ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΙΟΓΕΝΩΝ ΛΟΙΜΩΞΕΩΝ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΑΝΤΟΧΗΣ

Transcript

1 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία και Εργαστηριακή Διαγνωστική Περίοδος Β, Τόμος 15, Τεύχος 3, σελ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΕΙΣ ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΙΟΓΕΝΩΝ ΛΟΙΜΩΞΕΩΝ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΑΝΤΟΧΗΣ Ε. ΚΡΑΝΙΩΤΑΚΗ 1, ΕΥΑΓΓ. ΠΛΑΤΣΟΥΚΑ 2 Η ανακάλυψη των αντι-ιικών φαρμάκων για τη θεραπεία λοιμώξεων, υπήρξε ένα από τα σημαντικά ιατρικά επιτεύγματα του περασμένου αιώνα. Η αποτελεσματική αντι-ιική χημειοθεραπεία είναι η μόνη ελπίδα για την επιβίωση ή την ανακούφιση εκατομμυρίων ανθρώπων παγκοσμίως που πάσχουν από κάποια χρόνια ιογενή λοίμωξη, συμπεριλαμβανομένων αυτών που προκαλούνται από τον ιό της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας, τους ιούς της ηπατίτιδας Β και C. Όμως παρά τη σημαντική πρόοδο στην ανάπτυξη αποτελεσματικών αναστολέων που στοχεύουν σε συγκεκριμένα στάδια του κύκλου ζωής των ιών, η θεραπευτική δραστικότητα έχει περιοριστεί από την εμφάνιση ανθεκτικών ιών. Τα ανθεκτικά στελέχη έχουν μεγάλη κλινική σημασία κυρίως για τους ανοσοκατασταλμένους ασθενείς, όμως εμφάνιση και μετάδοση των μεταλλαγμένων ανθεκτικών ιών έχει παρατηρηθεί και στον ανοσοεπαρκή πληθυσμό. Νέες προσεγγίσεις για την ανάπτυξη διαγνωστικών και θεραπευτικών μεθόδων ή στρατηγικών πρόληψης, είναι απαραίτητες για να ενισχύσουν το βασικό πεδίο έρευνας. (Λέξεις ευρετηρίου: αντοχή στα αντι-ιικά, ιοί ηπατίτιδος και γρίπης, HIV, CMV, γονοτυπικές και φαινοτυπικές δοκιμασίες). Αντι-ιική χημειοθεραπεία 1. Μικροβιολογικό Τμήμα, Γ.Ν.Α. «Ο Ευαγγελισμός». 2. Μικροβιολογικό Τμήμα, «Κωνσταντοπούλειο» Γ.Ν. Ν. Ιωνίας Η σύντομη ιστορία της αντι-ιικής χημειοθεραπείας ως επιστήμης αρχίζει τη δεκαετία του 1950 με την ανακάλυψη της μεθισαζόνης, μιας θειοσεκαμικαρβαζόνης που αναστέλλει την αναπαραγωγή των ιών της ευλογιάς. Σήμερα, ι- σχυρά φάρμακα είναι διαθέσιμα έναντι ιών του έρπητα, του ιού της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας (HIV), του ιού της ηπατίτιδας Β (ΗΒV) και του ιού της γρίπης. Καινούργια φάρμακα αναμένονται κατά τη διάρκεια των επόμενων 5-10 ετών, για την αντιμετώπιση των ιών των ανθρώπινων θηλωμάτων (papillomaviruses), των αναπνευστικών ιών, των εντεροϊών και του ιού ηπατίτιδας C (HCV). Στην Ελλάδα αυτή την περίοδο κυκλοφορούν 42 εγκεκριμένα α- πό τον Ε.Ο.Φ. αντι-ιικά φάρμακα (εκτός των ιντερφερονών). Οι στόχοι των αντι-ιικών φαρμάκων για τον επακόλουθο σχεδιασμό τους, αφορούν στα διάφορα στάδια του βιολογικού

2 Περίοδος B, Τόμος 15, Τεύχος 3, κύκλου ζωής του ιού (προσκόλληση, διείσδυση, έκδυση, σύνθεση μακρομορίων, ωρίμαση, απελευθέρωση). Η αντι-ιική χημειοθεραπεία έχει οδηγήσει σε τεράστιες βελτιώσεις στη διαχείριση ορισμένων ιικών λοιμώξεων. Τα αντι-ικά φάρμακα έχουν βελτιώσει σημαντικά την πρόγνωση και έχουν αυξήσει το μέσο όρο ζωής σε πολλούς ασθενείς με τη νόσο του HIV. Επίσης, έχουν συμβάλει στην επιτυχή αντιμετώπιση α- σθενών με χρόνια ηπατίτιδα Β ή με ηπατίτιδα C και ανοσοκατασταλμένων ασθενών με κίνδυνο λοίμωξης από τον ανθρώπινο κυτταρομεγαλοϊό (ΗCMV). Ακόμα και στις περιπτώσεις ιών που παραμένουν σε λανθάνουσα κατάσταση (ερπητοϊοί) ή ιών που αναπτύσσουν χρόνιες λοιμώξεις (HIV και ΗΒV), αν και ο ιός δεν ε- κριζώνεται από τον οργανισμό με τη θεραπεία, όμως καταστέλλεται αποτελεσματικά η αναπαραγωγή του. Ωστόσο, η αντι-ιική χημειοθεραπεία παρουσιάζει προβλήματα. Εκτός από την τοξικότητα των φαρμάκων, τις ανεπιθύμητες ενέργειες και το υψηλό κόστος, η εμφάνιση αντοχής στα αντι-ιικά αποτελεί το μεγαλύτερο εμπόδιο για την επίτευξη των θεραπευτικών στόχων. Αντοχή έχει τεκμηριωθεί έναντι όλων σχεδόν των αντι-ιικών φαρμάκων και η γενετική βάση της αντοχής είναι πλέον γνωστή. Βιολογική βάση της αντοχής στα αντι-ιικά φάρμακα Η αντοχή στα φάρμακα ορίζεται ως η μειωμένη ευαισθησία σε ένα φάρμακο σε ένα σύστημα εργαστηριακής καλλιέργειας και εκφράζεται με την αλλαγή της IC 50 ή IC 90 (συγκέντρωση φαρμάκου που απαιτείται για να εμποδίσει την αναπαραγωγή του ιού κατά 50% ή 90% αντίστοιχα). Αυτό καλείται φαινοτυπική αντοχή. Η φαινοτυπική αντοχή καθορίζεται από συγκεκριμένες μεταλλάξεις στο γονιδίωμα του ιού (γονοτυπική αντοχή), οι οποίες οδηγούν σε αλλαγές στην ιική πρωτεΐνη-στόχο (όπως η ανάστροφη μεταγραφάση του HIV) ή στον ιικό ενεργοποιητή φαρμάκων (όπως η θυμιδινική κινάση του έρπητα τύπου Ι). Τέλος, υπάρχει και η διασταυρούμενη αντοχή, που ορίζεται ως η αντοχή του ιού σε έναν αριθμό φαρμάκων της ιδίας ομάδας, που επηρεάζονται παρομοίως από τον ίδιο μηχανισμό αντοχής 1. Πολύ συχνές μεταλλάξεις παρατηρούνται στους κλασικούς ιούς RNA, όπως ο HIV και ο ι- ός της γρίπης. Αυτό είναι επακόλουθο της έμφυτης, μη υψηλής πιστότητας ανάγνωσης των ιικών RNA πολυμερασών, οι οποίες είναι υπεύθυνες για τον πολλαπλασιασμό του ιικού γονιδιώματος, οδηγώντας έτσι σε σφάλματα κατά τη μεταγραφή, λόγω έλλειψης ενζυμικών μηχανισμών που διορθώνουν τα λάθη μεταγραφής από RNA σε DNA ή RNA σε RNA 2. Ακολούθως, προκύπτει ένα ευρύ φάσμα γενετικών παραλλαγών του ιού (quasispecies), συμπεριλαμβανομένων εκείνων με μεταλλάξεις που σχετίζονται με την αντοχή στα αντι-ιικά φάρμακα. Η χρήση ενός αντι-ιικού φαρμάκου παρέχει την πίεση για την προνομιακή αναπαραγωγή των γενετικών παραλλαγών του ιού με μειωμένη ευαισθησία στα φάρμακα σύμφωνα με τις αρχές της εξέλιξης του Δαρβίνου. Ο ανθεκτικός στα φάρμακα ιός που προκύπτει, θα έχει καλύτερη ικανότητα αναπαραγωγής (viral fitness) παρουσία του φαρμάκου. Μερικοί ανθεκτικοί στα φάρμακα ιοί, εντούτοις, δεν αναπαράγονται, όπως ο μη μεταλλαγμένος ιός (wild type virus), ελλείψει του φαρμάκου. Σε μερικές περιπτώσεις, πολλαπλές μεταλλάξεις απαιτούνται για την ανάπτυξη υψηλού επιπέδου αντοχής, και η ανεπαρκής καταστολή της αναπαραγωγής του ιού από τα αντι-ιικά φάρμακα είναι υπεύθυνη για τη διαδοχική απόκτησή τους 3. Η συχνότητα μετάλλαξης στους ιούς DNA είναι κατά πολύ μικρότερη (μέχρι και 1000 φορές), οπότε το πρόβλημα της αντοχής στα φάρμακα είναι λιγότερο οξύ. Ωστόσο σε ανοσοκατασταλμένους ασθενείς, μεταλλάξεις σε DNA ιούς μπορεί να εμφανιστούν και να κυριαρχήσουν στον ιικό πληθυσμό (έρπης τύπου Ι ανθεκτικός στην ακυκλοβίρη, σε μεταμοσχευμένους ασθενείς) 3.

