نمونههاي استافیلوکوکوس اوري وس جدا شده از شیر ورم پستانی گاو گوسفند و بز در شهرستان سنندج

Transcript

1 . دوره چهاردهم شماره 2 تابستان 1397 تعیین فراوانی ژنهاي sea و seb در نمونههاي استافیلوکوکوس اوري وس جدا شده از شیر ورم پستانی گاو گوسفند و بز در شهرستان سنندج *1 الهام احمدي عباس قوزیوندي کاظم ابراهیمپورباصر و هیوا کریمیدرهآبی تاریخ دریافت: 95/10/23 تاریخ پذیرش: 96/8/6 خلاصه باکتري استافیلوکوکوس اوري وس به عنوان یکی از مهمترین عوامل ایجاد کنندهي مسمومیت غذایی در انسان مطرح است. این مسمومیت انتروتوکسینهاي استافیلوکوکی هستند که به انواع مختلفی وجود دارند. علت اصلی از یک سو با توجه به نقش احتمالی شیر آلوده با سویههاي انتروتوکسینزاي این باکتري در بروز مسمومیت غذایی در انسان و نقش مهم انتروتوکسینهاي A و B در بیماريزایی رودهاي باکتري و اهمیت مضاعف انتروتوکسین B به عنوان نوعی سلاح بیولوژیک و از سوي دیگر عدم وجود اطلاعات جامع در مورد نقش شیر و دو نوع انتروتوکسین مذکور در تهدید سلامت عمومی در منطقهي سنندج هدف از این مطالعه تعیین فراوانی ژنهاي sea و seb به عنوان فراوانترین انتروتوکسینها از جنبهي درمانگاهی میباشد. تعداد 120 نمونه شیر گاو و 60 نمونه شیر گوسفند و 60 نمونه شیر بز در شرایط استریل جمعآوري و به منظور تعیین حضور استافیلوکوکوس اوري وس توسط روشهاي روتین باکتریولوژیکی بررسی گردیدند. مولکولی ارزیابی شدند. و 21/66 درصد (13 جدایهها با روش PCR مبتنی بر ژن ترمونوکلي از (nuc) تا یید و براي شناسایی ژنهاي sea و seb با استفاده از روش در مجموع 23/33 درصد (28 مورد) از نمونههاي شیر گاو 31/66 درصد (19 مورد) از نمونههاي شیر گوسفند مورد ( از نمونههاي شیر بز با استافیلوکوکوس اوري وس آلوده بودند. اوري وس با منشا گاوي داراي ژن sea و فاقد seb بودند. 100 درصد جدایههاي استافیلوکوکوس sea به ترتیب در 78/94 درصد (15 مورد) و 23/07 درصد (3 مورد) از جدایه- هاي استافیلوکوکوس اوري وس با منشا گوسفندي و بزي و seb به ترتیب در 10/52 درصد (2 مورد) و 30/78 درصد (4 مورد) از جدایه- هاي استافیلوکوکوس اوري وس با منشا گوسفندي و بزي شناسایی گردید. حضور استافیلوکوکوس اوري وس جدا شده از نمونههاي شیر یک فاکتور خطر احتمالی براي سلامت مصرفکننده کیفیت بهداشتی شیر در منطقهي مورد مطالعه ضروري است. درصد بالاي ژنهاي انتروتوکسین در لحاظ میشود. لذا بهبود کلمات کلیدي: استافیلوکوکوس اوري وس انتروتوکسین شیر ورم پستانی واکنش زنجیرهاي پلیمراز مقدمه استافیلوکوکوس اوري وس نوعی باکتري گرم مثبت است که با تولید عوامل حدت متعدد باعث ایجاد بیماريهاي مختلفی در انسان و دام میشود (2009 al..(bystron et مسمومیت غذایی استافیلوکوکی در انسان با علایم حالت تهوع استفراغ حاد دلدرد و اسهال 1 تا 8 ساعت پس از مصرف غذاي آلوده توسط سویههاي باکتري ایجاد میگردد. انتروتوکسینزاي علیرغم بیماري خفیف و خودمحدود شونده با میزان مرگ و میر پایین این بیماري در سرتاسر جهان به عنوان یکی از مهمترین بیماريها از جنبهي بهداشت عمومی و اقتصادي مطرح میباشد ) Rall al (et. توکسینهاي رودهاي مترشحه از استافیلوکوکوس اوري وس پروتي ینهاي با وزن مولکولی کم ( دالتون ( و مقاوم به حرارت هستند که فعالیت بیولوژیکی خود را حتی پس از فرآوري *1 استادیار گروه پاتوبیولوژي دانشکدهي دامپزشکی واحد سنندج دانشگاه آزاد اسلامی 2 دانشآموختهي دکتراي حرفهاي دانشکدهي دامپزشکی واحد سنندج دانشگاه آزاد اسلامی 3 استادیار گروه پاتوبیولوژي دانشکدهي دامپزشکی واحد سنندج دانشگاه آزاد اسلامی elham.ahmadi.vet@gmail.com (نویسندهي مسي ول) 5 مجله دامپزشکی ایران دوره چهاردهم شماره 2 تابستان 1397

