Monolisa Total Anti-HAV PLUS 2 Πλακέτες

Transcript

1 Monolisa Total Anti-HAV PLUS 2 Πλακέτες KIT ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΚΑΙ ΤΗΝ ΠΟΣΟΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗ ΟΛΩΝ ΤΩΝ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ ΕΝΑΝΤΙ HAV ΣΕ ΟΡΟ/ΠΛΑΣΜΑ ΜΕ ΑΝΟΣΟΕΝΖΥΜΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ /02

2 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1. ΠΡΟΒΛΕΠΟΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ 2. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΕΞΕΤΑΣΗΣ 3. ΣΥΝΘΕΣΗ ΤΟΥ KIT 4. ΑΠΑΙΤΟΥΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ ΠΟΥ ΔΕΝ ΠΑΡΕΧΟΝΤΑΙ 5. ΟΔΗΓΙΕΣ ΥΓΙΕΙΝΗΣ ΚΑΙ ΑΣΦΑΛΕΙΑΣ 6. ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ 7. ΔΕΙΓΜΑΤΑ 8. ΑΝΑΣΥΣΤΑΣΗ ΤΩΝ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ - ΕΓΚΥΡΟΤΗΤΑ - ΦΥΛΑΞΗ 9. ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΑΝΑΛΥΣΗΣ : ΠΟΙΟΤΙΚΕΣ ΚΑΙ ΠΟΣΟΤΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ 10. ΠΡΟΣΑΡΜΟΓΕΣ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ 11. ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ : ΠΟΙΟΤΙΚΗ ΜΕΘΟΔΟΣ 12. ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ: ΠΟΣΟΤΙΚΗ ΜΕΘΟΔΟΣ 13. ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΗ ΕΠΑΛΗΘΕΥΣΗ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ ΚΑΙ ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ ΜΕ ΠΙΠΕΤΑ (ΠΡΟΑΙΡΕΤΙΚΟ) 14. ΑΠΟΔΟΣΕΙΣ 15. ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΤΗΣ ΕΞΕΤΑΣΗΣ 16. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 2 [GR]

3 1 - ΠΡΟΒΛΕΠΟΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ Το Monolisa Total anti-hav PLUS είναι ένα κιτ ανοσοενζυµικής ανάλυσης για την ανίχνευση και την ποσοτικοποίηση όλων των αντισωµάτων anti-hav στον ανθρώπινο ορό ή στο πλάσµα. Το κιτ αυτό µπορεί να χρησιµοποιηθεί ως βοήθηµα για τη διάγνωση παλαιότερης ή ενεργού λοίµωξης από τον ιό της Ηπατίτιδας Α (HAV). Το κιτ αυτό µπορεί να χρησιµοποιηθεί επίσης για τον προσδιορισµό της ανοσολογικής κατάστασης πριν από τον εµβολιασµό και την εκτίµηση του βαθµού προστασίας µετά τον εµβολιασµό κατά του HAV. Μετά τον εµβολιασµό κατά του HAV, τα αντισώµατα anti-hav µπορούν να ανιχνευθούν µετά από 2 εβδοµάδες περίπου και συνήθως για πολλά έτη. Η συγκέντρωση των 20 miu/ml θεωρείται συνήθως η τιµή κατωφλίου που διασφαλίζει την ανοσία του ασθενή έναντι της λοίµωξης από HAV. Εποµένως, η τυπική µέση απορρόφηση των 20 miu/ml (βάσει του 2ου Διεθνούς Προτύπου για την Ανοσοσφαιρίνη κατά της Ηπατίτιδας Α του Παγκοσµίου Οργανισµού Υγείας, 1998) χρησιµοποιείται ως τιµή αναφοράς. 2 - ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΕΞΕΤΑΣΗΣ Η ανάλυση αυτή είναι µια ανοσοενζυµική ανάλυση αναστολής που βασίζεται στη χρήση µικροπλακών επικαλυµµένων µε µονοκλωνικό αντίσωµα ποντικιού κατά του HAV, αντιγόνου HAV και δείγµατος και στη συνέχεια µε ανιχνευτή ενζύµων που περιέχει µονοκλωνικό αντίσωµα ποντικιού κατά του HAV σηµασµένο µε υπεροξειδάση αγριοραφανίδας. 1. Κατά την πρώτη επώαση, τα δείγµατα (ή οι οροί ελέγχου) και το αντιγόνο HAV επωάζονται µαζί µια για 1 ώρα στους 37 C. Αν στο δείγµα υπάρχουν αντισώµατα κατά του HAV, τα αντισώµατα αυτά σχηµατίζουν ένα σύµπλεγµα µε το αντιδραστήριο του αντιγόνου HAV παρεµποδίζοντας τη δέσµευση του αντιγόνου στα αντισώµατα κατά τη στερεά φάση (Μικροπλάκα). 2. Στο τέλος της πρώτης επώασης, µε ένα βήµα πλυσίµατος αποµακρύνεται αδέσµευτο δείγµα, αδέσµευτο αντιγόνο και διαλυτά συµπλέγµατα HAV/anti- HAV. 3. Ο ανιχνευτής ενζύµων που περιέχει µονοκλωνικό αντίσωµα ποντικιού κατά του HAV σηµασµένο µε υπεροξειδάση αγριοραφανίδας προστίθεται σε κάθε µικροβύθισµα και επωάζεται για 1 ώρα στους 37 C. Η ποσότητα του ανιχνευτή ενζύµων που δεσµεύεται στη στερεά φάση µέσω του αντιγόνου HAV και η επακόλουθη ενζυµική δραστηριότητα είναι αντιστρόφως ανάλογα προς τα αντισώµατα anti-hav που υπάρχουν στο δείγµα ή στον ορό ελέγχου. 4. Το πλεόνασµα ανιχνευτή ενζύµων αποµακρύνεται κατά το βήµα του πλυσίµατος και σε κάθε µικροβύθισµα προστίθεται διάλυµα χρωµογόνου/υποστρώµατος TMB. 5. Μετά από 30 λεπτά επώασης σε θερµοκρασία δωµατίου, η αντίδραση σταµατά και η ερµηνεία εκτελείται µε φασµατοµετρία στα 450/ nm. Η µέτρηση της απορρόφησης για ένα δείγµα επιτρέπει τον προσδιορισµό της παρουσίας ή την ποσοτικοποίηση όλων των αντισωµάτων anti-hav στο υπό εξέταση δείγµα. 3 [GR]

