Vaja 5: Spektrofotometrično določanje Cr (VI)

Transcript

1 26 Vaja 5: Spektrofotometrično določanje Cr (VI) Teoretično ozadje V naravi največkrat obstaja krom v dveh oksidacijskih stanjih: a) v oksidacijskem stanju 6+: - kot rumeni CrO 4 2- pri višjem ph-ju (bazični medij); - kot oranžni Cr 2 O 7 2- pri nižjem ph-ju (kisli medij); b) v oksidacijskem stanju 3+ kot zeleni Cr 3+. V oksidacijskem stanju 6+ je krom močan oksidant (reducira se do stanja 3+) in kot tak nevaren za živa bitja (tudi kancerogen). V nasprotju reducirana oblika (Cr 3+ ) ni nevarna in predstavlja celo enega izmed esencialnih mikroelementov v živih bitjih. Pri vaji bomo določevali kromat (VI) z merjenjem absorbance obarvanega kompleksa med difenilkarbazonom in Cr 3+, kompleksom, ki nastane po redukciji kromata (VI) v krom (III) in hkratni oksidaciji difenilkarbazida v difenilkarbazon. Reakcija poteka v kislem mediju. H O N N N N N N Cr 2 O H + 3 N N + H H H O difenilkarbazid difenilkarbazon 14H 2 O + 4Cr 3+ rdeč kompleks med Cr 3+ in difenilkarbazonom Slika 1: Reakcija Spektrofotometrija je absorpcijska molekulska spektroskopska metoda, ki se uspešno uporablja v kemiji kot biokemiji in ostalih naravoslovnih panogah. Temelji na absorpciji vidne (400 do 750 nm) oziroma ultravijolične svetlobe (100 do 400 nm) pri določenih valovnih dolžinah, ki so značilne za določene ione in molekule. Ko bela (vidni del spektra) svetloba prehaja skozi raztopino, ki vsebuje neko obarvano komponento, se fotoni določenih valovnih dolžin absorbirajo v raztopini (analitu). Valovna dolžina absorpcije je odvisna od strukturnih lastnosti analita (vezi, kemijske skupine, ). Absorbirana svetloba (energija: E = h * υ) povzoči povišanje molekularne energije analita (rotacijska in vibracijska energija). Preostala svetloba se od vzorca odbije (refleksija - merjenje reflektance) oziroma preide skozi vzorec (transmisija merjenje transmitance in absorbance).

2 27 Raztopina s koncentracijo Svetloba, ki prihaja I 0 analita c, tu pride I Svetloba, ki s primarnega vira do absorpcije pade na detektor svetlobe dolžina kivete l Slika 2: Shema absorpcije svetlobe v spektrofotometru V spektrofotometriji sta pomembna dva zakona: a) Lambertov zakon: Delež vpadne svetlobe, ki jo vzorec absorbira, je neodvisen od intenzitete svetlobe. I = I 0 e -αl ali v preurejeni obliki: logi 0 /I = Kl, kjer je K = α/2.303 in logi 0 /I = A I 0 intenziteta vpadne svetlobe (W) I.intenziteta presevane svetlobe (W) α absorpcijski koeficient (K za primer logaritmirane enačbe) (cm -1 ) l.pot svetlobe skozi vzorec (cm) A...absorbanca b) Beerov zakon: Absorbanca je (pri nizkih koncentracijah analita) premosorazmerna koncentraciji analita. logi 0 /I = -logi/i 0 = -logt = A = ε * c * l T = I / I 0 = transmitanca ali propustnost l pot svetlobe skozi vzorec (cm) c...koncentracija analita (mol / L) ε...molarni ekstinkcijski koeficient (L/mol * cm). Njegova vrednost je odvisna od vrste snovi in valovne dolžine svetlobe. Za vzbujanje uporabimo monokromatsko svetlobo (tako s točno določeno valovno dolžino), in sicer izberemo valovno dolžino, pri kateri je absorpcija največja. Absorbanco merimo s spektrofotometrom. Bistveni deli spektrofotometrov: - primarni izvor svetlobe, ki oddaja širši spekter valovnih dolžin. Svetloba potuje od primarnega vira proti monokromatorju; - monokromator (prizme al uklonske mrežice): Razpršijo sevanje tako, da za meritev od celega spektra svetlobe uporabimo le ozek pas valovnih dolžin. - Monokromatska svetloba z intenziteto I 0 preide skozi vzorec v kiveti, na drugi strani pride ven z manjšo intenziteto I. - Na koncu pade na detektor, ki izmeri jakost vpadne svetlobe.