2 الهام احمدي عباس قوزیوندي و همکاران حرارتی مواد غذایی و از آن جمله پاستوریزاسیون حفظ میکنند. به عنوان مثال انتروتوکسین A استافیلوکوکی پس از 28 دقیقه حرارت دیدن در 121 درجهي سانتی- گراد همچنان فعال باقی میماند (2009 al..(pelisser et همچنین این توکسینها نسبت به غیرفعالسازي توسط پروتي ازهاي معدهاي-رودهاي از جمله پپسین مقاوم هستند. علاوه بر ماهیت سمیت براي دستگاه گوارش انتروتوکسینهاي این باکتري به عنوان توکسینهاي تبزا عمل و باعث سرکوب سیستم ایمنی و تکثیر غیراختصاصی لنفوسیتهاي T شده و به دلیل این اثرات سوپرآنتیژن نامیده میشوند 2009) al..(pelisser et بر اساس تفاوتهاي سرولوژیکی انتروتوکسینهاي استافیلوکوکی (SEs) 5 نوع انتروتوکسین کلاسیک SEA تا SEE شناسایی شده است که مسي ول 95 درصد موارد شیوع مسمومیت غذایی استافیلوکوکی میباشند و درصد 5 باقیمانده توسط انتروتوکسینهاي غیرکلاسیک ایجاد میگردد 2005) al..(pinto et SEA استافیلوکوکی و به عنوان فراوانترین عامل مسمومیت غذایی به دلیل قابلیت SEB استفاده به عنوان نوعی سلاح بیولوژیکی در بیوتروریسم مهمترین انتروتوکسینهاي این باکتري قلمداد میگردند. انتروتوکسین B علاوه بر راه گوارشی به صورت آي روسل و از طریق تنفسی نیز میتواند باعث ایجاد سندرم شوك توکسیک شود و به همین علت سویههاي مولد این توکسین توسط مو سسهي بینالمللی آلرژي و بیماريهاي 1 عفونی به عنوان پاتوژنهاي با درجهي اولویت B طبقه- بندي میشوند 2006) al..(ahanotu et با توجه به شیوع ورم پستان استافیلوکوکی در جمعیت دامهاي اهلی شهرستان سنندج و نیز تولید محصولات لبنی غیرپاستوریزه در این منطقه امکان ورود انتروتوکسینهاي استافیلوکوکی به زنجیرهي غذایی انسان با احتمال زیادي مطرح است. جغرافیاي گسترده در به علاوه با توجه به تنوع پراکندگی سویههاي انتروتوکسین- زاي استافیلوکوکوس اوري وس و نبود اطلاعات کافی در مورد نقش شیرهاي آلوده استافیلوکوکی و انتروتوکسین- هاي باکتري در ایجاد بیماري در انسان در این تحقیق به شناسایی مولکولی هاي مولد انتروتوکسینهاي باکتري استافیلوکوکوس اوري وس و ژن- A و B انتروتوکسینهاي مترشحه از این باکتري شیر در شهرستان سنندج پرداخته شده است. مواد و روش کار در طی یک تحقیق میدانی-مقطعی تعداد به عنوان مهمترین در نمونههاي نمونه 120 شیر گاوي و تعداد 60 نمونه شیر گوسفندي و 60 نمونه شیر خرداد بزي در بازهي 6 زمانی 1394 از دامهاي شهرستان شمارهگذاري گردید. با پنبه آغشته به الکل اول دوشش دور ریخته شده ماهه از دي تا 1393 ماه سنندج جمعآوري و قبل از نمونهگیري انتهاي کارتیهها 70 درصد استریل و چند قطرهي و سپس نمونهي ظروف نمونهگیري دربدار استریل ریخته شد. شیر در نمونهها در کنار یخ به آزمایشگاه میکروبیولوژي دانشکدهي دامپزشکی دانشگاه آزاد اسلامی واحد سنندج منتقل و مقدار خوندار 300 میکرولیتر از هر نمونه روي محیط آگار (Merck, Germany) استریل گوسفندي پلیتها به مدت انکوبه شدند. حاوي (بهارافشان ایران درصد خون 5 ( کشت گردید. درجهي 37 ساعت در 36 سانتیگراد پرگنههاي با قطر حدود 4 میلیمتر گرد صاف و براق با رنگ زرد طلایی به عنوان پرگنههاي مشکوك به استافیلوکوکوس اوري وس در نظر گرفته شدند. شناسایی استافیلوکوکوس اوري وس بر اساس خصوصیات همولیز و مورفولوژي کلنیها رنگآمیزي گرم تست کاتالاز و تخمیر قند مانیتول انجام شد (2011.(Quinn تمام جدایهها پس از تعیین هویت تا شروع مراحل مولکولی در محیط تریپتیک سوي براث (TSB) و در 1- National Institute for Allergy and Infectious Diseases 6 مجله دامپزشکی ایران دوره چهاردهم شماره 2 تابستان 1397

