ΟΥΡΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝ, ΣΙΣΜΑΝΟΓΛΕΙΟ ΝΟΣΟΚΟΜΕΙΟ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Κ. ΔΗΜΟΠΟΥΛΟΣ

Transcript

1 Pf- ΙΊίΜ ΟΥΡΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝ, ΣΙΣΜΑΝΟΓΛΕΙΟ ΝΟΣΟΚΟΜΕΙΟ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Κ. ΔΗΜΟΠΟΥΛΟΣ Η ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΤΟΥ ΚΛΑΣΜΑΤΟΣ ΠΟΛΛΑΠΛΑΣΙΑΣΜΟΥ ΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΜΕ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΑΥΤΟΜΑΤΟΠΟΙΗΜΕΝΗΣ ΚΥΤΤΑΡΟΛΟΠΑΣ ΣΤΟΝ ΕΛΕΓΧΟ ΤΩΝ ΝΕΟΠΛΑΣΜΑΤΩΝ ΤΟΥ ΟΥΡΟΠΟΙΗΤΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ ΐΊ^ ΦΡΑΤΖΕΣΚΑ ΜΠΑΖΠΌΥ ΒΙΟΠΑΘΟΛΟΓΟΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΑΘΗΝΑ 997

2

3 Ημε^ηνία «rt-w «^ J ^, ο» 994 ΝοεμΡρ( Ημερομηνία οριομου Τριμ.» Μέλη Τριμ. **tf Btrt e 0,W Κ Λημόπουλος, Κοθηγη^Κ ΛΠανταζόπουλος,Αν.Καθ^ :. κωοτακόπουλος. Av. «J «Α

4 Η έγκριση της διδακτορικής διατριβής από την Ιατρική Σχολή του Πανεπιστημίου Αθηνών δεν υποδηλώνει ότι αποδέχεται τις γνώμες του συγγραφέα (Οργανισμός Πανεπιστημίου Αθηνών, άρθρο 202, παρ.2, του Ν. 5343).

5 Στους γονείς μ ο υ ' αδέλφια μου

6 Mw(<mmi<m*mmw <m<mmimmm)m ί"3 $ ίκ <ΦΜΚΦΚ* ΚΑΡ0ΛΙΠΉΑΚΟΚ ΠΑΚ<ΠΙ^ΤΗ^ΙΟΚ ΑΦΗΚ>Κ fis! Si yj Si vivi ΙΑΤΝΚΗ *XOAH Mm>ìmm^mmmm >M)mm)mmmM u

7 twmmmmm^m^u Ι.. ΙΠΠΟΚΡΑΤΙΚΌΣ ΟΡΚΟΣ ΚΕΙΜΕΝΟ ΟΜΝΥΜΙ ΑΠΟΛΛΩΝΑ ΙΗΤΡΟΝ ΚΑΙ ΑΣΚΛΗΠΙΟΝ ΚΑΙ ΥΓΙΕΙΑΝ ΚΑΙ ΜΕΝΟΣ. ΕΠΙΤΕΛΕΛ'^Π^ΗΣΕΙΝΊ<ΑΤΑ^4ΥΝΑΜΙΝ ΚΑΙ ΚΡΙΣΙΝ ΕΜΗΝ ΟΡΚΟΝ ΤΟΝΔΕ Κ^Ι ΞΥΓρΑΦ^Κΐ^ΗΝΔΕ. ΗΓΗΣΕΣΘΑΙ ΜΕΝ ΤΟΝ ΔΙΔΑΞΑΝΤΑ ΜΕΛΉΝ ΤΕΧΝΗΝΤΑΥΤΗΝ ΙΣΑ ΓΕΝΕΤΗΣΙΝ ΕΜΟΙΣΙ. ΚΑΙ ΒΙΟΥ ΚΟΙΝΩΣΕΣΘΑΙ ΚΑΓ^ΕυΝ^ΧΡΗΙΖΟΝΤ^ΕΤΑΔΟΣΙΝ ΣΕΣΘΑΙ ΚΑΙ ΓΕΝΟΣ ΤΟ Ε^^^^ΑΔΕΛΦΕΟΪΒ^ΣΟΝ ΠΑΝΑΚΕΙΑΝ ΚΑΙ ΘΕβΥΣ ΠΑΝΤΑΣ ΤΒ.ΚΑΙ ΠΑΣΑΣ ΙΣΤΟΡΑε*ΠΟΙΕΥ- ΠΟΙΗ- ΕΠΙΚΡΙΝΕΕΙΝ ΑΡΡΕΣΙ ΚΑΙ ΔΙΔΑΞΕΙΝ ΤΗΝ TÉXNHN TAYTHÖfilN ΧΡΗΙΖΩΣΙ ΜΑΝ-./ -* tes Μ ΘΑΝΕΙΝ. ΑΝΕΥ ΜΙΣΘΟΥ~ΚΆΙ ΈΥΓ^ΑΦΗ^ ΕΜΑΑΓΓΕΛΙΗΣ TE ΚΑΙ ΑΚΡΟΗΣΙΟΣ ΚΑΠΉΣ ΛΟΙΠΗΣ ΑΠΑΣ&ΙΜΘΗΣΑ ΜΕΤΑΔΟΣΙΝ ΠΟΙΗ- ΣΕΣΘΑΙ ΥΙΟΙΣΙ Τ& ΕΜΟΙΣΙ WJïÇ$ff&(./Λ^ ΕΜΒ ΔΙΔΑΞΑΝΤΟΣ ΚΑΙ ΜΑΘΗΤΑΙΣΙ ΙΗΤΡΙΚΩ. ΑΛΛΩ&ΔΕ" ΞΥΓΠΕΓΡΑΜΜΕ^ΟΙΣ ΟΥΔΕΝΐ/,' ΔΙΑΙΤΗΜΑϊΓ ^TAK^^&ÇKIZMENOIZ JE ΧΡΗΣΟΜΑΙ ΝΟΜΩ ΕΠ' ΩΦΕΛΕΙΗ KAMI ΔΗΛΗΣΕΙ ΔΕ ΚΑΙ ΟΥΔΕΝΙ ΑΙΤΗΘΕΙΣΙ > ΤΟΙΗΝΔΕ ΟΜΟΙΩ! ΑΓΝΩΣ ΔΕ ΚΑΙ θ; ΤΗΝ ΕΜΗΝ. ΟΥ ΤΙ ΕΡΓΑΤΗΣΙΝ ANAPi ΕΣΙΩ. ΕΣΕΛΕΥΣΟΙ ΠΑΣΗΣ ΑΔΙΚΙΗΣ ΕΚ( ΔΙΣΙΩΝ ΕΡΓΩΝ ΕΙ ΕΛΕΥΘΕΡΩΝ TE ΑΚΟΥΣΩ, Η ΚΑΙ ΑΝ ΧΡΗ ΠΟΤΕ ΕΚΛΑΛΕΙ ΕΙΝΑΙ ΤΑ ΤΟΙΑΥΤΑ. ΠΟΙΕΟΝΤΙ ΚΑΙ ΜΗ Ξ ΝΗΣ, ΔΟΞΑΖΟΜΕΝΡ NON- ΠΑΡΑΒΑΙΝΟΙ ΝΤΩΝ ΚΑΪ^ΔΥΝΑΜΙΝ,ΚΑΙώΚΡΙΣΙΝ ΕΜΗΝ. ΕΠΙ " ff AÄlKlfyBf*Ξ ΟΥΔΕ ΦΑΡΜΑΚΟΝ MAI ΞΥΜΒΟΥΛΙΗΝ ΦθΟΡΙΟΝ ΔΩΣΩ. MON ΚΑΙ ΤΕΧΝΗΝ ^ΓΑΣ, ΕΚΧΩΡΗΣΩ ΔΕ 2.<Μ^ΑΣ ΔΕ ΟΚΟΣΑΣ ΑΝ '""' ΤΩΝ, ΕΚΤΟΣ ΕΩΝ ΑΛΛΗΣ ΚΑΙ ΑΦΡΟ- Ν ΚΑΙ ΑΝΔΡΕΙΩΝ. 9ΕΡΑΠΕΙΗ Η ΙΔΩ Η [<Μ Ι ΑΝΘΡΩΠΩΝ, Α ΜΗ fpphta ΗΓΕΥΜΕΝΟΣ Ι ΤΟΝΔΕ ΕΠΙΤΕΛΕΑ»ΑΙ ΚΑΙ ΒΙΟΥ ΚΑΙ ΤΕΧ- >ΙΣ ΕΣ ΤΟΝ ΑΙΕΙ ΧΡΟ- ΔΕ(ΚΑΙ ΕΡ!Ρ?ΚΕρΝΤΙ.ρΑΝΑΝΤΙΑ ΤΟΥΤΕΩΝ..' ' vi. W.> il'?-' ι r"~j fi'v \<&\ 'm ί :Λ3 [(MCM(^^l(m^l<^M^M(M^l(#i^m^.ri*

8 ί^τβρα ΙΠΠΟΚΡΑΤΙΚΌΣ ΟΡΚΟΣ ΜΕΤΑΦΡΑΣΗ ΟΡΚΙΖΟΜΑΙ ΣΤΟΝ ΑΠΟΛΛΩΝΑ ΤΟΝ ΙΑΤΡΟ ΚΑΙ ΣΤΟΝ ΑΣΚΛΗΠΙΟ ΚΑΙ ΣΤΗΝ ΥΓΕΙΑ ΚΑΙ ΣΤΗ^ΑΚΑΚΟΑ^ Σ' ΟΛΟΥΣ ΤΟΥΣ ΘΕΩγΣ ΚΑΙ ΤΙΣ ΘΕΕΣ. ΠΟΥ BA2JÌMAE J(J^JÒT\ Θ^ ΕΚΠΛΗΡΩΣΟ*ΓΟΝΜ3ΡΚΟ ΜΟΥ ΑΥΤΟ ΚΑΙ ΤΟ^ΥΜΒΟΛ^ΐρ.ΑΥΤΟ, ΧΥΜΦΩΝΑ ΜΕΟΉ ΔΥΝΑΜΗ ΜΟΥ ΚΑΙ ΤΗΝ ΚΜΉ Μ ΔΙΔΑΞΕ ΤΗΝ ΤΕΧΝΗ ΑΥ ΚΑΝΩ ΚΟΙΝΩΝφ TOY Bll ΔΙΚΑ ΜΟΥ Ο.ΤΙ ΧΡΕΙΑΖΙ ΑΔΕΛΦΟΥΣ ΜΟΥ ΚΑΙ ΘΑ ΘΥΜΟΥΝ ΝΑ ΜΑΘΟΥΝ. ΜΕΤΑΔΩΣΩ ΤΟΥΣ ΕΠΑΓΓΕΛΜΑΤΑ ΜΑΘΗΜΑΤΑ ΚΑΙ/ίΤΣ ΥΠΟΛΟΐΠΕΣ ΜΟΥ. ΣΤΟΥΣ ΓΙφΥΣ ΤΟΥ ΔΙΔΑΣ ΘΑ ΕΧΟΥΝ ΣΥΝ ΤΗ ΣΥΝΗΘΕΙΑ Ti ΘΑ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙ ΤΩΝ ΑΡΡΩΣΤΩΙ ΜΟΥ. ΚΑΙ (ΥΠΟ) ΒΛΑΒΗ ΚΑΙ ΑΔΙΚ ΔΕΝ ΘΑ ΧΟΡΗΓΗ, ΚΑΙ ΑΝ ΠΑΡΑΚΛΗ ΣΗΣ ΔΕΝ ΘΑ ΔΩ: ΚΑΘΑΡΗ ΘΑ ΔΙΑΓ ΘΑ ΧΕΙΡΟΥΡΓΗ ΤΡΑ, ΑΛΛΑ ΘΑ Α< ΣΕ ΟΣΑ ΣΠΙΤΙΑ ΠΙ ΑΡΡΩΣΤΩΝ. ΚΡΑ ΘΕΛΗΜΑΤΙΚΗ ΑΔΙΙ ΜΑΚΡΙΑ ΑΠΟ ΚΑΘΙ ΚΑΙ ΑΝΔΡΩΝ. ΕΛΕ ΟΣΑ ΔΕ ΚΑΤΑ ΤΗΝ Η ΚΑΙ ΠΕΡΑ ΑΠΟ ΔΕΝ ΠΡΕΠΕΙ ΠΟΤΕ ΣΙΩΠΩ. ΥΠΟΛΟΓΙΖΟΙ ΠΟΝ ΘΑ ΤΗΡΩ ΤΟΝ ΟΙ ΕΙΘΕ ΝΑ ΠΕΤΥΧΑΙΝΩ ΚΑΛΟ ΟΝΟΜΑ nantj ΟΜΩΣ ΤΟΝ ΠΑΡΑΙ Sjjfa ΘΕΩΡΩ ΕΚΕΙΝΟΝ ΠΟΥ ΜΟΥ. ΜΕ'ΤΠρΥΣ^ΓρΝ,ς/^ΜΟΥ. ΚΑΙ ΘΑ ΤΟΝ ΙθΫ KÌaJr A Τ0Υ\ΠΡΟΣΦΕΡΩ ΑΠΟ ΤΑ 4 ΑΠΟΓΟΝ ΤΟΥ ΘΑ ΘΕΩΡΩ ΩΣ T H I ^ J p N H ΑΥΤΗ, ΑΝ ΕΠΙ- ΚΑΙ ΧΩ^ΙΓΕΥΜΦΩΝΙΑ. ΟΤΙ ΘΑ Σ, ΤΑ ΘΕΩΡΗΤΙΚΑ ΗΣΕΙΣ ΣΤΟΥΣ ΓΙΟΥΣ ΣΕ ΜΑΘΗΤΕΣ ΠΟΥ ΣΥΜΒΟΛΑΙΟ, ΚΑΤΑ Ο. ι ΜΟΝΟ ΓΙΑ ΩΦΕΛΕΙΑ ΜΗ ΚΑΙ ΤΗΝ ΚΡΙΣΗ ΆΑΞΩ ΑΠΟ ΚΑΘΕ ΣΕ ΚΑΝΕΝΑ. ΟΣΟ ΙΑ ΣΥΜΒΟΥΛΗ. ΕΠΙ- ΡΩΤΙΚΟ. ΑΓΝΗ ΚΑΙ ΤΕΧΝΗ ΜΟΥ. ΔΕΝ ΠΑΣΧΟΥΝ ΑΠΟ ΠΕ- ΕΞΑΣΚΗΜΕΝΟΥΣ. ΓΙΑ ΤΟ ΚΑΛΟ ΤΩΝ ΜΑΚΡΙΑ ΑΠΟ ΚΑΘΕ ΚΑΙ ΠΡΟ ΠΑΝΤΩΝ ΣΩΜΑΤΑ ΓΥΝΑΙΚΩΝ φα ΔΩ Η ΘΑ ΑΚΟΥΣΩ. ΗΜΕΡΙΝΗ ΖΩΗ. ΟΣΑ Σ ΕΞΩ. ΘΑ ΤΑ ΑΠΟ- ΜΥΣΤΙΚΑ. ΟΣΟ ΛΟΙ- ΘΑ ΤΟΝ ΠΑΡΑΒΙΑΖΩ. ΓΕΧΝΗ ΜΟΥ. ΕΧΟΝΤΑΣ Ε ΑΝΘΡΩΠΟΥΣ ΕΑΝ ΠΑΘΩ ΤΑ ΑΝΤΙΘΕΤΑ.

9 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Βιογραφικό Σημείωμα Πρόλογος ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ. Καρκίνος της ουροδόχου κύστεως. Συχνότητα.2 Προδιαθεσικοί παράγοντες 2.3 Συμπτώματα 3.4 Ιστολογική Ταξινόμηση 3.5 Σταδιοποίηση των όγκων της ουροδόχου κύστεως 4.6 Ιστολογικός βαθμός διαφοροποίησης 7 2. Περιεκτικότητα των κυττάρων σε DNA 9 2. Πλοειδικότητα του DNA και καρκίνος της κύστεως 3. Κυτταρικός κύκλος 4 3. Κυτταρικός κύκλος και δείκτες πολλαπλασιασμού 4 4. Πυρηνικό αντιγόνο πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων 2 4. Ιστορική Ανασκόπηση Ο ρόλος του PCNA/κυκλίνη στον κυτταρικό κύκλο Μονοκλωνικά αντισώματα έναντι του PCNA/κυκλίνη PCNA/κυκλίνη και καρκίνος Ανάλυση Εικόνας (Image analysis) Ιστορική ανασκόπηση Περιγραφή του οργάνου Πλοειδικότητα του DNA Ποιοτικός Έλεγχος 29 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Ι.Υλικό-Μέθοδος 3. Λήψη των δειγμάτων 3.2 Προετοιμασία των δειγμάτων 32.3 Χρώση των δειγμάτων 32.4 Μέτρηση των δειγμάτων Αποτελέσματα Μετρήσεις Στατιστική ανάλυση Συζήτηση 7 4. Περίληψη Summary 8 6. Βιβλιογραφία 83

10 ΒΙΟΓΡΑΦΙΚΟ ΣΗΜΕΙΩΜΑ Γεννήθηκα στην Αθήνα τον Οκτώβριο του 965. Κατά το χρονικό διάστημα παρακολούθησα το Δημοτικό Σχολείο της Φιλεκπαιδευτικής Εταιρείας (Αρσάκεια Σχολεία Ψυχικού) και στη συνέχεια από το 973 έως το 984 ολοκλήρωσα τη βασική και μέση εκπαίδευση μου στο St. George's English School στη Ρώμη της Ιταλίας. Το Σεπτέμβριο του 984 γράφτηκα, μετά από εισαγωγικές εξετάσεις, στο University of London, Queen Mary College, Course of Medical Biochemistry. To Νοέμβριο του 984 γράφτηκα, μετά από εισαγωγυχές εξετάσεις, στην Ιατρική Σχολή του Πανεπιστημίου Πατρών από όπου αποφοίτησα τον Ιούλιο του 990 με βαθμό πτυχίου "Λίαν καλώς". Υπηρέτησα, για την υποχρεωτική υπηρεσία υπαίθρου, στο Περιφερειακό Ιατρείο Αγ. Βαρβάρας Ερυμάνθειας του Νομού Αχαΐας από τον Οκτώβριο του 990 έως το Νοέμβριο του 99. Άρχισα την ειδίκευση μου στη Βιοπαθολογία στο Περιφερειακό Γενικό Νοσοκομείο "Σισμανόγλειο" το Νοέμβριο του 99. Κατά τη διάρκεια της ειδικότητας παρακολούθησα ειδυχά τμήματα στο Γενικό Περιφερειακό Νοσοκομείο (Γ.Π.Ν.) Νοσημάτων θώρακος Αθηνών "Σωτηρία", στο Π.Γ.Ν. Αθηνών, στο Π.Γ.Ν.Α. "Ευαγγελισμός" και στο Π.Γ.Ν. Παίδων "Αγ. Σοφία". Το Νοέμβριο του 995 συμπλήρωσα τον απαιτούμενο χρόνο ειδικότητας και έλαβα, μετά από εξετάσεις, την άδεια ασκήσεως ειδικότητας Βιοπαθολογίας το Δεκέμβριο του 995. Από το Φεβρουάριο του 996 έως τον Απρίλιο του 996 εργάστηκα ως εφημερεύων Βιοπαθολόγος στο Ιατρικό Αθηνών και από το Μάϊο του 996 έως και σήμερα εργάζομαι ως Βιοπαθολόγος στο ΙΑΣΩ Α.Ε.. Από ξένες γλώσσες γνωρίζω Αγγλικά και Ιταλικά άπταιστα και Γαλλικά μέτρια.

