Φυτοχημική Ανάλυση - 1 η άσκηση

Transcript

1 Φυτοχημική Ανάλυση - 1 η άσκηση Αλκαλοειδή του τροπανίου Atropa belladonna Ευρώπη, Βόρεια Αμερική, Δυτική Ασία. Τα φύλλα και οι καρποί είναι ιδιαίτερα τοξικά και περιέχουν αλκαλοειδή του τροπανίου.

2 Φυτοχημική Ανάλυση - 1 η άσκηση Η Atropa belladonna είναι ένα γοητευτικό και ταυτόχρονα ύπουλο φυτό. Όλα τα μέρη του φυτού είναι εξαιρετικά τοξικά, δηλητηριώδη. Τα ξερά φύλλα περιέχουν ατροπίνη και σκοπαλαμίνη που έχουν ναρκωτική και αντισπασμωδική δράση. Ο υψηλός βαθμός τοξικότητάς της υπάρχει σε όλα τα μέρη του φυτού και ιδιαίτερα στους σπόρους, στις ρίζες και στα φύλλα. Tο όνομα Atropa belladonna αναφέρεται στην Μοίρα Άτροπο της ελληνικής μυθολογίας, την άκαμπτη που κόβει το νήμα της ζωής, υπονοώντας την δραστηριότητα του δηλητηρίου. Από τα πολύ παλιά χρόνια, η ονομασία του βοτάνου στα ελληνικά είναι "Άτροπος η δελεαστική".

3 Φυτοχημική Ανάλυση - 1 η άσκηση Η δρόγη αποτελείται από τα ξερά φύλλα του φυτού και ονομάζεται Folia Belladonnae. Τα κύρια δραστικά συστατικά της δρόγης είναι τα αλκαλοειδή του τροπανίου, με κυριότερο την υοσκυαμίνη και δευτερεύοντα την ατροπίνη και τη σκοπολαμίνη. Η δράση της ευθαλείας είναι κεντρική και περιφερειακή. Η κεντρική εκδηλώνεται στο ΚΝΣ, ενώ η περιφερειακή δράση μπορεί να είναι στη καρδιά, στις λείες μυϊκές ίνες, στους αδένες και στα μάτια. Η δρόγη χρησιμοποιείται με τη μορφή βάμματος και χορηγείται για παθήσεις του πεπτικού συστήματος, κολικούς, διάρροιες και ελκώδεις κολίτιδες για τη κατάπαυση των πόνων. Λόγω της αντιχολινεργικής δράσης των αλκαλοειδών, η δρόγη χρησιμοποιείται για τη ρύθμιση της υπερβολικής κινητικότητας του γαστρεντερικού σωλήνα και των σπασμών του ουροποιητικού συστήματος.

4 Φυτοχημική Ανάλυση - 1 η άσκηση 10 g τριμμένων φύλλων του φυτού Atropa belladonna εμβαπτίζονται σε 100 ml διαλύματος αλκοόλης (3 μέρη αλκοόλης, 1 μέρος νερό) για τη παραλαβή βάμματος με εξίκμαση. 100 ml βάμματος τοποθετούνται σε πορσελάνινη κάψα, η οποία θερμαίνεται σε υδατόλουτρο μέχρι να εξατμιστεί πλήρως η αλκοόλη. Το υπόλειμμα εκπλένεται με 25 ml EtOAc και 25 ml νερό, τα οποία τοποθετούνται σε διαχωριστική χοάνη. Γίνεται αλκαλοποίηση με NH 3 (ph 9-11), ώστε τα αλκαλοειδή να πάρουν την μορφή των βάσεων. Το μίγμα αναταράσσεται και αφού διαχωριστούν οι δύο στοιβάδες, παραλαμβάνεται η οργανική φάση σε κωνική φιάλη (3 επαναλήψεις).

5 Φυτοχημική Ανάλυση - 1 η άσκηση Η οργανική φάση τοποθετείται σε διαχωριστική χοάνη και προστίθενται 25 ml H 2 SO N, ώστε τα αλκαλοειδή να πάρουν την μορφή των αλάτων. Το μίγμα αναταράσσεται και αφού διαχωριστούν οι δύο στοιβάδες, παραλαμβάνεται η υδατική φάση σε κωνική φιάλη (3 επαναλήψεις). Γίνεται εκ νέου αλκαλοποίηση της υδατικής φάσης με NH 3 και προστίθενται 25 ml EtOAc. Το μίγμα αναταράσσεται και αφού διαχωριστούν οι δύο στοιβάδες, παραλαμβάνεται η οργανική φάση σε κωνική φιάλη (3 επαναλήψεις συνολικά).

