NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

Transcript

1 Chương 2: KỸ THUẬT PHÒNG THÍ NGHIỆM NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

2 KHÁI NIỆM Nuôi cấy mô (tissue culture) là một nhánh của sinh học, trong đó, mô hay tế bào được nuôi cấy nhân tạo trong một môi trường có kiểm soát. Nhaân gioáng in vitro thực vật hay vi nhaân gioáng thực vật (micropropagation) laø phöông thöùc nuoâi caáy tế bào, cơ quan thực vật trong oáng nghieäm, bình nuôi cấy, ôû ñieàu kieän voâ truøng, nhằm mục đích nhaân nhanh giống, mang laïi hieäu quaû kinh teá cao.

3 ƯU ĐIỂM CỦA PHƯƠNG PHÁP VI NHÂN GIỐNG THỰC VẬT Gồm 05 điểm nổi bật: - Nhân nhanh các giống cây: hệ số nhân giống cao. - Cây giống sau khi nuôi cấy có sự đồng nhất về mặt di truyền. - Loại sạch bệnh cây, đảm bảo các cây giống khỏe mạnh, có sức tăng trưởng nhanh. - Chủ động nguồn giống cây trồng cho sản xuất. - Trẻ hóa vật liệu giống.

4 NHƯỢC ĐIỂM CỦA PHƯƠNG PHÁP VI NHÂN GIỐNG THỰC VẬT Gồm 03 điểm nổi bật: - Hạn chế về chủng loại sản phẩm. - Chi phí sản xuất cao: Vi nhân giống đòi hỏi nhiều lao động kỹ thuật thành thạo. - Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình: đặc biệt là các biến dị di truyền.

5 Các yếu tố đảm bảo sự thành công trong nuôi cấy mô thực vật là gì? 2.1 Bảo đảm điều kiện vô trùng 2.2 Chọn đúng môi trường và chuẩn bị môi trường đúng cách 2.3 Chọn mô cấy thích hợp, xử lý mô cấy thích hợp trước và sau khi cấy

6 2.1 BẢO ĐẢM ĐIỀU KIỆN VÔ TRÙNG

7 Ý NGHĨA CỦA VÔ TRÙNG TRONG VI NHÂN GIỐNG THỰC VẬT Môi trường nuôi cấy mô thực vật có chứa đường, muối khoáng và vitamin, là môi trường thích hợp cho các loài nấm, vi khuẩn phát triển. Tốc độ phân chia tế bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn rất nhiều so với tế bào thực vật. Nếu môi trường nuôi cấy bị nhiễm vài bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày đến một tuần, toàn bộ bề mặt môi trường nuôi cấy và mẫu cấy sẽ phủ đầy nấm, khuẩn, thí nghiệm chắc chắn phải loại bỏ.

8 Để đảm bảo điều kiện vô trùng trong quá trình nuôi cấy, đòi hỏi chúng ta phải thực hiện các yêu cầu: - Vô trùng mô cấy. - Vô trùng dụng cụ thủy tinh, môi trường và nút đậy. - Trong thao tác nuôi cấy cần tránh làm rơi nấm, khuẩn lên bề mặt môi trường.

9 VÔ TRÙNG MÔ CẤY Mô cấy có thể là các bộ phận khác nhau của thực vật, tùy theo sự tiếp xúc với môi trường bên ngoài mà các bộ phận này chứa nhiều hay ít vi khuẩn, nấm. Phương pháp vô trùng mẫu cấy phổ biến hiện nay là dùng các chất hóa học có hoạt tính diệt nấm, diệt khuẩn. Hiệu lực diệt nấm, diệt khuẩn của các chất này phụ thuộc vào thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập trên bề mặt mô cấy.

10 Nồng độ và thời gian sử dụng một số chất diệt nấm, diệt khuẩn có thể dùng để xử lý mô cấy: Tác nhân vô trùng Nồng độ (%)Thời gian xử lý (phút) Hiệu quả Hypochlorite canxi Rất tốt Hypochlorite natri Rất tốt Hydroperoxid (H 2 O 2 ) Tốt Nước Brom Rất tốt HgCl 2 0, Trung bình Chất kháng sinh 4 50 (mg/l) Khá tốt

11 Lưu ý: Trong quá trình xử lý mô cấy phải ngập hoàn toàn trong dung dịch diệt nấm, khuẩn. Với các bộ phận có bám nhiều cát, bụi trước khi xử lý cần rửa sạch bằng xà phòng và nước máy. Sau khi xử lý xong, mô cấy được rửa sạch nhiều lần bằng nước cất vô trùng và loại bỏ những phần bị hoại tử trước khi đặt mô cấy lên môi trường.

12 Quy trình khử trùng mẫu thực sinh: Mẫu thực sinh Rửa kĩ bằng xà phòng và nước máy Cho vào bình tam giác Ngâm trong cồn 70 0 C (khoảng 30 giây) Rửa bằng nước cất vô trùng 3 lần Tiếp tục ngâm trong dung dịch diệt khuẩn (khoảng phút) với 05 giọt Tween 80 Rửa bằng nước cất vô trùng 3 lần Cắt bỏ những phần mô bị tác nhân vô trùng làm hoại tử (trắng) Đặt lên môi trường nuôi cấy

13 VÔ TRÙNG DỤNG CỤ THỦY TINH, MÔI TRƯỜNG VÀ NÚT ĐẬY Dụng cụ thủy tinh, môi trường và nút đậy của chai lọ hay dụng cụ thủy tinh được vô trùng bằng cách hấp khử trùng ở nhiệt độ C, áp suất 1atm trong thời gian phút.

14 o C o F Taùc ñoäng ñeán vi sinh vaät Nhieät hôi nöôùc tieâu dieät hoaøn toaøn vi sinh vaät vaø baøo töû (15 20 phuùt) Nhieät hôi nöôùc tieâu dieät hoaøn toaøn vi sinh vaät vaø baøo töû (30 40 phuùt) Nhieät hôi nöôùc tieâu dieät hoaøn toaøn vi sinh vaät vaø baøo töû (60 80 phuùt) Nhieät ñoä soâi cuûa nöôùc coù khaû naêng tieâu dieät teá baøo dinh döôõng nhöng khoâng tieâu dieät ñöôïc baøo töû Tieâu dieät hoaøn toaøn teá baøo ñang phaùt trieån vi khuaån, naám men, naám moác Caùc vi sinh vaät öa nhieät vaãn phaùt trieån ñöôïc Pasteur hoùa, tieâu dieät phaàn lôùn vi sinh vaät gaây beänh trong söõa, nöôùc quaû, tröø baøo töû cuûa chuùng Caùc loaøi naám men, naám sôïi, vi khuaån phaùt trieån maïnh Caùc loaøi öa laïnh phaùt trieån maïnh 0 32 Caùc loaøi vi sinh vaät ngöøng phaùt trieån 18 0 Vi khuaån ôû traïng thaùi cheát Raát nhieàu loaøi vi sinh vaät khoâng bò cheát trong hydrogen loûng

15 KỸ THUẬT CẤY VÔ TRÙNG Buoàng caáy: laø buoàng coù dieän tích nhỏ, coù hai lôùp cöûa. Buoàng caáy caàn laùt gaïch traùng men, töôøng sôn coù theå lau röûa được. Tröôùc mỗi lần söû duïng, buoàng caáy caàn ñöôïc xöû lyù vô trùng sơ bộ. Caùc duïng cuï mang vaøo buoàng caáy ñeàu cần phaûi ñöôïc khöû truøng: aùo choàng, muõ, khaåu trang, dao keùo, keïp, giaáy boïc, boâng, oáng nghieäm, v.v... Tuû caáy: laø loaïi tuû coù thieát bò thoåi khoâng khí voâ truøng vaøo vị trí thao taùc caáy.

16 KỸ THUẬT CẤY VÔ TRÙNG Vô trùng dụng cụ trong nuôi cấy Rữa tay bằng xà phòng và nước trước khi cấy Lau cồn mặt bàn tủ cấy vô trùng Dùng ngọn lửa đèn cồn để vô trùng pince, dao cấy, kéo,... Tránh quơ tay ngang qua các dụng cụ vô trùng trong tủ cấy. Đậy các dụng cụ và môi trường vô trùng sau mỗi thao tác Hạn chế nói chuyện trong phòng cấy.

17

18 2.2 CHỌN ĐÚNG MÔI TRƯỜNG VÀ CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG ĐÚNG CÁCH

19 MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY Thành phần của môi trường nuôi cấy thay đổi tùy theo loài thực vật, loại tế bào, mô và cơ quan nuôi cấy. Đối với cùng một loại mô, cơ quan nhưng mục đích nuôi cấy không giống nhau, môi trường sử dụng cũng khác nhau. Môi trường nuôi cấy còn thay đổi theo giai đoạn sinh trưởng và phát triển của mẫu cấy.

20 PHÂN LOẠI MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY Trong nuoâi caáy moâ teá baøo thöïc vaät coù haøng traêm loaïi moâi tröôøng khaùc nhau. Tuy nhieân coù theå chia chuùng thaønh 3 nhoùm: - Moâi tröôøng ngheøo dinh döôõng: ñieån hình laø moâi tröôøng Knop, moâi tröôøng Knudson C; - Moâi tröôøng trung bình: ñieån hình laø moâi tröôøng moâi tröôøng White; moâi tröôønng B5 cuûa Gamborg; - Moâi tröôøng giaøu dinh döôõng: ñieån hình laø moâi tröôøng Murashige Skoog (moâi tröôøng MS).

21 MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY Các thành phần cơ bản của môi trường nuôi cấy: Khoáng đa lượng và vi lượng. Nguồn cacbon. Các vitamin. Chất kích thích sinh trưởng. Các chất bổ sung, các amino acid và các chất làm thay đổi trạng thái môi trường,

22 KHOÁNG ĐA LƯỢNG Nguoàn nitô: gồm các dạng: amon, nitrat và amino acid (canxi nitrat, kali nitrat, natri nitrat hay amon nitrat (NH 4 NO 3 ), amon sulphat). Nguoàn phospho: thöôøng duøng nhaát laø NaH 2 PO 4.7H 2 O vaø KH 2 PO 4. Noàng ñoä phospho trong moâi tröôøng bieán thieân töø 0,15 ñeán 4,00mM, thöôøng duøng khoaûng 1,00mM. Nguoàn kali: kali nitrat, kali chlorua, kali phosphat. Noàng ñoä K + trong moâi tröôøng bieán thieân töø 2 ñeán 25 mm, trung bình khoaûng 10mM.

23 KHOÁNG ĐA LƯỢNG Nguoàn canxi: muoái canxi nitrat, canxi chlorua. Noàng ñoä Ca2 + trong moâi tröôøng từ 1,0 ñeán 3,5mM, trung bình laø 2,0mM. Nguoàn magieâ: magieâ sunphat, vôùi noàng ñoä trong moâi tröôøng khoaûng 0,5 3,0mM. Nguoàn saét: Nhöõng moâi tröôøng coå ñieån duøng saét ôû daïng chlorua saét FeCl 2 sulphat saét, citrat saét Fe(C 4 H 4 O 6 ). Hieän nay haàu heát caùc phoøng thí nghieäm ñeàu duøng saét ôû daïng chelat keát hôïp vôùi Na 2 -ethylen diamintetraacetat (EDTA).