11 ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΕΣ ΕΡΓΑΣΙΕΣ Ε. ΠΑΠΑΦΡΑΓΚΑΣ, Φ. ΜΠΑΖΙΓΟΥ. Κ. ΠΑΥΛΟΥ-ΤΕΛΙΟΥΣΗ, Π. ΚΑΨΙΟΧΑ, θ. ΜΠΟΥΖΟΥΡΑ, Δ. ΝΙΚΗΤΑ-ΤΣΟΥΡΕΛΗ: In vitro δραστικότητα κινολονών σε κλινικά σημαντικά Gram-αρνητικά βακτηρίδια. 6ο Εθνικό Συνέδριο Μικροβιολογίας, 3-5 Ιουνίου 994, Πάτρα. Ρ. ΝΙΚΟΛΟΠΟΥΛΟΥ, Ε. ΑΛΑΦΑΚΗ, Γ. ΔΡΟΣΟΣ, Φ. ΜΠΑΖΙΓΟΥ. Π. ΚΑΨΙΟΧΑ, Ε. ΚΑΛΚΑΝΗ, Κ. ΓΙΑΝΝΟΠΟΥΛΟΥ: Ο ρόλος των προϊόντων αποδομής ινώδους-ινωδογόνου στον καρκίνο από μεταβατικό επιθήλιο. Δελτίο Ελληνικής Μικροβιολογικής Εταιρείας, 994, τόμος 39, τεύχος 2. ΠΑΠΑΦΡΑΓΚΑΣ Ε., ΓΟΥΡΝΗ Μ., ΠΑΥΛΟΥ-ΤΕΛΙΟΥΣΗ Κ., ΒΑΡΣΑΜΗ Η., ΜΠΑΖΙΓΟΥ Φ.. ΣΤΑΥΡΟΠΟΥΛΟΥ Κ., ΝΙΚΗΤΑ-ΤΣΟΥΡΕΛΗ Δ.: Νοσοκομειακές ουρολοιμώξεις στο Περιφερειακό Γενικό Νοσοκομείο "Σισμανόγλειο". 3ο Πανελλήνιο Συνέδριο Νοσοκομειακών Λοιμώξεων & Υγιεινής στο Χώρο του Νοσοκομείου, Φεβρουαρίου 995, Αθήνα. Ρ. KARAKITSOS, I. GERGOULAKIS, Α. KOSTAKOPOULOS, G. KOUTSOKALIS, Ν. TAMVAKIS, F. BAZIGOU. Ν. GOULANDRIS: Flow Cytometry analysis in the objective assessment of spermatogenesis. 4th Mediterranean Congress of Urology, 6-0 September 995, Rhodes, Greece. Ι. ΓΕΩΡΓΟΥΛΑΚΗΣ, Φ. ΜΠΑΖΙΓΟΥ. Π. ΚΑΡΑΚΙΤΣΟΣ, Α. ΚΑΡΑ- ΓΙΑΝΝΗΣ, Φ. ΣΟΦΡΑΣ, Χ. ΔΕΛΗΒΕΛΙΩΤΗΣ, Ζ. ΚΥΡΙΑΚΑΚΗΣ, Ν. ΓΟΥΛΑΝΔΡΗΣ: Η περιεκτικότητα των κυττάρων σε DNA και το αντιγόνο πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων (PCNA) στον καρκίνο της κύστεως σε σχέση με το grade και τη διηθητικότητα του όγκου. 3ο Πανελλήνιο Ουρολογικό Συνέδριο, Οκτωβρίου 996, Λεμεσός, Κύπρος. Έλαβε Τιμητική Διάκριση καλύτερης ελεύθερης ανακοίνωσης από την Ελληνική Ουρολογική Εταιρεία. ΣΤΑΘΟΠΟΥΛΟΥ Π., ΒΑΡΣΑΜΗ Η., ΓΟΥΡΝΗ Μ., ΚΟΣΜΟΠΟΥΛΟΥ Α., ΜΠΑΖΙΓΟΥ Φ.. ΡΟΥΣΟΥ Μ., ΠΑΠΑΦΡΑΓΚΑΣ Ε.: Αναδρομική μελέτη στελεχών Μ. tuberculosis, που απομονώθηκαν τη διετία 995-6, στο "Σισμανόγλειο" Γενυχό Νοσοκομείο. 4ο Πανελλήνιο Συνέδριο

12 Νοσοκομειακών Λοιμώξεων & Υγιεινής στο Χώρο του Νοσοκομείου, Φεβρουαρίου 997, Αθήνα. ΠΑΡΑΚΟΛΟΥΘΗΣΗ ΣΥΝΕΔΡΙΩΝ - ΣΕΜΙΝΑΡΙΩΝ - ΗΜΕΡΙΔΩΝ και ΣΥΜΠΟΣΙΩΝ Πάτρα, Απρ ο Πανελλήνιο Συνέδριο Περιγεννητυχής Ιατρικής. Αθήνα, 9 Φεβ. 992 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Υγιεινής στο χώρο του Νοσοκομείου και Νοσοκομειακών Λοιμώξεων. Αθήνα, -4 Απρ ο Πανελλήνιο Συνέδριο Ανοσολογίας, θεσσαλονίκη 8,9 Απρ. 5ο Συνέδριο Μικροβιολογίας. 992 Αθήνα, 5,6 Μαΐου 992 2ο Μετεκπαιδευτώ σεμινάριο :"Νέες εξελίξεις στην εξωσωματική γονιμοποίηση ". Αθήνα, Μαΐου 992 Συμπόσιο : "Νεότερες μέθοδοι στην ταχεία διάγνωση των λοιμώξεων". Αθήνα, 2-6 Μαίου 992 8ο Ετήσιο Πανελλήνιο Ιατρικό Συνέδριο. Αθήνα, 22,23 Οκτ. 992 Μετεκπαιδευτυχό Σεμινάριο Ηπατολογίας : "Χρονιά Ηπατίτις, Πυλαία Υπέρταση". Αθήνα, 29-3 Οκτ ο Πανελλήνιο Συνέδριο AIDS. Αθήνα, 22 Ιαν. 993 Ημερίδα : "Τροφογενείς και Υδατογενείς Λοιμώξεις ". Αθήνα, 2 Map. 993 Ημερίδα : " Γρίπη". Αθήνα, 30 Map. -2 Απρ. ος κύκλος μετεκπαιδευτικών μαθημάτων 993 Ανοσολογίας. Αθήνα, 3 Μαίου 993 Ημερίδα : " Έλεγχος ποιότητας των αναλύσεων". Αθήνα 4-8 Μαΐου 993 9ο Ετήσιο Πανελλήνιο Ιατρικό Συνέδριο. Αθήνα, 5-7 Νοε ο Πανελλήνιο Συνέδριο AIDS. Αθήνα, 0 Νοε. 993 Ημερίδα : "Τα αντιβιοτυχά στο εργαστήριο και το αντιβιόγραμμα στην κλινική". Αθήνα, 9-20 Νοε ο Μετεκπαιδευηκό Σεμινάριο Ηπατολογίας: "Ηπατοκυτταρικός Καρκίνος. Αλκοολική Ηπατοπάθεια". Αθήνα, Σεπ. 993-Ιουν. Μηνιαίες επιστημονικές συνεδρίες της Ελληνικής 994 Μικροβιολογυχής Εταιρείας.

13 Αθήνα, 29 Map. -2 Απρ. 994 Αθήνα, 3,4 Map. 994 Αθήνα, -3 Νοε. 994 Αθήνα, 8,9 Νοε. 994 Αθήνα, 3 Δεκ. 994 Αθήνα, Νοε Ιαν. 995 Αθήνα, 2 Ιαν. 995 Αθήνα, 8 Μαΐου 995 Πάτρα, Μαίου 995 Αθήνα, Οκτ. 995 Αθήνα, Οκτ. 995-Ιουν. 996 Αθήνα, 8-20 Οκτ. 996 Αθήνα, Οκτ. 996-Ιουν ος κύκλος Σεμιναρίου Ανοσολογίας. Μετεκπαιδευτικό Σεμινάριο : "Βασικές αρχές λειτουργίας του ενδοκρινικού συστήματος και εργαστηριακή διερεύνηση των ορμονυχών διαταραχών". Ιο Πανελλήνιο Ανδρολογικό Συνέδριο. Σεμινάριο :'Ή εργαστηριακή προσέγγιση στην HIV-λοίμωξη". Ημερίδα."Αξιολόγηση ορμονολογικών εξετάσεων". Ταχύρρυθμο μετεκπαιδευτικό σεμινάριο της Ελληνικής Μυχροβιολογικής Εταιρείας. Σεμινάριο :" Κυτταρομετρία ροής - κλινικές εφαρμογές". Συμπόσιο : "Διάγνωση και παρακολούθηση ιογενών ηπατοπαθειών". 3 ος κύκλος Σεμιναρίου Ανοσολογίας. Ανοσοαιματολογίας. Ιο Διεθνές Συνέδριο Εργαστηριακών Ιατρών: "Το ιατρικό εργαστήριο στη Διάγνωση-Πρόληψη και θεραπεία". Μηνιαίες επιστημονικές συνεδρίες της Ελληνικής Μικροβιολογικής Εταιρείας. Ιο Πανελλήνιο Συνέδριο Κλινυχής Χημείας. Μηνιαίες επιστημονικές συνεδρίες της Ελληνικής Μικροβιολογικής Εταιρείας.

14 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η εκτίμηση της βιολογικής συμπεριφοράς των νεοπλασμάτων που στηρίζεται στη σταδιοποίηση του όγκου και την εξέταση του βαθμού διαφοροποίησης των κυττάρων του δεν είναι πάντα εύκολη. Επί πλέον η εκτίμηση του βαθμού διαφοροποίησης είναι σε μεγάλο βαθμό υποκείμενη με αποτέλεσμα η αναπαραγωγιμότητα της εξέτασης να είναι πτωχή. Οι ατέλειες αυτές, που περιορίζουν σημαντυχά την προγνωστική αξία των συμβατικών εξετάσεων, ώθησαν τους ερευνητές στην αναζήτηση άλλων χαρακτηριστικών παραμέτρων του νεοπλασματυχου κυττάρου. Στην αναζήτηση αυτή βοήθησε σημαντικά η ανάπτυξη των τεχνυχών αυτοματοποιημένης κυτταρολογίας, η οποία έχει προσφέρει νέες μεθόδους ποσοηκής και αντικειμενυχής εκτίμησης της βιολογικής συμπεριφοράς των διαφόρων νεοπλασμάτων. Η μέτρηση της περιεκτυχότητας των κυττάρων σε DNA είναι μία από τις πρώτες εφαρμογές αυτών των τεχνυχών. Ωστόσο στη βιβλιογραφία υπάρχουν αντιφατικά αποτελέσματα ως προς την προγνωσπκή αξία του δείκτη DNA. Έτσι η έρευνα στράφηκε στην αναζήτηση άλλων δευχτών με βάση τους οποίους θα μπορούσε να εκτιμηθεί με μεγαλύτερη ακρίβεια ο βαθμός κακοήθειας και η πρόγνωση της νεοπλασματικής νόσου. Μέσα στο πλαίσιο αυτό έχει μελετηθεί τα τελευταία χρόνια ο ρυθμός πολλαπλασιασμού των νεοπλασματυχών κυττάρων και η σχέση του με τους άλλους προγνωστικούς δείκτες στα διάφορα νεοπλάσματα. Η εργασία αυτή αφορά την εκτίμηση με τεχνικές αυτοματοποιημένης κυτταρολογίας του κλάσματος πολλαπλασιασμού των κυττάρων στους όγκους του ουροποιητικού συστήματος. Από τους όγκους αυτούς προτιμήθηκαν οι καρκίνοι της ουροδόχου κύστεως από μεταβατικό επιθήλιο λόγω της μεγαλύτερης συχνότητας με την οποία απαντούν και η οποία επιτρέπει την εξαγωγή πιο αξιόπιστων συμπερασμάτων. Η εκτίμηση του κλάσματος πολλαπλασιασμού έγινε με τον προσδιορισμό της έκφρασης του πυρηνικού αντιγόνου πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων (PCNA), που είναι ένα αντιγόνο στενά συνδεδεμένο με τον κυτταρικό κύκλο. Συγκεκριμένα η έκφραση του PCNA αρχίζει να αυξάνεται στον πυρήνα των κυττάρων που βρίσκονται προς το τέλος της Gl φάσης, αμέσως πριν από την έναρξη της σύνθεσης του DNA, φθάνει το ύψιστο σημείο της στη διάρκεια της φάσης S και στη συνέχεια ελαττώνεται στη διάρκεια της G2M φάσης. Η μελέτη έγινε σε δείγματα ιστών που προέρχονταν από διουρηθρική εκτομή των όγκων ή από ολική κυστεκτομή. Τα αποτελέσματα της μέτρησης

15 της έκφρασης του PCNA συγκρίθηκαν τελικά με την πλοειδικότητα του DNA, το βαθμό διαφοροποίησης και το στάδιο του όγκου. Συνολικά μελετήθηκαν 60 άρρωστοι με καρκίνο της κύστεως που χειρουργήθηκαν στην Πανεπιστημιακή Ουρολογική Κλινυχή του Γενυχού Περιφερειακού Νοσοκομείου "Σισμανόγλειο". Η εκτίμηση του βαθμού διαφοροποίησης και του σταδίου των όγκων έγινε στο Εργαστήριο Παθολογυςής Ανατομικής του ίδιου Νοσοκομείου. Ο προσδιορισμός της περΐ κτικότητας των κυττάρων σε DNA και της έκφρασης του PCNA έγιναν με την Ανάλυση Εικόνας στο Ερευνητικό Εργαστήριο της Πανεπιστημιακής Ουρολογυτής Κλινικής στο ίδιο Νοσοκομείο. Στο σημείο αυτό οφείλω να ευχαριστήσω το Διευθυντή του Mucpoßioλογικού Εργαστηρίου του Σισμανόγλειου Νοσοκομείου Δρ. Ε. Παπαφράγκα και τη Διευθύντρια του Αιματολογυχού Εργαστηρίου Δρ. Κ. Γιαννόπουλου του ίδιου Νοσοκομείου για την εκπαίδευση μου στην ειδυχότητα της Βιοπαθολογίας. θερμά επίσης ευχαριστώ τον Καθηγητή κ. Κ. Δημόπουλο, τον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Δ. Πανταζόπουλο και τον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Α. Κωστακόπουλο, μέλη της Τριμελούς Συμβουλευτυχής Επιτροπής, για την όλη επίβλεψη της διατριβής και τις πολύτιμες συμβουλές τους σε όλες τις φάσεις της εκπόνησης της. Ιδιαίτερα ευχαριστώ τον κ. Ν. Γουλανδρή, Επίκ. Καθηγητή, που με βοήθησε στην όλη μου προσπάθεια. Οφείλω επίσης να ευχαριστήσω τον Κυτταρολόγο κ. Ι. Γεωργουλάκη για την ανεκτίμητη βοήθεια του στην εκτέλεση και αξιολόγηση του εργαστηριακού μέρους της εργασίας και για τις συμβουλές του στη συγγραφή της διατριβής. Επίσης ευχαριστώ τον Κυτταρολόγο κ. Π. Καρακίτσο για τις υποδείξεις του στην επιλογή των εργαστηριακών μεθόδων, θερμά ευχαριστώ τον πατέρα μου κ. Γ. Μπαζίγο, τ. Αναπλ. Καθηγητή της Βιοστατιστικής του Πανεπιστημίου Κρήτης, για τη βοήθεια του στη στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων και τη συμπαράσταση του γενικότερα, θερμές ευχαριστίες οφείλω και στην Παρασκευάστρια κ. Ε. Μπάνου για την πολύτιμη βοήθεια της στην τεχνική επεξεργασία των δειγμάτων. Αισθάνομαι τέλος την υποχρέωση να εκφράσω τις ευχαριστίες μου σε όλους τους συναδέλφους της Πανεπιστημιακής Ουρολογυχής Κλινικής και του Εργαστηρίου Παθολογικής Ανατομικής του "Σισμανόγλειου" Γ.Π.Ν. για τη βοήθεια τους στη συλλογή και τη μελέτη του υλικού αυτής της διατριβής.