6 Φυτοχημική Ανάλυση - 1 η άσκηση Η οργανική φάση θερμαίνεται σε υδατόλουτρο μέχρι να εξατμιστεί πλήρως ο διαλύτης και το δείγμα θερμαίνεται για 15 λεπτά επιπλέον ώστε να απομακρυνθούν τυχόν πτητικές βάσεις. Προστίθενται 15 ml H 2 SO N και ερυθρό του μεθυλίου ως δείκτης και η περίσσεια του οξέος εξουδετερώνεται με NaOH 0.02 N. Υπολογίζεται η % κ.β. περιεκτικότητα των αλκαλοειδών του τροπανίου εκφρασμένων ως υοσκυαμίνη στο δείγμα, δεδομένου ότι 1 ml H 2 SO N εξουδετερώνει mg υοσκυαμίνης.

7 Φυτοχημική Ανάλυση - 1 η άσκηση Παράδειγμα Έχουμε προσθέσει 15 ml H 2 SO Ν Για την εξουδετέρωση χρειάσθηκαν 14.5 ml ΝaΟΗ 0.02Ν Δεδομένου ότι 1 ml H 2 SO N εξουδετερώνει mg αλκαλοειδών τροπανίου εκφρασμένα ως υοσκυαμίνη Τα = 0.5 ml H 2 SO 4 που χρειάσθηκαν για την εξουδετέρωση των αλκαλοειδών της Atropa belladonna αντιστοιχούν σε 1ml H 2 SO ml X mg αλκαλοειδών Χ= x 0.5/1 = mg Άρα τα mg αλκαλοειδών περιέχονται σε 100 ml βάμματος που προέρχεται από 10 g τριμμένων φύλλων. Άρα σε 100 g τριμμένων φύλλων περιέχονται mg (=28.94/1000 g) Συνεπώς η % κ.β. περιεκτικότητα των αλκαλοειδών εκφρασμένων ως υοσκυαμίνη είναι %

8 Φυτοχημική Ανάλυση - 2 η άσκηση Ποσοτικός προσδιορισμός σεννοσιδών σε φύλλα σέννης Η σέννα (Cassia acutifolia και C. angustifolia, οικ. Leguminosae) είναι ένα μικρό δέντρο, αυτοφυές στις περιοχές της τροπικής Αφρικής και της Αραβίας. Η χρήση των φύλλων της σέννας στη θεραπευτική άρχισε τον 10 ο αιώνα από Άραβες γιατρούς. Η δρόγη αποτελείται από τα ξερά φύλλα του φυτού και ονομάζεται Folia Sennae, γνωστή και ως φύλλα Αλεξανδρείας. Τα κύρια δραστικά συστατικά της δρόγης είναι τα παράγωγα ανθρακινονών είτε ελεύθερα είτε ως γλυκοσίδες, με κυριότερα τους σεννοσίδες A-D (γλυκοσίδες διανθρονών). Η δρόγη χρησιμοποιείται ως υπακτικό με τη μορφή εγχύματος ή εμβρέγματος σε περιπτώσεις οξείας δυσκοιλιότητας.

9 Φυτοχημική Ανάλυση - 2 η άσκηση σεννοσίδης Α σεννοσίδης Β

10 Φυτοχημική Ανάλυση - 2 η άσκηση 0.25 g κονιοποιημένων φύλλων του φυτού Senna sp. τοποθετούνται σε σφαιρική φιάλη και προστίθενται 30 ml νερού. Η σφαιρική φιάλη θερμαίνεται σε υδατόλουτρο για 20 λεπτά με τη χρήση κάθετου ψυκτήρα ώστε να μην μειώνεται ο όγκος του νερού. Αφού ψυχθεί η σφαιρική φιάλη, το περιεχόμενο διηθείται μέσω ηθμού βαμβακιού σε ογκομετρικό κύλινδρο και συμπληρώνεται με νερό μέχρι όγκου 30 ml. 20 ml διαλύματος μεταφέρονται σε διαχωριστική χοάνη, γίνεται οξίνιση με 1 σταγόνα π. HCl, ώστε να υδρολυθούν τα υπόλοιπα παράγωγα, και προστίθενται 25 ml EtOAc. Το μίγμα αναταράσσεται και αφού διαχωριστούν οι δύο στοιβάδες, παραλαμβάνεται η υδατική φάση η οποία εκπλένεται εκ νέου άλλες 2 φορές με 25 ml EtOAc και παραλαμβάνεται σε κωνική φιάλη.