24 KHOÁNG VI LƯỢNG Teân vi löôïng Daïng söû duïng Noàng ñoä (µm) Mangan (Mn) MnSO 4.4H 2 O Bo (B) H 3 BO Keõm (Zn) ZnSO 4.7H 2 O Ñoàng (Cu) CuSO 4.5H 2 O 0,04 0,08 Molypden (Mo) (NH 4 ) 6 Mo 7 O 24.4H 2 O 0,007 1,0 NaMoO 4.2H 2 O Coban (Co) CoCl 2.6H 2 O 0,1 0,4 Ioát (I) KI 2,5 20,0

25 NGUỒN CACBON ĐƯỜNG Hai daïng ñöôøng thöôøng söû duïng nhaát laø saccharose vaø glucose. Tuøy theo muïc ñích nuoâi caáy, loại mẫu cấy và giai đoạn sinh trưởng của mẫu cấy, noàng ñoä saccharose bieán ñoåi töø 1-6% (w/v), thoâng duïng nhaát laø 2%, töông öùng vôùi 58,4mM.

26 CÁC VITAMIN Teân vitamin Noàng ñoä söû duïng (mg/l) Myo-inozitol 100 Acid nicotinic (vitamin PP) 0,5 1,0 Pyridoxine HCl (vitamin B6) 0,05 0,5 Thiamine HCl (vitamin B1) Panthotenat canxi 1 5 Riboflavine (vitamin B2) 1 5 Biotin 0,1 1,0 Acid folic 0,1 1,0

27 CHẤT KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG Teân phytohormone Noàng ñoä söû duïng (mg/l) 2,4D (Dichlorophenoxyacetic acid 0,2 5,0 α- NAA (α- Naphtylacetic acid) 0,1-5,0 β-iaa (β-indolacetic acid) 5 20 IBA (Indolbutyric acid) 1 5 Kinetin (6-Furfurylaminopurine) 0,1 2,0 BA (6-BAP) (6-Benzylaminopurine) 0,1 2,0 2-iP (N6γ,γ-Dimethylallylaminopurine) 0,1 2,0 GA3 (Gibberellic acid) 0,1 2,0

28 CÁC CHẤT BỔ SUNG Nöôùc döøa: trong nöôùc döøa ñaõ có chứa myo-inozitol vaø moät soá amino acid. Löôïng nöôùc döøa duøng trong moâi tröôøng nuoâi caáy thöôøng töø 5-20% theå tích moâi tröôøng. Nöôùc chieát: nước chiết nấm men, malt,... laø caùc cheá phaåm thöôøng duøng trong nuoâi caáy vi sinh vaät, moâ teá baøo ñoäng vaät, ñaõ ñöôïc tieâu chuaån hoùa vaø baùn döôùi daïng thöông phaåm, thöôøng duøng laø 1 gam cho 1 lít moâi tröôøng.

29 TÁC NHÂN LÀM THAY ĐỔI TRẠNG THÁI VẬT LÝ MÔI TRƯỜNG Tác nhân tạo gel quyết định trạng thái vật lý của môi trường nuôi cấy (agar, phytagel,...) Agar là polysaccharide có khả năng làm đông môi trường, được lấy từ rong biển, hòa tan hình thành chất keo kết dính với nước và hấp thụ hóa chất. Hàm lượng sử dụng agar là 0,5 10% (w/v) tùy theo chất lượng của chúng và loại môi trường nuôi cấy.

30 Môi trường MS Hóa chất Nồng độ (mg/l) Khoáng đa lượng NH 4 NO KNO CaCl 2.2H 2 O 440 MgSO 4.7H 2 O 370 KH 2 PO Khoáng vi lượng FeSO 4.7H 2 O 27,8 Na 2 EDTA 37,3 H 3 BO 3 6,2 MnSO 4.4H 2 O 22,3 ZnSO 4.7H 2 O 8,6 CuSO 4.5H 2 O 0,025 CoCl 2.6H 2 O 0,025 Na 2 MoO 4.2H 2 O 0,25 KI 0,83 Vitamin Glycine 2 Nicotinic acid 0,5 Pyridoxine_HCl 0,5 Thiamin HCl 0,1 Myo_Inositol 100

31 PHƯƠNG PHÁP PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG Môi trường nuôi cấy mô thực vật có thành phần rất phức tạp, có sự hiện diện của rất nhiều loại hoá chất với hàm lượng rất nhỏ. Các môi trường nuôi cấy hay môi trường làm việc sẽ được pha tröôùc caùc dung dòch ñaäm ñaëc (cân hoá chất mỗi lần pha với độ đậm đặc từ X10 X100 - dung dịch mẹ (stock)). Dung dòch ñaäm ñaëc sau ñoù sẽ được pha loaõng khi söû duïng. Caùc dung dòch ñaäm ñaëc ñöôïc baûo quaûn daøi ngaøy trong tuû laïnh thöôøng hoaëc tuû laïnh saâu. Thông thường pha các dung dịch mẹ: stock đa lượng, stock vi lượng, Fe EDTA, stock vitamin, stock chất sinh trưởng, và các stock cần thiết khác.

32 Ví Dụ: Pha 1 lít môi trường MS có công thức: MS + Suc (30g/l) + Agar (8g/l), ph=5,8 Bước 1: Chọn môi trường cần pha Bước 2: Chuẩn bị, kiểm tra đầy đủ hóa chất trang thiết bị - dụng cụ Bước 3: Pha chế các dung dịch mẹ (stock) 3.1. Pha stock khoáng đa lượng nồng độ đậm đặc 20 lần (x20) 3.2. Pha stock khoáng vi lượng nồng độ đậm đặc 100 lần (x100) 3.3. Pha stock vitamin nồng độ đậm đặc 100 lần (x100) 3.4. Pha stock Fe-EDTA nồng độ đậm đặc 100 lần (x100) 3.5. Pha stock các hormon điều hòa sinh trưởng thực vật

33 Bước 4: Pha môi trường làm việc: tiến hành tuần tự - Dùng ống đong, đong khoảng 500 ml nước cất vào becher - Bổ sung 30 g đường sucrose vào, khuấy tan hoàn toàn - Bổ sung 50 ml dung dịch stock đa lượng x20, khuấy đều. - Bổ sung 10 ml dung dịch stock vi lượng x100, khuấy đều. - Bổ sung 10 ml dung dịch stock Fe-EDTA x100, khuấy đều. - Bổ sung 10 ml dung dịch stock vitamin x100, khuấy đều. - Bổ sung stock điều hòa sinh trưởng thực vật với lượng tùy mục đích nuôi cấy. - Chuyển tất cả dung dịch vào bình định mức, dùng nước cất chuẩn lại cho đủ 1000 ml. - Chỉnh ph của dung dịch bằng NaOH 1N hay HCl 1N về ph=5,8. - Bổ sung 8g agar. - Đun sôi cho tan agar, khuấy đều. Chia hỗn hợp môi trường vào các bình nuôi cấy. Hấp khử trùng bằng autoclave ở C, 1atm, 30phút. Môi trường sau khi hấp được bảo quản ở 25 0 C.

34 2.3 CHỌN MÔ CẤY VÀ XỬ LÝ MÔ CẤY

35 CHỌN MÔ CẤY VÀ XỬ LÝ MÔ CẤY Các mô có sức phát triển mạnh: mô phân sinh ngọn, tượng tầng, đầu rễ, lá non, cuống hoa, chồi bên,..., thường được dùng làm mô cấy. Caùc moâ khaùc nhau treân cuøng moät caây coù theå cho caùc loại moâ seïo hoaøn toaøn khaùc nhau vôùi khaû naêng taùi sinh raát khaùc nhau. Sau khi cấy, mô cấy thường được đặt trong các điều kiện ổn định về nhiệt độ, ánh sáng, ẩm độ,...,.

36 CÁC THIẾT BỊ CƠ BẢN CỦA PHÒNG THÍ NGHIỆM NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

37 PHÒNG RỬA VÀ NƯỚC CẤT Máy nước cất một lần Máy nước cất hai lần Máy sản xuất nước khử ion Bồn rửa dụng cụ

38 PHÒNG SẤY VÀ HẤP Tủ sấy Nồi hấp tuyệt trùng

39 PHÒNG CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG Máy đo ph (độ chính xác 0.1 đơn vị) Cân phân tích cân kỹ thuật (độ chính xác 0.1 mg) Máy khuấy từ Máy rót môi trường Bếp điện bếp gas Microwave Tủ lạnh thường Tủ lạnh sâu (-20 0 C)

40 PHÒNG CẤY VÔ TRÙNG Đèn tử ngoại treo trần hay treo tường Tủ cấy Lamine Thiết bị lọc không khí

41 PHÒNG KÍNH HIỂN VI - PHÒNG ẢNH Kính hiển vi quang học Kính hiển vi điện tử Kính hiển vi soi nổi Thiết bị chụp ảnh trên kính hiển vi Kính lúp Các dụng cụ quan sát tế bào học Máy chụp ảnh Máy chiếu Các dụng cụ in tráng ảnh

42 Kính hieån vi ñaàu tieân Anton Van Leeuwenhoek Kính hieån vi ñieän töû Kính hieån vi quỳnh quang

43 PHÒNG SÁNG PHÒNG NUÔI CÂY Các kệ sáng nhiều ngăn có lắp các giàn đèn huỳnh quang (độ chiếu sáng 3000lux) Máy điều hòa nhiệt độ Máy lắc ngang Các thiết bị nuôi cấy tế bào đơn khác

44 Chương 3: CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG THỰC VẬT

45 CAÙC HORMON TAÊNG TRÖÔÛNG CUÛA THÖÏC VAÄT Định nghĩa: Hormon laø moät chaát höõu cô do teá baøo cuûa moät boä phaän cô theå taïo ra vaø ñöôïc chuyeån đến moät boä phaän khaùc, ôû ñoù, vôùi noàng ñoä raát thaáp, chaát đó gaây ra moät phaûn öùng sinh lyù. Phân loại: - Auxin: thường được tổng hợp trong sơ khởi lá, lá non, hạt đang phát triển. - Gibberellin: thường được tổng hợp trong mô non của chồi, hạt đang phát triển, rễ cây. - Cytokinin: thường được tổng hợp trong hạt đang phát triển, ngọn rễ cây. - Acid abscisic: tổng hợp trong rễ, lá trưởng thành. - Ethylen: tổng hợp trong các mô chịu stress, mô lão suy và chín trái.

46 COOH O OH N H CH 2 HO CO COOH AIA GA 1 CH 3 H HN CH 2 C C CH 2 OH CH 3 C H 3 CH 3 CH OH CH C CH N N O CH 3 COOH N N H ZEATIN H H C C H H AAB ETHYLEN

47 CAÙC HORMON TAÊNG TRÖÔÛNG CUÛA THÖÏC VAÄT Sự vận chuyển của các hormon tăng trưởng: - Auxin: di chuyeån töø teá baøo naøy sang teá baøo khaùc, trong libe. - Gibberellin: vaän chuyeån trong moäc vaø libe. - Cytokinin: vaän chuyeån trong moäc (reã đến choài). - Acid abscisic: tổng hợp ở reã, vaän chuyeån trong moäc; tổng hợp ở laù, vận chuyển trong libe. - Ethylen: khueách taùn töø nôi toång hôïp ra khắp nơi.