3 تعیین فراوانی ژنهاي sea و seb در نمونههاي... حضور 20 درصد گلیسرول در دماي 20- درجهي سانتی- گراد نگهداري شدند. به منظور استخراج DNA باکتري از کیت استخراج ژنومی باکتريهاي گرم مثبت شرکت ویژن (DELTA TM Life science, Iran) شرکت سازندهي کارایی مرحلهي کیت استفاده گردید. استخراج و تشخیص کیف تی پارس دلتا و براساس پروتکل به منظور تا یید DNA استخراجی الکتروفورز نمونههاي استخراجی بر روي ژل آگاروز 1 درصد و با ولتاژ 80 ولت به مدت 20 دقیقه انجام شد. به منظور تا یید مولکولی اوري وس از تکثیر ژن پرایمرهاي مورد استفاده nuc شامل جدایههاي استافیلوکوکوس استفاده گردید. توالی Forward primer: 5 - GCGATTGATGGTGATACGGTT-3 Reverse و primer: 5 -AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC- 3 میباشد 1992) al..(brakstad et واکنش تکثیر در میکروتیوبهاي میکرولیتري و 0/2 در حجم نهایی 25 میکرولیتر و در دستگاه ترموسایکلر (USA) BioRad T100 انجام گردید. مخلوط PCR شامل میکرولیتر مسترمیکس 12/5 آماده 2X 0.08 units/μl ) Taq DNA polymerase in reaction buffer, 3 mm (CinnaGen, Iran) (MgCl 2, 0.4 mm of each dntp 0/5 میکرولیتر از هر کدام از پرایمرهاي آغازگر (با غلظت 0/4 میکرولیتر 1 میکرومول) استخراج شده DNA (با غلظت 50 نانوگرم) و 10/5 میکرولیتر آب دیونیزه دوبار تقطیر بود. چرخهي دمایی واکنش تکثیر ژن nuc شامل مراحل دناتوریزاسیون اولیه در 94 C به مدت 3 دقیقه 35 بار تکرار مراحل دناتوریزاسیون در 1 به مدت 94 C دقیقه اتصال پرایمر در 55 C به مدت 30 ثانیه و امتداد در 72 C به مدت 50 ثانیه و مرحلهي امتداد نهایی در.(Brakstad et al. 1992) به مدت 3 دقیقه میباشد 72 C محصول حاصل از تکثیر بر روي ژل آگاروز 1/5 درصد رنگآمیزي شده با اتیدیوم بروماید و در حضور 100 bp DNA ladder (CinnaGen, Iran) ولت به 80 در ولتاژ 60 مدت استفاده سویهي دقیقه الکتروفورز گردید. استاندارد مسترمیکس فاقد DNA بود. ATCC کنترل مثبت مورد و کنترل منفی در مورد نمونههاي تا یید شده به عنوان استافیلوکوکوس اوري وس nuc وجود ژن انتروتوکسین به روش تکثیر مولکولی ژن A پرایمرهاي اختصاصی بررسی گردید. sea از جفت پرایمر B و sea 1 :TTGGAAACGGTTAAAACGAA sea 2 :GAACCTTCCCATCAAAAACA تشخیص ژن توسط جفت براي تشخیص ژن داراي seb از جفت پرایمر seb 1 :TCGCATCAAACTGACAAACG seb 2 :GCAGGTACTCTATAAGTGCC.(Johnson et al. 1991) و توالی و براي با توالی استفاده و شد واکنش PCR براي هر یک از ژنهاي sea و seb به صورت جداگانه با استفاده از کیت شرکت سیناژن (CinnaGen, Iran) در حجم نهایی 25 میکرولیتر حاوي 12/5 میکرولیتر مسترمیکس ) 2X 0.08 units/μl Taq DNA polymerase in reaction buffer, 3 CinnaGen, ) (mm MgCl 2, 0.4 mm of each dntp (Iran 0/7 میکرولیتر از هر یک از پرایمرهاي مستقیم و معکوس (با غلظت 0/5 میکرومول) و 2 میکرولیتر DNA استخراج شده چرخهي (با غلظت دمایی واکنش 50 PCR نانوگرم ( انجام گرفت. شامل seb و sea ژنهاي مراحل دناتوریزاسیون اولیه در 94 C به مدت 2 دقیقه 35 بار تکرار مراحل دناتوریزاسیون در در 2 به مدت 94 C دقیقه اتصال پرایمر در 55 C به مدت 45 ثانیه و امتداد دقیقه و مرحلهي 1 به مدت 72 C امتداد نهایی در.(Johnson et al. 1991) به مدت 5 دقیقه میباشد 72 C محصول تکثیر بر روي ژل آگاروز اتیدیوم بروماید و در حضور حاوي درصد 1/5 bp DNA ladder 100 (CinnaGen, Iran) مري ی شد. کنترل مثبت مورد استفاده در چرخهي تکثیر ژنهاي sea و seb به ترتیب سویههاي استاندارد شامل ATCC ATCC و و کنترل منفی مسترمیکس فاقد DNA بودند. 7 مجله دامپزشکی ایران دوره چهاردهم شماره 2 تابستان 1397

