3. vaja Razsoljevanje proteinov z gelsko izključitveno kromatografijo

Transcript

1 Osnovni princip kromatografije 3. vaja Razsoljevanje proteinov z gelsko izključitveno kromatografijo 4. vaja Ionskoizmenjevalna ter afinitetna kromatografija Miha Pavšič komponente zmesi različne interakcije različna porazdelitev potovanje mobilne faze različna hitrost potovanja komponent ločitev komponent stacionarna faza Tekočinska kolonska kromatografija pojmi (1) eluent zvitje, narava interakcij mobilna faza molekule vzorca Tekočinska kolonska kromatografija pojmi (2) encimski test, elektroforeza, ELISA, A 280 posameznih frakcij frakcije vzorec spektrofotometer kolona eluat frakcije smer toka mobilne faze stacionarna faza na nosilcu (matriksu) mehanizem ločitve kromatogram (elucijski volumen retenzijski čas) 1

2 T = monokromator λ=280 nm I kiveta debeline l z vzorcem (konc. c) A! T%! 1! 10 %! transmitanca 2! 1 %! A = log T 3! 0,1 %! absorbanca 4! 0,01%! I0 Gelska filtracija sol absorbanca A280 absorpcija lučka izstopni žarek intenziteta I porazdelitev vzorca med stacionarno in mobilno fazo zaradi različne topnosw adsorpcija vstopni žarek intenziteta I0 Mehanizmi ločitve ionske interakcije à ionskoizmenjevalna kromatografija afiniteta à afinitetna kromatografija hidrofobne interakcije à hidrofobna kromatografija hidroksiapawtna kromatografija kovalentna kromatografija velikost Absorbanca pri λ=280 nm (A280) gelska filtracija A280 = ε280 c l molarni ekswnkcijski koeficient majhen protein velik protein GF: Uporaba ločevanje različno velikih makromolekul v preparafvne namene določevanje molekulske mase globularnih proteinov razsoljevanje vzorcev Pharmacia / Amersham / GE Healthcare 2

3 Ionskoizmenjevalna kromatografija (IEX) angl. ionexchange chromatography (IEX) temelji na privlačnih elektrostatskih interakcijah med nasprotno nabiwmi delci (ioni, poliioni) molekule se vežejo na nasprotno nabito stacionarno fazo ) ) Ionskoizmenjevalna kromatografija 1. splošno (ionska izmenjava) 2. stacionarna faza 3. naboj molekul vzorca 4. izbira stacionarne faze in ph mobilne faze (pufra) 5. stopnje ionskoizmenjevalne kromatografije (povzetek) 6. načini elucije IEX: Ionska izmenjava (1) neg. ioni soli močno negawvno nabit protein šibko negawvno nabit protein poziwvno nabit protein IEX: Ionska izmenjava (2) neg. ioni soli močno negawvno nabit protein šibko negawvno nabit protein poziwvno nabit protein mobilna faza (pufer) stacionarna faza nanos vzorca vezava vzorca speremo nevezano nizka konc. soli nizka konc. soli elucija 1 3

4 IEX: Ionska izmenjava (3) neg. ioni soli močno negawvno nabit protein IEX: Naboj proteinov visoka konc. soli šibko negawvno nabit protein poziwvno nabit protein visoka konc. soli arginin (Arg, R) asparaginska kislina (Asp, D) hiswdin (His, H) glutaminska kislina (Glu, E) lizin (Lys, K) elucija 2 IEX: Naboj proteinov (primer) negawvno nabite regije poziwvno nabite regije IEX: Naboj proteinov (primer) negawvno nabite regije poziwvno nabite regije nukleosom (histoni DNA) jedro iz histonov RCSB 3LZ0 10 MARTKQTARK 70 LLIRKLPFQR 130 MPKDIQLARR ! STGGKAPRKQ LATKAARKSA PATGGVKKPH RYRPGTVALR EIRRYQKSTE! ! LVREIAQDFK TDLRFQSSAV MALQEACEAY LVGLFEDTNL CAIHAKRVTI!! IRGERA! histon H3.1 4

5 IEX: Naboj proteinov IEX: Naboj proteinov pk a = log K a = [A ][H ] [HA] koncentracija zwijerionska oblika obe skupini protonirani obe skupini deprotonorani Neto naboj: Glutamat HisFdin (ekvivalent) (ekvivalent) IEX: Naboj proteinov je odvisen od ph!!! IEX: Izoelektrična točka (pi) nizek ph (kislo) arginin visok ph (bazično) Izoelektrična točka je Wsta vrednost ph, pri kateri je celokupni naboj proteina enak 0. izoelektrična točka hiswdin lizin asparaginska kislina glutaminska kislina Na splošno velja, da so proteini v kislem nabiw poziwvno, v bazičnem pa negawvno. 5