48 CAÙC HORMON TAÊNG TRÖÔÛNG CUÛA THÖÏC VAÄT Vai trò sinh lý: - Auxin: taùc duïng keùo daøi, phaân chia teá baøo, coù tính höôùng ñoäng vaø öu thế ngoïn, gaây laõo suy, ruïng, ñaäu vaø taêng tröôûng traùi, chín traùi, quy ñònh tính caùi cuûa hoa. - Gibberellin: taùc duïng keùo daøi loùng thaân, giúp hạt naûy maàm, ñaäu vaø taêng tröôûng traùi, quy ñònh tính ñöïc cuûa hoa. - Cytokinin: phaân chia teá baøo, taïo choài trong trong nuoâi caáy moâ, taêng tröôûng nuï naùch, taêng roäng laù, chaäm laõo suy. - Acid abscisic: ñoùng khí khaåu, caûn taêng tröôûng choài, caûm öùng toång hôïp protein haït, caûm öùng vaø duy trì söï nguû. - Ethylen: Gôõ höu mieân, taêng tröôûng vaø phaân hoùa choài, reã, taïo reã baát ñònh, gaây ruïng laù vaø traùi, quy ñònh tính caùi cuûa hoa, laõo suy hoa, traùi, chín traùi.

49 AUXIN

50 Lịch sử phát hiện: AUXIN Auxin được Darwin phát hiện vào năm 1880 khi khảo sát tính hướng sáng của thực vật. Sau đó, tính chất và ảnh hưởng của Auxin lên thực vật lần lượt được các nhà khoa học làm rõ với các thí nghiệm: Boysen - Jensen (1913), Paal (1919), Sodid (1925) Went (1926) chứng minh được vai trò kích thích sinh trưởng và định lượng được nồng độ Auxin Kogl và Haagen-Smith đã tách được Auxin B từ nước tiểu người năm 1931 và năm 1934 đã tách được IAA từ men bia Năm 1946 Haagen-Smith và cộng sự đã phân lập được IAA từ nội nhũ của ngô

51

52

53 Auxin Là những hợp chất có nhân indol, được tổng hợp từ tryptophan trong mô phân sinh (ngọn, lóng) và lá non. Sau đó, auxin sẽ di chuyễn đến rễ và tích tụ trong rễ. Acid indoleacetic (AIA) Tryptophan (Trp)

54 Một số chất điển hình của Auxin

55 Tính chất sinh lý của Auxin Vai trò trong sự kéo dài tế bào: Khi tế bào được cung cấp auxin, auxin sẽ hoạt hóa bơm ion H + trên màng sinh chất. Ion H + được vận chuyển tích cực từ tế bào chất vào trong vách. Sự gia tăng đó làm hoạt hóa enzim giúp bẻ gảy một số liên kết chéo giữa các đường đa cấu tạo vách và vách trở nên mềm dẻo hơn. Vì vậy, nước vào tế bào và không bào càng lúc càng nhiều vách sẽ bị căng ra.

56 Tính chất sinh lý của Auxin Vai trò trong quang hướng động của cây: Auxin khuếch tán từ phần ngọn diệp tiêu vào khối agar và khi đặt khối agar này lên phần diệp tiêu còn lại thì chất này được di chuyển xuống và kích thích sự tăng dài (Went, 1926). Khi ánh sáng tác động từ một phía ngọn cây, ánh sáng làm giảm sự cung cấp auxin cho cây ở phía ánh sáng và tăng ở phía ở trong tối. Kết quả là bên phía được chiếu sáng cây tăng trưởng chậm hơn phía bên tối, và sự tăng trưởng bất xứng này làm cho cây mọc cong về phía sáng.

57 Tính chất sinh lý của Auxin Vai trò trong địa hướng động của cây:

58 Tính chất sinh lý của Auxin Vai trò trong địa hướng động của cây: Nồng độ auxin ở phía dưới của thân nằm ngang tăng, trong khi ở phía trên lại giảm. Sự phân bố không đều của auxin này kích thích tế bào ở phía dưới tăng trưởng nhanh hơn những tế bào ở phía trên và vì thế thân mọc cong lên. Khi đặt rễ nằm ngang, phần tế bào ở phía trên mọc nhanh hơn những tế bào ở phía dưới, do đó rễ mọc hướng xuống.

59 Tính chất sinh lý của Auxin Auxin ngăn cản sự tăng trưởng của chồi bên: Auxin có ảnh hưởng ngăn cản sự tăng trưởng của chồi bên, làm cho chúng mọc chậm hay không mọc được. Nếu chồi ngọn được cắt bỏ đi, một số chồi bên phía trên sẽ tăng trưởng tạo ra nhánh, khi đó chồi ngọn của nhánh lại ức chế các chồi bên dưới nhánh nhỏ.

60

61 Tính chất sinh lý của Auxin Auxin kích thích söï phaân chia teá baøo ñoái vôùi caùc teá baøo coù nguoàn goác töôïng taàng. ÔÛ noàng ñoä cao, auxin kích thích söï taïo moâ seïo. Auxin ở nồng độ cao sẽ kích thích tạo sơ khởi rễ, tuy nhiên, lại có tác dụng ngăn cản sự phát triển của chính các sơ khởi rễ này.

62 Một số ứng dụng của Auxin Caùc chaát coù caáu truùc auxin ñöôïc söû duïng trong giaâm caønh (kích thích söï ra reã ôû caønh giaâm), caûn söï phaùt trieån choài (maét khoai taây), laøm chaäm söï thu hoaïch quaû, taïo traùi khoâng haït (cam, quyùt). Trong lónh vöïc nuoâi caáy moâ in vitro, hieäu quaû cuûa auxin ñöôïc aùp duïng trong quaù trình taïo moâ seïo (2,4 D), kích thích taïo reã (NAA). Auxin ngaên caûn traùi vaø laù ruïng. Neáu phun auxin leân traùi seõ giöõ ñöôïc traùi treân caây ñeán luùc muoán thu hoaïch.

63 GIBBERELLIN

64 Gibberellin Lịch sử phát hiện: Năm 1989, Hori tìm ra bệnh Bakanae được gây ra bởi nấm thuộc chi Fusarium. Năm 1935, Yabuta phân lập được Gibberellin A. Năm 1938, Yabuta và Sumiki kết tinh thành công Gibberellin A và B. Sau đó các nhà khoa học đã tìm được nhiều dẫn xuất của GA khác, ngày nay đã có khoản 136 GA được tìm thấy, thường được phân lập và kết tinh từ nấm mốc Gibberella fugikuroi và một số loài thực vật có hoa khác. Gibberellin thường được sử dụng nhất là GA 3 và những dạng hoạt động GA 1.

65 Một số dạng Gibberellin

66 Tính chất sinh lý của Gibberellin Gibberellin kích thích sự tăng dài thân cây. Gibberellin được tạo ra trong những mô còn non của thân và trong hạt đang phát triển. Gibberellin dễ dàng đi xuyên qua màng tế bào nhờ khả năng hòa tan trong lipid. Gibberellin có khả năng cảm ứng sự nẩy mầm ở một số hạt, cảm ứng cây tăng trưởng, trổ hoa và kích thích sự phát triển của trái ở một số loài.

67 Một số ứng dụng của Gibberelin Söï keùo daøi cuoáng hoa ôû caùc caây ngaøy daøi, ñaëc bieät caùc caây coù daïng hoa hoàng (giuùp söï ra hoa) laø taùc duïng ñaëc saéc cuûa GA. GA giuùp söï taïo hoa ñöïc (caây löôõng tính nhö döa chuoät hay caây phaân tính nhö spinach) trong khi auxin giuùp söï taïo caùc hoa caùi. Gioáng nhö auxin, GA giuùp söï ñaäu traùi. Trong söï ñaäu traùi, GA kích thích söï naûy maàm cuûa haït phaán vaø söï taêng tröôûng cuûa oáng phaán. GA kích thích söï taêng tröôûng cuûa traùi, laøm chaäm söï laõo suy traùi, giuùp caùc traùi dính laâu treân caây hôn ñeå chôø ñöôïc haùi.

68 Một số ứng dụng của Gibberelin GA laøm chaäm söï vaøo hieän töợng nguû cuûa choài do ngaøy ngaén caûm öùng (muøa thu), vaø gôõ söï nguû cuûa caùc choài caây goã (ñoái khaùng vôùi AAB). GA gôõ söï nguû nhaïy saùng ôû vaøi loaïi haït. GA coù theå gôõ söï caûn naûy maàm do AAB.

69 Một số ứng dụng của Gibberelin Söï lieân heä vôùi auxin: Trong phaàn lôùn caùc tröôøng hôïp, GA coù hoaït ñoäng boå sung cho auxin: - Auxin kích thích töôïng taàng, GA kích thích moâ phaân sinh loùng. - Auxin kích thích söï keùo daøi teá baøo cuûa caùc teá baøo daãn xuaát töø moâ phaân sinh (vuøng döôùi ngoïn, vuøng keùo daøi); GA kích thích söï keùo daøi cuûa caùc teá baøo coù nguoàn goác töø moâ phaân sinh loùng. - Auxin caûn choài naùch; GA kích thích söï taêng tröôûng choài vaø gôõ vaøi söï nguû cuûa choài vaø phoâi. - Auxin kích thích söï taïo reã; GA khoâng coù hieäu öùng naøy (ñoâi khi coù hieäu öùng nghòch).

70 Một số điểm khác biệt của Gibberelin và Auxin Cấu tạo GA Có một vòng gibban cơ bản Chỉ có nguyên tố C, H, O H Tổng hợp Tiền chất là acid mevalonic NHAÂN GIBBERELLAN 17 Auxin Có vòng indol hoặc vòng phenol Luôn có N trong công thức cấu tạo NHAÂN INDOL Tiền chất là triptophan Tác dụng sinh lý Kích thích sinh trưởng kéo dài của cây Kích thích sự sinh trưởng giãn của tế bào theo mọi hướng

71 CYTOKININ

72 Cytokinin Lịch sử xuất hiện: Năm 1944, Miller và Skoog tách được 1 chất từ tinh dịch cá thu có thể kích thích sự phân bào mạnh mẽ trong nuôi cấy mô gọi là Kinetin (6- furfuryl aminopurin). Năm 1963, Letham và Miller tách được Cytokinin kết tinh từ hạt ngô gọi là Zeatin. Ngày nay, đã xác định được Cytokinin có ở tất cả các thực vật khác nhau

73 Cytokinin Cytokinin được tạo ra trong ngọn rễ và trong hạt đang phát triển, sau đó, được vận chuyển qua mô gỗ từ rễ lên thân. Cytokinin có vai trò chính trong sự phân cắt tế bào. Tác động của cytokinin lên sự tăng trưởng của tế bào trong môi trường nuôi cấy mô lệ thuộc vào sự hiện diện đồng thời của auxin, tỉ lệ giữa cytokinin và auxin có ý nghĩa quan trọng trong việc xác định sự chuyên hóa của tế bào mới.