4 3 - ΣΥΝΘΕΣΗ ΤΟΥ KIT Αναγνωριστικά στοιχεία ετικέτας R1 Microplate R2 Concentrated washing solution (20X) R3 Negative control R4 Positive cut-off R5 Positive control R6 Specimen diluent R7 HAV viral antigen R8 Substrate buffer R9 Chomogen: TMB solution (11X) R10 Stopping solution Περιγραφή Μικροπλάκα 12 λωρίδες των 8 µικροβυθισµάτων επικαλυµµένα µε µονοκλωνικά αντισώµατα anti-hav Συµπυκνωµένο διάλυµα έκπλυσης (20X) Ρυθµιστικό διάλυµα Tris NaCl ph 7,4 Συντηρητικό: ProClin 300 (0,04%) Αρνητικός Ορός Ελέγχου Ανθρώπινος ορός, αρνητικός για αντισώµατα anti- HAV, αντιγόνο HBs, αντισώµατα anti-hcv και αντισώµατα anti-hiv 1-2. Συντηρητικό : Αζίδιο του νατρίου (< 0,1%) Θετικό πρότυπο 20 miu/ml Ανθρώπινος ορός, θετικός για αντισώµατα anti- HAV και αρνητικός για αντιγόνο HBs, αντισώµατα anti-hcv και αντισώµατα anti-hiv 1-2, αραιωµένος σε συγκέντρωση ανθρώπινου ορού, αρνητική για αντισώµατα anti-hav. Συντηρητικό : Αζίδιο του νατρίου (< 0,1%) Θετικός Ορός Ελέγχου 80 miu/ml Ανθρώπινος ορός, θετικός για αντισώµατα anti- HAV και αρνητικός για αντιγόνο HBs, αντισώµατα anti-hcv και αντισώµατα anti-hiv 1-2, αραιωµένος σε συγκέντρωση ανθρώπινου ορού, αρνητική για αντισώµατα anti-hav. Συντηρητικό : Αζίδιο του νατρίου (< 0,1%) Ιικό αντιγόνο Ρυθµιστικό διάλυµα Tris που περιέχει πρωτεΐνη, ιό HAV και ενδεικτική χρωστική δείγµατος Συντηρητικό: ProClin 300 (0,1%) Συζεύκτης Ρυθµιστικό διάλυµα Tris που περιέχει πρωτεΐνη, συζεύκτη anti-hav επικαλυµµένο µε υπεροξειδάση και ενδεικτική χρωστική δείγµατος. Συντηρητικό: ProClin 300 (0,1%) Υπόστρωµα Διάλυµα κιτρικού οξέως και οξικού νατρίου, ph 4,0, που περιέχει H 2 O 2 (0,015%) και 4% διµεθυλοσουλφοξειδίου (DMSO) Χρωµογόνο: Διάλυµα TMB Διάλυµα που περιέχει 3,3, 5,5 τετραµεθυλική βενζιδίνη (TMB) Ανασχετικό διάλυµα Διάλυµα θειικού οξέος (H 2 SO 4 1N) Παρουσίαση Προετοιµασία πλάκες 1 φιαλίδιο 235 ml 1 φιαλίδιο 1,5 ml 1 φιαλίδιο 3 ml 1 φιαλίδιο 1 ml 1 φιαλίδιο 28 ml 1 φιαλίδιο 26 ml 1 φιαλίδιο 60 ml 1 φιαλίδιο 5 ml 1 φιαλίδιο 28 ml 4 [GR]

5 4 - ΑΠΑΙΤΟΥΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ ΠΟΥ ΔΕΝ ΠΑΡΕΧΟΝΤΑΙ Αποσταγµένο ή απιονισµένο νερό. Υποχλωριώδες νάτριο (λευκαντικό) και διττανθρακικό νάτριο. Απορροφητικό χαρτί. Γάντια µίας χρήσης. Προστατευτικά γυαλιά. Σωληνάρια µίας χρήσης. Αυτόµατες ή ηµιαυτόµατες, ρυθµιζόµενες ή σταθερές πιπέτες µε δυνατότητα κατανοµής από 50 µl, 80 µl, 100 µl, 200 µl και 1 ml. Βαθµονοµηµένοι κύλινδροι χωρητικότητας 10 ml, 200 ml και 1000 ml. Αναδευτήρας τύπου Vortex. Αυτόµατο*, ηµιαυτόµατο* ή χειροκίνητο σύστηµα πλύσης µικροπλάκας. Υδατόλουτρο ή ξηρός επωαστήρας*, µε θερµοστατική ρύθµιση στους 37 C ± 1 C. Δοχείο για µολυσµένα απορρίµµατα. Συσκευή ανάγνωσης µικροπλάκας * (µε φίλτρα 490,620,450/620 έως 700 nm). (*) Για περισσότερες πληροφορίες σχετικά µε τον εγκεκριµένο εξοπλισµό από τις τεχνικές µας υπηρεσίες, επικοινωνήστε µε τον αντιπρόσωπο της περιοχής σας. 5 - ΟΔΗΓΙΕΣ ΥΓΙΕΙΝΗΣ ΚΑΙ ΑΣΦΑΛΕΙΑΣ Όλα τα αντιδραστήρια που περιέχει το κιτ προορίζονται για «in vitro» διαγνωστική χρήση. Η ονοµασία της εξέτασης καθώς και ο ειδικός αριθµός αναγνώρισης της εξέτασης αναγράφονται στο πλαίσιο κάθε µικροπλάκας τιτλοποίησης. Αυτός ο ειδικός αριθµός αναγνώρισης αναγράφεται, επίσης, και σε κάθε λωρίδα. Monolisa Total anti-hav PLUS : Ειδικός αριθµός αναγνώρισης = 59. Επαληθεύετε τον ειδικό αριθµό αναγνώρισης πριν από τη χρήση. Αν δεν υπάρχει αριθµός αναγνώρισης ή ο αριθµός αναγνώρισης είναι διαφορετικός από αυτόν που αναφέρεται παραπάνω, δεν πρέπει να χρησιµοποιήσετε τη λωρίδα. Κατά το χειρισµό αντιδραστηρίων και δειγµάτων πρέπει να φοράτε γάντια µίας χρήσης και να πλένετε σχολαστικά τα χέρια σας µετά το χειρισµό τους. Μην αναρροφάτε µε πιπέτα από το στόµα. Το υλικό ανθρώπινης προέλευσης που χρησιµοποιήθηκε στην προετοιµασία του αρνητικού ορού ελέγχου (R3), του θετικού ορού ελέγχου (R5) και του θετικού προτύπου 20 miu/ml (R4) εξετάστηκε και βρέθηκε αρνητικό στην παρουσία αντιγόνου επιφανείας της ηπατίτιδας Β (HBs Ag), αντισωµάτων κατά του ιού της ηπατίτιδας C (HCV) και αντισωµάτων κατά του ιού της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας (HIV-1 και HIV-2 Ab). Καθώς καµία γνωστή µέθοδος εξέτασης δεν µπορεί να διασφαλίσει πλήρως την απουσία µολυσµατικών παραγόντων, πρέπει να χειρίζεστε τα αντιδραστήρια και τα δείγµατα ασθενών ως εν δυνάµει µολυσµατικά. Υλικά που έρχονται σε άµεση επαφή µε δείγµατα και αντιδραστήρια ανθρώπινης προέλευσης καθώς και διαλύµατα πλύσης, πρέπει να θεωρούνται µολυσµατικά υλικά. Αποφεύγετε τη διαρροή δειγµάτων ή διαλυµάτων που περιέχουν µολυσµατικά υλικά. Τυχόν κηλίδες πρέπει να καθαρίζονται µε λευκαντικό αραιωµένο κατά 10%. Αν το µολυσµένο υγρό είναι οξύ, οι κηλίδες πρέπει αρχικά να εξουδετερωθούν µε διττανθρακικό νάτριο και, στη συνέχεια, να καθαριστούν µε λευκαντικό και να σκουπιστούν µε απορροφητικό χαρτί. Το υλικό που χρησιµοποιήθηκε για τον καθαρισµό πρέπει να απορρίπτεται σε δοχείο για µολυσµένα απορρίµµατα. 5 [GR]