11 Φυτοχημική Ανάλυση - 2 η άσκηση 10 ml της υδατικής φάσης μεταφέρονται σε σφαιρική φιάλη, προστίθενται 2-3 σταγόνες Na 2 CO 3 (ph 7-8), 8 ml διαλύματος FeCl 3 και 12 ml νερού. Η σφαιρική φιάλη θερμαίνεται σε υδατόλουτρο για 20 λεπτά με τη χρήση κάθετου ψυκτήρα, ώστε να σπάσει ο δεσμός άνθρακα-άνθρακα μεταξύ των δύο μορίων ανθρακινόνης. Χωρίς να διακοπεί η θέρμανση, προστίθενται 20 σταγόνες π. HCl και συνεχίζεται η θέρμανση για 20 λεπτά επιπλέον, ώστε να σπάσει ο γλυκοσιδικός δεσμός μεταξύ γενίνης και σακχάρου. Αφού ψυχθεί η σφαιρική φιάλη, το περιεχόμενο μεταφέρεται σε διαχωριστική χοάνη και προστίθενται 25 ml EtOAc. Το μίγμα αναταράσσεται και αφού διαχωριστούν οι δύο στοιβάδες, παραλαμβάνεται η οργανική φάση σε κωνική φιάλη (3 επαναλήψεις).

12 Φυτοχημική Ανάλυση - 2 η άσκηση Για να απομακρυνθούν τυχόν υπολείμματα FeCl 3 που μπορεί να δώσουν θετικό σφάλμα, η οργανική φάση τοποθετείται εκ νέου σε διαχωριστική χοάνη και προστίθενται 25 ml νερό. Το μίγμα αναταράσσεται και αφού διαχωριστούν οι δύο στοιβάδες, παραλαμβάνεται η οργανική φάση σε κωνική φιάλη (3 επαναλήψεις). Η οργανική φάση μεταφέρεται σε ογκομετρική φιάλη των 100 ml και ο όγκος συμπληρώνεται με EtOAc μέχρι τη χαραγή.

13 Φυτοχημική Ανάλυση - 2 η άσκηση 10 ml διαλύματος μεταφέρονται με σιφώνιο σε πορσελάνινη κάψα, η οποία θερμαίνεται σε υδατόλουτρο μέχρι να εξατμιστεί πλήρως ο διαλύτης Το υπόλειμμα διαλύεται σε 10 ml ΚΟΗ 1 Ν και αμέσως μετράται η απόσβεση στα 515 nm Υπολογίζεται η % κ.β. περιεκτικότητα των σεννοσιδών εκφρασμένων ως σεννοσίδης Β στο δείγμα, δεδομένου ότι Ε (1% κ.ο., 1 cm) = 240 στα 515 nm

14 Φυτοχημική Ανάλυση - 2 η άσκηση Παράδειγμα Έστω ότι μετρήσαμε απορρόφηση 0.25 Δεδομένου ότι η απορρόφηση διαλύματος 1% κ.ο. περιεκτικότητας είναι 240 στα 515 nm 1% 240 X 0.25 Χ= 0.25 x 1% /240 = 0.001% Άρα το διάλυμα στην κυψελίδα και άρα στην κάψα και άρα στην ογκομετρική φιάλη είναι 0.001% που σημαίνει g στα 100 ml Αφού έχουμε χρησιμοποιήσει 10 ml από τα 30 ml του αρχικού εκχυλίσματος η ποσότητα που είχε το εκχύλισμα είναι 3 x g = g που προέρχεται από 0.25 g Senna sp. Συνεπώς η % κ.β. περιεκτικότητα των σεννοσιδών εκφρασμένων ως σεννοσίδης Β είναι Χ 100 Χ= x 100/0.25 = 1.2%