74 Một số dạng Cytokinin NH 2 N N N 9 H ADENIN N 8 7 N HN N C H2 N H KINETIN N O HN H C H2 CH 2 OH CH 3 HN C H2 N N O N N N N N H N H N N ZEATIN H DIPHENILURE H BA

75 Tính chất sinh lý của Cytokitin Trong söï taêng tröôûng teá baøo: Caùc cytokinin kích thích söï phaân chia teá baøo vôùi ñieàu kieän coù söï hieän dieän cuûa auxin. Cytokinin taùc ñoäng treân caû hai böôùc cuûa söï phaân chia teá baøo: phaân nhaân vaø phaân baøo. Cytokinin caûn söï keùo daøi teá baøo theo chieàu doïc, nhöng kích thích söï taêng roäng (söï taêng tröôûng cuû).

76 Tính chất sinh lý của Cytokitin Trong söï taïo cô quan: Khuùc caét loõi hay moâ seïo thuoác laù coù theå taïo reã hay choài tuøy theo tyû leä auxin/cytokinin trong moâi tröôøng nuoâi caáy: tyû leä cao giuùp söï taïo reã - tyû leä thaáp giuùp söï taïo choài. Cytokinin khi thì hoã trôï auxin (taêng tröôûng), khi thì ñoái khaùng (phaân hoaù choài vaø reã). Do ñoù, söï caân baèng giöõa hai kieåu hormon naøy laø moät trong nhöõng yeáu toá kieåm soaùt söï phaùt trieån. Trong öu tính ngoïn: Cytokinin coù khaû naêng gôõ öu tính ngoïn ôû caùc choài naùch (do auxin ñöôïc tieát töø ngoïn): chích BA hay kinetin vaøo moät goác choài naùch seõ haïn cheá taùc ñoäng cuûa auxin töø treân xuoáng, vaø giuùp söï taêng tröôûng cuûa choài naøy.

77 ACID ABSCISIC

78 ACID ABSCISIC Lịch sử phát hiện: Năm 1961, Liu và Carn đã tách được abscicin I ở quả bông già có khả năng làm rụng cuống bông non. Năm 1963, Chukuma và Eddicott đã tách được abscicin II gây rụng lá, ngủ nghỉ chồi. Năm 1966, xác định được bản chất hóa học và gọi tên là acid abscicic.

79 ACID ABSCISIC Acid abscisic được tạo ra từ lá trưởng thành và được vận chuyển qua mô libe. Hormon acid abscisic kiểm soát sự rụng lá ở nhiều cây, là chất cảm ứng miên trạng của chồi và hột. Acid abscisic gây ra một số đáp ứng, bao gồm sự đóng các khí khẩu giúp cây chịu đựng khô hạn, chỉ vài phút sau khi cây bắt đầu héo, nồng độ acid abscisic trong lá tăng lên 10 lần.

80 ACID ABSCISIC Acid abscisic được xem là yếu tố ngăn cản sự tăng trưởng, nhưng trong nhiều trường hợp lại có tác động cảm ứng tăng trưởng và phát triển. Thí dụ: thúc đẩy sự vận chuyển những sản phẩm quang hợp cho phôi phát triển trong hạt và cảm ứng sự tổng hợp protein.

81 ETHYLEN

82 ETHYLEN Lịch sử phát hiện: Ethylenne được sử dụng từ rất lâu đời Năm 1864, Girardin nghiên cứu vai trò chính thức của ethylene. Năm 1917, Doubt xác định ethylene kích thích sự rụng quả. Năm , Denny nghiên cứu phương pháp làm chín cam quýt bằng sự đốt và chứng minh Ethylene là thành phần chính từ sự đốt này

83 ETHYLEN Ethylen có ảnh hưởng đến chu kỳ đời sống của cây: sự tăng trưởng phát triển của cây. sự lão hóa. sự chín của trái. Ethylen là một chất khí, được tổng hợp trong các mô đang xảy ra sự lão hóa hay sắp chín, là một chất gây ra sự chín.

84 ETHYLEN Quá trình chín bắt đầu khi có sự bộc phát về các hoạt động biến dưỡng do nồng độ ethylen tăng lên khoảng 100 lần. Ngăn cản sự tạo ethylen hay loại bỏ được ethylen ngay khi chúng được sinh ra thì ngăn chận được sự chín. Ethylen cũng thúc đẩy sự rụng của lá, hoa, trái và góp phần vào những biến đổi tiêu biểu sự lão hóa trong cây hoặc một phần của cây. Ngoài ra, ethylen còn có thể giúp phá vỡ sự miên trạng của chồi và hạt của một số loài và gây trổ hoa ở một số loài thực vật khác như Khóm.

85 TỔNG HỢP TÁC ĐỘNG ĐIỀU HÒA CỦA CÁC HORMON

86 TÁC ĐỘNG ĐIỀU HÒA CỦA CÁC HORMON Tác động trên sự phân chia của tế bào, khâu đầu tiên của quá trình tăng trưởng được kích thích bởi gibberellin, cytokinin và auxin. Các hormon tác động lên sự tăng trưởng của tế bào, là giai đoạn thứ hai của quá trình tăng trưởng, có sự tham gia của các chất như auxin và gibberellin thúc đẩy tế bào dài ra.

87 TÁC ĐỘNG ĐIỀU HÒA CỦA CÁC HORMON Các loại hormon hiện diện trong cây với tác động phối hợp và ảnh hưởng chuyên biệt của nó trên từng phần của cây, giúp điều phối sự phát triển về cả về hình thái và chức năng của cây là do tác động kết hợp của auxin và cytokinin. Qúa trình lão hóa dẫn đến sự chết, do sự tác động của những chất gây lão hóa khác nhau như acid abscisic, ethylen; trong đó ethylen là một trong những chất quan trọng nhất..

88 Chương 4: CÁC PHƯƠNG PHÁP VI NHÂN GIỐNG THỰC VẬT

89 4.1 NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT

90 CÁC GIAI ĐOẠN TỔNG QUÁT Vi nhaân gioáng caây troàng thường goàm 4 giai ñoaïn chuû yeáu : - Giai ñoaïn I: Kieán laäp, tạo mô caáy vô trùng. - Giai ñoaïn II: Nhaân caây gioáng (tạo chồi). - Giai ñoaïn III: Taïo reã. - Giai ñoaïn IV: Thích nghi.

91 Giai ñoaïn I: Kieán laäp, tạo mô caáy vô trùng Mục đích: tạo thaønh coâng maãu caáy voâ truøng, không bò nhieãm taïp vaø bước đầu oån ñònh mẫu cấy. Giai ñoaïn I goàm caùc noäi dung sau: - Chọn mẫu cấy - Vô trùng mẫu cấy - Ổn định các điều kiện sinh lý cho mẫu cấy.

92 Giai ñoaïn I: Kieán laäp, tạo mô caáy vô trùng Choïn maãu caáy: Mức độ thaønh coâng của vi nhaân gioáng phuï thuoäc rất nhiều vaøo ñaëc ñieåm cuûa caây non duøng ñeå nhaân gioáng. Coù 3 yếu tố cần quan taâm: a/ Ñaëc ñieåm di truyeàn vaø sự phaùt sinh caù theå cuûa nguoàn thöïc vaät duøng ñeå nhaân gioáng. b/ Kieåm tra nguoàn gaây beänh. c/ Ñieàu kieän sinh lyù cuûa caây.

93 Giai ñoaïn I: Kieán laäp, tạo mô caáy vô trùng Khöû truøng maãu caáy: Caùc yeáu toá gaây nhieãm trong vi nhaân gioáng: caáy. virus. a/ Nhieãm naám, vi khuaån treân beà maët maãu b/ Nhieãm virus vaø caùc cô theå töông töï c/ Caùc nguoàn beänh beân trong.

94 Mẫu thực sinh Rửa kĩ bằng xà phòng và nước máy Rửa cồn 70 0 (30-60 giây) Rửa nước cất vô trùng (3 lần) Ngâm trong dung dịch diệt khuẩn với vài giọt Tween 80 Rửa nước cất vô trùng (3 lần) Loại bỏ những phần mô bị tác nhân vô trùng làm hoại tử Đặt lên môi trường nuôi cấy Sơ đồ tổng quát khử trùng mẫu thực sinh

95 Giai ñoaïn I: Kieán laäp, tạo mô caáy vô trùng Dịch rỉ cây địa lan Ổn định các điều kiện sinh lý cho mẫu cấy: Tạo sự ổn định cho maãu caáy (được xem như giai đoạn tái sinh mẫu cấy): caáy chuyeàn nhieàu laàn trên môi trường thích hợp, nhằm mục đích taïo ra nhöõng caây con ñoàng nhaát, sinh tröôûng toát. Haïn cheá taùc haïi cuûa loaïi dòch ræ.

96 Giai ñoaïn II: Nhaân caây gioáng (tạo chồi) Muïc ñích: nhaân nhanh caây con, là giai đoạn then chốt của quá trình. Môi trường dinh dưỡng thường được bổ sung các chất điều hoà sinh trưởng (Auxin, Cytokynin, Gibberellin, ), các chất bổ trợ, nước dừa, dịch chiết nấm men, Tuỳ thuộc vào từng đối tượng nuôi cấy, có thể nhân nhanh thông qua kích thích hình thành cụm chồi (nhân cụm chồi), kích thích sự phát triển của các chồi nách (vi giâm cành) hoặc thông qua việc tạo cây từ phôi vô tính. Quá trình thường được thöïc hieän baèng caùch thöû nghiệm có heä thoáng caùc noàng ñoä khaùc nhau cuûa caùc yếu toá môi trường hay phoái hôïp tỉ lệ caùc yeáu toá với nhau.

97 Bảng: Nhân chồi invitro cây giá tỵ BA (mg/l) IAA (mg/l) Số chồi phát sinh (chồi) Chiều cao thân chồi (mm) 0,1 0,1 4,6g 45b 0,5 3,2gh 38b 1,0 2,4h 30c 0,5 0,1 12,5c 58a 0,5 6,5f 42b 1,0 3,8gh 38b 1,0 0,1 16,4a 34b 0,5 14,8b 28c 1,0 12,6c 21c CV(%) 14,2 12

98 Giai ñoaïn II: Nhaân caây gioáng (tạo chồi). Tæ leä nhaân gioáng: Laø soá caây thu ñöôïc trong moät laàn nhaân gioáng. Tæ leä nhaân gioáng cao khoâng nhaát thieát laø điều quan trọng nhaát trong quá trình nhân giống. Taàn soá nhaân gioáng coù theå keùo daøi töø hai ñeán taùm tuaàn.

