ/ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ 99 ΔΡΑΣΤΗΡΙΟΤΗΤΑ 3 Η 102 ΔΗΜΙΟΥΡΓΙΑ ΦΥΛΟΓΕΝΕΤΙΚΩΝ ΔΕΝΤΡΩΝ 102 ΔΡΑΣΤΗΡΙΟΤΗΤΑ 4 Η 104 ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ ΕΚΚΙΝΗΤΩΝ (PRIMERS) ΓΙΑ PCR 104 2

7 ΟΔΗΓΟΣ ΠΡΟΣΟΜΟΙΩΣΕΩΝ ΓΙΑ ΤΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ COPASI 3

8 1. Συνοπτική περιγραφή Το πρόγραμμα COPASI χρησιμοποιείται ευρέως σε πολλά ερευνητικά έργα για: Τη μοντελοποίηση βιολογικών, βιοχημικών και χημικών συστημάτων, Την ανάπτυξη θεωρητικών και υπολογιστικών μεθόδων Την ανάπτυξη εργαστηριακών μεθόδων Το COPASI είναι διαθέσιμο σε δύο εκδόσεις. Η πρώτη (CopasiUI) περιέχει GUI προσφέροντας διαδραστικότητα και η δεύτερη έκδοση (CopasiSE) χωρίς GUI για τη μαζική επεξεργασία αρχείων. Και οι δύο εκδόσεις υποστηρίζουν το ίδιο σύνολο παραμέτρων γραμμής εντολών, αν και μερικές δεν έχουν νόημα για την έκδοση GUI και επομένως αγνοούνται. Το πρόγραμμα COPASI επιτρέπει τη μελέτη της κινητικής μεμονωμένων ενζυμικών αντιδράσεων, ή ενός συνόλου αντιδράσεων που ανήκουν σε ένα μεταβολικό δρόμο αφιερώνοντας ελάχιστο χρόνο στην εκμάθηση του προγράμματος και μηδενική επένδυση στην επίλυση διαφορικών εξισώσεων. Το τελευταίο είναι εφικτό αφού το COPASI λειτουργεί με τρόπο που δεν απαιτεί την πλήρη (μαθηματική) περιγραφή των εξισώσεων ισορροπίας των αντιδράσεων που μετέχουν στο μοντέλο. Οι απαιτήσεις του περιορίζονται κυρίως στη γνώση της στοιχειομετρίας των αντιδράσεων του μεταβολικού δρόμου, την επιλογή από ένα τυποποιημένο σύνολο των εξισώσεων που περιγράφουν την κινητική τους και την εισαγωγή των τιμών των κινητικών σταθερών των εμπλεκόμενων ενζύμων. Με βάση τα προηγούμενα δεδομένα, το πρόγραμμα χρησιμοποιεί μεθόδους αριθμητικής ανάλυσης για να κατασκευάσει αυτόματα τις απαιτούμενες εξισώσεις και να τις επιλύσει. Αποτέλεσμα της επίλυσης είναι ο προσδιορισμός των συγκεντρώσεων όλων των μεταβολιτών, καθώς και των ροών τους στις διάφορες κατευθύνσεις του μεταβολικού δρόμου. Η επίλυση μπορεί να αφορά είτε στην εξέλιξη του βιοχημικού συστήματος σε συνάρτηση με το χρόνο (time course simulation), είτε στην εύρεση μιας σταθερής κατάστασης κοντά στο σημείο εκκίνησης του μοντέλου (steady state). Η σχετική απλότητα του προγράμματος έχει συμβάλλει στην εκτεταμένη χρήση του για εκπαιδευτικούς σκοπούς. Το COPASI επιτρέπει την αλλαγή των τιμών μιας ή περισσοτέρων παραμέτρων του μοντέλου με άμεση παρατήρηση των επιπτώσεών τους στις μεταβλητές του συστήματος. Έτσι το COPASI είναι ιδιαίτερα ελκυστικό 4

9 στο χρήστη, δεδομένου ότι επιτρέπει την εκμάθηση των βασικών αρχών που εμπλέκονται στη ρύθμιση του μεταβολισμού με εύκολο και γρήγορο τρόπο. Προς την κατεύθυνση αυτή συνεισφέρει σημαντικά και η επεξήγηση των κύριων εννοιών του μεταβολισμού που επεξηγούνται στον ιστότοπο του προγράμματος ( Εκτός από τη χρήση του σε εκπαιδευτικές δραστηριότητες, το COPASI έχει αξιοποιηθεί από ερευνητές ως εργαλείο πειραματικού σχεδιασμού επιτρέποντας τη μελέτη των πιθανών αποτελεσμάτων ενός πειράματος και την αποφυγή άλλων πειραμάτων αμφίβολης σκοπιμότητας χωρίς να καταναλωθεί χρόνος και αντιδραστήρια στο εργαστήριο. 2. Λειτουργία του προγράμματος Η αρχική εικόνα που εμφανίζεται στο χρήστη με το άνοιγμα του προγράμματος COPASI έχει την ακόλουθη μορφή: Εικόνα 1: Έναρξη προγράμματος COPASI Το γραφικό περιβάλλον του COPASI αποτελείται από τέσσερα βασικά στοιχεία. Στην κορυφή του κεντρικού παραθύρου, υπάρχει η μπάρα του μενού (menu bar) (στην περίπτωση των Mac η ίδια μπάρα βρίσκεται στην κορυφή της οθόνης). Κάτω από αυτή υπάρχει ένα μενού εργαλείων με βασικές εντολές, όπως άνοιγμα αρχείου ή αποθήκευση. Το υπόλοιπο παράθυρο εργασίας χωρίζεται κάθετα σε δύο τμήματα από μία μπάρα. Το μέγεθος των δύο 5

10 επιμέρους τμημάτων μπορεί να τροποποιηθεί από τη μπάρα αυτή που τα χωρίζει. Το αριστερό τμήμα αποτελεί το «δέντρο των αντικειμένων» (object tree), το οποίο παρουσιάζει το πρόσφατο μοντέλο στο οποίο δουλεύεις, καθώς και τις εντολές που μπορείς να πραγματοποιήσεις σε αυτό. Ανάλογα με το επιλεχθέν αντικείμενο του «δέντρου» στο αριστερό τμήμα, εμφανίζονται οι αντίστοιχες επιλογές στο δεξί τμήμα του παραθύρου, προκειμένου να επιτρέπεται κάθε φορά η τροποποίηση και το «τρέξιμο» του αντικειμένου αυτού. Εφόσον ο χρήστης ανοίξει το COPASI χωρίς κάποια γραμμή εντολής, τότε το πρόγραμμα θα ανοίξει ένα καινούργιο μοντέλο. Αντίστοιχα θα επιλεγεί η βάση του object tree και στο δεξί τμήμα του παραθύρου θα εμφανιστεί το λογότυπο του COPASI. Το δέντρο διαθέτει πέντε κλαδιά, πέρα από το στοιχείο της βάσης. Το πρώτο περιέχει όλα τα αντικείμενα που ανήκουν στο τρέχον μοντέλο. Το δεύτερο και το τρίτο κλαδί περιέχει όλες της εντολές που μπορεί να εκτελέσει το πρόγραμμα, το τέταρτο περιέχει τα διαφορετικά στοιχεία εξόδου που μπορεί να διαχειριστεί, ενώ το τελευταίο κλαδί περιέχει όλες τις ορισμένες εξισώσεις κινητικών. Αυτές περιλαμβάνουν τόσο τις κινητικές που είναι ήδη αποθηκευμένες στο πρόγραμμα, όσο και αυτές που έχει εισάγει ο χρήστης. Εφόσον τώρα επιλεγεί το κλαδί που απεικονίζει το μοντέλο (model branch), το δεξί τμήμα της οθόνης θα αλλάξει έτσι ώστε να εμφανιστεί ένα παράθυρο που σου επιτρέπει να κάνεις τροποποίηση του μοντέλου σου (model settings). Στη συνέχεια περιγράφονται οι ξεχωριστοί διάλογοι που μπορούν να εμφανιστούν επιλέγοντας διαφορετικά κλαδιά του δέντρου. Μέσω αυτής της περιγραφής μπορεί να μάθει ο αναγνώστης πως να σχεδιάζει ένα νέο μοντέλο στο COPASI και να τρέχει διαφορετικές εντολές σε αυτό. Γενικές ρυθμίσεις μοντέλου Αν επιλεχθεί το κλαδί του object tree που απεικονίζει το μοντέλο (model branch), όπως αναλύθηκε στην προηγούμενη παράγραφο, ενεργοποιείται ένας διάλογο που επιτρέπει να ορίζει ο χρήστης συγκεκριμένες μεταβλητές για το μοντέλο του, όπως η ονομασία του και οι μονάδες που θα χρησιμοποιηθούν για τα μεγέθη του χρόνου, του όγκου και της συγκέντρωσης. Επίσης μπορεί να δώσει μία γραπτή περιγραφή του μοντέλου του, η οποία είναι πιο 6

11 επεξηγηματική από τις αντιδράσεις και τις εξισώσεις. Έτσι μπορεί να περιγραφεί για παράδειγμα ποιο τμήμα του μεταβολισμού περιγράφεται από το μοντέλο (π.χ γλυκόλυση), καθώς και να προστεθούν ορισμένες αναφορές από σχετικές δημοσιεύσεις. Αυτό θα διευκολύνει τον αναγνώστη του μοντέλου (και το χρήστη/ σχεδιαστή του μοντέλου) να καταλάβει και να αναγνωρίσει τα μοντέλα. Εικόνα 2: Γενικές ρυθμίσεις μοντέλου Προσοχή: Πρέπει ο χρήστης να γνωρίζει πως αλλάζοντας τις ορισμένες από το πρόγραμμα μονάδες, αλλάζει ουσιαστικά το μοντέλο του. Αν, για παράδειγμα, αλλάξει τις μονάδες του όγκου από liters σε milliliters, όλοι οι αντίστοιχοι αριθμοί στο μοντέλο πολλαπλασιάζονται αυτόματα με τον παράγοντα Το COPASI, βάσει του κώδικά του, αντιστοιχίζει μεγέθη από ένα είδος (species) με αριθμό σωματιδίων (particle numbers). Αν μία συγκέντρωση πρέπει να παρουσιαστεί στην οθόνη ή χρειάζεται για την εξαγωγή κάποιας μεταβλητής, τότε αυτή υπολογίζεται από τον αριθμό των σωματιδίων, τον όγκο του διαμερίσματος (compartment) στον οποίο εντοπίζεται το συγκεκριμένη είδος και τον αριθμό Avogadro. Ας υποθέσουμε λοιπόν πως οι μονάδες όγκου έχουν οριστεί σε fl και η μονάδα της ποσότητας σε nmol και το είδος A δίνεται σε ποσότητα. Υποθέτοντας περαιτέρω πως ο όγκος του διαμερίσματος που περιέχει το A έχει οριστεί σε 1.0 fl, θα έχουμε τελικά τη συγκέντρωση 7

12 για το είδος A. Εφόσον η μονάδα μέτρησης της ποσότητας έχει οριστεί σε nmol αντί για mol θα πρέπει να πολλαπλασιαστεί το αποτέλεσμα με. Τότε το COPASI θα παρουσίαζε τη συγκέντρωση. Είναι εύκολο να αλλάξει κανείς την παρουσίαση των μεγεθών από αριθμό σωματιδίων σε συγκεντρώσεις με την επιλογή της αντίστοιχης λίστας από τη μπάρα του μενού στην κορυφή του παραθύρου. Το COPASI, από μόνο του, παρουσιάζει τα μεγέθη ως συγκεντρώσεις. Επιλέγοντας τη λίστα Rate Law Interpretation, μπορεί ο χρήστης να ορίσει πως θα ερμηνεύει το πρόγραμμα τους κανόνες κινητικής που έχει καθορίσει για τις αντιδράσεις. Εξ ορισμού, το COPASI θα ερμηνεύσει όλους τους κανόνες ως ντετερμινιστικούς κανόνες. Εφόσον το COPASI επιτρέπει στο χρήστη να προσομοιάζει ένα μοντέλο είτε ντετερμινιστικά είτε στοχαστικά, το πρόγραμμα πρέπει να κάνει ορισμένες διορθώσεις στους ντετερμινιστικούς κανόνες, όταν αυτοί χρησιμοποιούνται για μία στοχαστική προσομοίωση. Αυτή η λειτουργία ορισμένες φορές παρεμποδίζεται από κανόνες που έχουν γραφτεί για μία στοχαστική προσομοίωση και συνεπώς οι προηγούμενες διορθώσεις έχουν γίνει ήδη από το χρήστη. Επομένως, αν ένα μοντέλο έχει κανόνες που προορίζονται για στοχαστική προσομοίωση, θα πρέπει αυτό να συγκεκριμενοποιηθεί στο πρόγραμμα επιλέγοντας «stochastic» από την αντίστοιχη λίστα. Εφόσον γίνει αυτό, το COPASI δεν θα εφαρμόσει διορθώσεις στους κανόνες του μοντέλου καθώς θα τρέχει μία στοχαστική προσομοίωση. Διαμερίσματα (Compartments) Στο COPASI, τις περισσότερες φορές, υπάρχουν πολλοί τρόποι για να εκτελεστεί μία εργασία και απλά ο χρήστης επιλέγει αυτόν που προτιμά. Αυτό ισχύει ιδιαίτερα στην περίπτωση ορισμού των αντικειμένων του μοντέλου. Αν πρόκειται απλά για ένα μοντέλο που έχει ένα μόνο διαμέρισμα κατά πάσα πιθανότητα δε θα χρειαστεί καν να προστεθούν λεπτομέρειες για το συγκεκριμένο διαμέρισμα, αλλά θα επανέλθουμε σε αυτό στις παραγράφους Είδη (Species) και Αντιδράσεις (Reactions). 8

13 Αν και δε θα χρειαστεί πιθανότατα να προστεθούν διαμερίσματα πολύ συχνά, είναι χρήσιμο να γνωρίζει κανείς πως γίνεται, ειδικά δεδομένου του ότι η προσθήκη άλλων συστατικών του μοντέλου όπως «Είδη» και «Αντιδράσεις» λειτουργεί με την ίδια λογική. Υπάρχουν τρεις τρόποι για να προστεθεί ένα νέο διαμέρισμα σε ένα μοντέλο, ωστόσο και για τους τρεις πρέπει να μεταφερθεί κανείς στο κλαδί των διαμερισμάτων (Compartments branch) του δέντρου αντικειμένων που βρίσκεται κάτω από το κλαδί «Model Biochemical». Οπότε αρχικά πρέπει να επιλεχθεί το κλαδί του μοντέλου (Model branch) και από εκεί το κλαδί της βιοχημείας του μοντέλου (Biochemical branch) κλικάρωντας πάνω στο βελάκι πριν από το όνομα Biochemical ή με διπλό κλικ πάνω στο όνομα αυτό. Εικόνα 3: Άδειος πίνακας ενός διαμερίσματος Ξεκινώντας ένα καινούργιο μοντέλο και επιλέγοντας το κλαδί διαμερισμάτων (Compartments branch) θα εμφανιστεί στην οθόνη ένας άδειος πίνακας με οχτώ στήλες (βλ. την παραπάνω εικόνα). Οι στήλες αυτές έχουν τα εξής ονόματα: «#», «Name», «Type Initial Volume», «Volume», «Rate», «Initial Expression» και «Expression». Η στήλη # περιέχει τον δείκτη ενός συγκεκριμένου διαμερίσματος του μοντέλου. Πρέπει να σημειωθεί πως ο δείκτης του νέου διαμερίσματος δεν δίνεται, παραπέμποντας στο ότι αυτό το διαμέρισμα δεν αποτελεί τμήμα του μοντέλου. Η στήλη «Name» αφορά το κανονικό όνομα του διαμερίσματος. Η στήλη «Type» διευκρινίζει πως καθορίζεται ο μεταβλητός όγκος ενός διαμερίσματος, ενώ η «Initial Volume» και η στήλη «Volume» απεικονίζει τον όγκο του διαμερίσματος πριν και μετά τους υπολογισμούς που πραγματοποιεί το πρόγραμμα κάθε φορά, αντίστοιχα. 9

14 Αυτές οι δύο τιμές, οι οποίες ορίζονται στο παράθυρο διαλόγου «model settings», πρέπει να είναι οι ίδιες αν στη στήλη «Type» το είδος του διαμερίσματος έχει οριστεί σε «fixed». Η στήλη «Rate» δείχνει το ρυθμό αλλαγής του διαμερίσματος (έχει οριστεί από έναν μαθηματικό υπολογισμό). Η στήλη «Initial Expression» και «Expression» παρουσιάζει τις μαθηματικές εκφράσεις που χρησιμοποιούνται για τον υπολογισμό του αρχικού όγκου του διαμερίσματος και του μεταβλητού αντίστοιχα. Αυτές οι στήλες είναι άδειες, εφόσον δεν έχει οριστεί καμία μαθηματική σχέση για τα παραπάνω μεγέθη. Ο πιο προφανής τρόπος για να προστεθεί ένα διαμέρισμα είναι μέσα από το κουμπί «New» στον πάτο του παραθύρου. Έτσι θα δημιουργηθεί ένα νέο διαμέρισμα το οποίο θα προστεθεί στον παραπάνω πίνακα με το δείκτη #1. Εικόνα 4: Πίνακας διαμερίσματος που περιέχει ένα διαμέρισμα Οποιοδήποτε διαμέρισμα έχει δημιουργηθεί μπορεί να διαγραφεί επιλέγοντας από τον πίνακα ολόκληρη τη γραμμή του διαμερίσματος (που δείχνει δηλαδή το δείκτη του διαμερίσματος), είτε κλικάρωντας το κελί # που περιέχει το δείκτη του διαμερίσματος που επιθυμεί να διαγράψει κανείς και πατώντας το κουμπί «Delete». Αυτή η διαγραφή εκτελείται αμέσως αν δεν πρόκειται να επηρεάσει τα υπόλοιπα περιεχόμενα του μοντέλου. Αν πάλι υπάρχουν επιρροές, όπως η διαγραφή ορισμένων ειδών του μοντέλου, εμφανίζεται ένα παράθυρο διαλόγου στην οθόνη, ενημερώνοντας το χρήστη για τις τυχόν μεταβολές και ρωτώντας κατά πόσο θέλει να προχωρήσει με την αλλαγή ή να ακυρώσει τη διαγραφή του διαμερίσματος. Η επιλογή «Διαγραφή όλων» (Delete All) είναι ένας εύκολος τρόπος διαγραφής όλων των διαμερισμάτων. Με αυτή όλα τα διαμερίσματα θα διαγραφούν και θα εμφανιστεί ένα παράθυρο επιβεβαίωσης για κάθε 10

15 διαμέρισμα, του οποίου η διαγραφή έχει επιπλέον συνέπειες στο συνολικό μοντέλο. Ο χρήστης μπορεί να ακυρώσει ή να επιβεβαιώσει κάθε επιμέρους διαγραφή διαμερίσματος. Ο πιο βολικός τρόπος για να προσθέσει κανείς ένα διαμέρισμα είναι να τροποποιήσει οποιοδήποτε κελί που αντιστοιχεί σε αυτό από τον πίνακα. Για παράδειγμα το κελί του ονόματος «Name» μπορεί να τροποποιηθεί ώστε να αποκτήσει άλλο όνομα του εν λόγω διαμέρισμα. Από τη στιγμή που μεταφέρεται σε άλλο κελί, είτε πατώντας το «return» είτε το δεξί κλικ, είτε απλά πατώντας κάτι άλλο στον πίνακα, οι πληροφορίες για το νέο διαμέρισμα προστίθενται στο μοντέλο και μία νέα σειρά, που αντιστοιχεί στο νέο μοντέλο προστίθεται στον πίνακα. Συγκεκριμένα, πατώντας το κουμπί «return» αφού πληκτρολογηθεί το όνομα του διαμερίσματος, οδηγεί κατευθείαν στην επόμενη σειρά όπου μπορεί κανείς, εφόσον το θελήσει, να συνεχίσει να προσθέτει διαμερίσματα. Ο τρίτος τρόπος να προσθέσει κανείς ένα καινούργιο διαμέρισμα είναι να κλικάρει δύο φορές πάνω σε μία άδεια σειρά του πίνακα. Η διαδικασία αυτή είναι ουσιαστικά η ίδια με το να επιλέξει το κουμπί «New» και να κλικάρει δύο φορές στην εισαγωγή στοιχείων στο νέο διαμέρισμα. Είδη (species) Η προσθήκη νέων ειδών (species) γίνεται με τον ίδιο ακριβώς τρόπο όπως η προσθήκη νέου διαμερίσματος (compartment), οπότε προτείνεται να γίνει η ανάγνωση της παραγράφου αυτής πρώτα (αν δεν έχει γίνει ήδη). Στην προκείμενη παράγραφο θα καλυφθούν οι διαφορές μεταξύ της προσθήκης νέου διαμερίσματος και νέου είδους. 11