3 128 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία Τα κυριότερα προβλήματα που προκύπτουν από την αντοχή στα αντι-ιικά φάρμακα είναι τα εξής: Αποτυχία της θεραπείας Το μεταλλαγμένο (ανθεκτικό) στέλεχος ενδέχεται να είναι ακόμα παθογόνο Οι εναλλακτικές θεραπείες μπορεί να είναι πολύ τοξικές ή να έχουν μεγάλο κόστος Το μεταλλαγμένο (ανθεκτικό) στέλεχος μπορεί να μεταδοθεί σε άλλα άτομα. Κλινική σημασία της αντοχής Ερπητοϊοί Οι ερπητοϊοί (έρπης απλός, έρπης ζωστήρ, κυττταρομεγαλοϊός) είναι υπεύθυνοι για πολλές λοιμώξεις, οι οποίες έχουν συνήθως καλή έκβαση στους ανοσοεπαρκείς ασθενείς, ενώ σε ανοσοκατασταλμένους ασθενείς είναι α- πειλητικές για τη ζωή με υψηλή θνητότητα και νοσηρότητα. Ο απλός έρπης και ο έρπης ζωστήρ διαθέτουν το ένζυμο θυμιδινική κινάση (ΤΚ) το οποίο φωσφορυλιώνει τα νουκλεοτίδια που στη συνέχεια θα μετατραπούν σε τριφωσφορικά νουκλεοτίδια από κυτταρικά ένζυμα και με αυτή τη μορφή θα προστεθούν στην αυξανόμενη DNA αλυσίδα μέσω της ιικής DNA πολυμεράσης. Η ιική θυμιδινική κινάση έχει μικρότερη ειδικότητα ως προς το υπόστρωμα, σε σχέση με την κυτταρική θυμιδινική κινάση 4. Ο κυτταρομεγαλοϊός δεν διαθέτει τη θυμιδινική κινάση, αλλά μια ομόλογη πρωτεΐνη, την UL97 η οποία δρα με παρόμοιο τρόπο 5. Τα φάρμακα που χρησιμοποιούνται σήμερα για τη θεραπεία λοιμώξεων από τους συγκεκριμένους ιούς, χωρίζονται σε δύο κατηγορίες: α) στα νουκλεοσιδικά ανάλογα που έχουν ως στόχο την DNA πολυμεράση και απαιτούν φωσφορυλίωση από τις ιικές κινάσες, όπως είναι η ακυκλοβίρη και το προφάρμακό της βαλακυκλοβίρη, η πενσικλοβίρη και το προφάρμακό της φαμσικλοβίρη, η γκανσικλοβίρη και το προφάρμακό της βαλγκανσικλοβίρη και η βριβουδίνη β) στα φάρμακα που δεν απαιτούν φωσφορυλίωση από τις ιικές κινάσες και έχουν στόχο την DNA πολυμεράση, όπως είναι η βιδαραβίνη, η σιδοφοβίρη και η φοσκαρνέτη. Η ακυκλοβίρη (όπως και η πενσικλοβίρη) δρα μιμούμενη τα φυσικά υποστρώματα, κυκλοφορώντας στο εξωκυττάριο υγρό ως αδρανές μόριο και διαχεόμενη μέσα και έξω από το κύτταρο. Φωσφορυλιώνεται μόνο μέσα σε προσβεβλημένα από τον ιό κύτταρα, μέσω της θυμιδινικής κινάσης, έτσι ώστε η τυχόν φαρμακογενής τοξίκωση να αποφεύγεται ή να περιορίζεται στο μολυσμένο από τον ιό κύτταρο. Τα κυτταρικά ένζυμα μετατρέπουν στη συνέχεια το μονοφωσφορικό φάρμακο στην τριφωσφορική μορφή του, που είναι ισχυρός αναστολέας της ιικής DNA πολυμεράσης και σταματά την επιμήκυνση του ιικού DNA (Εικόνα 1). Αυτό συμβαίνει επειδή η ακυκλοβίρη δεν διαθέτει την 3~ υδροξυλιομάδα στον δακτύλιο του σακχάρου, απαραίτητη για τη σύνδεση με τη φωσφορική ρίζα και άρα την προσθήκη νέων βάσεων. Τέλος, η ακυκλοβίρη έχει μηδαμινή επίδραση στις κυτταρικές DNA πολυμεράσες 6. Η γκανσικλοβίρη η οποία έχει δράση κυρίως κατά του κυτταρομεγαλοϊού, φωσφορυλιώνεται από την πρωτεΐνη UL97 7 στη μονοφωσφορική μορφή της και στη συνέχεια δρα στην τριφωσφορική μορφή της ως αναστολέας της DNA πολυμεράσης του ιού (Εικόνα 1). Η βριβουδίνη που χρησιμοποιείται με ε- πιτυχία για τη θεραπεία του έρπητα ζωστήρα, έχει παρόμοιο μηχανισμό δράσης με τα προηγούμενα φάρμακα, μόνο που δεν σταματά την επιμήκυνση του ιικού DNA 7. Η φοσκαρνέτη είναι ένα πυροφωσφορικό ανάλογο που δεν απαιτεί ενδοκυττάρια ενεργοποίηση, αλλά δρα απευθείας μπλοκάροντας το πυροφωσφορικό σημείο δέσμευσης της ιικής DNA πολυμεράσης, 7 εμποδίζοντας έτσι την ενσωμάτωση τριφωσφορικών δεοξυνουκλεοσιδίων (dntp s) στο ιικό DNA (Εικόνα 1). Η σιδοφοβίρη είναι ένα νουκλεοσιδικό α- νάλογο της κυτιδίνης, υπάρχει σε μονοφωσφορική μορφή και απαιτεί ενεργοποίηση (φω-

4 Περίοδος B, Τόμος 15, Τεύχος 3, Εικόνα 1. Κύτταρο μολυσμένο από ερπητοϊό και μηχανισμός δράσης των αντι-ιικών φαρμάκων ακυκλοβίρης, γκανσικλοβίρης, σιδοφοβίρης και φοσκαρνέτης (τροποποίηση από βιβλιογραφική αναφορά 50). σφορυλίωση) από τα κυτταρικά ένζυμα για να δράσει έναντι του ιού 7. Μόλις αποκτήσει τη διφωσφορική της μορφή, αναστέλλει την DNA πολυμεράση του ιού με μηχανισμό παρόμοιο με αυτόν της γκανσικλοβίρης (Εικόνα 1). Η βιδαραβίνη είναι ένα νουκλεοσιδικό πουρινικό ανάλογο το οποίο φωσφορυλιώνεται στην ενεργό του τριφωσφορική μορφή ara ATP, από τις κυτταρικές κινάσες και όχι τις ιικές. Το φάρμακο δρα αναστέλλοντας την DNA πολυμεράση και τερματίζοντας τη σύνθεση του ιικού DNA με μηχανισμό παρόμοιο με αυτόν της ακυκλοβίρης 7. Οι ερπητοϊοί παρουσιάζουν χαμηλή συχνότητα μεταλλάξεων στο γονιδίωμά τους, ε- πειδή η πολυμεράση τους έχει μηχανισμό που διορθώνει τα λάθη μεταγραφής από DNA σε DNA. Χρειάζονται επομένως πολλοί αναπαραγωγικοί κύκλοι για να προκύψει ένας ανθεκτικός ιός, ενώ παράλληλα η ικανότητα των φαρμάκων να αναστέλλουν την αναπαραγωγή των ιών, μειώνει ακόμα περισσότερο αυτή την πιθανότητα. Ωστόσο, έχει εμφανιστεί αντοχή σε όλα τα παραπάνω φάρμακα in vitro και in vivo 3. O απλός έρπης (και πιο σπάνια ο έρπης ζωστήρ) αναπτύσσει αντοχή με τρεις βασικούς μηχανισμούς: α) Μετάλλαξη εξάλειψης, παρεμβολής ή σημειακή μετάλλαξη στο γονίδιο που κωδικοποιεί την ΤΚ. Το αποτέλεσμα είναι η παραγωγή μιας ελλειμματικής ΤΚ πρωτεΐνης, που είναι ενζυμικά ανενεργός. Αυτά τα στελέχη (ΤΚ minus), αναπαράγονται πολύ αργά εφόσον λείπει το γονίδιο λοιμικότητας ΤΚ, οπότε σε α- νοσοεπαρκή άτομα αντιμετωπίζονται άμεσα από την ανοσιακή άμυνα του οργανισμού, αλλά είναι παθογόνα σε ανοσοκατασταλμένους ασθενείς (π.χ.hiv) προκαλώντας σοβαρές επιπλοκές 8. β) Μετάλλαξη στο γονίδιο ΤΚ που αλλάζει την εξειδίκευση του ενζύμου ως προς το υπόστρωμά του, οπότε δεν αναγνωρίζει πλέον το νουκλεοσιδικό ανάλογο που πρέπει να φωσφορυλιώσει (ΤΚ altered στελέχη) 9. γ) Μετάλλαξη στην ιική DNA πολυμεράση, η οποία δεν αναγνωρίζει πλέον την τριφωσφορική μορφή των φαρμάκων, αλλά αναγνωρίζει τα φυσικά τριφωσφορικά νουκλεοτίδια, επιτρέποντας έτσι τη γρήγορη αναπαραγωγή του ιού. Και οι δύο τελευταίες μεταλλάξεις είναι εξαιρετικά σπάνιες 9. Γενικά, η αντοχή στα φάρμακα παρουσιάζεται κυρίως στους ανοσοκατασταλμένους. Υπολογίζεται ότι τα ανθεκτικά στην ακυκλοβίρη/πενσικλοβίρη στελέχη του απλού έρπητα α- ποτελούν το 5-10% του συνόλου σε ασθενείς με AIDS και σε μεταμοσχευμένους με μυελό των οστών 10. Έρπης ζωστήρ ανθεκτικός στην ακυκλοβίρη έχει περιγραφεί επίσης σε ασθενείς με AIDS 11. Διασταυρούμενη αντοχή και αντοχή σε πολλαπλά φάρμακα του απλού έρπητα έχει

5 130 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία τεκμηριωθεί 12. Μόνο μια περίπτωση μετάδοσης έρπητα ανθεκτικού στην ακυκλοβίρη έχει καταγραφεί μέχρι σήμερα 13. Σε τέτοιες περιπτώσεις ανθεκτικών ιών, η θεραπεία διακόπτεται και χορηγείται φοσκαρνέτη, η οποία δρα απευθείας στην πολυμεράση, χωρίς να εξαρτάται από την ΤΚ. Στον κυτταρομεγαλοϊό η εμφάνιση αντοχής στην κλινική πράξη σχετίζεται κυρίως με τη χορήγηση γκανσικλοβίρης είτε προφυλακτικά από τη μεταμόσχευση και μετά, είτε για προληπτική θεραπεία. Η αντοχή έχει μεγαλύτερη συχνότητα στην πρώτη περίπτωση. Οι μεταλλάξεις αντοχής βρίσκονται κυρίως στην πρωτεΐνη UL97 και είναι είτε υποκαταστάσεις αμινοξέων, είτε μικρές (1- έως 17-αμινοξέα) μεταλλάξεις εξάλειψης στα κωδικόνια 460 και 520 ή στην περιοχή που ορίζεται από τα κωδικόνια 590 έως 607, που σχετίζονται με τη σύνδεση του ΑTP και την αναγνώριση του υποστρώματος αντίστοιχα. Μόνο λίγες υποκαταστάσεις αμινοξέων που σχετίζονται ενδεχομένως με την αντοχή στην γκανσικλοβίρη έχουν αναφερθεί σε άλλα σημεία της πρωτεΐνης 14. Η δεύτερη ιική πρωτεΐνη που αφορά στην αντοχή του κυτταρομεγαλοϊού σε όλα τα αντιιικά είναι η ιική DNA πολυμεράση (pul54). Οι δύο κύριες ενζυμικές λειτουργίες της πολυμεράσης είναι ο πολυμερισμός και η 3-5 δραστηριότητα εξωνουκλεάσης. Η τριφωσφορική γκανσικλοβίρη, η τριφωσφορική βιδαραβίνη και η διφωσφορική σιδοφοβίρη, δρουν ως ε- ναλλακτικά υποστρώματα για την ιική DNA πολυμεράση, οπότε οι πιθανοί μηχανισμοί α- ντοχής για τα παραπάνω αντι-ιικά είναι οι εξής τρεις: α) μειωμένη συγγένεια του ενζύμου για τον αναστολέα, β) μειωμένη εκλεκτική ενσωμάτωση του αναστολέα στην ιική αλυσίδα DNA που επιμηκύνεται, ή γ) εκλεκτική απομάκρυνση από την αλυσίδα DNA των ενσωματωμένων αναστολέων. Στην περίπτωση της φοσκαρνέτης, που δεν ενσωματώνεται στην ιική αλυσίδα DNA, ισχύει μόνο ο πρώτος μηχανισμός αντοχής 15. Ανάμεσα στις πιο συχνές μεταλλάξεις της DNA πολυμεράσης είναι οι V715M, V781I και L802M, οι οποίες ευθύνονται για αντοχή στη φοσκαρνέτη και οι F412C, L501I/ F και P522S, που ευθύνονται για αντοχή σε γκανσικλοβίρη και ακυκλοβίρη. Η μετάλλαξη A809V, που ευθύνεται για αντοχή σε γκανσικλοβίρη και φοσκαρνέτη είναι επίσης συχνή. Κάποιες μεταλλάξεις (E756K και V812L και οι εξαλείψεις των κωδικονίων 981 και 982) σχετίζονται με αντοχή και στα τρία αντι-ιικά. Θεραπεία επιλογής για τα ανθεκτικά στην γκανσικλοβίρη στελέχη κυτταρομεγαλοϊού, παραμένει η φοσκαρνέτη 16. Iός της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας Όλα τα αντιρετροϊκά φάρμακα δεν είναι αρκετά ισχυρά όταν χρησιμοποιούνται ως μονοθεραπεία, διότι γρήγορα ο ιός αναπτύσσει αντοχή, οπότε κλινικό όφελος υπάρχει μόνο όταν γίνεται συνδυαστική θεραπεία. Η αποκαλούμενη αντιρετροϊκή θεραπεία μεγάλης αποτελεσματικότητας (HAART), περιλαμβάνει σήμερα έξι ευδιάκριτες κατηγορίες εγκεκριμένων για τη θεραπεία φαρμάκων (Εικόνα 2): α) Νουκλεοσιδικοί και νουκλεοτιδικοί αναστολείς ανάστροφης μεταγραφάσης (NRTIs). Νουκλεοσιδικά και νουκλεοτιδικά ανάλογα, φωσφορυλιωμένα από τα κυτταρικά ένζυμα, τα οποία ενεργούν ως τερματιστές της σύνθεσης της ιικής DNA αλυσίδας και εμποδίζουν την ανάστροφη μεταγραφή του ιικού RNA γονιδιώματος σε DNA 17. Υπάρχουν οκτώ φάρμακα στην κατηγορία των NRTIs: ζιδοβουδίνη, διδανοσίνη, ζαλσιταβίνη, σταβουδίνη, λαμιβουδίνη, αβακαβίρη, τενοφοβίρη και εμτρισιταβίνη. β) Μη νουκλεοσιδικοί αναστολείς ανάστροφης μεταγραφάσης (ΝΝRΤΙs). Αρωματικά, πολυκυκλικά μόρια που δεσμεύουν και εμποδίζουν την ανάστροφη μεταγραφάση 17. Υπάρχουν τέσσερα φάρμακα στην κατηγορία των NNRTIs: νεβιραπίνη, δελαβιρδίνη, ετραβιρίνη και εφαβιρένζη. γ) Αναστολείς της πρωτεάσης (PIs). Μικρά, πεπτιδικά κλάσματα που δεσμεύουν αμετάκλητα στην ενεργό περιοχή της ιικής πρωτεάσης, ε-