16 ί. Γί >..;.Χ ^ ; Ι -F? ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

17 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ. Καρκίνος της ουροδόχου κύστεως από μεταβατικό επιθήλιο Τα τελευταία χρόνια, οι ερευνητές έχουν προχωρήσει στην καλύτερη κατανόηση της βιολογικής συμπεριφοράς του καρκίνου από μεταβατικό επιθήλιο της ουροδόχου κύστεως. Αυτό, σε ορισμένες περιπτώσεις, έχει αλλάξει ριζικά τη θεραπευτική αντιμετώπιση του όγκου. Όμως, ο καρκίνος του μεταβατυχού επιθηλίου των ανωτέρων ουροφόρων οδών και της ουροδόχου κύστεως παραμένει σε πολλά σημεία αδιευκρίνιστος. Για παράδειγμα, παρόλο που οι όγκοι του ουροθηλίου εκδηλώνονται με μία από τις συγκεκριμένες μορφές (in situ, επιφανειακοί, διηθητυχοί και μεταστατικοί) δεν μπορεί να προσδιοριστεί η τελική έκβαση του αρρώστου. Δεν μπορεί να προβλεφθεί αν ο όγκος θα παραμείνει τοπικός ή θα δώσει μεταστάσεις, και αν ναι, το χρονυχό διάστημα στο οποίο θα συμβεί αυτό μέσα στην όλη πορεία της νόσου (Droller, 986). /./ Συχνότητα Οι όγκοι της ουροδόχου κύστεως είναι σχεδόν στο σύνολο τους επιθηλιακοί. Από αυτούς, το 99% είναι, με βάση τα κριτήρια που θέτει η Παγκόσμια Οργάνωση Υγείας (WHO, 973) και το Ινστιτούτο Παθολογοανατομίας των Ενωμένων Δυνάμεων (AFIP, 975), όγκοι κακοήθεις. Για πρακτικούς επομένως λόγους, τα επιθηλιακά νεοπλάσματα και ο καρκίνος της ουροδόχου κύστεως από μεταβατικό επιθήλιο είναι συνώνυμες έννοιες, δεδομένου μάλιστα ότι οι καλοήθεις όγκοι της κύστεως (θήλωμα και ανάστροφο θήλωμα), είναι πολύ σπάνιοι. Η σχετική συχνότητα του καρκίνου της ουροδόχου κύστεως στις Ηνωμένες Πολιτείες, για άτομα πάνω από 40 ετών, είναι 20 ανά κατοίκους (Davies, 977). Η μεγαλύτερη συχνότητα παρουσιάζεται στην ηλικία των ετών (Melicow, 974), με μέση ηλυχία τα 65 έτη (Narayna, Loening και Gulp, 98). Η σχέση ανδρών/γυναυχών είναι 2,7: (Silverberg και Lubera, 987). Εκτός από τον καρκίνο από μεταβατικό επιθήλιο, στην ουροδόχο κύστη αναπτύσσονται και άλλοι ιστολογικοί τύποι καρκινωμάτων, όπως το αδενοκαρκίνωμα και το πλακώδες καρκίνωμα. Το αδενοκαρκίνωμα εμφα-

18 νίζεται κυρίως στην πέμπτη και έκτη δεκαετία της ζωής (Jacobo, Loening, Schmidt και συν., 977). Η σχέση ανδρών/γυναικών είναι περίπου 3: (Mostofi, Thomson και Dean, 955). Το πλακώδες καρκίνωμα της κύστεως απαντάται στο 3-6,7% όλων των καρκίνων της κύστεως (Faysal, 98). Το αδενοκαρκίνωμα και το πλακώδες καρκίνωμα απαντώνται συχνότερα σε έδαφος λιθίασης της ουροδόχου κύστεως. Η εντόπιση των όγκων της ουροδόχου κυστεως κατά σειρά συχνότητας είναι η εξής: Πλάγια τοιχώματα 24% Οπίσθιο τοίχωμα 6% θόλος 5% Πρόσθιο τοίχωμα 3% Τρίγωνο 3% Αυχένας % (Droller, 986) Οι συχνότερες μεταστάσεις είναι στους λεμφαδένες, στο ήπαρ, στους πνεύμονες και στα οστά. Τα πιο πάνω στοιχεία προκύπτουν από μελέτες που έγιναν σε νεκροτομικό υλικό, στο οποίο βρέθηκαν μεταστάσεις στις 58 από τις 87 περιπτώσεις με καρκίνο της κύστεως που εξετάστηκαν (ποσοστό 66,7%) (Droller, 986). Η συχνότητα των μεταστάσεων στο ίδιο αυτό υλικό βρέθηκε να έχει σχέση με το βάθος της διήθησης (Narayna, Loening και Culp, 98), σε επέκταση δε του όγκου έξω από την κύστη όλοι οι ασθενείς βρέθηκαν με μεταστάσεις (Droller, 986). Σε άλλες νεκροτομές το ποσοστό των μεταστάσεων κυμαινότανε από 40-70% (Narayna, Loening και Culp, 98). Η συχνότητα των λεμφαδενικών μεταστάσεων αυξάνεται με το κλινικό στάδιο (Smith και Whitmore, 98), με συχνότερες μεταστάσεις στους αδένες που βρίσκονται στα έξω λαγόνια, έσω λαγόνια και κοινά λαγόνια αγγεία (Narayna, Loening και Culp, 98)..2 Προδιαθεσικοί παράγοντες Υπάρχουν ορισμένα άτομα που έχουν προδιάθεση να αναπτύξουν καρκίνο της ουροδόχου κύστεως (Δημόπουλος, 987), όπως: -Οι εργαζόμενοι ή ασχολούμενοι με διάφορες χρωστικές ουσίες. -Άτομα με τοπικά προδιαθεσικά αίτια, όπως, σχιστοσωμίαση, λευκοπλακία, κυστική κυστίτιδα. -Άτομα με βαλκανική νεφροπάθεια. 2

19 -Άτομα με νεφροπάθεια από αναλγητικά φάρμακα (φαινακετίνη). -Καπνιστές (τοπική δράση στο μεταβολισμό της τρυπτοφάνης ή άλλος μηχανισμός). -Ο ρόλος του καφέ είναι ακόμη αδιευκρίνιστος. -Σε άτομα που λαμβάνουν κυκλοφωσφαμίδη ο κίνδυνος για ανάπτυξη καρκίνου της κύστεως αυξάνει κατά 9 φορές (Plotz, Klippel, Decker και συν., 979). -Γυναίκες που ακτινοβολήθηκαν στην πύελο για αιμορραγία της ουρήθρας ή για καρκίνο του τραχήλου της μήτρας εμφάνισαν καρκίνο της κύστεως 2 έως 4 φορές συχνότερα του φυσιολογυχού (Palmer και Sprate, 956). - Χρωμοσωμιακές ανωμαλίες με συχνότερη την απώλεια του μακρού σκέλους του χρωμοσώματος 9 (9q-) (Sandberg και Berger, 994)..3 Συμπτώματα Το συχνότερο σύμπτωμα είναι η μακροσκοπική αιματουρία. Αλλα συμπτώματα είναι η συχνουρία, ο πόνος στην ούρηση, η δυσουρία και σπάνια η επίσχεση των ούρων (Droller, 986). Το 90% των ασθενών με καρκίνωμα in situ παρουσιάζουν μόνο κυστικά ενοχλήματα που αποδίδονται σε πιθανή κυστίτιδα ή προστατίτιδα (Utz, Farrow, Rife και συν., 984, Utz, Hanash και Farrow, 970). Βασική προϋπόθεση για τη θεραπευτική αντιμετώπιση των όγκων της ουροδόχου κύστεως είναι η έγκαιρη διάγνωση. Για το λόγο αυτό, πρέπει να καθιερωθεί ως αξίωμα ότι κάθε αιματουρία, οποιαδήποτε και αν είναι η μορφή της, δηλ. μεγάλη ή μικρή, ολυχή, αρχική ή τελυχή, μακροσκοπική ή μικροσκοπυτή, επώδυνη ή ανώδυνη, επιβάλλει, χωρίς καθυστέρηση, την εκτέλεση ενδοφλέβιας ουρογραφίας με κυστεογραφία πριν και μετά την ούρηση. Σε περίπτωση που με αυτή την εξέταση δεν προσδιορίζεται το αίτιο της αιματουρίας, τότε είναι αναγκαία η κυστεοσκόπηση (Δημόπουλος, 987)..4 Ιστολογική Ταξινόμηση Η μεγάλη πλειοψηφία (98%) των όγκων της ουροδόχου κύστεως έχουν επιθηλιακή προέλευση. Σύμφωνα με την Παγκόσμια Οργάνωση Υγείας (WHO) υπάρχουν τέσσερις τύποι καρκίνου: ο καρκίνος από μεταβατικό επιθήλιο, το πλακώδες καρκίνωμα, το αδενοκαρκίνωμα και οι αδιαφορο- 3

20 ποίητοι όγκοι (Mostofi, Sobin και Toriin, 973). Οι καρκίνοι από μεταβατικό επιθήλιο αποτελούν το 92% περίπου του συνόλου των όγκων, από πλακώδη μεταπλασία το 6-7%, τα αδενοκαρκινώματα το -2% και λιγότερο από % οι αδιαφοροποίητοι όγκοι. Πολλές φορές, και κυρίως σε διηθητικούς όγκους, συναντώνται περισσόεροι του ενός κυτταρικοί τύποι. Πιο συχνά πρόκειται για όγκους από μεταβατικό επιθήλιο με πλακώδεις, αδενικούς ή σωληνώδεις κατά τόπους σχηματισμούς. Η βιολογική συμπεριφορά των όγκων αυτών (mixed tumors) δεν φαίνεται να τροποποιείται από τους συνυπάρχοντες τύπους. Εκτός από τους όγκους επιθηλιακής προέλευσης στην ουροδόχο κύστη απαντούν και μη επιθηλιακοί όγκοι, οι οποίοι περιλαμβάνουν το σάρκωμα, το φαιοχρωμοκύττωμα, το κακόηθες λέμφωμα, τους μικτούς μεσεγχυματικούς όγκους και τους πρωτογενείς καρκινοειδείς όγκους. Οι παραπάνω μη επιθηλιακοί όγκοι συνιστούν μόλις το 2% του συνόλου των όγκων της ουροδόχου κύστεως..5 Σταδιοποιηση των όγκων της ουροδόχου κύστεως Το πρώτο σύστημα σταδιοποίησης για τον καρκίνο της ουροδόχου κύστεως ανακοινώθηκε το 946 από τους Jewett και Strong. Με βάση αυτό το σύστημα ο καρκίνος της κύστεως ταξινομείται σε τρία στάδια (A-C) ανάλογα με το βάθος της διήθησης του τοιχώματος του οργάνου και την ύπαρξη μεταστάσεων. Αργότερα το στάδιο Β διαιρέθηκε σε δύο υποκατηγορίες για να γίνει η διάκριση μεταξύ των όγκων που διηθούν την επιπολής μυϊκή στοιβάδα (στάδιο BÎ) από αυτούς που διηθούν την εν τω βάθει μυϊκή στοιβάδα (στάδιο Β2) (Jewett και Cason, 948). Το 952 ο Marshall παρουσίασε μία τροποποίηση του προηγουμένου συστήματος. Συγκεκριμένα πρόσθεσε το στάδιο 0 και D. Στο 0 περιέλαβε όγκους που διηθούν τη βασική στοιβάδα, περιπτώσεις στις οποίες δεν βρίσκεται όγκος στο εγχειρητυχό παρασκεύασμα της ριζικής κυστεκτομής και περιπτώσεις με in situ νεόπλασμα. Στο στάδιο D περιέλαβε όγκους με μεταστάσεις που διαίρεσε σε δύο υποκατηγορίες: στο στάδιο DI, στο οποίο η νόσος είναι περιορισμένη στην πύελο και στάδιο D2, στο οποίο η νόσος υπερβαίνει τα όρια της πυέλου με απομακρυσμένες μεταστάσεις. Ένα από τα μειονεκτήματα αυτού του συστήματος είναι ότι δεν διαχωρίζει το θηλώδες μη διηθητικό νεόπλασμα από το μη θηλώδες μη διηθητικό (καρκίνωμα in situ). 4

21 Πιο ευρύτερα αποδεκτό και χρησιμοποιούμενο σήμερα σύστημα είναι το Τ.Ν.Μ. Το σύστημα αυτό προτάθηκε από την U.I.C.C. (Union Internationale Contre Cancer) για πρώτη φορά το 950 και το οποίο με τις διάφορες τροποποιήσεις είναι το περισσότερο χρησιμοποιούμενο σήμερα. Το σύστημα αυτό έχει γίνει αποδεκτό από την AJCC (American Joint Cancer Committee) (Grignon, 997). Σύμφωνα με το σύστημα αυτό η ταξινόμηση του όγκου γίνεται με βάση την εκτίμηση της τοπικής εκτάσής του (Τ), τη διήθηση ή όχι των επιχώριων λεμφαδένων (Ν) και την παρουσία ή απουσία μεταστάσεων σε απομακρυσμένα όργανα (Μ). Το 974 η U.I.C.C. ανακοίνωσε τη δεύτερη τροποποίηση και το 978 ανακοίνωσε την τρίτη τροποποίηση του συστήματος Τ.Ν.Μ.. Σύμφωνα με την τελευταία τροποποίηση η έκταση του πρωτογενούς νεοπλάσματος πρέπει να εκτιμάται με την κλινική εξέταση, την ενδοφλέβια ουρογραφία, την κυστεοσκόπηση, την αμφίχειρη εξέταση υπό νάρκωση και τη βιοψία. Η κατάσταση των επιχωρίων λεμφαδένων εκτιμάται με την κλινική εξέταση, με ή χωρίς ακτινολογικό έλεγχο, στον οποίο συμπεριλαμβάνονται η λεμφαγγειογραφία, η ενδοφλέβια ουρογραφία και η αξονική τομογραφία. Η ύπαρξη των μεταστάσεων καθορίζεται με κλινική εξέταση, με ακτινολογικό έλεγχο και με ραδιοϊσοτοπικές μελέτες. Στην ίδια τροποποίηση του 978 εισήχθη και ο διαχωρισμός των θηλωματωδών όγκων σε στάδιο Ta (μη διηθητικό) και στάδιο ΤΙ (διήθηση του υποβλεννογόνιου χιτώνα). Συγκεκριμένα στο σύστημα ΤΝΜ ξεχωρίζονται τα ακόλουθα στάδια: Tis: προδιηθητικό καρκίνωμα ή καρκίνωμα in situ, το οποίο καλείται επίσης και επίπεδο καρκίνωμα (το νεόπλασμα δεν ξεπερνάει το επιθήλιο). Ta: θηλώδες μη διηθητικό καρκίνωμα στο οποίο υπάγονται και τα θηλώματα. ΤΙ: στην αμφίχειρη εξέταση μπορεί να γίνει αντιληπτή μία κινητή μάζα που θα πρέπει όμως να εξαφανιστεί μετά από πλήρη διουρηθρική εκτομή. Μικροσκοπικά η διήθηση του όγκου δεν ξεπερνάει το χόριο. Τ2: στην αμφίχειρη εξέταση βρίσκεται κινητή σκληρία που και αυτή εξαφανίζεται μετά από την πλήρη διουρηθρική εξαίρεση του όγκου. Μικροσκοπικά υπάρχει διήθηση του επιπολής μυός. 5

22 T3: στην αμφίχεφη εξέταση βρίσκεται σκληρία ή οζ(όδης μάζα κινητή, που παραμένει και μετά από τη διουρηθρική εξαίρεση του εξωφυτικού τμήματος του όγκου. Μικροσκοπικά υπάρχει διήθηση του εν τω βάθει μυϊκού τοιχώματος ή και ολόκληρου του κυστικού τοιχώματος. Έτσι το στάδιο Τ3 διαιρείται στο: T3a: όταν η διήθηση φτάνει στο εν τω βάθει μυϊκό τοίχωμα και T3b: όταν η διήθηση αφορά όλο το κυστικό τοίχωμα. Τ4: ο όγκος είναι καθηλωμένος ή επεκτείνεται στα γειτονικά όργανα. Μικροσκοπικά υπάρχει ένδειξη τέτοιας επέκτασης. To Τ4 διαιρείται στο: T4a: όταν ο όγκος διηθεί τον προστάτη, τη μήτρα ή τον κόλπο, και T4b: όταν ο όγκος είναι καθηλωμένος στο πυελικό ή στο κοιλιακό τοίχωμα. Τχ: Έτσι χαρακτηρίζεται ο όγκος όταν δεν μπορούν να γίνουν ούτε οι ελάχιστες εξετάσεις που απαιτούνται για τη σταδιοποίησή του. Η προσθήκη του γράμματος m στο ανάλογο Τ στάδιο δείχνει την πολλαπλότητα του όγκου, π.χ. T2tn. Με το στοιχείο Ν χαρακτηρίζεται η διήθηση των επιχώριων και παραεπιχώριων λεμφαδένων, αυτό δε προστίθεται στο στοιχείο Τ που αφορά την τοπική επέκταση του όγκου. Επιχώριοι λεμφαδένες για την ουροδόχο κύστη είναι όσοι βρίσκονται κάτω από το διχασμό των κοινών λαγονίων αρτηιών, ενώ παραεπιχώριοι είναι οι βουβωνικοί, οι κοινοί λαγόνιοι και οι παραρτικοί λεμφαδένες. Ανάλογα με την έκταση της διήθησης των αδένων αυτών διακρίνονται τα στάδια: NO: όταν δεν υπάρχει καμία ένδειξη λεμφαδενικής προσβολής. NI: όταν υπάρχει ένδειξη προσβολής ενός μόνο σύστοιχου επιχώριου λεμφαδένα. Ν2: όταν υπάρχει ένδειξη προσβολής ετερόπλευρων ή αμφοτερόπλευρων πολλαπλών επιχώριων λεμφαδένων. Ν3: όταν υπάρχει ένδειξη διηθημένων και καθηλωμένων επιχώριων λεμφαδένων (υπάρχει μάζα καθηλωμένη στο πυελικό τοίχωμα με χώρο ελεύθερο μεταξύ αυτού και του όγκου). Ν4: όταν υπάρχει ένδειξη προσβολής των παρα-επιχώριων λεμφαδένων. Νχ: όταν δεν έχουν γίνει οι ελάχιστες εξετάσεις που απαιτούνται για την ανίχνευση της διήθησης των λεμφαδένων. 6