16 Εικόνα 5: Πίνακας ειδών με νέα καταχώρηση Αρχικά, για να γίνει η προσθήκη νέων ειδών πρέπει να γίνει η επιλογή του κλάδου Species στο object tree (αριστερά) που βρίσκεται στο «Model Biochemical branch» ακριβώς κάτω από το «Compartments». Στην περίπτωση αυτή εμφανίζεται ένας πίνακας (βλέπε εικόνα παραπάνω), ο οποίος αποτελείται από εννέα στήλες. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι ένα είδος έχει περισσότερες παραμέτρους από ότι ένα διαμέρισμα. Οι στήλες «Status» και «Name» θα πρέπει ήδη να είναι γνώριμες από τον αντίστοιχο πίνακα των διαμερισμάτων. Οι υπόλοιπες στήλες προσδιορίζουν το διαμέρισμα στο οποίο βρίσκεται το κάθε είδος, τον τρόπο με τον οποίο υπολογίζεται η συγκέντρωσή του, την αρχική και μεταβατική συγκέντρωσή του, τον ρυθμό μεταβολής του, όπως επίσης και δύο μαθηματικές εκφράσεις που χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό της αρχικής και μεταβατικής συγκέντρωσης, αντίστοιχα. Για νεοδημιουργηθέντα είδη ο ρυθμός θα παραμένει κενός έως ότου χρειαστεί να υπολογιστεί για πρώτη φορά, π.χ. κατά τη διάρκεια μιας «time course simulation». Όταν προστίθεται ένα νέο είδος και στο μοντέλο δεν έχουν προσδιοριστεί ακόμα τα διαμερίσματα, το COPASI θα προσθέτει αυτόματα ένα νέο διαμέρισμα στο μοντέλο και τα είδη θα τοποθετούνται στο διαμέρισμα αυτό. Όταν έχουν ήδη προσδιοριστεί ένα ή περισσότερα διαμερίσματα, τα είδη θα τοποθετούνται στο πρώτο διαμέρισμα που υπάρχει στη λίστα. Αυτό μπορεί να αλλάξει αργότερα. Για την προσθήκη νέου είδους υπάρχουν οι ίδιοι τρεις τρόποι όπως και για την προσθήκη νέου διαμερίσματος (βλέπε προηγούμενες παραγράφους). 12

17 Εικόνα 6: Διάλογος για αλλαγή των παραμέτρων ενός είδους Η επεξεργασία των παραμέτρων ενός είδους λειτουργεί επίσης με ακριβώς τον ίδιο τρόπο όπως για τα διαμερίσματα. Είτε γίνεται διπλό κλικ στην καταχώρηση ενός είδους στον πίνακα, είτε χρησιμοποιείται το object tree ώστε να επιλεγεί το συγκεκριμένο είδος προς επεξεργασία. Οι παράμετροι ενός είδους που βρίσκονται κάτω από τη διαχωριστική γραμμή προσδιορίζονται αυτόματα και δεν μπορούν να αλλάξουν από τον χρήστη. Οι παράμετροι που δύνανται να αλλαχτούν είναι το όνομα του είδους, το διαμέρισμα στο οποίο ανήκει και το πώς υπολογίζεται η συγκέντρωση. Με εξαίρεση την περίπτωση που ο τύπος της προσομοίωσης έχει οριστεί το «assignment», η αρχική συγκέντρωση μπορεί επίσης να αλλάξει. Σε περίπτωση που προτιμάται να αλλάξει ο αρχικός αριθμός σωματιδίων αντί της αρχικής συγκέντρωσης, πρέπει να επιλεγεί το «Particle Numbers» στην αναπτυσσόμενη λίστα της μπάρας του μενού στην κορυφή της σελίδας. Αυτό θα αλλάξει όλες τις οθόνες στο πρόγραμμα ώστε να χρησιμοποιούν τον αριθμό σωματιδίων αντί των συγκεντρώσεων και έπειτα από αυτό μπορεί να εισαχθεί τιμή για τον αρχικό αριθμό σωματιδίων (παρατηρείστε ότι η ταμπέλα έχει αλλάξει). Ο όγκος που χρησιμοποιείται για τον υπολογισμό των αριθμών σωματιδίων από την συγκέντρωση προκύπτει από το διαμέρισμα που σχετίζεται με κάθε είδος. Αν πραγματοποιηθεί και πάλι αλλαγή σε αρχική συγκέντρωση, το COPASI θα επαναϋπολογίσει εσωτερικά τον αρχικό αριθμό σωματιδίων. Σε κάποιες περιπτώσεις το COPASI θα αποτρέψει το χρήστη από την αλλαγή σε αρχική συγκέντρωση. Αυτό γίνεται όταν η αλλαγή της συγκέντρωσης οδηγεί σε κυκλικές εξαρτήσεις κατά τη διάρκεια υπολογισμών όλων των αρχικών τιμών. 13

18 Η αιτία αυτού είναι πιθανότατα ένας κανόνας ανάθεσης για το συγκεκριμένο διαμέρισμα. Σε αυτήν την περίπτωση, είναι πιθανό να εξακολουθεί να μπορεί να αλλάξει ο αρχικός αριθμός σωματιδίων. Κανονικά η συγκέντρωση ενός είδους προσδιορίζεται από την αρχική της συγκέντρωση και από τις κινητικές των αντιδράσεων στις οποίες συμμετέχει είτε ως υπόστρωμα είτε ως προϊόν. Οι αντιδράσεις βρίσκονται στη λίστα στο κάτω μέρος της σελίδας γραφικών των «Ειδών» (Εικόνα 6). Πίνακας 1: Τύποι προσομοίωσης ειδών Όνομα Αντιδράσεις (reactions ) Σταθερά (fixed) Ανάθεση (assignment) Συνήθης διαφορική εξίσωση (Ode) Περιγραφή Η συγκέντρωση/ποσότητα του είδους προσδιορίζεται από τους κινητικούς νόμους των αντιδράσεων που τροποποιούν τα είδη Η συγκέντρωση/ποσότητα ενός είδους έχει μία σταθερή τιμή (η οποία αντιστοιχεί στη δοθείσα αρχική τιμή) Η συγκέντρωση/ποσότητα ενός είδους προσδιορίζεται από τον υπολογισμό της δοθείσας μαθηματικής έκφρασης Ο ρυθμός μεταβολής της συγκέντρωσης/ποσότητας ενός είδους προσδιορίζεται από μία συνήθη διαφορική εξίσωση Οι νεότερες εκδόσεις του COPASI επιτρέπουν και τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης ενός είδους από κάποια μαθηματική έκφραση ή παρέχοντας μία συνήθη διαφορική εξίσωση για το ρυθμό μεταβολής της. Για να προσδιοριστεί εάν ένα είδος έχει σταθερή συγκέντρωση/ποσότητα, αυτό γίνεται από τις αντιδράσεις (Reactions), διαφορετικά η συγκέντρωση/ποσότητα του υπολογίζεται με το χρόνο σύμφωνα με κάποια μαθηματική έκφραση, χρησιμοποιώντας την αναπτυσσόμενη λίστα «Simulation Type», η οποία περιέχει τέσσερεις καταχωρήσεις (Πίνακας 1). Αν ένα είδος πρέπει να υπολογιστεί με μία δεδομένη μαθηματική έκφραση, γίνεται επιλογή της καταχώρησης «assignment» από την αναπτυσσόμενη λίστα. Αυτό ενεργοποιεί ένα πεδίο κειμένου όπου μπορεί να 14

19 εισαχθεί η μαθηματική έκφραση. Αντίστοιχα αν πρέπει να προσδιοριστεί ο ρυθμός μεταβολής της συγκέντρωσης ενός είδους από μία συνήθη διαφορική εξίσωση (ordinary differential equation), επιλέγεται η καταχώρηση «ode» από την αναπτυσσόμενη λίστα. Αντιδράσεις (Reactions) Ξανά, προσθέτοντας Αντιδράσεις (reactions), αυτές λειτουργούν ουσιαστικά με τον ίδιο τρόπο όπως η προσθήκη Διαμερισμάτων ή Ειδών. Όταν περιηγείστε στον κλάδο «Αντιδράσεις» του object tree που βρίσκεται κάτω από τον κλάδο Model Biochemical, θα δείτε έναν πίνακα με πέντε στήλες. Τα πρώτα δύο είναι η κατάσταση (Status) και το όνομα (Name) της αντίδρασης (Εικόνα 8). Η τρίτη στήλη που ονομάζεται «Εξίσωση» (Equation) περιγράφει τον χημικό τύπο και πιθανόν πρόσθετους τροποποιητές της αντίδρασης. Η τέταρτη στήλη αναφέρει την κινητική της αντίδρασης που εξαρτάται από την εξίσωση (Rate Law). Η τελευταία στήλη δείχνει τη ροή μέσω αυτής της αντίδρασης (Flux). Η ροή δεν μπορεί να οριστεί από τον χρήστη, αλλά υπολογίζεται αυτόματα όταν κάνετε μία προσομοίωση χρονικού διαστήματος (time course). Εικόνα 8: ορισμός Αντιδράσεων Ο ευκολότερος τρόπος για να προσθέσετε μία αντίδραση είναι να πληκτρολογήσετε τη χημική εξίσωση σε ένα κενό κελί εξισώσεων στον πίνακα. Αφού πληκτρολογήσατε την εξίσωση, πατήστε το πλήκτρο επιστροφής και θα μεταβείτε αυτόματα στην επόμενη σειρά, όπου μπορείτε να πληκτρολογήσετε την επόμενη εξίσωση αντίδρασης. Με αυτό τον τρόπο μπορείτε να εισάγετε 15

20 όλες τις αντιδράσεις που συνθέτουν το μοντέλο σας. Όταν τελειώσετε με την πληκτρολόγηση των εξισώσεων αντίδρασης, δεσμεύετε όλες τις αντιδράσεις. Αν κάποια από τις αντιδράσεις περιέχει Είδη (species) που δεν υπάρχουν ήδη στο μοντέλο, προστίθενται αυτόματα. Εάν δεν υπήρχε Διαμέρισμα (compartment) πριν, προστίθεται επίσης ένα διαμέρισμα και όλα τα νέα είδη προστίθενται σε αυτό το Διαμέρισμα. Εάν υπάρχει ήδη ένα ή περισσότερα Διαμερίσματα, όλα τα νέα είδη προστίθενται στο πρώτο Διαμέρισμα που περιλαμβάνεται στο object tree. Προσοχή: Κατά την πληκτρολόγηση των εξισώσεων αντίδρασης πρέπει να έχετε κατά νου ότι τα ονόματα ειδών στο COPASI μπορούν να περιέχουν χαρακτήρες όπως "+" ή ακόμα και κενά. Δεδομένου ότι αυτοί οι χαρακτήρες θα καθιστούσαν πολύ δύσκολο, αν όχι αδύνατο, να αναλύσουμε την εξίσωση χημικής αντίδρασης, πρέπει να τοποθετήσετε τα ονόματα των ειδών σε διπλά εισαγωγικά. Π.χ. "Είδος 1" ( Species 1 ) + "Είδος 2" ( Species 2 ) -> "Είδος 3" ( Species 3 ). Ανεξαρτήτως αν και τα ονόματα των Eιδών σας περιέχουν ειδικούς χαρακτήρες ή όχι, τα ονόματα των Eιδών πρέπει να διαχωριστούν από τα σύμβολα αντίδρασης (+, *, =, και ->) με κενά. Κάθε νέα αντίδραση παίρνει έναν προκαθορισμένο νόμο κινητικής ταχύτητας που είναι μη αντιστρεπτή μαζική δράση για αντιδράσεις που περιέχουν ένα υπόστρωμα. Για την αντίδραση που έχει μόνο ένα προϊόν (π.χ. εισροή σε ένα σύστημα), επιλέγεται σταθερή κινητική ροής. 16

21 Εικόνα 9: Παράθυρο διαλόγου για την αλλαγή των παραμέτρων αντίδρασης Κάνοντας διπλό κλικ σε μία καταχώρηση στον πίνακα, θα μεταφερθείτε σε άλλο παράθυρο διαλόγου που σας επιτρέπει να αλλάξετε ορισμένες παραμέτρους της αντίδρασης. Μπορείτε να αλλάξετε το όνομα της αντίδρασης, τη χημική εξίσωση και αν η αντίδραση είναι αντιστρεπτή ή όχι. Αλλάζοντας τη χημική εξίσωση και την αντιστρεψιμότητα μιας αντίδρασης επηρεάζεται ο τύπος της κινητικής που μπορείτε να επιλέξετε για την Αντίδραση. Κάθε κινητική λειτουργία ορίζει πόσα υποστρώματα, προϊόντα και τροποποιητές αναμένονται. Επιπροσθέτως, ορίζει αν μπορεί να χρησιμοποιηθεί μόνο για αντιστρεπτές ή μη αντιστρεπτές αντιδράσεις ή αν μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε οποιαδήποτε από αυτές. Έτσι, ανάλογα με τον αριθμό των υποστρωμάτων, των προϊόντων και των τροποποιητών που έχει η κινητική σας εξίσωση και ανάλογα με το αν είναι αντιστρεπτή ή όχι, μόνο ένα υποσύνολο των καθορισμένων κινητικών λειτουργιών θα είναι διαθέσιμο στο «Rate Law combo box». Εάν η κινητική λειτουργία που θέλετε να αντιστοιχίσετε στην αντίδραση δεν είναι ακόμα διαθέσιμη, μπορείτε να την προσθέσετε κάνοντας κλικ στο κουμπί «New Rate Law» (δείτε επίσης «user defined functions»). Ανάλογα με την κινητική λειτουργία που επιλέξατε, μπορείτε να πάρετε μία επιλογή παραμέτρων στον πίνακα που ονομάζεται «Ορισμός Συμβόλου» (Symbol Definition), όλες οι παράμετροι λειτουργιών παίρνουν μία προεπιλεγμένη τιμή 0,1 που μπορεί να αλλάξει κάνοντας κλικ στο αντίστοιχο κελί και πληκτρολογώντας μία νέα τιμή. 17

22 Μέχρι στιγμής δεν αναφερθήκαμε λεπτομερώς για το πώς θα προσδιοριστούν οι χημικές εξισώσεις. Οι χημικές εξισώσεις έχουν ένα απλό σχήμα. Αρχικά δηλώνετε όλα τα υποστρώματα που διαχωρίζονται με χαρακτήρες "+". Βεβαιωθείτε ότι διαχωρίσατε το όνομα του υποστρώματος και τον χαρακτήρα "+" τουλάχιστον από έναν κενό χαρακτήρα, διαφορετικά το COPASI θα ερμηνεύσει το σύμβολο "+" ως το όνομα του Είδους. (Έχοντας τον χαρακτήρα "+" ως μέρος του ονόματος ενός Είδους, επιτρέπεται στο Copasi) μετά τον κατάλογο των υποστρωμάτων, καθορίζετε είτε έναν ίσον ("=") χαρακτήρα, εάν η αντίδραση είναι αντιστρεπτή, είτε συνδυασμό χαρακτήρων "->", αν η αντίδραση είναι μη αντιστρεπτή. Αυτό ακολουθείται από τον κατάλογο των προϊόντων που πρέπει, επίσης, να διαχωριστούν με τον χαρακτήρα "+". Βεβαιωθείτε ξανά ότι έχετε κενά γύρω από τους διαχωριστικούς χαρακτήρες "+". Προαιρετικά, ο όρος αυτός μπορεί να ακολουθείται από ένα ερωτηματικό και μια λίστα τροποποιητών που διαχωρίζονται με κενά. Είτε ο κατάλογος των υποστρωμάτων, είτε ο κατάλογος των προϊόντων μπορεί επίσης να είναι κενός, αλλά τουλάχιστον ένας από αυτούς πρέπει να είναι παρών. Ας δούμε δύο παραδείγματα: 1. Το είδος Α (Species A) μετατρέπεται μη αντιστρεπτώς σε είδος Β (Species B). Η χημική εξίσωση που θα πληκτρολογήσετε είναι "A -> B". 2. Τα είδη Α (Species A) και Β (Species B) μετατρέπονται αντιστρεπτώς στο είδος C (Species C), η αντίδραση έχει 2 τροποποιητές C και D. Γι αυτό η χημική εξίσωση στο COPASI θα είναι: "A + B = C, C D". Σημειώστε ότι ένας από τους τροποποιητές είναι το προϊόν! Προσοχή: Εάν η αντίδραση λαμβάνει χώρα σε ένα διαμέρισμα, η κινητική της αντίδρασης καθορίζει ένα ρυθμό αλλαγής της συγκέντρωσης, ενώ εάν η αντίδραση λαμβάνει χώρα σε διάφορα διαμερίσματα, η κινητική καθορίζει την ποσότητα αλλαγής ουσίας με την πάροδο του χρόνου. Π.χ. στην αντίδραση A -> B, αν τα Α και Β βρίσκονται στο ίδιο Διαμέρισμα, η κινητική λειτουργία της αντίδρασης επιστρέφει το αποτέλεσμά της σε mol / (l * s). Εάν τα Α και Β βρίσκονται σε διαφορετικά Διαμερίσματα, το αποτέλεσμα επιστρέφει σε mol / s. (Αυτό προϋποθέτει ότι οι προεπιλεγμένες σας μονάδες έχουν οριστεί σε mol, l και s.) 18

23 Προβολή παραμέτρων (Parameter View) Το γράφημα προβολής παραμέτρων (parameter view) μπορεί να εμφανιστεί επιλέγοντας το φύλλο που ονομάζεται «Επισκόπηση παραμέτρων» (Parameter Overview) στο πεδίο Model Biochemical (Εικόνα 10). Αυτό το γράφημα σας επιτρέπει να βλέπετε και να επεξεργάζεστε όλες τις παραμέτρους του μοντέλου σε ένα μέρος. Πράγμα που σας εξοικονομεί από τη μετακίνηση γύρω από το δέντρο-μοντέλο αν π.χ. πρέπει πρώτα να επεξεργαστείτε τις αρχικές συγκεντρώσεις για ορισμένα Είδη και κατόπιν τις παραμέτρους μιας ή περισσοτέρων Αντιδράσεων. Η προβολή σας δείχνει τις αρχικές συγκεντρώσεις για τα Είδη στην κορυφή, ακολουθούμενη από τον αρχικό χρόνο και τους όγκους όλων των Διαμερισμάτων και στο κάτω μέρος τις Κινητικές παραμέτρους όλων των Αντιδράσεων. Εικόνα 10: Επισκόπηση παραμέτρων Προκειμένου να αλλάξετε μία τιμή, κάνετε διπλό κλικ σε αυτήν, πράγμα που σας επιτρέπει να εισάγετε μία νέα τιμή. Όταν πατήσετε το πλήκτρο επιστροφής ή κάνοντας κλικ κάπου αλλού, η νέα τιμή δεν γράφεται απευθείας στο αντικείμενο, αλλά εμφανίζεται ένας χαρακτήρας * μπροστά από το όνομα της αλλαγμένης παραμέτρου. Αν αφήσετε τώρα αυτό το γράφημα ή πατήσετε το κουμπί «Commit» στο κάτω μέρος του παραθύρου-διαλόγου, η νέα τιμή είναι γραμμένη στο αντίστοιχο αντικείμενο του μοντέλου. 19

24 Λειτουργίες καθορισμένες από το χρήστη (user defined parameters) Το COPASI ορίζει ήδη ένα μεγάλο σύνολο κοινά χρησιμοποιούμενων κινητικών λειτουργιών για να διαλέξετε. Ο κατάλογος των καθορισμένων λειτουργιών βρίσκεται στον τελευταίο πεδίο του object tree. Εικόνα 11: Πίνακας λειτουργιών με προκαθορισμένες λειτουργίες Παρόλα αυτά, μερικές φορές πρέπει να ορίσετε τη δική σας κινητική λειτουργία για να λύσετε ένα συγκεκριμένο πρόβλημα. Το COPASI σας δίνει τη δυνατότητα να προσθέσετε μία νέα λειτουργία, είτε κάνοντας διπλό κλικ σε μία κενή γραμμή του πίνακα, είτε κάνοντας κλικ στο κουμπί «Νέο» (New) στο κάτω μέρος της οθόνης. Στο παράθυρο διαλόγου ορισμού λειτουργιών, δίνετε στη λειτουργία σας ένα όνομα στο πεδίο «Όνομα λειτουργίας» (Name field). Αυτό το όνομα πρέπει να είναι μοναδικό μέσα στη λίστα καθορισμένων λειτουργιών. Στη συνέχεια, πρέπει να καθορίσετε έναν τύπο που καθορίζει τον ρυθμό αντίδρασης της κινητικής σας λειτουργίας στο πεδίο «Φόρμουλα» (Formula field). Η σειρά συμβόλων καλύπτει μόνο τη δεξιά πλευρά του ρυθμού λειτουργίας. 20

25 Εικόνα 12: Παράθυρο διαμόρφωσης ορισμού λειτουργίας Έτσι για τον Michaelis-Menten που ορίζεται ως v = V * (S / (Km + S)) θα εισάγετε v = V*(S / (Km + S)) στο πεδίο «Formula». Κατά την πληκτρολόγηση του τύπου, το COPASI προσπαθεί ήδη να αναλύσει την εξίσωση και να εξαγάγει τις παραμέτρους. Όλες τις παραμέτρους που εντοπίζει το COPASI παρατίθενται στον πίνακα «Παράμετροι» (Parameters table). Εικόνα 13: Παράθυρο διαμόρφωσης ορισμού λειτουργίας με γραφική απεικόνιση της λειτουργίας Στις παραμέτρους COPASI μπορεί να υπάρχουν αυθαίρετα ονόματα, καθώς υπάρχουν μόνο λίγοι κανόνες που κάποιος πρέπει να γνωρίζει. Εάν μια παράμετρος ξεκινάει με ένα γράμμα ή με έναν υπογραμμισμένο χαρακτήρα και περιέχει μόνο γράμματα, ψηφία και υπογραμμισμένους χαρακτήρες, όλα είναι καλά, αν όμως το όνομα παραμέτρου περιέχει άλλους χαρακτήρες, ολόκληρο το όνομα παραμέτρου πρέπει να περικλείεται σε διπλά εισαγωγικά. 21

