Masni spektrometer. Ionizacija molekul v plinih. M + e M *+ + 2e eV (70eV), t = s ABCD *+ ABC+ + D* AB + + CD* AB* + CD + vakum.

Transcript

1 Masni spektrometer uvajanje ionizacija Masni analizator detektor vakum Ionizacija molekul v plinih procesor M + e M *+ + 2e eV (70eV), t = s ABCD *+ ABC+ + D* AB + + CD* AB* + CD + Izotopni ioni, večkrat ionizirani ioni Stabilni in metastabilni ioni ENAKI MS - spektri - zbirke

2 MS -SPEKTROMETRIJA Ioni z različnim m/z v različnem številu Reža za izbiro ionov Analiza ionov po m/z Elektronska pomnoževalka

3 Ionizacija z elektroni (EI-Electron Impact Ionization) MS katoda ~10-5 Pa Vzorec v plinu Energija elektronov eV Višja energija izdatnejša ionizacija tudi večja fragmentacija (v povprečju se ionizira le vsaka 10-4 od vseh prisotnih molekul) Največkrat za ionizacijo nepolarnih in slabo polarnih org. molekul do m/z 1000 Problemi pri določanju molekulske mase!

4 MASNA SPEKTROMETRIJA POTREBEN JE VISOK VAKUUM ( TOR) RAZLOG: VEČJA PROSTA POT DELCEV PROSTA POT: POVPREČNA RAZDALJA, KI JO PREPOTUJEJO DELCI (IONI, MOLEKULE), PREDEN ZADENEJO DRUGI DELEC

5 VAKUUMSKI SISTEM Dvostopenjski sistem črpalk rotacijska črpalka (predčrpalka) vakuum torr turbomolekularna ali difuzijska črpalka za končni vakuum 10-5 tor

6 Ionizacija- elektronska Elektron z energijo 70 ev zadene nevtralno molekulo. Pri trku izbije elektron in nastane molekularni ion z dodatno energijo Dodatna energija povzroči fragmentacijo cepitev molekule. 70 ev je primerna energija elektronov. Manjša energija povzroči neučinkovito ionizacijo, pri višjih energijah pa je fragmentacija prevelika, kar vpliva na kvaliteto informacij v spektru

7 Elektronska Ionizacija visoka stopnja ionizacije izgine molekularni ion vzorec mora odpareti odparevanje v ionskem izvoru

8 Ionizacija- elektronska

9 Ionizacija- elektronska Katoda žička iz Re ali W - izvor elektronov Tarča: anoda, ki v povezavi s katodo tvori elektrone Odbojna elektroda- repeller potiska pozitivne ione iz izvora Ionske leče: serija negativnih elektrod z naraščajočim negativnim nabojem, ki pospeši ione v masni spektrometer

10 Ionizacija

11 Pospeševanje ionov

12

13 EI spekter etilbenzena pravila fragmentiranjaznačilni odcepi: ali spremenjeni za 2 (-2H), PREMESTITVE heksil m/z 85 pentil 71 butil 57 etil 29 metil 15

14 EI-spekter metilenklorida 35 Cl : 37 Cl = 75:25; 13 C : 12 C=1:100; 79 Br : 81 Br = 1:1

15 Izotopi ogljika 12 C 13 C (1%) Intenziteta M+1 služi za oceno št. C atomov

16 Masni spektrometer identifikacija spojin Na osnovi masnih spektrov- pravila fragmentacije, dušikovo pravilo- vse organske spojine imajo sodo molsko maso, razen če vsebujejo liho število N atomov Primerjava MS s spektri v zbirkah Problemi: prevelika fragmentacija-izgubimo M +, izomeri, čiste spojine Kvantitativna analiza standardi (intenzitete, izotopsko razredčenje) Določanje elementne sestave- HRMS

17 MS Kemijska ionizacija katoda ~100Pa ~10-2 Pa Vzorec : reagentni plin (1:1000) Ionizacija reagentnega plina (CH 4 ) CH 4+, CH 3+ (90%),CH 2 + Pride do prenosa protona (M+1) +, (M-1) + Mehka ionizacija - slabša fragmentacija