23 Με το στοιχείο Μ χαρακτηρίζεται η ύπαρξη μακρινών μεταστάσεων, αυτό δε προστίθεται στο Τ και Ν για να είναι ολοκληρωμένη η κλινική κατάταξη του όγκου. Έτσι για το Μ διακρίνονται τα στάδια: MO: όταν δεν υπάρχει καμία ένδειξη για την ύπαρξη μεταστάσεων. Μ : όταν υπάρχει ένδειξη μακρινών μεταστάσεων. Μχ: όταν δεν έχουν γίνει οι ελάχιστες εξετάσεις που απαιτούνται για την ανίχνευση μεταστάσεων. Η τετάρτη τροποποίηση του Τ.Ν.Μ. που ανακοινώθηκε από την U.I.C.C. το 987 έχει εγείρει σοβαρές διαφωνίες και δεν έχει τύχει ευρείας αποδοχής, ειδικά στην Ευρώπη (Schroder, Cooper, Debryne και συν., 988). Στην έκδοση του 987 του U.I.C.C. έχει τροποποιθεί ο τρόπος προσδιορισμού του παράγοντα Τ και έχει παραλειφθεί σαν παράμετρος η ύπαρξη ορατής ή ψηλαφητής μάζας. Το θήλωμα δεν υπάρχει σαν οντότητα σε αυτό το σύστημα. Τα στάδια T4a και T4b καταργούνται και ορίζεται ένα στάδιο Τ4, στο οποίο περιλαμβάνονται τα νεοπλάσματα που διηθούν το πυελικό τοίχωμα ή τα γειτονυχά όργανα. Οι όγκοι Tis και Ta περιλαμβάνονται στο στάδιο ΤΟ. Μετά από την εγχείρηση και την παθολογοανατομυχή εξέταση του όγκου γίνεται η ιστοπαθολογική ταξινόμηση που χαρακτηρίζεται με τα στοιχεία ρ- Τ. Τα στάδια αυτής της ταξινόμησης είναι: ρ-το: καμία ιστολογυχή ένδειξη ύπαρξης όγκου (όταν προφανώς έχει προηγηθεί ακτινοβολία). p-tis: καρκίνωμα in situ. p-ta: μη διηθητικό καρκίνωμα. ρ-τι: διηθητικό καρκίνωμα όχι πέρα από τη lamina propria (βασική μεμβράνη). ρ-τ2: διήθηση του επιπολής μυός. p-t3a: διήθηση του εν τω βάθει μυός. p-t3b: διήθηση του περυχυσηκού λίπους. p-t4a: διήθηση του προστάτη, της μήτρας ή του κόλπου. p-t4b: διήθηση του κοιλιακού ή του πυελυχού τοιχώματος (Pront, 977)..6 Ιστολογικός βαθμός διαφοροποίησης (Grade) Υπάρχουν πολλά συστήματα ταξινόμησης των όγκων της κύστεως σύμφωνα με το βαθμό διαφοροποίησης των κυττάρων. Ένα από τα συστήματα αυτά είναι του Bergkvist και συνεργατών (965) με 4 βαθμούς 7

24 διαφοροποίησης. Με την κατάταξη της W.H.O., τρεις βαθμοί διαφοροποίησης έχουν προταθεί: ο βαθμός (grade) Ι με τον ελάχιστο βαθμό ατυπίας, ο βαθμός III με την πιο σοβαρή μορφή ατυπίας και ο βαθμός II με ενδιάμεσου βαθμού ατυπία (Mostofi, Sorbin, Torloni και συν., 973). Οι διάφοροι βαθμοί διαφοροποίησης φαίνονται αναλυτικότερα πιο κάτω: GRADE Ι Το θηλώδες καρκίνωμα βαθμού Ι, χαρακτηρίζεται από αύξηση των κυτταρικών στοιβάδων του επιθηλίου (περισσόερες των 0). Δεν υπάρχουν σημαντυχές πυρηνυχές μεταβολες. GRADE II Η γενική δομή του επιθηλίου χαρακτηρίζεται από αξιοσημείωτη υπερπλασία. Παρατηρούνται πυρηνυχές μεταβολές και κυρίως διόγκωση και υπέρχρωση. GRADE III Η συνολυχή δομή του ουροθηλίου έχει καταστραφεί και παρατηρείται ανώμαλη επιθηλιακή ανάπτυξη μαζί με έντονες πυρηνυχές διαταραχές. Η U.I.C.C. έχει αποδεχτεί το σύστημα αυτό έχοντας προσθέσει και την ιστολογυχή οντότητα θήλωμα (papilloma), που ορίζεται σαν ένας θηλώδης επιθηλιακός όγκος καλυπτόμενος από επιθήλιο παρόμοιο με το φυσιολογυχό μεταβατικό επιθήλιο (λιγότερες των 6 κυτταρυχών στοιβάδων) χωρίς ύπαρξη πυρηνυχών διαταραχών (Sobin, 978). Η U.I.C.C. κατέταξε αυτούς τους όγκους στην κατηγορία GO. Το μειονέκτημα της ταξινόμησης του WHO, που ωστόσο έχει επυχρατήσει, είναι ότι για καρκίνους grade II δεν μπορεί να προβλεφθεί με ακρίβεια η πρόγνωση της νόσου. Για το λόγω αυτό οι Pauwels και συν. (988) διαχώρισαν το grade II σε grade IIa και grade IIb με βάση το σχήμα και τον προσανατολισμό των πυρήνων των κυττάρων. 8

25 2. Περιεκτικότητα των κυττάρων σε DNA Είναι γνωστό ότι η καρκινογένεση σχετίζεται συχνά με διαταραχές των χρωμοσωμάτων, μεταβολές του γενετικού κώδικα, μετρητές διαφορές στην περιεκτικότητα των κυττάρων σε DNA (πλοειδικότητα του DNA) και αλλαγές του κυτταρικού κύκλου των καρκινικών κυττάρων (Fossa, Berner, Waehre και συν., 992, Bosari, Lee, Tahan και συν., 992, Muhoren, Pyrhoenen, Laasonen και συν., 992). Η πλοειδικότητα του DNA και ο κυτταρικός κύκλος μπορούν να μελετηθούν σήμερα με κυτταρομετρία ροής και με ανάλυση εικόνας (Muhoren, Pyrhoenen, Laasonen και συν., 992, Umehara, Kimura, Yoshida και συν., 992, Peters, Miles, Cerry και συν., 992). Η εξέταση της πλοειδικότητας του DNA στηρίζεται στις διαφορές που παρατηρούνται στο ποσό του πυρηνικού DNA μεταξύ φυσιολογικών και νεοπλασματικών κυττάρων. Είναι γνωστό ότι τα φυσιολογυχά σωματικά κύτταρα του ανθρώπου περιέχουν σταθερό, διπλοειδικό αριθμό (23 ζεύγη) χρωμοσωμάτων, που ορίζεται και ως 2η και επομένως σταθερό ποσό DNA (περίπου 7pg) που ορίζεται και ως 2c (Trujillo, Cork, Hart και συν., 974, Barlogie, Gohde και Drewinko, 979, Barlogie, Drewinko, Schumann και συν., 980). Μερικά φυσιολογικά κύτταρα, όπως τα γεννητικά, δεν είναι διπλοειδικά αλλά απλοειδικά, περιέχουν δηλ. το μισό αριθμό χρωμοσωμάτων του κανονικού. Ορισμένα άλλα κύτταρα, όπως τα φυσιολογικά μεγακαρυοκύτταρα, είναι πολυπλοειδικά, περιέχουν δηλ. αριθμό χρωμοσωμάτων, που είναι ακέραιο πολλαπλάσιο του κανονικού. Είναι δυνατόν επίσης με την επίδραση της ιονίζουσας ακτινοβολίας ή/και της χημειοθεραπείας τα φυσιολογικά κύτταρα να μεταπέσουν σε ανευπλοειδυχά, δηλ. με αριθμό χρωμοσωμάτων, και επομένως ποσό DNA, έξω από τα ακέραια πολλαπλάσια του κανονικού (Booking, 993). Σε αντίθεση με τα φυσιολογυχά, τα νεοπλασματικά κύτταρα χαρακτηρίζονται, όπως αναφέρεται και πιο πάνω, από γενετική μεταβλητότητα και σχεδόν πάντοτε εμφανίζουν χρωμοσωματικές ανωμαλίες (Atkin, Martinson και Baker, 966, Barlogie, Drewinko, Schumann και συν., 980, Vielh, Magdelenat, Remvikos και συν., 99) με αποτέλεσμα να έχουν συχνά παθολογικά αυξημένο ποσό πυρηνικού DNA (Trujillo, Cork, Hart και συν., 974, Barlogie, Gohde και Wijkstrom, 986, Remvikos, Gerbaut-Seareau, Vielh και συν., 988, Schackney, Burholt, Pollice και συν., 990). 9

26 Σύμφωνα με ευρήματα καρυοτυπυχής ανάλυσης των συμπαγών όγκων, τρεις είναι οι συχνότερες αιτίες που οδηγούν σε χρωμοσωματικές ανωμαλίες: α) η λανθασμένη ένωση τμημάτων ή σκελών χρωμοσωμάτων, β) η δομική επαναδιάταξη του γενετικού υλικού που οδηγεί σε εξάλειψη ή διπλασιασμό και γ) ο ενδοδιπλασιασμός που καταλήγει στο σχηματισμό κυττάρων τετραπλοειδυχών, οκταπλοειδυχών, δηλ. με αριθμό χρωμοσωμάτων 2 και 4 φορές μεγαλύτερο του κανονυχού. Οι αριθμητυχές μεταβολές συνίστανται σε αύξηση και λιγότερο συχνά σε μείωση του αριθμού των χρωμοσωμάτων. Ορισμένες φορές έχουν παρατηρηθεί διαφορετυχοί συνδυασμοί χρωμοσωματικών ανωμαλιών σε όγκους του ίδιου τύπου και συχνά σε διαφορετικούς κλώνους του ίδιου όγκου. Πρέπει να τονιστεί ότι η ανάλυση εικόνας και η κυτταρομετρία ροής επιτρέπουν την αναγνώριση της μεταβολής του DNA, όχι όμως και την αιτία της χρωμοσωματικής μεταβολής που την προκάλεσε (Vielh, Magdelenat, Remvikos και συν., 99). Με τις παραπάνω δύο μεθόδους το αποτέλεσμα της μέτρησης του πυρηνικού DNA εκφράζεται ως δείκτης DNA (DNA index), που είναι η σχέση του σχετυχού ποσού DNA που έχουν τα εξεταζόμενα νεοπλασματυχά κύτταρα στη φάση G0G, προς το σχετυχό ποσό DNA που έχουν τα φυσιολογυχά κύτταρα στην ίδια φάση. Ο δείκτης DNA επομένως, δείχνει σε πιο βαθμό τα νεοπλασματυχά κύτταρα απέχουν από τα φυσιολογικά κύτταρα ως προς την περιεκτικότητα σε DNA (Dressler, Seamer, Ownens και συν., 988). Η περιεκτικότητα των κυττάρων σε DNA αναφέρεται και ως πλοειδικότητα του DNA, η οποία πρέπει να διακρίνεται από την πλοειδυχότητα του κυττάρου, που είναι όρος της Κυτταρογενετυχής και αναφέρεται στον αριθμό και στη δομή των χρωμοσωμάτων. Με βάση την πλοειδυχότητα του DNA οι όγκοι διακρίνονται σε διπλοειδικούς και σε ανευπλοειδυχούς. Διπλοειδυχοί είναι οι όγκοι με δείκτη DNA ίσο με τη μονάδα, δηλ. τα νεοπλασματυχά κύτταρα περιέχουν ποσό DNA που αντιστοιχεί σε κανονυχό αριθμό χρωμοσωμάτων. Ανευπλοειδικοί είναι οι όγκοι με δείκτη DNA είτε μικρότερο είτε μεγαλύτερο από τη μονάδα, που αντιστοιχεί πάντοτε σε παθολογυχή σύνθεση χρωμοσωμάτων. Όμως, πολλοί όγκοι εμφανίζονται ως διπλοειδυχοί, ακόμα και όταν τα κύτταρα τους έχουν παθολογική σύνθεση χρωμοσωμάτων. Αυτό εξηγείται από το ότι η παθολογυχή αυτή σύνθεση γίνεται αντιληπτή, όταν ο αριθμός των χρωμοσωμάτων αυξηθεί ή μειωθεί κατά τρία τουλάχιστον χρωμοσώματα (από 46 σε 49 ή 43 χρωμοσώματα) (Quirke, 990). Κατ' άλλους μάλιστα ερευνητές μπορούν να ανιχνευθούν μεταβολές του DNA μέχρι και 0% του ποσού του, που αντιστοιχεί σε ακόμα μυχρότερες μεταβολές του ίο

27 αριθμού των χρωμοσωμάτων (Booking, 993). Αν επιπλέον ληφθεί υπόψη ότι υπάρχουν και οι ποιοτικές διαταραχές των χρωμοσωμάτων, οι οποίες είναι δυνατό να μην προκαλούν μεταβολές του ποσού του DNA, τότε ένας δείκτης DNA ίσος με τη μονάδα μπορεί να αντιστοιχεί σε φυσιολογικό, ελαφρά διαταραγμένο ή και πολύ ανώμαλο καρυότυπο. Αντίθετα, ένας δείκτης που δείχνει υποδιπλοειδυχό ή τριπλοειδικό DNA αντιστοιχεί σε πολύ ανώμαλο καρυότυπο (Quirke,990, Vielh, Magdelenat, Remvikos και συν., 99, Peters-Gee, Miles, Cerny και συν., 992). Ορισμένοι συγγραφείς διακρίνουν τους όγκους σε ευπλοειδυχούς και σε ανευπλοειδικούς (Auer, Falkmer και Zetterberg, 99). Ευπλοειδικοί είναι οι όγκοι που τα κύτταρα τους έχουν κανονικό ποσό DNA ή το ποσό του DNA είναι ακέραιο πολλαπλάσιο του φυσιολογικού ποσού (τετραπλοειδικοί, οκταπλοειδικοί όγκοι). Ανευπλοειδικοί είναι οι όγκοι που τα κύτταρα τους έχουν ποσό DNA, που δεν αντιστοιχεί σε ακέραια πολλαπλάσια του κανονικού ποσού. Άλλη διάκριση των όγκων είναι σε διπλοειδικούς και μη διπλοειδικούς. Οι διπλοειδικοί είναι αυτοί των οποίων τα κύτταρα έχουν κανονικό ποσό DNA, ενώ όλοι οι άλλοι χαρακτηρίζονται ως μη διπλοειδικοί. Στη δεύτερη επομένως κατηγορία συμπεριλαμβάνονται και όγκοι με ποσό DNA ακέραιο πολλαπλάσιο του κανονικού ποσού, όπως είναι οι τετραπλοειδικοί, οκταπλοειδικοί κ.ο.κ. (Viehl, Magdelenat, Remvikos και συν., 99). Τέλος, ο όρος πολυπλοειδία, όταν αναφέρεται στα νεοπλάσματα, υποδηλώνει την ύπαρξη περισσότερων του ενός μη διπλοειδικών κυτταρικών πληθυσμών, δηλ. με κύτταρα που έχουν δείκτη DNA διαφορετικό της μονάδας (Viehl, Magdelenat, Remvikos και συν., 99). Η πολυπλοειδία στην περίπτωση αυτή είναι αποτέλεσμα της ετερογένειας, που παρατηρείται αρκετά συχνά στους διαφόρους όγκους. 2. Πλοειδικότητα του DNA και καρκίνος της ουροδόχου κύστεως Το καρκίνωμα της ουροδόχου κύστεως είναι ένα νεόπλασμα με ποικίλη βιολογική συμπεριφορά, του οποίου η θεραπευτική αντιμετώπιση ποικίλλει, ανάλογα με το στάδιο της νόσου, από την πιο συντηρητική, που είναι η διουρηθρική αφαίρεση του όγκου, μέχρι και τη ριζική κυστεκτομή (Raghavan και συν., 990, Baak, Blomjous και Tosi, 99). Η πρόγνωση επομένως *και η επιλογή της κατάλληλης θεραπείας σε κάθε περίπτωση πρέπει να στηρίζεται στην ακριβή εκτίμηση της επέκτασης και του βαθμού κακοήθειας του όγκου.