15 Χρωματογραφία

16 3 η άσκηση: Σύγκριση διαφορετικών μεθόδων διαχωρισμού Το φαιοφύκος Dictyota dichotoma (οικ. Dictyotaceae) είναι κοσμοπολίτικο είδος, ευρύτατα εξαπλωμένο σε τροπικές, υποτροπικές και εύκρατες θάλασσες (Ατλαντικός, Ινδικός και Ειρηνικός Ωκεανός, Μεσόγειος και Καραϊβική Θάλασσα, Θάλασσα της Ιαπωνίας). Στην Ελλάδα απαντά τόσο στο Αιγαίο, όσο και στο Ιόνιο Πέλαγος. Το είδος D. dichotoma είναι γνωστό για το πλούσιο χημικό περιεχόμενο του σε σεσκιτερπένια και διτερπένια κανονικής βιοσύνθεσης που ανήκουν σε μία πληθώρα ανθρακικών σκελετών. Επιπλέον, έχουν απομονωθεί στεροειδή, καροτενοειδή και λιπαρά οξέα. Πολλοί μεταβολίτες του εμφανίζουν αξιοσημείωτες βιολογικές δράσεις, όπως αντιβακτηριακή, αντιμυκητιασική, αντιϊκή, κυτταροτοξική, αντιτροφική, ανθελονοσιακή, ιχθυοτοξική, κ.α.

17 3 η άσκηση: Σύγκριση διαφορετικών μεθόδων διαχωρισμού 10 g τριμμένης δρόγης από το φαιοφύκος Dictyota dichotoma τοποθετούνται σε κωνική φιάλη και προστίθενται 40 ml διαλύματος CH 2 Cl 2 / MeOH 1:1 ώστε να εκχυλιστεί η δρόγη. Το εκχύλισμα διηθείται από ηθμό βάμβακος και στη δρόγη προστίθενται εκ νέου 40 ml διαλύματος CH 2 Cl 2 / MeOH 1:1. Μετά από ανάδευση για 1 ώρα, το εκχύλισμα διηθείται από ηθμό βάμβακος. Τα δύο διηθήματα συνενώνονται και χωρίζονται σε δύο ίσα μέρη, τα οποία εξατμίζονται μέχρι ξηρού. 1 η μέθοδος διαχωρισμού με χρωματογραφία στήλης (διαχωρισμός υγρής-στερεής φάσης) Ως στατική φάση χρησιμοποιείται γέλη πυριτιού. Ως κινητή φάση χρησιμοποιείται σύστημα διαλυτών προοδευτικά αυξανόμενης πολικότητας (c-hex, EtOAc, MeOH).

18 3 η άσκηση: Σύγκριση διαφορετικών μεθόδων διαχωρισμού Η πλήρωση της στήλης με γέλη πυριτίου γίνεται ως εξής: τοποθετείται βαμβάκι στον πάτο της στήλης που θα χρησιμοποιηθεί ως διάφραγμα, η γέλη πυριτίου αναμιγνύεται με chex/etoac 95:5 και το εναιώρημα τοποθετείται στη στήλη, και ανοίγει η στρόφιγγα ώστε να απομακρυνθεί ο διαλύτης που βρίσκεται πάνω από την επιφάνεια του υλικού πλήρωσης, ενώ η στήλη δονείται ελαφρά για να γίνει το γέμισμα ομοιόμορφα και να αποφευχθεί η δημιουργία φυσαλίδων. Το πρώτο μέρος του υπολείμματος διαλύεται σε 2-3 ml chex/etoac 95:5 και τοποθετείται στο άνω μέρος της στήλης. Προστίθεται ποσότητα άμμου ώστε να δημιουργηθεί στοιβάδα πάχους 5-8 mm, η οποία αποτρέπει την ανάμιξη των συστατικών με τους διαλύτες έκλουσης.

19 3 η άσκηση: Σύγκριση διαφορετικών μεθόδων διαχωρισμού Η έκλουση των συστατικών γίνεται διαδοχικά με 50 ml chex/etoac 95:5, 50 ml EtOAc και 50 ml MeOH, οπότε λαμβάνονται τα τρία αντίστοιχα κλάσματα με σειρά αυξανόμενης πολικότητας. Χρειάζεται ιδιαίτερη προσοχή ώστε η στάθμη του διαλύτη να μην κατέβει χαμηλότερα από την επιφάνεια της στατικής φάσης. Τα κλάσματα (1-3) φυλάσσονται για έλεγχο με χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας.

20 3 η άσκηση: Σύγκριση διαφορετικών μεθόδων διαχωρισμού 2 η μέθοδος διαχωρισμού με εκχύλιση (διαχωρισμός υγρής-υγρής φάσης) Το δεύτερο μέρος του υπολείμματος παραλαμβάνεται με 20 ml διαλύματος MeOH / Η 2 Ο 9:1 και τοποθετείται σε διαχωριστική χοάνη, όπου προστίθενται 20 ml cηex. Το μίγμα αναταράσσεται και αφού διαχωριστούν οι δύο στοιβάδες παραλαμβάνεται σε κωνική φιάλη η στοιβάδα του κυκλοεξανίου (2 επαναλήψεις). Στη στοιβάδα της MeOH προστίθενται επιπλέον 6 ml H 2 O και το σύνολο εκχυλίζεται με 20 ml EtOAc. Το μίγμα αναταράσσεται και αφού διαχωριστούν οι δύο στοιβάδες παραλαμβάνεται σε κωνική φιάλη η στοιβάδα του οξικού αιθυλεστέρα (2 επαναλήψεις). Η στοιβάδα της μεθανόλης και του νερού παραλαμβάνεται σε άλλη κωνική φιάλη. Τα κλάσματα (4-6) φυλάσσονται για έλεγχο με χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας.