6 Τα δείγµατα, τα αντιδραστήρια ανθρώπινης προέλευσης, καθώς και τα µολυσµένα υλικά και τα προϊόντα πρέπει να απορρίπτονται µετά την απολύµανση - είτε µε εµβάπτιση σε λευκαντικό τελικής 5% υποχλωριώδους νατρίου (1 όγκος λευκαντικού προς 10 όγκους µολυσµένου υγρού ή νερού) για 30 λεπτά, - είτε µε αποστείρωση σε αυτόκαυστο στους 121 C για τουλάχιστον 2 ώρες. ΠΡΟΣΟΧΗ: ΜΗΝ ΕΙΣΑΓΕΤΕ ΣΤΟ ΑΥΤΟΚΑΥΣΤΟ ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ ΠΟΥ ΠΕΡΙΕΧΟΥΝ ΥΠΟΧΛΩΡΙΩΔΕΣ ΝΑΤΡΙΟ. Αποφεύγετε τυχόν επαφή του δέρµατος και του βλεννογόνου µε το ρυθµιστικό διάλυµα υποστρώµατος, το χρωµογόνο και το διάλυµα αναστολής. Μην παραλείπετε την εξουδετέρωση και/ή αποστείρωση σε αυτόκαυστο των διαλυµάτων ή των αποβλήτων πλύσης ή άλλων υγρών που περιέχουν βιολογικά δείγµατα πριν από την απόρριψή τους στο νεροχύτη. Για συστάσεις αναφορικά µε τους κινδύνους και τις προφυλάξεις που σχετίζονται µε κάποια χηµικά συστατικά αυτού του κιτ εξέτασης, ανατρέξτε στα εικονογραφήµατα που αναφέρονται στις ετικέτες και στις πληροφορίες που παρέχονται στο τέλος των οδηγιών χρήσης. Το Δελτίο Δεδοµένων Ασφαλείας διατίθεται στη διεύθυνση ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ Η ποιότητα των αποτελεσµάτων εξαρτάται από τις παρακάτω ορθές εργαστηριακές πρακτικές : Μη χρησιµοποιείτε αντιδραστήρια που έχουν λήξει. Μην αναµιγνύετε αντιδραστήρια από διαφορετικές παρτίδες σε µία συγκεκριµένη ανάλυση εξέτασης. ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΗ: Για το διάλυµα πλύσης (R2 µε την σήµανση στην ετικέτα 20Χ, πράσινου χρώµατος), το ρυθµιστικό διάλυµα υποστρώµατος υπεροξειδάσης (R8, αναγνώριση ετικέτας : το ρυθµιστικό διάλυµα TMB, µπλε χρώµατος), το χρωµογόνο (R9, αναγνώριση ετικέτας : TMB 11X, µοβ χρώµατος) και το διάλυµα αναστολής (R10, αναγνώριση ετικέτας : 1N κόκκινου χρώµατος) µπορείτε να χρησιµοποιήσετε άλλες παρτίδες από αυτές που περιλαµβάνονται στο κιτ, µε την προϋπόθεση ότι σε µία συγκεκριµένη ανάλυση εξέτασης θα χρησιµοποιηθεί η ίδια παρτίδα. Τα αντιδραστήρια αυτά µπορούν να χρησιµοποιηθούν και µε ορισµένα άλλα προϊόντα της εταιρίας µας. Για περισσότερες πληροφορίες επικοινωνήστε µε την τεχνική υπηρεσία. Επιπλέον, το ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης (R2 µε την σήµανση στην ετικέτα 20Χ, πράσινου χρώµατος) µπορεί να παρασκευασθεί µε ανάµιξη µε τα άλλα 2 ρυθµιστικά διαλύµατα πλύσης που περιέχονται στις συσκευασίες διαφορετικών αντιδραστηρίων της εταιρείας Bio-Rad (R2 µε την σήµανση στην ετικέτα 10Χ, µπλέ χρώµατος ή 10Χ, πορτοκαλί χρώµατος) όταν πραγµατοποιείται σωστή ανασύσταση, παρέχοντας όµοια συγκέντρωση του υλικού σε κάθε κύκλο αναλύσεων. Πριν από τη χρήση, περιµένετε 30 λεπτά µέχρι να σταθεροποιηθούν τα αντιδραστήρια σε θερµοκρασία δωµατίου. Ανασυστήστε προσεκτικά τα αντιδραστήρια αποφεύγοντας τυχόν µόλυνση. Μην εκτελείτε την εξέταση παρουσία δραστικών αερίων (οξέων, αλκαλίων, αλδεϋδών) ή σκόνης που θα µπορούσαν να επηρεάσουν την ενζυµική δραστηριότητα του συζεύκτη. Χρησιµοποιείτε υλικά από γυαλί, που έχουν πλυθεί και ξεπλυθεί σχολαστικά µε απιονισµένο νερό, ή κατά προτίµηση υλικά µίας χρήσης. Μην αφήνετε τη µικροπλάκα να στεγνώσει στο διάστηµα από το τέλος της πλύσης και µέχρι την κατανοµή των αντιδραστηρίων. 6 [GR]