28 Για πολλά χρόνια τα κυρία προγνωστικά κριτήρια ήταν το στάδιο και ο βαθμός διαφοροποίησης του όγκου. Συχνά όμως οι όγκοι, ακόμα και όταν είναι του ίδιου σταδίου και του ίδιου βαθμού διαφοροποίησης, παρουσιάζουν διάφορες ως προς τη βιολογική τους συμπεριφορά. Αυτό φαίνεται από το γεγονός ότι σε πολλούς όγκους η εξέλιξη μετά τη θεραπεία δεν είναι αυτή που αναμένεται με βάση τα αρχικά τους χαρακτηριστικά. Παράδειγμα είναι οι επιφανειακοί όγκοι της κύστεως, οι μισοί από τους οποίους παρουσιάζουν μετά την πλήρη αφαίρεση τους καλή εξέλιξη, ενώ οι άλλοι μισοί, παρόλο ότι ανήκουν στην ίδια κατηγορία, εμφανίζουν υποτροπές (Weinstein, 979, Heney και συν., 983, Raghavan και συν., 990, Baak, Blomjous και Tosi, 99). Ένας επί πλέον λόγος είναι ότι η εκτίμηση του κλινυχού σταδίου δεν θεωρείται απόλυτα ακριβής, η δε εξέταση του βαθμού διαφοροποίησης είναι σε μεγάλο βαθμό υποκειμενική, με αποτέλεσμα να υπάρχουν συχνά εκτιμήσεις που διαφέρουν από εξεταστή σε εξεταστή. Αυτό καταδείχτηκε σε μία σειρά από μελέτες, στις οποίες βρέθηκαν σημαντυχές διαφορές μεταξύ πεπειραμένων εξεταστών ή ακόμα και στον ίδιο εξεταστή στην εκτίμηση του ίδιου δείγματος (Baak, Langley, Talerman και Delameres, 987, Ooms, Anderson και Alons, 983, Sherman, Koss και Adams, 984, Robertson και συν., 990, Stephenson, Zahniser, Wong και Hutchinson, 99). Από τα πιο πάνω συνάγεται ότι η πρόγνωση, όταν στηρίζεται μόνο σε παθολογοανατομικά κριτήρια, δεν είναι πάντα ακριβής. Αυτός ήταν και ο κύριος λόγος, για τον οποίο η έρευνα στράφηκε στη μελέτη άλλων παραμέτρων, που θα μπορούσαν να αποτελέσουν ακριβέστερα προγνωστικά κριτήρια. Από τις διάφορες παραμέτρους που έχουν μελετηθεί είναι η έκφραση των αντιγόνων των ομάδων αίματος στην επιφάνεια των καρκινυίών κυττάρων (Decenzo, Howard και Irish, 975), η παρουσία του Τ-αντιγόνου στα καρκινικά κύτταρα (Coon, Weistein και Summers, 982), τα μορφομετρικά χαρακτηρισηκά των καρκινικών κυττάρων (Ooms, Anderson και Alons, 983) και η πλοειδικότητα του DNA των καρκινικών κυττάρων. Η πλοειδικότητα του DNA στον καρκίνο της κύστεως άρχισε να μελετάται το 966 από τους Tavares και συν. Οι πρώτες ωστόσο προσπάθειες μέτρησης του DNA, που έγιναν σε ούρα που συλλέγονται με την ούρηση, δεν είχαν ικανοποιητικά αποτελέσματα λόγω της μικρής κυτταρικότητας των δειγμάτων, αλλά και λόγω του ότι στα ούρα τα νεοπλασματικά κύτταρα γρήγορα εκφυλίζονται και αλλοιώνονται (Melamed, 984). Στη συνέχεια σε διάφορες μελέτες διαπιστώθηκε ότι η πλοειδικότητα 2

29 των όγκων εμφανίζει συσχέτιση με το βαθμό διαφοροποίησης και με τη μορφολογική ταξινόμηση του όγκου. Τα καρκινώματα με grade Ι είναι συνήθως διπλοειδικά, αυτά με grade III είναι κυρίως ανευπλοειδικά και αυτά με grade II είναι τα μισά διπλοειδυχά και τα μισά ανευπλοειδυχά (Gustafson, Tribukait και Esposti, 982, Chin, Pontes και Frankfurt, 985). Σε μία εργασία των Shaaban και συν. (990) οι ανευπλοειδυχοί όγκοι βρέθηκαν να δίνουν σε πολύ μεγαλύτερο ποσοστό (34%) λεμφαδενυχές μεταστάσεις σε σχέση με τους διπλοειδικούς (2%). Έχει βρεθεί επίσης ότι η πλοειδυχότητα του όγκου έχει σχέση και με την επιβίωση των ασθενών. Η 5ετής επιβίωση στους όγκους με διπλοειδυ^ό DNA φθάνει το 9%, με τετραπλοειδυχό DNA το 83%, με ανευπλοειδυίό DNA το 59% και με πολυπλοειδικό DNA το 30% (Tribukait, 987, de Vita, Forte, Maggi και συν., 99). Όσον αφορά τους θηλωματώδεις όγκους, αυτοί παρουσιάζουν ανευπλοειδία στις μισές περιπτώσεις, ενώ οι μη θηλωματώδεις όγκοι, οι διηθητικοί και το καρκίνωμα in situ είναι ανευπλοειδυ^οί σε μεγάλο ποσοστό (Koss, Wersto, Simmons και συν., 989, de Vita, Forte, Maggi και συν., 99). Ειδικά τα καρκινώματα in situ παρουσιάζουν ανευπλοειδία στις 90-00% των περιπτώσεων (Gustafson, Tribukait και Esposti, 982, Melamed και Klein, 984). Σε εργασίες που έγιναν από τους Song και συν., (990) για το αδενοκαρκίνωμα της κύστεως δεν βρέθηκε καμία σχέση της πλοειδικότητας με το βαθμό διαφοροποίησης του όγκου, ενώ αντίθετα βρέθηκε στενή συσχέτιση της πλοειδυχότητας με την τάση επέκτασης του όγκου και με την επιβίωση των ασθενών. Αντίθετα, στο πλακώδες καρκίνωμα της κύστεως βρέθηκε από τους Saaban και συν. (990) στενή συσχέτιση της πλοειδικότητας με το βαθμό διαφοροποίησης, όχι όμως και με το στάδιο της νόσου. Από την όλη μελέτη της πλοειδυχότητας του DNA στο καρκίνο της κύστεως βγαίνει το συμπέρασμα ότι η παράμετρος αυτή μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως δείκτης του βαθμού κακοήθειας του όγκου, πάντοτε όμως σε συνδυασμό με το βαθμό διαφοροποίησης και με το στάδιο της νόσου. Σημαντική επίσης βοήθεια μπορεί να προσφέρει η εξέταση στην πρώτη διάγνωση του καρκίνου της κύστεως. Καλά τέλος αποτελέσματα φαίνεται πως έχει η μέθοδος στην παρακουλούθηση του θεραπευτικού αποτελέσματος και την ανίχνευση των υποτροπών, ενώ δεν προσφέρεται για τη μαζική εξέταση ομάδων ατόμων υψηλού κινδύνου, λόγω της ανάγκης του καθετηριασμού και της έκπλυσης της κύστεως για τη λήψη του δείγματος (Γουλανδρής, Καρακίτσος και Γεωργουλάκης, 994). 3

30 3. Κυτταρικός κύκλος Η μέτρηση της περιεκτικότητας των κυττάρων σε DNA με διάφορες τεχνικές επιτρέπει τη μελέτη των διαφόρων φάσεων του κυτταρικού κύκλου και κατά επέκταση του ρυθμού ανάπτυξης του όγκου. Όπως είναι γνωστό, αμέσως μετά τη συμπλήρωση της μίτωσης (φάση M=Mitosis) τα θυγατρικά κύτταρα εισέρχονται στη φάση Gl (θερ=χάσμα), η διάρκεια της οποίας ποικίλλει ανάλογα με το είδος του ιστού. Σε αυτή τη φάση και όταν δεν υπάρχουν σοβαρές κυτταρογενετικές ανωμαλίες, το φυσιολογυχό σωματικό κύτταρο του θηλασακού περιέχει διπλοειδυχό αριθμό χρωμοσωμάτων, επομένως διπλοειδή ποσότητα DNA (2n). Η είσοδος στη φάση Gl σημαίνει ότι το κύτταρο εισέρχεται στο μιτωτικό κύκλο και σε κάποια χρονική στιγμή θα προχωρήσει στην παραγωγή DNA. Στην αντίθετη περίπτωση, που το κύτταρο δεν θα προχωρήσει στη σύνθεση του DNA, θα εισέλθει στη φάση GO ή αλλιώς φάση ηρεμίας, κατά την οποία τα κύτταρα δεν πολλαπλασιάζονται, μπορούν όμως ανά πάσα στιγμή να εισέλθουν στον κυτταρικό κύκλο και να διαιρεθούν ξανά. Μετά τη φάση Gl το κύτταρο θα εισέλθει στη φάση σύνθεσης ή φάση S (S=synthesis), η οποία στα θηλαστικά διαρκεί από 2 έως 24 περίπου ώρες και κατά την οποία διπλασιάζεται το γενετικό υλικό, δηλαδή το DNA από 2η γίνεται 4η. Όταν ο αριθμός των χρωμοσωμάτων διπλασιαστεί η σύνθεση του DNA μειώνεται σημαντικά και το κύτταρο μπαίνει σε ένα δεύτερο χάσμα που λέγεται φάση G2, η οποία χαρακτηρίζεται μορφολογικά από τη μετάφαση και διαρκεί περίπου μία ώρα. Η συνολική διάρκεια του κύκλου ποικίλλει από 2 έως 4 ημέρες. Οι φάσεις Gl και G2 καλούνται και μεσόφαση (Τζαννίνης, 993). Οι διάφορες φάσεις του κυτταρικού κύκλου φαίνονται στο Σχήμα. Από τις διάφορες φάσεις του κύκλου ιδιαίτερη σημασία έχει η φάση της σύνθεσης (φάση S), στην οποία παράγεται το μέγιστο ποσό DNA και η οποία θεωρείται ότι αντανακλά την πολλαπλασιαστική δραστηριότητα των κυττάρων του όγκου. Σε ορισμένα νεοπλάσματα η δραστηριότητα αυτή είναι ανάλογη του βαθμού κακοήθειας των κυττάρων (Meyer, 982). 3. Κυτταρικός κύκλος και δείκτες πολλαπλασιασμού των κυττάρων Εκτός από την πλοειδικότητα του DNA, αρκετοί δείκτες έχουν εφαρμοστεί για να προσδιορίσουν τις διάφορες φάσεις του κυτταρικού κύκλου και να τις συσχετίσουν με τη βιολογική συμπεριφορά των όγκων. 4

31 Σχήμα. Σχηματική παράσταση του κυτταρικού κύκλου Περιληπτικά οι δείκτες αυτοί αναφέρονται παρακάτω: Αριθμός μιτώσεων: Είναι ίσως ο πιο εύκολος και ευρέως χρησιμοποιούμενος δείκτης. Εκφράζεται ως ο αριθμός μιτώσεων ανά 0 οπτικά πεδία. Αν και χρησιμοποιείται από παλιά από τους παθολογοανατόμους ως διαγνωστικός και προγνωσακός δείκτης για τη μελέτη των νεοπλασιών, η αξία του ως δείκτη του ρυθμού πολλαπλασιασμού είναι υπό αμφισβήτηση. Στους όγκους μαλακών μορίων της μήτρας οι Bums και συν. το 979 παρατήρησαν μία στενή συσχέτιση μεταξύ αριθμού μιτώσεων και επιθετυχής συμπεριφοράς του όγκου και παράλληλα τόνισαν το πρόβλημα της ευρείας διακύμανσης των αποτελεσμάτων μεταξύ των παρατηρητών. Τέτοιες ευρείες διακυμάνσεις είχαν αναφερθεί νωρίτερα και από τον Siverberg (976), ο οποίος είχε εκφράσει τις αμφιβολίες του ως προς την αξία του αριθμού των μιτώσεων ως δείκτη κακοήθειας. Το γεγονός ότι η μέτρηση του αριθμού των μιτώσεων δεν μπορεί να αναπαραχθεί πιστά από διαφορετικούς παρατηρητές και ότι δεν αποτελεί ανεξάρτητο δείκτη του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, την καθιστά ολοένα και πιο δύσχρηστη στην κλινική πράξη με αποτέλεσμα να χάνει έδαφος μπροστά σε καινούργιες και πιο εξειδυχευμένες μεθόδους. Τριτιωμένη θομιδίνη: Χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά στη μελέτη υλικού από μαστό το 96 από τους Johnson και Bond (96), οι οποίοι βρήκαν ότι η ενσωμάτωση τριτιωμένης θυμιδίνης είναι αυξημένη στα 5

32 ινοαδενώματα. Από τότε, η προσοχή έχει στραφεί στο ρόλο της ενσωμάτωσης της τριτιωμένης θυμιδίνης (TLI, Thymidine labeling index) ως προγνωστικού δείκτη στον καρκίνο του μαστού. Στη μέθοδο αυτή, όπου χρησιμοποιείται τριτιωμένη θυμιδίνη, υπολογίζεται το ποσοστό των κυττάρων που βρίσκονται στη φάση S του κυτταρυχού κύκλου. Βασίζεται σε in vitro μέτρηση, κατά την οποία επωάζεται πρόσφατος καρκινυχός ιστός σε ένα μέσο που περιέχει τριτιωμένη θυμιδίνη. Στη συνέχεια γίνεται αυτοραδιογραφία και τα σεσημασμένα κύτταρα μετρώνται και συγκρίνονται με τα μη σεσημασμένα της μεσόφασης. Έτσι υπολογίζεται ο δείκτης TLI. Εκτός από τον καρκίνο του μαστού, ο TLI έχει χρησιμοποιηθεί για την εκτίμηση της βιολογυχής συμπεριφοράς των πλασμακυτταρικών δυσκρασιών. Σε συνδυασμό με τη συνολική μάζα των πλασματοκυττάρων ο TLI έχει χρησιμοποιηθεί ως παράμετρος αναγνώρισης των ασθενών με πολλαπλούν μυέλωμα που χρειάζονται θεραπευτική αγωγή (Boccadoro Massaia, Dianzani και συν., 987). Στα non-hodgkin λεμφώματα χαμηλά επίπεδα TLI έχουν συσχετιστεί με χαμηλό βαθμό κακοήθειας και καλή πρόγνωση (Del Bino, Silvestrini, Costa και συν., 986). Ωστόσο η χρήση του TLI ως δείκτη πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων έχει αρκετούς περιορισμούς, γιατί με τον TLI εκτιμάται ο αριθμός των κυττάρων που βρίσκονται στη φάση S, αλλά όχι και η συνολυαί διάρκεια της φάσης, με αποτέλεσμα ένας όγκος να έχει χαμηλό ρυθμό πολλαπλασιασμού και υψηλό TLI (Holten, Croton, Leinster και συν., 986). Επειδή η μέτρηση του TLI απαιτεί νωπό καρκινικό ιστό, είναι χρονοβόρα και απαιτεί αυτοραδιογραφία δεν είναι μία διαθέσιμη τεχνυ^ή ρουτίνας για το εργαστήριο. Βρωμοδεοξυουριδΐνη (BrdU): Η βρωμοδεοξυουριδίνη (BrdU) είναι ένα ανάλογο της θυμιδίνης, η οποία έχει τη δυνατότητα να ενσωματώνεται αυτόματα στα κύτταρα κατά τη φάση της σύνθεσης του DNA. Πρόσφατα έχουν παραχθεί διάφορα μονοκλωνικά αντισώματα έναντι της BrdU (Gratzner, 982). Κύτταρα που ενσωματώνουν τη BrdU, είτε in vivo είτε in vitro, αντιδρούν με το αντίσωμα που συνδέεται με φθορίζουσα ουσία. Έτσι με τη μέτρηση του εκπεμπόμενου φθορισμού υπολογίζεται το ποσοστό των κυττάρων που βρίσκονται στη φάση της σύνθεσης. Συγκεκριμένα, τα χρωσμένα κύτταρα μετρούνται υπό το μυχροσκόπιο και το αποτέλεσμα εκφράζεται ως ποσοστό επί 500 ή 000 καρκινυαόν κυττάρων. Η μέτρηση του φθορισμού μπορεί να γίνει και με την κυτταρομετρία ροής (Schutte, Reynderss, van Assche και συν., 987). 6

33 Σε μία προκαταρκτική μελέτη στον καρκίνο του στομάχου βρέθηκε ότι ο δείκτης BrdU στο στάδιο Ι ήταν χαμηλότερος από ότι στα στάδια II, III και IV (Kikuyama, Kubota, Watanabe και συν., 988). Η μέθοδος BrdU έχει σαφή πλεονεκτήματα έναντι του TLI, γιατί αποφεύγεται η έκθεση σε ραδιοϊσότοπα, απαιτεί λιγότερο χρόνο και γενικά μπορεί να χρησιμοποιηθεί ευκολότερα στην κλινυχή διαγνωστική ρουτίνα. Πρόσφατα έχει βρεθεί μία τεχνική για την ταυτόχρονη μέτρηση της ενσωμάτωσης της τριτιωμένης θυμιδίνης και της βρωμοδεοξυουριδίνης (Hume, 990). Παρόλο που η συσχέτιση αυτών των δύο δεικτών με το στάδιο και το βαθμό διαφοροποίησης των όγκων έχει πολλές φορές αποδειχτεί, σήμερα οι δύο αυτοί παλαιοί αλλά αξιόπιστοι δείκτες χρησιμοποιούνται ως σημείο αναφοράς για τους νεότερους δείκτες (Bleiberg, Morrei, Galand και συν., 993, Cohen, Waldman, Carroll και συν., 993). Ki-67: To Ki-67 είναι ένα IgG μονοκλωνυχό αντίσωμα από ποντικό, το οποίο παρήχθη το 983 από τους Gerdes και συν. Το επονόμασαν Ki-67 από τη σύνθεση της λέξης Kiel και του αριθμού 67, που αντιπροσωπεύουν τον τόπο παραγωγής και τον αριθμό του πηγαδιού όπου αναπτύχθηκε ο κλώνος που παρήγαγε το αντίσωμα πάνω στη καλλιέργεια των κυττάρων. Το αντίσωμα αυτό αναγνωρίζει ένα πυρηνικό αντιγόνο που βρίσκεται μόνο σε κύτταρα στη φάση του πολλαπλασιασμού. Η ακριβής φύση του αντιγόνου δεν είναι γνωστή, αλλά φαίνεται ότι εκφράζεται μόνο σε ορισμένες φάσεις του κυτταρικού κύκλου. Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι το αντιγόνο αυτό είναι στοιχείο της θεμέλιας πυρηνυχής ουσίας (Verheijen, Kuijpers, Schlingeman και συν., 988). To Ki-67 μπορεί να μετρηθεί σε τομές κρυοστάτη (νωπός ιστός) με ανοσοϊστοχημικές μεθόδους. Ο αριθμός των κυττάρων που αντιδρά με το μονοκλωνικό αντίσωμα Ki-67 αντιπροσωπεύει τον αριθμό των κυττάρων που βρίσκονται εντός του κυτταρικού κύκλου εκείνη τη δεδομένη στιγμή, δηλαδή το κλάσμα ανάπτυξης. Τα αποτέλεσμα εκφράζεται ως η σχέση του αριθμού των θετικών κυττάρων προς τον συνολικό αριθμό των καρκινικών κυττάρων. Προκαταρκτικές μελέτες έχουν δείξει μία θετική συσχέτιση μεταξύ θετικότητας στο Ki-67 και του βαθμού κακοήθειας στα non-hodgkin λεμφώματα (Hall, Richards, Gregory και συν., 986). Αντίθετα οι Gerdes και συν., στον καρκίνο του μαστού, δεν βρήκαν καλή συσχέτιση μεταξύ του Ki-67 και του ιστολογικού βαθμού κακοήθειας (Gerdes, Lelle, Pickartz και συν., 986). Επίσης σε μία μελέτη 08 ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου η ομάδα του Sheperd δεν βρήκε συσχέτιση μεταξύ του Ki-67 και των 7

