JCP بررسی فراوانی اینتگرونهاي کلاس I و پلاسمید حدت در سویههاي بالینی سالمونلا تیفی موریوم چکیده مقدمه فرناز حسنیه کیومرث امینی میترا صالحی

Transcript

1 پاتوبیولوژي مقایسهاي علمی پژوهشی سال یازدهم بهار شماره بررسی فراوانی اینتگرونهاي کلاس و پلاسمید حدت در سویههاي بالینی سالمونلا تیفی موریوم 3 2* 1 فرناز حسنیه کیومرث امینی میترا صالحی چکیده سرووارهاي مشخصی از سالمونلا متعلق به تحت گونه سالمونلا انتریکا پلاسمید حدت حامل اپرون SPV را حمل میکنند. این اپرون به همراه دیگر ژنها در ایجاد حدت و مقاومت دارویی نقش عمدهاي دارد. لذا با توجه به اهمیت موضوع در این تحقیق به بررسی فراوانی اینتگرونهاي کلاس پلاسمید حدت در سویههاي بالینی سالمونلا تیفی موریوم پرداخته شده است. و تعداد 663 نمونه مدفوعی از بیمارستانهاي سطح شهر تهران جمعآوري گردید. بعد از انجام آزمایشات بیوشیمیایی بر روي نمونهها تعداد 37 جنس سالمونلا جداسازي گردید. سپس با استفاده از پرایمرهاي اختصاصیST11 و Fli15 ST15 Typ04 به ترتیب مربوط به شناسایی جنس و گونه از مجموع 37 سالمونلا 12 جدایه به عنوان سالمونلا تیفی موریوم تاي ید گردید. در نهایت آزمایش Multiplex PCR با استفاده از پرایمرهاي nt وVirجهت بررسی حضور اینتگرونهاي کلاس و پلاسمید حدت انجام گردید. نتایج نشان داد که از مجموع 12 جدایه 4 جدایه (%33/3) داراي ژن مربوط به اینتگرون کلاس و 5 جدایه (%41/7) داراي پلاسمید حدت بودند. حضور ژنهاي پلاسمید حدت و اینتگرونهاي کلاس -1 در بین سویههاي تیفی موریوم جدا شده در مطالعه حاضر نشان میدهد با توجه به انتقال افقی این ژنها این جدایهها میتوانند مشکلات جدي در سلامت عمومی بهداشت جامعه و درمان ایجاد نمایند. واژگان کلیدي: سالمونلا تیفی موریوم پلاسمید حدت اینتگرون. تاریخ دریافت: 92/4/18 مقدمه تاریخ پذیرش: 92/6/2 باکتري سالمونلا یکی از اعضاء خانواده انتروباکتریاسه است که به صورت باسیلهاي گرم منفی با تاژههاي پري تریش دیده میشود (1). این باکتري یکی از شایعترین باکتريهاي قابل انتقال از حیوانات به انسان است که به دلیل تنوع مخازن حیوانی یکی از مهمترین عوامل بیماريهاي قابل انتقال از غذا و یکی از مشکلات بهداشتی در سراسر جهان محسوب میگردد (16). دانشگاه آزاد اسلامی واحد قم گروه میکروبیولوژي قم ایران * 2 دانشگاه آزاد اسلامی واحد پردیس علوم تحقیقات ساوه گروه میکروبیولوژي ساوه ایران Kamini@iau.saveh.ac.ir 3- استادیار گروه میکروب شناسی دانشگاه آزاد اسلامی واحد تهران شمال تهران ایران سالمونلاها بیماريهایی را در انسان ایجاد میکند که به اشکال بالینی گاستروانتریت تب رودهاي (تیفوي ید یا پاراتیفوي ید) و سپتی سمی تظاهر مییابند (6). پیدایش روز افزون مقاومت آنتی بیوتیکی به خصوص مقاومت چند دارویی در سالمونلا انتریکا یک نگرانی مهم است. ژنهاي مقاومت آنتی میکروبی ممکن است از طریق اجزا ژنتیکی متحرك نظیر پلاسمیدها ترانسپوزونها و اینتگرونها گسترش یابند (7). اینتگرونها عناصر ژنتیکی هستند که توانایی تسخیر کردن ژنها را به وسیلهي نوترکیبی اختصاصی مکان دارند (9). اینتگرونهاي کلاس شایعترین نوع اینتگرونها در بسیاري از کشورها در سرووارهاي مختلف سالمونلا میباشند (11). این اینتگرونها شامل یک قطعه حفاظت شده '5 (5'CS) و یک قطعه حفاظت شده '3 (3'CS) میباشند. 5'CS حاوي ژن کد کننده آنزیم اینتگراز کلاس است و همچنین سایت نوترکیبی (att1) در این ناحیه قرار دارد. 3'CS شامل یک ژن qaceδ1 است که مقاومت به ترکیبات 4 گانه آمونیوم را اعطا میکند و ژن دیگر این ناحیه sul میباشد که مقاومت به سولفونامیدها را ایجاد مینماید (9). ارتباط اینتگرونها با عناصر متحرك و ژنهاي مقاومت منجر به گسترش و انتشار سریع آنها در بین باکتري ها در محیط هایی که در معرض آنتی بیوتیک قرار دارند میگردد (18). پلاسمید حدت در سرووارهاي متعددي از سالمونلا انتریکا حامل اپرونSPV است. این اپرون که در حدود 8 کیلو باز است نقش مهمی در حدت باکتري در برابر میزبان ایفا میکند.(4) این اپرون از 5 ژن spvd spvc spvb spva 1153