6 IEX: Različni proteini à različna izoelektrična točka različni proteini različno ak- zaporedje protein A različen delež Arg, Lys, His, Asp, Glu protein B različen naboj pri isw vrednosw ph Wtracijske krivulje pi (protein A) = 3,5 pi (protein B) = 8,8 Protein B je bolj bazičen od proteina A. / Protein A je bolj kisel kot protein B. IEX: Stacionarna faza nabite skupine, kovaletno vezane na nosilec (matriks) kroglice narava skupin določa kateri proteini se bodo vezali kako močno se bodo proteini vezali (jakost vezave) ANIONSKI izmenjevalci: so pozifvno nabiw vežejo ANIONE KATIONSKI izmenjevalci: so negafvno nabiw vežejo KATIONE IEX: Anionski in kawonski izmenjevalci vežejo anione vežejo kawone anionski izmenjevalci kafonski izmenjevalci šibki izm. IEX: Jakost izmenjevalcev Razlika med močnimi in šibkimi izmenjevalci je v vrednosw pka močni izmenjevalci so nabiw v širokem območu ph šibki izmenjevalci so nabiw v ozkem območju ph pk a = log K a = [A ][H ] [HA] šibke kisline: velik pka močne kisline: majhen pka diewlaminoewl (DEAE) karboksimewl (CM) šibek karboksimewl (CM) pk a 4 močni izm. močan sulfopropil (SP) pk a 1 ph = 7 močno kislo (ph < 3) kvartarni aminoewl (QAE) sulfopropil (SP) Vezava na močne ionske izmenjevalce je na močnejša. 6

7 IEX: Izbira stacionarne faze in ph pufra Izrednega pomena za uspešno ločitev proteinov v vzorcu je pravilna izbira stacionarne faze in vrednosf ph pufra (mobilne faze). IEX: Izbira ph pufra ph pufra vpliva na: naboj proteina stabilnost in topnost proteina pi določa, kateri ioni se bodo vezali nanjo določa ionsko obliko proteinov kawonski izmenjevalci vezava kawonov anionski izmenjevalci vezava anionov nizek ph (kislo) kawonska oblika visok ph (bazično) anionska oblika ph blizu izoelektrične točke ekstremne vrednosw ph (močno kislo, močno bazično) lahko pride do agregacije in obarjanja izguba funkcionalnosw denaturacija proteina IEX: Načrtovanje IEX ph stabilnost podatki o proteinu izračun pi in Wtracijske krivulje IEX: Primer načrtovanja IEX Situacija: v kompleksni zmesi imamo več proteinov, med drugim protein X, ki ga želimo ločiw od ostalih proteinov z IEX. poznamo akzaporedje proteina X à izračunamo pi poznamo ph območje stabilnosw proteina X vezava na anionski izmenjevalec izbira primernega ph glede na stabilnost območje stabilnosw IzbraW moramo: pufer s ph med 7 in 9 anionski izmenjevalec izbira primernega ionskega izmenjevalca vezava na kawonski izmenjevalec izberemo ustrezen izmenjevalec 7

8 IEX: Izvedba po stopnjah Izbran imamo pufer (ph) in ionski izmenjevalec. ekvilibracija vezava spiranje elucija Kolono speremo s pufrom z izbrano vrednostjo ph ob NIZKI IONSKI JAKOSTI. Na kolono nanesemo vzorec, ki je v enakem/podobnem pufru. DIALIZA! Z enakim pufrom speremo nevezane proteine. Vezane proteine eluiramo s pufrom z višjo ionsko jakostjo ali s spremembo ph. IEX: Elucija izokratska elucija eluiramo z začetnim pufrom vezava preko ionskih interakcij je ravnotežne narave à vezani proteini počasi potujejo prow iztoku iz kolone slabost: velika količina pufra, počasnost, slaba ločljivost elucija s spremembo ph ali povišanjem ionske jakosf IEX: Elucija s spremembo ph / ionske jakosw sprememba ph pufra sprememba nabojev sprememba moči vezave ph IEX: Stopenjska in gradientna elucija Po stopnjah ali zvezno (gradientno) spreminjamo ionsko jakost ali ph. elucija šibko vezanih proteinov elucija močno vezanih proteinov povišanje ionske jakosf tekmovanje za vezavo na kolono elucija proteina sol 8