99 Giai ñoaïn II: Nhaân caây gioáng (tạo chồi). Hệ số nhaân gioáng: Là số lượng cây giống được tạo nên từ một cây ban đầu trong một thời gian nhất định (thường là một năm). Ví dụ: Sau 01 tháng, từ 01 cây giống tạo nên 4 cây con. Hệ số nhân giống trong một năm là: 4 12 Sau 03 tháng, từ 01 cây giống tạo nên 4 cây con. Hệ số nhân giống trong một năm là: 4 4

100 Quy trình nuôi cấy chồi ngọn

101 Giai ñoaïn III: Taïo reã Mục đích: taïo reã cho maãu caáy. Mẫu cây giống khi đạt được kích thước nhất định sẽ được chuyển sang giai đoạn tạo rễ, thường được thực hiện bằng 02 cách: - Caáy chuyeàn mẫu caáy sang moâi tröôøng taïo reã coù tæ leä phytohormone giaûm hoaëc hoaøn toaøn khoâng chöùa cytokinin vaø taêng nồng độ auxin, haøm löôïng muoái khoaùng thöôøng giaûm ñi moät nöûa. - Caáy chuyeàn caùc mẫu caáy sang moâi tröôøng taïo reã (moâi tröôøng lỏng) trong moät thời gian ngắn (thường giờ), sau ñoù, caáy chuyeàn sang moâi tröôøng khoâng chöùa auxin ñeå taïo reã.

102 Dụng cụ chuyên dụng nuôi cấy tạo rễ invitro

103 Giai ñoaïn III: Taïo reã Taïo reã beân ngoaøi oáng nghieäm: - Xöû lyù maãu caáy baèng auxin: nhuùng nhanh vaøo dung dòch phytohormone vaø caém vaøo giá thể trong vöôøn öôm coù ñoä aåm cao. Khi chuyeån ra troàng vöôøn öôm, caây taïo reã ngoaøi oáng nghieäm sẽ deã thích nghi vôùi ñieàu kieän moâi tröôøng, vì vậy, coù tæ leä soáng soùt rất cao.

104 Giai ñoaïn IV: Thích nghi Là giai đoạn đưa cây từ ống nghiệm ra môi trường tự nhiên, là bước quyết định khả năng ứng dụng quá trình nhân giống in vitro vào thực tiễn sản xuất. Đây là giai đoạn chuyển cây con in vitro từ trạng thái sống dị dưỡng sang sống tự dưỡng, do đó, cần đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh như: nhiệt độ, ánh sáng, ẩm độ, phù hợp để cây con đạt tỷ lệ sống cao trong vườn ươm hay trên ruộng sản xuất.

105 Thuùc ñaåy toác ñoä thích nghi vôùi khí haäu Tröôùc khi ñöa caây ra khoûi oáng nghieäm: Laøm giaûm ñoäâ aåm cuûa moâi tröôøng trong oáng nghieäm: đặt ống nghiệm trong môi trường có nhiệt độ tự nhiên khoảng 5-7 ngày, sau đó, môû naép oáng nghieäm 5-7 ngaøy tröôùc khi ñem caây con ra ngoaøi. Thúc đẩy thích nghi của cây giống

106 Thuùc ñaåy toác ñoä thích nghi vôùi khí haäu Sau khi ñöa caây ra khoûi oáng nghieäm: Giaûm töø töø ñoä aåm laø bieän phaùp xöû lyù thoâng duïng nhaát ñeå caây con thích nghi vôùi khí haäu. Ñoä aåm coù theå duy trì baèng caùch xöû lyù söông muø giaùn ñoạn hoaëc ñaët caây con trong maøng polyethylene. Ñaây laø böôùc raát quan troïng trong quaù trình giúp caây laøm quen vôùi môi trường tự nhiên. Đưa cây ra vườn ươm

107 Thuùc ñaåy toác ñoä thích nghi vôùi khí haäu Sau 1-2 tuần, cây con sẽ được chuyển ra bầu đất hay luống ươm. Cơ chất bầu đất hay luống ươm phải tơi xốp, đầy đủ chất dinh dưỡng. Hàng tuần, cây con cần được phun thêm dinh dưỡng khoáng (hổn hợp N-P-K; 1-2 lần/tuần). Sau 7-10 ngày, cây bắt đầu ra rễ mới. Khi đó, ánh sáng, ẩm độ, nhiệt độ không khí mát và các điều kiện tập tính sinh trưởng của từng loại cây nếu được duy trì sẽ giúp cây phát triển nhanh, khỏe mạnh. Cây sinh trưởng vườn ươm

108 4.2 NUÔI CẤY ĐỈNH SINH TRƯỞNG

109 NUÔI CẤY MÔ PHÂN SINH ĐỈNH SINH TRƯỞNG TẠO CÂY SẠCH BỆNH Mô phân sinh là loại mô gồm những tế bào thường xuyên thực hiện sự phân chia để hình thành nên những tế bào mới, những tế bào này sẽ chuyên hóa và tạo nên các loại mô khác nhau. Tùy thuộc vào vị trí hay nguồn gốc phát sinh, có thể chia mô phân sinh ra làm: hay: - Mô phân sinh ngọn - Mô phân sinh lóng - Mô phân sinh sơ cấp - Mô phân sinh thứ cấp

110 NUÔI CẤY MÔ PHÂN SINH ĐỈNH SINH TRƯỞNG TẠO CÂY SẠCH BỆNH

111 NUÔI CẤY MÔ PHÂN SINH ĐỈNH SINH TRƯỞNG TẠO CÂY SẠCH BỆNH Sự hình thành các cơ quan mới ở thực vật luôn bắt đầu từ các mô phân sinh đỉnh. Moâ phaân sinh ñænh chöùa nhöõng teá baøo khởi sinh (teá baøo ñænh sinh tröôûng), ñöôïc bao boïc bôûi moät lôùp cutin và thường có thể tích ổn định.

112

113 NUÔI CẤY MÔ PHÂN SINH ĐỈNH SINH TRƯỞNG TẠO CÂY SẠCH BỆNH Quá trình sinh trưởng của đỉnh sinh trưởng: - Giai đoạn phôi sinh: Các điểm sinh trưởng (trong các mô phân sinh đỉnh) xảy ra sự hình thành mầm cơ quan, phân chia hình thành các mô riêng biệt. - Giai đoạn kéo dài: các mô riêng biệt phát triển, mầm cơ quan đạt kích thước tối đa, có hình dạng nhất định. - Giai đoạn kết thúc: kết thúc phân hóa tế bào, bắt đầu sự hoá gỗ các thành tế bào, xuất hiện những chỗ dầy lên có cấu tạo ổn định không còn khả năng tiếp tục sinh trưởng. Quá trình diễn ra liên tục, thể tích đỉnh sinh trưởng gần như không đổi.

114

115 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng tạo cây sạch bệnh Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng là phương pháp nhân giống rất tiện ích: - Hệ số nhân giống cao. - Tạo ra được những loại cây trồng sạch vius, sạch bệnh (quá trình sinh tổng hợp DNA của virus không xảy ra trong tế bào đỉnh sinh trưởng). Chồi đỉnh, chồi nách, đầu tận cùng của rễ hay gốc của mỗi lóng là những vị trí có thể phân tách thu nhận đỉnh sinh trưởng, trong đó, chồi non (10-15 cm), vừa mới nhú lá là vật liệu thường được sử dụng nhất.

116 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng tạo cây sạch bệnh Một số điểm cần lưu ý: - Kích thước mẫu: ñænh sinh tröôûng kích thöôùc 0,1 0,15 mm seõ taïo ra ñöôïc 100% soá caây con saïch beänh (tæ leä naøy giaûm daàn ñeán kích thöôùc 1 mm). - Xöû lyù nhieät - Bổ sung các hoùa chaát loaïi tröø virus (ribavirein) vaøo moâi tröôøng nuoâi caáy. - Nhaân gioáng ñænh sinh tröôûng ñöôïc söû duïng hieäu quaû vôùi nhieàu loaïi caây thaûo moäc, phương pháp naøy phöùc taïp hôn ñoái vôùi caùc loaøi caây goã.

117 4.3 KỸ THUẬT VI GHÉP

118 KỸ THUẬT VI GHÉP Vi gheùp (micrografting) là phương pháp ghép invitro, giúp khaéc phuïc những nhöôïc ñieåm của kyõ thuaät ghép truyeàn thoáng (thôøi gian troàng goác gheùp keùo daøi, caùc beänh virus deã laây truyeàn) nhờ vào kyõ thuaät gheùp ñænh sinh tröôûng. Veà nguyeân taéc, vi gheùp laø nuoâi caáy ñænh sinh tröôûng nhöng thoâng qua dinh döôõng töï nhieân cuûa goác gheùp.

119 KỸ THUẬT VI GHÉP Ñænh sinh tröôûng laøm maét gheùp coù kích thöôùc 0,2 0,5 mm ñöôïc taùch töø buùp non ñang sinh tröôûng maïnh cuûa caây meï tröôûng thaønh. Goác gheùp thường laø maàm cây cuûa gioáng hoang daïi. Caây gheùp ñöôïc nuoâi döôõng trong ñieàu kieän invitro. Nhöõng caây gheùp thu ñöôïc baèng phöông phaùp vi ghép hoaøn toaøn saïch beänh vaø mang ñaëc ñieåm di truyeàn cuûa caây meï cho maét gheùp.

120 1. Gieo haït laáy caây maàm laøm goác gheùp: - Taùch haït töø quaû chín, röûa saïch vaø ñeå khoâ. - Gieo hạt invitro: boùc voû traáu, voû luïa, khöû truøng gieo treân moâi tröôøng bán rắn. gheùp. Phương pháp vi ghép - Sau khi caây maàm daøi 5-8 cm, sử dụng laøm goác 2. Taùch ñænh sinh tröôûng laøm maét gheùp: - Sử dụng buùp non (1,5 3,0cm) từ caây meï tröôûng thaønh coù naêng suaát vaø phaåm chaát toát. - Khöû truøng và taùch ñænh sinh tröôûng, chuyeån vaøo vò trí gheùp.

121 3. Tieán haønh gheùp: Phương pháp vi ghép Caét boû ñaàu reã, thaân truï treân laù maàm (ñeå laïi ôû phaàn reã 2-3cm vaø ôû phaàn thaân 2cm). - Gheùp leân maët caét: Ñaët maét gheùp tröïc tieáp leân beà maët laùt caét, treân voøng töôïng taàng. - Gheùp chöõ T ngöôïc: Duøng ñaàu nhoïn löôõi dao caét loã gheùp hình chöõ T ngöôïc, chaân chöõ T laø maët caét ñeå deã boäc loä vuøng töôïng taàng. Ñaët maét gheùp sao cho maët caét cuûa noù tieáp xuùc vôùi töôïng taàng. - Gheùp haøm eách: Khoeùt treân thaân maàm caùch maët caét 5mm moät veát loõm hình haøm eách, chieàu saâu veát loõm baèng beà daøy lôùp voû. Ñaët maét gheùp vaøo ñaùy haøm eách.

122 Các kiểu vi gheùp

123 Phương pháp vi ghép 4. Nuoâi caây gheùp: Caây gheùp sẽ ñöôïc nuoâi, chăm sóc trong điều kiện invitro như các cây invitro thông thường. Sau ngaøy, coù theå quan saùt thaáy moät voøng moâ seïo phaùt sinh trên vị trí ghép, ñieàu kieän ñeå maét gheùp vaø goác gheùp lieân keát vôùi nhau. Trong khoảng 01 tuaàn maét gheùp ñaït kích thöôùc 1,5 2,0 mm vaø sau 04 tuaàn choài gheùp coù kích thöôùc mm. Reã cuûa goác gheùp sẽ moïc theâm nhiều reã phuï.