2 فرناز حسنیه کیومرث امینی میترا صالحی و spvr تشکیل شده است که در تقویت و افزایش گسترش سیستمیک پاتوژن نقش دارد (18). ژنهاي spv در گونههاي سالمونلا بونگوري Bongori).S) حضور ندارند ولی در تحت گونه هاي V V a سالمونلا انتریکا مشخص شدهاند (12). تحقیقات در سالهاي اخیر نشان داده است که پلاسمیدهاي مقاومت ویرولانس نیز میتوانند شکل بگیرند. اینها پلاسمیدهاي هیبریدي هستند که حامل عوامل موثر در مقاومت و ویرولانس یا بیماریزایی میباشند( 17 و 13 8). لذا با توجه به اهمیت موضوع در مطالعه حاضر با استفاده از روش Multiplex PCR به بررسی حضور ژنهاي حدت و اینتگرونهاي کلاس در سویه هاي بالینی سالمونلا تیفی موریوم به طور همزمان پرداخته شده است. مواد و روش کار تعداد 663 نمونه از مدفوع بیماران در مراکز درمانی سطح شهر تهران جداسازي گردید. نمونههاي مدفوع بلافاصله پس از نمونهگیري به محیط کشت راپاپورت واسیلیادیس Vasiliadis) (Rappaport منتق ل گردید و ب ه آزمایشگاه میکروبشناسی انتقال داده شد. سپس بعد از 24 ساعت انکوباسیون به محیط هاي کشت انتخابی مانند سالمونلا- شیگلا آگار ( ssآگار) انتقال داده شد و به مدت 24 ساعت در دماي 37 درجه سانتیگراد قرار داده شد. سپس کلونیهاي مشکوك به سالمونلا جداسازي و جهت انجام تستهاي بیوشیمایی استاندارد نظیر سیمون سیترات MR- SM TS VP و اوره مورد شناسایی قرار گرفت. باکتري جدا شده با ویژگیهاي بیوشیمیایی لاکتوز منفی H 2 S مثبت حرکت مثبت سیترات مثبت متیل رد مثبت هیدرولیز اوره منفی به عنوان یک جدایه متعلق به جنس سالمونلا تعیین گردید. سپس جهت تایید سالمونلا تیفی موریوم ازروش PCR چندگانه با استفاده از پرایمرهاي اختصاصیST11 ST15 Fli15 و Typ04 به ترتیب مربوط به شناسایی جنس وگونه استفاده گردید. براي این روش ژنوم سالمونلا با استفاده از کیت استخراج DNA ژنومی باکتري استخراج گردید. بعد از انجام واکنش PCR و تاي ید جنس و گونه تیفی موریوم آزمون Multiplex PCR براي بررس ی حضور ژنهاي پلاسمید حدت و اینتگرونه اي کلاس بک ار گرفت ه شد(جدول 1). سپس جهت آشکارسازي DNA تکثیر یافته از الکتروفورز نمونهها بر روي ژل آگارز %0/8 استفاده گردید. جدول 1- پرایمرهاي مربوط به شناسایی اینتگرون هاي کلاس و پلاسمید حدت (10). توالی پرایمر (5 3 ) ژن هدف نام پرایمر FloF FloR flo st (florfenicol) ACCCGCCCTCTGGATCAAGTCAAG CAAATCACGGGCCACGCTGTATC محصول (bp) PCR 584 VirF VirR spvc (virulence) GGGGCGGAAATACCATCTACA GCGCCCAGGCTAACACG 392 nvf nvr inva (invasion) CGCGGCCCGATTTTCTCTGGA AATGCGGGGATCTGGGCGACAAG 321 ntf ntr int (integron) GCCCTCCCGCACGATGAT ATTGGCGGCCTTGCTGTTCTTCTA