3 28 Eksperimentalni del vaje Pri tej vaji boste izvajali meritve s spektrofotometrom, ki smo ga sestavili v našem laboratoriju, da boste bolje seznanjeni s samim delovanjem spektrofotometra. Spektrofotometer je sestavljen iz naslednjih sestavnih delov: 1. Izvor svetlobe vidnega dela spektra (polikromatska svetloba). 2. Monokromator (prizma), s katero razklonimo belo svetlobo na njene osnovne barve (glej Sliko 3). 3. Chopper, s pomočjo katere izbiramo svetlobo določene frekvence. 4. Leča za usmerjanje svetlobe na ogledalo. 5. Ogledalo, ki usmeri žarek svetlobe na vzorec v kiveti (dolžine 1 cm). 6. Nosilec za kiveto. 7. Reža, s katero prepuščamo svetlobo določene valovne dolžine na fotopomnoževalko. Reža je povezana z mikrometerski vijakom, s katerim merimo premik reže po barvnem spektru. 8. Fotopomnoževalka je povezana na lock-in, na katerem spremljamo jakost svetlobe izbrane valovne dolžine (I in I 0 ) v mv nm nm nm nm nm zelena viola modra Modrozelena Rumenozelena nm Rume na nm nm oranžna rdeča Slika 3: Barvni spekter vidne svetlobe z odgovarjajočimi valovnimi dolžinami. Obvezna je uporaba rokavic, očal in halje! Raztopine kroma zlivamo v posebej pripravljeno posodo in po opravljenih vajah raztopino reduciramo do Cr (III) z vodikovim peroksidom. Mešanice reragentov v epruvetah zlivamo posebej. 1. Priprava umeritvene krivulje a) Že pripravljene osnovne raztopine kromata (VI) (Cr 2 O 7 2- ) v vodi (70 ppm, 30 ppm, 10 ppm) 1x ali 2x redčimo, in sicer raztopino s koncentracijo 70 ppm do 7 ppm, 0.7 ppm, raztopino s koncentracijo 30 ppm do 3 ppm, raztopino s koncentracijo 10 ppm do 1 ppm. To naredimo tako, da v epruvete, v katere smo že dodali 9 ml vode, zaporedno z avtomatsko pipeto prenašamo po 1 ml vzorca iz višje koncentracije proti nižji. Pred prenosom 1 ml v drugo epruveto epruveto pokrijemo s parafilmom in dobro premešamo. Kot slepi vzorec uporabimo deionizirano vodo (9 ml). Vse raztopine razen slepega vzorca pripravljamo v dveh paralelkah! b) Pripravljenim razredčinam in raztopinam v epruvetah (9 ml) dodamo 0.7 ml DPC = difenilkarbazida (10 g/l v acetonu) in nato 0.4 ml H 3 PO 4 (25 %). Pred meritvijo prepustnosti počakamo 20 minut, da poteče reakcija.

4 29 2. Določitev valovne dolžine pri kateri boste določali absorbanco pripravljenih vzorcev Za merjenje absorbanc vašega vzorca potrebujete svetlobo valovne dolžine, pri kateri vaš vzorec (barvni kompleks) najmočneje absorbira. Za določitev valovne dolžine svetlobe, pri kateri barvni kompleks v tej vaji najbolj absorbira, boste uporabili vzorec, ki je najmočneje obarvan (7 ppm), kot tudi slepi vzorec (vzorec, ki ste ga pripravili samo z vodo). Najprej boste v kiveto dali slepi vzorec in premikali režo s korakom 0,5 mm od začetne vrednosti (0) na mikrometerskem vijaku desno po barvnem spektru svetlobe, ki ga boste videli na reži. Korak 0,5 mm na mikrometerskem vijaku ustreza 20 nm valovne dolžine svetlobe. Pri vsakem koraku mikrometerskega vijaka v desno (+) od začetnega položaja (0) boste zapisali tudi jakosti signala svetlobe na lock-in, I 0 v mv. Na tak način boste določali jakost prepuščene svetlobe pri izbranih valovnih dolžinah skozi vaš slepi vzorec. Postopek boste ponovili tudi za obarvan vzorec, to pomeni da boste izmerili jakost svetlobe skozi vzorec pri enakih položajih mikrometerskega vijaka (pri enakih valovnih dolžinah) kot pri slepem vzorcu (I v mv). Obe vrednosti, izmerjene pri vsakem položaju reže (pri vsaki valovni dolžini) boste pretvorili v absorbanco (Abs = log 10 I 0 /I). Podatke boste zbirali tako, kot je navedeno v preglednici 1 na strani 30. Določite pri kateri valovni dolžini svetlobe je vaša absorbanca največja. Pri tej valovni dolžini svetlobe, oziroma pri tem položaju mikrometerskega vijaka boste nato merili jakost prepuščene svetlobe vseh ostalih raztopin znanih koncentracij kromata (VI) in tudi vzorcev neznanih koncentracij kromata (VI) (Vzorec 1 in Vzorec 2). Pri preračunavanju I v absorbanco boste uporabljali I 0, ki ste ga določili pri tem položaju mikrometerskega vijaka. Narišite boste graf (umeritvena krivulja) odvisnosti absorbance od znanih koncentracij kromata (VI) v ppm. Vsako točko v umeritveni krivulji narišite kot povprečje meritev dveh raztopin. 2. Določitev koncentracije kromata (VI) neznanih koncentracij (Vzorec 1 in Vzorec 2). Na enak način kot smo merili absorbance znanih koncentracij kromatov (VI) za umeritveno krivuljo. Barvne reakcije izvedemo enako kot v primeru izdelave umeritvene krivulje (dve paralelki). Iz umeritvene krivulje odčitajte koncentracijo kromata (VI) Vzorca 1 in Vzorca 2. Material: Sestavljen spektrofotometer, pripravljene vodne raztopine K 2 Cr 2 O 7 (70 ppm, 30 ppm, 10 ppm), 2 vodna vzorca z neznano koncentracijo, 1000 µl avtomatska pipeta (+ modri tipsi), parafilm,

5 ml čaši za odpadke, brisače, deionizirana voda, epruvete, stojalo za epruvete. Preglednica 1: Način zbiranja podatkov za določanje valovne dolžine, pri kateri je absorbanca barvnega kompleksa največja. Premik mikrometerskega vijaka (mm) Barva v spektru, kjer je reža 0 Rdeča ,5 Rdeča Oranžna ,5 Oranžna Rumena ,5 Zelena Zelena ,5 Zelena Zelena ,5 Zeleno-modra Modra ,5 Modra 440 Ocenjena valovna dolžina spektra (nm) I 0 (mv) I (mv) Abs (log 10 I 0 /I) Naloga: 1. Najprej poiščite ustrezno valovno dolžino svetlobe, pri kateri vaš končni barvni kompleks najbolj absorbira. Narišite spekter barvnega kompleksa (absorbanca v odvisnosti od valovne dolžine svetlobe). 2. Izmerjene vrednosti I in I 0 za vsak vzorec znanih koncentracij kromata (VI) pretvorite v absorbanco (A). 3. Izdelava umeritvene krivulje absorbanca barvnega kompleksa v odvisnosti od koncentracije kromata (VI). 4. Določitev koncentracij kromata (VI) v pripravljenih vzorcih z neznanimi koncentracijami kromata (VI) s pomočjo umeritvene krivulje.