7 Η ενζυµική αντίδραση είναι πολύ ευαίσθητη σε οποιοδήποτε µέταλλο ή µεταλλικό ιόν. Εποµένως, κανένα µεταλλικό στοιχείο δεν πρέπει να έρχεται σε επαφή µε διαλύµατα που περιέχουν διάλυµα συζεύκτη ή υποστρώµατος. Το διάλυµα ανάπτυξης (ρυθµιστικό διάλυµα υποστρώµατος + χρωµογόνο) πρέπει να έχει ροζ χρώµα. Η µεταβολή του ροζ χρώµατος εντός µερικών λεπτών µετά την ανασύσταση υποδεικνύει ότι το αντιδραστήριο δεν µπορεί να χρησιµοποιηθεί και πρέπει να αντικατασταθεί. Η προετοιµασία του διαλύµατος ανάπτυξης µπορεί να γίνει σε καθαρό πλαστικό δίσκο µίας χρήσης ή σε γυάλινο δοχείο που έχει προηγουµένως πλυθεί µε 1N HCl, ξεπλυθεί σχολαστικά µε αποσταγµένο νερό και στεγνώσει. Το αντιδραστήριο αυτό πρέπει να φυλάσσεται σε σκοτεινό µέρος. Για κάθε ορό χρησιµοποιείτε νέο ακροφύσιο κατανοµής. Η πλύση των µικροβυθισµάτων αποτελεί ιδιαίτερα σηµαντικό στάδιο σε αυτήν τη διαδικασία: Τηρείτε το συνιστώµενο αριθµό κύκλων πλύσης και να βεβαιώνεστε ότι όλα τα µικροβυθίσµατα είναι πλήρως γεµάτα και, στη συνέχεια, άδεια. Η εσφαλµένη πλύση ενδέχεται να οδηγήσει σε ανακριβή αποτελέσµατα. Μη χρησιµοποιείτε ποτέ το ίδιο δοχείο για την κατανοµή του συζεύκτη και του διαλύµατος ανάπτυξης. 7 - ΔΕΙΓΜΑΤΑ Συλλέξτε ένα δείγµα αίµατος σύµφωνα µε τη συνήθη πρακτική. Η εξέταση θα πρέπει να εκτελείται σε µη αραιωµένο ορό ή πλάσµα (που έχει συλλεχθεί σε αντιπηκτικά µε βάση EDTA, κιτρικό οξύ, ACD και αντιπηκτικά µε βάση την ηπαρίνη). Τα δείγµατα που περιέχουν συσσωµατώµατα πρέπει να διαλύονται µε φυγοκέντριση πριν από την εξέταση. Τα εναιωρήµατα συσσωµατωµάτων ινώδους ή σωµατιδίων ενδέχεται να προκαλέσουν ψευδώς θετικά αποτελέσµατα. Τα δείγµατα θα πρέπει να αποθηκεύονται στους +2-8 C, εφόσον η ανίχνευση πρόκειται να εκτελεστεί εντός 7 ηµερών ή να καταψύχονται στους -20 C. Αποφύγετε την επανειληµµένη ψύξη/απόψυξη. Σε περίπτωση µεταφοράς των δειγµάτων, συσκευάστε τα δείγµατα σύµφωνα µε τους κανονισµούς σχετικά τη µεταφορά αιτιολογικών παραγόντων, κατά προτίµηση κατεψυγµένα. ΜΗ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΕΙΤΕ ΜΟΛΥΣΜΕΝΟΥΣ, ΥΠΕΡΛΙΠΑΙΜΙΚΟΥΣ Ή ΥΠΕΡΑΙΜΟΛΥΤΙΚΟΥΣ ΟΡΟΥΣ. Παρατήρηση: Τα δείγµατα που περιέχουν έως και 60 g/l λευκωµατίνης και 100 mg/l χολερυθρίνης, τα λιπαιµικά δείγµατα που περιέχουν έως και 36 g/l τριελαΐνης και τα αιµολυµένα δείγµατα που περιέχουν έως και 5 g/l αιµοσφαιρίνης δεν επηρεάζουν τα αποτελέσµατα. Τα θετικά και αρνητικά δείγµατα για αντισώµατα κατά του ιού της ηπατίτιδας Α (HAV) εξετάστηκαν πριν και µετά από 3 κύκλους ψύξης/απόψυξης. Η επεξεργασία αυτή δεν επηρεάζει την ανίχνευση αντισωµάτων. 7 [GR]

8 8 - ΑΝΑΣΥΣΤΑΣΗ ΤΩΝ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ - ΕΓΚΥΡΟΤΗΤΑ - ΦΥΛΑΞΗ Πριν από τη χρήση των αντιδραστηρίων του κιτ ανάλυσης Monolisa Total anti- HAV PLUS, αφήστε τα αντιδραστήρια να σταθεροποιηθούν σε θερµοκρασία δωµατίου για 30 λεπτά. 1) Αντιδραστήρια έτοιµα για χρήση Μικροπλάκα (R1) Κάθε µικροπλάκα που περιέχει 12 ταινίες είναι πακεταρισµένη σε µία συσκευασία αεροστεγώς κλεισµένη. Ανοίξτε την συσκευασία µε ψαλίδι κόβωντας 0,5 εώς 1 εκατοστό. Ανοίξτε την συσκευασία καιαφαιρέστε την µικροπλάκα. Επανατοποθετήστε τις µη χρησιµοποιηµένες ταινίες µέσα στην συσκευασία. Κλείστε προσεκτικά την συσκευασία και τοποθετήστε την στο ψυγείο στους +2-8 C. Αρνητικός Ορός Ελέγχου (R3) Θετικό πρότυπο 20 miu/ml (R4) Θετικός Ορός Ελέγχου (R5) Ιικό αντιγόνο (R6) Συζεύκτης (R7) Οµογενοποιήστε το αντιδραστήριο πριν από τη χρήση. 2) Αντιδραστήρια προς ανασύσταση Διάλυµα πλύσης (20X): R2 Αραιώστε το διάλυµα πλύσης R2 µε αποσταγµένο νερό σε αναλογία 1:20. Οµογενοποιήστε το διάλυµα. Ετοιµάστε 800 ml για µία µικροπλάκα των 12 ταινιών. Διάλυµα ανάπτυξης (R8 + R9) Αραιώστε το αντιδραστήριο (R9) χρησιµοποιώντας το αντιδραστήριο R8 µε αναλογία 1:11 (παράδειγµα : 1 ml αντιδραστηρίου R9 µε 10 ml αντιδραστηρίου R8). Για 1 έως 12 λωρίδες απαιτούνται και επαρκούν 10 ml. Οµογενοποιήστε το διάλυµα. 3) Αντιδραστήρια προς αραίωση για ποσοτική εξέταση Για την ποσοτική εξέταση, προετοιµάστε σηµεία εύρους 40 και 10 miu/ml µε διάλυµα R4 και R5 σε R3 σε αναλογία 1:2. Το εύρος βαθµονόµησης θα αποτελείται από τα ακόλουθα σηµεία: Cal 80 = 80 miu/ml βαθµονοµητής = R5 Cal 40 = 40 miu/ml βαθµονοµητής = R5 ½ αραίωση σε R3 ( µl) Cal 20 = Θετικό πρότυπο 20 miu/ml = R4 Cal 10 = 10 miu/ml βαθµονοµητής = R4 ½ αραίωση σε R3 ( µl) Cal 0 = 0 miu/ml βαθµονοµητής = R3 4) Εγκυρότητα - Φύλαξη Η συσκευασία πρέπει να αποθηκεύεται στους +2-8 C. Όταν συντηρείται σε αυτή την θερµοκρασία, κάθε αντιδραστήριο που περιέχεται µέσα στην συσκευασία µπορεί να χρησιµοποιηθεί µέχρι την αναγραφόµενη πάνω στην συσκευασία ηµεροµηνία λήξης (εκτός εάν υπάρχουν συγκεκριµένες οδηγίες). R1: Μετά το άνοιγµα, τα βοθρία διατηρούνται στο αρχικό σακουλάκι τους, το οποίο πρέπει να κλείνετε προσεκτικά και να φυλάοσνται σε θερµοκρασία +2 έως 8 C, ενώ µπορούν να χρησιµοποιηθούν για 4 εβδοµάδες. R2: Το ανασυστηµένο ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης µπορεί να αποθηκευθεί στους +2-8 C για 2 εβδοµάδες. Το συµπυκνωµένο ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης (R2) µπορεί να αποθηκευθεί στους C. R8 + R9: Μετά την ανασύσταση, το αντιδραστήριο αποθηκευµένο στο σκοτάδι µπορεί να χρησιµοποιηθεί για 6 ώρες σε θερµοκρασία περιβάλλοντος. 8 [GR]