6 Περίοδος B, Τόμος 15, Τεύχος 3, ΑΝΑΣΤΡΟΦΗ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ Εικόνα 2. Κύκλος ζωής του ιού της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας και στόχοι των αντιρετροϊκών φαρμάκων (τροποποίηση από org/.../106-hiv-life-cycle.html). 1. Ελεύθερος ιός 2. Προσκόλληση του ιού στην επιφάνεια του κυττάρου μέσω του CD4 και του CCR5 ή CXCR4. Δράση από αναστολείς εισόδου και σύντηξης 3. Μόλυνση του κυττάρου με απελευθέρωση του ιικού RNA 4. Ανάστροφη μεταγραφή του ιικού RNA σε DNA μέσω της ανάστροφης μεταγραφάσης. Δράση από αναστολείς της ανάστροφης μεταγραφάσης 5. Ενσωμάτωση του ιικού DNA στο χρωμόσωμα του κυττάρου ξενιστή με τη μεσολάβηση της ιντεγκράσης. Δράση από αναστολείς ιντεγκράσης 6. Μεταγραφή του ιικού DNA σε mrna και σύνθεση των πρωτεϊνών του ιού 7. Συγκέντρωση των ιικών πρωτεϊνών και των ιικών RNA γονιδιωμάτων σε νέα ιικά σωμάτια που είναι έτοιμα να βγουν από το κύτταρο 8. Έξοδος με σχηματισμό του ελύτρου του ιού 9. Ωρίμαση του ιού με τη δράση της πρωτεάσης, η οποία κόβει τις πρωτεϊνικές αλυσίδες και προκύπτουν οι ιικές πρωτεΐνες. Δράση από αναστολείς πρωτεάσης. μποδίζοντας την ενζυμική κατάτμηση των ιικών πρωτεϊνικών προδρόμων 17. Υπάρχουν εννιά φάρμακα στην κατηγορία των PIs: σακουϊναβίρη, ινδιναβίρη, ριτοναβίρη, νελφιναβίρη, α- μπρεναβίρη, λοπιναβίρη, αταζαναβίρη, δαρουναβίρη και τιπραναβίρη. δ) Αναστολείς σύντηξης (FIs). Ο αναστολέας σύντηξης ενφουβιρτίδη δεσμεύει την HR1 περιοχή της γλυκοπρωτεϊνης gp41, η οποία είναι υπεύθυνη για τη σύντηξη του ελύτρου του ιού με την κυτταρική μεμβράνη του κυττάρουξενιστή (κύτταρα που εκφράζουν τον CD4 υποδοχέα) 17. ε) Αναστολείς εισόδου (ΕIs): το φάρμακο μαραβιρόση, το οποίο εμποδίζει την είσοδο του ιού στο κύτταρο-ξενιστή, δρώντας ανταγωνιστικά στον υποδοχέα β χημειοκινών CCR5, ο οποίος είναι ο συνυποδοχέας του ιού στο κύτταρο-ξενιστή 17. στ) Αναστολείς ιντεγκράσης (IIs): το φάρμακο ραλτεγκραβίρη, το οποία δρα εμποδίζοντας την ιική ιντεγκράση, η οποία ενσωματώνει το διπλής έλικας DNA του ιού στο χρωμόσωμα του κυττάρου-ξενιστή 17. Οι στόχοι της HAART είναι η καταστολή της αναπαραγωγής του ιού και η επακόλουθη παράταση της επιβίωσης των υπό θεραπεία ασθενών με HIV. Εντούτοις, αυτά τα οφέλη αναστέλλονται από την ανάπτυξη αντοχής στα αντιρετροϊκά φάρμακα. Ο συνεχής, υψηλού επιπέδου πολλαπλασιασμός του ιού in vivo (10 7 κύκλοι αναπαραγωγής ανά ημέρα) και το έμφυτο ποσοστό λάθους της ανάστροφης μεταγραφάσης (3X10-5 μεταλλάξεις ανά κύκλο αναπαραγωγής), μαζί με την υψηλή συχνότητα του γενετικού ανασυνδυασμού, έχουν ως αποτέλεσμα τη γένεση HIV πληθυσμών που είναι ιδιαίτερα ετερογενείς (quasispecies). Κατά συνέπεια, ο HIV είναι σε θέση να παρακάμψει γρήγορα την ανοσιακή απάντηση του ξενιστή και να αναπτύξει αντοχή στα φάρμακα 18. Οι μεταλλάξεις διαιρούνται σε πρωτεύουσες ή βασικές και δευτερεύουσες ή βοηθητικές. Οι πρωτεύουσες μεταλλάξεις προκαλούν αντοχή με την τροποποίηση των λειτουργικών ιδιοτήτων των ενζύμων στόχων. Οι δευτερεύουσες μεταλλάξεις δεν προκαλούν αντοχή, αλλά ρυθμίζουν τα επίπεδα αντοχής με την πρόκληση διαμορφωτικών τροποποιήσεων που αντισταθμίζουν τα ελλείμματα που προκαλούνται από τις πρωτεύουσες μεταλλάξεις.

7 132 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία Πολλές μεταλλάξεις προκαλούν διασταυρούμενη αντοχή στα φάρμακα μιας συγκεκριμένης κατηγορίας (ιδίως οι ΝΝRΤΙs έχουν χαμηλό φραγμό αντοχής), ενώ η συσσώρευση πολλαπλών μεταλλάξεων στις διαφορετικές πρωτεΐνες στόχους, μπορεί να προκαλέσει αντοχή σε πολλά διαφορετικά φάρμακα που ανήκουν σε διαφορετικές κατηγορίες αντιρετροϊκών. Οι μεταλλάξεις επιδρούν βλαπτικά στη φυσική κατάσταση (fitness) του ιού και επομένως στην ικανότητα πολλαπλασιασμού, τη λοιμικότητα και εξέλιξη της νόσου 19. Ένα από τα πιο σοβαρά προβλήματα που προκύπτουν από την α- ντοχή, είναι η μετάδοση ανθεκτικών στελεχών του ιού 20. Η αντοχή αντιμετωπίζεται με εναλλακτικές θεραπευτικές αγωγές, αλλά θα μπορούσε να αποτραπεί εάν υπήρχε πιο ισχυρή θεραπεία ή/και εάν τα φάρμακα ήταν εκλεκτικότερα έ- τσι ώστε να μπορούν να χορηγηθούν σε υψηλότερες δόσεις. Τα πρόσφατα αποτελέσματα με τον αναστολέα ιντεγκράσης παρουσιάζουν πολύ γρηγορότερη καταστολή του HIV RNA, η οποία προσφέρει την προοπτική για καθυστέρηση στην εμφάνιση αντοχής όταν η αρχική θεραπεία ασθενών που δεν έχουν λάβει προηγουμένως αντιρετροϊκά, περιλαμβάνει έναν αναστολέα ιντεγκράσης 21. Δυστυχώς, οι ανθεκτικοί γονότυποι του ι- ού μπορούν να παραμείνουν στα κύτταρα -ξενιστές με τη μορφή του προ-ιικού DNA, από την οποία επανενεργοποιούνται πολλά χρόνια μετά 22. Ιοί ηπατίτιδας Β και C H θεραπεία της χρόνιας ηπατίτιδας Β περιλαμβάνει σήμερα εκτός από την αρχικά χρησιμοποιούμενη ιντερφερόνη άλφα και τη χορήγηση των νουκλεοσιδικών/νουκλεοτιδικών αναλόγων. Ένα στάδιο της αναπαραγωγής του ιού περιλαμβάνει μια ανάστροφη μεταγραφάση όμοια με αυτή των ρετροϊών, οπότε κάποια από τα φάρμακα με δράση κατά του HIV, έ- χουν δράση και κατά του ιού της ηπατίτιδας Β. Η ιντερφερόνη άλφα είναι μία φυσική γλυκοπρωτεΐνη που εκκρίνεται από τα κύτταρα όταν υπάρχει ιική λοίμωξη και έχει μη ειδική αντι-ιική και ανοσοτροποποιητική δράση. Δρα δεσμεύοντας έναν υποδοχέα μεμβράνης. Η δέσμευση του υποδοχέα ξεκινάει μία σειρά από ενδοκυτταρικά σήματα που τελικά οδηγούν σε αυξημένη έκφραση κάποιων γονιδίων. Αυτό οδηγεί στην αύξηση και στην επαγωγή ορισμένων κυτταρικών δραστηριοτήτων, συμπεριλαμβανομένης της αύξησης της καταστροφής των κυττάρων-στόχων από τα λεμφοκύτταρα και της παρεμπόδισης της αναπαραγωγής των ιών στα μολυσμένα κύτταρα 23. Τα νουκλεοσιδικά/ νουκλεοτιδικά ανάλογα εμποδίζουν την ανάστροφη μεταγραφή του RNA προγενώματος του ιού σε DNA, προκαλώντας τον τερματισμό της σύνθεσης του ιικού DNA με ενσωμάτωση συνθετικών νουκλεοτιδίων (Εικόνα 3). Αρχικά κλινική εμπειρία υπήρχε μόνο με τη λαμιβουδίνη, που ήταν το μόνο εγκεκριμένο φάρμακο για πολλά χρόνια. Η λαμιβουδίνη ως μονοθεραπεία, εμφανίζει ισχυρή αντι-ιική δράση έναντι του ιού με αποτέλεσμα σημαντικού βαθμού ιική καταστολή και συνεπακόλουθη βιοχημική και ιστολογική ύφεση της νόσου στην πλειονότητα των ασθενών. Ωστόσο, α- ντοχή εμφανίζεται μετά από κάποιο χρονικό διάστημα σε όλους σχεδόν τους ασθενείς, λόγω μεταλλάξεων στην ανάστροφη μεταγραφάση του ιού και κυρίως στην καλά διατηρημένη αλληλουχία YMDD, το καταλυτικό σημείο του ενζύμου 24. Άλλα νουκλεοσιδικά/νουκλεοτιδικά ανάλογα με ισχυρή δράση είναι η αδεφοβίρη, η τενοφοβίρη, η τελμπιβουδίνη και η εντεκαβίρη. Η εμφάνιση αντοχής στη λαμιβουδίνη μπορεί να αυξήσει τον κίνδυνο αντοχής σε όλα σχεδόν τα άλλα αντι-ιικά με σταδιακή συσσώρευση μεταλλάξεων αντοχής, ακόμα και στην αδεφοβίρη και την εντεκαβίρη που είναι αποτελεσματικές στην αντιμετώπιση των ανθεκτικών στη λαμιβουδίνη στελεχών 2. Λαμβάνοντας υπόψη τα παραπάνω, θα πρέπει να αποφεύγεται η μονοθεραπεία με λαμιβουδίνη ως αρχική θεραπεία για τον ιό. Ό-