6 31 Vaja 6: Ionska kromatografija Teoretično ozadje Kromatografske metode so vrsta analitskih tehnik, ki spadajo med separacijske metode in se uporabljajo v analizni kemiji za kvalitativno in kvantitativno določevanje analitov v vzorcih. V to skupino spada tudi ionska kromatografija, ki se uporablja za merjenje nabitih molekul, ionov. Jedro ločbe analitov (ionov) predstavlja kromatografska kolona (1), ki je sestavni del HPLC (High pressure liquid chromatography) sistema. Kolona je napolnjena s posebnim polnilom ki ima na svoji površini kovalentno vezane nabite skupine in predstavlja»stacionarno fazo«. Glede na naboj stacionarne faze, v osnovi delimo ionsko kromatografijo na anionsko (+ naboj; amini ) oziroma kationsko kromatografijo ( - naboj; -SO 3 - ). Princip ločbe analitov temelji na interakcijah med analiti, mobilno fazo (pufer, ki se pretaka skozi kromatografsko kolono) in stacionarno fazo. Mobilna faza ali eluent (pufer) potiska vzorec skozi kolono. Med pretokom skozi kolono analiti, tekmujejo z ioni mobilne faze za vezno mesto na stacionarni fazi, ki je nasprotnega naboja. Različno močne interakcije med analiti in stacionarno fazo (kemijsko ravnotežje) so različni elucijski (retenzijski) časi analitov iz kolone. Retenzijski časi ločenih analitov so ob konstantnih pogojih (pretok mobilne faze, sestava mobilne faze, temperatura ) konstantni in so uporabni za kvalitativno določitev ionov. Poleg kromatografske kolone sestavljajo HPLC sistem še detektor (2), visokotlačna črpalka (3), injekcijski ventil (4), supresorski modul (5) in procesorska enota (6). Vzorec se v HPLC sistem vnaša preko injekcijskega ventila, ki ima znan volumen, definiran z injekcijsko zanko. Ventil nam omogoča vnos vzorca v sistem brez vpliva na pretok mobilne faze. Nadalje vzorec potuje v kromatografsko kolono, kjer se izvrši ločba med ioni v vzorcu. Ker je eluent prevoden in prevladuje nad analiti, bi na detektorju povzročal močen signal ozadja. Zatorej se v naslednjem koraku v supresorskem modulu eluent nevtralizira v supresorskih kolonah. Preostali ločeni analiti potujejo na konduktometrični (prevodniški) detektor, ki deluje na podlagi spremembe v prevodnosti ob prehodu nabitih molekul. Signal, (električni tok) beležen med kromatografskim procesom se shranjuje v procesorski enoti, ki je povezana z računalnikom. Na ekranu se signal izpisuje v obliki grafa kromatograma. V primeru uspešne ločbe analitov (ionov) so v kromatogramu lepo razvidni ločeni vrhovi (kromatografski vrhovi), ki predstavljajo posamezne vrste ionov. Površina in višina kromatografskega vrha sta linearno odvisni od koncentracije analita in sta uporabni za kvantitativni del analize.

7

8 33 Ekperimentalni del vaje 1. Določitev retencijskih časov standardnih raztopin anionov (F -, NO 2 -, SO 4 2-, Br -, Cl -, NO 3 -, PO 4 3- ) Standardne raztopine Cl -, NO 3 - in mešanice anionov (F -, NO 2 -, SO 4 2-, Br -, Cl -, NO 3 -, PO 4 3- ) je potrebno razredčiti; (600µL standardne raztopine µl deionizirane vode H 2 O). Določite retenzijske čase Cl -, NO 3- ionov in pripadajoče kromatografske vrhove v standardni raztopini mešanice ionov. Analizirajte vzorec: standardne raztopine mešanice ionov, standardne raztopine Cl - iona, standardne raztopine NO 3 - iona. Za ostale ione, ki so v standardni mešanici in za katere ni posameznih osnovnih raztopin vam asistent pove red elucije. 2. Meritve ionov v odvzetih vodnih vzorcih (metoda standardnega dodatka) V potok (Vaja 1) pojdite dva vodna vzorca vode (250 ml). Glede na vrsto analitov izberite ustrezno posodo vzorčenja. Vodne vzorce pripravite po naslednjem postopku: Za vsak vodni vzorec: 2400 µl vodnega vzorca µl standardne raztopine µl deionizirane vode 2400 µl vodnega vzorca µl standardne raztopine µl deionizirane vode 2400 µl vodnega vzorca µl standardne raztopine Material in metode: HPLC sistem: detektor: Schimadzu CDD-6A Conductivity detector supresor: Alltech 335 SPCS Supressor Module črpalka: procesor: Schimadzu CBM-10A Comunications Bus Module, PC Pentium I, 120 MHz injektor: Rheodine, 100 µl zanka kolona: Alltech ANION HC 4.6 X 100mm mobilna faza: HCO 3- /CO 3 2- =1.05mM/ 0.8mM, pretok= 1.5ml/min (izokratsko)

9 34 Standardi: AgNO 3, KCl Alltech Anion Mixture A (cat.no ): F ppm, Cl ppm, NO ppm, Br ppm, NO ppm, PO ppm, SO ppm -Avtomatska pipeta 1000/5000 µl -12 malih čaš, 5ml -250 ml čaša za odpadke 2X -brisače -deionizirana voda -plastična brizga 5 ml. Naloga: 1. Določitev retenzijskih časov analitov (grafični prikaz standardne mešanice v programu Excel) (podatke presnamete na disketo, zato jo prinesete s sabo) Prikažite graf kromatograma za standardno raztopino (mešanico ionov). Določite kromatografske vrhove, ki pripadajo Cl -, NO 3 -. Na podlagi znanja iz predavanj Kemije poskusite ugotoviti še za preostale kromatografske vrhove. 2. Določite vrsto in koncentracije prisotnih ionov v vodnih vzorcih, po metodi standardnega dodatka. (določite samo za kromatografske vrhove, ki dovolj dobro soupadajo v retenzijskih časih). Prikažite graf umeritvene krivulje (površina kromatografskega vrha v odvisnosti od volumna dodane standardne raztopine). Podajte formulo premice, ki teče skozi točke grafa. (Koncentracijo ionov določite na oba načina.)

