Jure Stojan 2. predavanje termodinamične osnove, encimske katalize encimska kataliza časovni potek encimske reakcije začetna hitrost

Transcript

1 FFA: Laboratorijska medicina, Molekularna encimologija, 2010/ predavanje Jure Stojan 2. predavanje termodinamične osnove, encimske katalize encimska kataliza časovni potek encimske reakcije začetna hitrost Matjaž Zorko 3. predavanje vplivi na hitrost encimske reakcije vpliv substrata (Michaelisova kinetika) ravnotežno -stacionarno stanje VPLIV: - koncentracije substrata - koncentracije encima - ph - temperature

2 k A + B C

3 K A B 2 k = RT Nh e G RT * 2

4 Encimska kinetika Obravnava hitrost, s katero se spreminjajo reaktanti (substrati S) v produkte (P): S P Hitrost podaja spremembo koncentracije substrata/produkta v časovni enoti (mol/s) V = -d(s)/dt = d(p)/dt Hitrost encimske reakcije je merilo za aktivnost encima; enote za encimsko aktivnost: U = 1μmol/min ali katal (SI sistem) = 1mol/s Specifična aktivnostencimskega pripravka: aktivnost/mg proteina; enote za specifično aktivnost: μmol/min/mg ali katal/min/mg A B Masa proteinov (vse kroglice) je večja v čaši A kot v čaši B Št. molekul encima (rdeče kroglice) je enako v obeh čašah encimska aktivnost enaka v obeh čašah Encimska aktivnost, izražena na mg proteinov (specifična aktivnost) je večja v čaši B kot v čaši A

5

6 Začetna hitrost in vpliv koncentracije substrata S P v = (P)/ t Koncentracija substrata se s časom zmanjšuje, zato se zmanjšuje tudi hitrost! začetna hitrost (v o ) je hitrost pri t = 0 S 4 > S 3 > S 2 > S 1

7 Če so nanašali v o v diagram v odvisnosti od [S], so dobili krivuljo nasičenja V 0 =k[s] 1 1. order reaction V 0 =k[s] 0 0. order reaction

8 Krivulja nasičenja nasičenje E s S [ E][ S] = K [ ES] [ E] [ ES] s = K S [ S] S E ES

9 Henry (1903) in kasneje Michaelis in Mentenova (1913) so skušali na osnovi ravnotežja najti enačbo za popis eksperimentalno dobljene krivulje. Pogoj: k 2 mora biti zelo majhna (k 2 <<k -1 )! k1[ E][ S] k 1[ ES] = [ E][ S] [ ES] k k = 1 1 = K s Ks je disociacijska konstanta kompleksa ES substratna konstanta!

10 [ E][ S] [ ES] = K s KAJ SKUŠAMO NAREDITI: 1.IZRAZITI [ES], ker v o =k 2 [ES] 2.VPELJATI [E o ], ker je to merljiva količina! [E] = [E o ] [ES] ([ Eo] [ ES])[ S] = K s [ ES] [ ES] = [ Eo][ S] [ S] + K s

11 [ ES] = [ Eo][ S] [ S] + K s pomnožimo s k 2 k 2 k2[ Eo][ S] [ ES] = [ S] + K s upoštevamo: v o =k 2 [ES] v o = k [ 2 Eo][ S] [ S] + K s upoštevamo: V max =k 2 [E o ] v o = V [ S] + max [ S] K s upoštevamo: zato je [S] = [S o ] [S o ]>>[E o ], in v o = V [ S o So] ] + K max [ s

12 v o = V [ S o So] ] + K max [ s POZOR: (E) = konst.! je Michaelis-Mentenova enačba K S = k k 1 1

13 Ker pogoj ravnotežja ni bil v celoti izpolnjen, enačba ni imela splošne veljave veljala je le za omejeno količino encimov! Zato so iskali splošno rešitev. Briggs-Haldanov pristop: STACIONARNO STANJE! OPIŠI RAZLIKO MED RAVNOTEŽNIM IN STACIONARNIM STANJEM!

14 ZAČETNO STANJE RAVNOTEŽNO STANJE Višini vode v sodih sta odvisni od dotoka in iztoka ter debeline prehodne cevi; pri konstantnem dotoku in iztoku se višini ne spreminjata: STACIONARNO STANJE

15 [S] o E+S ES E+P

16 Če je koncentracija ES stalna, mora [ES] enako hitro nastajati kot razpadati! k 1[ E][ S] = k 1[ ES] + k2[ ES] = [ ES]( k 1 + k2) nastajanje ES razpadanje ES razpadanje ES k 1[ E][ S] = [ ES]( k 1 + k2) Podobno kot M.- M. dobimo analogno enačbo, ki pa velja za STACIONARNO STANJE, takorekoč splošno: [ E][ S] [ ES] k + k k = = K M v o = V [ S o So] ] + K max [ M

17 Michaelis Mentenova enačba in krivulja v o V = max K M + [ S] [ S] k 1 + K M = k 1 k 2 Page 479

18 Dvojno recipročni (Lineweaver Burkov) diagram v o = V [ S o So] ] + K max [ M 1 v o = K V M max [ S] Vmax Page

19 KDAJ Michaelis-Mentenova ENAČBA VELJA: 1. KADAR SMO V RAZMERAH ZAČETNE HITROSTI 2. KADAR JE [S]>>[E] 3. KADAR IMAMO LE EN AKTIVNI CENTER ali 4. KADAR JE AKTIVNIH CENTROV VEČ, A SO NEODVISNI PRI KONSTRUKCIJI M.-M. KRIVULJE ALI NJENIH DERIVATOV (L.-B. KRIVULJA) MORAMO DRŽATI [E]O KONSTANTNO!