3 پاتوبیولوژي مقایسهاي علمی پژوهشی سال یازدهم بهار شماره واکنش Multiplex PCR در حجم نهایی 50 میکرولیتر شامل بافر PCR (حاوي 15 میلی مولار (MgCl 2 5 میکرولیتر 4 dntps میکرولیتر 0/5 میکرولیتر از هر پرایمر 1 واحد آنزیم Taq پلیمراز DNA الگو 1 میکرولیتر و آب مقطر استریل 36 میکرولیتر انجام شد. از برنامه Multiplex PCR که شامل دناتوراسیون اولیه در 94 درجه سانتی گراد به مدت 90 ثانیه با تکرار 1 سیکل دناتوراسیون در 94 درجه سانتی گراد به مدت 45 ثانیه با تکرار 30 سیکل اتصال پرایمرهاي در 60 درجه سانتی گراد به مدت 45 ثانیه با تکرار 30 سیکل بسط ابتدایی در 72 درجه سانتی گراد به مدت 90 ثانیه با تکرار 30 سیکل و تکثیر نهایی در 72 درجه سانتی گراد به مدت 3 دقیقه با تکرار 1 سیکل استفاده گردید. از سویه استاندارد تیفی موریوم موجود در کلکسیون میکروبی دانشگاه آزاد ساوه با ATCC به عنوان کنترل مثبت استفاده گردید. باکتري سالمونلا تیفی موریوم تعدادکل نتایج بعد از انجام آزمایشات بیوشیمیایی و مولکولی بر روي نمونه هاي بالینی جدا شده از مجموع 663 نمونه 37 جدایه مشکوك به سالمونلا تشخیص داده شد و با استفاده از واکنش Multiplex PCR از مجموع 37 جدایه جنس سالمونلا 12 گونه تیفی موریوم تایید گردید. از این 12 جدایه 4 جدایه براي ژن int که ژن مربوط به اینتگرون کلاس میباشد مثبت بودند و 5 جدایه ژن spvc که ژن مربوط به پلاسمید حدت میباشد را دارا بودند. تمام 12 جدایه جدول 2 - درصد فراوانی ژنها ژنint باند inva که ژن مربوط به تهاجم میباشد را نشان دادند. 4 جدایه نیز براي ژن flo st که ژن مقاومت به آنتی بیوتیک فلورفنیکل میباشد مثبت بودند(نگاره 1). درصد فراوانی ژنهاي فوق در جدول 2 بیان شده است. ژنspvC ژنinvA ژن flo st 4( %33/3) 12( %100) 5(%41/7) 4(%33/3) 12 نگاره 1- نتایج حاصل از Multiplex PCR سویههاي سالمونلا تیفی موریوم به ترتیب از سمت چپ 1- bp Ladder کنترل مثبت 584 bp 392 bp 321 bp 265 bp ATCC14028) 3 S.Typhimurium( تا -14 سویههاي بالینی S.Typhimurium 15- کنترل منفی(آب مقطر). بحث بیماري منتقل شونده از راه غذا که به وسیله سالمونلاهاي غیرتیفوي یدي ایجاد میشود یک مشکل عمده سلامت عمومی در جهان است (7). اخیرا ظهور سویههاي واجد مقاومت چندگانه آنتی بیوتیکی سبب بروز مشکلاتی در درمان عفونت حاصل از این باکتري در انسانها و حیوانات شده است (14). بسیاري از ژنهاي مقاوم به آنتی بیوتیک در سالمونلا در عناصر یا اجزاء ژنتیکی متحرك به خصوص اینتگرونهاي کلاس شناسایی شدهاند که غالبترین نوع اینتگرون در بین سالمونلاهاي داراي مقاومت چندگانه آنتی بیوتیکی میباشند (5). اپرون SPV در پلاسمید ویرولانس چندین سرووار از زیرگونههاي سالمونلا انتریکا وجود دارد که مسي ول عفونت سیستمیک و مقاومت چند 1155

4 فرناز حسنیه کیومرث امینی میترا صالحی دارویی در انسانها و حیوانات میباشد. ژنهاي این اپرون همچنین مسي ول القا تکثیر باکتریایی در داخل سلول و آپوپتوزیز ماکروفاژهاي آلوده شده هستند (2). سویههایی از باکتري سالمونلا به خصوص تیفی موریوم و انتریتیدیس که حامل پلاسمید ویرولانس هستند میتوانند بیماري سیستمیک ایجاد کنند در حالی که گونههاي فاقد پلاسمید حدت میتوانند بیماري موضعی یا بدون علامت را ایجاد کنند (2). عامل حدت اپرون SPV را به spvb و spvc نسبت دادهاند و ژنهاي spvb و spvc میتوانند به تنهایی جایگزین همه ژنهاي اپرون SPV پلاسمید حدت از سرووار تیفی موریوم گردند (6). یافتههاي ما نشان داد که تقریبا نیمی از جدایه ها براي ژن spvc مثبت بودند. در مطالعه انجام شده توسط Chiu و همکاران در سال 2006 در کشور تایوان بر روي 59 سالمونلا تیفی موریوم جدا شده از انسان نشان داد که 91/5 درصد آنها واجد پلاسمید حدت بودند (3). در مطالعه اي که توسط Wienser و همکاران در سال 2009 در کشور مکزیک بر روي 76 