10 35

11 36 Vaja 7: Plinska kromatografija (GC = gas chromatography) 1. Teoretično ozadje 1.1. Osnova V današnjem času kromatografije predstavljajo eno najpogosteje uporabljenih tehnik za analizo in ločevanje kompleksnih zmesi. Široko se uporabljajo pri raziskavah in razvoju (kemija, farmacija, medicina), nadzoru kakovosti surovin, polizdelkov in končnih izdelkov (»quality control«,»on-line«ali»off-line«nadzor), okoljskih analizah, ipd.. Lahko pa jih uporabimo tudi na preparativnem nivoju kot eno izmed tehnik v proizvodnem procesu (predvsem v farmaciji). Kromatografske tehnike omogočajo ločevanje in določevanje (kvalitativno in kvantitativno) ozko sorodnih komponent v kompleksnih vzorcih. Pogosto se uporabljajo kot ena od komponent (ločevalna) v t. i. sklopljenih analitskih tehnikah (npr. GC/MS, GC/IR, LC/MS, LC/DAD). Široki razširjenosti kromatografije je botrovala njena splošna uporabnost, prilagodljivost in možnosti avtomatizacije procesov Princip delovanja Osnova delovanja vseh kromatografskih metod je porazdelitev analita med mobilno in stacionarno fazo. Mobilna in stacionarna faza se ne smeta mešati oz. raztapljati druga v drugi. Nasploh je zaželeno, da je med njima čim manj interakcij. Mobilna faza potuje skozi stacionarno fazo in s seboj nosi analit. Le-ta se med njima porazdeli glede na različno afiniteto. Tiste komponente, ki se močneje vežejo na stacionarno fazo, potujejo počasneje. Nasprotno pa komponente, ki se na stacionarno fazo vežejo šibkeje (oz. se močneje vežejo na mobilno fazo), potujejo hitreje. Na tak način iz enega kompleksnega vzorca dobimo serijo ločenih komponent, ki jih lahko kvantitativno in/ali kvalitativno analiziramo. Glede na vrsto mobilne faze ločimo tri osnovne tipe kroamtografij: Tekočinska kromatografija (liquid chroamtography LC): tekoča mobilna Plinska kromatografija (gas chromatography GC): plinasta mobilna faza Superkritična kromatografija (Supercritycal-fluid chromatography SFC): mobilna faza je superkritični fluid Plinska kromatografija (gas chromatography GC) Pri plinski kromatografiji se kot mobilno fazo uporablja plin (N 2, He, H 2 ). Stacionarna faza je lahko trdna, tekoča (v obliki nehlapne tekočine) ali kemijsko vezan na površini. Pri kapilarnih kolonah je nanesena na notranji steni steklene kapilare (kremenčevo steklo»fused silica«), pri polnjenih pa na delcih polnila v steklenih, teflonskih ali kovinskih kolonah. Polnjene kolone so dolge do nekaj metrov in imajo notranji premer do 8 mm, kapilarne kolone pa do nekaj deset metrov in imajo notranji premer običajno manjši od 1 mm. Te kolone so mnogo bolj učinkovite kot polnjene (večje število teoretičnih prekatov).

12 37 Ločba temelji na različnih afinitetah komponent analita do adsorpcije / desorpcije na stacionarni fazi. Stacionarne faze se razlikujejo po polarnosti, mobilna faza plin pa pravzaprav samo prenaša komponente mešanice, ki se termično desorbirajo s stacionarne faze, naprej po koloni. Proces separacije lahko poteka pri konstantni temperaturi (izotermno) ali pa temperaturo med analizo spreminjamo (temperaturno programiranje). GC je primerna za dovolj hlapne (tipično do M 600 D) in termično stabilne spojine Glavni deli plinskega kromatografa (Slika 1): vir nosilnega plina (carrier gas), injektor za vzorec, termostatirana peč (column oven) s kromatografsko kolono, detektor. Slika 1: shema plinskega kromatografa s FID detektorjem Glavne vrste detektorjev za GC Detektor na toplotno prevodnost (TCD): predstavlja enega najstarejših načinov detekcije pri GC. Temelji na razliki v toplotni prevodnosti čistega nosilnega plina (mobilne faze) in nosilnega plina, ki s sabo nosi komponento analita. Prednosti: široka uporabnost, nedestruktivna metoda, enostavnost, široko dinamično linearno območje (~10 5 ).