18 CI, EI spekter 1-dekanola

19 Ionizacija v tekočinah Ionizacija z razprševanjem pri atmosferskem pritisku (APCI) N 2 + e N e N N 2 N N 2..H 3 O +, H 3 O + (H 2 O) n, H 3 O + (H 2 O) n + M MH + + (n+1) H 2 O Protonirane/deprotonirane molekule Ionizacija z razprševanjem v električnem polju (ESI) Že ioni v raztopinah

20 APCI

21 Ionizacija z razprševanjem v električnem polju (ESI) že ioni v raztopinah Nastanek večkrat nabitih ionov- identifikacija proteinov-proteomika Peptidne karte po razgradnji proteinov

22 Masni analizatorji: Analiza ionov ločevanje ionov po m/z R = m/δ m Identifikacija spojin z enako nominalno maso: C 2 H 4+ (28,0313), CH 2 N + (28,0187), N 2+, CO + m/z = 28 m = 0,0126 R = 28/0,0126 = 2200 visokoločljivostni R 1000 (na magnetni razklon, na osnovi časa preleta ionov) nizkoločljivostni R 1000 (kvadrupolni, na osnovi ionske pasti)

23 Ločjivost analizatorjev

24 Analizatorji na magnetni razklon zev = ½ mv 2 zevb = mv 2 /r r = 1/B x 2mV/ze Težji ioni Lažji ioni

25 Samo ioni s pravim m/z za dano jakost magnetnega polja (B) dosežejo kolektor Umerjanje-kalibracija tuning MS s spojinami z znano fragmentacijo (PFTBA perfluorotributil amin m/z 69,219,502)

26 TOF-ANALIZATOR TOF analizator na osnovi časa preleta ionov ½ mv 2 = zev L = v.t m/z = (2eV/L 2 ) t 2

27 TOF-ANALIZATOR

28 Kvadrupolni masni analizatorji Kompaktni in robustni cenejši hiter čas scaniranja (analize po vseh m/z v izbranem območju) Ločljivost pod 1000, primeren za GC-MS, tudi za LC-MS

29 Detekcija ionov Fotografska plošča Elektronska ali fotoelektronska pomnoževalka Velika ojačitev tokov (10 9 )- merimo tok nekaj ionov ----nizka meja zaznave

30 Uporaba masne spektrometrije v analitiki MS omogoča identifikacijo spojin iz ng količin! Identifikacija spojin z MS v mešanici zelo težavna! Spojina mora biti čista, sicer MS/MS MS SE PREDVSEM UPORABLJA KOT SELEKTIVNI DETEKTOR pri kromatografiji!

31 Detektorji FID,TCD, ECD določanje PCN,PCB, NPD triazini MS nizki LOD za vse spojine (1ng spojine) MS specifični detektor na m/z osnovi, merimo predvsem ione z m/z od 20 do 500 Ionizacija spojin EI (70eV) trda ionizacija - fragmentacija ; lahko izgubimo molekulski ion CI mehka ionizacija tudi za kvantitativno analizo

32 Identifikacija,kvantifikacija z GC-MS Povezava GC s kapilarnimi kolonami (pretok ml/min) brez make up plina enostavna! Izbira nosilnega plina- He? Odstranitev topila solvent delay Kolona direktno v ionizacijsko celico, IZBIRA KOLONE! MSD- TIC (EIC-extracted ion chromatogram) LOD primerljiv z FID (ng) (EI, CI) masni spektri identifikacija Kvantitativna analiza Merjenje toka vseh ionov (TIC) SIM (Selective Ion Monitoring) kvantitativna analiza Uporaba izotopsko označenih spojin kot interni standard NIŽJA LOD!