جدایه سالمونلا تیفی موریوم انسانی انجام گردید مشخص شد که 32/9 درصد از آنها داراي پلاسمید حدت بودند (19). شیوع اینتگرون هاي کلاس در مطالعه حاضر در مقایسه با مطالعات دیگران نیز تفاوتهایی را نشان میدهد. در مطالعهاي که توسط Zhang و همکاران در سال 2004 در کشور چین بر روي 23 سالمونلا جدا شده از انسان انجام گردید مشخص شد 17/3 درصد جدایهها داراي اینتگرون کلاس بودند (20). در مطالعه انجام شده توسط Jin و همکاران در سال 2009 در کشور هنگ کنگ بر روي 834 سالمونلاي جدا شده از انسان مشخص گردید که 13 درصد از آنها داراي اینتگرون کلاس بودند (9). در مطالعهاي که توسط رجایی بر روي که 59/5 بودند و همکاران در سال 2011 در ایران 84 سالمونلا جدا شده از انسان انجام گردید معلوم شد درصد از جدایهها از اینتگرون کلاس برخوردار ( 15 ).تفاوت در شیوع اینتگرونهاي کلاس و همچنین پلاسمید حدت در مطالعه حاضر در مقایسه با مطالعات دیگران احتمالا میتواند به دلیل تفاوت در رعایت بهداشت در بین جمعیت هاي انسانی و یا حیوانی در کشورهاي مختلف و همچنین مناطق مختلف یک کشور باشد. همچنین احتمالا میتواند به دلیل تفاوت در میزان استفاده از مواد ضد میکروبی در درمان انسان و حیوان در کشورهاي مختلف باشد. وجود اینتگرونهاي کلاس و پلاسمید حدت در بین جدایههاي بدست آمده در مطالعه حاضر و احتمال انتقال افقی آنها ما بین سویهها میتواند نشان دهنده یک زنگ خطر جدي در جامعه بهداشتی ما باشد. برخورداري این جدایهها از پلاسمید حدت و اینتگرونهاي کلاس نشان میدهد که این جدایهها میتوانند مشکلات جدي در سلامت عمومی بهداشت جامعه و درمان ایجاد نمایند. نتیجه نهایی اینکه روشهاي تشخیصی سریع مانند Multiplex PCR میتواند در شناسایی همزمان ژنهاي اینتگرون و پلاسمید حدت مفید باشد. با شناسایی این ژنها و اطلاع از حضور آنها و با درمان آنتی بیوتیکی به موقع و استفاده از آنتی بیوتیکهاي مناسب و با رعایت دوز کامل میتوان از انتقال این ژنها مابین سویهها جلوگیري به عمل آورد. فهرست منابع 1. رنجبر ر. ناغونی ع. تبراي ی ب. (1387): ناهمگونی الگوي مقاومت آمینو گلیکوزیدي در میان ایزوله هاي بالینی سالمونلا در تهران مجله میکروب شناسی پزشکی ایران (2): 33-,27 2. Amini, K., Zahreai salehi, T., Nikbakht, G., Ranjbar, R., Amini, J., Ashrafgan jooei, Sh. (2010): Molecular detection of inva and spv virulence genes in salmonella Enteritidis isolated from human and animals in ran. Afri. J. Micro. 4(21): Chiu, C.H., Su, L.H., Wang, M.H., Yeh, C.M., Weill, F.X., Chu, C. (2006): Detection of multidrug- resistant salmonella enterica serovar Typhimurium phagetypes DT102, DT104 and U320 by multiplex PCR. JMC. 44(7):

5 پاتوبیولوژي مقایسهاي علمی پژوهشی سال یازدهم بهار شماره Chu, C. S., Hong Tsai, C. W., Lin, T., Liu, J. T. ou. (2001): Comparative physical and genetic maps of the virulence plasmids of salmonella enterica serovar Typhimurium, Enteritidis, Cholerasuis, and Dublin. nfect. mmun. 67: Chuanchuen, R., Ajari Yakhajorn, K., Koowatananukul, C., Wanna Prasat, W., Khemtong, S., Samngamnim, S. (2010): Antimicrobial resistance and virulence genes in salmonella enterica isolates from dairy cows. Food. Pathog..Dis. 7(1): Donald, G., Fierer, J. (2011): The role of the spv genes in salmonella pathogenesis. Front. Microb. (2): Firoozeh, F., Shaheheraghi, F., Zahraei salehi, T., Karimi, V., Aslani, MM. (2011): Antimicrobial resistance profile and presence of class integrons among salmonella enterica serovars isolated from human clinical specimens in Tehran. ran. ranian J. Microb. 