8 Περίοδος B, Τόμος 15, Τεύχος 3, Εικόνα 3. Κύκλος ζωής του ιού της ηπατίτιδας Β και στόχοι των αντι-ιικών φαρμάκων (τροποποίηση από 1. Προσκόλληση του ιού στο ηπατοκύτταρο μέσω του κυτταρικού υποδοχέα 2. Μετάβαση του νουκλεοκαψιδίου στο κυτταρόπλασμα 3. Απελευθέρωση του ιικού DNA στον πυρήνα όπου μετατρέπεται σε ένα κλειστό, κυκλικό DNA (cccdna) 4. Μεταγραφή σε RNA 5. Τα ιικά mrnas μεταφράζονται σε πρωτεΐνες στο κυτταρόπλασμα 6-7. Το RNA προγένωμα μαζί με την ανάστροφη μεταγραφάση (RT) ενθυλακώνονται σε ένα καψίδιο που αποτελείται από την πρωτεΐνη core 9. Σύνθεση ιικού DNA από το RNA προγένωμα με τη βοήθεια της ανάστροφης μεταγραφάσης. Δράση από αναστολείς της ανάστροφης μεταγραφάσης. Τα νεοσύστατα νουκλεοκαψίδια που προκύπτουν μπορούν είτε να απελευθερώσουν το ιικό DNA στον πυρήνα αρχίζοντας έναν νέο κύκλο σύνθεσης cccdna, είτε (10) να αποκτήσουν έλυτρο στο ενδοπλασματικό δίκτυο (ER) και τα σωμάτια Golgi και να απελευθερωθούν (11) οι ώριμοι ιοί από το μολυσμένο κύτταρο με εξωκυττάρωση. σον αφορά στη συνδυαστική θεραπεία, ο συνδυασμός πεγκυλιωμένης ιντερφερόνης-α2α και λαμιβουδίνης δεν είχε κάποιο πλεονέκτημα 25. Παρομοίως και η τελμπιβουδίνη σε συνδυασμό με την λαμιβουδίνη 26. Αντιθέτως, ο συνδυασμός λαμιβουδίνης και αδεφοβίρης είχε πλεονεκτήματα ως προς το μειωμένο ιικό φορτίο και στην αύξηση του χρόνου που απαιτείται για την ανάπτυξη αντοχής 27. Ο ιός της ηπατίτιδας Β είναι μικρός και συμπαγής και τα γονίδια που κωδικοποιούν την ανάστροφη μεταγραφάση και το αντιγόνο επιφανείας επικαλύπτονται. Έτσι, οι μεταλλάξεις αντοχής στην ανάστροφη μεταγραφάση μπορεί να μεταβάλουν τη δομή του αντιγόνου επιφανείας 28 με συνέπειες στην αποτελεσματικότητα του εμβολίου (τα εμβόλια του ιού της ηπατίτιδας Β διεγείρουν χυμική ανοσιακή α- πάντηση με παραγωγή αντισωμάτων έναντι ε- πίτοπων του αντιγόνου επιφάνειας). Έτσι, α- παιτείται προσεκτικός έλεγχος των ανθεκτικών στελεχών του ιού ηπατίτιδας Β, καθώς η χρήση των φαρμάκων αυξάνεται. Ο ιός της ηπατίτιδας C (HCV) κάνει χρόνια λοίμωξη κατά τη διάρκεια της οποίας ο ιός αναπαράγεται διαρκώς. Ο HCV διαθέτει γρήγορο πολλαπλασιασμό και η HCV-RΝΑ-εξαρτώμενη RNA πολυμεράση (NS5B), το ένζυμο αρμόδιο για την αντιγραφή του γονιδιώματος του HCV, είναι επιρρεπής σε λάθη ελλείψει μηχανισμών διόρθωσης. Η τρέχουσα θεραπεία για τη χρόνια λοίμωξη από τον ιό είναι πεγκυλιωμένη ιντερφερόνη μόνη ή σε συνδυασμό με ριμπαβιρίνη. Το ποσοστό αποτελεσματικότητας ποικίλλει, ανάλογα με τους ιικούς γονότυπους. Οι περισσότερες μελέτες δείχνουν ότι οι γονότυποι 1a και 1b είναι οι ανθεκτικότεροι από τους γονοτύπους τύπου 1, σε οποιαδήποτε θεραπεία βασισμένη σε ιντερφερόνη άλφα 29. Η φυσική αντοχή μερικών στελεχών του ιού στην ιντερφερόνη έχει αποδοθεί στην ιική μη δομική πρωτεΐνη NS5A και στην πρωτεΐ-

9 134 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία νη του ελύτρου E2, οι οποίες αδρανοποιούν την R πρωτεϊνική κινάση της οποίας η παραγωγή επάγεται από την ιντερφερόνη 30. Η ε- νεργοποίηση της ιντερλευκίνης 8 έχει αποδειχθεί επίσης ότι συμβάλλει στην αντοχή στην ιντερφερόνη 31. Η ριμπαβιρίνη, ένα ριβινουκλεοσιδικό ανάλογο, θεωρείται ότι έχει άμεση αντι-ιική δράση λόγω της δυνατότητάς του να εμποδίζει τη σύνθεση του RNA διάφορων RNA ιών. Ε- ντούτοις, η ριμπαβιρίνη ως μονοθεραπεία κατά του ιού της ηπατίτιδας C δεν επέδειξε αντιιική δραστηριότητα στις κλινικές δοκιμές και κατά συνέπεια, θεωρείται γενικά ότι δρα ως ανοσοτροποποιητής ή ότι αυξάνει την μεταλλαξιογένεση στο RNA και με αυτές τις ενέργειες συμβάλλει στη μείωση της μολυσματικότητας του ιού Ωστόσο, ο ακριβής μηχανισμός της κλινικής δράσης της ριμπαβιρίνης παραμένει ασαφής. Η γονοτυπική ανάλυση στελεχών του ιού πριν και μετά από μονοθεραπεία με ριμπαβιρίνη έδειξε μόνο δευτερεύουσες μεταλλάξεις ως αποτέλεσμα της θεραπείας, εντούτοις, α- νιχνεύτηκε μια συγκεκριμένη μετάλλαξη στην περιοχή της NS5B RNA πολυμεράσης του γονοτύπου 1a του ιού. Η μετάλλαξη είναι στην περιοχή δέσμευσης του υποστρώματος της πολυμεράσης. Όταν αυτή η μετάλλαξη εισήχθη σε υπογενωμικά ρεπλικόνια του ιού in vitro, τα τελευταία παρουσίασαν ενισχυμένη αντoχή στη ριμπαβιρίνη 34. Αυτά τα στοιχεία δείχνουν ότι η ριμπαβιρίνη μπορεί να λειτουργήσει και ως άμεσο αντι-ιικό in vivo. Γενικότερα, οι λόγοι για τη μειωμένη ανταπόκριση του ιού της ηπατίτιδας C στη θεραπεία (πεγκυλιωμένη ιντερφερόνη με ή χωρίς ριμπαβιρίνη), περιλαμβάνουν ιολογικούς παράγοντες, γενετικούς παράγοντες, φαρμακοκινητικούς και φαρμακοδυναμικούς παράγοντες, και ανοσοκατασταλτικούς παράγοντες, όπως αυτούς που προκύπτουν από τη θεραπεία μετά από μεταμόσχευση οργάνων ή από συλλοίμωξη με HIV 35. Νέα φάρμακα κατά του ιού, αναστολείς της ιικής πρωτεάσης, πολυμεράσης και ελικάσης, είναι σε φάση κλινικών δοκιμών ή αναμένουν έγκριση. Ιοί της γρίπης Δύο κατηγορίες αντι-ιικών φαρμάκων είναι διαθέσιμες αυτήν την περίοδο για την αντιμετώπιση των ιών της γρίπης: οι αναστολείς του δίαυλου Μ2 (η αμανταδίνη και η ριμανταδίνη που δεν κυκλοφορεί στην Ελλάδα) και οι αναστολείς της νευραμινιδάσης (η οσελταμιβίρη και η ζαναμιβίρη) (Εικόνα 4). Οι αναστολείς του δίαυλου Μ2 είναι ενεργοί μόνο έναντι των ιών γρίπης Α και χρησιμοποιούνται και στη θεραπεία και στη χημειοπροφύλαξη της γρίπης Α, ενώ οι αναστολείς της νευραμινιδάσης είναι ενεργοί έναντι των ιών γρίπης Α και Β. Η πρωτεΐνη Μ2 σχηματίζει έναν ιοντικό δίαυλο στο έλυτρο του ιού, ο οποίος επιτρέπει ιόντα υδρογόνου να μπουν στο βιριόνιο από το ενδόσωμα, κάνοντας έτσι πιο όξινο το ph στο εσωτερικό του ιού, οπότε αποσυνδέεται η ιική πρωτεΐνη Μ1 από το RNA του ιού και ο ιός αποβάλλει το έλυτρο (έκδυση). Οι αναστολείς του δίαυλου Μ2 εγκαθίστανται στον ιοντικό δίαυλο και εμποδίζουν την είσοδο των πρωτονίων. Έτσι, αντοχή σ αυτή την κατηγορία φαρμάκων εμφανίζεται κατόπιν σημειακών μεταλλάξεων στην πρωτεΐνη Μ2, οι οποίες ε- μποδίζουν την εγκατάσταση του φαρμάκου και τη δράση του ως πύλης 36. Η αντοχή του ιού της γρίπης Α στους αναστολείς του δίαυλου Μ2 μπορεί να εμφανιστεί αφ εαυτής ή να προκύψει σύντομα κατά τη διάρκεια της θεραπείας. Μια σημειακή μετάλλαξη στα κωδικόνια για τα αμινοξέα στις θέσεις 26, 27, 30, 31, ή 34 της πρωτεΐνης Μ2 μπορεί να προκαλέσει διασταυρούμενη αντοχή σε αμανταδίνη και ριμανταδίνη. Ούτε η αναπαραγωγή, ούτε η μετάδοση, ούτε και η λοιμικότητα των αμανταδίνη-ανθεκτικών ιών της γρίπης Α εξασθενίζουν από τις σημειακές μεταλλάξεις αντοχής 37. Η νευραμινιδάση αποσυνδέει την ιική αιμοσυγκολλητίνη από τους κυτταρικούς υποδοχείς σιαλικού οξέος, επιτρέποντας έτσι στα νεοσχηματισμένα ιικά σωμάτια να βγουν από την επιφάνεια του κυττάρου 36. Μεταλλάξεις στη νευραμινιδάση ή στην αιμοσυγκολλητίνη,

10 Περίοδος B, Τόμος 15, Τεύχος 3, Εικόνα 4. Κύκλος ζωής του ιού της γρίπης και στόχοι των αντι-ιικών φαρμάκων (τροποποίηση από 1. Δέσμευση του ιού από υποδοχέα σιαλικού οξέος (Ν: νευραμινιδάση, Η: αιμοσυγκολλητίνη, Μ2: πρωτεΐνη Μ2) 2. Ενδοκυττάρωση του ιού από την κυτταρική μεμβράνη και μεταφορά στο ενδόσωμα. Δράση από αναστολείς διαύλου Μ2 3. Έκδυση. Ο ιός αποβάλλει το έλυτρο μετά από σύντηξη με τη μεμβράνη του ενδοσώματος, υποβοηθούμενος από το όξινο ph 4. Μεταφορά του ιικού RNA στον πυρήνα, σύνθεση του mrna και πολλαπλασιασμός του ιικού RNA 5. Σύνθεση των πρωτεϊνών του ιού στο κυτταρόπλασμα (εσωτερικές πρωτεΐνες) και στο ενδοπλασματικό δίκτυο (ΕR) (πρωτεΐνες μεμβράνης) 6. Σχηματισμός του ελύτρου του ιού και έξοδος από το κύτταρο 7. Απελευθέρωση από την επιφάνεια του κυττάρου με την συμβολή της νευραμινιδάσης. Δράση από αναστολείς της νευραμινιδάσης. μειώνουν τη συγγένειά της αιμοσυγκολλητίνης ως προς το σιαλικό οξύ, ελαττώνοντας έτσι την ανάγκη του ιού για τη λειτουργική δραστηριότητα της νευραμινιδάσης και οδηγώντας στην εμφάνιση αντοχής στους αναστολείς νευραμινιδάσης. Σε αντίθεση με την αντοχή στους αναστολείς του δίαυλου Μ2, η αντοχή στους αναστολείς νευραμινιδάσης παραμένει σπάνια παγκοσμίως. Μεταλλάξεις στα κωδικόνια 119, 152,198, 274, 275 και 292 στην ενεργό περιοχή της νευραμινιδάσης, σχετίζονται με αντοχή. Οι μεταλλάξεις στα «καταλυτικά» κωδικόνια 292 και 152 προκαλούν διασταυρούμενη αντοχή σε οσελταμιβίρη και ζαναμιβίρη 38. Κατά τη διάρκεια των τελευταίων χρόνων, τα στελέχη του υποτύπου Η3Ν2 του ιού της γρίπης Α παρουσιάζουν υψηλό ποσοστό αντοχής στους αναστολείς του διαύλου Μ2 39. Από τον Ιανουάριο του 2008, τα στελέχη του εποχικού υποτύπου Η1Ν1, παρουσίασαν μεγάλη αύξηση της αντοχής στην οσελταμιβίρη. Το φαινόμενο αυτό, δεν σχετίζεται με εκτεταμένη χρήση της οσελταμιβίρης και παραμένει ανεξήγητο 40. Η οσελταμιβίρη παραμένει το φάρμακο που συστήνεται από τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας για την αντιμετώπιση της γρίπης από στελέχη του υποτύπου της γρίπης Α H5N1(γρίπη των πτηνών). Μόνο από έναν πολύ μικρό αριθμό ασθενών παγκοσμίως απομονώθηκαν ανθεκτικά στην οσελταμιβίρη στελέχη Η5Ν1. Αυτοί οι ιοί δεν μεταδόθηκαν σε άλλους 41. Στην οσελταμιβίρη επίσης παραμένουν ευαίσθητα τα στελέχη του υποτύπου Η3Ν2 και ο ιός της γρίπης Β και στη ζαναμιβίρη τα στελέχη του υποτύπου Η3Ν2 και του εποχικού υποτύπου Η1Ν1 της γρίπης Α και ο ιός της γρίπης Β 41. Σύμφωνα με τα τελευταία στοιχεία του CDC για το 2009, από τα πανδημικά στελέχη του υποτύπου Η1Ν1 (που είναι διαφορετικά από αυτά του εποχικού Η1Ν1 υποτύπου) που απομονώθηκαν, το 98% ήταν ευαίσθητα στην οσελταμιβίρη και το 100% ήταν ευαίσθητα στη ζαναμιβίρη. Οι αναστολείς του διαύλου Μ2 δεν έχουν καμία δράση στο πανδημικό στέλεχος.