26 Εάν το όνομα της παραμέτρου περιέχει διπλά εισαγωγικά ή backslashes, αυτά πρέπει να διαφεύγουν με ένα backslash. Καθώς ορίζονται όλες οι μεταβλητές που έχουν οριστεί, σαν προεπιλογή, ως «Παράμετροι» (Parameters), πρέπει να καθορίσετε τους σωστούς τύπους τους, επιλέγοντας έναν από την αναπτυσσόμενη λίστα «Περιγραφή» (Description). Ωστόσο, ο συγκεκριμένος τύπος μεταβλητών θα επηρεάσει τον τύπο των αντιδράσεων στις οποίες μπορεί να χρησιμοποιηθεί η λειτουργία. Π.χ., αν ορίσετε η λειτουργία να περιέχει δύο υποστρώματα και έναν τροποποιητή, μπορείτε αργότερα να το χρησιμοποιήσετε μόνο για Αντιδράσεις που πραγματικά έχουν δύο υποστρώματα. Προσοχή: Οι περιορισμοί στον αριθμό των τροποποιητών δεν είναι αυστηροί, δεδομένου ότι τα υποστρώματα και τα αντιδραστήρια μπορούν να λειτουργήσουν ως τροποποιητές. Επομένως, ο παραπάνω νόμος συχνοτήτων θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί σε αντιδράσεις που δεν καθορίζουν ρητά έναν τροποποιητή. Παραγωγή αποτελεσμάτων Προκαθορισμένες αναφορές (Predefined reports) Για κάποιες από τις υπολογιστικές εργασίες το COPASI διαθέτει προκαθορισμένες αναφορές (Predefined reports). Αυτές δημιουργούνται αυτόματα κατά την εκκίνηση του λογισμικού ή όταν φορτώνεται ένα αρχείο το οποίο δεν τις περιέχει ήδη. Τα ονόματα αυτών των αναφορών είναι ίδια με την εργασία για την οποία είναι κατάλληλες. Για παράδειγμα η προκαθορισμένη αναφορά για υπολογισμούς σταθερής κατάστασης (Steady-State calculations) ονομάζεται Steady-State. Οι προκαθορισμένες αναφορές εξάγουν μια περιγραφή των ρυθμίσεων που ορίστηκαν για τον υπολογισμό, συνήθως έναν πίνακα με ενδιάμεσα αποτελέσματα (εφόσον υπάρχει αυτή η δυνατότητα για τον συγκεκριμένο υπολογισμό) και στο τέλος μια λεπτομερή αναφορά των αποτελεσμάτων. Οι ορισμοί των αναφορών μπορούν να αλλάξουν ή να διαγραφούν χρησιμοποιώντας τον μηχανισμό που περιγράφεται στον οδηγό. Στην περίπτωση που αλλάξατε μια από τις προκαθορισμένες αναφορές και επιθυμείτε να επιστρέψετε στην αρχική, απλά διαγράψτε τον ορισμό της 22

27 αναφοράς και αποθηκεύστε το αρχείο. Όταν φορτώσετε ξανά το αποθηκευμένο αρχείο, η τρέχουσα προεπιλεγμένη αναφορά θα δημιουργηθεί αυτόματα. Βοηθός εξαγωγής αποτελεσμάτων (Output assistant) Η επιλογή Output assistant αποτελεί τον ευκολότερο τρόπο για να δημιουργήσετε τις δικές σας output definitions, τις οποίες μπορείτε αργότερα να προσαρμόσετε στις ανάγκες σας χρησιμοποιώντας τις τεχνικές που περιγράφονται στην παράγραφο Manual Definition. Σχεδόν όλα τα παράθυρα εργασιών του λογισμικού διαθέτουν στο κάτω δεξιά τμήμα την επιλογή Output Assistant. Εάν την επιλέξετε, ένα νέο παράθυρο με τη λίστα των προκαθορισμένων output definitions θα ανοίξει στα αριστερά. Στην περίπτωση που επιλέξετε μια εκ των προκαθορισμένων output definitions της λίστας θα δείτε μια σύντομη περιγραφή της λειτουργίας της στη δεξιά πλευρά του παραθύρου. Πάνω από τη σύντομη περιγραφή υπάρχει ο τίτλος της output definition. Αυτός ο τίτλος μπορεί να αλλάξει προκειμένου να είστε σε θέση να αναγνωρίσετε τις διαφορετικές output definitions στην περίπτωση που σχεδιάζετε να δημιουργήσετε περισσότερες από μια του ίδιου τύπου. Γραφήματα και αναφορές μπορούν να δημιουργηθούν χρησιμοποιώντας αυτό το παράθυρο. Στη συνέχεια πατώντας την επιλογή Create στο κάτω μέρος του παραθύρου θα εμφανιστεί μια νέα αναφορά ή γράφημα στο αντίστοιχο τμήμα του Output του μενού ανάλογα με το τι έχετε επιλέξει. Η επιλογή Output είναι προτελευταία στο μενού που βρίσκεται στα αριστερά του παραθύρου. Η ονομασία των Output definitions θα είναι ο τίτλος του αντικειμένου που επιλέξατε από τη λίστα. Εάν κάποιο άλλο output definition έχει ήδη το ίδιο όνομα, ένα επίθημα θα προστεθεί στην ονομασία. Το output που έχει δημιουργηθεί μπορεί πλέον να υποστεί επεξεργασία ή και να διαγραφεί. Εάν το νέο output που δημιουργήθηκε είναι μια αναφορά, τότε αυτή θα επιλεχθεί αυτομάτως ως η ενεργή αναφορά της τρέχουσας εργασίας. Στη συνέχεια θα πρέπει να επιλέξετε το όνομα του αρχείου για το output χρησιμοποιώντας την επιλογή Report. 23

28 Εικόνα 14: Βοηθός εξαγωγής αποτελεσμάτων Αναφορές (Reports) Σε αυτήν τη παράγραφο θα περιγραφεί η δημιουργία ή η επεξεργασία ενός ορισμού αναφοράς (report definition). Να θυμάστε ότι πρέπει να επιλέξετε την αναφορά για τη συγκεκριμένη υπολογιστική εργασία που επιθυμείτε να πραγματοποιήσετε. Αυτό μπορεί να γίνει χρησιμοποιώντας την επιλογή Report όπως περιγράφεται παρακάτω. Εικόνα 15: Πίνακας αναφορών με προεπιλεγμένες αναφορές. Το παράθυρο για τον ορισμό των report definitions βρίσκεται στην επιλογή Output à Reports του μενού που βρίσκεται στα αριστερά. Με διπλό κλικ σε μια 24

29 άδεια σειρά του πίνακα μπορείτε να δημιουργήσετε ένα νέο αντικείμενο αναφοράς και ταυτόχρονα ανοίγει το παράθυρο για την τροποποίηση του report definition. Στο ίδιο παράθυρο μπορείτε να ορίσετε το όνομα του report στο πεδίο Name. Στη συνέχεια, από το μενού και την επιλογή Task μπορείτε να επιλέξετε το είδος της εργασίας στην οποία θα αναφέρεται το συγκεκριμένο report. Επομένως, εάν επιθυμείτε να αποθηκεύσετε τα αποτελέσματα μιας μελέτης χρόνου (time course), θα πρέπει να επιλέξετε Time-Course. Η αναφορά συνήθως αποθηκεύει τα αποτελέσματα της εργασίας υπό τη μορφή πίνακα: ο κύριος χαρακτήρας διαχωρισμού για τα στοιχεία του πίνακα είναι ο χαρακτήρας tab (\t). Εάν θέλετε να ορίσετε διαφορετικό χαρακτήρα για τον διαχωρισμό των στοιχείων, θα πρέπει να αποεπιλέξετε την επιλογή <tab> και να προσδιορίσετε τον χαρακτήρα που επιθυμείτε στο πεδίο Separator. Εκτός από την επιλογή <tab> υπάρχει ακόμα ένα πεδίο με την ονομασία Precision. Με τη χρήση του πεδίου Precision ο χρήστης μπορεί να ορίσει τον αριθμό των σημαντικών ψηφίων των αριθμητικών αποτελεσμάτων. Η προεπιλεγμένη τιμή είναι 6. Εν συνεχεία, θα πρέπει να επιλέξετε τα αντικείμενα τα οποία θέλετε να εμφανίζονται στην αναφορά. Υπάρχουν δύο τρόποι να ορίσετε τα report definitions. Η προεπιλογή του λογισμικού είναι η εξαγωγή των αναφορών ως πίνακες. Για παράδειγμα, η αναφορά για μια προσομοίωση μελέτης χρόνου (time course simulation) θα περιλαμβάνει μια γραμμή για κάθε χρονικό βήμα και κάθε γραμμή τυπικά περιέχει τον χρόνο και τις συγκεντρώσεις ενός ή περισσοτέρων αντιδρώντων. Στη λειτουργία για προχωρημένους, η οποία ενεργοποιείται από την επιλογή Advanced, η αναφορά χωρίζεται σε τρία τμήματα που περιλαμβάνουν μια επικεφαλίδα, το κυρίως τμήμα και ένα υποσέλιδο. Το περιεχόμενου το κάθε τμήματος μπορεί να οριστεί επιλέγοντας την αντίστοιχη καρτέλα. Προκειμένου να επιστρέψετε στην απλή διάταξη του πίνακα, θα πρέπει να κάνετε κλικ στην επιλογή Advanced ξανά. Το λογισμικό θα σας προειδοποιήσει ότι μπορεί να χάσετε κάποιες πληροφορίες κατά τη μετάβαση από advanced report στην προεπιλεγμένη μορφή. 25

30 Εργασίες (Tasks) Ανάλυση σταθερής κατάστασης (Steady-State Analysis) Προκειμένου να πραγματοποιήσετε μια ανάλυση σταθερής κατάστασης, θα πρέπει από το μενού στα αριστερά να επιλέξετε Task à Steady-State. Εικόνα 16: Ανάλυση σταθερής κατάστασης Στο παράθυρο που εμφανίζεται έχετε την δυνατότητα να ορίσετε αρκετές ρυθμίσεις οι οποίες επηρεάζουν τον τρόπο με τον οποίο υπολογίζεται η ανάλυση σταθερής κατάστασης. Αρχικά, μπορείτε να αποφασίσετε αν το COPASI θα υπολογίσει τον Ιακωβιανό πίνακα και/ή πραγματοποιήσει ανάλυση σταθερότητας επιλέγοντας την αντίστοιχη επιλογή (check box). Η επιλογή με την ονομασία executable χρησιμοποιείται προκειμένου να δώσει εντολή στη γραμμή εντολών CopasiSE να πραγματοποιήσει την εργασία αν τρέχει από το αντίστοιχο αρχείο. Στον πίνακα με ονομασία Method Parameter έχετε επίσης τη δυνατότητα να κάνετε ρυθμίσεις που θα επηρεάσουν τον τρόπο υπολογισμού του Steady-State. Για λεπτομερή περιγραφή αυτών των παραμέτρων δείτε την παράγραφο «Methods» του παρόντος οδηγού. Εν τέλη, για να τρέξετε την ανάλυση Steady-State, πατήστε το κουμπί Run που βρίσκεται στο κάτω δεξιά μέρος του παραθύρου. Μετά το πέρας των υπολογισμών, το COPASI θα περάσει στο γραφικό στοιχείο Result. Προσομοίωση μελέτης χρόνου (Time course Simulation) Προκειμένου να πραγματοποιήσετε μια προσομοίωση μελέτης χρόνου, θα πρέπει από το μενού που βρίσκεται στα αριστερά να επιλέξετε Task à Time course. 26

31 Εικόνα 17: Προσομοίωση μελέτης χρόνου Στο παράθυρο με την ονομασία Time Course έχετε τη δυνατότητα να αλλάξετε αρκετές παραμέτρους της χρονικής μελέτης, όπως για παράδειγμα τη διάρκεια της προσομοίωσης και τον αριθμό των διαστημάτων τα οποία υπολογίζονται στο χρονικό εύρος. Εναλλακτικά στη ρύθμιση του αριθμού των διαστημάτων, μπορείτε να θέσετε το μέγεθος του κάθε διαστήματος. Όποιο από τα δύο και αν επιλέξετε η τιμή του άλλου θα ανανεωθεί αντίστοιχα. Η επιλογή με την ονομασία Save Result in Memory δίνει την εντολή στο λογισμικό να κρατήσει στη μνήμη τα αποτελέσματα των υπολογισμών στους διάφορους χρόνους και να τα εκθέσει σε ένα παράθυρο αποτελεσμάτων. Βέβαια, από τη στιγμή που το μέγεθος των δεδομένων μπορεί να είναι πολύ μεγάλο ανάλογα με το μέγεθος του μοντέλου και/ή του αριθμού των διαστημάτων που έχετε ορίσει, θα πρέπει να απενεργοποιήσετε αυτή την επιλογή αν πιστεύετε ότι τα αποτελέσματα θα υπερβούν τη χωρητικότητα της διαθέσιμης μνήμης. Η απενεργοποίηση αυτής της επιλογής έχει ως συνέπεια την ανάγκη ορισμού αναφοράς από εσάς προκειμένου να αποθηκευτούν τα αποτελέσματα της προσομοίωσης μελέτης χρόνου. Μια άλλη παράμετρος που μπορείτε να προσαρμόσετε σε αυτό το παράθυρο είναι ο χρόνος έναρξης καταγραφής της απόκρισης. Υπό κανονικές συνθήκες, το COPASI θα αποθηκεύσει όλα τα δεδομένα εξόδου και θα τα εκθέσει στο γράφημα και στις αναφορές, αν υπάρχουν, ή στο παράθυρο αποτελεσμάτων, αν δεν έχει απενεργοποιηθεί αυτή η λειτουργία. Με χρήση της επιλογής delayed και μια τιμή στο πεδίο Start Output Time, το λογισμικό απορρίπτει όλα τα αποτελέσματα πριν από ένα συγκεκριμένο χρονικό σημείο. Για παράδειγμα, μπορείτε να αποφασίσετε ότι θέλετε να πραγματοποιήσετε 27

32 μια προσομοίωση μελέτης χρόνου διάρκειας 100 s αλλά ενδιαφέρεστε μόνο για τα τελευταία 50 s της προσομοίωσης. Σε αυτήν την περίπτωση θα πρέπει να ενεργοποιήσετε την επιλογή delayed και να ορίσετε μια καθυστέρηση, ας πούμε, 50. Αυτή η καθυστέρηση θα χρησιμοποιηθεί για όλα τα είδη δεδομένων εξόδου. Η προσομοίωση μελέτης χρόνου δεν ξεκινάει απαραίτητα σε χρόνο t o =0. Ο χρόνος έναρξης της προσομοίωσης εξαρτάται από το χρόνο του αρχικού μοντέλου ο οποίος μπορεί να προσδιορισθεί στο παράθυρο general model settings. Δουλεύοντας με γραφήματα (plots) Στην περίπτωση που έχετε ορίσει ένα ενεργό γράφημα πριν τον υπολογισμό, το COPASI θα σχεδιάσει το γράφημα. Το παράθυρο γραφημάτων αποτελείται από τρία στοιχεία. Πρώτο είναι η γραμμή εργαλείων στην κορυφή, η οποία σου επιτρέπει την εκτύπωση του γραφήματος ή την αποθήκευση των δεδομένων σε ένα αρχείο, δεύτερο το υπόμνημα, από το οποίο μπορείς να επιλέξεις μεταξύ των γραφημάτων, και τρίτο στοιχείο είναι το τρέχων διάγραμμα. Εικόνα 18: Παράθυρο απεικόνισης γραφημάτων Μετακινώντας τον κέρσορα του ποντικιού πάνω στο γράφημα, οι συντεταγμένες του κέρσορα αντιστοιχούν στο σύστημα συντεταγμένων του γραφήματος και εμφανίζονται δίπλα σε αυτόν. Προκειμένου να μεγεθύνετε κάποια περιοχή του γραφήματος μπορείτε να επιλέξετε μια ορθογώνια περιοχή 28

33 κάνοντας κλικ κάπου στο γράφημα και σέρνοντας τον κέρσορα. Η περιοχή του γραφήματος που επιλέξατε θα μεγεθυνθεί. Για να επιστρέψετε στο αρχικό γράφημα κάντε δεξί κλικ κάπου στην περιοχή του γραφήματος. Ανάλυση μεταβολικού ελέγχου (Metabolic control analysis, MCA) Το COPASI μπορεί να πραγματοποιήσει στο μοντέλο σας ανάλυση μεταβολικού ελέγχου (Metabolic Control Analysis, MCA). Για να πραγματοποιήσετε MCA θα πρέπει από το μενού που βρίσκεται στα αριστερά να επιλέξετε Tasks à Metabolic Control Analysis. Εικόνα 19: Ανάλυση μεταβολικού ελέγχου Προκειμένου να πραγματοποιήσετε μια πλήρη MCA, πχ ελαστικότητες (elasticities) και συντελεστές ελέγχου (control coefficients), το COPASI χρειάζεται να ανιχνεύσει αρχικά ένα Steady-State, αλλιώς μπορεί να υπολογίσει μόνο τις ελαστικότητες. Εάν δεν έχετε ήδη πραγματοποιήσει μια ανάλυση Steady-State και ανανεώσατε το μοντέλο σας έτσι ώστε το σύστημα να είναι ήδη σε Steady-State, θα πρέπει να ενεργοποιήσετε την επιλογή που υποδεικνύει στο COPASI να κάνει υπολογισμό Steady-State πριν υπολογίσει την MCA. Ανάλογα με το αν το COPASI χρειάζεται να πραγματοποιήσει μια ανάλυση Steady-State ή όχι, μπορείτε να αλλάξετε μια ή περισσότερες παραμέτρους οι οποίες επηρεάζουν τον τρόπο με τον οποίο οι αναλύσεις MCA και Steady-State υπολογίζονται. Οι παράμετροι για τον υπολογισμό σε Steady- State περιγράφονται παραπάνω στην παράγραφο Ανάλυσης Σταθερής Κατάστασης (Steady-State analysis). 29

34 Πατώντας το κουμπί Run ξεκινάει ο υπολογισμός. Μετά το πέρας του υπολογισμού, το COPASI θα αλλάξει αυτόματα στο παράθυρο Result. Το παράθυρο έχει τρεις καρτέλες οι οποίες περιέχουν τα αποτελέσματα των ελαστικοτήτων (Elasticities), των συντελεστών ελέγχου ροής (Flux Control Coefficients) και τους συντελεστές ελέγχου συγκεντρώσεων (Concentration Control Coefficients). Ανάλογα με το αν γίνει εύρεση συνθηκών σταθερής κατάστασης ή όχι, μπορεί μόνο η καρτέλα Elasticities να είναι ενεργοποιημένη. Το λογισμικό υποδεικνύει την ύπαρξη συνθηκών σταθερής κατάστασης με μια ετικέτα ακριβώς πάνω από τις καρτέλες. Για όλα τα αποτελέσματα, μπορείτε να επιλέξετε εάν θέλετε το COPASI να τα παρουσιάζει scaled ή unscaled. Προκειμένου να έχετε δεδομένα εξόδου από την MCA, θα πρέπει να δημιουργήσετε μια αναφορά όπως περιγράφεται στην παράγραφο ή να αποφασίσετε να χρησιμοποιήσετε την προεπιλεγμένη αναφορά. Η προεπιλεγμένη αναφορά θα έχει ως αποτέλεσμα εξόδου όλους τους πίνακες που υπολογίστηκαν καθώς και το Steady-State, αν ο υπολογισμός σταθερής κατάστασης είχε επιλεγεί. Το μόνο που χρειάζεται να κάνετε για να γράψετε τα δεδομένα εξόδου σε ένα αρχείο είναι να συνδέσετε το output definition με ένα αρχείο. Αυτό μπορεί να επιτευχθεί κάνοντας κλικ στο κουμπί Report. Πατώντας το θα ανοίξει ένα παράθυρο το οποίο σας επιτρέπει να συνδέσετε την αναφορά μιας συγκεκριμένης εργασίας σε ένα αρχείο στον σκληρό σας δίσκο. Αρχικά, επιλέγουμε μια αναφορά που είναι κατάλληλη για την εργασία MCA από το αναπτυσσόμενο μενού το οποίο βρίσκεται στην κορυφή του παραθύρου. Η προεπιλεγμένη αναφορά για την MCA ονομάζεται Metabolic Control Analysis. Εν συνεχεία, προσδιορίζουμε το αρχείο που θα χρησιμοποιηθεί για την αποθήκευση της αναφοράς κάνοντας κλικ στο κουμπί browse και επιλέγοντας τον προορισμό στη λίστα αρχείων που ανοίγει. Το COPASI, βάση προεπιλογής, δημιουργεί ένα νέο αρχείο ή αντικαθιστά έναν υπάρχων με το ίδιο όνομα. Εναλλακτικά, μπορείτε να δώσετε την εντολή στο COPASI να προσαρτήσει την αναφορά στο τέλος ενός αρχείου με το ίδιο όνομα επιλέγοντας την αντίστοιχη επιλογή Append στο κάτω μέρος του παραθύρου. Αφού ολοκληρώσετε, κάντε κλικ στο κουμπί Confirm. Εάν τώρα τρέξετε την εργασία, το COPASI θα αποθηκεύσει τα δεδομένα εξόδου στο αρχείο που ορίσατε. 30