124 4.4 NUÔI CẤY PHÁT SINH PHÔI SOMA

125 NUÔI CẤY PHÁT SINH PHÔI SOMA Phôi soma là phôi được hình thành và phát triển từ các tế bào sinh dưỡng có khả năng hình thành phôi gọi là tế bào tiền phôi, thường có cấu trúc lưỡng cực, một cực phân hóa hình thành rễ, một cực tạo ra chồi tương tự phôi hợp tử (phôi hữu tính), có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh.

126 NUÔI CẤY PHÁT SINH PHÔI SOMA Tế bào tiền phôi thường là những tế bào có hạch nhân lớn, hàm lượng protein, RNA cao, tế bào chất đậm đặc, chứa nhiều hạt tinh bột lớn. Tế bào tiền phôi có thể có nguồn gốc từ tế bào sinh dưỡng, tế bào sinh sản không phải hợp tử hay trục hạ diệp, tử diệp của cây phát sinh không qua quá trình tạo mô sẹo. Kỹ thuật nhân giống phôi soma mang lại nhiều hiệu quả, đặc biệt, giải quyết nhu cầu về sản xuất giống cây trồng chất lượng cao trên quy mô công nghiệp.

127 Sự phát sinh phôi soma Quá trình phát sinh phôi diễn ra qua 02 con đường: - Phôi phát sinh trực tiếp, không qua giai đoạn tạo mô sẹo. - Phôi phát sinh gián tiếp, có qua giai đoạn tạo mô sẹo và giai đoạn cảm ứng tạo phôi.

128 Quá trình phát triển phôi soma Gồm 03 giai đoạn: 1. Những tế bào đơn phát triển, hình thành những cụm tế bào hình cầu. 2. Tế bào hình cầu trải qua giai đoạn phân cực tạo các tế bào hình tim. 3. Tế bào hình tim phát triển hình thành các tế bào hình thủy lôi.

129 Qúa trình phát triển phôi hữu tính Qúa trình phát triển phôi vô tính

130 Quy trình tạo và nuôi cấy phôi soma Choïn vaät lieäu nuoâi caáy thích hôïp: Goàm caùc coâng vieäc taïo callus, taïo huyeàn phuø teá baøo hoaëc taïo protoplast. Caûm öùng taïo phoâi caùc teá baøo nuoâi caáy: Nhöõng khoái teá baøo tieàn phoâi sẽ ñöôïc taùch ra döïa vaøo söï khaùc bieät veà kích thöôùc và được cấy chuyeån sang moâi tröôøng phaân hoùa. Nhöõng teá baøo nhoû hôn sẽ ñöôïc caáy tieáp tuïc saûn xuaát phoâi.

131 Quy trình tạo và nuôi cấy phôi soma Phaân hoùa vaø thaønh thuïc phoâi: Tính ñoàng boä vaø söï phaùt trieån cuûa phoâi sẽ được tiếp tục duy trì. Taïo caây con: Caùc phoâi thaønh thuïc coù kích thöôùc bình thöôøng sẽ ñöôïc ñaët leân moâi tröôøng thaïch coù chöùa cytokinin noàng ñoâï thaáp ñeå taùi sinh caây con hoaøn chænh. Ñöa caây con ra vöôøn öôm: Sau khi laù vaø reã ñaõ hình thaønh phát triển đầy đủ, caây con sẽ ñöôïc ñöa ra chaêm soùc vöôøn öôm.

132

133 Kỹ thuật nuôi cấy phôi Một số điểm cần lưu ý: 1. Mẫu nuôi cấy: khử trùng mẫu, tách mẫu. 2. Môi trường nuôi cấy: chất vô cơ, nguồn carbon, nguồn nitrogen, các dịch chiết và các chất hữu cơ, chất điều hòa sinh trưởng, agar, than hoạt tính. 3. Điều kiện nuôi cấy: ph, nhiệt độ, ánh sáng. 4. Quá trình duy trì sự phát sinh phôi đồng nhất: kích thích sự phân chia đồng nhất, tách tế bào phôi, kiểm soát sinh trưởng bằng áp suất thẩm thấu. 5. Quá trình tái sinh phôi soma: ảnh hưởng của auxin, quá trình làm khô.

134 4.5 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ VI NHÂN GIỐNG

135 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ VI NHÂN GIỐNG Kiểu gen: các giống khác nhau trong một loài, khi nuôi cấy invitro sẽ cho hệ số tăng sinh, sức sinh trưởng, kích thước cây giống rất khác nhau. Cơ quan nuôi cấy: chọn cơ quan nuôi cấy phù hợp mục đích nuôi cấy, chồi đỉnh là cơ quan được chọn sử dụng nhiều nhất. Tuổi sinh lý: mẫu cấy non dễ biệt hóa, tái sinh hơn mẫu cấy già. Sức sống của mẫu: mẫu cấy khỏe mạnh không nhiễm các loại bệnh. CHỌN DÒNG

136 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ VI NHÂN GIỐNG Nhiệt độ: thích hợp trong khoảng C. Ánh sáng: nhu cầu về quang kỳ, cường độ chiếu sáng và chất lượng ánh sáng mỗi loài cây đều khác nhau. Môi trường dinh dưỡng: chọn môi trường khoáng, nồng độ, tỉ lệ các hormon sinh trưởng thực vật phù hợp mục đích nuôi cấy. Các chất khí: O 2, CO 2, ethylene thường được quan tâm khảo sát nhiều trong môi trường nuôi cấy (đặc biệt, trong nuôi cấy vi nhân giống quang tự dưỡng).

137 SỰ BIẾN DỊ VÀ NHỮNG VẤN ĐỀ TỒN TẠI TRONG VI NHÂN GIỐNG CÂY TRỒNG

138 SỰ BIẾN DỊ VÀ NHỮNG VẤN ĐỀ TỒN TẠI TRONG VI NHÂN GIỐNG CÂY TRỒNG Tính bất định về mặt di truyền: Độ biến dị trung bình khoảng 40%. Nguyên nhân có thể do sự thay đổi vị trí của các DNA. Nuôi cấy mô sẹo, nuôi cấy tế bào đơn thường có sự biến dị nhiều hơn nuôi cấy chồi đỉnh. Những nhân tố gây ra sự biến dị: - Kiểu di truyền - Thể bội - Số lần cấy chuyền - Loại mô nuôi cấy

139 SỰ BIẾN DỊ VÀ NHỮNG VẤN ĐỀ TỒN TẠI TRONG VI NHÂN GIỐNG CÂY TRỒNG Sự hoại mẫu: Tác nhân gây hoại mẫu thường là: các vi sinh vật (hoại mẫu) hay các virus hay thể giống virus xâm nhiễm (không hoại mẫu nhưng ảnh hưởng đến sinh trưởng mẫu). Mẫu cấy nhiễm khuẩn

140 SỰ BIẾN DỊ VÀ NHỮNG VẤN ĐỀ TỒN TẠI TRONG VI NHÂN GIỐNG CÂY TRỒNG Sự hoại mẫu: Biện pháp hạn chế, khắc phục: Khử trùng mẫu trước khi cấy vào môi trường. Trồng cây mẹ ở môi trường mát và khô 2-3 tuần, trước khi sử dụng làm mẫu nguyên liệu. Sử dụng mô phân sinh đỉnh (phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng) làm mẫu cấy. Bổ sung các chất kháng sinh vào môi trường nuôi cấy.

141 SỰ BIẾN DỊ VÀ NHỮNG VẤN ĐỀ TỒN TẠI TRONG VI NHÂN GIỐNG CÂY TRỒNG Việc tiết các chất gây độc từ mẫu cấy: Mẫu cấy thường tiết ra các hợp chất phenol, polyvinylpyrilidone (PVP), tannin, tyramine, eucomic acid,... làm hóa nâu, hóa đen môi trường nuôi cấy gây ức chế sinh trưởng, thậm chí, làm chết mẫu. Dịch tiết từ mẫu cây hoa lan

142 SỰ BIẾN DỊ VÀ NHỮNG VẤN ĐỀ TỒN TẠI TRONG VI NHÂN GIỐNG CÂY TRỒNG Việc tiết các chất gây độc từ mẫu cấy: Biện pháp hạn chế : Tách các phần tử phenol: bổ sung các chất kìm hãm, các chất khử phenol, các chất chống oxy hóa: than hoạt tính, ascorbic acid, citric acid, glutathione, mecaptoethanol,... Nuôi cấy lỏng lắc cây địa lan Giảm sự tập trung phenol tại nơi cấy mẫu: nuôi cấy môi trường lỏng lắc.

143 SỰ BIẾN DỊ VÀ NHỮNG VẤN ĐỀ TỒN TẠI TRONG VI NHÂN GIỐNG CÂY TRỒNG Việc tiết các chất gây độc từ mẫu cấy: Biện pháp hạn chế : Phenolase Ngăn chặn sự hoạt động của enzyme phenolase: sử dụng môi trường nuôi cấy có ph thấp (ph = ) hay ngâm mẫu vào dung dịch ph thấp (dùng ascorbic acid, citric acid) vài giờ trước khi cấy mẫu. Hạn chế cường độ tiết phenol của mẫu cấy: hạn chế vết thương, vết cắt trên mẫu.

144 SỰ BIẾN DỊ VÀ NHỮNG VẤN ĐỀ TỒN TẠI TRONG VI NHÂN GIỐNG CÂY TRỒNG Hiện tượng thủy tinh thể: Cây invitro bị hiện tượng thủy tinh thể là những cây có màu xanh lục đậm, dạng thủy tinh trong suốt, khả năng sinh trưởng kém và tỉ lệ sống rất thấp khi chuyển ra trồng ở vườn ươm. Về cấu tạo vi cấu trúc, cây thủy tinh thể có tế bào chất kém đậm đặc, đặc biệt, diệp lục phát triển rất kém. Cây thủy tinh thể thường gặp khi nuôi cây trên môi trường lỏng hay môi trường thạch có hàm lượng thạch (agar) thấp, đặc biệt, môi trường có sự trao đổi khí thấp.

145 Chồi lan ngọc điểm bị thủy tinh thể Chồi thủy tùng bị thủy tinh thể Chồi thủy tùng bình thường Chồi lan ngọc điểm bình thường

146 SỰ BIẾN DỊ VÀ NHỮNG VẤN ĐỀ TỒN TẠI TRONG VI NHÂN GIỐNG CÂY TRỒNG Hiện tượng thủy tinh thể: Biện pháp ngăn chặn: - Giảm sự hút nước: tăng nồng độ đường. - Hạn chế gây các vết cắt, vết thương trên mẫu. - Tăng cường độ ánh sáng, giảm nhiệt độ phòng nuôi cây. - Giảm mật độ mẫu cấy, tăng khả năng trao đổi khí, độ thông thoáng cho bình nuôi cấy.

147 SỰ BIẾN DỊ VÀ NHỮNG VẤN ĐỀ TỒN TẠI TRONG VI NHÂN GIỐNG CÂY TRỒNG Một số trở ngại khi thương mại hóa: Tính hiệu quả so với các phương pháp nhân giống thông thường đối với một số cây trồng. Vấn đề về chi phí, đặc biệt, tần suất cấy chuyền khi thương mại hóa. Sự lo ngại về các mầm bệnh hay tính bất định di truyền của cây vi nhân giống.