11 136 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία Τέλος, έχει συζητηθεί η πιθανότητα χρήσης συνδυασμού φαρμάκων κατά της γρίπης για την αντιμετώπιση της αντοχής 42, αλλά δεν υπάρχουν ακόμα έγκυρα αποτελέσματα από τις κλινικές δοκιμές. Εργαστηριακός έλεγχος αντοχής: γονοτυπικές και φαινοτυπικές δοκιμασίες Η δοκιμή ευαισθησίας στα αντι-ιικά φαρμάκα έχει γίνει ένα σημαντικό κομμάτι της α- ντι-ιικής θεραπείας και είναι συχνά ουσιαστική για την κατάλληλη αντιμετώπιση των χρόνιων ιικών παθήσεων, αλλά και για την αποφυγή της μετάδοσης ανθεκτικών ιών και τη μελλοντική ανακάλυψη νέων φαρμάκων. Για τον έλεγχο της αντοχής, δύο ειδών δοκιμασίες χρησιμοποιούνται: οι γονοτυπικές και οι φαινοτυπικές. Οι γονοτυπικές δοκιμασίες ανιχνεύουν στο ιικό γονιδίωμα τις μεταλλάξεις που σχετίζονται με αντοχή. Η διδεοξυνουκλεοτιδική ανάλυση της γενετικής αλληλουχίας (sequencing) είναι η βασική μέθοδος προσδιορισμού και οι τρέχουσες εφαρμογές στηρίζονται σε αυτοματοποιημένη ανάλυση της γενετικής αλληλουχίας 43. Οι γονοτυπικές δοκιμασίες είναι γρηγορότερες, πιο προσιτές, και λιγότερο δαπανηρές από τις φαινοτυπικές δοκιμασίες, εντούτοις έχουν διάφορους περιορισμούς. Η ανίχνευση μεταλλάξεων παρέχει μια έμμεση μέτρηση της ευαισθησίας στα φάρμακα και, επομένως, παρέχει πληροφορίες μόνο όταν συγκεκριμένες αλλαγές στη γενετική αλληλουχία έχουν ήδη χαρακτηριστεί και συσχετιστεί με την αντοχή στα φάρμακα. Επιπλέον, δεν επιτρέπουν την άμεση ερμηνεία των σύνθετων μεταλλάξεων α- ντοχής, της διασταυρούμενης αντοχής, της πολλαπλής αντοχής και των αλλαγών στην αντοχή. Οι περισσότερες γονοτυπικές δοκιμασίες δεν ανιχνεύουν τις γενετικές παραλλαγές του ιού, παρούσες σε ένα μικρό ποσοστό μόνο στο κλινικό δείγμα 43. Οι φαινοτυπικές δοκιμασίες μετρούν α- μέσως τη δυνατότητα του ιού για αναπαραγωγή παρουσία ενός φαρμάκου. Ειδικότερα, οι φαινοτυπικές δοκιμασίες καθορίζουν την α- νασταλτική συγκέντρωση ενός αντι-ιικού φαρμάκου που μειώνει την ιική αντοχή κατά 50% (IC50) ή κατά 90% (IC90) στις κυτταροκαλλιέργειες. Η ευαισθησία του ιού συγκρίνεται έπειτα με αυτήν του ευαίσθητου στο φάρμακο ιού (wild type virus) ή με αυτήν του ιού που α- πομονώνεται από τον ίδιο ασθενή πριν από τη θεραπεία 44. Για τους ερπητοϊούς, η δοκιμή ευαισθησίας στα φάρμακα είναι κατάλληλη για τους ασθενείς που δεν είχαν καλή ανταπόκριση στη θεραπεία πρώτης γραμμής. Ειδικά για τον κυτταρομεγαλοϊό, η δοκιμή συνιστάται σε όσους έχουν λάβει μονοθεραπεία για κάποια περίοδο (συνήθως μετά από 3-4 μήνες σε ασθενείς με AIDS και μετά από μακροχρόνια προφυλακτική θεραπεία σε μεταμοσχευμένους ασθενείς), ιδίως όταν υπάρχουν προδιαθεσικοί παράγοντες (μεταμόσχευση πνεύμονα ή νεφρού και AIDS με CD4 μετρήσεις <50 κύτταρα/µl). Επιπρόσθετα, όταν ο ενεργός ιικός πολλαπλασιασμός εμμένει (υψηλά ή αυξανόμενα επίπεδα DNAαιμίας, αντιγοναιμίας, ιαιμίας) κατά τη διάρκεια της θεραπείας, παρά τις υψηλές χορηγούμενες δόσεις ενδοφλέβιων αντι-ιικών. In-house γονοτυπικές και φαινοτυπικές δοκιμασίες είναι διαθέσιμες για τον απλό έρπητα, τον έρπητα ζωστήρα, και τον κυτταρομεγαλοϊό. Τα αντιδραστήρια του εμπορίου για την φαινοτυπική δοκιμασία αντοχής του απλού έρπητα και του κυτταρομεγαλοϊού, βασίζονται σε ένα σύστημα παράλληλων καλλιεργειών που χρησιμοποιεί κύτταρα αναφοράς που περιέχουν το γονίδιο της β-γαλακτοσιδάσης, για να ποσοτικοποιήσουν χρωμογονικά την ιική αύξηση 45. Για τον ιό της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας, ο έλεγχος αντοχής συνιστάται στην οξεία λοίμωξη, στην πρόσφατη λοίμωξη (<12 μήνες), στη χρόνια λοίμωξη πριν από την έναρξη της θεραπείας, σε αποτυχία της πρώτης θεραπείας (αδυναμία καταστολής του ιικού πολλαπλασιασμού μέσα σε 8-12 εβδομάδες), στην αποτυχία οποιουδήποτε θεραπευτικού σχήματος ( 1,000

12 Περίοδος B, Τόμος 15, Τεύχος 3, ιικά αντίγραφα/ml) και στην εγκυμοσύνη. Γονοτυπικές δοκιμασίες είναι διαθέσιμες στο εμπόριο 43. Οι τρεις υψηλά αυτοματοποιημένες φαινοτυπικές δοκιμασίες που είναι σήμερα διαθέσιμες από εξειδικευμένα ερευνητικά εργαστήρια [Antivirogram assay (Virco Lab, Titusville, NJ), PhenoSense assay (Virologic, South San Francisco, CA), Phenoscript (Special ty Laboratories, Santa Monica, CA and VIR alliance, Paris, France)] βασίζονται σε α- νασυνδυασμένους ιούς, οι οποίοι περιέχουν τα γονίδια των πρωτεϊνών-στόχων (πρωτεάση, ανάστροφη μεταγραφάση) που έχουν προκύψει από το πλάσμα ασθενών με PCR ανάστροφης μεταγραφής (RT-PCR). Τα τελευταία χρόνια ένας νέος τύπος δοκιμασιών έχει αναπτυχθεί για την ανάλυση της ικανότητας αναπαραγωγής (fitness, ικανότητα αναπαραγωγής του ιού σε συγκεκριμένο περιβάλλον) των ανθεκτικών ΗΙV στελεχών in vivo και in vitro 46. Δεν είναι ακόμα γνωστό αν η εμφάνιση αντοχής και η επακόλουθη αλλαγή της ικανότητας αναπαραγωγής, μειώνει τη λοιμικότητα του ιού και κατά συνέπεια καθυστερεί την εξέλιξη της νόσου 47. Μια τέτοια διαπίστωση, θα ήταν σημαντική για την αντιμετώπιση των ασθενών στους οποίους ο ιικός πολλαπλασιασμός δεν μπορεί να κατασταλεί. Η ανάλυση της ιικής ικανότητας αναπαραγωγής, μπορεί να αποδειχθεί σημαντική για την ερμηνεία της αντοχής του ιού στα αντιρετροϊκά. Για τον ιό της ηπατίτιδας Β, ο έλεγχος αντοχής συνιστάται σε περιπτώσεις θεραπευτικής αποτυχίας, αλλά και σε ασθενείς που πρόκειται να ξεκινήσουν θεραπεία, εφόσον ενδέχεται να είναι μολυσμένοι με ανθεκτικό στέλεχος του ιού. Οι γονοτυπικές και φαινοτυπικές δοκιμασίες αντοχής για τον ιό ακολουθούν την ίδια λογική των αντίστοιχων δοκιμασιών για τον ΗΙV 48. Για τον ιό της γρίπης, ο έλεγχος αντοχής είναι περιορισμένης χρήσης λόγω της καθυστέρησης στη λήψη των αποτελεσμάτων. Ε- ντούτοις, ορισμένοι ασθενείς μπορούν να ω- φεληθούν, όπως είναι οι ανοσοκατασταλμένοι ή οι ασθενείς της ΜΕΘ, οι ασθενείς που δεν δείχνουν κανένα σημάδι κλινικής βελτίωσης μετά από αντι-ιική θεραπεία 5 ημερών, αλλά και εκείνοι που ανέπτυξαν τη γρίπη ενώ ήταν υπό χημειοπροφύλαξη. Οι δοκιμασίες αντοχής περιλαμβάνουν την εξέταση αναστολής της νευραμινιδάσης για την ανίχνευση της αντοχής στην οσελταμιβίρη ή στη ζαναμιβίρη, που συνοδεύεται από ανάλυση της γενετικής αλληλουχίας του ιού για την ανίχνευση μεταλλάξεων που σχετίζονται με την αντοχή. Η αντοχή στους αναστολείς διαύλου Μ2 μπορεί να εντοπιστεί με ανάλυση της γενετικής αλληλουχίας του ιού για την ανίχνευση των γνωστών μεταλλάξεων αντοχής 49. Αυτήν την περίοδο, οι δοκιμασίες εκτελούνται από το CDC, καθώς επίσης και από μερικά ερευνητικά εργαστήρια και μεμονωμένες περιπτώσεις εργαστηρίων δημόσιας υγείας. Σε πολλές περιπτώσεις, η κλινική χρησιμότητα των δοκιμασιών αντοχής δεν έχει αποδειχθεί. Διαρκές και εντατικό πεδίο έρευνας αποτελεί η εύρεση πιο αξιόπιστων κλινικών ορίων φαινοτυπικής αντοχής, ούτως ώστε να παρέχονται περισσότερες πληροφορίες για τη συσχέτιση φαινοτύπου και κλινικής ανταπόκρισης του α- σθενούς και να εκτιμάται καλύτερα η πιθανή συμβολή οποιουδήποτε αντι-ιικού φαρμάκου σε μια θεραπεία πολλαπλών φαρμάκων. Συμπεράσματα Η εμφάνιση αντοχής έναντι οποιουδήποτε ειδικού και ισχυρού αντι-ιικού φαρμάκου είναι αναπόφευκτη. Έρευνα για την ανακάλυψη νέων αναστολέων γίνεται για όλες τις παραπάνω κατηγορίες ιών, αλλά και για άλλους πολύ σημαντικούς ιούς για τους οποίους δεν υπάρχουν αποτελεσματικά φάρμακα (όπως οι οκτώ ιοί της ηπατίτιδας και οι ιοί των ανθρώπινων θηλωμάτων). Η πρόσφατη πανδημία γρίπης με το μεταλλαγμένο στέλεχος του ιού Α, Η1Ν1, ενίσχυσε την ανάγκη για αντι-ιικά φάρμακα ευρέος φάσματος. Παράλληλα, αναμένονται τα αποτελέσματα των κλινικών δοκιμών για τα εμ-