35 Εικόνα 20: Αποτελέσματα ανάλυσης MCA σε συνθήκες Steady-State Εικόνα 21: Αποτελέσματα ανάλυσης MCA όταν δε βρέθηκε Steady-State 31

36 1η ΑΣΚΗΣΗ ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΒΙΟΜΕΤΑΤΡΟΠΗ ΑΠΟ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΟΥ ΜΟΝΤΕΛΟΥ Με την παρούσα άσκηση επιτυγχάνεται η προσομοίωση ενός μικρού βιοχημικού μονοπατιού στο οποίο η ουσία Α μετατρέπεται από μικροβιακά κύτταρα στο προϊόν Β. Η πορεία της διεργασίας απεικονίζεται στο Σχήμα 1. ΚΥΤΤΤΑΡΟ Αex Αin Bin Bex ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝ Σχήμα 1. Μετατροπή του υποστρώματος Α σε προϊόν Β από μικροβιακά κύτταρα. Οι αντιδράσεις που λαμβάνουν χώρα είναι οι ακόλουθες: 1. Αex Ain. Είσοδος του υποστρώματος στο εσωτερικό του κυττάρου (R1) 2. Αin Bin. Ενζυμική μετατροπή του υποστρώματος σε προϊόν (R2) 3. Bin Bex. Έξοδος του προϊόντος από το κύτταρο (R3) όπου Α και Β υπόστρωμα και προϊόν, ενώ οι ενδείξεις in και ex αντιστοιχούν σε εσωκυτταρική και εξωκυτταρική συγκέντρωση, αντίστοιχα. Η μετατροπή του υποστρώματος καταλύεται από ένζυμο το οποίο ακολουθεί κλασική κινητική Michaelis-Menten. Η αντίδραση εισόδου του Α στο κύτταρο περιγράφεται από κινητική πρώτης τάξης (Mass action irreversible), δηλαδή η ταχύτητά της είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του υποστρώματος στο 32

37 περιβάλλον του κυττάρου (Aex). Ο ίδιος κινητικός τύπος (Mass action irreversible) περιγράφει και την έξοδο του προϊόντος Β από το κύτταρο. ΔΡΑΣΤΗΡΙΟΤΗΤΕΣ Προσδιορισμός του μοντέλου Αρχικά καθορίζονται τα διαμερίσματα (Compartments) του νέου μοντέλου που δημιουργείται. Το συγκεκριμένο μοντέλο περιλαμβάνει δύο διακριτά διαμερίσματα (Κύτταρο - Περιβάλλον), τα οποία και καθορίζονται από την επιλογή των Βιοχημικών Παραμέτρων του μοντέλου (Model -> Biochemical -> Compartments). O αρχικός όγκος (Initial Volume) και στις δύο περιπτώσεις, ορίζεται ίσος με 1 ml. Από τις Βιοχημικές Παραμέτρους του μοντέλου (Model -> Biochemical - > Reactions), εισάγονται οι 3 αντιδράσεις όπως αυτές έχουν περιγραφεί ανωτέρω, ενώ ορίζονται και οι κινητικοί τους τύποι από την επιλογή Rate Law. Οι σταθερές πρέπει να λάβουν τις ακόλουθες τιμές: R1: k1=0.1 (Mass action irreversible) R2: Km=1, V=1 (Henri Michaelis-Menten) R3: k1=0.1 (Mass action irreversible) Αφού οριστούν οι αντιδράσεις, στο μενού Species (Model -> Biochemical -> Species) έχουν καθοριστεί αυτομάτως και οι εμπλεκόμενοι μεταβολίτες. Ορίζονται οι αρχικές συγκεντρώσεις των μεταβολιτών καθώς και το διαμέρισμα στο οποίο εντοπίζονται με βάση τα δεδομένα του παρακάτω πίνακα: Name Compartment Type Initial Concentration (mmol/ml) Aex ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝ reactions 10 Ain ΚΥΤΤΑΡΟ reactions 0 Bin ΚΥΤΤΑΡΟ reactions 0 Bex ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝ reactions 0 Το μοντέλο αποθηκεύεται (File -> Save as) ώστε να είναι διαθέσιμο για μελλοντική χρήση. Από την επιλογή Model -> Biochemical -> Parameter Overview πραγματοποιείται ο τελικός έλεγχος του μοντέλου που δημιουργήθηκε. 33

38 Επιλογή εργασιών της διαδικασίας προσομοίωσης Ως τρόπος επίλυσης του μοντέλου ορίζεται η επιλογή Time Course (Tasks -> Time Course). Ο συνολικός χρόνος προσομοίωσης (Duration) ορίζεται στα 10 sec και τα μεσοδιαστήματα δειγματοληψίας (Intervals) σε 50. Οι παράμετροι προς παρακολούθηση για το συγκεκριμένο μοντέλο είναι ο χρόνος (Time), οι μεταβατικές συγκεντρώσεις των μεταβολιτών (Transient Concentrations) [Ain]t, [Aex]t, [Βin]t και [Βex]t, καθώς και οι ροές των αντιδράσεων (Reaction Fluxes) (R1).Flux, (R2).Flux και (R3).Flux. Η επιλογή Output Assistant προσφέρει την δυνατότητα της δημιουργίας γραφημάτων (Plots) των μεταβατικών συγκεντρώσεων και των ροών σε συνάρτηση με το χρόνο. Η επιλογή μπορεί να γίνει είτε μέσα από ένα σύνολο έτοιμων γραφημάτων, είτε ακόμα και μέσω της δυνατότητας δημιουργίας νέου γραφήματος (Create New), προσαρμοσμένου στις ανάγκες του χρήστη. Στην περίπτωση νέου γραφήματος, ο καθορισμός των παραμέτρων οι οποίες θα απεικονίζονται σε αυτό ρυθμίζεται μέσω της επιλογής Output Specifications -> Plots -> Create New, από όπου μπορούν να προστεθούν και νέα (New) γραφήματα. Μετά τον ορισμό των επιθυμητών γραφημάτων, εκτελείται η προσομοίωση μέσω της επιλογής Run στο menu του Time Course, με βάση τα χαρακτηριστικά του μοντέλου που έχει οριστεί και παρουσιάζονται τα αποτελέσματα (Tasks -> Time Course -> Result) καθώς και τα αντίστοιχα γραφήματα που έχει ορίσει ο χρήστης. Κάθε γράφημα προσφέρει την δυνατότητα αποθήκευσης των αποτελεσμάτων ως εικόνες (Save Image) αλλά και ως αρχεία.txt (Save Data). 34

39 ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ Ποια η συγκέντρωση των μεταβολιτών σε χρόνο 10 sec; Έχει καταναλωθεί το υπόστρωμα στο χρονικό διάστημα που διαρκεί η προσομοίωση; Αυξήστε το χρόνο της προσομοίωσης τόσο ώστε το σύστημα να βρεθεί σε σταθερή κατάσταση και καταγράψτε τις τιμές των συγκεντρώσεων των μεταβολιτών. Ποια η μορφή της καμπύλης που παριστάνει τη χρονική εξέλιξη της συγκέντρωσης κάθε μεταβολίτη; Για κάθε καμπύλη εξηγείστε τι συμβαίνει στα διάφορα χρονικά σημεία. Mελετήστε τις μεταβατικές συγκεντρώσεις των μεταβολιτών Ain, Aex, Bin, και τη ροή (R1).Flux. Παρουσιάζει ομοιότητες η καμπύλη της μεταβολής του (R1).Flux με την καμπύλη κάποιου μεταβολίτη και γιατί; Υπάρχει αντίστοιχη ομοιότητα για τις ροές J(R2) και J(R3) με κάποιον από τους μεταβολίτες Ain, Aex, Bin και Bex; Πώς μπορεί να προσομοιωθεί η συνθήκη στην οποία για κάποιο λόγο το προϊόν σταματά να εξέρχεται από το κύτταρο; Στην περίπτωση αυτή ποιες οι τελικές συγκεντρώσεις του προϊόντος Β στο κύτταρο (Βin) και στο περιβάλλον (Bex); Επαναφέρατε τις τιμές των μεταβλητών και τις παραμέτρους που ίσχυαν πριν την τελευταία δραστηριότητα. Ενεργοποιείστε την προσομοίωση για χρόνο 60 sec. Ποιες οι μέγιστες συγκεντρώσεις των μεταβολιτών Α και Β που παρατηρήθηκαν κατά τη διάρκεια της προσομοίωσης στο εσωτερικό του κυττάρου; Συγκρίνετε τις προηγούμενες τιμές με τις αντίστοιχες τιμές που προκύπτουν αν η αντίδραση εξόδου του Β από το κύτταρο είναι διευκολυνόμενη από διαμεμβρανικό ένζυμο που ακολουθεί κινητική Henri Michaelis-Menten με τιμές σταθερών Km=1, V=10. Σχολιάστε. 35

40 2η ΑΣΚΗΣΗ ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΜΕ ΚΙΝΗΤΙΚΗ MICHAELIS-MENTEN ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΟΥ ΜΟΝΤΕΛΟΥ Η άσκηση αυτή έχει ως στόχο την προσομοίωση της κλασικής ενζυμικής κινητικής Michaelis-Menten. Όπως είναι γνωστό, η περίπτωση αυτή προσεγίζεται με τη σύνθεση των δύο διαδοχικών αντιδράσεων που εμφανίζονται στο Σχήμα 2. E + S k1 k2 ES k3 E + P Σχήμα 2. Μοντελοποίηση ενζυμικής αντίδρασης με κινητική Michaelis-Menten. Η πρώτη αντίδραση με την οποία σχηματίζεται το σύμπλοκο ενζύμουυποστρώματος (ES) είναι αμφίδρομη και ακολουθεί κινητική πρώτης τάξης (mass action reversible), ενώ η δεύτερη κατά την οποία παράγεται το προϊόν P είναι μη αντιστρεπτή και ακολουθεί κινητική πρώτης τάξης (mass action irreversible). ΔΡΑΣΤΗΡΙΟΤΗΤΕΣ Προσδιορισμός του μοντέλου Eισάγονται οι 2 αντιδράσεις όπως αυτές περιγράφονται στο Σχήμα 2, ενώ ορίζονται και οι κινητικοί τους τύποι από την επιλογή Rate Law. Οι αμφίδρομες αντιδράσεις εισάγονται με το σύμβολο =. Οι σταθερές πρέπει να λάβουν τις ακόλουθες τιμές R1: k1=100, k2=1(mass action reversible) R2: k1=1 (Mass action irreversible) Μέσω της επιλογής Global Quantities (Model -> Biochemical -> Global Quantities) ορίζεται η συνάρτηση υπό το όνομα Κm (Simulation Type: assignment) και μαθηματικό τύπο: 36

41 ({(R1).k2} + {(R2).k1}) / {(R1).k1} Η παραπάνω μαθηματική φόρμουλα καθορίζεται μέσω του εικονιδίου select object. Ορίζονται οι αρχικές συγκεντρώσεις των μεταβολιτών (Species) με βάση τα δεδομένα του παρακάτω πίνακα. Η επιλογή Fixed στην περίπτωση του υποστρώματος αντιστοιχεί σε σύστημα στο οποίο υπάρχει μεγάλη περίσσεια S (μπορεί να επιτευχθεί με συνεχή παροχή). Name Compartment Type Initial Concentration (mmol/ml) E compartment reactions 1 ES compartment reactions 0 S compartment fixed 100 P compartment reactions 0 Το μοντέλο αποθηκεύεται (File -> Save as) ώστε να είναι διαθέσιμο για μελλοντική χρήση. Από την επιλογή Model -> Biochemical -> Parameter Overview πραγματοποιείται ο τελικός έλεγχος του μοντέλου που δημιουργήθηκε. Επιλογή εργασιών της διαδικασίας προσομοίωσης Ως τρόπος επίλυσης του μοντέλου ορίζεται η επιλογή Time Course (Tasks -> Time Course). Ο συνολικός χρόνος προσομοίωσης (Duration) ορίζεται στα 10 sec και τα μεσοδιαστήματα δειγματοληψίας (Intervals) σε 50. Οι παραμέτροι προς παρακολούθηση για το συγκεκριμένο μοντέλο είναι ο χρόνος (Time), οι μεταβατικές συγκεντρώσεις των μεταβολιτών (Transient Concentrations) [E]t, [ES]t, [S]t, [P]t, οι ροές των αντιδράσεων (Reaction Fluxes) (R1).Flux, (R2).Flux και η Km. Ερωτήσεις Ποιοι από τους μεταβολίτες εμφανίζουν σταθερή συγκέντρωση ως 37

42 προς το χρόνο; Ποιου μεταβολίτη η σταθερή συγκέντρωση απαιτεί απαραίτητη προϋπόθεση για την υπόθεση Briggs Haldane (quasi steadystate approximation); Τι ποσοστό του ενζύμου βρίσκεται στη μορφή συμπλόκου με το υπόστρωμα (ES); Πώς μεταβάλλεται η τιμή της Km σε συνάρτηση με το χρόνο; Ενεργοποιείστε τη διαδικασία σάρωσης παραμέτρων (Parameter Scan -> Create) για να μελετήσετε τη συμπεριφορά της διεργασίας όταν η αρχική συγκέντρωση του ενζύμου [Εi] πάρει τιμές στο πεδίο (δηλ. min=1, max=100, intervals=1). Επιλεξτε Run από το menu Parameter Scan ώστε να προσομοιωθεί η σάρωση, μελετήστε τα γραφήματα που παράγονται καθώς και τα αντίστοιχα αποτελέσματα σε μορφή.txt (Save Data). o Πώς διαφοροποιούνται οι τελικές συγκεντρώσεις των S, E, P; o Πώς διαφοροποιούνται οι ροές των 2 αντιδράσεων (R1).Flux, (R2).Flux; Αυξήστε τον αριθμό των μεσοδιαστημάτων της σάρωσης (intervals=5) και δημιουργείστε τα αντίστοιχα γραφήματα. Χρησιμοποιώντας τη διαδικασία σάρωσης παραμέτρων (Parameter Scan) βρείτε πώς επηρεάζει την τιμή της Km η μεταβολή (min=1, max=100, intervals=5) καθεμιάς από τις κινητικές σταθερές του μοντέλου [(R1).k1, (R1).k2, (R2).k1]. Ποια σταθερά έχει τη μεγαλύτερη επίδραση; Tip -> Μελετήστε την επίδραση κάθε σταθεράς ξεχωριστά. Η παραγωγή ενός Report που θα περιέχει τις τιμές της Km όπως αυτές διαμορφώνονται με βάση τις τιμές κάθε σταθεράς είναι ιδιαίτερα χρήσιμη. Από την επιλογή Parameter Scan -> Output Assistant μπορείτε να επιλέξετε την εξαγωγή νέου Report (Create New). Eπιλέγξτε τα δεδομένα εξόδου που θα περιέχονται στο Report από το Output Specifications -> Plots -> Create New και τρέξτε την προσομοίωση από το Parameter Scan, αφου πρώτα ορίσετε το όνομα του Report (Parameter Scan -> Report). Επαναλάβετε για κάθε μια από τις σταθερές. Προσομοιώστε την ενζυμική αντίδραση τύπου Michaelis-Menten 38

43 δημιουργώντας ένα καινούργιο μοντέλο που περιλαμβάνει μια αντίδραση της μορφής S à P και ορίζοντας την κινητική της αντίδρασης από την επιλογή Kinetic types. Οι μεταβλητές που απαιτούνται για το μαθηματικό τύπο της οριζόμενης από το χρήστη κινητικής και η κατηγορία καθεμιάς από αυτές είναι: E modifier k constant S substrate Km constant Επιλέγοντας τις ίδιες τιμές για τις παραμέτρους συγκρίνετε τα αποτελέσματα (χρονική εξέλιξη S, P, ροής αντίδρασης) των δύο εναλλακτικών μοντέλων. 39

44 3η ΑΣΚΗΣΗ ΣΥΝΑΓΩΝΙΣΤΙΚΗ ΚΑΙ ΜΗ ΣΥΝΑΓΩΝΙΣΤΙΚΗ ΠΑΡΕΜΠΟΔΙΣΗ ΤΗΣ ΔΡΑΣΗΣ ΕΝΖΥΜΩΝ ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΟΥ ΜΟΝΤΕΛΟΥ Σκοπός της παρούσας άσκησης είναι η μοντελοποίηση και σύγκριση δύο βιοχημικών οδών όπου ασκείται συναγωνιστική (competitive) και μη συναγωνιστική (non competitive) παρεμπόδιση της ενζυμικής δράσης. Και στις δύο περιπτώσεις ισχύει η ακολουθία των αντιδράσεων που παρουσιάζεται στο Σχήμα 3. A - B C Σχήμα 3. Βιοχημικό μοντέλο με παρεμπόδιση της ενζυμικής δράσης. Οι αντιδράσεις που λαμβάνουν χώρα είναι οι ακόλουθες: 1. Α = Β. Ενζυμική μετατροπή του υποστρώματος Α στο ενδιάμεσο προϊόν Β 2. Β = C. Ενζυμική μετατροπή του ενδιάμεσου Β σε τελικό προϊόν C Όπως απεικονίζεται στο σχήμα, το τελικό προϊόν C ασκεί παρεμποδιστική δράση στη μετατροπή του Α σε Β. Η αμφίδρομη αντίδραση μετατροπής του Α σε Β υφίσταται συναγωνιστική παρεμπόδιση στην πρώτη περίπτωση και μη συναγωνιστική παρεμπόδιση στη δεύτερη. Και στις δύο περιπτώσεις η αντίδραση μετατροπής του Β σε τελικό προϊόν C είναι αμφίδρομη και ακολουθεί κινητική Michaelis-Menten. ΔΡΑΣΤΗΡΙΟΤΗΤΕΣ Προσδιορισμός του μοντέλου συναγωνιστικής παρεμπόδισης Eισάγονται οι 2 αντιδράσεις όπως αυτές περιγράφονται παραπάνω, ενώ ορίζονται και οι κινητικοί τους τύποι από την επιλογή Rate Law. Οι σταθερές πρέπει να λάβουν τις ακόλουθες τιμές. Ορίζεται αρχικά η R2 για πρακτικούς λόγους. 40

45 R1: Kms=1, Kmp=10, Vf=1, Vr=1, Ki=0.1, Inhibitor=C (Competitive inhibition reversible) R2: Kms=1, Kmp=10, Vf=1, Vr=1 (Reversible Michaelis-Menten) Ορίζονται οι αρχικές συγκεντρώσεις των μεταβολιτών (Species) με βάση τα δεδομένα του παρακάτω πίνακα. Name Compartment Type Initial Concentration (mmol/ml) A compartment reactions 10 B compartment reactions 0 C compartment reactions 0 Το μοντέλο αποθηκεύεται (File -> Save as) ώστε να είναι διαθέσιμο για μελλοντική χρήση. Η προσομοίωση της μη συναγωνιστικής παρεμπόδισης απαιτεί την δημιουργία και δεύτερου μοντέλου, συνεπώς ο διαχωρισμός των δύο μοντέλων και η αποθήκευση κάθε ενός ξεχωριστά μπορεί να διευκολύνει την σύγκριση ανάμεσα στα δύο είδη παρεμπόδισης. Από την επιλογή Model -> Biochemical -> Parameter Overview πραγματοποιείται ο τελικός έλεγχος του μοντέλου που δημιουργήθηκε. Προσδιορισμός μοντέλου μη συναγωνιστικής παρεμπόδισης Για το μοντέλο μη συναγωνιστικής παρεμπόδισης αρκεί μια μικρή τροποποίηση στο αρχείο που έχει ήδη δημιουργηθεί για τη συναγωνιστική παρεμπόδιση. Η τροποποίηση αυτή έγκειται στον ορισμό της κινητικής της πρώτης αντίδρασης (R1) ως Non-competitive inhibition reversible (Model -> Biochemical -> Reactions - > Rate Law). Αφού λοιπόν δημιουργηθεί αρχικά το πρώτο μοντέλο και αποθηκευτεί, πραγματοποιείται η μετατροπή για την R1, διαμορφώνεται το όνομα του νέου μοντέλου και το μοντέλο αποθηκεύεται εκ νέου με διαφορετικό όνομα αρχείου. 41