13 38 Pomanjkljivost: relativno nizka občutljivost ( 10-8 g analita / ml nosilnega plina) Plamensko-ionizacijski detektor (FID): je zaradi svoje široke uporabnosti, enostavnosti, robustnosti, relativno nizke nabavne cene in nizkih obratovalnih stroškov danes najpogosteje uporabljan tip detektorja. Srce detektorja je vodikov gorilnik, v katerega priteka tok nosilnega plina z analitom. Gorilnik je obdan s kolektorsko elektrodo, med njima pa je napetostni potencial nekaj sto voltov. Pri sežigu organskih snovi nastajajo nabiti delci (ioni in elektroni), zaradi katerih na kolektorsko elektrodo steče električni tok (~10-12 A), ki je proporcionalen količini analita v nosilnem plinu. Detektor ne zaznava negorljivih plinov (npr. voda, CO 2, SO 2, NO x ). Pri gorljivih organskih snoveh pa je občutljivost odvisna od funkcionalnih skupin; heteroatomarne skupine zmanjšajo elektronski tok. Prednosti: široka uporabnost, robustnost enostavna uporaba, visoka občutljivost ( g analita / s) široko dinamično linearno območje (~10 7 ), majhen šum. Pomanjkljivost: destruktivna metoda Detektor na zajetje elektronov (ECD): je selektivni detektor za halogenirane spojine. Veliko se uporablja predvsem na področju okoljskih analiz (npr. določevanje halogeniranih ogljikovodikov v vodi in prsti, določevanje pesticidov). Detektor deluje na principu redukcije elektronskega toka. V detektor je vgrajen radioaktivni β sevalec, ki ionizira nosilni plin. Pri tem dobimo tok elektronov, ki ga lahko merimo. V prisotnosti analita, ki vsebuje elektronegativne funkcionalne (halogeni, peroksidi, kinoni, nitro), se tok prostih elektronov znatno zmanjša. Signal predstavlja zmanjšanje elektronskega toka. Detektor je neobčutljiv za amine, alkohole, ogljikovodike. Prednosti: selektivenost, nedestruktivna metoda, visoka občutljivost. Pomanjkljivost: ozko dinamično linearno območje (~10 2 ) Termoinski detektor (TID) ali Dušik fosforjev detektor (NPD): ima visoko občutljivost za organske spojine, ki vsebujejo fosfor in dušik (

14 oz. 50 bolj v primerjavi s FID). Po zgradbi nekoliko podoben FID. Tok nosilnega plina se uvaja v vodikov plamen, nastali vroč plin pa pride v stik s segreto keramično površino (Rb silikat) v električnem polju. Pri tem pride do nastanka plazme z visoko vsebnostjo fosforjevih in dušikovih ionov (če so prisotni v analitu). Mirimo spremembo ionskega toka med keramično površino in kolektorsko elektrodo (prisotnost N in P poveča ionski tok proti ozadju). Prednost: selektivenost. Pomanjkljivost: destruktivna metoda Masno selektivni detektor (MSD): ker ga je mogoče uporabiti tudi samega (brez plinskega kromatografa) in zaradi (v primerjavi z GC) nesorazmerno visoke cene običajno povezavo GC/MS obravnavamo kot t.i. sklopljeno tehniko (»hyphenated method«). V tem primeru kot detektor plinskega kromatografa služi masni spektrometer (»ion trap«, kvadrupolni,»time of flight«, na magnetni sektor). V detektorju se tok molekul analita ionizira s pomočjo elektronskega ali atomskega curka. Pri tem nastanejo pozitivno in negativno nabiti ioni in nevtralni radikali. Odvisno od načina delovanja (polaritete ionskih leč) za nadaljnjo obdelavo izberemo negativno oz. pozitivno nabite ione, ki jih nato ločimo z masnim spektrometrom. Fragmentacija (nabor molskih mas in njihova intenziteta) sta značilni za posamezno spojino. Tehnika omogoča direktno pozitivno identifikacijo komponent vzorca brez uporabe standardov za določanje retenzijskega časa. To tudi pomeni, da kvalitativna določitev sestave vzorca ni odvisna od fluktuacij v delovanju kromatografskega sistema. Detektor ponuja visoko občutljivost in hkrati visoko selektivnost tudi v primerih koelucije različnih komponent analita. Prednosti: selektivenost, možnost pozitivne identifikacije komponent, ne zahteva popolne kromatografske ločbe komponent analita. visoka občutljivost. Pomanjkljivost: relativno ozko dinamično linearno območje, velike razlike v odzivu glede na tip molekule, destruktivna metoda, visoka cena Priprava in čiščenje vzorcev za plinsko kromatografijo V analizi okoljskih vzorcev (zemlja, živila, voda, ) je potrebno vzorce pred kromatografsko separacijo predhodno pripraviti. Vzorce izpostavimo verižni obdelavi,

15 40 tako da so na koncu kompatibilni z analizno tehniko, detekcijo in separacijo ter vsebujejo selektivno skoncentriran analita, ki ga določamo. Med pripravo se moramo izogniti kontaminaciji vzorca in odstraniti možne interference iz vzorca. Vzorec mora biti reprezentativen, kar pomeni da prikazuje resnično sliko stanja, v času in prostoru, ki ga želimo analizirati.. Čiščenje zahteva veliko časa in potrpljenja, namenjeno pa je ohranjanju instrumentov, kvalitetnejši separaciji in boljši občutljivosti detektorja. Priprava vzorca pa predstavlja žal tudi največjo napako v analiznem postopku Klasične metode izolacije spojin iz vzorcev Ekstrakcijo uporabljamo v glavnem za izolacijo spojin iz raztopin in iz trdnih zmesi. Temelji na razliki topnosti sestavin zmesi v dveh topilih (ekstrakcija tekoče tekoče) oziroma razliki topnosti v danem topilu (ekstrakcija trdo - tekoče) Ekstrakcija iz raztopin Če raztopini dodamo neko topilo, ki se s prvim ne meša, dobimo dvofazni sistem (dve plasti). Ko takšno zmes dobro stresamo, spojina, ki jo hočemo ekstrahirati, delno preide v drugo topilo, delno pa ostane v prvem, pravimo da se porazdeli med obe fazi. Če nato obe plasti ločimo in na novo dobljeno raztopino uparimo, dobimo ekstrahirano spojino. Iz povedanega lahko takoj sklepamo, da bo ločitev z ekstrakcijo uspešna le, če bo spojina v dodanem topilu zelo topna. Ravnotežno razmerje koncentracij dane spojine v dveh topilih, ki se med seboj ne mešata, imenujemo porazdelitveni koeficient (K d ), ki je odvisen od temperature in v bolj koncentriranih raztopinah tudi od koncentracije. K d = c 1 / c 2 Pri čemer je c 1 ravnotežna koncentracija topljenca v prvem topilu in c 2 ravnotežna koncentracija topljenca v drugem. Če je razdelilni koeficient večji od 1, pomeni, da je topljenec bolje topen v prvem topilu kot v drugem. Pri večini ekstrakcij iz raztopin je eno topilo voda, drugo pa neko organsko topilo, ki se z vodo ne meša. Ekstrakcijo običajno večkrat ponovimo, ker hočemo spojino izolirati s čim boljšim izkoristkom. Dokažimo, da je bolje ekstrahirati večkrat z manjšo količino topila kot enkrat z večjo. Recimo, da začnemo z V v ml vode, v kateri je raztopljeno m v g topljenca. Po prvi ekstrakciji z V o ml organskega topila ostane v vodni raztopini m 1 g topljenca, m v - m 1 pa je masa topljenca, ki je prešla v organsko topilo. Iz teh podatkov izračunamo koncentracijo topljenca v vodi po prvi ekstrakciji: c v = m 1 / V v koncentracija topljenca v organski fazi po prvi ekstrakciji; in porazdelitveni koeficient: c o = (m v -m 1 ) / V o