148 4.6 VI NHÂN GIỐNG QUANG TỰ DƯỠNG

149 KHÁI NIỆM Toyoki Kozai khởi xướng nghiên cứu phương pháp vi nhân giống quang tự dưỡng từ năm Hiện đang là hướng nghiên cứu quan trọng trong lĩnh vực vi nhân giống thực vật. Là phương pháp vi nhân giống sử dụng môi trường không có đường, sự tăng trưởng và tích tụ các chất hydratcacbon phụ thuộc vào khả năng quang hợp và sự hấp thu khoáng vô cơ của thực vật được nuôi cấy. Cơ sở khoa học: thực vật có diệp lục tố sẽ có khả năng tự quang hợp để tồn tại và phát triển.

150 Các nhân tố ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển cây invitro

151 Bình nuôi cấy được đậy kín bằng giấy lọc phân tử

152 ƯU ĐIỂM - Tỉ lệ cây chết do nhiễm nấm, khuẩn thấp. - Hiệu suất quang hợp và khả năng tự dưỡng của cây được nâng cao. - Giảm chi phí cho các thành phần trong môi trường nuôi cấy (đường, vitamine, ). - Cây thích nghi tốt hơn với môi trường thực sinh về sau. - Giảm được sự biến dị di truyền không mong muốn. - Có thể sử dụng các loại bình nuôi cấy có thể tích lớn, giảm công lao động và dễ tự động hóa hơn.

153 4.7 CÔNG NGHỆ HẠT NHÂN TẠO

154 Ý NGHĨA Công nghệ hạt nhân tạo được ứng dụng giải quyết các vấn đề về hạt giống đối với các loại thực vật không có khả năng nhân giống bằng hạt hay giá thành hạt giống quá cao (cây lai, cây không hạt, hạt giống tự nhiên kém chất lượng, ). Hạt nhân tạo có thể được bảo quản, tồn trữ và trồng trọt bằng những kỹ thuật canh tác truyền thống, đăc biệt, không phụ thuộc vào các điều kiện thời tiết, mùa vụ.

155 CẤU TẠO Hạt nhân tạo có cấu tạo gồm một phôi vô tính được bao bọc bởi một lớp áo bên ngoài thay cho nội nhũ và vỏ của hạt tự nhiên. Hạt nhân tạo Hạt song tử diệp Hạt đơn tử diệp

156 KỸ THUẬT TẠO HẠT NHÂN TẠO Gồm các bước: 1. Tạo phôi vô tính

157 KỸ THUẬT TẠO HẠT NHÂN TẠO Hỗn hợp Alginate Na và môi trường nuôi cảm ứng phôi Tạo màng bao Alginate Ca (khoảng 20 phút) Gồm các bước: 2. Tạo áo bao hạt nhân tạo Nhỏ giọt Chuyển phôi vào giọt phiểu Thu hạt nhân tạo Rửa nước

158 BẢO QUẢN VÀ GIEO TRỒNG Bảo quản: Hạt nhân tạo sau khi tạo thành sẽ được làm khô và bảo quản ở nhiệt độ lạnh 4 0 C, thời gian bảo quản khoảng 04 tháng. Gieo trồng: Trước khi đưa hạt nhân tạo ra gieo trồng nên trải hạt trên giá thể ẩm, nhiệt độ khoảng 30 0 C. Sau 04 ngày, phôi sẽ bắt đầu phát triển trở lại và có thể gieo trồng tự nhiên.

159 4.8 BIOREACTOR VÀ CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP

160 SƠ LƯỢC VỀ HỆ THỐNG BIOREACTOR Là hệ thống phản ứng sinh học, loại thiết bị điều khiển các hoạt động biến đổi hóa sinh của tế bào sống thông qua việc kiểm soát môi trường và điều kiện nuôi cấy vô trùng. Bảng: Các loại Bioreactor thông dụng

161 BIOREACTOR NUÔI CẤY THỰC VẬT Hệ thống cung cấp và xả môi trường hay các loại khí vô trùng được thiết kế có khả năng tạo ra một môi trường nuôi cấy vô trùng, kiểm soát các yếu tố môi trường bên trong. - Sản xuất sinh khối - Sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp - Chuyển hoá sinh học các chất chuyển hóa ngoại sinh

162 BIOREACTOR NGẬP CHÌM TẠM THỜI Hệ thống RITA Hệ thống bình sinh đôi BIT Hệ thống Plantima

163 BIOREACTOR NGẬP CHÌM TẠM THỜI Hệ thống Plantima

164 BIOREACTOR CÁNH KHUẤY

165 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP

166 CÁC CHẤT THỨ CẤP Các chất thứ cấp hay sản phẩm trao đổi chất thứ cấp, là các chất có hoạt tính sinh học được tạo ra qua quá trình biến dưỡng thứ cấp của tế bào. Gồm 03 nhóm chính: - Alkaloid: codein, nicotine, caffeine, morphine,... - Các tinh dầu: chứa hỗn hợp terpenoid: chất mùi, chất thơm, dung môi, - Glycoside: các phenolic, tanin và flavonoid, saponin và các cyanogenic glycoside, được sử dụng làm chất nhuộm, các chất mùi thực phẩm và dược phẩm.

167 NUÔI CẤY TẾ BÀO THU NHẬN CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP Hợp chất thứ cấp thực vật được nghiên cứu từ những năm Tulecke và Nickell là người đầu tiên nuôi cấy thành công tế bào thực vật thu hợp chất thứ cấp (shikonin, ginsenosid và berberin) trên quy mô lớn (1959). Hiện nay, đã có khoảng hợp chất được chiết xuất từ một số tế bào nhất định, rất có giá trị trong cuộc sống.

168 NUÔI CẤY TẾ BÀO THU NHẬN CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP Điều kiện nuôi cấy tế bào thu nhận hợp chất thứ cấp: - Tốc độ phân hủy các chất thứ cấp phải thấp hơn tốc độ tổng hợp. - Các phản ứng sinh tổng hợp các chất thứ cấp phải được thực hiện. - Sự xuất hiện các chất trung gian trong quá trình sinh tổng hợp

169 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH NUÔI CẤY TẾ BÀO THU NHẬN CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP - Sản phẩm thứ cấp và khả năng tổng hợp trong tế bào. - Chất lượng dòng tế bào. - Chất điều hòa sinh trưởng: sinh trưởng tế bào, cấu trúc tế bào, khả năng tổng hợp các chất thứ cấp. - Nguồn đạm, nguồn cacbon. - Ánh sáng. - Tiền chất. - Các yếu tố khác: ph, các chất khí, các elicitor, + Điều kiện nuôi cấy tế bào + Điều kiện duy trì quá trình nuôi cấy

170 2. Tạo và nhân sinh khối mô sẹo 3. Tạo và nhân sinh khối huyền phù tế bào 1. Nguồn thực vật 7. Tinh sạch sản phẩm 6. Tách chiết, thu hoạt chất 4. Nuôi cấy Bioreactor huyền phù tế bào 5. Nuôi cấy bình nuôi cấy công nghiệp

171 Chương 5: CÁC PHƯƠNG PHÁP CHỌN GIỐNG THỰC VẬT

172 5.1 NUÔI CẤY ĐƠN BỘI BAO PHẤN HẠT PHẤN

173 KỸ THUẬT NUÔI CẤY CÂY ĐƠN BỘI Ý nghĩa: Thời gian tạo dòng thuần nhanh, tiết kiệm nguồn lực và rút ngắn thời gian cần thiết để tạo ra giống mới, rút ngắn thời gian chọn giống. Nguyên liệu lý tưởng cho chọn giống. Chọn lọc giữa các thể đơn bội đối với các tính trạng do một alen trội kiểm soát dễ dàng (cá thể đồng hợp tử trội và dị hợp tử).

174 KỸ THUẬT TẠO CÂY ĐƠN BỘI KỸ THUẬT NUÔI CẤY TÚI PHẤN Nuôi cấy in vitro các bao phấn chứa tiểu bào tử hay hạt phấn chưa thành thục trên môi trường dinh dưỡng, tạo ra cây đơn bội. Số nhiễm sắc thể của cây đơn bội sẽ được nhân đôi (nhị bội hóa), tạo cây lưỡng bội đồng hợp tử hoàn toàn, thể đơn bội kép.

175 Quy trình tạo dòng đơn bội kép nuôi cấy hạt phấn Bước 1: Chọn vật liệu khởi nguyên và tạo các tổ hợp lai P1 x P2 F1 Bước 2: Nuôi cấy hạt phấn cây lai Bước 3: Tái sinh cây hoàn chỉnh (cây đơn bội) Bước 4: Nhị bội hóa cây đơn bội từ nuôi cấy túi phấn Bước 5: Đánh giá các dòng đơn bội kép về những tính trạng mong muốn

176

177 Quy trình tạo dòng đơn bội kép nuôi cấy hạt phấn Phöông phaùp kieåm tra möùc boäi theå: Thân caây con (khoảng ngaøy tuổi) ñöôïc coá ñònh trong dung dịch Carnoy töø 6 ñeán 12 giôø. Sau đó, nhuộm baèng dung dòch Acetocarmin hoaëc Fuchsine và kieåm tra möùc boäi theå döôùi kính hieån vi. Phöông phaùp nhò boäi hoùa bằng colchicin: - Ngaâm reã trong dung dòch colchicin, sau ñoù röûa saïch vaø caáy laïi. - Caét boû phaàn ngọn, bao choã caét baèng boâng taåm dung dòch colchicin. - Raïch ñoaïn thaân khoaûng 2cm, ñaët boâng taåm dung dòch colchicin.

178 Quy trình tạo dòng đơn bội kép nuôi cấy hạt phấn Ưu điểm: - Thời gian tạo dòng thuần nhanh hơn, rút ngắn thời gian chọn giống - Chọn lọc giữa các thể đơn bội kép hiệu quả hơn - Chọn lọc giữa các thể đơn bội đối với các tính trạng do một alen trội kiểm soát dễ dàng hơn Nhược điểm: - Thời gian đánh giá dòng thuần có thể lâu hơn - Thiết bị và nhân lực chuyên môn - Tần số thể đơn bội khó dự đoán trước - Tái tổ hợp bị hạn chế

179 Quy trình tạo dòng đơn bội kép nuôi cấy hạt phấn Những yếu tố cần lưu ý khi đơn bội kép: - Tình trạng sinh lý cây cho hạt phấn. - Hạt phấn: tuổi phát triển, kiểu gen, các tác nhân hóa lý. - Điều kiện xử lý trước khi nuôi cấy. - Môi trường nuôi cấy.