46 Επιλογή εργασιών της διαδικασίας προσομοίωσης Ως τρόπος επίλυσης του μοντέλου και στην μια και στην άλλη περίπτωση ορίζεται η επιλογή Time Course (Tasks -> Time Course) αλλά και η προσέγγιση Steady State (Tasks -> Steady State). Για την επίλυση time course: Ο συνολικός χρόνος προσομοίωσης (Duration) ορίζεται στα 300 sec και τα μεσοδιαστήματα δειγματοληψίας (Intervals) σε 50. Οι παραμέτροι προς παρακολούθηση για το συγκεκριμένο μοντέλο είναι ο χρόνος (Time), οι μεταβατικές συγκεντρώσεις των μεταβολιτών (Transient Concentrations) [A]t, [B]t, [C]t, οι ροές των αντιδράσεων (Reaction Fluxes) (R1).Flux, (R2).Flux. Για την επίλυση steady state: Οι παράμετροι προς παρακολούθηση είναι οι συγκεντρώσεις μόνιμης κατάστασης (steady state concentrations) [Α]ss, [Β]ss, [C]ss. Ερωτήσεις Συγκρίνοντας τις τελικές τιμές των συγκεντρώσεων των μεταβολιτών (επίλυση time course) με τις αντίστοιχες συγκεντρώσεις της επίλυσης steady state, μπορείτε να συμπεράνετε αν στο χρονικό διάστημα που διαρκεί η προσομοίωση το σύστημα έχει φτάσει σε μόνιμη κατάσταση; Απαντήστε και για τα 2 είδη παρεμπόδισης. Συγκρίνετε τις συγκεντρώσεις των μεταβολιτών στη μόνιμη κατάσταση για τα δύο είδη παρεμπόδισης. Να συγκρίνετε τις συγκεντρώσεις που έχουν οι μεταβολίτες στο τέλος της προσομοίωσης της συναγωνιστικής παρεμπόδισης (δηλ. μετά από 300 sec) με τις αντίστοιχες συγκεντρώσεις στην περίπτωση της μη συναγωνιστικής παρεμπόδισης. Σε ποιο από τα δύο είδη είναι πιο έντονο το φαινόμενο της παρεμπόδισης; Επαναλάβετε την προσομοίωση και για τα δύο είδη παρεμπόδισης χρησιμοποιώντας αυξημένη συγκέντρωση υποστρώματος (μεταβάλλετε 42

47 τη συγκέντρωση του Α από 10 σε 100). Πώς συγκρίνονται σ αυτήν την περίπτωση οι τελικές συγκεντρώσεις των μεταβολιτών μεταξύ συναγωνιστικής και μη συναγωνιστικής παρεμπόδισης; Τι συμπέρασμα εξάγετε για την επίδραση της συγκέντρωσης του υποστρώματος; Επαναφέρετε τη συγκέντρωση του Α στην αρχική τιμή (10) και επαναλάβετε την προσομοίωση και για τα δύο είδη παρεμπόδισης χρησιμοποιώντας αυξημένη συγκέντρωση τελικού προϊόντος C (μεταβάλλετε τη συγκέντρωση του C από 0 σε 2). Πώς συγκρίνονται σ αυτήν την περίπτωση οι τελικές συγκεντρώσεις του υποστρώματος μεταξύ συναγωνιστικής και μη συναγωνιστικής παρεμπόδισης; Τι συμπέρασμα εξάγετε για την επίδραση της συγκέντρωσης του τελικού προϊόντος; Επαναφέρετε τη συγκέντρωση του C στην αρχική τιμή (0) και επαναλάβετε την προσομοίωση και για τα δύο είδη παρεμπόδισης δίνοντας αυξημένη τιμή στη σταθερά παρεμπόδισης (μεταβάλλετε την τιμή του Κi από 0.1 σε 1). Πώς συγκρίνονται σ αυτήν την περίπτωση οι τελικές συγκεντρώσεις των μεταβολιτών μεταξύ συναγωνιστικής και μη συναγωνιστικής παρεμπόδισης; Τι συμπέρασμα εξάγετε για την επίδραση της τιμής του Ki; 43

48 4η ΑΣΚΗΣΗ ΚΥΚΛΟΣ ΤΟΥ ΓΛΥΟΞΥΛΙΚΟΥ ΟΞΕΟΣ (προσαρμοσμένη για το πρόγραμμα Gepasi) ΕΙΣΑΓΩΓΗ Τα κύτταρα των θηλαστικών δεν έχουν τη δυνατότητα να χρησιμοποιούν τα λιπαρά οξέα ως πρόδρομες ενώσεις για τη βιοσύνθεση υδατανθράκων. Αντίθετα, τα φυτά στη φάση εκβλάστησης μπορούν να μεταβολίσουν τα αποθέματα των λιπαρών ουσιών, που περιέχονται στους πλούσιους σε έλαια σπόρους, μετατρέποντάς τα σε σάκχαρα (κυρίως σακχαρόζη), έτσι ώστε να καλυφθούν οι αυξημένες ανάγκες των αναπτυσσόμενων φυτικών κυττάρων. Η μεταβολική αυτή διεργασία λαμβάνει χώρα σε εξειδικευμένα υποκυτταρικά οργανίδια που είναι γνωστά ως γλυοξυσώματα. Τα γλυοξυσώματα έχουν διάρκεια ζωής ίση περίπου με μια εβδομάδα και συνθέτουν κάποια από τα ένζυμα του κύκλου του κιτρικού οξέος. Επίσης διαθέτουν τη λυάση του ισοκιτρικού οξέος και τη συνθάση του μηλικού οξέος, ένζυμα με τα οποία μεταβολίζεται το ακετυλο-coa, που αποτελεί βασικό ενδιάμεσο στο μεταβολισμό των λιπαρών οξέων ώστε να προχωρά ο κύκλος του γλυοξυλικού οξέος. Ο κύκλος του γλυοξυλικού οξέος παρότι μοιάζει με αυτόν του κιτρικού οξέος χαρακτηρίζεται από σημαντικές διαφορές. Τα στάδια απομάκρυνσης του CO 2 στις αντιδράσεις του κύκλου του κιτρικού (που καταλύονται από τις αφυδρογονάσες του ισοκιτρικού και του κετογλουταρικού οξέος, αντίστοιχα) εμφανίζουν σημαντική υστέρηση. Αντίθετα, η παρουσία της λυάσης του ισοκιτρικού οξέος οδηγεί στη σύνθεση του γλυοξυλικού και του ηλεκτρικού οξέος. Το γλυοξυλικό οξύ με τη βοήθεια της συνθάσης του μηλικού οξέος αντιδρά με το ακετυλο-coa σχηματίζοντας μηλικό οξύ, το οποίο στη συνέχεια οξειδώνεται προς οξαλοξικό οξύ. Το δεύτερο προϊόν (ηλεκτρικό οξύ) εξέρχεται από τα γλυοξυσώματα, εισέρχεται στα μιτοχόνδρια και μετατρέπεται σε μηλικό οξύ, το οποίο μετά την έξοδό του στο κυτταρόπλασμα χρησιμοποιείται στη σύνθεση σακχαρόζης. Οι βασικές αντιδράσεις του κύκλου απεικονίζονται στο Σχήμα

49 ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΟΥ ΜΟΝΤΕΛΟΥ Οι μεταβολίτες που συμμετέχουν στις αντιδράσεις του μοντέλου είναι: AcetylCoA ή X, ακετυλο-coa (προϊόν μετατροπής των λιπαρών οξέων) ISO, ισοκιτρικό οξύ KET, α-κετογλουταρικό οξύ SUC, ηλεκτρικό οξύ MAL, μηλικό οξύ OAA, οξαλοξικό οξύ GLY, γλυοξυλικό οξύ Y, γλουταμικό οξύ (δεξαμενή για τη βιοσύνθεση κυτταρικών συστατικών) Ζ, πρόδρομος στο μονοπάτι βιοσύνθεσης σακχαρόζης AcetylCoA ή X OAA Ε1 Z Ε9 Ε8 MAL Ε7 GLY Ε6 ISO Ε2 Ε5 KET SUC Ε4 Ε3 Y 45

50 Σχήμα 4.1 Βιοχημικό μοντέλο του κύκλου του γλυοξυλικού οξέος. Τα ένζυμα που καταλύουν τις αντιδράσεις του μοντέλου είναι: E1, συνθάση του κιτρικού, ακονιτάση E2, αφυδρογονάση του ισοκιτρικού E3, αφυδρογονάση του γλουταμικού E4, αφυδρογονάση του κετογλουταρικού E5, αφυδρογονάση του ηλεκτρικού E6, λυάση του ισοκιτρικού E7, συνθάση του μηλικού E8, αφυδρογονάση του μηλικού Οι αντιδράσεις του μοντέλου είναι: Οι αρχικές συγκεντρώσεις των μεταβολιτών που συμμετέχουν στις αντιδράσεις του μοντέλου (εκ των οποίων αυτές των ενζύμων και των Χ, Υ, Z είναι σταθερές-fixed) είναι: 46

51 Για την επίλυση του μοντέλου απαιτείται εισαγωγή 3 νέων κινητικών τύπων (Model definition/kinetic Types/Add) Οι 3 κινητικοί τύποι (παραλλαγές της Michaelis-Menten) και οι κατηγορίες των μεταβλητών τους πρέπει να τεθούν με βάση τα στοιχεία που ακολουθούν: 1. 1S-1P (1 υπόστρωμα & 1 προϊόν): E*(VS*S1 - VP*P1)/(KM+ S1 + P1) 2. 1S-2P (1 υπόστρωμα & 2 προϊόντα): E*(VS*S1 - VP*P1*P2)/(KM+ S1 + P1 + P2) 3. 2S-1P (2 υποστρώματα & 1 προϊόν): E*(VS*S1*S2 - VP*P1)/(KM+ S1 + S2 + P1) EnzymeScaled-MM-1S-1P EnzymeScaled-MM-1S-2P EnzymeScaled-MM-2S-1P E Modifier E Modifier E Modifier VS Constant VS Constant VS Constant S1 Substrate S1 Substrate S1 Substrate VP Constant VP Constant VP Constant 47

52 P1 Product P1 Product P1 Product KM Constant P2 Product KM Constant KM Constant S2 Substrate Η κινητική των αντιδράσεων του μοντέλου και οι σχετικές σταθερές είναι: Κινητική VS VP Km Modifier R1 Χ+ΟΑΑ = ISO EnzymeScaled-MM- 2S-1P E1 R2 ISO=KET EnzymeScaled-MM- 1S-1P E2 R3 KET=Y EnzymeScaled-MM- 1S-1P E3 R4 KET=SUC EnzymeScaled-MM- 1S-1P E4 R5 SUC=MAL EnzymeScaled-MM- 1S-1P E5 R6 ISO=GLY+SU C EnzymeScaled-MM- 1S-2P E6 R7 GLY+X=MAL EnzymeScaled-MM- 2S-1P E7 R8 MAL=Z EnzymeScaled-MM- 1S-1P E8 R9 MAL=OAA EnzymeScaled-MM- 1S-1P E9 ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ 1. Με βάση τα διαγράμματα της εξέλιξης της συγκέντρωσης των μεταβολιτών ως προς το χρόνο, ποιοι μεταβολίτες παρουσιάζουν σταθερή συγκέντρωση; Ποιος από τους μεταβολίτες του κύκλου του γλυοξυλικού οξέος (που δεν έχει σταθερή συγκέντρωση - fixed) εμφανίζει τη μεγαλύτερη συγκέντρωση στη σταθερή κατάσταση; 2. Με βάση την τάξη μεγέθους των ροών (J) των αντιδράσεων (R1-R9) να 48

53 εντοπίσετε το τμήμα του κύκλου του γλυοξυλικού οξέος που παρουσιάζει υστέρηση. 3. Με δεδομένο ότι το σχετικό τμήμα του κύκλου του κιτρικού οξέος παρουσιάζει υστέρηση, πώς καλύπτονται οι απαιτήσεις των αναπτυσσόμενων φυτικών κυττάρων για τη βιοσύνθεση κυτταρικών συστατικών; 4. Με βάση τις τιμές του συντελεστή ελαστικότητας (ELASTICITIES) ποιο από τα προϊόντα (ηλεκτρικό ή γλυοξυλικό οξύ) ασκεί μεγαλύτερη αρνητική επίδραση στη ροή της αντίδρασης R6; 5. Με βάση τις τιμές του συντελεστή ελέγχου συγκέντρωσης (CONCENTRATION CONTROL COEFFICIENTS), να εντοπίσετε τις 2 αντιδράσεις που ασκούν τη μεγαλύτερη θετική και αρνητική επίδραση, αντίστοιχα, στη συγκέντρωση του γλυοξυλικού οξέος. 6. Με βάση τις τιμές του συντελεστή ελέγχου ροής (FLUX CONTROL COEFFICIENTS) η αύξηση στη δραστικότητα ποιου(ών) ενζύμου(ων) θα μπορούσε να οδηγήσει σε μεγαλύτερη ταχύτητα σχηματισμού σακχαρόζης μέσω του κύκλου του γλυοξυλικού οξέος; 49

54 ΒΑΣΙΚΕΣ ΟΔΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ PYMOL 50

55 1. Εισαγωγή Το PyMOL αποτελεί ένα σύστημα απεικόνισης μοριακών γραφικών σε πραγματικό χρόνο για τη δημιουργία τόσο εικόνων υψηλής ποιότητας όσο και κινουμένων σχεδίων (animation). Επίσης, είναι δυνατή η τροποποίηση υπαρχόντων αρχείων PDB (Protein Data Bank), βοηθώντας έτσι αποτελεσματικά την δομική μελέτη πρωτεϊνικών μορίων. Πρόκειται για ένα πρόγραμμα ανοικτού λογισμικού το οποίο είναι ελεύθερα διαθέσιμο (μέχρι την έκδοση v0.99) μέσω του διαδικτύου στον παρακάτω σύνδεσμο: Οι εκδόσεις του PyMOL πέρα της v0.99 απαιτούν πληρωμή ενώ αντίθετα εξακολουθεί ο κώδικας να είναι ανοικτός (open-source access). Για τον λόγο αυτό, δεν συνίσταται το κατέβασμα της τελευταίας έκδοσης v1.0 η οποία λόγο κόστους είναι αντίθετη στη διδασκαλία του εργαστηριακού μαθήματος. Στην ιστοσελίδα PyMolWiki υπάρχουν χρήσιμες πληροφορίες και σύνδεσμοι (links) για το PyMOL οι οποίες ανανεώνονται συχνά: 2. Δυνατότητες προγράμματος Συμβατότητα: Το PyMOL υποστηρίζει συστήματα Unix, Macintosh όπως και Windows. Χειρισμός μέσω γραφικού περιβάλλοντος (Graphical User Interface, GUI) και μέσω εντολών (command line): Ο ταυτόχρονος χειρισμός δίνει στο χρήστη τη δυνατότητα τόσο απλής όσο και εξειδικευμένης χρήσης του προγράμματος. Επιλογή ατόμων, διαίρεση και ένωση μοριακών δομών: Πρωτεϊνικά μόρια μπορεί να κοπούν, να μοιραστούν και τελικά να ενωθούν πολύ σύντομα, παράγοντας καινούργια αρχεία PDB. Ταινίες: Δυνατότητα δημιουργίας animation και εξαγωγή αυτών σε διάφορα πρωτόκολλα όπως GIF ή mpeg χρησιμοποιώντας εξειδικευμένες εντολές. Απεικόνιση των πρωτεϊνών με διάφορους τρόπους όπως π.χ. σε επιφάνειες (surface), cartoon ή ribbons: Η δυνατότητα απεικόνισης των 51

56 πρωτεϊνών με τους τρεις αυτούς τρόπους γίνεται αρκετά εύκολα και σε ποιότητα ίδια με εκείνη άλλων εξειδικευμένων προγραμμάτων γνωστών στο χώρο της Δομικής Βιολογίας όπως το Molscript. Φωτοσκίαση: Ένα πανίσχυρο ενσωματωμένο πρόγραμμα (Ray-tracer) δίνει τη δυνατότητα στο PyMOL δημιουργίας σκιάσεων και βάθους σε κάθε εικόνα, παράγοντας έτσι εικόνες εντυπωσιακών γραφικών. Εξαγωγή: Οι εικόνες του PyMOL μπορούν να εξαχθούν σε αρχεία PNG τα οποία μεταφέρονται απευθείας στο MS Powerpoint. Δυνατότητα προσθήκης συμπληρωματικών χαρακτηριστικών (plugins) εμπλουτίζοντας τις δυνατότητες ή απλοποιώντας δύσκολες τεχνικές όπως για παράδειγμα την κατασκευή μοριακών βίντεο. Χρήσιμα plugins: Ø Colorama (αύξηση δυνατοτήτων χρωματισμού) o Ø ProMOL (εύρεση καταλυτικών κέντρων) o Ø Emovie (ευκολότερη δημιουργία μοριακών βίντεο) o Ø Ez-Viz (ευκολότερη διαχείριση μοριακών δομών) o 52

57 3. Εγκατάσταση σε Περιβάλλον MS Windows Προτιμώμενη εγκατάσταση: Windows 2000 ή XP. Σχετικά σύγχρονο μοντέλο κάρτας γραφικών με επιταχυντή γραφικών συμβατό με 3D OpenGL της nvidia, ATI, 3Dlabs ή παρόμοια αυτών. 512 ΜΒ RAM (προτιμότερα 768 ΜΒ ή 1 GB). Επεξεργαστής στα 3 GHz Pentium 4 ή παρόμοιος. Ελάχιστες απαιτήσεις: Windows 98 και ME, ή νεότερες εκδόσεις αυτών. Το PyMOL δεν είναι συμβατό με τα Windows 95 και NT. Κάρτα γραφικών με επιταχυντή γραφικών συμβατό με 3D OpenGL. 256 MB RAM. Επεξεργαστής 500 MHz Pentium Διαδικασία εγκατάστασης 1. Κατεβάζουμε από το σύνδεσμο το συμπιεσμένο αρχείο *.zip όπως για παράδειγμα το παρακάτω: pymol-0_99-bin-win32.zip 2. Αποσυμπίεση του αρχείου χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα WinZip. Οι χρήστες Windows XP ανοίγουν το αρχείο αυτό (*.zip) απευθείας. 3. Διπλό κλικ στο εικονίδιο Setup ή Setup.exe. 4. Ακολουθούμε τη διαδικασία μέσω του οδηγού εγκατάστασης των Windows. Μετά την επιτυχή εγκατάσταση του PyMOL, η εφαρμογή μπορεί να τρέξει από το Start Menu των Windows. 53

58 3.2 Φορτώνοντας αρχεία PDB Ø Χρησιμοποιώντας τον εξωτερικό GUI Ο εξωτερικός GUI παρέχει την κλασσική επιλογή <Open> από το μενού <File> η οποία μας δίνει τη δυνατότητα να επιλέξουμε (Browse) το αρχείο PDB που θέλουμε να ανοίξουμε. Ø Χρησιμοποιώντας εντολές Load <όνομα αρχείου> παράδειγμα load test/dat/pept.pdb Εικόνα από το PyMOL μετά τη φόρτωση ενός αρχείου PDB. 54

59 4. Τα παράθυρα του PyMOL Το PyMOL ανοίγει δυο παράθυρα: Το εσωτερικό και εξωτερικό παράθυρο του GUI. Τα δύο παράθυρα του PyMOL Το GUI είναι η συντομογραφία του Graphical User Interface, το οποίο αποτελείται συνήθως από μενού, κουμπιά, κείμενα και άλλα γνωστά στους χρήστες Windows χαρακτηριστικά. Το PyMOL διαθέτει δύο τέτοια GUI: Ένα εσωτερικό το οποίο βρίσκεται μέσα στο παράθυρο που βλέπουμε μια πρωτεΐνη (Viewer) και ένα εξωτερικό το οποίο βρίσκεται ακριβώς πάνω από το παράθυρο του Viewer. Οι λόγοι για τους οποίους υπάρχουν δυο GUI είναι καθαρά τεχνικοί αλλά σύντομα, σε μελλοντική έκδοση, τα δυο ξεχωριστά GUI θα ενωθούν σε ένα κύριο. 55

60 4.1 Το παράθυρο του Viewer Ο Viewer του PyMOL αποτελεί την καρδιά του συστήματος. Είναι ένα OpenGL παράθυρο όπου όλα τα 3D γραφικά απεικονίζονται ενώ παράλληλα λαμβάνουν χώρα όλες οι αλληλεπιδράσεις του χρήστη με το τρισδιάστατο πρωτεϊνικό μόριο. O Viewer του PyMOL με τον εσωτερικό GUI Ο εσωτερικός GUI ο οποίος περιέχεται στο παράθυρο αυτό (δεξιά) μας επιτρέπει να εκτελούμε ενέργειες σε συγκεκριμένα αντικείμενα και επιλεγμένα άτομα. Από πάνω προς τα κάτω, περιέχονται ένας κατάλογος ονομάτων, ένας πίνακας διάταξης των λειτουργιών των πλήκτρων του ποντικιού, ένας δείκτης frame/sec και μια ομάδα από κουμπιά βίντεο για τη λειτουργία animation. Ο Viewer περιέχει επίσης γραμμή εντολών για το τρέξιμο εντολών του PyMOL. Πατώντας το ESC μπορούμε να αλλάζουμε μεταξύ γραφικού περιβάλλοντος και γραμμής εντολών σε όλη την επιφάνεια του Viewer. 56

