مجله دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی تهران آبان 1395 دوره 74 شماره 8 صفحههاي 545 تا 553

Transcript

1 545 القاي ایم ین هترولوگ علیه سویهه يا رایج آنفلوانزا با استفاده از واکسن مجله دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی تهران آبان 1395 دوره 74 شماره 8 صفحههاي 545 تا 553 مقاله اصیل القاي ایمنی هترولوگ علیه سویههاي رایج آنفلوانزا با استفاده از واکسن ژنی بر پایه قطعه HA2 *1 سینا سلیمانی 1 شهلا شاهسوندي امید مددگار 2 1 موسسه تحقیقات واکسن و سرمسازي رازي سازمان تحقیقات آموزش و ترویج کشاورزي کرج ایران. 2 گروه میکروبیولوژي و ایمونولوژي دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران تهران ایران. * نویسنده مسي ول: کرج سازمان تحقیقات آموزش و ترویج کشاورزي موسسه تحقیقات واکسن و سرمسازي رازي. چکیده زمینه و هدف: واکسنه يا ایم ین اسید نوکلي یک بهعنوان نسل سوم واکسنها براي کنترل آنفلوانزا به دلیل افزایش سویههاي نوپدید و بازپدید ویروس و انتقال مستقیم ویروسهاي پرندگان به انسان مورد توجه خاصی قرار گرفتهاند. مزیت مهم این واکسنها القاي هر دو نوع سیستم ایمنی سلولی و هومورال و کنترل سویهه يا در گردش میباشد. مطالعه حاضر با هدف استفاده از قطعه محافظت شده HA2 هماگلوتینین آنفلوانزا جهت طراحی یک واکسن ژنی جامع و ارزیا یب متقاطع آن علیه ویروسه يا رایج انجام شد. روش بررسی: این مطالعه توسعهاي کاربردي از آذر 1393 تا تیر 1394 در موسسه تحقیقات واکسن و سرمسازي رازي انجام شد. توالی HA2 در وکتور pcdna3.1 بیان شده و به گروهه يا Prime/Boost تزریق شد. ایم ین موش Bulb/c تیمار و کنترل با استراتژي هومورال محافظت کننده متقاطع با بررسی عیار آنتیبادي در فواصل زمانی معین با روش (VN) Virus neutralization با دو سروتیپ مختلف ویروس آنفلوانزا H1N1) و (H9N2 ایم ین Proliferation assay و بیضرري واکسن با بازرسیه يا هیستوپاتولوژي مورد ارزیابی قرار گرفت. یافتهها: عیار آنتیبادي و ایم ین بوده و در گروه تیمار سلولی در گروهه يا روزانه واکنشه يا سلولی با آزمایش موضعی و عمومی و همچنین آزمایش تیمار براي هر دو سروتیپ بهطور معناداري از گروه کنترل بالاتر با دو بار تزریق یادآور داراي بالاترین عیار بود (0/01>P). در موشه يا واکنش موضعی اثرات پاتولوژیک بافتی واکنشهاي عمومی و یا مرگ و میر مشاهده نشد. نتیجهگیري: واکسن ژنی بر پایه قطعه سلولی بدون ایجاد عوارض جانبی میشود. کلمات کلیدي: آنفلوانزا DNA واکسن HA2 ایم ین تحت آزمایش هیچگونه HA2 سبب افزایش عیار آنتیبادي علیه آنفلوانزا و همچنین تحریک ایم ین متقاطع. دریافت: 1395/03/17 ویرایش: 1395/08/18 پذیرش: 1395/08/29 آنلاین: 1395/08/30 تلفن: s.soleimani@rvsri.ac.ir مقدمه بیماري آنفلوانزا بهعنوان یک بیماري عفونی با قدمت چند هزار ساله بهدلیل ایجاد بیماري در انسان پرندگان و بسیاري از حیوانات داراي اهمیت بهداشتی و اقتصادي چشمگیري میباشد. آلودگی با ویروس آنفلوانزا سبب بروز هر دو دسته پاسخهاي ایمنی سلولی و هومورال میشود. پاسخهاي ایمنی هومورال با آنتیباديهاي اختصاصی تولید شده توسط پلاسماسلهاي ترشحکننده آنتیبادي ایجاد میشود. این فرایند توسط CD4T کمکی حمایت میشود. پاسخهاي ایمنی سلولی پس از شناسایی آنتیژنهاي ویروسی عرضه شده با مولکولهاي (MHC) Major histocompatibility complex (Antigenpresenting cells, APC) کلاسهاي I و II توسط سلولهاي عرضهکننده آنتیژن که به فعالسازي ازدیاد و تمایز سلولهاي اختصاصی آنتیژن CD8T یا CD4 منجر میشود آغاز خواهد Tehran Univ Med J (TUMJ) 2016 November;74(8):54553