34 άλλων γνωστών προγνωστικών παραγόντων περιλαμβανόμενης της σταδιοποίησης κατά Dukes (Sheperd, Richman και England, 988). Πρόσφατα έχουν βρεθεί νέα αντισώματα που αντιδρούν με ιστούς μονιμοποιημένους σε φορμόλη. Οι Cattoretti και συν. παρήγαγαν τρία καινούργια αντισώματα, τα ΜΙΒ -3, που είναι όλα ανάλογα προς το Ki- 67 (Cattoretti, Becker, Key και συν., 99). To Ki-SI είναι επίσης ένα καινούργιο μονοκλωνυοό αντίσωμα που αντιδρά με ένα πυρηνικό αντιγόνο μοριακού βάρους 60kD και που εκφράζεται σε όλες τις φάσεις του κυτταρικού κύκλου εκτός της GO φάσης, δηλ. στις ίδιες φάσεις στις οποίες εκφράζεται το Κί-67 (Kreipe, Heidebrecht, Hansen και συν., 993). Από πρακτικής άποψης, βασυχό μειονέκτημα της μεθόδου Κΐ-67 είναι η ανάγκη χρησιμοποίησης μόνο νωπού υλικού, καθώς και ότι η αντίδραση πρέπει να γίνεται αμέσως μετά την τομή του κρυοστάτη, αφού γίνει βραχεία μονιμοποίηση σε ακετόνη. Παρά τις αναφερθείσες αντιξοότητες και τα απογοητευτικά αποτελέσματα των μέχρι σήμερα μελετών, χρειάζεται ακόμα και άλλη διερεύνηση της αξίας του Κΐ-67 ως προγνωσηκού δείκτη και ακόμα περισσότερη διερεύνηση των καινούργιων αντισωμάτων (Shiina, Igawa, και Nagami, 996). AgNORs: Μία άλλη μέθοδος που έχει χρησιμοποιηθεί για την εκτίμηση του δείκτη πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων είναι αυτή της χρώσης με άργυρο, η οποία αναδεικνύει μη ιστονυχές πρωτεΐνες που σχετίζονται με περιοχές οργάνωσης του πυρηνίου (NORs). Ένα πλεονέκτημα της τεχνικής των AgNORs είναι ότι η μέθοδος, αν και χρονοβόρα, είναι σχετικά απλή σε σχέση με άλλες πιο πολύπλοκες τεχνικές και δεν απαιτεί δαπανηρό εξοπλισμό. Από τη σύγκριση του αριθμού AgNORs με άλλους δείκτες (DNA, Ki-67 κλπ.) έχει φανεί ότι ο αριθμός τους είναι τουλάχιστον ένας δείκτης της πολλαπλασιαστικής ικανότητας των κυττάρων. Βλάβες με μεγάλο ποσοστό κυττάρων στη φάση της σύνθεσης ή υψηλό δείκτη Ki-67 τείνουν να έχουν υψηλότερο αριθμό AgNORs (Dervan, Gilmartin, Loftus και συν., 989). Σήμερα, αν και πολλοί ερευνητές πιστεύουν ότι η αύξηση του αριθμού και του μεγέθους των AgNORs σχετίζεται με το βαθμό κακοήθειας διαφόρων νεοπλασμάτων, το θέμα της σημασίας και της διαγνωστικής αξίας της έκφρασης των AgNORs εξακουλουθεί να παραμένει ανοικτό (Toikanen και Joensuu, 993). Κυκλίνες (Cyclins): Οι κυκλίνες είναι μία ομάδα πυρηνυχών πρωτεϊνών που σχετίζεται με τη φάση S του κυτταρικού κύκλου και έχει χρησιμοποιηθεί με καλά αποτελέσματα, κυρίως σε τομές παραφίνης, για την 8

35 αναζήτηση των κυττάρων που βρίσκονται στη φάση αυτή (Cellis, Madsen, Nielsen και συν., 986, Georgoulakis, Karakitsos, Kyrkou και συν., 993, Karakitsos, Georgoulakis, Tambakis και συν., 993). Οι κυκλίνες διακρίνονται σε κυκλίνη Α και κυκλίνη Β. Η κυκλίνη Α αυξάνεται στη Gl φάση, πρώτο σημείο ελέγχου του κυτταρυχού κύκλου, και εξαφανίζεται πριν τη μετάφαση. Η κυκλίνη Β αυξάνεται στο τέλος της φάσης S και της φάσης G2, δεύτερο σημείο ελέγχου του κυτταρικού κύκλου, στην αρχή της μίτωσης. Το PCNA/κϋκλίνη (πυρηνικό αντιγόνο πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων) ανήκει στην κατηγορία των κυκλινών (Hall, Levison, Weeds και συν., 990). Η πρωτείνη αυτή ταυτοποιήθηκε για πρώτη φορά το 978 με τη μέθοδο του ανοσοφθορισμού σε διεργεμένα λεμφοκύτταρα (Miyaki, Frizler και Tan, 978) και συνδέθηκε άμεσα με τον κυτταρυχό κύκλο και πιο συγκεκριμένα με το τέλος της φάσης Gl και με τη φάση S της σύνθεσης του DNA. Σε επόμενο κεφάλαιο περιγράφονται με λεπτομέρειες όλα τα σχετικά με το PCNA/κυκλίνη, δεδομένου ότι αποτελεί ένα από τα αντυχείμενα αυτής της διατριβής. ρ 05: Το ρ 05 είναι ένα άλλο πυρηνικό αντιγόνο, το οποίο αυξάνει την έκφραση του κατά τη διάρκεια του κυτταρυχού κύκλου. Έχει χρησιμοποιηθεί στην εκτίμηση της ικανότητας πολλαπλασιασμού των νεοπλασματικών κυττάρων και έχει βρεθεί να συσχετίζεται με τον αριθμό των κυττάρων που βρίσκονται στις φάσεις S και G2M. Το ρ 05 είναι ανθεκτικό στη μονιμοποίηση και μπορεί να ανιχνευθεί και σε δείγματα παραφίνης (Clevenger, Bauer και Epstein, 985, Clevenger, Epstein και Bauer, 987). Επίσης ορισμένες πρωτείνες, όπως η DNA-πολυμεράση α και η τρανσφερρίνη, εκφράζονται σε αυξημένα ποσά στα κύτταρα που πολλαπλασιάζονται και θα μπορούσαν και αυτές να χρησιμοποιηθούν ως δείκτες πολλαπλασιασμού των κυττάρων (Danova, Riccardi, Mazzini και συν., 990). Τέλος δύο άλλες πρωτείνες που έχουν μελετηθεί είναι η στατίνη και η τερμίνη. Η πρωτείνη στατίνη (57kD) βρέθηκε στα καλοήθη νεοπλάσματα του εγκεφάλου σε ποσοστό 22% - 96% και στα κακοήθη μόνο σε ίσο ή λιγότερο του 2% των κυττάρων (Tsanadis, Brera, Gately και συν., 99), ενώ η πρωτείνη τερμίνη ανευρίσκετε μόνο στα κύτταρα εν ηρεμία (Wang και Tomaszewski, 99). Η σχέση των παραπάνω δεικτών με τις διάφορες φάσεις του κυτταρυχού κύκλου φαίνεται στο Σχ. 2. 9

36 ΚΥΚΑίΝΗΒ ΚΥΚ VINH Α TP Αϊ ίσφερρινη ρ05 PCNA Kì 67, ΜΙΒ -3, fcìsi DNA χολυμεράοη ETATINH, τ ΡΜΙΝΙΝΗ GO Gl S G2 Μ Σχήμα 2. Σχηματική παράσταση της σχέσης του PCNA/κυκλίνη με τις άλλες πρωτείνες πολλαπλασιασμού στις διάφορες φάσεις του κυτταρικού κύκλου. 20

37 4. Πυρηνικό αντιγόνο πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων (PCNA) 4. Ιστορική Ανασκόπηση To PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) πρωτοπεριγράφτηκε το 978. Ο Miyachi και οι συνεργάτες του αναγνώρισαν ένα αυτοαντίσωμα, στον ορό ασθενών με ερυθηματώδη λύκο, που αντιδρούσε με πυρηνικά(ο) αντιγόνα(ο) πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων σε φυσιολογικούς αλλά και νεοπλασματικούς ιστούς (Miyachi, Fritzler και Tan, 978). Δύο χρόνια αργότερα, μία παρόμοια πρωτείνη αναγνωρίστηκε και ονομάστηκε κυκλίνη. Στη συνέχεια, το 984, ο Mathews και οι συνεργάτες του βρήκαν ότι το PCNA και η κυκλίνη είναι ταυτόσημα μόρια (Mathews, Bernstein, Franza και συν., 984). 4.2 Ο ρόλος του PCNA/κυκλίνη στον κυτταρικό κύκλο Το PCNA/κυκλίνη είναι μία όξινη πυρηνική πρωτείνη με μοριακό βάρος KD, η οποία λειτουργεί ως επικουρική πρωτείνη προς τη DNA πολυμεράση δ στη σύνθεση του DNA (Tan, Castillo και Downey, 986, Bravo και Macdonald-Bravo, 987, Prelich, Tan, Kostura και συν., 987, Fairman 990). Μπορεί επίσης να παίζει ρόλο και στη μη προγραμματισμένη σύνθεση του DNA (Ogata, Kurki, Celis και συν., 987, Suzuka, Daidoji, Matsuoka και συν., 989). Μελέτες που έγιναν με ανοσοφθορισμό πάνω σε καλλιεργήματα κυττάρων έδειξαν ότι το PCNA/κυκλίνη είναι ένα αντιγόνο στενά συνδεδεμένο με τον κυτταρικό κύκλο (Celis και Celis, 985). Αυτές οι μελέτες έχουν δείξει ότι υπάρχουν 2 πληθυσμοί PCNA/κυκλίνης κατά τη διάρκεια της φάσης S. Στον πρώτο πληθυσμό το πυρηνοπλασματικό PCNA/κυκλίνη ανευρίσκετε σε χαμηλά επίπεδα στα κύτταρα εν ηρεμία, τα οποία ωστόσο είναι ικανά για κυτταρική διαίρεση. Αντίθετα δεν ανευρίσκετε στα κύτταρα που έχουν μονιμοποιηθεί σε οργανικούς διαλύτες. Ο δεύτερος πληθυσμός του PCNA/κυκλίνη είναι συνδεδεμένος με τις μονάδες αναδιπλασιασμού του DNA και δεν μπορεί να εκχυλιστεί με οργανικούς διαλύτες (Hall, Levison και Wright, 992). Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι η ολική αύξηση του PCNA/κυκλίνη κατά τον κυτταρικό κύκλο δεν είναι περισσότερη από διπλάσια ή τριπλάσια της φυσιολογικής τιμής. Κυρίως αυξάνεται το ποσό του PCNA/κυκλίνη που είναι συνδεδεμένο με τις μονάδες αναδιπλασιασμού του DNA. Έχει δειχτεί 2

38 επίσης ότι η ποσότητα του PCNA/κυκλίνη στον πυρήνα του κυττάρου κατά τον κυτταρυχό κύκλο υπερβαίνει αυτή που χρειάζεται για τη σύνθεση του DNA (Morris και Mathews, 989). To PCNA/κυκλίνη έχει ημιπερίοδο ζωής περίπου 20 ώρες και ανευρίσκεται με ανοσολογικές μεθόδους ακόμη και στα κύτταρα που έχουν ολοκληρώσει τον κυτταρικό κύκλο. Ωστόσο, δεν ανιχνεύεται με τις πιο πάνω μεθόδους σε κύτταρα που βρίσκονται σε ηρεμία (Hall, Levison και Wright, 992). Το γονίδιο που κωδυχοποιεί το PCNA/κυκλίνη μεταγράφεται στα κύτταρα που βρίσκονται σε ηρεμία και σε αυτά που πολλαπλασιάζονται, αλλά το mrna του PCNA/κυκλίνη αυξάνεται μόνον στα δεύτερα (Chang, Ottavio, Travalli και συν., 990). Στα κύτταρα σε ηρεμία το mrna του PCNA/κυκλίνη είναι ασταθές και μόνον αν αφαιρεθεί μία παρεμβαλλόμενη αλληλουχία (intron 4) αυξάνεται η ποσότητα του PCNA/κυκλίνη (Ottavio, Chang, Rizzo και συν., 990). Επίσης έχει βρεθεί ότι αυξητικοί παράγοντες και κυρίως ο αιμοπεταλιακός αυξητικός παράγοντας (PDGF), αυξάνουν τη σταθερότητα του PCNA mrna και επιτρέπουν την αντιγραφή του PCNA/κυκλίνη. Η συσσώρευση του PCNA/κυκλίνη δεν είναι απαραίτητα εξαρτημένη από τη σύνθεση του DNA, αλλά αυξάνεται και παρουσία υδροξυουρίας, η οποία αναστέλλει τη σύνθεση του DNA (Bravo και Macdonald-Bravo, 984, 985). Γενικά, είναι γνωστό ότι το PCNA/κυκλίνη είναι σταθερό στη διάρκεια του κυτταρυχού κύκλου κατά τη μετάβαση ενός κυττάρου από την αύξηση μέχρι το στάδιο ηρεμίας. Η αύξηση του PCNA/κυκλίνη αρχίζει μόλις πριν, αλλά ανεξάρτητα, από τον αναδιπλασιασμό του DNA (van Dierendonck, Wijsman, Keijzer και συν., 99). Ο βαθμός σύνθεσης του PCNA/κυκλίνη είναι πολύ χαμηλός στα μέσα της Gl φάσης, αυξάνεται προς το τέλος της και φτάνει στο μέγιστο σημείο στα μέσα της S φάσης. Στη συνέχεια πέφτει αργά μέχρι την αρχική τιμή του, την οποία φτάνει κατά το τέλος της S φάσης (Bravo, Frank, Blundell και συν., 987). Η σχέση του PCNA/κυκλίνη με τις άλλες πρωτεΐνες πολλαπλασιασμού κατά τις διάφορες φάσεις του κυτταρικού κύκλου φαίνεται στο Σχ. 2. Το PCNA/κυκλίνη έχει μία περιοχή όμοια με τη θεωρούμενη DNAσυνδεόμενη περιοχή διαφόρων πρωτεϊνών. Διεγείρει την DNA-πολυμεράση δ, αλλά όχι την πολυμεράση a (Prelich, Tan, Kostura και συν., 987). Η επιδιόρθωση του DNA με την αφαίρεση νουκλεοτιδίου είναι η κύρια οδός η ακολοθούμενη από τα ευκαριωτικά κύτταρα για την απαλλαγή τους από καρκινογόνες ουσίες που προκύπτουν από μεταλλάξεις. Μετά την αφαίρεση 22

39 του νουκλεοτιδίου, η καινούργια ακολουθία του DNA πολυμερίζεται αποκλειστικά με τη DNA-πολυμεράση δ παρουσία του PCNA/κυκλίνη (Vasko, 994). Τέλος, το PCNA/κυκλίνη έχει διατηρηθεί φυλογενετυχά που αποδευχνύεται με την παρουσία του στα φυτά, στους ζυμομύκητες και στα ανώτερα θηλαστικά (Baserga, 99). 4.3 Μονοκλωνικά αντισώματα έναντι του PCNA/κυκλίνη Πρόσφατα, έχουν παραχθεί με μηχανική γενετική μονοκλωνυχά αντισώματα έναντι του PCNA/κυκλίνη. Το πρώτο μονοκλωνυχό αντίσωμα, το επονομαζόμενο 9Α2, είχε σημαντική ετερογένεια στα πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα σε διάφορες περιοχές του όγκου, αλλά μόνον όταν ο ιστός είχε μονιμοποιηθεί με μεθανόλη, και δεν λειτουργούσε σε ιστούς μονιμοποιηθέντας με φορμόλη (Garcia, Coltera και Gown, 989). Πριν 0 χρόνια οι Ogata και συν. (987) κατόρθωσαν να παράγουν και άλλα μονοκλωνικά αντισώματα έναντι του PCNA/κυκλίνη, ενώ πρόσφατα παρήχθη ένα νέο μονοκλωνυχό αντίσωμα, το PC 0. Έτσι έγινε δυνατή η μελέτη της ανοσοϊστοχημυχής έκφρασης του PCNA/κυκλίνη σε τομές παραφίνης, σε ένα ευρύ φάσμα από φυσιολογυχούς ιστούς (Hall, Levison, Woods και συν., 990) και σε νεοπλασματυχούς ιστούς, όπως σε λεμφώματα στομάχου (Woods, Handy, Hall και συν., 990), καρκινώματα μαστού (Robbins, delà Vega, Ogata και συν., 987, Chan, Frakes, Tan και συν., 983), αιμαγγειοπερυχυττώματα (Yu, Hall, Fletcher και συν., 990), και όγκους ωοθηκών (Nakopoulou, Janinis, Davaris και συν., 993). Η ανοσοϊστοχημική μελέτη της κινητικής των κυττάρων σε τομές παραφίνης με τη βοήθεια μονοκλωνικών αντισωμάτων έναντι του PCNA/κυκλίνη είναι σχετικά εύκολη μέθοδος, αλλά πρέπει να αξιολογηθεί με προσοχή, καθώς η σημασία του PCNA/κυκλίνη ως δείκτη πολλαπλασιασμού των κυττάρων, δεν έχει ακόμη πλήρως αξακριβωθεί. 4.4 PCNA/κυκλίνη και καρκίνος Διάφορες μελέτες έχουν δείξει τη συσχέτιση του PCNA/κυκλίνη με άλλους δείκτες πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Συγκεκριμένα, έχει βρεθεί γραμμυχή συσχέτιση μεταξύ του αριθμού των κυττάρων των θετικών ανοσοϊστοχημικά για το PCNA/κυκλίνη, του Ki-67 και της ενσωμάτωσης της θυμιδίνης στο DNA του πυρήνα (Bleiberg, Morrei, και Galant, 993, Cohen, Waldman, Carroll και συν., 993), αλλά και συσχέτιση μεταξύ της 23