9 9 - ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΑΝΑΛΥΣΗΣ Τηρείτε αυστηρά το πρωτόκολλο. Χρησιµοποιείτε αρνητικούς και θετικούς ορούς ελέγχου για κάθε εξέταση, προκειµένου να εξασφαλίσετε την ποιότητα της εξέτασης. Εφαρµόστε την ορθή εργαστηριακή πρακτική. Μέθοδοι 1) Καθορίστε προσεκτικά την κατανοµή δείγµατος και τον τρόπο ταυτοποίησης. 2) Προετοιµάστε το αραιωµένο διάλυµα πλύσης (αραιωµένο R2) και το θετικό ορό ελέγχου του αντιγόνου εργασίας (R5a + R5B) 3) Αφαιρέστε την προστατευτική σακούλα του πλαισίου µικροπλάκας και των λωρίδων (R1). 4) Προσθέστε αµέσως και διαδοχικά, χωρίς πρόπλυση της µικροπλάκας, τα εξής : µl ιικού αντιγόνου (R6) σε κάθε µικροβύθισµα Για ποιοτική ανάλυση 50 µl αρνητικού ορού ελέγχου (R3) στο µικροβύθισµα Α1, 50 µl Θετικού Ορού 20 miu/ml (R4) στο µικροβύθισµα B1,C1, D1, 50 µl θετικού βαθµονοµητή (R5) στο µικροβύθισµα E 1, 50 µl δείγµατος 1 στο µικροβύθισµα F1, 50 µl δείγµατος 2 στο µικροβύθισµα G1, κλπ... Για ποσοτική ανάλυση 50 µl of CAL 0 στο µικροβύθισµα A1, B1 50 µl CAL 10 miu/ml στο µικροβύθισµα C1, D1 50 µl CAL 20 miu/ml στο µικροβύθισµα E1, F1 50 µl CAL 40 miu/ml στο µικροβύθισµα G1, H1 50 µl CAL 80 miu/ml στο µικροβύθισµα A2, B2 50 µl δείγµατος 1 καθαρού ή αραιωµένου στο µικροβύθισµα C2 50 µl δείγµατος 2 στο µικροβύθισµα D2, κλπ... Τα δείγµατα µπορούν να αραιωθούν µε αρνητικό ορό ελέγχου R3 (Cal 0mIU/ml). Αν η κατανοµή δειγµάτων υπερβαίνει τα 10 λεπτά, συνιστάται η κατανοµή των αρνητικών και θετικών ορών ελέγχου µετά τα δείγµατα. Σύµφωνα µε το σύστηµα που χρησιµοποιείτε, µπορείτε να αλλάξετε τη θέση των ορών ελέγχου. ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΗ: Μετά την προσθήκη του δείγµατος, το χρώµα των µικροβυθισµάτων που περιέχουν διάλυµα ιικού αντιγόνου (R6) και δείγµα ή ορούς ελέγχου µετατρέπεται από κόκκινο σε πορτοκαλί. Μπορείτε να επαληθεύσετε την παρουσία δείγµατος στα µικροβυθίσµατα βάσει της φασµατοφωτοµετρικής ένδειξης στα 490 nm (ένα µήκος κύµατος). Ανατρέξτε στην ενότητα 13 : ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΗ ΕΠΑΛΗΘΕΥΣΗ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ ΚΑΙ ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ ΜΕ ΠΙΠΕΤΑ. 5) Όταν είναι δυνατό, καλύψτε τη µικροπλάκα µε αυτοκόλλητη µεµβράνη. Πιέστε σταθερά περιµετρικά της πλάκας για να διασφαλιστεί η στεγανή σφράγιση. 6) Επωάστε τη µικροπλάκα σε υδατόλουτρο που ελέγχεται από θερµοστάτη ή επωαστή µικροπλάκας για 60 ± 5 λεπτά στους 37 C ± 1 C. 9 [GR]

10 7) Αφαιρέστε την αυτοκόλλητη µεµβράνη. Αναρροφήστε το περιεχόµενο όλων των µικροβυθισµάτων σε ένα δοχείο για βιολογικά επικίνδυνα απόβλητα. Προσθέστε σε κάθε µικροβύθισµα τουλάχιστον 370 µl διαλύµατος πλύσης. Αφήστε να περάσουν τουλάχιστον 30 δευτερόλεπτα µέχρι να διαποτιστεί. Αναρροφήστε ξανά. Επαναλάβετε τη διαδικασία τουλάχιστον δύο φορές (δηλ. τουλάχιστον 3 πλύσεις συνολικά). Ο υπολειπόµενος όγκος πρέπει να είναι µικρότερος από 10 µl (αν είναι απαραίτητο, στεγνώστε την πλάκα αναποδογυρίζοντάς την πάνω σε απορροφητικό χαρτί). Σε περίπτωση που χρησιµοποιείτε αυτόµατη συσκευή πλύσης, ακολουθήστε την ίδια διαδικασία. 8) Διοχετεύστε αµέσως 100 µl διαλύµατος συζεύκτη (R7) σε όλα τα µικροβυθίσµατα. Ο συζεύκτης πρέπει να αναδεύεται πριν από τη χρήση. Όταν είναι δυνατό, καλύψτε τη µικροπλάκα µε νέα αυτοκόλλητη µεµβράνη και επωάστε για 60 ± 5 λεπτά στους 37 C ± 1 C. ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΗ: Η κατανοµή του διαλύµατος συζεύκτη, το οποίο έχει µοβ χρώµα, µπορεί να ελεγχθεί οπτικά σε αυτό το βήµα της διαδικασίας βάσει της φασµατοφωτοµετρικής ένδειξης στα 620 nm (Ανατρέξτε στην ενότητα 12 : ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΗ ΕΠΑΛΗΘΕΥΣΗ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ ΚΑΙ ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ ΜΕ ΠΙΠΕΤΑ). 9) Αφαιρέστε την αυτοκόλλητη µεµβράνη, αδειάστε όλα τα µικροβυθίσµατα µε αναρρόφηση και εκτελέστε τη διαδικασία πλύσης τουλάχιστον 4 φορές όπως περιγράφεται παραπάνω. 10) Προετοιµάστε το διάλυµα ανάπτυξης (Ανατρέξτε στην ενότητα 8 : ΑΝΑΣΥΣΤΑΣΗ ΤΩΝ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ). 11) Διοχετεύστε αµέσως 80 µl παρασκευασµένου διαλύµατος υποστρώµατος (R8 + R9) σε όλα τα µικροβυθίσµατα. Αφήστε την αντίδραση να πραγµατοποιηθεί σε σκοτεινό µέρος για 30 ± 5 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου (18-30 C). Μη χρησιµοποιείτε αυτοκόλλητη µεµβράνη κατά τη διάρκεια της συγκεκριµένης επώασης. ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΗ: Η κατανοµή του διαλύµατος ανάπτυξης, το οποίο έχει ροζ χρώµα, µπορεί να ελεγχθεί οπτικά σε αυτό το βήµα της διαδικασίας: υπάρχει σαφής διαφορά στο χρώµα των κενών µικροβυθισµάτων και των µικροβυθισµάτων που περιέχουν το ροζ διάλυµα υποστρώµατος (Ανατρέξτε στην ενότητα13: ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΗ ΕΠΑΛΗΘΕΥΣΗ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ ΚΑΙ ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ ΜΕ ΠΙΠΕΤΑ). 12) Προσθέστε 100 µl διαλύµατος αναστολής (R10) χρησιµοποιώντας την ίδια ακολουθία και συχνότητα κατανοµής που χρησιµοποιήσατε για το διάλυµα υποστρώµατος. ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΗ: Η κατανοµή του διαλύµατος αναστολής, το οποίο είναι άχρωµο, µπορεί να ελεγχθεί οπτικά σε αυτό το βήµα της διαδικασίας. Μετά την προσθήκη του διαλύµατος αναστολής, το χρώµα του υποστρώµατος, ροζ (για τα αρνητικά δείγµατα) ή µπλε (για τα θετικά δείγµατα), εξαφανίζεται για τα αρνητικά δείγµατα ή µετατρέπεται από µπλε σε κίτρινο για τα θετικά δείγµατα. 13) Σκουπίστε προσεκτικά το κάτω µέρος της πλάκας. Τουλάχιστον 4 λεπτά µετά την προσθήκη του διαλύµατος αναστολής και εντός 30 λεπτών από τη διακοπή της αντίδρασης, διαβάστε την οπτική πυκνότητα στα 450/ nm χρησιµοποιώντας µια συσκευή ανάγνωσης πλάκας. 14) Πριν καταγράψετε τα αποτελέσµατα, ελέγξτε την αντιστοιχία µεταξύ της ένδειξης και του διαγράµµατος κατανοµής και ταυτοποίησης πλακών και δειγµάτων. 10 [GR]