61 4.2 Το παράθυρο του εξωτερικού GUI Το PyMOL διαθέτει και ένα εξωτερικό GUI παράθυρο το οποίο παρέχει μία μπάρα επιλογών, τη γραμμή εντολών και μία μικρή περιοχή εμφάνισης των εντολών που εκτελούνται (output). Το εξωτερικό GUI παράθυρο του PyMOL Βασικό πλεονέκτημα του εξωτερικού GUI έναντι του εσωτερικού είναι ότι υποστηρίζει λειτουργίες αποκοπής και επικόλλησης (cut and paste) εντολών ή και γενικά μικρών προγραμμάτων (scripts) στη γραμμή εντολών του. Για τον σκοπό αυτό χρησιμοποιούμε τις συντομεύσεις Ctrl-X, Ctrl-C και Ctrl-V για αποκοπή (Cut) αντιγραφή (Copy) και επικόλληση (Paste) αντίστοιχα, αφού το κλασσικό Edit menu των Windows δεν έχει ακόμη προστεθεί. 5. Χειρισμός της εικόνας Το ποντίκι αποτελεί το βασικό εργαλείο κίνησης και χειρισμού της εικόνας του PyMOL ενώ τα πλήκτρα (SHIFT, CTRL, SHIFT+CTRL) χρησιμοποιούνται βοηθητικά για να τροποποιούν τις βασικές λειτουργίες του ποντικιού. Για την αποτελεσματικότερη χρήση του PyMOL είναι αναγκαία η χρήση ποντικιού με τρία πλήκτρα ή ποντίκι δύο πλήκτρων με ροδέλα στη μεσαία θέση. 57

62 5.1 Βασικές λειτουργίες ποντικιού Γενικά τα ποντίκια τα οποία διαθέτουν αντί μεσαίου πλήκτρου μία ροδέλα μπορούν να χρησιμοποιηθούν ακριβώς το ίδιο απλά με το πάτημα της προς τα κάτω. Βασικές λειτουργίες ποντικιού Ο παρακάτω πίνακας συνοψίζει τις λειτουργίες των πλήκτρων του ποντικιού οι οποίες αναγράφονται στον εσωτερικό GUI μαζί με τους συνδυασμούς των βοηθητικών πλήκτρων. Βοηθητικά Αριστερό Μεσαίο πλήκτρο Δεξί πλήκτρο πλήκτρα πλήκτρο Περιστροφή Μετακίνηση στο Μετακίνηση στον (Trackball) επίπεδο ΧΥ άξονα Ζ Πλήκτρο SHIFT Επιλογή επιφανειακών τομών Πλήκτρο CTRL Πλήκτρο Επιλογή SHIFT+CTRL διαφορετικού συστήματος συντ/νων περιστροφής 58

63 Στον εσωτερικό GUI υπάρχει η συντομογραφία του παραπάνω πίνακα θυμίζοντας στο χρήστη τις δυνατότητες που παρέχονται χρησιμοποιώντας το ποντίκι ως έχει ή σε συνδυασμό με τα βοηθητικά πλήκτρα: L M R Rota Move MovZ Shft Ctrl CtSh Orig Clip 5.2 Περιστροφή Trackball Η περιστροφή αυτή γίνεται σαν να υπάρχει μια αόρατη μπάλα στο κέντρο του μορίου/πρωτεΐνης που μελετάμε. Όταν κρατάμε το αριστερό πλήκτρο του ποντικιού πατημένο και κινούμε το ποντίκι είναι σαν να κινούμε την αόρατη αυτή μπάλα με το χέρι μας σε οποιαδήποτε κατεύθυνση εμείς θέλουμε. Στην περίπτωση που κάνουμε κλικ έξω από τη νοητή σφαίρα, εκτελούμε περιστροφή μόνο στον άξονα Ζ. Γενικά, ο χειρισμός της εικόνας είναι ευκολότερος όταν κάνουμε αριστερό κλικ στο κέντρο της εικόνας και κινούμε το δείκτη του ποντικιού προς τα έξω (κυρίως περιστροφή στο επίπεδο ΧΥ) ή με κλικ γύρω από τα άκρα της εικόνας και κίνηση σε κυκλική τροχιά (περιστροφή στον άξονα Ζ). Εικονικό Trackball του PyMOL 59

64 5.3 Επιλογή επιφανειακών τομών (clip) Γενικά, ο χειρισμός επιλογής των επιφανειακών τομών είναι κάτι ασυνήθιστο και χρειάζεται εξάσκηση για να καταλάβουμε πως ακριβώς χρησιμοποιείται. Αντί να υπάρχουν ξεχωριστοί χειρισμοί για την επιλογή τομών πίσω και μπροστά από τη μελετώμενη πρωτεΐνη, όλοι οι χειρισμοί συνδυάζονται σε έναν όπου η κίνηση του ποντικιού πάνω-κάτω επιλέγει μπροστινά επίπεδα της πρωτεΐνης (κοντινά πλάνα) ενώ η κίνηση δεξιάαριστερά του ποντικιού επιλέγει τα πίσω επίπεδα της πρωτεΐνης (απομακρυσμένα πλάνα). Επιλογή επιφανειακών τομών Η επιλογή επιφανειακών τομών είναι επίσης δυνατή με τη χρήση της εντολής clip από την γραμμή εντολών. 5.4 Επιλογή διαφορετικού συστήματος συντεταγμένων περιστροφής Κατά τη μελέτη μίας πρωτεΐνης, είναι αναγκαία η επιλογή διαφορετικής αρχής συντεταγμένων της περιστροφής του συστήματος με σκοπό την επιθεώρηση της γειτονικής ως προς ένα άτομο περιοχής. Ο γρηγορότερος τρόπος στο PyMOL είναι η επιλογή ενός ατόμου πατώντας ταυτόχρονα Control + Shift + Μεσαίο κλικ ποντικιού. Όπως θα δούμε παρακάτω (παρ. 6.1), η επιλογή αυτή μπορεί να γίνει και από τις εντολές του μενού Action του εσωτερικού GUI. 60

65 Επιλογή αρχής συντεταγμένων περιστροφής με τη χρήση ποντικιού 6. Χειρισμός βασικών λειτουργιών του PyMOL μέσω εσωτερικού GUI Όπως αναφέρθηκε και παραπάνω (παρ. 4.1), η χρήση του εσωτερικού GUI διευκολύνει την εφαρμογή πολύπλοκων εντολών και προγραμμάτων script σε ένα βιομόριο χρησιμοποιώντας απλά το ποντίκι. Μετά την φόρτωση ενός αρχείου PDB, εμφανίζονται δύο μπάρες στα δεξιά του viewer, η μία με το όνομα <all> ενώ η άλλη με το όνομα του PDB αρχείου (π.χ. <1YPQ>). Κάθε μία απο τις μπάρες στο δεξί της μέρος έχει τα αρχικά A (Action), S (Show), H (Hide), L (Label) και C (Color). Πλευρικές μπάρες εσωτερικού GUI Κάθε ένα από τα παραπάνω στοιχεία διαθέτει ένα υπομενού από εντολές οι οποίες πραγματοποιούνται στο αντικείμενο που εκπροσωπεί η μπάρα στην οποία αναγράφονται. Το συγκεκριμένο χαρακτηριστικό είναι πολύ χρήσιμο όταν κάνουμε επιλογές ατόμων, μορίων, αμινοξέων ή και ακόμη ολόκληρων 61

66 μεγαλομοριακών τμημάτων όπου εμφανίζεται μία νέα μπάρα με το όνομα <(sele)> (selection) στην οποία μπορούμε να εφαρμόσουμε τις συγκεκριμένες εντολές για να αναδείξουμε έτσι ενδιαφέροντα στοιχεία στη δομή του βιομορίου που μελετάμε. Για τις ανάγκες του εργαστηριακού μαθήματος θα προβούμε μόνο στα βασικά στοιχεία των εντολών αυτών τα οποία θα μας δώσουν την δυνατότητα της λεπτομερούς επισκόπησης πρωτεϊνικών δομών για την κατανόηση των βασικών εννοιών όπως η πρωτοταγής, δευτεροταγής, τριτοταγής και τεταρτοταγής δομή αλλά και της πολύ σημαντικής περιοχής για την καταλυτική ενεργότητα ενός ενζύμου που είναι το ενεργό κέντρο. 6.1 Εντολές του μενού Action Από το υπομενού αυτό θα ασχοληθούμε με τις παρακάτω εντολές: v <zoom>: Μεγεθύνει/μικραίνει την περιοχή που έχουμε επιλέξει (ή και όλο το μόριο στην περίπτωση της μπάρας <all>) ώστε να καλύπτει όλο το παράθυρο του viewer. v <orient>: Περιστρέφει το βιομόριο/επιλογή και το τοποθετεί στις αρχικές συντεταγμένες που ορίζει το αρχείο PDB. v <centre>: Κεντράρει το βιομόριο/επιλογή στην περίπτωση που το έχουμε μετακινήσει στο επίπεδο ΧΥ. v <preset>: Υπομενού με προεπιλεγμένες παραμέτρους απεικόνισης όπως o <simple>: απεικόνιση σε γραμμική μορφή της πεπτιδικής αλυσίδας (ribbon) παρουσία των ετεροατόμων και των μορίων διαλύτη (H 2 O). o <simple (no solvent)>: όπως το <simple> αλλά χωρίς τα μόρια διαλύτη (H 2 O). 62

67 o <ball and stick>: απεικόνιση σε μορφή ball and stick. o <b factor putty>: απεικόνιση σχετικά με την κινητικότητα που εμφανίζει η πεπτιδική αλυσίδα ενός βιομορίου. Το παραγόμενο σχήμα έχει μεταβλητές εξαρτώμενες της κινητικότητας, τόσο στο μέγεθος όσο και στο χρώμα της πεπτιδικής αλυσίδας. o <technical>: απεικόνιση κατάλληλη για δημιουργία/τροποποίηση τρισδιάστατων μοντέλων (κρυσταλογραφία/δομική βιολογία). 63

68 o <ligands>: εστίαση σε ενώσεις συναρμογής (ligands) οι οποίες π.χ. μπορεί να αποτελούν υποστρώματα στα ενεργά κέντρα των βιομορίων. o <ligand sites>: εστίαση στις περιοχές όπου αλληλοεπιδρούν οι ενώσεις συναρμογής με τα βιομόρια (ενεργά κέντρα, περιοχές δέσμευσης υδατανθράκων (CBMs), κτλ). Οι περιοχές αυτές μπορεί να απεικονιστούν υπό τη μορφή cartoon (i), χωροπληρωτικά (solid surface) (ii), διαφανή χωροπληρωτικά (transparent surface) (iii), όπως και χωροπληρωτικά μοντέλα dot surface (iv) και mesh surface (v). 64

69 (i) (ii) (iii) (iv) (v) o <pretty>: απεικόνιση cartoon μαζί με τα υποστρώματα/ligands έχοντας επιπλέον λεπτομέρειες που βελτιστοποιούν την εμφάνιση. o <pretty (with solvent)>: η απεικόνιση pretty παρουσία μορίων διαλύτη. o <publication>: απεικόνιση υψηλής ποιότητας κατάλληλης για δημοσίευση σε έγκριτα διεθνή επιστημονικά περιοδικά. o <publication (with solvent)> η απεικόνιση publication παρουσία μορίων διαλύτη. 65

70 v <find><polar contacts>: Υπομενού για την εύρεση σημαντικών πληροφοριών όπως οι αλληλοεπιδράσεις μεταξύ ligands ή υποστρωμάτων με τις πλευρικές ομάδες αμινοξέων ενεργών κέντρων ή γενικότερα με αμινοξέα περιοχών δέσμευσης ligands πρωτεϊνών. o <within selection>: απεικόνιση με διακεκομενες γραμμές των αλληλεπιδράσεων μεταξύ ομάδων που έχουν επιλεγεί. o <involving side chains>: απεικόνιση με διακεκομενες γραμμές των αλληλεπιδράσεων μεταξύ των πλευρικών αλυσίδων των αμινοξέων μεταξύ τους ή με άλλα παρεβρίσκοντα μόρια όπως μόρια H 2 O. o <involving solvent>: απεικόνιση με διακεκομενες γραμμές των αλληλεπιδράσεων μεταξύ μορίων διαλύτη με τις πλευρικές αλυσίδες των αμινοξέων ή με ετεροάτομα/υποστρώματα. o <excluding solvent>: απεικόνιση με διακεκομενες γραμμές των αλληλεπιδράσεων μεταξύ των πλευρικών αλυσίδων των αμινοξέων της πρωτεΐνης μεταξύ τους ή σε συνδυασμό με ετεροάτομα/υποστρώματα. o <excluding main chain>, <excluding intra-main chain>, <just intra-side chain>, <just intra-main chain>: απεικόνιση με διακεκομενες γραμμές των αλληλεπιδράσεων μεταξύ πλευρικών αλυσίδων αμινοξέων με άλλα μόρια εκτός της κύριας πεπτιδικής αλυσίδας ή μόνο μεταξύ των ενδο-πλευρικών αλυσίδων των αμινοξέων ή αντίστροφα μόνο μεταξύ των ενδο-πλευρικών αλυσίδων των αμινοξέων ή μεταξύ των ενδο-κυρίων πεπτιδικών αλυσίδων, αντίστοιχα. Οι διάφοροι παραπάνω συνδυασμοί δίνουν αποτελέσματα βασιζόμενα στο αρχείο PDB το οποίο μελετάμε μέσω του PyMOL. o <to other atoms in object>, <to others excluding solvent>, <to any atoms>, <to any excluding solvent>: οι εντολές αυτές εφαρμόζονται σε επιλεγμένα μέρη του συνολικού βιομορίου (μπάρα <sele>) όπου μπορόυμε να μελετήσουμε για παράδειγμα i) τις αλληλοεπιδράσεις ατόμων ή ετεροατόμων/υποστρωμάτων με άλλα άτομα, ii) άτομα εκτός μορίων διαλύτη, iii) οποιαδήποτε άτομα συμπεριλαμβανομένων των ετεροατόμων/υποστρωμάτων, iv) οποιαδήποτε άτομα συμπεριλαμβανομένων των ετεροατόμων εκτός μορίων διαλύτη, αντίστοιχα. Οι παραπάνω εντολές είναι πολύ σημαντικές αφού βοηθούν στην αποκάλυψη περιοχών δέσμευσης 66

71 όπως είναι το ενεργό κέντρο ή διαφόρων περιοχών δέσμευσης υδατανθράκων (Carbohydrate Binding modules, CBMs) ενός ενζύμου. v <hydrogens><add, remove>: Στο PyMOL για λόγους απλότητας, ως προεπιλογή, τα άτομα υδρογόνου παραλείπονται από μόριο το οποίο μελετάμε. Με την εντολή <add> προσθέτουμε τα υδρογόνα που υπολείπονται ενώ με την εντολή <remove> αφαιρούνται. v <remove waters>: Απομάκρυνση όλων των μορίων H 2 O από το μοντέλο που μελετάμε. v <sequence><include, exclude>: Επιλέγοντας την εντολή <include> ή <exclude> στο πάνω μέρος του viewer εμφανίζεται ή εξαφανίζεται, αντίστοιχα, η πρωτοταγής ακολουθία των αμινοξέων της πεπτιδικής αλυσίδας όπως και τυχόν ετεροάτομα/υποστρώματα της μελετώμενης πρωτεΐνης. Το ίδιο μπορεί να συμβεί πατώντας το κουμπί <S> (sequence) από το κάτω δεξί μέρος του Viewer. 6.2 Εντολές του μενού Show Οι εντολές Show επικεντρώνονται αποκλειστικά στην παρουσίαση του μορίου που μελετάμε χρησιμοποιώντας διαφορετικά στυλ (lines, sticks, ribbon, cartoon, dots, spheres, mesh, surface) τα οποία αναδεικνύουν διαφορετικά χαρακτηριστικά και πληροφορίες ανά περίπτωση. Τα παραπάνω στυλ απεικόνισης μπορεί να χρησιμοποιηθούν για την περίπτωση ολόκληρου ή μέρους του μορίου που μελετάμε, αντίστοιχα. Εδώ πρέπει να εστιάσουμε την προσοχή μας στο μονοπάτι εντολών <Show><as><X> και <Show><X> όπου Χ είναι ένα από τα στυλ που μόλις αναφέραμε (π.χ. cartoon). Στην πρώτη περίπτωση επιλέγουμε ένα στυλ εμφάνισης για το μελετούμενο μόριο (ή μέρος αυτού από τη μπάρα <sele>) ενώ στη δεύτερη περίπτωση προσθετικά μπορούμε να έχουμε παραπάνω από ένα στυλ εμφάνισης ταυτόχρονα. Στην περίπτωση των πολλαπλών στυλ εμφάνισης είναι απαραίτητος ο συνδυασμός εντολών Show και Hide για την προσθήκη και αφαίρεση διαφόρων στυλ εμφάνισης, αντίστοιχα. Από το υπομενού Show θα ασχοληθούμε με τις παρακάτω εντολές: v <as><lines, sticks, ribbon, cartoon, dots, spheres, mesh, surface>: Επιλέγουμε ένα μόνο στυλ για όλο ή μέρος (επιλογή <sele>) του μορίου που μελετάμε. Τα άτομα άνθρακα συμβολίζονται με πράσινο, τα άτομα 67

72 οξυγόνου με κόκκινο και τα άτομα αζώτου με μπλέ χρώμα. Τα στυλ που μπορούμε να επιλέξουμε είναι: o <lines>: απεικόνιση του μορίου ως απλές γραμμές. Πολύ χρήσιμο όταν έχουμε ένα μεγάλο μόριο και θέλουμε να επιλέξουμε ένα συγκεκριμένο αμινοξύ. o <sticks>: παρόμοιο στυλ με το lines με την διαφορά ότι οι γραμμές είναι τρισδιάστατες. o <ribbon>: απεικόνιση μόνο της κύριας πεπτιδικής αλυσίδας μίας πρωτεΐνης. Παρέχεται το σχήμα που παίρνει μία πρωτεΐνη στον χώρο χωρίς κανένα επιπλέον μοριακό δεδομένο. 68

73 o <cartoon>: απεικόνιση της τριτοταγούς δομής μίας πρωτεΐνης τονίζοντας τα δυο κύρια στοιχεία της δευτεροταγούς δομής που είναι οι α-έλικες και τα β-πτυχωτά φύλλα. o <dots>: απεικόνιση των ηλεκτρονικών νεφών των ατόμων του μορίου που μελετάμε υπό τη μορφή τελειών. o <spheres>: παρόμοια με την απεικόνιση dots με τη διαφορά ότι έχουμε εμφάνιση σφαιρών στην ακτίνα των ατομικών ηλεκτρονικών νεφών. 69

74 o <mesh>: η επιφάνεια του μορίου υπολογίζεται με βάση τα ηλεκτρονικά νέφη των ατόμων που αποτελούν την πρωτεΐνη δημιουργώντας έτσι ένα χωροπληρωτικό μοντέλο το οποίο καλύπτεται με ένα ηλεκτρονικό «δίχτυ». Με τον τρόπο αυτό μας δίνεται μία αντιπροσωπευτική απεικόνιση του σχήματος ενός μορίου στο χώρο. o <surface>: παρόμοιο χωροπληρωτικό μοντέλο με το mesh με την διαφορά ότι η επιφάνεια είναι αδιαφανής. 70

75 o o o o <organic><lines, sticks, spheres>: εκλεκτική απεικόνιση σε στυλ lines, sticks ή spheres για τα οργανικά μόρια εκτός πρωτεΐνης τα οποία μπορούν συνήθως να παίζουν ρόλο υποστρώματος. <main chain><lines, sticks, spheres>: εκλεκτική απεικόνιση σε στυλ lines, sticks ή spheres της κεντρικής πεπτιδικής αλυσίδας. <side chain><lines, sticks, spheres>: εκλεκτική απεικόνιση σε στυλ lines, sticks ή spheres των πλευρικών ομάδων των αμινοξέων της πεπτιδικής αλυσίδας. <disulfides><lines, sticks, spheres>: εκλεκτική απεικόνιση σε στυλ lines, sticks ή spheres των δισουλφιδικών δεσμών που πραγματοποιούνται μεταξύ δυο πλευρικών ομάδων αμινοξέων κυστεΐνης γειτνιαζόντων τμημάτων της πεπτιδικής αλυσίδας. Γενικότερα η εντολή αυτή είναι πολύ χρήσιμη για την σύντομη εύρεση δισουλφιδικών δεσμών, οι οποίοι εντοπίζονται εύκολα από το χρυσαφί τους χρώμα. 6.3 Εντολές του μενού Hide Οι εντολές του υπομενού Hide ενεργούν ακριβώς αντίθετα από τις αντίστοιχες που βρίσκονται στο υπομενού Show. Γενικότερα, ο συνδυασμός Show-Hide σε επιλεγμένα τμήματα (sele) ενός πρωτεϊνικού μορίου είναι ουσιαστικής σημασίας για την ανάδειξη σημαντικών περιοχών μίας πρωτεΐνης (π.χ. ενεργό κέντρο) και άλλων στοιχείων όπως η δευτεροταγής, τριτοταγής και σε κάποιες περιπτώσεις η τεταρτοταγής δομή η οποία ευθύνεται για τον καταλυτικό χαρακτήρα και ιδιότητες του υπό μελέτη βιομορίου. Οι εντολές Hide είναι περισσότερες σε αριθμό συγκριτικά με τις εντολές Show λόγω δύο επιπλέον εντολών που βρίσκονται στο μενού του πρώτου: v <hydrogens>: Απομάκρυνση των ατόμων υδρογόνου στην περίπτωση που απεικονίζονται αρχικά μετά την φόρτωση ενός αρχείου PDB ή κατά επιλογή από την εφαρμογή της εντολής <Action><hydrogens><add>. Η απομάκρυνση των ατόμων υδρογόνου γίνεται επίσης από την εντολή <Action><hydrogens> <remove> (παρ. 6.1). v <unselected>: Απεικόνιση μόνο του τμήματος που έχουμε επιλέξει (μπάρα sele), σβήνοντας το υπόλοιπο μόριο, διευκολύνοντας έτσι την μελέτη συγκεκριμένων περιοχών. 71