21 3 η άσκηση: Σύγκριση διαφορετικών μεθόδων διαχωρισμού Τα κλάσματα 1-6 ελέγχονται με χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας (TLC): Τοποθετούνται κηλίδες από κάθε κλάσμα σε κανονικής φάσης πλάκα TLC (πλάκες αλουμινίου επικαλυμμένες με λεπτή στρώση γέλης πυριτίου) σε απόσταση 1 cm εκατέρωθεν από κάθε άκρη. Η πλάκα TLC τοποθετείται σε χρωματογραφικό θάλαμο και αναπτύσσεται με διαλύτη ανάπτυξης μίγμα chex / EtOAc 60:40. Τα αποτελέσματα παρατηρούνται: με γυμνό οφθαλμό στο ορατό φως, στο υπεριώδες φως και μετά από ψεκασμό με γενικό αντιδραστήριο (H 2 SO 4 σε MeOH) και θέρμανση.

22 3 η άσκηση: Σύγκριση διαφορετικών μεθόδων διαχωρισμού

23 4 η άσκηση: Απομόνωση εσπεριδίνης από φλοιό πορτοκαλιών Η εσπεριδίνη είναι ένας γλυκοσίδης φλαβανόνης και συγκεκριμένα της εσπεριτίνης με ραμνόζη και γλυκόζη στον C-7. Έχει αντιοξειδωτική, αντιφλεγμονώδη και υπολιπιδαιμική δράση, ενώ παράλληλα μειώνει τη χοληστερόλη. Η εσπεριδίνη απαντάται κυρίως σε είδη του γένους Citrus (Rutaceae), όπως σε πορτοκάλια και λεμόνια. Η εσπεριδίνη ανιχνεύεται με προσθήκη διαλύματος FeCl 3 σε διάλυμα εσπεριδίνης οπότε και λαμβάνεται κόκκινο χρώμα.

24 4 η άσκηση: Απομόνωση εσπεριδίνης από φλοιό πορτοκαλιών 15 g αποξηραμένου φλοιού πορτοκαλιών κονιοποιούνται και τοποθετούνται σε διηθητικό ηθμό, ο οποίος εν συνεχεία τοποθετείται στον εκχυλιστήρα συσκευής Soxhlet, ενώ στη σφαιρική φιάλη τοποθετούνται 400 ml κυκλοεξανίου. Η σφαιρική φιάλη θερμαίνεται σε θερμαντικό μανδύα για 1,5 h με τη χρήση κάθετου ψυκτήρα. Στη συνέχεια το κυκλοεξανικό εκχύλισμα απορρίπτεται και στη σφαιρική φιάλη τοποθετούνται 400 ml MeOH. Η σφαιρική φιάλη θερμαίνεται σε θερμαντικό μανδύα για 1 h με τη χρήση κάθετου ψυκτήρα.

25 4 η άσκηση: Απομόνωση εσπεριδίνης από φλοιό πορτοκαλιών Στη συνέχεια 100 ml από το μεθανολικό εκχύλισμα μεταφέρονται σε κωνική φιάλη, η οποία θερμαίνεται σε υδατόλουτρο μέχρι να εξατμιστεί πλήρως ο διαλύτης. Στο ελαιώδες υπόλειμμα προστίθενται 30 ml διαλύματος οξικού οξέος 6% και εν συνεχεία 2-3 ml αιθανόλης, οπότε και παρατηρείται κρυστάλλωση της εσπεριδίνης. Το περιεχόμενο της κωνικής φιάλης διηθείται υπό κενό σε ηθμό με πορώδες (Νο. 4) και το στερεό αφήνεται να ξηρανθεί επί του ηθμού. Η εσπεριδίνη ανιχνεύεται με προσθήκη διαλύματος FeCl 3 εσπεριδίνης οπότε και λαμβάνεται πράσινο-μπλε χρώμα. σε διάλυμα