2 و 1 سینا سلیمانی و همکاران 546 شد. 2 تمام تحت تیپهاي ویروس آنفلوانزا A در پرندگان آبزي و مهاجر وجود داشته و به انسان نیز منتقل میشوند. مطالعات نشان دادهاند چنانچه در میزبان حیوانی تغییري در اسیدهاي آمینه مسوول شناسایی و تنظیم اختصاصی بودن اتصال ویروس به گیرنده از α2,6 به α2,3 در پروتیین هماگلوتینین (HA) ایجاد شود یا با حضوراسید گلوتامیک درجایگاه پروتیین 92 NS1 سبب فرار ویروس از پاسخهاي ضد ویروسی سیتوکینی میزبان شود و یا در جایگاههاي 627 و 701 پروتیین PB2 جهش رخ دهد آنگاه ویروس ویژگی جدیدي براي اتصال به گیرنده کسب میکند که موجب تنوع در 3 ویروس تطبیق با میزبان جدید و انتشار آلودگی در آن میشود. بنابراین انتشار سریع سویههاي نوپدید و بازپدید ویروس آنفلوانزا و ثبت مدارکی مبنی بر انتقال برخی از سویهها از گونههاي پرندگان به انسان و سایر پستانداران سبب شد تا توجه جهانی به سمت ارتقا و بهینهسازي روشهاي کنترل و پیشگیري از آنفلوآنزا معطوف شود. با توجه به اینکه پدیدار شدن واریتههاي آنتیژنی جدید از این ویروسها بهکارگیري واکسنهاي غیرفعال تجاري را با 4 یکی از راهکارهاي ارایه شده براي محدودیتهایی مواجه کرده است کنترل سویههاي در گردش موجود استفاده از واکسنهاي اسید نوکلي یک به عنوان نسل سوم واکسنها است که ایمنی محافظت کننده متقاطع ایجاد کنند. اساس کار این واکسنها فرایند طبیعی ترجمه ژن به پروتیین در سلولهاي موجودات زنده براي تولید پروتیین ایمونوژن در بدن و 5 القاي هر دو سیستم ایمنی سلولی و هومورال است. نتایج مطالعات براي کنترل بیماري آنفلوانزا نشان میدهند استفاده از اپیتوپهاي حفاظت شده HA آنتیباديهاي خنثیکننده علیه 6 با توجه ویروس ایجاد کرده و ایمنی مناسبی علیه بیماري القا میکند. به رخداد جهشهاي نقطهاي گسترده در زیر واحد HA1 و همچنین عدم وجود این تغییرات آنتیژنیکی در زیر واحد 7 HA2 استفاده از زیر واحد HA2 که داراي جایگاههاي آنتیژنی متعدد حفظ شده میباشد براي طراحی یک واکسن ژنی با ایمنی متقاطع براي سویههاي مهم در گردش آنفلوانزا مورد توجه میباشد. از اینروي هدف از انجام این مطالعه استفاده از قطعه HA2 ویروس آنفلوانزا براي ساخت یک واکسن ژنی مناسب و ارزیابی ایمنیزایی و بیضرري آن با تزریق با استراتژيهاي مختلف به موشهاي Bulb/c براي کنترل سویههاي در گردش آنفلونزا بود. روش بررسی این مطالعه از نوع توسعهاي کاربردي بود که از آذر 1393 تا تیر 1394 در موسسه تحقیقات واکسن و سرمسازي رازي کرج انجام شد. جامعه مورد مطالعه موشهاي آزمایشگاهی نژاد Bulb/c تهیه شده از موسسه تحقیقات واکسن و سرمسازي رازي بود. متغیرهاي مورد مطالعه میزان عیار آنتیبادي آنفلوانزا به روش (VN) و ضریب تزاید لنفوسیتها بود. Virus neutralisation توالیهاي اسید آمینهاي HA2 ویروس آنفلوانزا H9N2 از زمان شناسایی آن در سال از پایگاه داده 2014 تا 1997 GenBank ( همردیفی آنها با استخراج شده و ClustalW software (European Bioinformatics UK) Institute, Cambridge, انجام شد. با استفاده از BioEdit بخش محافظت شده HA2 تعیین شد. با استفاده از نرمافزار Software, GeneRunner v 3.01 (Hastings Hudson, NY; پرایمرهاي اختصاصی براي تکثیر ژن HA2 ویروس آنفلوانزا H9N2 به طول 571bp طراحی شد 5 GGATCCCATGGCTGCAGATAGGGATA3 ) HA2F: 5 CCATGGTTATATACAAATGTTGCACCT3.(HA2R: با بررسی جایگاههاي برش آنزیمهاي محدودگر در توالی ژن و جایگاههاي موجود در MCS وکتور بیانی Invitrogen, ) pcdna3.1 (USA, Catalog no: V79020 جایگاه برش آنزیم NcoI در ابتداي آغازگرهاي رفت و آنزیم BamHI در انتهاي هر دو آغازگر برگشت قرار داده شد. براي استخراج RNA از کیت (GeneAll, Ribospin Korean) استفاده شد. ژن مورد مطالعه با استفاده از کیت Next generation of premix Reverse transcription polymerase طی واکنش (Intron, Korea) Forward پرایمر 1 µl یک مرحلهاي با chain reaction (RTPCR) 2 µl پرایمر RNA 1 µl Reverse استخراج شده و 16 µl آب مقطر DNase فاقد تکثیر شدند. محصول PCR مولکولی DNA روي ژل آگارز %1 الکتروفورز شد. همراه با مارکر وزن در این پژوهش براي تهیه سلولهاي پذیرا از باکتري E.coli سویه مجله دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی تهران آبان 1395 دوره 74 شماره تا 553