4 الهام احمدي عباس قوزیوندي و همکاران نتایج 32 در این تحقیق تعداد 28 جدایه (23/33 درصد) باکتري استافیلوکوکوس اوري وس از نمونههاي شیر گاو و تعداد (26/66 جدایه درصد ( باکتري استافیلوکوکوس اوري وس از نمونههاي شیر گوسفند و بز شامل 31/66 درصد (19 مورد) از نمونههاي شیر گوسفند و 21/66 درصد (13 مورد ( از نمونههاي شیر بز جمعآوري از شهرستان سنندج براساس روشهاي فنوتیپی و حضور ژن (شکل nuc ( 1 شناسایی و جهت تعیین وجود ژنهاي مولد انتروتوکسین A و B مورد بررسی قرار گرفتند. در مورد باکتري استافیلوکوکوس اوري وس جدا شده از شیر گاو ژن حالی درصد 100 در sea که تمام جدایهها فاقد ژن جدایهها شناسایی شد در در مورد بودند. seb ایزولههاي استافیلوکوکوس اوري وس با منشا گوسفند و بز ژن sea در 18 مورد و ژن seb در 6 مورد ردیابی گردید که به تفکیک 1 جدول در آورده شده است. تکثیر sea قطعهاي با اندازهي 120 bp محصول (شکل 2) و در مورد seb قطعهاي به اندازهي 478 bp (شکل 3) میباشد. جدول 1: تعداد و درصد فراوانی ژنهاي sea و seb تعداد و درصد فراوانی ژن در جدایههاي استافیلوکوکوس اوري وس با منشاي بزي 07/23) درصد) 3 در باکتري استافیلوکوکوس اوري وس جدا شده از نمونههاي شیر ورم پستانی گوسفند و بز در شهرستان سنندج تعداد و درصد فراوانی ژن در جدایههاي استافیلوکوکوس اوري وس با منشاي گوسفندي 94/78) درصد) 15 نوع ژن sea seb 52/10) درصد) 2 78/30) درصد) 4 شکل 1: تصویر الکتروفورز حاصل از تکثیر ژن nuc در جدایههاي استافیلوکوکوس اوري وس M=100 bp Marker (CinnaGen, Iran), PC=Positive Control, NC=Negative Control, Lanes 1-9=275 bp nuc PCR product 8 مجله دامپزشکی ایران دوره چهاردهم شماره 2 تابستان 1397

5 تعیین فراوانی ژنهاي sea و seb در نمونههاي... شکل 2: تصویر الکتروفورز حاصل از تکثیر ژن sea در جدایههاي استافیلوکوکوس اوري وس M=100 bp Marker (CinnaGen, Iran), PC=Positive Control, NC=Negative Control, Lanes 1-9= 120 bp sea PCR product شکل 3: تصویر الکتروفورز حاصل از تکثیر ژن seb در جدایههاي استافیلوکوکوس اوري وس M=100 bp Marker (CinnaGen, Iran), PC=Positive Control, NC=Negative Control, Lanes 1-6= 478 bp seb product بحث جدایههاي درمانگاهی استافیلوکوکوس اوري وس قادر به تولید طیف وسیعی از توکسینها و عوامل حدت هستند که در بیماريزایی جرم مو ثر میباشند ) al. Ono et. (2008 قوانین بهداشتی ایران هیچ نوع محدودیتی را براي میزان استافیلوکوکوس اوري وس در شیر تعیین نکرده است و لذا شیر خام میتواند به یکی از راههاي مهم ورود انتروتوکسین به چرخهي غذایی انسان باشد. این باکتري علاوه بر حضور بر روي پوست سرپستانک و یا در داخل 9 مجله دامپزشکی ایران دوره چهاردهم شماره 2 تابستان 1397

6 الهام احمدي عباس قوزیوندي و همکاران کانال پستانی میتواند به صورت اگزوژن از طریق و دستگاه شیردوشی فومیتها حوله مورد استفاده براي خشک کردن سرپستانکها دست شیردوش و غیره به دامها منتقل و باعث ایجاد ورم پستان درمانگاهی و تحت درمانگاهی گردد عفونتهاي استافیلوکوکی. (Anderson et al. 2012) در دام در نتیجه از یک سو با ایجاد خسارات اقتصادي گسترده به صنعت دامپروري و از سوي دیگر با احتمال ایجاد مسمومیت غذایی ناشی از اگزوپروتي ینهاي انتروتوکسین همواره از دو جنبهي دامپزشکی و بهداشت عمومی حاي ز اهمیت بوده است. 5 چه اگر نوع انتروتوکسین کلاسیک و حدود انتروتوکسین غیرکلاسیک وجود دارند نوع 15 در این مطالعه فراوانی ژنهاي مولد انتروتوکسینهاي A و B به عنوان مهمترین انتروتوکسینهاي این باکتري بدون در نظر گرفتن بیان و یا عدم بیان ژنها در نمونههاي شیر خام گاو گوسفند و بز در شهرستان سنندج بررسی گردید. از مجموع 120 نمونه شیر خام گاو و 120 نمونه شیر خام گوسفند و بز باکتري استافیلوکوکوس اوري وس از تعداد 28 نمونه شیر گاو و 32 نمونه شیر گوسفند و بز به روش باکتریولوژیکی و مولکولی شناسایی و تا یید گردید. فراوانی ژن فراوانی ژن sea در جدایههاي گاوي 100 sea و seb گوسفند و بز به ترتیب بودند. در 56/25 مجموع درصد و درصد جدایههاي با منشا درصد 18/75 و اغلب ژنهاي کد کنندهي انتروتوکسینها بر روي 1 عوامل ژنتیکی متحرك نظیر پلاسمیدها پروفاژها و جزایر 2 پاتوژنیک استافیلوکوکی قرار دارند Srinivasan et al. ).