13 138 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία βόλια κατά του HIV και του ιού της ηπατίτιδας C. Εξίσου σημαντική είναι η αναζήτηση νέων στρατηγικών για καλύτερη χρήση των φαρμάκων που ήδη υπάρχουν και μεγιστοποίηση των κλινικών αποτελεσμάτων. Χρειάζονται πολύ σαφείς διαγνωστικές και θεραπευτικές οδηγίες για τη χρήση των αντι-ιικών στην πρωτοβάθμια υγεία, όπως είναι οι περιπτώσεις της γρίπης και του έρπητα ζωστήρα. Οι απειλές για βιοτρομοκρατία θα οδηγήσουν στην αξιολόγηση φαρμάκων εναντίον της ευλογιάς και άλλων ιών. Κεντρικό πρόβλημα στην εμφάνιση αντοχής είναι η αδυναμία καταστολής του ιικού πολλαπλασιασμού και σε αυτό πρέπει να επικεντρωθεί και η έρευνα για την ανακάλυψη νέων φαρμάκων. Υποδειγματική είναι η περίπτωση του απλού έρπητα για την αντι-ιική χημειοθεραπεία, διότι έχει επιτευχθεί η αντιμετώπιση της λοίμωξης χωρίς ιδιαίτερα προβλήματα αντοχής, παρά την επί δεκαετίες έκθεση του ιού στην α- κυκλοβίρη ή στην πενσικλοβίρη. Η ειδικότητα και η εκλεκτικότητα της δράσης των παραπάνω φαρμάκων, αλλά και το μεγάλο πλήγμα στην α- ναπαραγωγική ικανότητα, στη λοιμικότητα και στην ικανότητα μετάδοσης του ιού μετά από μετάλλαξη στη θυμιδινική κινάση, είναι κάποιοι από τους λόγους της θεραπευτικής επιτυχίας, έναντι των λοιμώξεων από έρπητα απλό. Οι ερευνητές μελετούν τη θεραπεία άλλων ιών βάσει του παραπάνω μοντέλου 2. Η αντοχή στα αντι-ιικά φάρμακα είναι ζημιογόνος για το σύστημα Υγείας, για τον ασθενή που αποτυγχάνει να αποκομίσει το μέγιστο θεραπευτικό όφελος και για την κοινότητα στην ο- ποία οι ανθεκτικοί ιοί μπορούν να μεταδοθούν. Υπάρχει επομένως επείγουσα ανάγκη για την αποτελεσματικότερη χρήση των δοκιμασιών αντοχής στα αντι-ιικά στην κλινική πράξη. Διεύθυνση Επικοινωνίας: Έλενα Κρανιωτάκη Μικροβιολογικό Τμήμα, Γ.Ν.Α. «Ο Ευαγγελισμός» Summary Treatment of viral infections and antiviral drug resistance H. KRANIOTAKI 1, E. PLATSOUKA 2 1 Dept of Microbiology, Evangelismos Hospital, Athens, Greece 2 Dept of Microbiology, Konstantopoulio General Hospital Neas Ionias, Greece Applied Clinical Microbiology The development of antimicrobial agents (antibacterials and antivirals) to treat infections has been one of the most notable medical achievements of the past century. Effective antiviral therapy is the only hope for survival or alleviation of disease for millions of individuals worldwide suffering from chronic viral infection, including those caused by HIV, HBV and HCV. Despite considerable progress in the development of effective inhibitors directed at specific aspects of viral life cycles, therapeutic efficacy has been limited by the evolution of resistant virus. While such resistant viral isolates are of clinical significance primarily in immunocompromised individuals, the development and transmission of such mutants have been reported in immunocompetent persons as well. Novel and innovative approaches are needed to advance the basic field of study, providing a basis of knowledge for the development of new diagnostic, therapeutic or preventive approaches. (Key words: viral infections, antiviral resistance, molecular basis, genotypic and phenotypic tests). ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Pillay D, Zambon M. Antiviral drug resistance. BMJ 1998, 317: Griffiths PD. A perspective on antiviral resistance. J Clin Virol 2009, 46: Pillay D, Taylor S, Richman DD. Incidence and impact of resistance against approved antiretroviral drugs. Rev Med Virol 2000, 10:

14 Περίοδος B, Τόμος 15, Τεύχος 3, Fyfe JA, Keller PM, Furman PA, Miller RL, Elion GB. Thymidine kinase from herpes simplex virus phosphorylates the new antiviral compound, 9-(2-hydroxyethoxymethyl) guanine. J Biol Chem 1978, 253: Prichard MN. Function of human cytomegalovirus UL97 kinase in viral infection and its inhibition by maribavir. Rev Med Virol 2009, 19: Schnipper LE, Crumpacker CS. Resistance of herpes simplex virus to acycloguanosine: role of viral thymidine kinase and DNA polymerase loci. Proc Natl Acad Sci USA 1980, 77: Vajpayee Μ., Malhotra Ν. Antiviral drugs against herpes infections. Indian Journal of Pharmacology 2000, 32: Morfin F, Thouvenot D. Herpes simplex virus resistance to antiviral drugs. J Clin Virol. 2003, 26: Bacon TH, Levin MJ, Leary JJ, Sarisky RT, Sutton D. Herpes simplex virus resistance to acyclovir and penciclovir after two decades of antiviral therapy. Clin Microbiol Rev 2003, 16: Pottage JC, Kersler HA. Herpes simplex virus resistance to aciclovir: clinical relevance. Infect Agents Dis 1995, 4: Saint-Léger E, Caumes E, Breton G, Douard D, Saiag P, Huraux JM, et al. Clinical and virologic characterization of acyclovir-resistant varicella-zoster viruses isolated from 11 patients with acquired immunodeficiency syndrome. Clin Infect Dis 2001, 33: Safrin S, Kemmerly S, Plotkin B, Smith T, Weissbach N, De Veranez D, et al. Foscarnet-resistant herpes simplex virus infection in patients with AIDS. J Infect Dis 1994, 169: Kost RG, Hill EL, Tigges M, Straus SE. Brief report: recurrent acyclovir-resistant genital herpes in an immunocompetent patient. N Engl J Med 1993, 329: Gilbert C, Boivin G. Human Cytomegalovirus Resistance to Antiviral Drugs. Antimicrob Agents Chemother 2005, 49: Cihlar T, Fuller M, Cherrington J. Characterization of drug resistance-associated mutations in the human cytomegalovirus DNA polymerase gene by using recombinant mutant viruses generated from overlapping DNA fragments. J. Virol 1998, 72: Chou S, Lurain NS, Thompson KD, Miner RC, Drew WL. Viral DNA polymerase mutations associated with drug resistance in human cytomegalovirus. J Infect. Dis 2003, 188: Potthoff AV, Brockmeyer NH. Current therapy of HIV. J Dtsch Dermatol Ges 2010, 8: Perelson AS, Neumann AU, Markowitz M, Leonard JM, Ho DD. HIV-1 dynamics in vivo: virion clearance rate, infected cell life-span, and viral generation time. Science 1996, 271: Clavel F, Race E, Mammano F. HIV drug resistance and viral fitness. Adv Pharmacol 2000, 49: Jakobsen MR, Tolstrup M, Søgaard OS, Jørgensen LB, Gorry PR, Laursen A, Ostergaard L. Transmission of HIV-1 drug-resistant variants: prevalence and effect on treatment outcome. Clin Infect Dis 2010, 50: Markowitz M, Nguyen BY, Gotuzzo E, Mendo F, RatanasuwanW, Kovacs C, et al. Rapid and durable antiretroviral effect of the HIV-1 Integrase inhibitor raltegravir as part of combination therapy in treatment-naive patients with HIV-1 infection: results of a 48-week controlled study. J Acquir Immune Defic Syndr 2007, 46: Williams SA, Greene WC. Regulation of HIV-1 latency by T-cell activation. Cytokine 2007, 39: Burke DC. The mechanism of interferon production. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 1982, 299: Ghany MG, Doo EC. Antiviral resistance and hepatitis B therapy. Hepatology 2009, 49(5 Suppl): S Lau GK, Piratvisuth T, Luo KX, Marcellin P, Thongsawat S, Cooksley G, et al. Peginterferon alfa-2a, lamivudine, and the combination for HBeAg-positive chronic hepatitis B. N Engl J Med 2005, 352: Lai CL, Leung N, Teo EK, Tong M, Wong F, Hann HW, et al. A 1-year trial of telbivudine, lamivudine, and the combination in patients with hepatitis B e antigen-positive chronic hepatitis B. Gastroenterology 2005, 129: Sung JJ, Lai JY, Zeuzem S, ChowWC, Heathcote EJ, Perrillo RP, et al. Lamivudine compared with lamivudine and adefovir dipivoxil for the treatment of HBeAg-positive chronic hepatitis B. J Hepatol 2008, 48:

15 140 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία 28. Pollicino T, Isgro G, Di Stefano R, Ferraro D, Maimone S, Brancatelliet S, et al. Variability of reverse transcriptase and overlapping S gene in hepatitis B virus isolates from untreated and lamivudine-resistant chronic hepatitis B patients. Antivir Ther 2009, 14: Legrand-Abravanel F, Colson P, Leguillou- Guillemette H, Alric L, Ravaux I, Lunel-Fabiani F, et al. Influence of the HCV subtype on the virological response to pegylated interferon and ribavirin therapy. J Med Virol 2009, 81: Muñoz de Rueda P, Casado J, Patón R, Quintero D, Palacios A, Gila A, et al. Mutations in E2-PePHD, NS5A-PKRBD, NS5A-ISDR, and NS5A-V3 of hepatitis C virus genotype 1 and their relationships to pegylated interferon-ribavirin treatment responses. J Virol 2008, 82: Jia Y, Wei L, Jiang D, Wang J, Cong X, Fei R. Antiviral action of interferon-alpha against hepatitis C virus replicon and its modulation by interferon-gamma and interleukin-8. J Gastroenterol Hepatol 2007, 22: Ogbomo H, Michaelis M, Altenbrandt B, Doerr HW, Cinatl JJr. A novel immunomodulatory mechanism of ribavirin in suppressing natural killer cell function. Biochem Pharmacol 2010, 79: Chevaliez S, Brillet R, Lazaro E, Hezode C, Pawlotsky JM. Analysis of ribavirin mutagenicity in human hepatitis C virus infection. J Virol 2007, 81: Young KC, Lindsay KL, Lee KJ, Liu WC, He JW, Milstein SL, Lai MM. Identification of a ribavirin-resistant NS5B mutation of hepatitis C virus during ribavirin monotherapy. Hepatology 2003, 38: Reiberger T, Rasoul-Rockenschaub S, Rieger A, Ferenci P, Gangl A, Peck-Radosavljevic M. Efficacy of interferon in immunocompromised HCV patients after liver transplantation or with HIV co-infection. Eur J Clin Invest 2008, 38: Hayden FG. Antiviral resistance in influenza viruses implications for management and pandemic response. N Engl J Med 2006, 354: Hay AJ, Zambon MC, Wolstenholme AJ, Skehel JJ, Smith MH. Molecular basis of resistance of influenza A viruses to amantadine. J. Antimicrob. Chemother 1986, 18 Suppl B: Moscona A. Neuraminidase inhibitors for influenza. N Engl J Med 2005, 353: Furuse Y, Suzuki A, Kamigaki T, Shimizu M, Fuji N, Oshitani H. Reversion of influenza A (H3N2) virus from amantadine resistant to amantadine sensitive by further reassortment in Japan during the 2006-to-2007 influenza season. J Clin Microbiol 2009, 47: Kramarz P, Monnet D, Nicoll A, Yilmaz C, Ciancio B. Use of oseltamivir in 12 European countries between 2002 and 2007 lack of association with the appearance of oseltamivir-resistant influenza A(H1N1) viruses. Euro Surveill 2009, 14: Monto AS. Implications of antiviral resistance of influenza viruses. Clin Infect Dis. 2009, 48: Poland GA, Jacobson RM, Ovsyannikova IG. Influenza virus resistance to antiviral agents: a plea for rational use. Clin Infect Dis 2009, 48: Shaffer RW. Genotypic testing for human immunodeficiency virus type 1 drug resistance. Clin Microb Rev 2002, 15: MacArthur RD. Understanding HIV phenotypic resistance testing: usefulness in managing treatment-experienced patients. AIDS Rev 2009, 11: Drew WL. Cytomegalovirus Resistance Testing: Pitfalls and Problems for the Clinician. Clin Infect Dis Epub ahead of print. 46. Quinones-Mateu ME, Arts EJ. HIV-1 fitness: implications for drug resistance, disease progression, and global epidemic evolution. In: HIV sequence compendium Kuiken C, Foley B, Hahn BH, Marx P, Mc Cutchan FE, Mellors J, et al. (editors). Los Alamos National Laboratory; pg Barbour JD, Grant RM. The clinical implications of reduced viral fitness. Curr Infect Dis Rep 2004, 6: Holness G, Carriero DC, Dieterich DT. Hepatitis B Therapies and Antiviral Resistance Detection and Management. Expert Rev Gastroenterol Hepatol 2009, 3: Deyde VM, Nguyen T, Bright RA, Balish A, Shu B, Lindstrom S, et al. Detection of molecular markers of antiviral resistance in influenza A