3 547 القاي ایم ین هترولوگ علیه سویهه يا رایج آنفلوانزا با استفاده از واکسن (Top10) DH5α استفاده شد. محصولات PCR ژن HA2 به مقدار 10) µl/ml به مدت 30 دقیقه براي تیمار ویروس قرار گرفت. سپس 100 µl تهیه شده و DNA با استفاده از کیت PCR product Korean) extraction (GeneAll, خالص شد. براي محاسبه غلظت DNA به دست آمده از دو روش الکتروفورز روي ژل آگارز و نیز خواندن جذب با اسپکتروفتومتر استفاده شد. ژنها در وکتور pcdna3.1 به روش شوك حرارتی کلون شدند. استخراج پلاسمید با استفاده از کیت EndoFree Plasmid Mega Kit (Qiagen, NcoI انجام شد. سپس با استفاده از آنزیمهاي محدودگر Germany) و BamHI و بررسی قطعه تولید شده در نتیجه واکنش هضم درستی ژن کلون شده ارزیابی شد. براي تایید کامل کلون سه کلون تک از کلونهاي تهیه شده تعیین توالی شدند. تعداد 40 سر موش ماده Razi Vaccine and Serum ) Balb/c (Research Institute, Karaj, Iran با سن شش هفته و میانگین وزنی 20 g در چهار گروه (هر گروه شامل 10 سر موش) شامل یک گروه کنترل و سه گروه تیمار قرار گرفتند. براي سازگاري با محیط موشها پس از تحویل به مدت 72 ساعت در محیط جدید قرار گرفتند. سپس براي اطمینان از عدم وجود آنتیبادي علیه ویروس آنفلوانزا در روز 3 (سه روز پیش از شروع نخستین تزریق) بهطور تصادفی از موشها خونگیري شده و عیار آنتیبادي در نمونههاي سرم با آزمایشهاي ممانعت ازآگلوتیناسیون (HI) مورد ارزیابی قرار گرفت. در روز صفر (نخستین تزریق) تزریق واکسن با راهبرد DNA/PrimeDNA/Boost در محل عضله چهار سر ران به میزان 0/1 ml انجام شد. یادآور اول 14 روز پس از تزریقهاي اولیه و یادآور دوم 14 روز پس از یادآور اول تزریق شد (جدول 1). موارد اخلاقی نگهداري موشها در دوره آزمایش شامل دریافت کافی و مناسب آب و غذا عدم ایجاد تنش به هنگام خونگیري و واکسیناسیون به طور کامل رعایت شد. براي بررسی میزان القاي ایمنی هومورال متقاطع حاصل از تزریق DNA واکسن HA2 عیار آنتیبادي در سرم موشهاي تیمار و کنترل با آزمایش (VN) Virus neutralization به شرح ذیل در روزهاي و 70 روز پس از تزریق اول ارزیابی شد. پیش از هر نوبت خونگیري موشها توزین میشدند. براي سازگاري سویههاي مورد استفاده در چالنج پس از آماده سازي فلاسکهاي کشت سلول Vero و 500 MDCK میکرولیتر از سویهه يا ترکیبهاي فوق به صورت جداگانه به همراه محیط DMEM به فلاسکهاي کشت سلول حاوي 2/5 µl/ml تریپسین بارور شدند. آثار آسیب سلولی پیدایش از پس Cytopathic effect (CPE) در فلاسکهاي کشت سلول براي تایید سازگاري ویروس در کشت سلول سه پاساژ متوالی از ویروس در سلولهاي مورد نظر همراه با بررسی CPE انجام شد. بر اساس عیار محاسبه شده از ویروس و استفاده از ویروس با تیتر CCID50 per ml 100 آزمایش VN پس از غیرفعالسازي حرارتی سرمهاي مورد مطالعه و تهیه سلول MDCK با رقت سلول در هر میلیلیتر انجام شد. کنترل سرم کنترلهاي ویروس به صورت ویروس 10 1 و ml) 100 (100 CCID50 per و کنترل سلول در نظر گرفته شد. عیار خنثیکنندگی سرم بر اساس بالاترین رقتی از سرم که از اثرات ویروس آنفلوانزا در مونولایر سلولی جلوگیري نماید و با استفاده از فرمول محاسبه Reed & 810 Munch به صورت PD50 محاسبه شد. 60 روز پس از تزریق DNA واکسن HA2 براي ارزیابی ایمنی سلولی القا شده در موشها از آزمون MTT استفاده شد. سوسپانسیونی تک سلولی در محیط RPMI 1640 از لنفوسیتهاي طحال موشهاي مورد مطالعه به تعداد 106 cells/ml تهیه شد. براي هر گروه 100 µl میتوژن فیتوهماگلوتینین (PHA) A به عنوان کنترل مثبت با غلظت 5 µg/ml در غلظت نهایی به شش گوده میکروپلیت اضافه شد. در دوازده گوده مربوط به هر گروه DNA 100 µl واکسن HA2 ریخته شد. براي هر گروه از لنفوسیتها شش گوده بهعنوان کنترل منفی در نظر گرفته شد. پس از اضافه کردن MTT و انکوباسیون مایع رویی گوده تخلیه و کریستالهاي فورمازان تشکیل شده با اضافه کردن 150 µl ديمتیل سولفوکساید (DMSO) به هر گوده حل شدند. سپس میزان جذب هر گوده در طول موج 630 nm تعیین شده و میانگین به همراه انحرافمعیار براي سه بار آزمایش محاسبه شد. ضریب تحریک (SI) به صورت نسبت میانگین OD گودههاي حاوي سلولهاي تحریک شده با واکسن ژنی به متوسط OD گودههاي حاوي سلول با محیط 11 (کنترل منفی) محاسبه شد. H9N2 و H1N1 در معرض 5 µl تریپسین 0 ا/ %0 (به نسبت براي بررسی آثار آسیب بافتی احتمالی ناشی از تزریق واکسن Tehran Univ Med J (TUMJ) 2016 November;74(8):54553