16 41 K d = c o / c v = ((m v -m 1 ) / V o ) / (m 1 / V v ). Vedeti želimo, koliko topljenca je po prvi ekstrakciji ostalo v vodni raztopini (m 1 ): m 1 = m v [V v / K d V o + V v ] Po drugi ekstrakciji ostane v vodni raztopini: in po n ekstrakcijah: m 2 = m 1 [V v / K d V o + V v ] = m v [V v / K d V o + V v ] 2 m n = m v [V v / K d V o + V v ] n Za učinkovito ekstakcijo pa je poleg večkratne ponovitve izrednega pomena izbira primernega topila, ki mora zadostovati naslednjim zahtevam: že v hladnem mora dobro in selektivno raztapljati spojino, ki jo hočemo izolirati, ne sme reagirati s spojino, ki jo ekstrahiramo, ne sme reagirati s topilom, iz katerega ekstrahiramo, ravnotežje se mora hitro izpostaviti, porazdelitveni koeficient naj bo čim večji, po gostoti naj se razlikuje od topila, iz katerega ekstrahiramo, vrelišče naj ne bo previsoko, da ga lahko odstranimo od spojine Ekstrakcija iz trdih zmesi Spojine lahko tudi iz trdih zmesi izoliramo z ekstrakcijo. Pogoj je le, da je spojina mnogo bolj topna v organskem topilu, kot primesi. Tako lahko na primer uspešno ločimo organske spojine od anorganskih soli, ki so v splošnem slabo topne v organskih topilih. Za ekstrakcijo iz trdih zmesi uporabljamo Soxhletov aparat. V Soxhletovem aparatu topilo segrevamo v bučki, pare kondenzirajo v hladilniku in kondenzat kaplja na trdo zmes, ki smo jo dali v tulec iz filtrirnega papirja in pokrili z vato. Ko raztopina napolni nastavek do višine odtoka, steče po principu natege v bučko in nato se postopek ponovi. Ekstrahirana spojina se nabira v bučki, v tulcu pa ostanejo netopne primesi Sušenje raztopin Raztopine spojin v organskih topilih, ki jih dobimo na primer pri ekstrakciji iz vodnih raztopin, običajno sušimo tako, da jim dodamo sušilno sredstvo, ki mora zadostiti naslednjim zahtevam: ne sme reagirati s topljencem, vezava vode mora potekati hitro, imeti mora veliko sušilno kapaciteto, ne sme se znatno raztapljati v sušeni raztopini,

17 42 ne sme katalizirati kemijskih pretvorb ( polimerizacija, oksidacija, kondenzacija in podobno), mora biti sorazmerno poceni. Postopek sušenja raztopin s sušilnimi sredstvi: raztopini dodamo manjšo količino sušilnega sredstva, dobro premešamo, zamašimo in opazujemo spremembo. Če ostane raztopina motna ali pa če se sušilno sredstvo vidno navlaži ali celo pretvori v tekočino, moramo dodati več sušilnega sredstva. Izogibamo se dodatku prevelike količine sušilnega sredstva, ker lahko pride do adsorpcije spojine na njegovi površini in s tem do izgub. Po dodatku sušilnega sredstva posodo zamašimo in pustimo stati nekaj minut do pol ure ter nato filtriramo skozi guban filter v suho posodo Novejše metode izolacije spojin iz vzorcev Danes klasične metode izolacije spojin iz vzorcev (ekstrakcija tekoče tekoče ter ekstrakcija trdo tekoče) zamenjujejo novejše metode, ki temeljijo predvsem na manjši porabi organski topil in s tem manjši količini vnosa»odpadnih«spojin v okolje ter krajšemu času priprave vzorcev. Krajši čas priprave pa pomeni tudi na dolgi rok manjše ekonomsko breme, na kratki rok pa veliko breme. Ponavadi so te metode omejene na visoko specializirane instrumente in orodja, ki so zelo specifični. Tako poznamo»purge and trap«tehniko, SPME (solid phase micro extraction),»static and dinamic headspace«, ki so omejene samo za GC analizo. SPE (solid phase extraction), to je ekstrakcija na trdni fazi, uporabljamo jo za pripravo vzorcev za GC in HPLC analizo, Purge and trap (izpihni in ujemi v past) Tehniko ponavadi uporabljamo za ekstrakcijo nepolarnih hlapnih organskih spojin (Tv < 200 C), ki jih analiziramo v plinskem kromatografu. Inertni plin (npr. N 2 ) prepihujemo skozi vzorec in s tem izpihnemo hlapne organske spojine iz vode v parno fazo. Hlapne spojine se nato ujamejo na adsorbent past, s katere jih nato termično desorbiramo ali pa mikro ekstrahiramo. Na tak način ločimo lahko hlapne organske spojine od kompliciranega matriksa (osnovna raztopina, vzorec zemlje,..) Headspace Headspace analizo uporabljamo pri analizi lahko hlapnih spojin v vzorcih. Vzorec prenesemo v vialo (steklena posodica z zamaškom) in jo postavimo v termostatirano kopel. Hlapne spojine (Tv = nizka) zapustijo vzorec in preidejo v parno fazo. Del te parne faze nato injiciramo v injektorski del plinskega kromatografa Ekstrakcija na trdni fazi (SPE) Pri tej tehniki uporabljamo mini ekstrakcijske kolone, diske ali vlakna (SPME solid phase micro extraction). Ekstrakcija temelji na porazdelitvi, adsorpciji, afiniteti ali ionski izmenjavi našega analita na polnilu. Kolona ima obliko klasične brizge, ki ima na dnu polnilo 40 µm (različna polnila v odvisnosti od našega analita), nad polnilom je 20 µm frita iz polipropilena. V zgornji del nalijemo naš vzorec (od µl do L), ki nato potuje skozi frito in polnilo. Na polnilu so vezane selektivne funkcionalne skupine, na