40 έκφρασης του PCNA/κυκλίνη και του κλάσματος των κυττάρων στη φάση S, όπως αυτό προσδιορίζεται με την κυτταρομετρία ροής. Τέτοιες μελέτες έχουν γίνει σε λεμφώματα του γαστρεντερικου σωλήνα (Woods, Handy, Hall και συν., 990) και σε συμπαγείς όγκους, όπως αδενοκαρκινώματα και σαρκώματα διαφόρων οργάνων (Garcia, Coltera και Gown, 989). Στα λεμφώματα μάλιστα του γαστρεντερικου σωλήνα ο δείκτης (index) του PCNA/κυκλίνη συσχετίζεται με το βαθμό κακοήθειας και με την πρόγνωση του όγκου (Woods, Hall, Shepherd και συν., 99). Όσον αφορά τον καρκίνο της ουροδόχου κύστεως, η έκφραση του PCNA/κυκλίνη συσχετίζεται με το στάδιο και το βαθμό κακοήθειας του όγκου, την πλοειδικότητα του DNA, τη φάση S του κυτταρικού κύκλου, τον αριθμό των μιτώσεων του πυρήνα, την έκφραση των περιοχών οργάνωσης του πυρηνίου και με την πρόγνωση της νόσου (Liponen και Eskelinen, 992). Αντίθετα, στον καρκίνο του μαστού και στο αιμαγγειοπερικύτωμα δεν έχει βρεθεί συσχέτιση του PCNA/κυκλίνη με τη φάση S και την πρόγνωση αυτών των όγκων (Hall, Levison, Woods και συν., 990). Ακόμη, δεν βρέθηκε διαφορά στην έκφραση του PCNA/κυκλίνη σε καλοήθεις και κακοήθεις όγκους του παχέος εντέρου (Bleiberg, Morrei, και Galand, 993). Ο προσδιοριμός της έκφρασης του PCNA μπορεί να γίνει ανοσοϊστοχημυχά είτε με το κοινό μυχροσκόπιο ή με την ανάλυση εικόνας είτε με φθορίζουσες χρωστικές με την κυτταρομετρία ροής. Στην εργασία αυτή χρησιμοποιήθηκε η ανάλυση ευχόνας, η οποία περιγράφεται στο επόμενο κεφάλαιο. 24

41 S. Ανάλυση Εικόνας (Image analysis) 5. Ιστορική ανασκόπηση Η ανάλυση εικόνας είναι μία μέθοδος ποσοτικής εκτίμησης διαφόρων παραμέτρων και βασίζεται σε δύο ειδών μετρήσεις: τη μικρομορφομετρία και τη μικροφωτομετρία. Η μικρομορφομετρία αρχικά είχε σκοπό την εκτίμηση του μεγέθους, των επιφανειών και των σχημάτων των εξεταζόμενων σωματιδίων. Σήμερα τα αντικείμενα της μικρομορφομετρίας είναι η εξέταση της αρχιτεκτονικής του ιστού, του καρυότυπου και της δομής της χρωματίνης (Marchevsky και Bartels, 994). Η μικροφωτομετρία αναπτύχθηκε από την κυτταροχημεία και την ιστοχημεία. Η μυχροφωτομετρία χρησιμοποιεί ως κύριο μεταβλητό χαρακτηριστικό τη μέτρηση της οπτυχής πυκνότητας του πυρήνα (Wied, 966). Σήμερα, οι δύο τεχνικές, μικρομορφομετρία και μικροφωτομετρία, χρησιμοποιούνται μαζί. Ο Caspersson και οι συνεργάτες του, το 935, έδειξαν ότι τα καρκινικά κύτταρα των επιθηλιακών όγκων διαφέρουν από τα φυσιολογικά ως προς τις πρωτεΐνες και τα πυρηνυχά οξέα. Οι ίδιοι ερευνητές, το 936, κατασκεύασαν το πρώτο κυτταροφωτόμετρο, που λειτουργούσε με υπεριώδες φως και απέδωσαν στην παρουσία των πυρηνυχών οξέων την ικανότητα των κυττάρων να απορροφούν το υπεριώδες φως. Σε μία μεταγενέστερη μελέτη του, ο Caspersson (939) έκανε τις πρώτες εκτιμήσεις για την ολική περιεκτικότητα των πυρήνων σε πυρηνικά οξέα και στη συνέχεια συμπλήρωσε την έρευνα πάνω στη σχέση μεταξύ πυρηνικών οξέων, πρωτεϊνών και καρκινικών κυττάρων (Caspersson, 940, Caspersson, 94). Ένα μειονέκτημα στις κυτταροχημικές μελέτες ήταν η αδυναμία διαχωρισμού μεταξύ DNA και RNA με την απορρόφηση υπεριώδους φωτός. Η χρησιμοποίηση του ορατού φωτός στα κυτταροφωτόμετρα εξουδετέρωσε το μειονέκτημα αυτό και αποτέλεσε τη βάση για την καθιέρωση της μικροφωτομετρίας. Σε αυτό συνέβαλε σημαντικά η εφαρμογή της αντίδρασης Feulgen, η περιγραφή της οποίας ανήκει στους Feulgen και Rossenbeck (924). Αργότερα οι μελέτες του Richards και Atkin (953) με τεχνυχή Feulgen και κυτταροχημεία άνοιξαν το δρόμο για τη μελέτη των κακοηθών όγκων στον άνθρωπο. Σε αυτές τις μελέτες η κατανομή του DNA σε διαφόρους 25

42 καρκίνους, ιδιαίτερα στον καρκίνο της μήτρας, συσχετίστηκαν με κλινικά και θεραπευτικά δεδομένα. Μέχρι το 966 τα μικροφωτόμετρα μετρούσαν αναλογικά δεδομένα (αριθμητικά ισοδύναμα). Με τη βοήθεια του υπολογιστή το σήμα συγκεντρωνόταν ηλεκτρονικά και μετατρεπόταν σε μία τιμή για κάθε επιλεγμένο πυρήνα. Η μετατροπή του συστήματος από αναλογικό σε ψηφιακό (διακεκριμένοι ακέραιοι αριθμοί) και η παρουσίαση της οπτικής εικόνας ως μίας σειράς από pixels (σύντμηση του pictures element - στοιχείο εικόνας, μικροσκοπικό στοιχείο το οποίο σχηματίζει μία ψηφιακή εικόνα επί μίας οθόνης με τιμές οπτικής πυκνότητας) ήταν μία βασική αλλαγή, που σημάδεψε την αρχή της ψηφιακής μικροσκοπίας, όπως τη γνωρίζουμε σήμερα (Marchevsky και Bartels, 994). 5.2 Περιγραφή του οργάνου Ο αναλυτής εικόνας αποτελείται από 3 βασικά μέρη: από το μικροσκόπιο που είναι συνδεδεμένο με μία video-camera, από την οθόνη της τηλεόρασης και από τον ηλεκτρονυχό υπολογιστή. Η video-camera μεταβιβάζει την εικόνα του οπτικού πεδίου του μικροσκοπίου στην οθόνη της τηλεόρασης και στον υπολογιστή. Από τη μικροσκοπική εικόνα, που εμφανίζεται στην οθόνη της τηλεόρασης, ο εξεταστής μπορεί να επιλέξει ένα προς ένα όσα κύτταρα ή πυρήνες ενδιαφέρουν τη διάγνωση. Στη συνέχεια, η εικόνα κάθε επιλεγμένου κυττάρου ή πυρήνα αναλύεται σε πολλά ευδιάκριτα σημεία (pixels). Η video-camera, ανάλογα με την ένταση του φωτός που διέρχεται ή απορροφάται από κάθε σημείο, παράγει ένα αναλογικό σήμα, το οποίο μετατρέπεται από τον υπολογιστή σε ψηφιακή τιμή (Γουλανδρής, Καρακίτσος και Γεωργουλάκης, 994). Μετά τη διαδοχική μέτρηση όλων των σημείων αναπαράγεται η εικόνα του εξεταζόμενου κυττάρου ή πυρήνα (Stephenson, 990) και δίνεται μία τελική τιμή, που αντιστοιχεί στο άθροισμα των τιμών από όλα τα σημεία. Η τελική αυτή τιμή δίνει και το μέγεθος της μετρούμενης παραμέτρου για κάθε κύτταρο ή πυρήνα χωριστά. Το αποτέλεσμα των μετρήσεων εμφανίζεται στην οθόνη του υπολογιστή με το ιστόγραμμα, το οποίο δείχνει την κατανομή της συχνότητας των κυττάρων ή πυρήνων σε σχέση με τη μετρούμενη παράμετρο (Bibbo, Bartel, Dytch και συν., 985, Brugal, 989, Koss, 99, Vielh και Magdelenat, 990). 26

43 5.3 Πλοειδικότητα του DNA Η μέτρηση της περιεκτικότητας των κυττάρων σε DNA και η μελέτη του κυτταρικού κύκλου αποτελούν τις πρώτες και σημαντικότερες μέχρι σήμερα κλινικές εφαρμογές της ανάλυσης εικόνας. Η ανάλυση αυτή μπορεί να γίνει σε κυτταρολογικά παρασκευάσματα ή σε παρασκευάσματα από νωπό ιστό ή από τομές παραφίνης. Τα κυτταρολογία παρασκευάσματα μπορεί να προέρχονται από τις επιφάνειες των βλεννογόνων, από παρακέντηση με λεπτή βελόνα ή από διάφορα υγρά του σώματος. Μπορεί επίσης να προέρχονται από νωπά δείγματα δηλ. επιχρίσματα, εντυπώματα ή δείγματα από μικροφυγοκέντρηση και επιπλέον από παλιά επιχρίσματα, τα οποία αποχρωματίζονται, μονιμοποιούνται και χρωματίζονται με τη μέθοδο Feulgen (Stephenson, 990). Η παρακέντηση με λεπτή βελόνα χρησιμοποιείται κυρίως στη λήψη υλικού από συμπαγείς όγκους. Τα διάφορα βιολογικά υγρά, προκειμένου να εξεταστούν πρέπει προηγουμένως να υποβληθούν σε μικροφυγοκέντρηση. Τα δείγματα από τομές παραφίνης έχουν το πλεονέκτημα ότι επιτρέπουν την επιλογή της κατάλληλης περιοχής του όγκου για εξέταση (Schutte, Reynderss, Bosnian και συν., 985, Becker και Mikel, 990). Έχουν όμως το μειονέκτημα ότι η προετοιμασία τους είναι πολύωρη και παρουσιάζει ορισμένες δυσκολίες. Τα δείγματα πρέπει να έχουν ολόκληρους πυρήνες, που όμως πρέπει να είναι μεμονωμένοι και να μην αλληλεπικαλύπτονται. Δεδομένου ότι τα κύτταρα είναι τρισδιάστατες μορφές που απεικονίζονται σε δύο διαστάσεις στις ιστολογικές τομές, παράγοντες όπως η γωνία και το πάχος της τομής παίζουν ρόλο στις διαφορές που παρατηρούνται κατά τη μικροσκόπηση. Στην πραγματικότητα τόσο οι λεπτές όσο και οι παχύτερες τομές έχουν τα μειονεκτήματα τους. Στις λεπτές τομές (3-5 μπι) αποκόπτονται τμήματα των πυρήνων, οι οποίοι σε ποσοστό 25-90% χάνουν την ακεραιότητα τους. Η ακρίβεια των μετρήσεων με τις λεπτές τομές μειώνεται περισσότερο στους μεγάλους πυρήνες, γιατί όσο μεγαλύτερος είναι ο πυρήνας, τόσο μικρότερο είναι το τμήμα που μπορεί να μετρηθεί (Mikuz, Hoftstaedter και Delgado, 985). Στην περίπτωση αυτή απαιτείται η μέτρηση μεγάλου αριθμού πυρήνων, για να εξαχθεί η μέση τιμή με σχετυ^ή ακρίβεια (Stephenson, 990, Koss, 99, Fleege, van Diest και Baak, 99). Αντίθετα στις παχύτερες τομές μπορεί να υπάρχει αλληλεπικάλυψη των πυρήνων (Fu και Hall, 985). Το μειονέκτημα αυτό παρακάμπτεται με την επιλογή των μεμονω- 27

44 μένων πυρήνων, αλλά τότε η εξέταση δυσκολεύεται και καθυστερεί περισσότερο. Τέλος, τα κυτταρολογυχά παρασκευάσματα έχουν το πλεονέκτημα έναντι των τομών ότι περιλαμβάνουν ολόκληρους πυρήνες. Έχουν ωστόσο το μειονέκτημα ότι χάνεται η αρχιτεκτονυχή του ιστού, οπότε η αναγνώριση του τύπου των κυττάρων μπορεί να είναι δύσκολη. Είναι επίσης πιθανό, όπως συμβαίνει και στα άλλα είδη δειγμάτων, όταν υπάρχουν αθροίσματα κυττάρων, μέσα σε αυτά να κρύβονται άτυπα κύτταρα, που να μην αναγνωρίζονται (Stephenson, 990). Εκτός από το πάχος των τομών που αναφέρθηκε και άλλοι παράγοντες μπορεί να επηρεάσουν το αποτέλεσμα των μετρήσεων, όπως είναι το είδος του μονιμοποιητικού διαλύματος, το ph και η διάρκεια μονιμοποίησης. Η μονιμοποίηση προκαλεί συρρίκνωση του ιστού, ο βαθμός της οποίας εξαρτάται από το είδος της τεχνικής (Stephenson, 990, Becker και Mikel, 990). Στη μελέτη του Baak και των συνεργατών του (989) διαπιστώθηκε ότι οι μετρήσεις επηρεάζονται λιγότερο όταν το πάχος των τομών είναι 3-5 μηι και όταν το παρασκεύασμα μονιμοποιείται για 6-72 ώρες με φορμαλδεΰδη 4% σε ph 5-9. Πάντως ο CV στο ιστόγραμμα των δειγμάτων από τομές παραφίνης είναι υψηλότερος από ότι στα μη μονιμοποιημένα δείγματα, που δείχνει ότι η μέτρηση του DNA στα πρώτα είναι λιγότερο ακριβής (Schutte, Reynderss, Bosman και συν., 985). Η ποιότητα του δείγματος μπορεί να επηρεαστεί και από ορισμένους χειρισμούς κατά την προετοιμασία του. Η δίοδος του δείγματος μέσα από λεπτή βελόνα μπορεί να προκαλέσει εκλεκτική απώλεια ομάδων κυττάρων ή πυρήνων. Αυτό συμβαίνει στα πολυπύρηνα ή στα κύτταρα που βρίσκονται σε μίτωση, λόγω της αστάθειας ή και της έλλειψης της κυτταρικής ή πυρηνυχής μεμβράνης (Lopez, Cambier και Wheels, 98, Taylor, Titus- ErnstoffKaiStitely, 989). Η χρώση Feulgen που χρησιμοποιείται για την ανάλυση του DNA και η ανοσοϊστοχημική χρώση Ethyl Green με μονοκλωνικό αντίσωμα για το PCNA είναι στοιχειομετρική δηλ. το ποσό της συνδεόμενης χρωσπκής είναι ανάλογο προς το ποσό του DNA και PCNA αντίστοιχα. Απαραίτητη επίσης είναι η χρησιμοποίηση κυττάρων αναφοράς (controls), όπως είναι τα ηπατοκύτταρα του ποντικού με γνωστή περιεκτικότητα σε DNA, έναντι των οποίων γίνεται η μέτρηση του DNA των εξεταζόμενων κυττάρων (Wied, και συν., 989) και η χρησιμοποίηση γνωστών θετυχών και αρνητικών μαρτύρων για την αξιολόγηση των μετρήσεων του PCNA. 28

45 Εκτός από τα πιο πάνω, απαραίτητη προϋπόθεση για τη λήψη αξιόπιστων ιστογραμμάτων είναι η τήρηση της ίδιας διαδικασίας χρώσης σε όλα τα δείγματα, δεδομένου ότι η σύνθεση των διαλυμάτων, η καθαρότητα της χρωστικής ουσίας, το ph και η θερμοκρασία των διαλυμάτων μπορεί να έχουν σημαντική επίδραση στην ποιότητα της χρώσης. Ιδιαίτερη σημασία έχει επίσης ο αριθμός των μετρούμενων κυττάρων, ο οποίος πρέπει να είναι τουλάχιστον 300. Τα περισσότερα δείγματα ωστόσο, που περιλαμβάνονται στις δημοσιευμένες μελέτες, δεν ξεπερνούν τα 00 κύτταρα (Wied, Bartels, Bibbo και συν., 989). Το πρώτο βήμα στην εξέταση με την ανάλυση ευχόνας είναι η ρύθμιση του φωτισμού του οπτικού πεδίου, ώστε να ανταποκρίνεται στις προδιαγραφές που θέτει το όργανο. Η ρύθμιση του φωτισμού είναι ιδιαίτερης σημασίας, αν ληφθεί υπόψη ότι ο αναλυτής εικόνας μετράει την οπτική ένταση που δίνει κάθε σημείο του εξεταζόμενου αντικειμένου. Ακουλουθεί η εξέταση των πρωτύπων κυττάρων, περίπου 20-25, τα οποία υποβάλλονται στην ίδια προετοιμασία μαζί με τα εξεταζόμενα κύτταρα, ώστε να εξασφαλίζονται οι ίδιες συνθήκες χρώσης (Γουλανδρής, Καρακίτσος και Γεωργουλάκης, 994). Μετά τη μέτρηση των προτύπων κυττάρων τοποθετείται στο μικροσκόπιο το προς εξέταση δείγμα και από την εικόνα του οπτικού πεδίου που εμφανίζεται στην οθόνη της τηλεόρασης γίνεται η επιλογή των κυττάρων ή των πυρήνων για μέτρηση. Σε ορισμένους αναλυτές εικόνας, όπως είναι το CAS 00, η επιλογή των κυττάρων και η ταξινόμηση τους γίνεται είτε αυτόματα είτε από τον εξεταστή, αν και πολλές φορές παρουσιάζονται διαφορές στο αποτέλεσμα των μετρήσεων μεταξύ των δύο τρόπων. Η εντελώς αυτόματη επιλογή μπορεί να δώσει λανθασμένες τιμές, γιατί μπορεί να συμπεριλάβει στη μέτρηση και μη νεοπλασματικά κύτταρα (του στρώματος ή φλεγμονώδη), όπως και κύτταρα που αλληλεπικαλύπτονται ή που αντίθετα δεν εμφανίζονται ολόκληρα. Είναι επομένως προτιμότερη η επιλογή των κυττάρων από τον εξεταστή, που όμως σημαίνει απώλεια χρόνου (Herman, McGraw, Marder και συν., 987, Schneller, Eppich, Greenbaum και συν., 987). 5.4 Ποιοτικός Έλεγχος Η ερμηνεία του ιστογράμματος παρουσιάζει αρκετές δυσκολίες, γιατί δεν υπάρχει ενιαίος τρόπος εκτίμησης του, που οφείλεται στη δυσκολία του καθορισμού και του τρόπου υπολογισμού των ορίων του δείκτη DNA, μέσα στα οποία πρέπει να βρίσκεται ο διπλοειδικός κυτταρικός πληθυσμός. Τα 29