33 GC-MS

34 GC-MS R.Grob, E.F.Barry, Modern Practice of Gas Chromatography,Wiley 2004

35 Etilkarbamat v alkoholnih pijačah, vinu (MDK 30µg/L) Sadni likerji (400µg/L) EI spekter m/z 74,62,45, 44, 18 IS etil 13 C 15 N karbamat m/z 64

36 Uporaba MS kot detektorji pri HPLC Izbira mobilne faze- samo hlapne sestavine- pufri (amonacetat, trifluorocetna kislina) pretok ml/min Izbira ionizacije (ESI, APCI) predvsem informacijo o protoniranih ali deprotoniranih molekulah m/z Nižja meja zaznave v primerjavi s spektrofotometičnimi detektorji (nekaj 10ng nekaj 0,1ng) Za identifikacijo MS/MS selektivna detekcija z nizko LOD!

37 MS-MS Prekurzorski ion Produktni ion M 1,M 2,M 3 Injektor GC Ionizacija MS

38 MS-MS Različne kombinacije analizatorjev: 3Q Q-TOF (MALDI-Q-TOF) Prvi MS loči molekularne ione mešanice (PREKURZORSKI ION) Ionski izvor drugega MS-kolizijska celica (He, N 2 ), kjer pride do cepitve vezi fragmentacije prekurzorskega iona Drugi MS ločuje fragmente izbranega molekularnega iona Identifikacija spojin! Ni zbirk spektrov!

39 MS-MS SIM MRM (spremljanje specifičnih reakcij) Določanje ClO 3- v vodi (2ppb) 35 ClO 3-35 ClO ClO Cl - m/z =83 m/z = 67 Selektivna detekcija! Določanje polarnih pesticidov v vodah! Ni nujna popolna kromatografska ločitev!

40 Visokoločljivostna masna spektometrija -HRMS Ko določimo natančno maso iščemo pozbirkah možne bruto formule spojin- tudi strukture! Na osnovi lastnosti vezi lahko predvidimo cepitve-fragmente, ki jih lahko potrdimo z MS/MS Lahko določamo tudi natančno maso fragmentov. (ORBITRAP MS/MS n )

41 Visokoločljivostna masna spektometrija -HRMS Določanje formule spojine Posebna kalibracija npr. C 4 F 9 + m/z = 218,9856 Spojina masa C 13 H 20 N 2 O 220,1576 Natančnost masne meritve ± 1ppm V 2 = 4973,15 V V 1 = 5000 V m 1 /m 2 = V 2 /V 1 m 2 = m 1 V 1 /V 2 m 2 = 218,9856 X 5000/4973,1 = =220,1701 C 7 H 20 N 6 O 2 220,1647 C 9 H 22 N 3 O 3 220,1661 C 11 H 24 O 4 220,1674 C 12 H 20 N 4 220,1688 C 14 H 22 NO 220,1702

42 Določanje izotopske sestave Organske spojine pretvorimo v CO 2 in določimo 13 CO 2 / 12 CO 2 Standard CaCO 3 Pee-Dee ( 13 C/ 12 C = 1,12372x10-2 ) Vrednost d 13 C je odvisna od tega, ali gre za C3 fiksacijo ogljika (Calvinov fotosintezni cikel) ali C4 fiksacijo ogljika (Hatch- Slackov cikel) Vrednost d 13 C pri C4 fiksaciji:- 10 (koruza, sladkorni trs) Vrednost d 13 C pri C3 fiksaciji:- 25 Naravni med ima vrednosti d 13 C med :- 27,4 in -22,5 Geografski izvor Izvor rastlin

43 Določanje anorganskih spojin z MS ICP-MS Ali je ta ionizacija tudi primerna za ionizacijo organskih spojin? Določanje izotopske sestave določanje starosti (minerali,dokumenti, umetnine) sledenje izvora (naravni sladkorji v vinu sladkano vino, ponaredki-surogati medu,...) 13 C/ 12 C različno v glukozi glede na biološki cikel sprememba razmerja se uporablja za ugotavljanje izvora Sprememba razmerja tudi za določanje starosti

44 Določanje izotopske sestave Določanje biosintetskih poti Geografski izvor Izvor rastlin Organske spojine pretvorimo v CO 2 in določimo 13 CO 2 / 12 CO 2