3(3): rene Rodriguez, M. Rosario Rodico, Beatriz Guerra, katie L. Hopkins. (2012): Potential nternational spread of multidrug- resistant invasive salmonella enterica serovar Enteritidis. Emer. infec. Dis. 18(7): Jin, Y, Ling, J. M. (2009): Prevalence of integrons in antibiotic resistant salmonella spp. in Hong Kong. Jpn. J. nfect. Dis. 62: Khan, A., Nawaz, M., Khan, S., cerniglia, C. (2000): Detection of multidrug- resistant salmonella Typhimurium DT104 by multiplex polymerase chain reaction. FEMS Microb. letters. 182: Levings, R. S., D. Lightfood, S. R. Partridge, R. M. Hall, S. P. D jordjevic. (2005): The genomic island SG1, containing the multiple antibiotic resistance region of salmonella enterica serovar Typhimurium DT104 or variant of it, is widely distributed in other S. enterica serovars. J. Bacteriol. 187: Libby, S. J., Lesnick, M., Hasegawa, P., kurth, M., Belcher, C., Fierer, J., Guiney, D. G. (2002): Characterization of the spv locus in salmonella enterica serovar Arizona. nfect mmun. Jun Lindstedt, B. A., Heir, E., Nygard,., Kapperud G. (2003): Characterization of class integrons in clinical strains of salmonella enterica subsp Enterica serovars Typhimurium and Enteritidis from Norwegian hospitals. Med. Microb. 52: Miriagou, V., Carattoli, A., Fanning, S. (2006): Antimicrobial resistance islands: Resistance gene cluster in salmonella chromosome and plasmids. Microbes nfect. 8: Rajaei, B., Siadat, S. D., Razavi, M.R., Aghasadeghi, M.R., Sepehri Rad, N., Badmasti, F., Khanjani Jafroodi, S., Rajaei, T., Moshiri, A., Javadian, S. (2011): Expanding drug resistance through integron acquisition in salmonella spp. solated obtained in ran. Afric. J. Microb. 5(16): Ranjbar, R., Salimkhani, E., Sadeghifard, N., Zaeimi Yazdi, J., Morovvati, S., Jonaidi, N., et al. (2007): An outbreak of gastroenteritis of unknown origin in Tehran. Pak J Biol Sci. 10(7): Rodicio, MR., Herrero, A., Rodriguez,., Garcia, P., Montero,., Beuthch, J., et al. (2011): Acquisition of antimicrobial resistance determinants by virulence plasmids specific for non typhoid serovars of salmonella enterica. Rev. Med. Microbiol. 22: White, P.A., C. J. Mclver, W.D. Rawlinson. (2001): ntegrons and cassettes in the Enterobacteriacea. Antimicrob. Agents chemother. 45: Wienser, M., Zaidi, M.B., Calva, E., Fernandez-Mora, M., Calva, J.J., Silva, C. (2009): Association of virulence plasmid and antibiotic resistance determinants with chromosomal multilocus genotypes in Mexican samonella enterica serovar Typhimurium strains. BMC Microbiol. 278: Zhang, H., Shi, L., Li, L. (2004): dentification and characterization of calss integrons from healty human in China. Microbiol. mmunol. 48:

6 فرناز حسنیه کیومرث امینی میترا صالحی 1158