11 10 - ΠΡΟΣΑΡΜΟΓΗ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ ΠΛΥΣΗ: Ακολουθήστε µε προσοχή τις διαδικασίες πλύσης που περιγράφονται για µέγιστη απόδοση της εξέτασης. Για ορισµένα συστήµατα, µπορεί να χρειαστεί να προσαρµόσετε τον αριθµό των κύκλων πλύσης και των όγκων διαλύµατος πλύσης, ώστε να επιτευχθούν τα αποδεκτά κριτήρια εγκυρότητας ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ: ΠΟΙΟΤΙΚΗ ΜΕΘΟΔΟΣ Η παρουσία ή απουσία ανιχνεύσιµων αντισωµάτων κατά του HAV προσδιορίζεται µε σύγκριση της απορρόφησης που µετράται για κάθε δείγµα µε την υπολογισµένη τιµή αναφοράς. 1. Υπολογίστε τη µέση απορρόφηση του θετικού προτύπου 20 miu/ml (R4) Παράδειγµα : Θετικό πρότυπο 20 miu/ml (R4) Μικροβυθίσµατα Οπτική πυκνότητα B1 0,689 C1 0,673 D1 0,680 Συνολικό OD 2,042 Συνολική οπτική πυκνότητα 2,042 Μέση τιµή OD R4 = = = 0, Υπολογίστε το λόγο για κάθε δείγµα Λόγος δείγµατος = Μέση τιµή OD R4 / OD Δείγµατος 3. Τα κριτήρια εγκυρότητας είναι τα εξής α) Για αρνητικό ορό ελέγχου R3 : η µετρηµένη τιµή απορρόφησης πρέπει να είναι µεγαλύτερη από 1,0. β) Για Θετικό πρότυπο 20 miu/ml R4 : για κάθε R4, η µετρηµένη τιµή απορρόφησης πρέπει να είναι µεγαλύτερη από 0,350. Αν µία από τις µεµονωµένες τιµές θετικού προτύπου 20 miu/ml διαφέρει πάνω από 30% από τη µέση τιµή, αγνοήστε την και εκτελέστε ξανά τον υπολογισµό µε τις δύο υπόλοιπες τιµές θετικού προτύπου 20 miu/ml. Η µέση µετρηµένη τιµή απορρόφησης του θετικού προτύπου 20 miu/ml προς τη µετρηµένη τιµή απορρόφησης του αρνητικού ορού ελέγχου (Μέση τιµή OD R4 / OD R3) πρέπει να είναι µικρότερη από 0,6. γ) Για θετικό ορό ελέγχου R5 : η µετρηµένη τιµή απορρόφησης πρέπει να είναι µικρότερη από 0,300. Η τιµή του λόγου θετικού ορού ελέγχου (Λόγος R5 = Μέση τιµή OD R4 / OD R5) πρέπει να είναι µεγαλύτερη από 1,5. Η εξέταση ακυρώνεται αν δεν πληρείται ένα από τα παραπάνω κριτήρια. 4. Ερµηνεία αποτελεσµάτων Τα δείγµατα µε τιµή λόγου µικρότερη από 0,9 θεωρούνται αρνητικά µε την εξέταση Monolisa Total anti-hav PLUS. Τα δείγµατα µε τιµή λόγου µεγαλύτερη ή ίση µε 1,1 θεωρούνται θετικά µε την εξέταση Monolisa Total anti-hav PLUS. Τα δείγµατα µε τιµή λόγου µεγαλύτερη ή ίση µε 0,9 και µικρότερη από 1,1 θα πρέπει να επανεξετάζονται εις απλούν πριν από την τελική ερµηνεία. 11 [GR]

12 Μετά την επανεξέταση, το δείγµα θεωρείται θετικό µε την εξέταση Monolisa Total Anti-HAV PLUS, αν η τιµή λόγου είναι µεγαλύτερη ή ίση µε 1,1. Το δείγµα θεωρείται αρνητικό αν η τιµή λόγου είναι µικρότερη από 0,9. Αν η τιµή λόγου είναι µεγαλύτερη ή ίση µε 0,9 και µικρότερη από 1,1 δεν είναι δυνατή η ερµηνεία του δείγµατος και θα πρέπει να γίνει εξέταση του επόµενου δείγµατος ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ: ΠΟΣΟΤΙΚΗ ΜΕΘΟΔΟΣ 1. Υπολογίστε τη µέση τιµή απορρόφησης για κάθε βαθµονοµητή Παράδειγµα : CAL 40 miu/ml Μικροβυθίσµατα Οπτική πυκνότητα G1 0,295 H Συνολικό OD 0,587 Συνολική οπτική πυκνότητα 0,587 Μέση τιµή OD cal 40 mui/ml = = = 0, Τα κριτήρια εγκυρότητας είναι τα εξής a) Για αρνητικό ορό ελέγχου R3 (Cal 0 miu/ml): Η µετρηµένη τιµή απορρόφησης για κάθε αρνητικό ορό ελέγχου R3 πρέπει να είναι µεγαλύτερη από 1,0. β) Για θετικό βαθµονοµητή R4 (Cal 20 miu/ml): Η µετρηµένη τιµή απορρόφησης για κάθε R4 πρέπει να είναι µεγαλύτερη από 0,350. Η µέση µετρηµένη τιµή απορρόφησης του θετικού προτύπου 20 miu/ml προς τη µετρηµένη τιµή απορρόφησης του αρνητικού ορού ελέγχου (Μέση τιµή OD R4 / Μέση τιµή OD R3) πρέπει να είναι µικρότερη από 0,6. γ) Για θετικό ορό ελέγχου R5 (Cal 80 miu/ml): Η µετρηµένη τιµή απορρόφησης για κάθε θετικό ορό ελέγχου R5 πρέπει να είναι µικρότερη από 0,300. Η τιµή του λόγου θετικού ορού ελέγχου (R5) (Μέση τιµή OD R4 / Μέση τιµή OD R5) πρέπει να είναι µεγαλύτερη από 1,5. δ) Μέση τιµή OD Cal 0 > Μέση τιµή OD Cal 10 miu /ml Μέση τιµή OD Cal 10 > Μέση τιµή OD Cal 20 miu /ml Μέση τιµή OD Cal 20 > Μέση τιµή OD Cal 40 miu /ml Μέση τιµή OD Cal 40 > Μέση τιµή OD Cal 80 miu /ml Η εξέταση ακυρώνεται αν δεν πληρείται ένα από τα παραπάνω κριτήρια. 3. Ερµηνεία αποτελεσµάτων Η οπτική πυκνότητα κάθε σηµείου εύρους σχεδιάζεται, σηµείο προς σηµείο στον άξονα x, ως προς την καθορισµένη συγκέντρωση αντισωµάτων κατά του HAV που εκφράζεται σε miu/ml στον άξονα y. Η συγκέντρωση κάθε δείγµατος σε αντισώµατα κατά του HAV (miu/ml) µπορεί να προσδιοριστεί µε καταγραφή του OD του δείγµατος στον άξονα x και επισήµανση του σηµείου διατοµής του στον άξονα y. Διαβάστε τις συγκεντρώσεις στο γράφηµα για τα υπό εξέταση δείγµατα. Αν το δείγµα έχει αραιωθεί, πολλαπλασιάστε τη ληφθείσα συγκέντρωση µε το συντελεστή αραίωσης. 12 [GR]