76 6.4 Εντολές του μενού Color Ο χρωματισμός του πρωτεϊνικού μοντέλου που μελετάμε στο PyMOL είναι σημαντικό στοιχείο του προγράμματος διότι εκτός από το αισθητικό αποτέλεσμα που προσφέρει το χρώμα, έχει και την ιδιότητα να επισημαίνει σημαντικά δομικά χαρακτηριστικά διευκολύνοντας έτσι τη μελέτη. Με τις εντολές του μενού Color, μπορούμε να διαλέξουμε ένα χρώμα (reds, greens, blues, yellows, magentas, cyans, oranges, tints, grays και αποχρώσεις αυτών) σε όλο το μόριο (μπάρα all ή μπάρα PDB αρχείου) ή τμήμα μορίου (μπάρα sele). Ο χρωματισμός με βάση δομικά χαρακτηριστικά ενός μορίου μπορεί να επιτευχθεί με τις παρακάτω εντολές: v <by element>: Χρωματισμός με βάση τα άτομα των στοιχείων άνθρακα (C), υδρογόνου (Η), αζώτου (Ν), οξυγόνου (Ο) και θείου (S). Οι διαφορετικές επιλογές που μπορούμε να κάνουμε σε χρώματα εστιάζονται μόνο για τα άτομα του άνθρακα. Η εντολή αυτή εφαρμόζεται μόνο στην περίπτωση απεικόνισης μίας πρωτεΐνης σε lines ή sticks. v <by chain><by chain (e. c), by chain (*/ca), by chain, chainbows>: Χρωματισμός με βάση τις διαφορετικές πεπτιδικές αλυσίδες (περίπτωση πρωτεΐνης που εμφανίζει τεταρτοταγή δομή). o <by chain (e. c)>: η εντολή αυτή εφαρμόζεται σωστά στην περίπτωση απεικόνισης μίας πρωτεΐνης σε lines ή sticks όπου ο χρωματισμός των ατόμων των στοιχείων άνθρακα, (τα υπόλοιπα στοιχεία παραμένουν σταθερά στο χρώμα που είχαμε αρχικά) διαφέρει ανά πεπτιδική αλυσίδα έτσι ώστε να ξεχωρίζουν αυτές μεταξύ τους. 72

77 o <by chain (*/ca)>: όμοια με την προηγούμενη εντολή με την διαφορά ότι χρωματίζονται διαφορετικά μόνο τα άτομα άνθρακα και όχι οι ομοιοπολικοί δεσμοί μεταξύ τους, οι οποίοι παραμένουν στο χρώμα που είχαν αρχικά ή από προηγούμενη εντολή χρωματισμού. o <by chain>: ο χρωματισμός στην περίπτωση αυτή συμβαίνει πολύ απλά ανά πεπτιδική αλυσίδα όπως και στις προηγούμενες περιπτώσεις, με την διαφορά ότι δεν δίνεται διαφορετικό χρώμα στα άτομα άλλων στοιχείων εκτός από την περίπτωση ετεροατόμων ή γενικότερα άλλων οργανικών μορίων εκτός της πρωτεΐνης. 73

78 o <chainbows>: στην περίπτωση της εντολής <chainbow> οι διαφορετικές πεπτιδικές αλυσίδες χρωματίζονται βαθμιδωτά από το μπλε χρώμα (αμινο-τελικό άκρο) ως το κόκκινο (καρβοξυλοτελικό άκρο) κάθε αλυσίδας. Στην περίπτωση που έχουμε πρωτεΐνες που αποτελούνται από μία μόνο πεπτιδική αλυσίδα (απουσία τεταρτοταγούς δομής) η εντολή αυτή δίνει το ίδιο αποτέλεσμα με την εντολή <spectrum><rainbow> που θα δούμε παρακάτω. v <by ss>: Ο χρωματισμός στην περίπτωση αυτή γίνεται με βάση στοιχεία δευτεροταγούς δομής (ss: secondary structure) που εμφανίζει μία πρωτεΐνη όπως είναι οι α-έλικες (Helix) και τα β-πτυχωτά φύλλα (Sheet). Τα κομμάτια της πεπτιδικής αλυσίδας τα οποία δεν εμφανίζουν κάποιο από τα δύο αυτά δομικά στοιχεία, εμφανίζονται σαν απλές γραμμές οι οποίες ονομάζονται loop. Οι επιλογές χρωματισμού για την εντολή αυτή είναι δύο. v <spectrum><rainbow (e. c), rainbow (*/ca), rainbow>: Η εντολή αυτή χρωματίζει ολόκληρη την πρωτεΐνη βαθμιδωτά από το μπλε χρώμα (αμινο-τελικό άκρο) ως το κόκκινο (καρβοξυλο-τελικό άκρο) με τη σειρά που είναι γραμμένα τα αμινοξέα στο αρχείο PDB. Στην περίπτωση που η 74

79 πρωτεΐνη αποτελείται από παραπάνω από μία πεπτιδικές αλυσίδες δεν γίνεται χρωματισμός ανά αλυσίδα όπως γίνεται στην εντολή <by chain>. o <rainbow (e. c)>: χρωματισμός των ατόμων άνθρακα και των ομοιοπολικών τους δεσμών βαθμιδωτά από το μπλε προς το κόκκινο χρώμα. Η εντολή αυτή έχει εφαρμογή σε απεικόνιση line και stick. o <rainbow (*/ca)>: χρωματισμός μόνο των ατόμων άνθρακα (όχι οι ομοιοπολικοί δεσμοί) βαθμιδωτά από το μπλε προς το κόκκινο χρώμα. Η εντολή αυτή έχει εφαρμογή σε απεικόνιση line και stick. o <rainbow>: χρωματισμός όλης της πεπτιδικής αλυσίδας βαθμιδωτά από το μπλε προς το κόκκινο χρώμα. o <b-factors>: χρωματισμός της πεπτιδικής αλυσίδας με βάση την κινητικότητα των επιμέρους πεπτιδικών αλυσίδων. Η βαθμίδωση 75

80 του χρώματος ξεκινά από το μπλε προς το κόκκινο χρώμα για την περίπτωση των λιγότερο ευκίνητων προς τις περισσότερο ευκίνητες αλληλουχίες αμινοξέων, αντίστοιχα. 7. Χρήσιμες εντολές εξωτερικού GUI 7.1 Μενού Display Οι εντολές του μενού Display έχουν σαν σκοπό να προσθέσουν στοιχεία στο μοριακό μοντέλο που μελετάμε αυξάνοντας είτε το αισθητικό αποτέλεσμα είτε την παροχή σημαντικών πληροφοριών. Οι σημαντικότερες εντολές είναι: v <Sequence>: Εμφάνιση της πρωτοταγούς ακολουθίας στο πάνω μέρος του παραθύρου Viewer. Η εντολή αυτή εκτελείται και από το υπομενού <Action><Sequence><include> ή από το κουμπί <S> στο κάτω δεξί μέρος του Viewer (παρ. 6.1). Επιπλέον, ο εξωτερικός GUI παρέχει και την δυνατότητα εμφάνισης διαφορετικών μορφών της πρωτοταγούς ακολουθίας όπως π.χ. χρήση κωδικών των αμινοξέων κατά IUPAC (1 γράμμα, προεπιλογή), χρήση των συντομογραφιών των αμινοξέων (3 γράμματα), ταξινόμηση ανά πεπτιδική αλυσίδα κτλ. v <stereo>: Με την επιλογή αυτή παράγεται εικόνα κατάλληλη για τη χρήση ειδικών γυαλιών τα οποία δίνουν στο χρήστη τρισδιάστατη απεικόνιση του μελετώμενου μοριακού μοντέλου. v <zoom>: Επιλογή θέασης σε συγκεκριμένες αποστάσεις (8, 12, 16, 20, 30 Angstroms) από το κέντρο του μορίου. v <clip>: Επιλογή επιφανειακών τομών σε συγκεκριμένες αποστάσεις (4, 6, 8, 12, 20 Angstrom) από το κέντρο του μορίου. v <background>: Επιλογή διαφορετικού φόντου προβολής του μοριακού μοντέλου. 76

81 v <Color space>: Επιλογή συστήματος χρωμάτων για την απεικόνιση των γραφικών από το PyMOL. v <Quality>: Επιλογή τρόπου επεξεργασίας των γραφικών αυξάνοντας ή μειώνοντας τις απαιτήσεις σε υπολογιστική ισχύ, βελτιστοποιώντας το παραγόμενο αποτέλεσμα ανάλογα με το ηλεκτρονικό υπολογιστή που χρησιμοποιούμε. v <Orthoscopic view>: Αυξάνει το ρεαλισμό των τρισδιάστατων γραφικών. v <Smooth lines>: Εφαρμόζεται στην περίπτωση απεικόνισης με line ή stick δίνοντας στο μοριακό μοντέλο απαλές γραμμές. v <Depth cue>: Δίνει βάθος στην απεικόνιση του μορίου σκιάζοντας τα απομακρυσμένα μέρη. v <Two sided lighting>: Φωτισμός από δύο αντίθετες πλευρές (αριστερά και δεξιά). v <Specular reflections>: Αντανακλάσεις φωτός στην επιφάνεια του μοντέλου από την τεχνητή πηγή φωτισμού ώστε τα γραφικά να δείχνουν ποιό ρεαλιστικά. 7.2 Μενού Settings Το μενού Settings μπορεί να μεταβάλει πολλές παραμέτρους σχετικά με τα γραφικά του PyMOL και τον τρόπο επεξεργασίας τους. Λόγω της πολυπλοκότητας των επιλογών που μας παρέχει το μενού αυτό, θα εστιάσουμε την προσοχή μας μόνο στις επιλογές εκείνες που τροποποιούν το μελετούμενο μοντέλο προσδίδοντας επιπλέον χαρακτηριστικά και δυνατότητες: v <cartoon> o <Round Helices, Fancy Helices, Cylindrical Helices>: επιλογή διαφορετικού τρόπου παρουσίασης των α-ελικών σε ένα πρωτεϊνικό μόριο. <Round Helices> <Fancy Helices> <Cylindrical Helices> 77

82 o <Flat Sheets, Fancy Sheets>: επιλογή διαφορετικού τρόπου παρουσίασης των β-πτυχωτών φύλλων σε ένα πρωτεϊνικό μόριο. <Χωρίς επιλογή> <Flat Sheets> <Flat + Fancy Sheets> o <Smooth Loops>: επιλογή παρουσίασης των πεπτιδικών αλυσίδων οι οποίες δεν εμφανίζουν κάποιο στοιχείο δευτεροταγούς δομής σε ένα πρωτεϊνικό μόριο με ομαλές καμπύλες. <Χωρίς επιλογή> <Smooth Loops> v <Transparency><Cartoon, Surface, Stick, Sphere>: Η εντολή αυτή είναι πολύ χρήσιμη στην περίπτωση που θέλουμε ένα ή περισσότερα στυλ απεικόνισης να είναι διαφανή με διαφορετικό ποσοστό (0%, 20%, 40%, 50%, 60%, 80%) διαφάνειας, με σκοπό την παρατήρηση μονάδων αμινοξέων τα οποία βρίσκονται π.χ. στο κέντρο μίας πρωτεΐνης. 78

83 <cartoon + surface transparent> <lines + sticks + surface transparent> 7.3 Μενού Wizard Το μενού Wizard προσφέρει εξειδικευμένους υπολογισμούς και διεργασίες από τις οποίες θα αναφέρουμε ενδεικτικά μόνο τις παρακάτω: v <Appearance>: Με την επιλογή αυτή μας δίνεται η δυνατότητα να δίνουμε συγκεκριμένα στυλ απεικόνισης επιλέγοντας απλά με το ποντίκι κάθε άτομο/αμινοξύ/αλυσίδα/αντικείμενο κτλ. v <Measurement>: Υπολογισμοί αποστάσεων, γωνιών, πολικών αλληλεπιδράσεων με γειτονικά μόρια και αποστάσεις αυτών μεταξύ τους είναι κάποια από τα στοιχεία που υπολογίζονται και εμφανίζονται στο μοριακό μοντέλο κατά την εφαρμογή της εντολής αυτής. v <Mutagenesis>: Πολύ χρήσιμη εντολή για την μελέτη της μετάλλαξης σημείου όπου πολύ εύκολα ο χρήστης του προγράμματος μπορεί να παρατηρήσει τυχόν δομικές αλλαγές που πραγματοποιούνται στο βιομόριο κατά την αντικατάσταση ενός αμινοξέος από κάποιο άλλο. 79

84 8. Παραγωγή και αποθήκευση υψηλής ποιότητας εικόνων 8.1 Ray-Tracing Ο Ray-Tracing είναι ένας αλγόριθμος για την παραγωγή υψηλής ποιότητας γραφικών από τα μελετώμενα στο PyMOL μόρια. Με την τεχνική αυτή παράγονται σκιάσεις από μία εικονική φωτεινή πηγή, δίνοντας έτσι ρεαλιστικές 3D εικόνες κατάλληλες για παρουσιάσεις ή δημοσιεύσεις σε διεθνή επιστημονικά περιοδικά. Το PyMOL αποτελεί το πρώτο πρόγραμμα απεικόνισης μοριακών δομών το οποίο διαθέτει υψηλής ταχύτητας ray-tracer. Επεξεργασία OpenGL (χειρισμός Real-time) Επεξεργασία Ray-traced (sec ή min ανά frame) Για να κάνουμε ray-tracing σε μία επιλεγμένη σκηνή της πρωτεΐνης απλά κάνουμε κλικ στο Ray Trace κουμπί στον εξωτερικό GUI ή χρησιμοποιώντας την εντολή ray στη γραμμή εντολών. Με τον ray tracer του PyMOL είναι δυνατή η δημιουργία υψηλής ποιότητας ταινιών (animation) με τη συναρμολόγηση επιμέρους ray traced εικόνων. 8.2 Αποθήκευση εικόνων (png) Όλες οι εικόνες (ray-traced ή όχι) μπορούν να αποθηκευτούν σε πρωτόκολλο PNG χρησιμοποιώντας την png εντολή. Οι εικόνες png είναι συμβατές με το πρόγραμμα παρουσιάσεων MS PowerPoint, οι οποίες μπορούν εύκολα να μετατραπούν σε διαφορετικού τύπου αρχεία (π.χ. jpeg) χρησιμοποιώντας ελεύθερα πακέτα λογισμικού όπως το ImageMagick 80

85 ( Οι εικόνες επίσης μπορούν να αποθηκευτούν χρησιμοποιώντας την εντολή <File><Save Image>. Οι εικόνες πάντα αποθηκεύονται στην ίδια ανάλυση με την οποία παρατηρούμε ένα μόριο στο παράθυρο του Viewer. Επομένως, αν θέλουμε υψηλής ανάλυσης εικόνες *.png, θα πρέπει να κάνουμε το παράθυρο του viewer μεγέθυνση σε πλήρη έκταση της οθόνης μας (maximize) και από τον εξωτερικό GUI εκτέλεση της εντολής <File><Save Image>. ΔΡΑΣΤΗΡΙΟΤΗΤΑ 1 η Απεικόνιση α-αμυλάσης, ξυλανάσης και εστεράσης του φερουλικού οξέος Άσκηση 1 Παρατήρηση μίας α-αμυλάσης από το πάγκρεας χοίρου [pdb:1ppi]. Ø Απομονώστε όλες τις α-έλικες που αποτελούνται από >10 αμινοξέα Ø Εύρεση δισουλφιδικών δεσμών μεταξύ ζευγαριών κυστεϊνών. Ποιο ζευγάρι ενώνει δύο έλικες μεταξύ τους; Άσκηση 2 Παρατήρηση μίας εστεράσης του φερουλικού οξέος από τον C. thermocellum με σιναπικό οξύ [pdb:1wb4]. Ø Εύρεση αμινοξέων ενεργού κέντρου μιας εστεράσης του φερουλικού οξέος του C.thermocellum 81

86 Ø Άποψη χωροπληρωτικού μοντέλου μαζί με τα υποστρώματα Ø Παρατήρηση καταλυτικών αμινοξέων και μετατοπίσεις αυτών λόγω παρουσίας υποστρώματος στο ενεργό κέντρο της εστεράσης του φερουλικού οξέος (FAE) από τον C. thermocellum. Εύρεση αποστάσεων μετατόπισης. 82

87 Άσκηση 3 Παρατήρηση μίας ξυλανάσης από τον T. aurantiacus με FAXX [pdb:2bnj]. Ø Δέσμευση του υποστρώματος (FAXX) στο ενεργό κέντρο μίας ξυλανάσης από τον T. aurantiacus Ø Υπολογισμός απόστασης δεσμού υδρογόνου μεταξύ μονάδας L- αραβινόζης και γλουταμινικού οξέος E46 Ø Το φερουλικό οξύ του μορίου του ολιγοσακχαρίτη βρίσκεται εκτός του ενεργού κέντρου της πρωτεΐνης άρα δεν παίζει ρόλο στον καταλυτικό μηχανισμό υδρόλυσης 83

88 ΔΡΑΣΤΗΡΙΟΤΗΤΑ 2 η Απεικόνιση ξυλανασων GH10 και GH11 και αραβινοφουρανοζιδάσης GH54 Άσκηση 1 Ξυλανάση από το βακτήριο Cellvibrio japonicus (GH10) [PDB ID: 2CNC] Ø Απομόνωση α-ελικών άνω των 6 αμινοξέων. Απεικόνιση μόνο αυτών. Πόσες είναι? Στείλτε εικόνα (helix.png) μέσω . Ø Εύρεση αμινοξέων ενεργού κέντρου της ξυλανάσης Ø Διαθέτει το ένζυμο δισουλφιδικούς δεσμούς? Ø Απεικόνιση χωροπληρωτικού μοντέλου με το υπόστρωμα. Στείλτε εικόνα (CjXyn10.png) του μοντέλου σας ray-traced μέσω . Άσκηση 2 Πολύ-λειτουργικές πρωτεΐνες Αραβινοφουρανοσιδάση από το μύκητα Aspergillus kawachii [PDB ID: 2D43] Παρατήρηση της: Καταλυτική μονάδας (GH54) Μονάδα δέσμευσης υδατανθράκων (CBM42) Ø Εύρεση δισουλφιδικών δεσμών: Ζεύγη κυστεϊνών. Ποιο ζευγάρι ΔΕΝ συμβάλει στη σταθεροποίηση της τριτοταγούς δομής? Ø Εντοπισμός των αμινοξέων που σταθεροποιούν την δομή του CBM42 μέσω της Ν-ακετυλο-D-γλυκοσαμινικής γέφυρας 84

89 Ø Εντοπισμός των αμινοξέων του CBM42 που αλληλοεπιδρούν με τις μονάδες αραβινοβιόζης των πλευρικών αλυσίδων των πολυσακχαριτών που απαντούν στα κυτταρικά τοιχώματα των φυτών Ø Υπολογίστε τις αποστάσεις των δεσμών Η μεταξύ των μορίων της αραβινοβιόζης και των αμινοξέων της Ιστιδίνης (Η) σε κάθε περίπτωση. Άσκηση 3 Ξυλανάση από το βακτήριο Bacillus circulans (GH11) [PDB ID: 1BVV] Ø Απομόνωση β-πτυχωτών φύλλων άνω των 6 αμινοξέων. Απεικόνιση μόνο αυτών. Πόσα είναι? Ø Εύρεση αμινοξέων ενεργού κέντρου της ξυλανάσης Ø Απεικόνιση χωροπληρωτικού μοντέλου με το υπόστρωμα. 85