4 سینا سلیمانی و همکاران 548 DNA ضمن بازرسی روزانه موشها از نظر وجود واکنشهاي موضعی در محل تزریق واکنشهاي عمومی و کاهش وزن احتمالی نمونههاي طحال و ریه از موشهاي گروههاي مختلف تیمار و کنترل در روز سوم پس از تزریق و در پایان آزمایش گرفته شده و مقاطع بافتی با هماتوکسیلین و اي وزین براي آزمایش هیستوپاتولوژي رنگآمیزي شدند. از نتایج بر اساس میانگین و انحراف از معیار با استفاده SPSS statistical software, version 22 (IBM, Armonk, NY, USA) و آزمون آماري One way ANOVA مورد بررسی و پردازش آماري قرار گرفته و با در نظر گرفتن ضریب اطمینان %95 0/05>P معنادار در نظرگرفته شد. یافتهها محصول Reverse transcription polymerase chain reaction (RTPCR) حاصل از تکثیر ژن HA2 با جفت پرایمرهاي اختصاصی روي ژل آگارز %1 الکتروفورز شدند و باندي به طول 571bp حاصل شد (شکل 1). با کلونسازي ژنهاي HA2 در وکتور pcdna3.1 روي پلیتهاي مربوط به ژن تعداد زیادي کلنیهاي سفید رنگ رشد کرده بود که میتوانند حاوي پلاسمیدهاي نوترکیب یعنی داراي قطعه HA2 ویروس آنفلوانزا باشند (شکل 1). با توجه به اینکه براي ارزیابی حفاظت متقاطع آزمایش VN با ویروسهاي H1N1 و H9N2 به صورت جداگانه انجام شد نتایج این آزمایش براي سروتیپ H9N2 در نمودار 1 و نتایج حاصل از سروتیپ H1N1 در نمودار 2 آمده است. همانگونه که مشاهده میشود عیار به دست آمده در گروههاي تیمار براي هر دو سروتیپ بهطور معناداري از گروه کنترل بالاتر بود و در گروههاي تیمار براي هر دو سروتیپ گروه C با دو بار تزریق یادآور داراي بالاترین عیار در این آزمایش بود. همچنین سازگاري هر دو ویروس به کشت سلول MDCK به خوبی طی سه پاساژ متوالی انجام گرفت و ویروسها بر روي این کشت سلول اثرات آسیب سلولی مشخصی به صورت گرد شدن سلولها و کنده شدن سلولها از مونولایر سلولی داشتند. نتایج بهدست آمده از آزمایش MTT براي ارزیابی ایمنی سلولی به صورت میانگین ضریب تحریک (SI) ناشی از تاثیر میتوژن (فیتوهماگلوتینین) و آنتیژن (HA2) بر لنفوسیتهاي خون محیطی جدا شده از موشهاي مورد مطالعه در گروههاي مختلف با انحراف معیار مربوط در نمودار 3 آمده است. نتایج نشان داد که ایمنی سلولی نیز در گروههاي تیمار بهطور معناداري از گروه کنترل بالاتر بود. در بازرسی روزانه موشهاي تحت آزمایش هیچگونه واکنش موضعی مانند تورم قرمزي التهاب و جراحت در محل تزریق و یا واکنشهاي عمومی و یا مرگ و میر مشاهده نشد. میانگین وزن موشها در تمامی گروههاي کنترل و تیمار تفاوتی نداشت و در بازه زمانی آزمایش از میانگین 20 g به میانگین 32/8 g رسید. در آزمایش بافتشناختی نیز در نمونههاي ریه و طحال موشها هیچگونه واکنش التهابی ناخواسته پرخونی و یا تغییر شکل سلولی در اثر تزریقات مشاهده نشد. جدول 1 :گروهبندي موشها و راهبرد تزریق DNA واکسن HA2 ردیف گروه عنوان استراتژي تزریق تزریق اولیه تزریق یادآور اول تزریق یادآور دوم تیمار گروه A 1 تیمار گروه B 2 تیمار گروه C 3 کنترل سرم فیزیولوزي گروه D 4 مجله دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی تهران آبان 1395 دوره 74 شماره تا 553

5 549 القاي ایم ین هترولوگ علیه سویهه يا رایج آنفلوانزا با استفاده از واکسن شکل 1: تکثیر ژن HA2 ویروس آنفلوانزا H9N2 بهطول 571bp بههمراه مارکر وزن مولکولی (DNA100bp) (چپ) و تایید قطعات کلون شده HA2 با PCR در چند کلون مورد مطالعه بههمراه مارکر وزن مولکولی (DNA100bp) (راست). نمودار 1: مقایسه تیتر آنتیبادي علیه آنفلوانزا در گروههاي تحت آزمایش با روش VN با استفاده از ویروس.H9N2 بر اساس آزمون آماري 0/05>P ANOVA معنادار در نظرگرفته شده (P<٠/٠٠١ *** P<٠/٠١ ** P<0/05 * ) میانگین± انحرافمعیار گزارش شد. و نتایج بهصورت نمودار 2: مقایسه تیتر آنتیبادي علیه آنفلوانزا در گروههاي مختلف با آزمایش VN با استفاده از ویروس در نظرگرفته شده.H1N1 بر اساس آزمون آماري 0/05>P ANOVA معنادار (P<٠/٠٠١ *** P<٠/٠١ ** P<0/05 * ) میانگین± انحرافمعیار گزارش شد. و نتایج بهصورت نمودار 3: مقایسه ضریب تحریک گروههاي مختلف با آزمایش تزاید لنفوسیتها