13 Τα δείγµατα µε συγκέντρωση µικρότερη από 18 miu/ml θεωρούνται αρνητικά µε την εξέταση Monolisa Total Anti - HAV Plus. Τα δείγµατα µε συγκέντρωση µεγαλύτερη ή ίση µε 22 miu/ml θεωρούνται θετικά µε την εξέταση Monolisa Total anti-hav PLUS. Τα δείγµατα µε συγκέντρωση µεγαλύτερη ή ίση µε 18 miu/ml και µικρότερη από 22 miu/ml πρέπει να επανεξετάζονται εις απλούν πριν από την τελική ερµηνεία. Μετά την επανεξέταση, το δείγµα θεωρείται αρνητικό µε την εξέταση Monolisa Total anti-hav PLUS αν η συγκέντρωση είναι µικρότερη από 18 miu/ml. Tο δείγµα θεωρείται θετικό αν η συγκέντρωση είναι µεγαλύτερη ή ίση µε 22 mui/ml. Αν η συγκέντρωση του επανεξεταζόµενου δείγµατος είναι µεγαλύτερη ή ίση µε 18 miu/ml και µικρότερη από 22 miu/ml, δεν είναι δυνατή η ερµηνεία του δείγµατος και πρέπει να γίνει εξέταση του επόµενου δείγµατος ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΗ ΕΠΑΛΗΘΕΥΣΗ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ ΚΑΙ ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ ΜΕ ΠΙΠΕΤΑ (ΠΡΟΑΙΡΕΤΙΚΟ) ΕΠΑΛΗΘΕΥΣΗ ΙΙΚΟΥ ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ (R6) ΚΑΙ ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ ΜΕ ΠΙΠΕΤΑ Η παρουσία δείγµατος και διαλύµατος ιικού αντιγόνου (R6) στο µικροβύθισµα µπορεί να επαληθευτεί βάσει της φασµατοφωτοµετρικής ένδειξης στα 490 nm: η τιµή OD κάθε µικροβυθίσµατος που περιέχει ιικό αντιγόνο (R6) πρέπει να είναι µεγαλύτερη ή ίση µε 0,500. Μετά την προσθήκη δείγµατος, η αύξηση της τιµής OD κάθε µικροβυθίσµατος πρέπει να είναι τουλάχιστον ίση µε 0,100. Η επαλήθευση της µεταφοράς του δείγµατος µε πιπέτα δεν µπορεί να χρησιµοποιηθεί σε περίπτωση οµογενοποίησης του R6 µε δείγµα. ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΗ: Μετά την προσθήκη του δείγµατος, το χρώµα του διαλύµατος ιικού αντιγόνου R6 µετατρέπεται από κόκκινο σε πορτοκαλί. ΕΠΑΛΗΘΕΥΣΗ ΜΕΤΑΦΟΡΑΣ ΤΟΥ ΣΥΖΕΥΚΤΗ (R7) ΜΕ ΠΙΠΕΤΑ Η παρουσία συζεύκτη (R7) στο µικροβύθµισµα µπορεί να επαληθευτεί βάσει της φασµατοφωτοµετρικής ένδειξης στα 620 nm: η τιµή OD κάθε µικροβυθίσµατος πρέπει να είναι µεγαλύτερη ή ίση µε 0,500. ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΗ: το χρώµα του συζεύκτη R7 είναι µοβ. ΕΠΑΛΗΘΕΥΣΗ ΜΕΤΑΦΟΡΑΣ ΤΟΥ ΔΙΑΛΥΜΑΤΟΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ (R8 + R9) ΜΕ ΠΙΠΕΤΑ Η παρουσία του διαλύµατος ανάπτυξης (R8 + R9) στο µικροβύθµισµα µπορεί να επαληθευτεί βάσει της φασµατοφωτοµετρικής ένδειξης στα 490 nm: η τιµή OD κάθε µικροβυθίσµατος πρέπει να είναι µεγαλύτερη ή ίση µε 0,100 (µικρότερη τιµή OD υποδεικνύει ανεπαρκή κατανοµή του διαλύµατος ανάπτυξης). ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΗ: Μετά την προσθήκη του διαλύµατος ανάπτυξης παρατηρείται σηµαντική αλλαγή στο χρώµα των κενών µικροβυθισµάτων από άχρωµα σε ροζ ΑΠΟΔΟΣΕΙΣ ΤΗΣ ΕΞΕΤΑΣΗΣ Η απόδοση της εξέτασης Monolisa Total anti-hav PLUS καθορίστηκε σε τρεις τοποθεσίες µε εξέταση δειγµάτων από τυχαίους δότες αίµατος µε λοίµωξη από HAV, πίνακες του εµπορίου, πίνακες οροµετατροπής και πίνακες παρακολούθησης εµβολιασµού. 13 [GR]