180

181 Tứ bội Tam bội Nhị bội Đơn bội

182 5.2 BIẾN DỊ TẾ BÀO SOMA VÀ CHỌN GIỐNG THỰC VẬT

183 PHƯƠNG PHÁP CHỌN GIỐNG ĐỘT BIẾN Đột biến là một cơ chế tạo ra biến dị di truyền ở mọi cơ thể sống. Đột biến ở thực vật là những thay đổi di truyền đột ngột xảy ra trong vật chất di truyền của cây. Đối với chọn tạo giống, đột biến gồm: đột biến gen, đột biến nhiễm sắc thể, đột biến nhân và ngoài nhân. Tác nhân gây đột biến: chủ yếu gồm: tác nhân vật lý (tia X, tia gamma, ), tác nhân hóa học (ethyl methane sulphonate, nitrozo u-rê, ).

184 Ý NGHĨA CỦA CHỌN GIỐNG ĐỘT BIẾN Cung cấp nguồn vật liệu di truyền mang các tính trạng mới, tạo ra giống mới. Thay đổi, cải tiến những tính trạng đơn gen và đa gen, tạo ra khả năng kháng sâu, bệnh, các điều kiện bất lợi của ngoại cảnh, cải tiến hàm lượng các chất có ích, tăng chất lượng sản phẩm, giảm chiều cao cây, tạo ra tính chín sớm, tăng năng suất, tạo ra tính bất dục đực. Là phương pháp bổ sung cho các phương pháp chọn giống khác, các thể đột biến tạo thành có thể sử dụng trực tiếp làm giống mới hoặc sử dụng gián tiếp làm vật liệu bố mẹ cho phương pháp lai.

185 Lĩnh vực áp dụng muốn. - Nguồn biến dị tự nhiên không có tính trạng mong - Tính trạng mong muốn có trong nguồn gen cây trồng nhưng liên kết chặt với tính trạng không mong muốn. - Một giống ưu tú đang gieo trồng cần cải tiến một tính trạng đơn giản. - Tính trạng mong muốn có trong nguồn gen cây dại có họ hàng thân thuộc, nhưng khó lai và liên kết chặt với tính trạng không mong muốn. - Cần biến dị mới ở cây sinh sản bằng con đường vô tính

186 Phương pháp gây đột biến Chọn kiểu gen: Chọn lọc giống xử lý đột biến phụ thuộc vào tính trạng cần cải tiến (chọn các giống tốt nhất mang tính trạng mong muốn). Chọn vật liệu xử lý: - Cây con, cây nhỏ. - Hạt: phổ biến nhất (chịu được các tác động vật lý như ngâm nước, phơi khô, sấy nóng). - Hạt phấn. - Các bộ phận sinh dưỡng: cành giâm, đỉnh sinh trưởng. - Tế bào trong nuôi cấy.

187 Phương pháp gây đột biến Xử lý bức xạ ion hoá: Đặt vật mẫu dưới nguồn chiếu. Mẫu vật cần được trãi thành lớp mỏng và trộn đều nhiều lần. Độ ẩm, nhiệt độ, oxy, thời gian xử lý, liều lượng cần xử lý đều ảnh hưởng đến kết quả xử lý. Đối với xử lý hạt phấn: xử lý 4-7 ngày trước khi tung phấn, (cắt cành hoa cắm vào bình nước đặt dưới nguồn chiếu), sau đó, hạt phấn sẽ được dùng để thụ phấn cho cây mẹ. Ưu điểm của xử lý hạt phấn là khi tham gia vào quá trình thụ tinh hạt phấn truyền cho thế hệ con tất cả những đột biến.

188 Phương pháp gây đột biến Xử lý tác nhân hoá học: Xử lý trong dung dịch. Mẫu được ngâm trong dung dịch một thời gian nhất định, gồm các bước: trương trong nước, xử lý, rửa sạch, phơi khô. Các điều kiện ảnh hưởng: nhiệt độ (khoảng 20 0 C), thể tích dung dịch (gấp 10 lần thể tích mẫu xử lý), ph dung dịch, liều lượng xử lý, thời gian xử lý. Sau khi xử lý mẫu phải được rửa sạch để loại bỏ các chất phân giải do thuỷ phân.

189 Chọn lọc thể đột biến Đối với cây sinh sản hữu tính: Thể đột biến sẽ được chọn lọc qua nhiều thế hệ (5-7 thế hệ). Tùy thuộc vào tính ổn định của năng suất và các tính trạng khác, thể đột biến có thể sẽ được công nhận và phổ biến là giống cải tiến hoặc sử dụng gián tiếp để chuyển tính trạng có ích vào vật liệu chọn giống khác. Đối với cây sinh sản vô tính: Đột biến thường tạo thành các thể khảm, vì vậy cần tách đột biến ra khỏi thể khảm để tạo ra cây đột biến toàn phần và di truyền ổn định cho thế hệ sau.

190

191 Quy trình phân lập đột biến - Xử lý đột biến - Thế hệ VM1: tìm sự phát triển thể khảm. Thực hiện cắt ngọn chồi, ghép mắt,,. - Thế hệ VM2: trồng vật liệu VM1, chọn đột biến thế hệ VM2. Xác định cành ghép, cành, cây đột biến vòng hay đồng nhất. Cắt bỏ chồi không đột biến. - Thế hệ VM3: trồng vật liệu VM2. Kiểm chứng tính đồng nhất di truyền dòng đột biến. Tiếp tục phân lập đột biến soma và nhân cây đột biến. Đánh giá sơ bộ các thể đột biến. - Thế hệ VM4 và các thế hệ sau: đánh giá tính ổn định và sự đồng nhất của dòng vô tính ở VM4 và các thế hệ sau. Những dòng đồng nhất và ổn định sẽ được đánh giá đối với các đặc điểm nông học.

192 5.3 NUÔI CẤY TẾ BÀO TRẦN VÀ DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN

193 KỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO TRẦN - PROTOPLAST Tế bào trần laø teá baøo thöïc vaät ñaõ maát voû cellulose döôùi taùc duïng cuûa moät soá loaïi enzyne, chæ coøn laïi maøng sinh chaát bao quanh chaát nguyeân sinh. Protoplast coù khaû naêng dung hôïp vôùi nhau taïo thaønh caùc theå lai voâ tính döôùi taùc duïng cuûa polyethylen glycol (PEG). Protoplast coù khaû naêng haáp thu tröïc tieáp một số phaàn töû nhö virus, vi khuaån, caùc cô quan töû hay caùc ñaïi phaân töû ADN, ptotein.

194 KỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO TRẦN - PROTOPLAST Kyõ thuaät protoplast giuùp vieäc caûi taïo nhanh boä maùy di truyeàn teá baøo thoâng qua taùi sinh caùc theå lai voâ tính töø caùc protoplast lai. Khắc phục những nhược điểm cuûa phương pháp lai xa: caùc caây khoâng töông ñoàng giôùi tính, caùc caây coù hoï haøng xa. Phuïc vuï nghieân cöùu di truyeàn: thu nhận các bào quan, nhân, DNA,,. Sử dụng trong các nghiên cứu tế bào đơn, nghiên cứu sinh tổng hợp màng tế bào,..,.

195 Phương pháp cơ bản tách tế bào trần 1. Khử trùng mẫu lá. 2. Ngâm mẫu trong dung dịch thẩm thấu. 3. Tách lớp mặt dưới lá. 4. Ngâm mẫu trong dung dịch enzyme. 5. Tinh sạch tế bào trần. 6. Nuôi cấy tế bào trần.

196 Tách tế bào trần

197 Tinh sạch tế bào trần

198 Phương pháp cơ bản tách tế bào trần Coù theå taùch protoplast töø taát caû caùc phaàn cuûa caây: reã, thaân, laù, noát saàn reã, laù maàm, voû quaû, traøng hoa, teá baøo meï haït phaán, töø moâ seïo hay huyeàn phuø teá baøo. Dòch enzyme ñöôïc loïc voâ truøng qua loïc milipore. Hoãn hôïp enzyme có thể là: cellulase, hemicellulase, pectinase. Điều kiện nuôi cấy protoplast: nhiệt độ: C, chiếu sáng: tùy theo loài, thường nuôi cấy dịch lỏng, môi trường thường được bổ sung thêm các chất hữu cơ: nước dừa, carbohydrate,..,.

199 Phương pháp cơ bản tách tế bào trần Protoplast sẽ được xác định số lượng, mật độ, khả năng sống xót khi nhuộm fluorescein diacetate và buồng đếm hồng cầu.

200 Phương pháp dung hợp tế bào trần Söï keát hôïp hai protoplast ñöôïc goïi laø dung hôïp hay lai voâ tính (Power vaø Cocking, 1971). Naêm 1974, Kao vaø Michaylus phaùt hieän polyethylen glycol (PEG) gaây ra söï keát dính dung hôïp toát ôû protoplast thöïc vaät vaø tìm ra ñöôïc caùc ñieàu kieän ñeå ñaït ñöôïc taàn soá dung hôïp cao. Ngày nay, protoplast thường được dung hôïp baèng xung ñieän (electrofusion).

201

202 Phương pháp dung hợp tế bào trần bằng PEG Phương pháp PEG là phương pháp đơn giản và ít tốn kém nhất để dung hợp tế bào trần. PEG làm thay đổi tính chất màng, làm tế bào trần kết dính nhau, dán chặt nhau, tạo điều kiện trao đổi các thành phần bên trong. Có thể sử dụng thêm các chỉ thị màu (bố mẹ mang chỉ thị màu khác nhau), giúp phân biệt thể dung hợp (dị nhân) và dạng bố mẹ của chúng về sau.

203 Phương pháp dung hợp tế bào trần bằng PEG Phương pháp tiến hành: - Troän hai loaïi protoplast vôùi nhau. - Nhoû 3 gioït dòch hoãn hôïp protoplast leân 3 choã trong ñóa Petri, ñeå yeân 15 phuùt cho protoplast laéng xuoáng ñaùy ñóa. - Nhoû nheï nhaøng 1 gioït PEG leân moãi gioït dòch chöùa protoplast sao cho lôùp protoplast dính chaët vaøo ñaùy ñóa vaø khoâng bò bong leân. - UÛ protoplast trong dòch PEG 30 phuùt ôû nhieät ñoä trong phoøng.

204 Phương pháp dung hợp tế bào trần bằng PEG Phương pháp tiến hành: - Röûa saïch protoplast bằng cách cho 2ml moâi tröôøng nuoâi caáy vào và duøng pipet Pasteur huùt nheï dòch röûa ra. - Sau đó, tiếp tục cho 2ml moâi tröôøng nuoâi caáy coù chöùa ñaïm amon vào (giúp teá baøo phuïc hoài sau quaù trình taùch vaø dung hôïp). - Sau 3 4 ngaøy teá baøo baét ñaàu phaân chia, sau 10 ngaøy nuoâi caáy caùc teá baøo phaân chia thaønh cuïm teá baøo. - Caáy chuyeàn sang moâi tröôøng choïn lọc, chọn caùc dạng mang tính trạng lai mong muốn.

205

206

207 Phương pháp dung hợp tế bào trần bằng điện Phương pháp tiến hành: - Huyền phù tế bào trần được đặt giữa 2 điện cực. Khi có dòng điện yếu đi qua, các tế bào cùng điện tích dồn về một phía, tiếp xúc và xảy ra hiện tượng dung hợp tế bào chất với nhau. - Phương pháp điện di cho năng suất dung hợp khá cao, có hơn 50% thể dị nhân được hình thành sau mỗi lần dung hợp.