تحت تاثیر آنتیژن و یا میتوژن بحث تکنولوژي ساخت DNA واکسن با استفاده از پلاسمید برهنه حاوي ژنهاي ویروس آنفلوانزا و به ویژه قابلیت وجود چندین ژن بسیار محافظت شده بین تحت تیپهاي آن شامل M1 NP و M2 براي ایجاد حفاظت علیه این ویروسها در مطالعات مختلف مورد بررسی 12 قرار گرفت. مطالعات نشان میدهند که آنتیبادي علیه پروتیینهاي NP و M1 خنثیکننده نیستند و در نتیجه حفاظت ایجاد نمیکنند. پروتیین سطحی M2 نیز حفاظت محدودي در موش ایجاد 13 میکند. Park و همکاران حفاظت کاملی علیه آنفلوانزاي پرندگان سویه H5N2 با استفاده از DNA واکسن بیان کننده پروتي ین فیوژن 14 HA و M2e بهدست آوردند. در مطالعه Swayne و همکاران نشان داده شد که ایمنی هومورال و سلولار ایجاد شده توسط DNA 15 واکسنها با واکسنهاي زنده برابري میکند. بروز جهشهاي نقطهاي مکرر در زیر واحد HA1 گلیکوپروتیین سطحی HA ویروس آنفلوانزا و احتمال پدیدار شدن واریتههاي آنتیژنی جدید که میزبان علیه آنها ایمنی ندارد سبب رویکرد به سمت طراحی واکسنهاي Tehran Univ Med J (TUMJ) 2016 November;74(8):54553

6 سینا سلیمانی و همکاران 550 ژنی با استفاده از زیر واحد HA2 با هدف جایگزینی آن با واکسنهاي 16 و 17 رایج شده است. در این پژوهش براي ساخت DNA واکسن علیه آنفلوانزا از وکتور pcdna3 استفاده شد که داراي یک پروموتور یوکاریوتی و توالیهاي CPG غیر متیله براي بیان درست ژن مورد نظر درون سلول هدف میزبان است. با توجه به اینکه روش تلقیح واکسن DNA یک فاکتور حیاتی در تعیین نتیجه وکسیناسیون می باشد و تزریق داخل عضلانی ترجیحا سبب القاي ایمنی از نوع Th1 18 میشود از این روش براي بارورسازي DNA واکسن طراحی شده و ارزیابی پاسخهاي ایمنی استفاده شده است. تزریق یک نوبت این واکسن سبب القا ایمنی هومورال اختصاصی و افزایش عیار آنتیبادي و همچنین ایمنی سلولی علیه ویروس آنفلوانزا در گروههاي موش تحت آزمایش شد. شدت و سرعت پاسخ ایمنی اختصاصی با تعداد دفعات مواجه شدن با آنتیژن و فعال شدن سلولهاي خاطره مرتبط است. براي تولید و ذخیرهسازي تعداد مناسب سلولهاي خاطره باید آنتیژن مورد نظر در فواصل زمانی مختلف به بدن وارد شود تا سامانه ایمنی به میزان کافی نسبت به آن حساس شود. بنابراین در این مطالعه نیز نوبت هاي یادآور ایمن سازي با واکسن طراحی شده با استراتژي Prime/Boost انجام شد. نتایج نشان میدهند که در گروههایی که تزریق DNA واکسن طراحی شده انجام شد عیار آنتی بادي محافظت کننده و القاي ایمنی هومورال که در آزمایش VN مورد ارزیابی قرار گرفت (با توجه به اینکه در آنفلوانزا تیتر آنتیبادي محافظت کننده (نوترالیزان) میتواند 10 و 19 از عملکرد مستقیم HA ممانعت بهعمل آورد از آزمایش VN جهت سنجش عیار آنتیبادي محافظت کننده استفاده شد) به مراتب از گروه کنترل منفی بالاتر بود (0/01>P). به دلیل اهمیت القاي ایمنی سلولی در آنفلوانزا که یکی از اهداف مهم این مطالعه بود به موازات سنجش عیار آنتیبادي براي سنجش ایمنی سلولی از آزمایش MTT استفاده شد چرا که در این آزمایش در صورتی که حیوان آزمایشگاهی با یک آنتیژن و یا آلرژن حساس شده باشد میتوان از آن آنتیژن و یا آلرژن به عنوان محرك براي سنجش تکثیر لنفوسیتها استفاده نمود. نتایج حاصل از این آزمایش نیز نشان میدهند که DNA واکسن تلقیح شده علاوه بر افزایش تیتر آنتیبادي سبب افزایش ایمنی سلولی در موشهاي تزریق شده شد بهطوريکه میزان ضریب تحریک (SI) به دست آمده در این آزمایش در گروههاي تیمار بهطور معناداري از گروه کنترل بالاتر بود (0/01>P). پاسخ تکثیري لنفوسیتها به میتوژنهایی مانند فیتوهماگلوتینین که در این مطالعه در آزمایش سنجش ایمنی سلولی استفاده شده است قويتر از پاسخ به آنتیژن و یا آلرژن است زیرا پاسخ لنفوسیتها به میتوژن اختصاصی نیست. به بیان دیگر میتوژنها جمعیت وسیعی از لنفوسیتها را تحریک میکنند. در مقابل تحریک آنتیژنی بسیار اختصاصی بوده و فقط لنفوسیتهایی تحریک میشوند 20 که آن آنتیژن را شناسایی میکنند. بنابراین مطابق انتظار با وجود اینکه تحریک ناشی از میتوژن بیشتر از تحریک ناشی از واکسن پیشنهادي میباشد ضریب تکثیر مناسب ایجاد