18 katere se veže naš analit, ostali del vzorca pa potuje skozi kolono. S selektivnim topilom nato naš analit speremo s kolone in skoncentriramo v želenem topilu. 43

19 44 2. Eksperimentalni del 2.1. Plinska kromatografija Določanje aromatskih ogljikovodikov s plinsko kromatogarfijo Ogljikovodiki spadajo med nepolarne lahko hlapne organske spojine. V okolje jih vnašamo predvsem z uporabo nafte in njenih derivatov. Določamo jih lahko s plinsko kromatografijo, za detekcijo pa uporabljamo plamensko ionizacijski detektor (FID). Pred kromatografsko določitvijo ogljikovodikov, jih moramo iz vode ekstrahirati in jih s tem tudi skoncentrirati. Glavne komponente goriva so razvejani in nerazvejani alifatski ogljikovodiki (npr. oktan, cetan). Poleg tega so, odvisno od vira surove nafte ter in načina in stopnje predelave, prisotni še aromatski ogljikovodiki t.i. BTX (benzen, toluen in ksilen), različni oksidacijski produkti in različni dodatki za uravnavanje lastnosti goriva (npr. metil-t-butil eter, antidetonanti oz. radikalski promotorji, dodatki za zaščito motornih delov ). Stalen vir onesnaževanja podtalnice in zraka so hlapi, ki prehajajo v okolje pri točenju goriva v motorna vozila ter emisije nezgorelih ogljikovodikov med delovanjem hladnega motorja (preden motor in/ali katalizator dosežeta primerno delovno temperaturi). Občasno pa lokalno pride do hujših primerov kontaminacije, ki so posledica namernih ali nenamernih izpustov tekočih ogljikovodikov (npr. pronicanje goriva iz podzemnih in nadzemnih rezervoarjev, nesreče v prometu, čiščenje rezervoarjev, ) Naloga Doma izračunajte koncentracijo toluena in ksilena za pripravo umeritvene krivulje v ppm (mg/kg ali µl/l). Na plinskem kromatografu določite retenzijske čase za toluen, vse tri izomere ksilena in aceton. Ekstrahurate BTX iz vodne faze v diklorometan (metilen klorid; CH 2 Cl 2 ): ekstrakcija tekoče - tekoče S pomočjo umeritvene krivulje določite koncentracijo ogljikovodikov v vašem vodnem vzorcu (pred in po bencinski črpalki) Kromatografski pogoji Kolona: HP5-1 (95 % dimetilpolisiloksan + 5 % difenilpolisiloksana); mobilna faza: He; detektor: plamensko ionizacijski (FID); volumen vzorca: 1 µl; vzorec: ekstrakt v diklorometanu Potek Pripravite standardne raztopine čistih komponent benzena, toluena, ksilena in acetona v diklorometanu (1 µl / ml).

20 Retenzijske čase določite z vbrizganjem pripravljenih diklormetanskih raztopin čistih standardov benzena (1 kromatografski vrh), toluena (1 kromatografski vrh), ksilena (3 kromatografski vrhovi) in acetona v plinski kromatograf. Pripravite standardno raztopino benzena, toluena in ksilena tako, da v 1 ml acetona (ρ = 0,79 g/ml) dodate 10 µl benzena (ρ = 0,88 g/ml), 10 µl toluena (ρ = 0,87 g/ml) in 10 µl ksilena (ρ = 0,86 g/ml). Tako pripravljeno standardno raztopino (Aceton mix) hranite do uporabe v hladilniku. Delovne raztopine BTX, ki jih boste potrebovali za umeritveno krivuljo pripravite tako, da po 10 µl, 20 µl, 40 µl in 60 µl standardne raztopine v acetonu (Aceton mix) prenesete v 100 ml bučke, napolnjene z demineralizirano vodo. Bučke zaprite in vsebino dobro premešajte. Ekstrakte v diklometanu pripravite tako, da v 250 ml lij ločnik nalijete 100 ml vodne raztopine BTX (oz. vzorca vode). Dodate 3 ml diklormetana in 3 minute močno stresate v ločniku. Vmes večkrat odplinite ločnik. Ločnik postavite v stojalo in počakate, da se fazi ločita (nekako 10 min.). Za analizo odvzamete spodnjo (organsko) fazo!, ki jo natočite neposredno v vialo za vzorčke. Vialo zaprete s CRIMP pokrovčkom, da preprečite izhlapevanje. Na plinskem kromatografu analizirate diklormetanske ekstrakte (izmerite površine posameznih signalov) in s pomočjo umeritvene kvantitativno določite koncentracijo BTX v prinesenem vzorcu vode. 45