14 A - Ειδικότητα Η ειδικότητα σε 561 τυχαίους δότες αίµατος βρέθηκε ότι ήταν 100% [99, %] (IC 95), 561/561. Επιπλέον, εξετάστηκαν 700 δείγµατα ασθενών (κατεψυγµένα και µη). Η ειδικότητα βρέθηκε ότι ήταν 100% [99,57%-100%] (IC 95), 700/700. Εξετάστηκαν 192 ασθενείς µε διαφορετικές παθολογίες ή καταστάσεις που δεν συνδέονταν µε την ηπατίτιδα Α (έγκυες γυναίκες, ρευµατοειδής παράγοντας, αντιπυρηνικά αντισώµατα, αντισώµατα ποντικού Ig ή άλλες ιικές και βακτηριδιακές λοιµώξεις) παράλληλα µε µια εξέταση EIA του εµπορίου. Η συµφωνία µεταξύ αυτών των 2 εξετάσεων ήταν 99,48 % (191/192). Η ειδικότητα βρέθηκε επίσης ότι ήταν 100% (95/95). Ένα δείγµα εµβολίου γρίπης που βρέθηκε θετικό µε µια εναλλακτική εξέταση EIA του εµπορίου, βρέθηκε αρνητικό µε την εξέταση Monolisa Total anti HAV PLUS. B - Ευαισθησία Οι µελέτες σχετικά µε την ευαισθησία διεξήχθησαν σε 424 θετικά δείγµατα δοτών αίµατος και 1274 θετικά δείγµατα από 3 διαφορετικές τοποθεσίες. Συνολικά µε την εξέταση Monolisa Total anti-hav PLUS εξετάστηκαν 1698 δείγµατα και συγκρίθηκαν µε µια εξέταση EIA του εµπορίου. Η ευαισθησία βρέθηκε ίση µε 100%, ανεξάρτητα από το αν επρόκειτο για δείγµα δότη αίµατος ή ασθενή. Μελετήθηκαν και συγκρίθηκαν επίσης µε µια εξέταση EIA του εµπορίου 3 πίνακες οροµετατροπής HAV του εµπορίου και 12 πίνακες παρακολούθησης εµβολιασµού. Η συµφωνία µεταξύ των 2 εξετάσεων ήταν 100%. Γ. Ακρίβεια Ποσοτικά αποτελέσµατα δίνονται σε miu/ml και καλιµπράρονται σύµφωνα µε τα Διεθνή Πρότυπα Αντι-Ηepatitis A Immunoglobulin, Μελέτη συσχέτισης έχει πραγµατοποιηθεί µε την χρησιµοποίηση διαφορετικών συγκεντρώσεων 0, 10, 20, 40, 80 miu/ml που έχουν αποκτηθεί σύµφωνα µε τα διεθνή πρότυπα του οργανισµού WHO έναντι των εσωτερικών βαθµονοµητών. Ο συντελεστής συσχέτισης και η κλίση της αποκτηθείσας γραµµής είναι 0.98 και 1.04 αντίστοιχα. Γ Αναπαραγωγιµότητα ανάλυσης Η αναπαραγωγιµότητα της ανάλυσης Monolisa Total anti-hav PLUS καθορίστηκε µε την ανάλυση 4 δειγµάτων: 1 αρνητικό δείγµα και 3 θετικά δείγµατα HAV Ab (χαµηλής, µέση και υψηλής ). Η αναπαραγωγιµότητα εντός της ανάλυσης αξιολογήθηκε µε την εξέταση αυτών των 4 δειγµάτων 30 φορές στην ίδια ανάλυση. Η αναπαραγωγιµότητα µεταξύ των αναλύσεων αξιολογήθηκε µε την εξέταση αυτών των 4 δειγµάτων εις διπλούν κατά τη διάρκεια 20 ηµερών σε 2 ανεξάρτητες αναλύσεις κάθε µέρα. Τα αποτελέσµατα παρουσιάζονται στους παρακάτω πίνακες : Πίνακας 1: Αναπαραγωγιµότητα εντός της ανάλυσης Δείγµα Αρνητικό Μέση τιµή λόγου Θετικό χαµηλής Θετικό µέσης Θετικό υψηλής 0,43 2,25 3,08 4,29 SD 0,02 0,15 0,19 0,19 CV% 4,87 6,50 6,29 4,47 14 [GR]

15 Δείγµα Μέση τιµή τίτλου Αρνητικό SD 1,21 Θετικό χαµηλής Θετικό µέσης Θετικό υψηλής 2,78 39,96 67,33 >80 2,69 5,26 Δ/Ι CV% 43,53 6,72 7,81 Δ/Ι Πίνακας 2: Αναπαραγωγιµότητα µεταξύ των αναλύσεων Δείγµα Αρνητικό Μέση τιµή λόγου Θετικό χαµηλής Θετικό µέσης Θετικό υψηλής 0,45 2,13 3,43 4,80 SD 0,03 0,29 0,33 0,49 CV% 6, ,61 10,23 Δείγµα Αρνητικό Μέση τιµή τίτλου Θετικό χαµηλής Θετικό µέσης Θετικό υψηλής 3,10 38,91 71,88 >80 SD 1,24 3,65 4,13 Δ/Ι CV% 39,96 9,38 5,75 Δ/Ι 15 - ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΤΗΣ ΕΞΕΤΑΣΗΣ Η διάγνωση µιας µολυσµατικής ασθένειας δεν θα πρέπει να βασίζεται αποκλειστικά σε ένα αποτέλεσµα εξέτασης. Αντίθετα, µια ακριβής διάγνωση θα πρέπει να λαµβάνει υπόψη το κλινικό ιστορικό, τα συµπτώµατα καθώς και τα ορολογικά δεδοµένα του ασθενή. Η βακτηριδιακή µόλυνση των δειγµάτων µπορεί να επηρεάσει τις τιµές απορρόφησης των δειγµάτων ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Costa-Mattioli Mauro, Di Napoli A, Ferré V, Billaudel S, Perez-Bercoff R, Cristina J : Genetic variability of hepatitis A virus. Journal of General Virology (2003), 84, Normann A, Jung C, Vallbracht A, Flehmig B : Time course of Hepatitis A Viremia and Viral Load in the Blood of Human Hepatitis A Patients. Journal of Medical Virology 9999 :1-7 (2003) Lutz G. Guertler : Virus safety of human blood, plasma, derived products. Thrombosis Research 107 (2002)S39-S45 Jennifer A. Cuthbert : Hepatitis A : Old and New. Clinical Microbiology Reviews, Jan. 2001, p Morag Ferguson, Dawn Sands, Nico Lelie : Hepatitis A Immunoglobin : An International Collaborative Study to Establish the Second Intertional Standard. Biologicals Vol. 28, Issue 4, December 2000, p [GR]

16 World Health Organization, departement of communicable Disease Surveillance and Response : Hepatitis A. Who/cds/csr/edc/ ( Centers for Disease Control and Prevention (CDC) : Prevention of hepatitis A through active or passive immunization, recommendations of the advisory committee on immunization practices (ACIP). MMWR october 01, 1999 /48(RR12) ;1-37 Rosa M. Pinto, Juan F. Gonzalez-Dankaart, Gloria Sanchez, Susana Guix, M. Jose Gomara, Monica Garcia, Isabel Haro, Albert Bosch : Enhancement of the immunogenicity of a synthetic peptide bearing a VP3 epitope of hepatitis A virus. FEBS Letters 438 (1998) Stanley M. Lemon : Type A viral hepatitis : epidemiology, diagnosis, and prevention. Clinical Chemistry 43 :8(B) (1997) Stanley M. Lemon and Leonard N. Binn : Serum neutralizing antibody response to hepatitis A Virus. The Journal of Infectious Diseseases Vol. 148, no. 6 December 1983 Bertram Flehmig, Michael Ranke, Hans Berthold, Hans-Joachim Gerth : A Solid- Phase Radioimmunoassay for Detection of IgM Antibodies to Hepatitis A Virus. The Journal of Infectious Diseases Vol. 140, no. 2 August [GR]

17 17 [GR]

18 18 [GR]

19 19 [GR]

20 20 [GR]

21 21 [GR]