شده نشان میدهد که واکسن طراحی شده قادر به تحریک لنفوسیتهاي T میباشد. این امر موید توانایی ایمنسازي ژنتیکی در القاي ایمنی سلولی است. در بررسی مقایسهاي گروههاي تحت مطالعه گروه C (با یک تزریق اولیه و دو تزریق یادآور) داراي بیشترین عیار آنتیبادي در آزمایش سرولوژي و همچنین بیشترین القاي ایمنی سلولی در مقایسه با سایر گروهها بود (0/01>P). این دستاورد نشان میدهد که تزریق یادآور سبب افزایش پاسخهاي ایمنی در میزبان خواهد شد. نتایج گویاي آن است که پس از گروه C بهترتیب گروه B با یک تزریق یادآور و گروه A بدون تزریق یادآور قرار میگیرند. البته گفتنی است تفاوت بین این دو گروه در مقایسه با گروه C کمتر است. همچنین در طول دوره مطالعه یکنواختی در میزان ایمنی در گروههاي ایمن شده وجود داشت. از دیگر یافتههاي این مطالعه استفاده همزمان از دو سروتیپ ویروس آنفلوانزا یعنی H9N2 و H1N1 که از تحت تیپهاي رایج پرندگان و انسان هستند براي نشان دادن حفاظت متقاطع علیه ویروسهاي در گردش است. مقایسه دادههاي حاصل از بهکارگیري این دو تحت تیپ در آزمایش VN حاکی از این است که تفاوت معناداري بین نتایج به دست آمده وجود ندارد (0/05<P). مقایسه نتایج حاصل از این دو روش با محاسبه Zscore به صورت کاملا همسان افزایش عیار آنتیبادي را نشان میدهد. اندازه کاپا بین این دو آزمایش برابر با 0/93 محاسبه شد و از آنجایی که اندازه بیش از 0/8 نشاندهنده تطابق بالا بین دو ویروس است میتوان نتیجه گرفت که بین نتایج حاصل از دو ویروس در ارزیابی پاسخ ایمنی هومورال در موشهاي دریافت کننده DNA واکسن مجله دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی تهران آبان 1395 دوره 74 شماره تا 553

7 551 القاي ایم ین هترولوگ علیه al. et سویهه يا.S رایج Soleimani آنفلوانزا با استفاده از واکسن HA2 همخوانی بالایی وجود دارد. بنابراین میتوان نتیجه گرفت که استفاده از سازه پیشنهادي میتواند حداقل علیه این دو تحت تیپ شایع حفاظت متقاطع ایجاد نماید. بدیهی است این حفاظت پیامد استفاده از قطعه حفاظت شده HA2 در طراحی DNA واکسن علیه عفونتهاي آنفلوانزا میباشد و با توجه به حفاظت شدگی قطعه در تحت تیپهاي آنفلوانزا در سایر تحت تیپهاي این HA2 ویروس نیز ایجاد خواهد شد. همچنین پس از دو بار تزریق یادآور %84 موشهاي تیمار شده گروه C از میانگین عیار آنتیبادي 1/6< برخوردار بودند که تفاوت چشمگیري (0/01>P) با موشهاي همین گروه پیش از تزریق یادآور دوم داشتند. در بررسی بیضرري این واکسن در بازرسیهاي روزانه و همچنین آزمایش هیستوپاتولوژي هیچگونه واکنش التهابی و ناخواسته حاصل از تزریق DNA واکسن مورد مطالعه در موشهاي تحت آزمایش مشاهده نشد که این نتایج بیانگر این هستند که هیچ یک از ترکیبات DNA واکسن HA2 اثرات نامطلوبی نداشتند. بنابراین نتایج به دست آمده از این مطالعه حاصل القاي پاسخهاي ایمنی متقاطع هومورال و سلولی توسط DNA واکسن بر پایه قطعه HA2 علیه ویروس آنفلوانزا بیانگر این نکته هستند که این توالی اسید نوکلي یکی قابلیت افزایش پاسخهاي ایمنی متقاطع به صورت هومورال و سلولی را علیه ویروسهاي آنفلوانزا دارد. همچنین نتایج حاصل از این مطالعه نشان میدهند که با استفاده از DNA واکسن طراحی شده در این پژوهش در حیوانات آزمایشگاهی مورد مطالعه هیچگونه اثرات جانبی مشاهده نشد که نشان دهنده بیضرري واکسن مذکور میباشد. بر اساس مطالعه انجام شده و نتایج حاصل از آن براي انجام مطالعات بیشتر در این زمینه و همچنین ارایه راهکارهایی براي افزایش کارایی سیستمهاي جدید کنترل و پیشگیري ویروس آنفلوانزا طراحی واکسن بر مبناي اپیتوپهاي موجود در نواحی محافظت شده در توالی HA2 و یک پروتیین داخلی مانند NP و یا M2 به Ph.D. صورت پروتیین کایمر میتواند هدف مطالعه بعدي باشد. سپاسگزاري: این مقاله حاصل بخشی از پایاننامه دوره ویروسشناسی تحت عنوان "طراحی و ارزیابی DNA واکسن بر پایه HA2 علیه بیماري آنفلوانزا به همراه بررسی و معرفی ژن Mx به عنوان یاور زیستی براي تقویت پاسخهاي ایمنی" به شماره ثبت 608 در دانشگاه تهران میباشد که با حمایت موسسه تحقیقات واکسن و References