(2006 هاي کسب انتقال افقی عوامل ژنتیکی متحرك یکی از روش- این استافیلوکوکوس اوري وس فاکتورهاي است حدت در باکتري.(Gill et al. 2005) احتمال میرود که یکی از دلایل وجود ژن sea در 100 درصد جدایههاي استافیلوکوکوس اوري وس با منشا گاوي به دلیل وجود ژنوتیپهاي محدود باکتري در جمعیت گاوهاي شهرستان سنندج و انتقال افقی این ژن در بین آنها باشد Katsuda et al. 2005, Mellmann et al. ).(2008 اگر چه نقش انتروتوکسینها در حدت باکتري استافیلوکوکوس اوري وس در دام نامشخص است با این وجود استافیلوکوكهاي داراي ژنهاي انتروتوکسین از نمونههاي شیر ورم پستانی درمانگاهی و تحت درمانگاهی به فراوانی جدا میشوند. در در بررسی نمونههاي شیر گاوي ارومیه میزان شیوع آلودگی با استافیلوکوکوس اوري وس 21 درصد گزارش شده است با این وجود در هیچ یک از جدایهها ژنهاي sea و seb حضور نداشته و فقط در 5 مورد از مجموع 50 جدایه sec در دستهي ژن- هاي انتروتوکسینهاي کلاسیک ردیابی شده است 2013).( Ahmadi and Dastmalchi Saei همچنین در محصولات لبنی تهیه شده از شیر گاو به روش سنتی در تهران در 32 درصد اوري وس گزارش و ژن نمونهها آلودگی با استافیلوکوکوس sea در 15/6 درصد و ژن seb در 9/3 درصد شناسایی شده است ) al. Imani-Fooladi et.( 2010 در استان فارس میزان آلودگی با باکتري استافیلوکوکوس اوري وس در نمونههاي شیر گاو 16 درصد و در نمونههاي شیر گوسفند 10 درصد و با فراوانی 50 sea درصد در آنها گزارش شده است Rahimi and ). (Alian 2013 فراوانی کلی باکتري استافیلوکوکوس اوري وس در نمونههاي شیر شهرستان ماکو نسبتا بالا (42/7 درصد) گزارش شده است که علت احتمالی آن را شیوع بالاي ورم پستان تحت عنوان کردهاند درمانگاهی. (Sadeghi 2015) استافیلوکوکوس اوري وس گاوي در کره در شناسایی شده است 36 حاضر که فراوانی ژن مطالعهاي که بر روي 52 ناشی از این باکتري از مجموع 37 جدایه جدا شده از شیر ورم پستان seb مورد 3 و در sea مورد.(Lim 2004) sea بر بیشتر از خلاف مطالعهي میباشد در seb نمونه استافیلوکوکوس اوري وس جدا شده از شیر گوسفندي در شمال فلسطین انجام شده 1- Mobile genetic elements 2- Staphylococcal pathogenic islands 10 مجله دامپزشکی ایران دوره چهاردهم شماره 2 تابستان 1397

7 تعیین فراوانی ژنهاي sea و seb در نمونههاي... است غالب نمونهها (54/1 درصد) داراي ژن seb بودهاند.(Adwan et al. 2005) شده است مشخص گردیده که باکتري استافیلوکوکوس اوري وس در طی تحقیقی که در چین انجام درصد 65 سویههاي جدا شده از شیر گاو داراي ژنهاي انتروتوکسین میباشند که بیشترین فراوانی (36 درصد ( مربوط به sea بوده و همچون مطالعهي حاضر seb در هیچ یک از جدایهها شناسایی نشده است.(Chen et al. 2009) علت تفاوت در فراوانی این ژنها در مطالعات مختلف را میتوان به تفاوت در شیوع جغرافیایی و دورهاي انتروتوکسینزا در مناطق مختلف استافیلوکوکوس اوري وس نسبت داد ) al. Hwang et.(2010 اگر چه امکان شناسایی ژنهاي مولد انتروتوکسین به روش ایمنولوژیکی همچون الایزا لاتکس آگلوتیناسیون لاتکس ایمنواسی و ایمنوکروماتوگرافی به صورت تجاري وجود دارند اما این تستها داراي حساسیتهاي مختلفی بوده و نتایج حاصل از آنها وابسته به میزان بیان ژن و تولید محصول پروتي ینی انتروتوکسین است ) al. Wu et 2016 ) در نتیجه سویههاي استافیلوکوکوس اوري وس انتروتوکسینزا با قابلیت تولید سطوح کم توکسینهاي ترشحی (کمتر از میزان آستانهي تشخیص تست) و یا در صورت وجود آنتیژنهاي ایجاد کنندهي واکنشهاي متقاطع به دقت توسط این روشها شناسایی نمیشوند. (Van Belkum 2003) مزیت غالب در PCR روش شناسایی ژنهاي مولد انتروتوکسین در این است که امکان شناسایی سویههاي داراي ژنهاي SE را