21 Vaja 8: Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC- High performance liquid chromatography) Teoretično ozadje Pojem tekočinska kromatografija zajema širok spekter metod in tehnik, ko so namenjene analitskemu, semipreparativnemu in preparativnemu delu od laboratorijskega do industrijskega nivoja. Temu primerne so tudi mere aparatov, ki so lahko namizni, lahko pa dosegajo mere industrijskih strojev (več m). Bistvo tekočinske kromatografije je, da se kot mobilno fazo uporablja tekočina (organska topila, voda, pufrne raztopine). Stacionarna faza, ki ne sme biti topna v mobilni fazi, je polnjena v kovinskih, steklenih ali plastičnih kolonah v trdni oziroma gelski obliki. Zapolni lahko večino volumna kolone ali pa je nanesena oz. kemično vezana na delce inertnega nosilca. Tipična oblika stacionarne faze so kroglice s premerom µm (odvisno od namena uporabe), pri čemer je zaželeno, da je velikost polnila v eni koloni čim bolj homogena. Različne vrste tekočinske kromatografije ločujemo glede na uporabljen tlak. V analitske namene se pretežno uporablja visokotlačna tekočinska kromatografija (High Pressure Liquid Chromatography HPLC). Za analize običajno uporabljamo kolone premera 2-8 mm in dolžine večinoma 5-30 cm. Mobilna faza, ki jo pod visokim tlakom črpamo skozi kolono, ima lahko ves čas isto sestavo (izokratska elucija) ali pa jo med analizo spreminjamo (gradientna elucija). Tradicionalna stacionarna faza (»normalna faza«) je običajno silikagel SiO 2, ki je polaren in zahteva uporabo nepolarne mobilne faze. V primeru, da so predmet analize nepolarni analiti pa je bolj primerna uporaba nepolarnih mobilnih faz (»reverzna faza«). Običajno gre za silikagel, ki je na površini zrn kemično modificiran z manj polarnimi substituenti v tem primeru je mobilna faza polarnejša od stacionarne. Ločba pri HPLC temelji na razliki v porazdelitvi (različnem porazdelitvemem koeficientu) komponent analita med stacionarno in mobilno fazo; le-ti sta si po polarnosti različni. Molekule, ki so po polarnosti bolj podobne mobilni fazi, hitreje zapustijo kolono. Tiste, ki pa so glede na polarnost bolj sorodne stacionarni fazi, se na koloni zadržujejo dlje časa. Glavni deli tekočinskega kromatografa so: rezervoar za mobilno fazo, črpalka, injektor za vzorec, kromatografska kolona, detektor. Glavne vrste detektorjev: detektor na lomni količnik, UV-VIS spektrofotometrični detektor, detektor s serijo diod (DAD), fluorescenčni detektor, elektrokemični detektorji (konduktometrični, amperometrični). 46

22 47 Slika 1: Shema sistema tekočinske kromatografije. Eksperimentalni del vaje V pripravljenih vzorcih iz Vaje 4 boste določali prisotnost in količino insekticida imidakloprida. Kromatografski pogoji: Kromatograf Hewlett Packhard 1100 Series Kolona Eclipse XDB C8 (150 x 4.6 mm, 5µm) Volumen iniciranja 100 µl Detektor Diode array (270 nm) Pretok 0.75 ml/min Mobilna faza A = deionizirana voda (80 %) B = acetonitril HPLC grade (20 %) Elucija Izokratična Čas analize 15 min Temperatura analize 25 C

23 48 1. Vzorce v vialah (Vaja 4) termostatirajte na sobno temperaturo. Raztopine neznanega vzorca analizirajte na enak način kot boste analizirali standardne raztopine. 2. Izdelali boste dve umeritveni krivulji s 3 točkami. a. Umeritvena krivulja 1: S HPLC analizo standardnih raztopin, ki ste jih izpostavili ekstrakciji na trdnem nosilcu (y = k 1 x+n 1 ). b. Umeritvena krivulja 2: S HPLC analizo standardnih raztopin, ki jih niste izpostavili ekstrakciji na trdnem nosilcu (y = k 2 x+n 2 ). Vsaka točka umeritvene krivulje naj bo povprečje dveh kromatografskih meritev dveh paralelk vzorcev (skupno 4 meritve). Kromatografske analize pričnite z najmanjšo koncentracijo! Po opravljenih meritvah izdelajte umeritveno krivuljo (površina kromatografskih vrhov na y os, na x os koncentracije). Izračunajte naklon krivulje, ki ne gre skozi izhodišče in korelacijski koeficient. Iz naklonov krivulj izračunajte izkoristek ekstrakcije imidakloprida na trdnem nosilcu (η = k 2 /(k 1 *B), pri čemer ne pozabite, da smo standardne raztopine s postopkom SPE pri Vaji 4 nekoliko skoncentrirali. Samo razmerje koncentriranja (B) je v formuli za izračun izkoristka ekstrakcije s pomočjo naklonov umeritvenih krivulj tudi potrebno upoštevati. Zakaj? Kolikšen je ta faktor B v vašem primeru? Kakšen je izkoristek ekstrakcije imidakloprida iz vode s SPE na C 18 kolonah? 3. Na podlagi retenzijskega časa standarda imidakloprida boste določili morebitno prisotnost imidakloprida v vaših vodnih vzorcih z neznano količino imidakloprida (Vzorec 1). Katero umeritveno krivuljo boste uporabili in zakaj? Koncentracije imidakloprida v vodi boste podali v ppm (part per milion). 4. Po končani analizi kolono sperete s acetonitrilom! Naloga: Rezultat izrazite v ppm imidakloprida v vodi, iz katere ste ekstrahirali imidakloprid pri vaji 4. Upoštevajte vse izkoristke, razredčitve in koncentriranja. Odgovorite tudi na vsa vprašanja, ki so napisana s krepko pisavo.