سرمسازي رازي انجام شده است. 1. Testa JS, Shetty V, Hafner J, Nickens Z, Kamal S, Sinnathamby G. MHC class Ipresented T cell epitopes identified by immunoproteomics analysis are targets for a cross reactive influenzaspecific T cell response. PloS one 2012;7(11):e Soleimani S, Shahsavandi SH, Madadgar O, Mahravani H, Lotfi M. Mx bio adjuvant for enhancing immune responses against influenza virus. Tehran Univ Med J 2015;73(3): Li Q, Zhou L, Zhou M, Chen Z, Li F, Wu H, et al. Epidemiology of human infections with avian influenza A(H7N9) virus in China. N Engl J Med 2014;370(6): Cox RJ, Brokstad KA, Ogra P. Influenza virus: immunity and vaccination strategies. Comparison of the immune response to inactivated and live, attenuated influenza vaccines. Scand J Immunol 2004;59(1): van de Sandt CE, Kreijtz JH, Rimmelzwaan GF. Evasion of influenza A viruses from innate and adaptive immune responses. Viruses 2012;4(9): Khanna M, Sharma S, Kumar B, Rajput R. Protective immunity based on the conserved hemagglutinin stalk domain and its prospects for universal influenza vaccine development. Bio Med Res Int 2014; Article ID Levy DE, Marié IJ, Durbin JE. Induction and function of type I and III interferon in response to viral infection. Curr Opin Virol 2011;1(6): Hossain MJ, Perez S, Guo Z, Chen LM, Donis RO. Establishment and characterization of a MadinDarby canine kidney reporter cell line for influenza A virus assays. J Clin Microbiol 2010;48(7): Gauger PC, Vincent AL. Serum virus neutralization assay for detection and quantitation of serumneutralizing antibodies to influenza A virus in swine. Methods Mol Biol 2014;1161: Kitikoon P, Vincent AL. Microneutralization assay for swine influenza virus in swine serum. Methods Mol Biol 2014;1161: Riss TL, Moravec RA, Niles AL, Duellman S, Benink HA, Worzella TJ, et al. Cell Viability Assays. In: Sittampalam GS, Coussens NP, Nelson H, Arkin M, Auld D, Austin C, editors. Assay Guidance Manual. Bethesda (MD): Eli Lilly and Company and the National Center for Advancing Translational Sciences; Hessel A, SavidisDacho H, Coulibaly S, Portsmouth D, Kreil TR, Crowe BA, et al. MVA vectors expressing conserved influenza proteins protect mice against lethal challenge with H5N1, H9N2 and H7N1 viruses. PLoS One 2014;9(2):e Bragstad K, Vinner L, Hansen MS, Nielsen J, Fomsgaard A. A polyvalent influenza A DNA vaccine induces heterologous immunity and protects pigs against pandemic A(H1N1)pdm09 virus infection. Vaccine 2013;31(18): Tehran Univ Med J (TUMJ) 2016 November;74(8):54553

8 Induction of heterologous immunity against current influenza serotypes by HA2 sub unit DNA vaccine Park KS, Seo YB, Lee JY, Im SJ, Seo SH, Song MS, et al. Complete protection against a H5N2 avian influenza virus by a DNA vaccine expressing a fusion protein of H1N1 HA and M2e. Vaccine 2011;29(33): Swayne DE, Kapczynski D. Strategies and challenges for eliciting immunity against avian influenza virus in birds. Immunol Rev 2008;225: Cong YL, Pu J, Liu QF, Wang S, Zhang GZ, Zhang XL, et al. Antigenic and genetic characterization of H9N2 swine influenza viruses in China. J Gen Virol 2007;88(Pt 7): Fan X, Hashem AM, Chen Z, Li C, Doyle T, Zhang Y, et al. Targeting the HA2 subunit of influenza A virus hemagglutinin via CD40L provides universal protection against diverse subtypes. Mucosal Immunol 2015;8(1): Mastelic B, Garçon N, Del Giudice G, Golding H, Gruber M, Neels P, et al. Predictive markers of safety and immunogenicity