16 Περίοδος B, Τόμος 15, Τεύχος 3, (H5N1) viruses using a pyrosequencing method. Antimicrob Agents Chemother 2009, 53: Edward J, Zabawski Jr. A Review of Topical and Intralesional Cidofovir. Dermatology Online Journal 2000, 6: 3. Υποβλήθηκε: 9/3/2010 Εγκρίθηκε: 14/7/2010 Από την Ιστορία Πώς η «μεταβιβάσιμη αντοχή» πέρασε στο χώρο της μουσικής Στο «Microbiology today», τεύχος 37: 3, Αύγουστος 2010, της Society for General Microbiology, ένας τίτλος με μεγάλα γράμματα «Transferable Resistance - A musical tribute to the Royal Society» τραβά το βλέμμα του αναγνώστη. Σύμφωνα με το σχόλιο που ακολουθεί, η Royal Society του Λονδίνου παρήγγειλε τη σύνθεση ενός μουσικού έργου ως εναρκτήριο στον εορτασμό της 350ής επετείου από της ιδρύσεώς της (1660). Η σύνθεση ένα σύντομο εισαγωγικό μουσικό κομμάτι που γράφτηκε για χάλκινα πνευστά και μοιάζει με «φανφάρα» ετοιμάστηκε και προγραμματίστηκε να παιχτεί, από τα χάλκικα πνευστά της Φιλαρμονικής Ορχήστρας του Λονδίνου, το απόγευμα της 30ής Ιουνίου 2010 στο Royal Festival Hall. Τον τίτλο της σύνθεσης «Transferable Resistance» τον έδωσε ο συνθέτης του, Julian Anderson, τρίτος γιος του E.S. Anderson, ως φόρο τιμής στην ερευνητική εργασία του πατέρα του, που συγκαταλέγεται μεταξύ των πρώτων Ευρωπαίων επιστημόνων που διερεύνησαν τη μεταβιβάσιμη αντοχή των μικροβίων στα αντιβιοτικά. Η σύνθεση αφιερώνεται στη μνήμη τριών επίτιμων μελών της Royal Society: του καθηγητού Max Delbrück, του καθηγητού Bill Hayes και του πατέρα του, καθηγητού E.S. Anderson, που συνδέονταν με φιλικό δεσμό με τους δύο προηγούμενους διάσημους επιστήμονες. Ο E.S. Anderson είχε εργασθεί στην αρχή της σταδιοδρομίας του στην Αίγυπτο και την Κύπρο και επισκέφθηκε αρκετές φορές την Ελλάδα δίνοντας διαλέξεις σε νοσοκομεία και στο Μικροβιολογικό Εργαστήριο της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Αθηνών. Η Ελληνική Μικροβιολογική Εταιρεία τον είχε ανακηρύξει επίτιμο μέλος της, πριν 37 περίπου χρόνια, και Έλληνες Μικροβιολόγοι, όπως ο καθηγητής κ. Γ. Λεοναρδόπουλος, είχαν μετεκπαιδευθεί στο Εργαστήριό του στο Colindale. Β.Π-Π

17 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία και Εργαστηριακή Διαγνωστική Περίοδος Β, Τόμος 15, Τεύχος 3, σελ PANDAS: ΜΙΑ ΝΕΑ ΜΕΤΑΣΤΡΕΠΤΟΚΟΚΚΙΚΗ ΕΠΙΠΛΟΚΗ; Μ. ΔΑΣΚΑΛΑΚΗ, Μ. ΚΑΝΕΛΛΟΠΟΥΛΟΥ Νοσήματα που έχουν συσχετισθεί με λοιμώξεις από β- αιμολυτικό στρεπτόκοκκο ομάδας Α (S. pyogenes), είναι ο ρευματικός πυρετός, το οζώδες ερύθημα, η μεταστρεπτοκοκκική σπειραματονεφρίτιδα, η αντιδραστική αρθρίτιδα, καθώς και η δερματική πολυαρτηρίτιδα. Πρόσφατα στο φάσμα των ανωτέρω νοσημάτων προστέθηκε ομάδα ιδεοληπτικών-ψυχαναγκαστικών και άλλων ψυχιατρικών συμπτωμάτων καθώς και διαταραχών της κινητικότητας που παρατηρήθηκε σε παιδιά μετά από στρεπτοκοκκική λοίμωξη (GAS), όπου ο ρόλος της αυτοανοσίας είναι σημαντικός. Η πρόσφατη ομάδα ονομάζεται PANDAS (Pediatrtic Autoimmune Neuropsychiatric Disorders Associated with group A Streptococcal Infection) και παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον τόσο στη φυσιοπαθολογία, όσο και στη διάγνωση και αντιμετώπιση αυτών των ασθενών. (Λέξεις ευρετηρίου: PANDAS, GAS, β-αιμολυτικός στρεπτόκοκκος, ρευματικός πυρετός). Εισαγωγή Ο όρος PANDAS, ακρωνύμιο του Pediatric Autoinmune Neuropsychiatric Disorders Associated with Streptococcal infections, χρησιμοποιείται για να περιγράψει μια ομάδα ιδεοληπτικών ψυχαναγκαστικών διαταραχών και /ή γρήγορων επαναλαμβανόμενων μυϊκών συσπάσεων (tics) που εμφανίζονται κάθε φορά μετά από λοίμωξη από β- αιμολυτικό στρεπτόκοκκο ομάδας Α, (Streptococcus pyogenes), όπως φαρυγγίτιδα, αμυγδαλίτιδα, ή οστρακιά 1,2. Ως ιδεοληπτικές χαρακτηρίζονται οι διαταραχές, όπου στη συνείδηση του ατόμου εισβάλλουν σκέψεις B Μικροβιολογικό Τμήμα - Εργαστήριο Επειγόντων Περιστατικών «Σισμανόγλειο» Γενικό Νοσοκομείο Αττικής. ή εικόνες κατά τρόπο στερεότυπο, επαναλαμβανόμενο και ακούσιο, ενώ ως ψυχαναγκαστικές χαρακτηρίζονται επαναλαμβανόμενες συμπεριφορές ή νοητικά εκτελούμενες πράξεις προκειμένου να μειωθεί το άγχος των ιδεοληπτικών σκέψεων 3,4. Τα παιδιά με διαταραχές PANDAS έχουν δραματικά απότομη έναρξη των συμπτωμάτων, τα οποία συνίστανται σε κινητικά ή η- χητικά tics, ιδεοληψίες και ψυχαναγκαστικές πράξεις, κακή διάθεση ή ευερεθιστότητα, ανησυχία, αδυναμία συγκέντρωσης στο σχολείο, αδυναμία μάθησης, αδυναμία ανάγνωσης, διαταραχές ύπνου, νυκτερινή ενούρηση, υπερκινητικότητα, άγχος αποχωρισμού από τους γονείς ή από άλλα αγαπημένα πρόσωπα 4,5. Επίσης έχουν μη ελεγχόμενες μυϊκές συσπάσεις, όπως άνοιγμα-κλείσιμο των ματιών, ανύψωση των ώμων,

18 Περίοδος B, Τόμος 15, Τεύχος 3, προκαλούν αυτόματους θορύβους, π.χ. βήχα για να καθαρίσει ο λαιμός, γρύλισμα ή κραυγές και πολύ συχνά επαναλαμβάνουν τις ίδιες λέξεις 6. Πολλαπλές μυϊκές συσπάσεις παράλληλα με την παρουσία μιας τουλάχιστον ηχητικής μυϊκής σύσπασης παρατηρείται και στο σύνδρομο Tourette, στο οποίο γενετικοί, βιολογικοί και περιβαλλοντικοί παράγοντες προκαλούν δυσλειτουργία κυρίως των βασικών γαγγλίων του εγκεφάλου 7. H χορεία του Sydenham η οποία αποτελεί κύριο κριτήριο Ρευματικού Πυρετού (ΡΠ), χαρακτηρίζεται από μυϊκή αδυναμία, μειωμένο έλεγχο της λεπτής κινητικότητας, δυσαρθρία και διαταραχές της συμπεριφοράς (συναισθηματική αστάθεια, άγχος, ιδεοψυχαναγκαστικά συμπτώματα κ.λπ.) αποδίδεται σε οξεία φλεγμονώδη αντίδραση κυρίως των βασικών γαγγλίων και λιγότερο του φλοιού του εγκεφάλου, γεγονός που επιβεβαιώνεται με απεικονιστικές τεχνικές Πιστεύεται ότι στην ομάδα διαταραχών PANDAS συμβαίνει κάτι ανάλογο με τη χορεία του Sydenham. Συγκεκριμένα προσβάλλονται τα βασικά γάγγλια του εγκεφάλου, τα οποία είναι υπεύθυνα για την κίνηση και τη συμπεριφορά. Πρωτεΐνες του κυτταρικού τοιχώματος του GAS ομοιάζουν με πρωτεΐνες των βασικών γαγγλίων, φαινόμενο το οποίο ονομάζεται μοριακή μίμηση (molecular mimicry) 12,13. Καθιερώθηκαν πέντε διαγνωστικά κριτήρια μετά από την καταγραφή και ανάλυση των πληροφοριών 50 περιπτώσεων ασθενών με PANDAS 1. Διαγνωστικά κριτήρια PANDAS 1,14,15 1. Παρουσία ιδεοληπτικών/ψυχαναγκαστικών συμπεριφορών και / ή tics. Εμφανίζονται σε ποσοστό μέχρι 80% (και οι δύο τύποι) εντός έξι εβδομάδων από το επεισόδιο της στρεπτοκοκκικής λοίμωξης. 2. Ηλικία έναρξης των συμπτωμάτων, μεταξύ 3 ετών έως και πριν την εφηβεία. Προσβάλλονται και τα δύο φύλα, περισσότερο τα αγόρια (2,6:1 σε σχέση προς κορίτσια). 3. Απότομη έναρξη των συμπτωμάτων, ή δραματική επιδείνωση αυτών. Συνήθως οι α- σθενείς θυμούνται ακριβώς την ημέρα και την ώρα που εμφανίστηκαν τα συμπτώματα. Η αποδρομή είναι βραδεία, διαρκεί εβδομάδες ή μήνες, μέχρι μία νέα στρεπτοκοκκική λοίμωξη να πυροδοτήσει νέο κύκλο συμπτωμάτων. 4. Παροδική επιδείνωση των συμπτωμάτων ως αποτέλεσμα λοίμωξης από τον β-αιμολυτικό στρεπτόκοκκο ομάδας Α. Αποδεικνύεται με θετική καλλιέργεια. 5. Συσχέτιση με νευρολογικές διαταραχές π.χ. υπερκινητικότητα, χορειόμορφες κινήσεις, οι οποίες είναι ακούσιες μικρές κινήσεις προσώπου και άνω άκρων, και tics κατά την υποτροπή. Φυσιοπαθολογία Είναι άγνωστες ακόμα πολλές πλευρές σχετικά με την παθογένεια του συνδρόμου PANDAS. Σύμφωνα με το μοντέλο που έχει προταθεί από την S.E. Swedo υπάρχει μια ιδιοσυστατική (γενετική) ευαισθησία των ατόμων που πάσχουν, ώστε μετά από επαφή με τον S. pyogenes λαμβάνει χώρα μια μη ομαλή ανοσιακή απάντηση με αποτέλεσμα την εμφάνιση της συγκεκριμένης νοσολογικής οντότητας 1. Οι Pauls και οι συν. ανέλυσαν τη νοσηρότητα της διαταραχής Tourette και των ιδεοληπτικών-ψυχαναγκαστικών διαταραχών και θεώρησαν ότι πρόκειται για μια γενετική διαταραχή, που μεταβιβάζεται με τον επικρατούντα αυτοσωματικό χαρακτήρα και η οποία μπορεί να δικαιολογήσει την ευαισθησία αυτών των ατόμων με PANDAS 16. Συγκεκριμένα το αντιγόνο επιφανείας 883 ή D8/17 των Β-λεμφοκυττάρων έχει βρεθεί επανειλημμένα σε ασθενείς με PANDAS ( % vs 1-5% ασθενών ομάδος ελέγχου ή ασθενών με άλλες ψυχιατρικές διαταραχές). Σημαντικά συχνότερη παρουσία του D8/17 ευρίσκεται σε κύτταρα παιδιών με ρευματικό πυρετό ή χορεία του Sydenham 17,18.