مستقل از میزان بیان آنها فراهم ساخته و نیز به دلیل تکثیر اختصاصی ژن نتایج مثبت تنها در صورت وجود ژن مورد مطالعه ایجاد میشود. از سوي دیگر شناسایی ژن در روش مولکولی لزوما به معنی بیان آن ژن و تولید محصول پروتي ینی نمی- باشد زیرا عوامل مختلفی همچون تعداد باکتري (cfu/ml) فاکتورهاي محیطی شامل درجهي حرارت ph میزان آب فعال و فاکتورهاي وابسته به میزبان در بیان ژن مو ثر می- باشند. (Loncarevic et al. 2005) روشهاي ایمنولوژیکی و مولکولی در نتیجه همراهی شناسایی دقیق امکان ژن و میزان بیان آن را به صورت همزمان فراهم ساخته و لذا نتایج حاصله میتواند با احتمال بیشتري در پیشبینی نقش ژنهاي انتروتوکسین در بروز مسمومیتهاي غذایی استافیلوکوکی در انسان قابل استناد باشند. بر اساس نتایج فوق آلودگی شیرهاي خام در شهرستان سنندج به باکتري استافیلوکوکوس اوري وس رسیده است. به اثبات با توجه به وجود ژن انتروتوکسین در 100 درصد ایزولههاي با منشاي گاوي و 75 درصد ایزولههاي با منشاي گوسفندي-بزي نقش بالقوهي این باکتري در ایجاد مسمومیت غذایی استافیلوکوکی در شهرستان سنندج حاي ز اهمیت میباشد. لذا شناسایی و درمان سریع و مو ثر عفونتهاي پستان در دامهاي اهلی نه تنها در کاهش خسارات اقتصادي بهداشت عمومی نیز مو ثر میباشد. بلکه در حفظ سلامت انسان و تشکر و قدردانی میگردد. بدین وسیله از زحمات سرکار خانم مهندس فاطمه خانمحمدي و جناب آقاي مهندس علی کاظمنیا تشکر و قدردانی 11 مجله دامپزشکی ایران دوره چهاردهم شماره 2 تابستان 1397

8 الهام احمدي عباس قوزیوندي و همکاران Adwan, G.; Abu-Shanab, B. and Adwan, K. (2005). Enterotoxigenic Staphylococcus aureus in raw milk in the North of Palestine. Turkish Journal of Biology, 29: Ahanotu, E.; Alvelo-Ceron, D.; Ravita, T. and Gaunt, E.D. (2006). Staphylococcal enterotoxin B as a biological weapon: recognition, management, and surveillance of staphylococcal enterotoxin. Applied Biosafety, 11(3): Ahmadi, M. and Dastmalchi Saei, H. (2013). Detection of the enterotoxin-producing genes in Staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis milk by PCR in Tabriz and Urmia regions. Iranian Journal of Veterinary Research, 9 (3): (in persian) Anderson, K.L.; Lyman, R.; Moury, K.; Ray, D.; Watson, D.W. and Correa M.T. (2012). Molecular epidemiology of Staphylococcus aureus mastitis in dairy heifers. Journal of Dairy Science, 95 (9): Brakstad, O.G.; Aasbakk, K. and Maeland, J.A. (1992). Detection of Staphylococcus aureus by polymerase chain reaction amplification of the nuc gene. Journal of Clinical Mirobiology, 30 (7): Bystroń, J.; Bania, J.; Lis, E.; Molenda, J. and Bednarski M. (2009). Characterization of Staphylococcus aureus strains isolated from cow s milk. Bulletin of the Veterinary Institute in Pulawy, 53: Chen, F.J.; Hiramatsu, K.; Huang, I.W.; Wang, C.H. and Lauderdale, T.L. (2009). Panton- Valentine leukocidin (PVL)-positive methicillinsusceptible and resistant Staphylococcus aureus in Taiwan: identification of oxacillin susceptible meca-positive methicillin-resistant S. aureus. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 65 (4): Gill, S.R.; Fouts, D.E.; Archer, G.L.; Mongodin, E.F.; Deboy, R.T.; Ravel, J. et al. (2005). Insights on evolution of virulence and resistance from the complete genome analysis of an early methicillin-resistant Staphylococcus aureus strain and a biofilm-producing methicillinresistant Staphylococcus epidermidis strain. Journal of Bacteriology, 187 (7): Hwang, S.Y.; Park, Y.K.; Koo, H.C. and Park, Y.H. (2010). spa typing and enterotoxin gene profile of Staphylococcus aureus isolated from bovine raw milk in Korea. The Journal of Veterinary Science, 11 (2): Imani-Fooladi, A.A.; Riazipour, M. and Sattari, M. (2010). Molecular and serological detection of منابع Enterotoxigenic Staphylococcus aureus from traditionally dairy products. Journal of Shahrekord University of Medical Sciences, 11 (4): (in persian) Johnson, W.M.; Tyler, S.D.; Ewan, E.P.; Ashton, F.E.; Polland, D.R. and Rozee, K.R. (1991). Detection of genes for enterotoxins, exfoliative toxins, and toxic shock syndrome toxin 1 in Staphylococcus aureus by polymerase chain reaction. Journal of Clinical Microbiology, 29(3): Katsuda, K.; Hata, E.; Kobayashi, H.; Kohmoto, M.; Kawashima, K.; Tsunemitsu, H. et al. (2005). Molecular typing of Staphylococcus aureus isolated from bovine mastitic milk on the basis of toxin genes and coagulase gene polymorphisms. Veterinary Microbiology, 105(3-4): Lim, S.K.; Joo, Y.S.; Moon, J.S.; Lee, A.R.; Nam, H.M. and Wee, S.H. (2004). Molecular typing of enterotoxigenic Staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis in Korea. Journal of Veterinary Science, 66: Loncarevic, S.; Jorgensen, H.J.; Lovseth, A.; Mathisen, T. and Rorvik, L.M. (2005). Diversity of Staphylococcus aureus enterotoxin types within single samples of raw milk and raw milk products. Journal of Applied Microbiology, 98(2): Mellmann, A.; Weniger, T.; Berssenbrügge, C.; Keckevoet, U.; Friedrich, A.W.; Harmsen, D. et al. (2008). Characterization of clonal relatedness among the natural population of Staphylococcus aureus strains by using spa sequence typing and the BURP (based upon repeat patterns) algorithm. Journal of Clinical Microbiology, 46 (8): Ono, H.K.; Omoe, K.; Imanishi, K.; Iwakabe, Y.; Hu, D.L.; Kato, H. et al. (2008). Identification and characterization of two novel staphylococcal enterotoxins, types S and T. Infection and Immunity, 76: Pelisser, M.R.; Klein, C.S.; Ascoli, K.R.; Zotti, T.R. and Arisil, A.C.M. (2009). Occurrence of Staphylococcus aureus and multiplex PCR detection of classic enterotoxin genes in cheese and meat products. Brazilian Journal of Microbiology, 40 (1): Pinto, B.; Chenoll, E. and Aznar, R. (2005). Identification and typing of food-borne Staphylococcus aureus by PCR based techniques. Systemic and Applied Microbiology, 28 (4): مجله دامپزشکی ایران دوره چهاردهم شماره 2 تابستان 1397

9 تعیین فراوانی ژنهاي sea و seb در نمونههاي... Quinn, P.J. Staphylococcus aureus. In: Carter, J.R. and Wise, D.G. (2011). Principles in Veterinary Medicine. 3 rd ed. London, Mosby, Pp: Rahimi, E. and Alian, F. (2013). Presence of enterotoxigenic Staphylococcus aureus in cow, camel, sheep, goat, and buffalo bulk tank milk. Veterinarski Arhiv, 83 (1): Rall, V.L.; Vieira, F.P.; Rall, R.; Vieitis, R.L.; Fernandes, A.J.; Candeias, J.M. et al. (2008). PCR detection of staphylococcal enterotoxin genes in Staphylococcus aureus strains isolated from raw and pasteurized milk. Veterinary Microbiology, 132 (3-4): Sadeghi, M.R. (2015). The prevalence of Enterotoxigenic Isolates of Staphylococcus