20 Pomen Km V max, K m določimo eksperimentalno = K S POMNI: - velika K m majhna afiniteta encima do substrata - majhna K m velika afiniteta encima do substrata K m - odraža afiniteto encima do substrata - in tudi fiziološke razmere: K m [S] physiol.

21 K M - odraža afiniteto encima do substrata in nam pove pri katerih koncentracijah substrata bo encim učinkovit!

22 Pomen K M v fiziologiji primer: občutljivost Azijcev na alkohol Japonci in Kitajci dosežejo isti učinek alkohola (vazodilatacija, pospešen ritem srca...) že pri nižji koncentraciji zaužitega alkohola kot Evropejci Reakcije razgradnje alkohola CH 3 CH 2 OH + NAD + CH 3 CHO + H + + NADH encim: alkoholna dehidrogenaza CH 3 CHO + NAD + CH 3 COOH + H + + NADH encim: aldehidna dehidrogenaza Azijci nimajo izoencimske oblike encima aldehidne dehidrogenaze z nizko K M ; posledica: aldehid v krvi dolgo kroži po telesu Izoemcimi: katalizirajo isto reakcijo (isti substrat), različne pa so molekulske lastnosti encimov: različna molekulska masa (M r ), različna encimska aktivnost (V 0 ), različna MM konstanta (K m ); izoencime kodirajo različni geni!

23 k kat k kat = k najpočasnejše stopnje v desno! k kat - pretvorbeno število (turnover number): število molekul (molov) substrata, ki se pretvori v produkt na eni molekuli (molu) encima v časovni enoti (navadno sekundi).

24 Kinetična učinkovitost encimov: pretvorbeno število(turnover number), k kat Zakaj za mero učinkovitosti encima ne uporabljamo V max? Ker je odvisna od koncentracije encima, saj velja enačba: V max =k 2 [E] o

25 k kat /K m v o =k kat [ES] v o = V [ S o So] ] + K max [ M V max =k kat [E] o K M k + k 1 kat = Kadar je k 2 = k kat! k 1

26 Bisubstratne reakcije: Zelo različni mehanizmi! urejen sekvenčni mehanizem: A B P Q A A B B E EA EAB EPQ EQ E naključni sekvenčni mehanizem: A E B E A B P Q EA EQ - EB EABEPQ EP E A A B B B A Q P ping-pong mehanizem: A P B Q A B E - - EA FA F FB EQ E E

27 Ping Pong mehanizem [B] = konstanten.

28 Ping Pong mehanizem [A] = konstanten.

29 Vsi sekvenčni mehanizmi imajo dvojne recipročne diagrame, kjer se premice sekajo.

30 Vpliv koncentracije encima na aktivnost. Dokler velja [S] >> [E] se s povečanjem [E] proporcionalno poveča [ES]. Ker velja enačba v o = k kat [ES], velja linearna zveza med v o in [E]: če se [E] dvakrat poveča, se tudi v o dvakrat poveča. v o [E]

31 Vpliv ph na aktivnost encima(fumaraza). Zelo različne krivulje za različne encime, navadno so v skladu s fiziološkim delovanjem

32 ph profil peptidaze pomen skupin v aktivnem mestu encima in v substratu pk a! KAJ PA POMEN SKUPIN DRUGJE V STRUKTURI ENCIMA?

33 Različni encimi različni ph profili (zaradi različnih disociabilnih skupin v encimu in substratu) pepsin glukoza-6-fosfataza

34 Učinek ph je lahko kompleksen npr. kimotripsin Cumulative ph effect v k K cat M ph affects k cat ph affects K M

35 ph optimum 17β-HSD

36 Krivulji temperaturne in ph odvisnosti sta si podobni ph opt T opt T narašča do T opt : več in močnejši trki, zato hitrost narašča! k v o =k 2 [ES] = RT Nh e G RT * 2 T narašča nad T opt : encim se denaturira, zato hitrost pada! Razpad IV., III. in II. strukture encima, zato encim ni več aktiven!

37 Navidezni temperaturni optimum 17β-HSD

38 Temperaturna stabilnost 17β-HSD

39 Matjaž Zorko 3. predavanje vplivi na hitrost encimske reakcije vpliv substrata (Michaelisova kinetika) ravnotežno - stacionarno stanje VPLIV: - koncentracije substrata - koncentracije encima - ph - temperature Jure Stojan 4. predavanje Inhibicija - aktivacija - modulacija encimske katalize hitre kinetične metode matematično modeliranje - analiza podatkov