of adjuvanted vaccines. Biologicals 2013;41(6): Stephenson I, Das RG, Wood JM, Katz JM. Comparison of neutralising antibody assays for detection of antibody to influenza A/H3N2 viruses: an international collaborative study. Vaccine 2007;25(20): Gadalla MR, ElDeeb AH, Emara MM, Hussein HA. Insect cell surface expression of hemagglutinin (HA) of Egyptian H5N1 avian influenza virus under transcriptional control of whispovirus immediate early1 promoter. J Microbiol Biotechnol 2014;24(12): مجله دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی تهران آبان 1395 دوره 74 شماره تا 553

9 553 Tehran University Medical Journal, November 2016; Vol. 74, No. 8: Original Article Induction of heterologous immunity against current influenza Sina Soleimani Ph.D. 1* Shahla Shahsavandi Ph.D. 1 Omid Madadgar Ph.D. 2 1 Razi Vaccine & Serum Research Institute, Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO), Karaj, Iran. 2 Department of Microbiology and Immunology, Faculty of Veterinary Medicine, Tehran University, Tehran, Iran. serotypes by HA2 sub unit DNA vaccine Abstract Received: 06 Jun Revised: 08 Nov Accepted: 19 Nov Available online: 20 Nov Background: Problems of live and inactivated influenza vaccines such as, increasing emerge and reemerge viruses with high human mortality, current epidemics of influenza and direct transmission of avian viruses to human, affect the vaccination program. DNA vaccines as third generation of vaccines is specially considered for control of influenza in human and poultry. The main advantage of these vaccines is humoral and cellular immune responses and broad spectrum of using these vaccines for control of circulating strains of influenza. In this study the conserved fragment of HA2 to form of DNA vaccine was designed to induce immunity against influenza viruses and its heterologous protective immunity against these viruses was evaluated. Methods: The experimental study was performed in Razi Vaccine and Serum Research Institute from December 2014 to July 2015 in Iran. The HA2 was cloned into pcdna3.1 to assess the HA2 DNA vaccine and mice were immunized with the generated constructs in a DNA primedna boost regimen in 4 groups. The humoral immune responses were analyzed at defined intervals by VN tests. The safety of the vaccine was evaluated by daily inspection and histopathological examination. For evaluation of cellular immunity, proliferation assay was used. Results: The antibody titre and cellular immunity of immunized mice was significantly higher than control group for two serotypes and the highest responses was in the group with twotime boosting (P<0.01). There were no any local, general and histopathology reactions in immunized mice. Conclusion: The HA2 DNA vaccine significantly enhanced circulatory antibody responses and cellular immunity against influenza current serotypes. This study showed the highest immune responses were in the group that immunized with HA2 in prime and two boosts. Besides that, this construct did not have any local and general reaction and any side effects in treated mice. So, this construct was introduced as candidate for control of influenza virus serotypes. * Corresponding author: Razi Vaccine & Serum Research Institute, Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO), Karaj, Iran. Tel: s.soleimani@rvsri.ac.ir Keywords: DNA vaccines, HA2 protein, heterologous immunity, Influenza. Tehran Univ Med J (TUMJ) 2016 November;74(8):54553