9 IEX: Primer gradientne elucije Ionski izmenjevalec: QAESepharose (močan anionski) Pufer za vezavo: 20 mm Tris, ph 8,5 Pufer za elucijo: 20 mm Tris, ph 8,5, 0 0,5 M NaCl protein B Afinitetna kromatografija angl. affinity chromatography temelji na specifičnih interakcijah biološke interakcije à bioafiniteta nebiološke interakcije à psevdoafiniteta protein B protein A protein A Wtracijski krivulji kromatogram Afinitetna kromatografija 1. splošno Afinitetna kromatografija mobilna faza (pufer) stacionarna faza z imobilizirano molekulo 2. biološke interakcije 3. ravnotežna vezava, disociacijska konstanta 4. stopnje izvedbe vezava/imobilizacija liganda nanos vzorca, vezava elucija 5. primer psevdoafinitetne kromatografije nanos vzorca vezava vzorca spiranje kolone 9

10 Afinitetna kromatografija: biološke interakcije Stacionarna faza je ena od molekul, imobilizirana (vezana) na nosilec. molekula A encim receptor prowtelo nukleinska kislina protein molekula B substrat inhibitor kofaktor vitamin hormon anwgen komplementarna nukleinska kislina protein, ki se veže na nukleinsko kislino drug protein, ki se specifično veže nanj molekula A molekula B kompleks vzorec ligand kompleks Disociacijska konstanta K D = molekula A molekula B kompleks ekvivalenten zapis kompleks molekula A molekula B [A][B] [AB] Splošno pravilo: K D naj bo < 10 4 M. (mikromolarno območje oz. nižje) majhna K D à močna vezava Visoka K D à šibka vezava à nepopolna vezava à velike izgube. Imobilizacija liganda Ligand kovalentno vežemo na posebej pripravljen nosilec (matriks). primerna orientacija ligand makromolekula v vzorcu Nanos vzorca Volumen vzorca ni bistven! Afinitetno kromatografijo lahko uporabimo za koncentriranje. Kolono ekvilibriramo v pufru za vezavo (= pufer vzorca). Željene lastnosw pufra za vezavo: omogoča visoko jakost specifičnih interakcij oslabi nespecifične interakcije zadostna dostopnost (brez steričnih ovir) vmesnik ( spacer ) Ustrezna izbira ph ter ionske moči! Po nanosu vzorca kolono speremo z začetnim pufrom (= pufer za vezavo), da ostranimo nevezane snovi. 10

11 Elucija Poznamo dva osnovna načina: elucija s spremembo pogojev elucija s proswm ligandom (afinitetna elucija) Elucija Poznamo dva osnovna načina: elucija s spremembo pogojev elucija s proswm ligandom (afinitetna elucija) sprememba pufra oslabitev interakcij narava interakcij med ligandom in vzorcem elektrostatske hidrofobne interakcije oslabimo z ionsko jakostjo spremembo ph ionsko jakostjo dodatkom topil z nizko dielektrično konstanto šibki denaturanw (rahla sprememba konformacije) sprememba temperature Elucija Poznamo dva osnovna načina: elucija s spremembo pogojev elucija s prosfm ligandom (afinitetna elucija) Z visoko konc. nevezanega liganda izpodrinemo imobiliziran ligand. protein ligand vezan kompleks vezan ligand prost kompleks prost dobimo kompleks! Primer: imonoglobulin G (IgG) in protein A protein A iz Staphylococcus aureus IgG variabilne regije konstantna regija vezava drugih molekul imunskega sistema vezava anfgena S. aureus brez proteina A UNIČENJE S. aureus s proteinom A protein A S. aureus preslisiči imunski sistem!!! 11

12 Primer: imonoglobulin G (IgG) in protein A Nikeljafinitetna kromatografija čiščenje (izolacija) prowteles iz seruma psevdoafinitetna kromatografija IMAC ( immobilized metal affinity chromatography heksahiswdinski rep (His6) protein A (imobiliziran) nt CTG AGT GAG TGA! ak Leu Ser Glu STOP! genski inženiring ph nt CTG AGT GAG CAT CAT CAT CAT CAT CAT TGA! ak Leu Ser Glu His His His His His His STOP! dodamo serum protein A Sepharose nespremenjen protein vezava IgG (fiziološki ph) speremo nevezane proteine elucija s spremembo ph (oslabimo interakcijo med proteinom A in IgG) Nikeljafinitetna kromatografija spremenjen rekombinanten protein His6 4. vaja Ionskoizmenjevalna ter afinitetna kromatografija Ni2 oborjeni proteini (70% amonijev sulfat) dializa (20 mm NaOAc, ph 5) His6 nakisanje IEX: QAE, SP, CM NiNTASepharose (stacionarna faza) A280 koordinacijski kompleks med His6 in Ni2 elucija z imidazolom imidazol sol A280 BANA test His katepsin B afinitetna kromatografija: pepstawn Sepharose A280 Ansonov test encimska akwvnost katepsin D 12