19 144 Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία Σε πειραματικά μοντέλα με πειραματόζωα στα οποία έγινε έγχυση στον πλαγιοκοιλιακό βασικό πυρήνα του εγκεφάλου ορού ασθενών με διαταραχή Tourette α) με αυξημένα επίπεδα του αντιγόνου D8/17 (πρώτη ομάδα) β) ορού α- σθενών με χαμηλά επίπεδα του ίδιου αντιγόνου (δεύτερη ομάδα) και γ) ορού φυσιολογικών ατόμων, (τρίτη ομάδα) διαπιστώθηκε ότι τα ποντίκια παρουσίαζαν ηχητικά tics σε μεγαλύτερη συχνότητα, όσο μεγαλύτερη ήταν η συγκέντρωση του αντιγόνου D8/17 στον ορό των ασθενών. Η διαφορά μεταξύ της πρώτης ομάδας και των δύο τελευταίων όπου τα επίπεδα του αντιγόνου D8/17 ήταν ελαττωμένα ή ανύπαρκτα, ήταν στατιστικά σημαντική. Έχει διαπιστωθεί ότι οι τιμές του είναι αυξημένες σε καταστάσεις που εντάσσονται στο πλαίσιο της κλινικής οντότητας PANDAS αλλά όχι σε άλλες μεταστρεπτοκοκκικές νόσους όπως στη μεταστρεπτοκοκκική σπειραματονεφρίτιδα και στο συστηματικό ερυθηματώδη λύκο. Η τιμή του παραπάνω α- ντιγόνου δεν μεταβάλλεται με την πάροδο του χρόνου, ούτε και μετά από επαναλοιμώξεις από τον β-αιμολυτικό στρεπτόκοκκο Το αντιγόνο D8/17 είναι μια ανοσοσφαιρίνη τύπου Μ, η οποία ανιχνεύεται με μονοκλωνικά αντισώματα, ανοσοφθορισμό ή κυτταρομετρία ροής. Η ευαισθησία και η ειδικότητα των δύο τελευταίων μεθόδων είναι παρόμοιες (70/87%,77/87%) 19,20. Μελέτες όμως για τη χρησιμότητα του D8/17 ως διαγνωστικού δείκτη σε PANDAS, χορεία Sydenham και διάφορες νευροψυχιατρικές καταστάσεις είναι πρώιμες και σε εξέλιξη 4,21. Λοίμωξη Ο μικροοργανισμός που έχει ενοχοποιηθεί περισσότερο για τη γένεση PANDAS είναι ο Streptococcus pyogenes ο οποίος διαθέτει πολλά αντιγονικά στοιχεία, όπως την πρωτεΐνη F, το λιποτειχοϊκό οξύ, τα υπεραντιγόνα και την πρωτεΐνη Μ, η οποία προκαλεί τη σημαντικότερη αντισωματική απάντηση. Ως γνωστόν η πρωτεΐνη Μ διαιρείται σε 85 οροτύπους. Σύμφωνα με πειραματικές μελέτες οι «ρευματογόνοι» ορότυποι: Μ6 (κυρίως), Μ5 και Μ19 (λιγότερο), καθώς και Μ24, παρουσιάζουν διασταυρούμενες αντιδράσεις με τον εγκεφαλικό ιστό. Στη διαταραχή Tourette διαπιστώθηκε ότι οι ορότυποι Μ12 και Μ19 παρουσίαζαν περισσότερες διασταυρούμενες αντιδράσεις με τον ιστό των βασικών γαγγλίων σε σχέση με άλλους οροτύπους 22,23. Υποστηρίζεται ότι στους ασθενείς με PANDAS οι τίτλοι των αντισωμάτων έναντι της στρεπτολυσίνης,(αsτo) και της DNAse B (antidnaase B), είναι υψηλότεροι έναντι ομάδος ασθενών ελέγχου 24,25. Αποτελέσματα αντίθετα με τα παραπάνω είχε η μελέτη των Murphy και συνεργατών, οι οποίοι διαπίστωσαν ότι ασθενείς με διαταραχή Tourette και με ιδεοψυχαναγκαστικές διαταραχές εμφάνιζαν διαφορές μόνο στο αντιγόνο D8/17. Μια εξήγηση για τη διαφορά αυτή μπορεί να είναι το γεγονός ότι στην περίπτωση της πρωτολοίμωξης μεσολαβεί ένα μεσοδιάστημα μεταξύ της ανόδου του τίτλου των αντισωμάτων και της πρώτης εκδήλωσης των συμπτωμάτων, το οποίο δεν υπάρχει στην περίπτωση των επαναλοιμώξεων, όπου η άνοδος του τίτλου των αντισωμάτων είναι άμεση 19. Γι αυτόν το λόγο οι ίδιοι ερευνητές μελετώντας μία διαφορετική ομάδα ασθενών διαπίστωσαν ότι μεταξύ των ασθενών που παρουσίαζαν υποτροπές οι τίτλοι των ΑSΤΟ και antidnase B ήταν υψηλοί και έτσι κατά κάποιο τρόπο υποστηρίζεται η υπόθεση ότι η νόσηση από S. pyogenes δίνει γένεση σε έ- να αυτοάνοσο μηχανισμό, ο οποίος με τη σειρά του προκαλεί τα συμπτώματα των διαταραχών, που εντάσσονται στο πλαίσιο της νοσολογικής οντότητας PANDAS 19. Υποστηρίζεται ότι η ανοσολογική απάντηση στη λοίμωξη από GAS οδηγεί στο σχηματισμό αντισωμάτων έναντι του ιστού των βασικών γαγγλίων. Έχει διαπιστωθεί ότι ορισμένοι επίτοποι της πρωτεΐνης Μ είναι παρόμοιοι με αυτούς των ελικοειδών πρωτεϊνών, όπως π.χ. της μυοσίνης, της τροπονίνης και κερατίνης, καθώς και με τμήματα του κυτταροσκελετού του πυρήνα και της μεμβράνης των νευρώνων των

20 Περίοδος B, Τόμος 15, Τεύχος 3, βασικών γαγγλίων Αυτό παράγει τον λεγόμενο μοριακό μιμιτισμό (molecular mimicry), με αποτέλεσμα να προκαλείται διασταυρούμενη αντίδραση και να παράγονται αυτοαντισώματα τύπου IgG, φλεγμονώδης αντίδραση τύπου ΙΙ και ανάλογα κλινικά συμπτώματα 12,13. Δεν είναι γνωστό πώς γίνεται η διέλευση των αυτοαντισωμάτων δια μέσου του αιματοεγκεφαλικού φραγμού. Υποστηρίζεται ότι κατά τη διάρκεια μιας λοίμωξης η άνοδος της θερμοκρασίας προκαλεί αλλαγές στον αιματοεγκεφαλικό φραγμό, που είτε επιτρέπουν στα αυτοαντισώματα να τον διαπερνούν, είτε διευκολύνουν τη δημιουργία τους μέσα στο κεντρικό νευρικό σύστημα Πάντως αξίζει να αναφερθεί ότι έχουν περιγραφεί περιπτώσεις PANDAS, και μετά από λοιμώξεις που προκάλεσαν μικροοργανισμοί όπως: Borrelia burgdorferi και Mycoplasma pneumoniae. Έτσι μένει να διερευνηθεί, αν το PANDAS εμφανίζεται ως μεταλοιμώδης κατάσταση που προκαλείται από διάφορους μικροβιακούς παράγοντες και όχι μόνο τον πυογόνο στρεπτόκοκκο 27. Θεραπεία Η θεραπεία του συνδρόμου προσανατολίζεται στα εξής: αρχικά σε κάθε παιδί με tics ή ιδεοψυχαναγκαστική συμπεριφορά πρέπει να γίνεται καλλιέργεια φαρυγγικού επιχρίσματος με τη λογική να αποδεικνύεται η συσχέτιση του νοσήματος με τον GAS. Υπάρχει συμφωνία χορήγησης πενικιλίνης ή αμοξυκιλίνης ή κεφαλοσπορίνης στις ενδεικνυόμενες δόσεις έστω και αν το παιδί δεν βρίσκεται στην οξεία φάση λοίμωξης, δεδομένου ότι το PANDAS είναι αυτοάνοσο νόσημα. Θεωρείται χρήσιμη η προφύλαξη με βενζαθενική πενικιλίνη G U μια φορά το μήνα, ή η χορήγηση πενικιλίνης V 250 mg δυό φορές την ημέρα, ή αζιθρομυκίνης 500 mg μια φορά την εβδομάδα. Επίσης έχει δοκιμαστεί ενδοφλέβια χορήγηση ανοσοσφαιρίνης και πλασμαφαίρεσης, διαδικασίες όμως οι οποίες ενέχουν κινδύνους και επιπλοκές για τους ασθενείς 4. Τέλος η συμβολή του παιδονευρολόγου-παιδοψυχιάτρου και του παιδορευματολόγου θεωρείται απαραίτητη και δεδομένη προκειμένου να χορηγηθεί η απαιτούμενη φαρμακευτική αγωγή σε ένα τόσο σύνθετο νόσημα όπως είναι το PANDAS. Διεύθυνση Επικοινωνίας: Μαρία Δασκαλάκη Βιοπαθολόγος, Επικουρικός Ιατρός Β Μικροβιολογικού Τμήματος - ΤΕΠ Σισμανόγλειο Γενικό Νοσοκομείο Αττικής Τηλ.: Summary M. Daskalaki, M. Kanellopoulou PANDAS: (Pediatric Autoimmune Neuropsychiatric Disorders) new post- streptococcal sequelae? 2nd Microbiology Department, Laboratory of Emergency Department «Sismanoglion» General Hospital of Athens Applied Clinical Microbiology Several diseases have been associated with preceding streptococcal disorders. In this group belong various inflammatory disorders like acute rheumatic fever, erythema nodosum, post-streptococcal glomerulonephritis, reactive arthritis and cutaneous polyarteritis. Recently to the spectrum of poststreptococcal diseases in children have been added several symptoms that range from obsessive-compulsive and neuropsychiatric disorders to motor tics and they have been considered to be a part of an autoimmune procedure. That recently described subgroup of childhood disorders have been named PANDAS, which is the acronyme of Pediatric Autoimmune Neuropsychiatric Disorders Associated with group A Streptococcal Infection and is of great interest regarding its pathophysiology and patients management. To