90 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ ΒΙΟΠΛΗΡΟΦΟΡΙΚΗΣ 86

91 1. Εισαγωγή Ο πρωταρχικός σκοπός της Βιοπληροφορικής είναι η καταγραφή και κατανόηση βιολογικών δεδομένων χρησιμοποιώντας βάσεις δεδομένων και αλγορίθμους που εφαρμόζουν μαθηματικές και στατιστικές τεχνικές. Το επιστημονικό αυτό πεδίο περιλαμβάνει δραστηριότητες όπως α) τη μοντελοποίηση DNA, RNA, πρωτεϊνών καθώς και τη προσομοίωση βιομοριακών αλληλεπιδράσεων τους, β) την αλληλούχιση, σύγκριση και το σχολιασμό γονιδίων/γονιδιωμάτων και των μεταλλάξεων τους, γ) την μελέτη των μηχανισμών ρύθμισης πρωτεϊνικής έκφρασης, δ) την καταγραφή και μοντελοποίηση βιολογικών μονοπατιών και δικτύων (Συστημική Βιολογία), δ) την ανάλυση εικόνας και σήματος και την εξόρυξη χρήσιμων αποτελεσμάτων από πειραματικά δεδομένων ε) την εξόρυξη κειμένου (text mining) από τη βιολογική βιβλιογραφία και την καταγραφή και οργάνωση των βιολογικών δεδομένων. Η χρήση της πληροφορικής είναι σήμερα σχεδόν αναγκαία σε κάθε πεδίο έρευνας στη βιολογία. Καθοριστικό ρόλο όμως για την ανάπτυξη του επιστημονικού πεδίου έπαιξε η εξέλιξη των πειραματικών τεχνικών αλληλούχιση βιομορίων και η ανάγκη για σύγκριση και καταγραφή γονιδίων που μπορεί περιέχουν χιλιάδες βάσεις νουκλεοτιδίων. Σήμερα, τεχνικές αλληλούχισης νέας γενιάς (Next-generation Sequencing) επιτρέπουν την αποκρυπτογράφηση ολόκληρου γονιδιώματος (3 δισεκατομμύρια βάσεις) γρηγορότερα και με ολοένα μικρότερο κόστος. Το τεράστιο μέγεθος των παραγόμενων πληροφοριών δημιούργησε την ανάγκη για καταγραφή, σχολιασμό, αποθήκευση, και πρόσβαση στα δεδομένα αυτά αλλά και για τη δημιουργία αλγόριθμων που να μπορούν με ταχύτητα να τα επεξεργαστούν. 2. Ευθυγράμμιση/στοίχιση αλληλουχιών (Sequence Alignment) Για να συγκρίνουμε δύο ή περισσότερες αλληλουχίες νουκλεοτιδίων σε μόρια DNA/RΝΑ ή αμινοξέων σε πρωτεΐνες χρειάζεται να πραγματοποιηθεί στοίχιση πριν τον έλεγχο για διαφορές μεταξύ των συγκρινόμενων μορίων σε κάθε θέση. Οι διαφορές σε μία θέση μπορεί να προέρχονται από : α) Μεταλλάξεις (Mutations) β) Απαλοιφές (Deletions) γ) Προσθήκες (Insertions) 87

92 Οι προσθήκες και οι απαλοιφές στοιχείων δημιουργούν κενά στη μία ή στην άλλη ακολουθία κατά την στοίχιση τους. Για την ευθυγράμμιση/στοίχιση αλληλουχιών χρειάζεται ο καθορισμός ενός συστήματος σκοραρίσματος που θα: α) ανταμείβει ένα όμοιο ζεύγος β) τιμωρεί μια μετάλλαξη γ) τιμωρεί ένα κενό Για παράδειγμα οι παρακάτω ακολουθίες μπορούν να στοιχηθούν με διαφορετικούς τρόπους με την εισαγωγή κενών στη αρχή ή ενδιάμεσα των βάσεων. Η ιδανική στοίχιση επιλέγεται με βάση το μεγαλύτερο σκορ που προκύπτει αν επιβραβεύσουμε κάθε ομοιότητα (+1) στις στοιχισμένες βάσεις και τιμωρήσουμε κάθε μετάλλαξη (-1) και κάθε κενό (-1). Sequence1: CAAAATG Sequence2: AACAATGGC scoring system: [+1 match; -1 mutation; -1 gap] CAAAATG CAAAATG CAA - AATG AACAATGGC AACAA - - TGGC AA CAATGGC * * && & Το συστήματα σκοραρίσματος που χρησιμοποιούνται διαφέρουν και μπορεί να τιμωρούν λιγότερο μεταλλάξεις μεταξύ συγγενών βάσεων (η μετάλλαξη μιας Πουρίνης σε μια άλλη (AàG) θεωρείται πιο πιθανή από τη μετάλλαξη της σε μια Πυριμιδίνη (ΑàΤ)) ή συγγενών αμινοξέων όπως φαίνεται στους πίνακες. Επίσης μπορεί να τιμωρούν τη δημιουργία κενών (gap existence) περισσότερο από τη επέκτασή τους (gap extension). 88

93 gap costs 11 for gap existence 1 for gap extension Για δύο αλληλουχίες με n στοιχεία, οι πιθανοί συνδυασμοί στοίχισης που μπορεί να προκύψουν αυξάνονται εκθετικά με το μήκος των αλληλουχιών και για μεγάλες αλληλουχίες οι πιθανές ευθυγραμμίσεις είναι ~2 2n /!". Δηλαδή για n=100 στοιχειά υπάρχουν περίπου πιθανές στοιχίσεις. Με τα μήκη εξεταζόμενων αλληλουχιών να φτάνουν μερικές χιλιάδες στοιχειών για ένα γονίδιο και δισεκατομμύρια για γονιδιώματα γίνεται αντιληπτό ότι χρειάζονται κατάλληλοι αλγόριθμοι που να μπορούν να βρουν με ταχύτητα την ιδανική ευθυγράμμιση μεταξύ δύο οι περισσοτέρων αλληλουχιών. Ένας από τους πιο συχνά χρησιμοποιούμενους αλγόριθμους για σύγκριση αλληλουχιών είναι ο αλγόριθμος Basic Local Alignment Search Tool ή BLAST (Altschul et al. (1990). "Basic local alignment search tool". Journal of Molecular Biology. 215 (3): ). Ο αλγόριθμος BLAST είναι από τα πιο διαδεδομένα προγράμματα στην βιοπληροφορική. Βασίζεται στον δυναμικό προγραμματισμό (dynamic programming) και είναι αρκετά γρήγορος ώστε να επιτρέπει την χρησιμοποίηση του για αναζητήσεις στις τεράστιες βάσεις δεδομένων γονιδιωμάτων. 3. Φυλογενετική ανάλυση Οι διαφορές που παρατηρούνται μεταξύ νουκλεοτιδικών ή πρωτεϊνικών μορίων δύο ή περισσοτέρων ειδών μπορεί να χρησιμοποιηθούν στην μελέτη εξελικτικών σχέσεων ή και τον προσδιορισμό της απόσχισης των ειδών αυτών. Οι αλληλουχίες των νουκλεοτιδίων του DNA στον άνθρωπο και στο χιμπατζή 89

94 διαφέρουν μόνο κατά 1,27% αλλά όσο απομακρυνόμαστε από πρωτεύοντα θηλαστικά σε άλλα είδη η ομοιότητα ελαττώνεται. Human mouse Human β chain: MVHLTPEEKSAVTALWGKV NVDEVGGEALGRLL VVYPWTQRFFESFGDLSTPDAVMGNPKVKAHGKKVLG Mouse β chain: MVHLTDAEKAAVNGLWGKVNPDDVGGEALGRLL VVYPWTQRYFDSFGDLSSASAIMGNPKVKAHGKK VIN Human β chain: AFSDGLAHLDNLKGTFATLSELHCDKLHVDPENFRLLGN VLVCVLAHHFGKEFTPPVQAAYQKVVAGVANALAHKYH Mouse β chain: AFNDGLKHLDNLKGTFAHLSELHCDKLHVDPENFRLLGN MI VI VLGHHLGKEFTPCAQAAFQKVVAGVASALAHKYH 27 διαφορές, (147 27) / 147 = 81.7 % identical Human Chicken Human β chain: MVH L TPEEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALGRLL VVYPWTQRFFESFGDLSTPDAVMGNPKVKAHGKKVLG Chicken β chain: MVHWTAEEKQL I TGLWGKVNVAECGAEALARLL IVYPWTQRFF ASFGNLSSPTA I LGNPMVRAHGKKVLT Human β chain: AFSDGLAHLDNLKGTFATLSELHCDKLHVDPENFRLLGN VLVCVLAHHFGKEFTPPVQAAY QKVVAGVANALAHKYH Chicken β chain: SFGDAVKNLDNIK NTFSQLSELHCDKLHVDPENFRLLGD I L I I VLAAHFSKDFTPECQAAWQKLVRVVAHALARKYH 44 διαφορές, (147 44) / 147 = 70.1 % identical Για την περιγραφή των εξελικτικών σχέσεων μεταξύ γονιδίων/οργανισμών, χρησιμοποιούμε φυλογενετικά δέντρα. Από τη σύγκριση τμημάτων DNA/mRNA/πρωτεϊνών μπορούμε να εκτιμήσουμε φυλογενετικές σχέσεις γονιδίων ή και των οργανισμών από τους οποίους προέρχονται. Το φυλογενετικό δέντρο μας δείχνει πόσο κοντά βρίσκεται η μια αλληλουχία στην άλλη, δηλαδή με ποια σειρά οι αλληλουχίες εξελίχθηκαν. Συγκρίνουμε ομόλογα γονίδια ή πρωτεΐνες. Η διαφοροποίηση ομόλογων γονίδιων σε διαφορετικούς οργανισμούς (orthologues) έχει προκύψει λόγω της ειδογένεσης. Αντίθετα, ομόλογα γονίδια, μέσα στο ίδιο είδος, ονομάζονται paralogues, και θεωρούμε ότι έχουν προκύψει από γονιδιακό διπλασιασμό και εξέλιξη μέσα στο είδος. Παράδειγμα της πρώτης περίπτωσης είναι οι α-αλυσίδες της αιμοσφαιρίνης του ποντικιού και το βατράχου, ενώ για τη δεύτερη περίπτωση οι α, και β, αλυσίδες της αιμοσφαιρίνης του ποντικιού. 90

95 Δύο παραδείγματα φυλογενετικών δέντρων (με ρίζα και κλιμακούμενους κλάδους) παρουσιάζονται παρακάτω. Το δέντρο αποτελείται από κόμβους και βραχίονες. Οι τελικοί κόμβοι αντιστοιχούν στα γονίδια (ή τους οργανισμούς) τα οποία εξετάζουμε. Οι εσωτερικοί κόμβοι στο δέντρο, δείχνουν τα σημεία διακλάδωσης, και καταλήγουν στη «ρίζα» του δέντρου, δηλαδή το χρονικό σημείο ύπαρξης του κοινού προγόνου. Τα μήκη των βραχιόνων, σε ένα κλιμακούμενο δέντρο, όπως τα εξεταζόμενα, συμβολίζουν το χρόνο που έχει περάσει από την απόσχιση των δύο γονιδίων/οργανισμών. Phylogenetic tree of 50 beta-globin proteins Sequence alignments of 251 genes in 22 vertebrates Lulu Yu et al. Scientific Reports 7, (2017) Amemiya et al., Nature 496: Η πρωτεΐνη της Αιμογλοβίνης Η Αιμογλοβίνη είναι η πρωτεΐνη που μεταφέρει το Οξυγόνο στο αίμα. Αποτελείται από τέσσερις πολυπεπτιδικές αλυσίδες (δύο άλφα και δύο βήτα). Είναι σχεδόν πανομοιότυπη σε γορίλα, χιμπατζή και άνθρωπο. Οι Zuckerkandl & Pauling παρατήρησαν ότι οι διαφορές στις αλληλουχίες δυο ειδών που κωδικοποιούν την ίδια πρωτεΐνη αυξάνει γραμμικά με το χρόνο απόκλισης των δύο ειδών. Παρατήρησαν ότι οι α αλυσίδες μεταξύ ανθρώπου και γορίλα διαφέρουν σε 2 91

96 αμινοξέα, και οι β αλυσίδες σε 1. Υπολόγισαν το χρόνο απόκλισης μεταξύ ανθρώπου και γορίλα για τις β αλυσίδες σε 7.3 εκατομμύρια χρόνια Οι βάσεις δεδομένων του NCBI Το National Center of Biotechnology Information (NCBI) του National Institutes of Health των Η.Π.Α έχει βάσεις βιολογικών δεδομένων και εργαλεία ανάλυσης. Ανάμεσα σε αυτά είναι η βάση βιβλιογραφίας Pubmed και η βάση γονιδίων (Genes) καθώς και τα εργαλεία (αλγόριθμοι) BLAST και Primer-BLAST τα οποία και θα χρησιμοποιήσουμε. 1. Βιβλιογραφικές αναζητήσεις National Center for Biotechnology Information 2. Gene Database 3. BLAST - Basic Local Alignment Search Tool: Σύγκριση Νουκλεοτιδίων/ πρωτεϊνών Αναζήτηση Νουκλεοτιδίων/πρωτεϊνών σε βάσεις δεδομένων 4. Primer BLAST : Σχεδιασμός εκκινητών Επιλεκτικοί για ένα γονίδιο/πρωτεΐνη 92

97 ΔΡΑΣΤΗΡΙΟΤΗΤΑ 1 η Εύρεση γονιδίων/πρωτεϊνών από βάσεις δεδομένων α) Βρείτε από τη βάση δεδομένων του NCBI το γονίδιο της Αιμογλοβίνης β (ΗΒΒ) για 6 οργανισμούς της επιλογής σας. Σημειώστε τους Accession numbers για το mrna και την πρωτεΐνη. Αντιγράψτε και κρατήστε την αλληλουχία αμινοξέων στις πρωτεΐνες. β) Για την Αιμογλοβίνη β (Rattus norvegicus) Παραθέστε την αλληλουχία βάσεων του γονίδιου και του mrna και των αμινοξέων της παραγόμενης πρωτεΐνης σε FASTA format. Σημειώστε στην αλληλουχία του γονιδίου τα ιντρόνια και τα εξώνια και στην αλληλουχια του mrna τις 5 και 3 UTRs. Σημειώστε το συνολικό μήκος των εξωνίων και των 3 και 5 UTR. Υπολογίστε τον αριθμό των μεταγραφόμενων και των μεταφραζόμενων βάσεων, και των αμινοξέων της πρωτεΐνης. Συγκρίνεται την απάντηση σας με μήκος της πρωτεΐνης στο NCBI. γ) Η ανάλυση του DNA ενός ασθενούς έδειξε μία μετάλλαξη στο χρωμόσωμα 11 στην θέση (Chr11: ;Assembly GRCh 38) μιας Αδενίνης σε Θυμίνη. Βρείτε αν θα υπάρχει μεταβολή στο mrna και στην παραγόμενη πρωτεΐνη (ΗΒΒ), ποιές θα είναι οι μεταβολές και σε ποια σημεία (του mrna και τις πρωτεΐνης) και από ποια ασθένεια μπορεί να νοσεί ο ασθενής. 93

98 Ø Πληκτρολογήστε την διεύθυνση για να βρεθείτε στη αρχική σελίδα του NCBI. Μπορείτε να επιλέξετε κάποια από τις βάσεις δεδομένων (Gene, Pubmed) ή κάποιο εργαλείο ανάλυσης (BLAST, Primer- BLAST) Ø Επιλέξτε την βάση δεδομένων Gene 94

99 Ø Βρείτε καταχωρήσεις για το γονίδιο που σας ενδιαφέρει σε διάφορους οργανισμούς Ø Επιλέξτε μία από τις καταχωρήσεις να δείτε το μέρος του χρωματοσώματος που βρίσκεται στο γονίδιο. scroll Θέση στο χρωμόσωμα 11 FASTA or GenBank format Exon SNPs Intron 3 UTR 95

100 Ø Προχωρήστε στη καταχώρηση και βρείτε τα links για το mrna και την Πρωτεΐνη του γονιδίου. mrna Protein Accession numbers Ø Ακολουθείστε τα links να βρείτε τις αλληλουχίες mrna και Πρωτεΐνης σε FASTA format First line of comments starts with > 96

101 Ø Ανοίξτε ένα αρχείο word και αντιγράψτε την αλληλουχία αμινοξέων στις πρωτεΐνες σε FASTA format. >[Homo sapiens] MVHLTPEEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALGRLLVVYPWTQRFFESFGDLSTPDAVMGNPKVKAHGKKVLG AFSDGLAHLDNLKGTFATLSELHCDKLHVDPENFRLLGNVLVCVLAHHFGKEFTPPVQAAYQKVVAGVAN ALAHKYH >[Rattus norvegicus] MVHLTDAEKAAVNGLWGKVNPDDVGGEALGRLLVVYPWTQRYFDSFGDLSSASAIMGNPKVKAHGKKVIN AFNDGLKHLDNLKGTFAHLSELHCDKLHVDPENFRLLGNMIVIVLGHHLGKEFTPCAQAAFQKVVAGVAS ALAHKYH >[Ursus maritimus] MVHLTGEEKSLVTGLWGKVNVDEVGGEALGRLLVVYPWTQRFFDSFGDLSSADAIMNNPKVKAHGKKVLN SFSDGLKNLDNLKGTFAKLSELHCDKLHVDPENFKLLGNVLVCVLAHHFGKEFTPQVQAAYQKVVAGVAN ALAHKYH Ø Για την Hemoglobin β (Rattus norvegicus). Βρείτε την θέση έναρξης και τερματισμού των εξωνίων και σημειώστε τα πάνω στην FASTA αλληλουχία exon : ACA TTT GCT zoom in 97

102 Ø Ø Ομοίως σημειώστε τις 5 και 3 UTR στην FASTA αλληλουχία του mrna. Σημειώστε το συνολικό μήκος των εξωνίων και των 3 και 5 UTR. Υπολογίστε τον αριθμό των μεταγραφόμενων και των μεταφραζόμενων βάσεων, και των αμινοξέων της πρωτεΐνης. Μεγεθύνετε σε μία περιοχή για να συλλέξετε πληροφορίες για γνωστές μεταλλάξεις. 98

103 ΔΡΑΣΤΗΡΙΟΤΗΤΑ 2 η Ευθυγράμμιση και σύγκριση γονιδίων/πρωτεϊνών α) Χρησιμοποιήστε τον αλγόριθμο BLAST για να ευθυγραμμίσετε και να συγκρίνετε τις πρωτεΐνες αιμογλοβίνη α (ΗΒΑ1) και β (ΗΒΒ) στον άνθρωπο. Παρουσιάστε την ευθυγράμμιση και αναφέρετε τον αριθμό ομοιοτήτων (identities), μεταλλάξεων (mutations) και κενών (gaps). β) Χρησιμοποιήστε BLAST για να βρείτε από που (γονίδιο και οργανισμό) προέρχεται το θραύσμα cdna/mrna >unknown ATTGATGCTTCTAAGCACATGTGGCCTGGAGACATAAAAGCAGTTTTGGATAAA CTTCACAACCTAAACA Ø Από την αρχική σελίδα του NCBI επιλέξετε το εργαλείο ανάλυσης BLAST. Έχετε την επιλογή να χρησιμοποιείστε τον αλγόριθμο για αλληλουχίες Νουκλεοτιδίων (DNA,mRNA) ή αμινοξέων (Protein). 99

104 Ø Η αλληλουχία που θέλουμε να εξετάσουμε μπορεί να εισαχθεί 1. Ολόκληρη σε FASTA format 2. Γράφοντας μόνο το Accession Number NM_ gi Ø Για σύγκριση αλληλουχίας με τις καταχωρημένες αλληλουχίες προτιμήστε την RefSeq_RNA database χωρίς model/predicted (XM/XP) sequences. 100

105 Ø Επιλέξτε την επιλογή (Align two or more sequences) για να συγκρίνετε δυο η περισσότερες ακολουθίες μεταξύ τους. Προτιμήστε την επιλογή Somewhat similar sequences για την σύγκρισή σας. 101

106 ΔΡΑΣΤΗΡΙΟΤΗΤΑ 3 η Δημιουργία φυλογενετικών δέντρων Χρησιμοποιείστε τις αλληλουχίες των πρωτεϊνών από τη Δραστηριότητα 1 και κατασκευάστε ένα φυλογενετικό δέντρο με την μέθοδο UPGMA Ø Πληκτρολογήστε την διεύθυνση για να βρεθείτε στη σελίδα του CLUSTAL Omega. Εισάγετε τις αλληλουχίες των πρωτεϊνών σε FASTA format από τη ΔΡΑΣΤΗΡΙΟΤΗΤΑ 1. FASTA, EMBL, GenBank, Format 102

107 Ø Στείλτε την ευθυγράμμιση του CLUSTAL για την δημιουργία φυλογενετικού δέντρου. Επιλέξτε τη μέθοδο UPGMA. 103

108 ΔΡΑΣΤΗΡΙΟΤΗΤΑ 4 η Σχεδιασμός εκκινητών (primers) για PCR Θέλουμε να μελετήσουμε την έκφραση HBB σε ενδοθηλιακά κύτταρα αορτής αρουραίου (Rattus norvegicus). Σχεδιάστε 3 ζεύγη εκκινητών για PCR (forwardreverse primers) με τα ακόλουθα χαρακτηριστικά: -Melting Temperature: 60+3 o C -Product size: bp -Primer Pair Specificity: [Refseq mrna; Exclude predicted Refseq transcript; Exclude uncultured/environmental sample sequences] α) Δώστε την αλληλουχία των βάσεων των εκκινητών, την θέση τους (αύξοντα αριθμό βάσεων mrna) και μέγεθος του mrna/cdna που θα πολλαπλασιαστεί με την PCR. β) Αν κατά τη διαδικασία απομόνωσης του RNA από τον ιστό παρέμεινε ποσότητα γενωμικού DNA, τι περιμένετε να συμβεί; Τι θα αλλάζατε στον σχεδιασμό των εκκινητών σε ένα τέτοιο σενάριο; Σχεδιάστε ένα ζεύγος εκκινητών για PCR που να πολλαπλασιάζει μόνο το mrna/cdna του γονιδίου. 104

109 Ø Εισάγετε στο Primer-BLAST την αλληλουχία του cdna/mrna που θέλετε να πολλαπλασιάσετε με PCR. Επιλέξτε παραμέτρους (product size, melting temperature) και την βάση δεδομένων την οποία ο αλγόριθμος θα ελέγξει για να δώσει εκκινητές που θα πολλαπλασιάζουν μόνο το ζητούμενο γονίδιο από το δείγμα σας. 105