aureus in Bovine and Sheep Bulk Tank Milk Samples of Maku. Journal of Veterinary Microbiology, 11 (1): (in persian) Srinivasan, V.; Sawant, A.A.; Gillespie, B.E.; Headrick, S.J.; Ceasaris, L. and Oliver, S.P. (2006). Prevalence of enterotoxin and toxic shock syndrome toxin genes in Staphylococcus aureus isolated from milk of cows with mastitis. Foodborne Pathogenic Disease, 3 (3): Van Belkum, A. (2003). Molecular diagnostics in medical microbiology: yesterday, today, and tomorrow. Current Opinion in Pharmacology, 3 (5): Wu, S.; Duan, N.; Gu, H.; Hao, L.; Ye, H.; Gong, W. et al. (2016). A review of the methods for detection of Staphylococcus aureus enterotoxins. Toxins, 8 (7): مجله دامپزشکی ایران دوره چهاردهم شماره 2 تابستان 1397

10 Vol. 14, No. 2, Summer, 2018 Identification of sea and seb frequency in Staphylococcus aureus isolated from cow, sheep and goat mastitic milk samples in Sanandaj city Ahmadi, E. 1 ; Ghuzivandi, A. 2 ; Ebrahim Pourbaser, K. 2 and Karimi Dareabi, H. 1 Received: Accepted: Abstract Staphylococcus aureus is one of the most important causes of food poisoning in human. The main etiological agent, staphylococcal enterotoxins (SEs) are in different types. Based on the plausible role of contaminated milk with enterotoxigenic strains of this bacterium in human food poisoning and the important role of SEA and SEB in bacterial intestinal pathogenesis, plus with the multiple role of SEB as a biological weapon on one hand, and the lack of any data on the role of milk and the two mentioned enterotoxins in public health threatening in Sanandaj on the other hand, this study was aimed to determine the prevalence of sea and seb genes, as the most clinically important enterotoxins in mastitic milk samples. 120 cow, 60 sheep, and 60 goat mastitic milk samples were collected under sterile conditions and analyzed for the presence of S. aureus by routine bacteriological methods. The isolates were confirmed by thermonuclease (nuc)-based PCR and were evaluated for detection of sea and seb genes using molecular technique. Totally, 23.33% (28 numbers) of cow milk, 31.66% (19 numbers) of sheep milk, and 21.66% (13 numbers) of goat milk samples were contaminated with S. aureus. Among the bovine originated S. aureus, 100% were found to harbor sea with no seb. sea was detected in 78.94% (15 numbers) and 23.07% (3 numbers) of S. aureus isolates with ovine and caprine origins, respectively, and seb was detected in 10.52% (2 numbers) and 30.78% of S. aureus with ovine and caprine origins, respectively. The high percentage of SE genes in S. aureus isolated from milk samples constitutes a potential risk for consumers health. Therefore, improving the hygienic quality of milk is essential in the mentioned area. Key words: Staphylococcus aureus, Enterotoxin, mastitic milk, Polymerase chain reaction (PCR) 1- Assistant Professor, Department of Pathobiology, Faculty of Veterinary Medicine, Sanandaj Branch, Islamic Azad University, Sanandaj, Iran 2- DVM Graduated from Faculty of Veterinary Medicine, Sanandaj Branch, Islamic Azad University, Sanandaj, Iran Corresponding Author: Ahmadi, E., elham.ahmadi.vet@gmail.com Iranian Veterinary Journal 126