46 όρια αυτά κυμαίνονται από 0,8 έως,2 και κατά άλλους από 0,95 έως,5. Σε μία συγκρνηκή μελέτη, που έγινε με τον αναλυτή εικόνας CAS 00 σε διαφόρους τύπους φυσιολογικών ιστών (από χειρουργικά και νεκροτομικά παρασκευάσματα), βρέθηκε ότι ο δείκτης DNA κυμαίνεται από 0,92 έως,08. Κάθε τιμή του δείκτη που είναι κάτω από 0,88 και πάνω από,2 θεωρείται παθολογυτή, ενώ τιμές από 0,88 μέχρι 0,92 και από,08 μέχρι,2 θεωρούνται οριακές (Taylor, Titus-Ernstoff και Stitely, 989). Γενυχές οδηγίες για το ποιοτικό έλεγχο στην ανάλυση ευχόνας δεν έχουν ακόμα συνταχθεί (Marchevsky και Bartels, 994), αλλά είναι σαφές ότι είναι απόλυτη ανάγκη να υπάρχουν οι ακόλουθες προϋποθέσεις: προτυποποίηση των μεθόδων επεξεργασίας των δειγμάτων, ρύθμιση του οπτικού συστήματος του μηχανήματος, χρησιμοποίηση γνωστών κυττάρων για μάρτυρες (controls), επαναληψιμότητα των μετρήσεων, καθαριότητα και καλή συντήρηση του οργάνου. 30

47 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

48 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ.ΥΛΙΚ0-ΜΕΘ0Δ0Σ Στην εργασία αυτή έγινε διερεύνηση της έκφρασης του αντιγόνου πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων (PCNA) σε καρκίνους της ουροδόχου κύστεως από μεταβατικό επιθήλιο με σκοπό να εκτιμηθεί το κλάσμα πολλαπλασιασμού των νεοπλασματικών κυττάρων. Τα αποτελέσματα των μετρήσεων συγκρίθηκαν τελικά με την περιεκτικότητα των κυττάρων σε DNA, το βαθμό διαφοροποίησης (grade) και το στάδιο του όγκου. Μελετήθηκαν συνολικά 60 περιπτώσεις με διαγνωσμένο για πρώτη φορά και μη μεταστατικό καρκίνο της ουροδόχου κύστεως από μεταβατικό επιθήλιο, οι οποίες νοσηλεύθηκαν στην Ουρολογυτή Κλινική του Πανεπιστημίου Αθηνών του Γενυχού Περιφερειακού Νοσοκομείου "Σισμανόγλειο". Η εκτίμηση του βαθμού διαφοροποίησης και του σταδίου του όγκου έγινε από το Εργαστήριο Παθολογικής Ανατομικής του Γενικού Περιφερειακού Νοσοκομείου "Σισμανόγλειο". Οι προσδιορισμοί της περιεκτικότητας των κυττάρων σε DNA και της έκφρασης του PCNA έγιναν στο Ερευνητικό Εργαστήριο της Πανεπιστημιακής Ουρολογικής Κλινικής του ιδίου Νοσοκομείου. /./ Λήψη των δειγμάτων Τα δείγματα των ιστών προέρχονταν είτε από διουρηθρική εκτομή του όγκου είτε από χειρουργικά παρασκευάσματα ολικών κυστεκτομών. Τα τεμάχια του ιστού λαμβάνονταν από το πιο αντιπροσωπευτικό μακροσκοπικά τμήμα του όγκου και ιδιαίτερα από περιοχές οι οποίες δεν παρουσιάζανε νέκρωση ή φλεγμονή. Στις περιπτώσεις της διουρηθρικής εκτομής του όγκου επιλεγόταν ένα τεμάχιο ιστού που δεν είχε εμφανή σημεία νέκρωσης από την επίδραση της διαθερμίας. Η λήψη των τεμαχίων του ιστού γινόταν απαραίτητα πριν από την τοποθέτηση του χειρουργικού παρασκευάσματος σε φορμόλη. Παράλληλα με τα πιο πάνω σε 5 περιπτώσεις ελήφθησαν τμήματα βλεννογόνου της κύστεως από περιοχές του τοιχώματος που δεν παρουσίαζαν μακροσκοπικά καμία αλλοίωση. Στα τμήματα αυτά και μετά την ιστολογική επιβεβαίωση ότι επρόκειτο για φυσιολογικό βλεννογόνο έγινε προσδιο- 3

49 ρισμός της έκφρασης του PCNA για να καθορισθούν τα ανώτερα όρια της έκφρασης στο φυσιολογικό ιστό. Τα τεμάχια του ιστού μεταφέρονταν από το χειρουργείο στο εργαστήριο μέσα σε μία γάζα εμποτισμένη με φυσιολογικό ορό για τη δημιουργία εντυπωμάτων για τη διερεύνηση της περιεκτικότητας των κυττάρων σε DNA. Μετά από αυτό αποστέλλονταν στο Παθολογοανατομικό Εργαστήριο για την ιστολογική διάγνωση και την εκτίμηση του grade και του σταδίου του όγκου. Για τη διερεύνηση της έκφρασης του PCNA χρησιμοποιήθηκαν τομές παραφίνης από τα ίδια ιστοτεμάχια, όπως και από τα τμήματα του φυσιολογικού βλεννογόνου..2 Προετοιμασία των δειγμάτων Τα εντυπώματα για τη διερεύνηση της περιεκτικότητας των κυττάρων σε DNA γίνονταν με ελαφρά πίεση του τεμαχίου του ιστού πάνω σε αντικειμενοφόρο πλάκα, αφήνονταν για μία ώρα στον αέρα, τοποθετούντο για άλλη μία ώρα σε ουδέτερη φορμόλη, μετά αφήνονταν και πάλι στον αέρα μέχρι να στεγνώσουν και φυλάσσονταν μέχρι την ημέρα της χρώσης τους σε θερμοκρασία δωματίου. Η διερεύνηση της έκφρασης του PCNA έγινε σε τομές παραφίνης πάχους 5μπι. Η αποπαραφίνωση των τομών γινόταν με τοποθέτηση τους σε ξυλόλη για 30' στον κλίβανο σε θερμοκρασία 58 C και μετά άλλα 5'-20' σε καθαρή ξυλόλη σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια τοποθετούντο αλληλοδιάδοχα και ανά 0 λεπτά σε οινόπνευμα απόλυτο, 96, 96, 70 και 50 και σε νερό απεσταγμένο και μετά στεγνώνανε στον κλίβανο για να ακολουθήσει η χρώση των δειγμάτων με την ανοσοϊστοχημική τεχνική Avidin- Extravidin..3 Χρώση των δειγμάτων Για τον προσδιορισμό της περιεκτικότητας των κυττάρων σε DNA στον αναλυτή εικόνας CAS 00 χρησιμοποιήθηκε η χρώση Feulgen με το KIT και το πρωτόκολλο εργασίας της Εταιρείας Becton Dickinson που έχει ως εξής:. Παρασκευή του διαλύματος χρώσης Σε μια φιάλη Erlenmeyer των 25mL τοποθετούνται looml 0, Ν υδροχλωρικού οξέος και διαλύεται ολόκληρο το περιεχόμενο του φιαλιδίου της χρωστικής, η οποία είναι βασυχή φουξίνη. Στη συνέχεια 32

50 κλείνεται η Erlenmeyer με παραφίλμ και τοποθετείται στο μαγνητικό αναδευτήρα για μία ώρα. 2. Παρασκευή του διαλύματος έκπλυσης Σε μία Erlenmeyer των 500mL τοποθετούνται 300mL 0.05Ν υδροχλωρικού οξέος και φιαλίδιο διαλύματος έκπλυσης (rinse reagent). Ακολουθεί καλή ανάδευση. 3. Τοποθέτηση των εντυπωμάτων σε διάλυμα 5Ν υδροχλωρικού οξέος για ώρα με στεγανή κάλυψη με παραφίλμ. 4. Απόρριψη του υδροχλωρικού οξέος και προσθήκη του διαλύματος χρώσης μετά από διήθηση. Στο διάλυμα χρώσης τα εντυπώματα παραμένουν για ώρα. 5. Απόρριψη του διαλύματος χρώσης και έκπλυση 3 φορές (η πρώτη για 30 δευτερόλεπτα, η δεύτερη για 5 λεπτά και η τρίτη για 0 λεπτά) με looml τη φορά από το διάλυμα έκπλυσης. Το δοχείο πρέπει να σκεπάζεται στεγανά με παραφίλμ. 6. Απόρριψη και του τρίτου διαλύματος έκπλυσης και έκπλυση με απεσταγμένο νερό για 5 λεπτά. 7. Εμβάπτιση για 5 λεπτά σε % διάλυμα οξυνισμένης αλκοόλης. 8. Απόρριψη του υπερκείμενου και εμβάπτιση σε απόλυτη αιθανόλη 2 φορές από 3 λεπτά. 9. Απόρριψη του υπερκείμενου και εμβάπτιση σε ξυλόλη 2 φορές από 3 λεπτά. 0. Επικάλυψη των πλακιδίων με Endellan (συνθετική ρητίνη). Για τον προσδιορισμό της έκφρασης του PCNA χρησιμοποιήθηκε το μονοκλωνικό αντίσωμα PC-0 (DAKO) σε αραίωση :40 και εφαρμόστηκε η ανοσοϊστοχημική τεχνική Avidin-Extravidin ως εξής:. Μετά την αποπαραφίνωση, τοποθέτηση των πλακιδίων για 5-0 λεπτά σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών αλάτων (PBS) με ph 7,2. 2. Για την αναστολή της δράσης της ενδογενούς υπεροξειδάσης, επώαση για 0 λεπτά σε διάλυμα 3% υπεροξειδίου του υδρογόνου σε θερμοκρασία δωματίου σε σκοτεινό μέρος μετά από επικάλυψη με αλουμινόχαρτο. 3. Απόρριψη του Η και έκπλυση με PBS για 5 λεπτά. 4. Σκουπίζονται τα πλακίδια από το PBS, καλύπτονται με παράγοντα δέσμευσης της πρωτεΐνης και τοποθετούνται οριζόντια για 0 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. 33

51 5. Σκουπίζονται και πάλι τα πλακίδια, καλύπτονται με το μονοκλωνικό αντίσωμα PC-0 σε αραίωση :40 και επωάζονται για ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. 6. Έκπλυση δύο φορές για 5 και 0 λεπτά με PBS. 7. Επώαση για 30 λεπτά με anti-rb, Gt, Mo, το οποίο χρησιμοποιείται ως δεύτερο αντίσωμα. 8. Έκπλυση δύο φορές για 5 και 0 λεπτά με PBS. 9. Επώαση με διάλυμα Avidin-Extravidin για 20 λεπτά. 0. Έκπλυση δύο φορές για 5 και 0 λεπτά με PBS.. Εμβάπτιση των πλακιδίων σε διάλυμα diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) (Dako), η οποία χρησιμοποιήθηκε ως χρωμογόνο, και τοποθέτηση τους σε σκοτεινό μέρος και με το δοχείο καλυμμένο με αλουμινόχαρτο για 6 λεπτά. 2. Έκπλυση με νερό βρύσης 3. Εμβάπτιση των πλακιδίων στο διάλυμα Ethyl Green για αντίχρωση και φύλαξη σε σκοτεινό μέρος και με το δοχείο καλυμμένο με αλουμινόχαρτο επί 0 λεπτά. 4. Γίνονται τρεις διαδοχικές εκπλύσεις με νερό βρύσης. 5. Γίνονται τρεις διαδοχικές εμβαπτίσεις σε ισοπροπυλική αλκοόλη (καθαρό διάλυμα κάθε φορά). 6. Γίνονται τρεις διαδοχικές εμβαπτίσεις σε ξυλόλη (καθαρό διάλυμα κάθε φορά). 7. Επικάλυψη με Endellan. Παρασκευή του διαλύματος DAB Για την παρασκευή του DAB σε μία κωνική φιάλη με loml PBS προστίθεται δισκίο DAB. Η φιάλη τυλίγεται (μαζί με το πώμα της) με αλουμινόχαρτο και τοποθετείται σε μαγνητικό αναδευτήρα. Από το διάλυμα αυτό για κάθε 0 πλακίδια χρησιμοποιούνται 4mL, στα οποία προστίθενται και 3μ. υπεροξείδιο του οξυγόνου 3%. Παρασκευή του διαλύματος Ethyl Green Για την παρασκευή του διαλύματος Ethyl Green, σε μια κωνική φιάλη προστίθενται looml απεσταγμένου νερού, 8mL 0,2Μ οξεικού άλατος νατρίου και 82mL οξεικού οξέος 0,2Μ. Στο διάλυμα αυτό των 200mL προστίθενται 0,4g Ethyl Green σε σκόνη. Ακο- 34

52 λουθεί ανάδευση σε μαγνητικό αναδευτήρα σε σκοτεινό μέρος με τη φιάλη καλυμμένη με αλουμινόχαρτο..4 Μέτρηση των δειγμάτων Ο προσδιορισμός της περιεκτυχότητας των κυττάρων σε DNA και της έκφρασης του PCNA έγινε με αναλυτή εικόνας (CAS 00 της Εταιρείας Becton Dickinson). Για τον προσδιορισμό του DNA και για να αποφευχθούν οι διακυμάνσεις που παρατηρούνται στις μετρήσεις, χρησιμοποιήθηκαν ως κύτταρα αναφοράς ηπατοκύτταρα ποντικού, γνωστής περιεκτυχότητας σε DNA, χρωματισμένα με τη μέθοδο Feulgen, τα οποία περιλαμβάνονται στο KIT της Εταιρείας Becton Dickinson. Πριν από κάθε μέτρηση, απαραίτητη προϋπόθεση ήταν η ρύθμιση του φωτισμού του οπτικού πεδίου με τη βοήθεια του ηλεκτρονικού υπολογιστή, ώστε να ανταποκρίνεται στις προδιαγραφές που θέτει το όργανο. Ακολουθούσε η εξέταση κυττάρων αναφοράς και στη συνέχεια η εξέταση των κυττάρων του δείγματος. Σε κάθε δείγμα μετά από επιλογή από τον ίδιο εξεταστή, μετρήθηκαν τουλάχιστον 200 κύτταρα. Κάθε μετρούμενος πυρήνας τοποθετείτο από τον υπολογιστή πάνω σε ιστόγραμμα ανάλογα με την περιεκτικότητα του σε DNA. Η περιεκτικότητα των κυττάρων σε DNA εκφράστηκε με το δείκτη DNA, ο οποίος είναι το πηλίκον της περιεκτικότητας σε DNA του εξεταζόμενου κυτταρικού πληθυσμού προς την περιεκτικότητα σε DNA ενός διπλοειδικού πληθυσμού. Οι όγκοι χαρακτηρίζονταν διπλοειδικοί όταν ο δείκτης DNA ήταν μεταξύ 0,9 -, και ανευπλοειδικοί όταν ο δείκτης ήταν πάνω από,. Από την ανάλυση επίσης του ιστογράμματος του DNA έγινε δυνατό να εξαχθεί και το ποσοστό των κυττάρων των φάσεων G0G, S και G2M του κυτταρικού κύκλου σε σχέση με το σύνολο των μετρηθέντων κυττάρων του δείγματος. Η έκφραση του PCNA μετρήθηκε από τον ίδιο εξεταστή. Το πρόγραμμα μέτρησης που διαθέτει ο αναλυτής εικόνας έχει τη δυνατότητα να υπολογίζει το εκατοστιαίο ποσοστό της θετικά για PCNA χρωσμένης επιφάνειας σε σχέση με τη συνολική επιφάνεια των εξεταζόμενων πυρήνων. Μετρήθηκαν σε κάθε δείγμα 6 αντιπροσωπευηκά οπτικά πεδία (συνολικής επιφάνειας τουλάχιστον 25μιη ). Οι όγκοι διακρίθηκαν σε χαμηλής έκφρασης PCNA, όταν το ποσοστό της θετικά χρωσμένης για PCNA επιφάνειας σε σχέση με τη 35

53 συνολικά μετρηθείσα επιφάνεια ήταν κάτω από 30% και σε υψηλής έκφρασης, όταν το αντίστοιχο ποσοστό ήταν πάνω από 30%. Μετρήθηκαν επίσης θετικοί και αρνητικοί μάρτυρες (ανθρώπινη αμυγδαλή μονιμοποιημένη σε ουδέτερη φορμόλη για 24 ώρες). Οι αρνητυχοί μάρτυρες επωάστηκαν με normal horse serum χωρίς το αντίσωμα PC-0. Στην ευχόνα.4. απευχονίζεται ενδευχτικά ένα ιστόγραμμα ενός διπλοειδυχοϋ όγκου και ενός ανευπλοειδυχού όγκου. Στην εικόνα.4.2 φαίνεται το ιστόγραμμα ενός χαμηλής και ενός υψηλής έκφρασης PCNA. Και οι δύο παραπάνω μετρήσεις έχουν γίνει στον ίδιο αναλυτή ευχόνας. Τα αποτελέσματα των μετρήσεων της περιεκτυχότητας των κυττάρων σε DNA και της έκφρασης τους σε PCNA συγκρίθηκαν τόσο μεταξύ τους όσο και με το βαθμό διαφοροποίησης και το στάδιο του όγκου. 00 ι W ι C 60 β» 40 t 20 OMtnbutfon of DNA Mn> 3Nà.run saw* ο«7 'β acsgrvn Β 00 - c «20 OatnbvMn d ON* Mw ON* «dei MMd on 7 ifl B<csgr*m ON* Mm ΙΡιι»«ι mrmi 2 6 ONA M tpxoqßmnml 24 Εικόνα.4. Διπλοειδικό (Α) και ανευπλοειδικό (Β) ιστόγραμμα OUANTTTATTVf NUCUAJ ANTIGEN Ukr Ar«H2 4 *»' Β 20 QUANTITATIVE NUO AD ANTBCN =»OW» «AfM 74 Εικόνα.4.2 Ιστόγραμμα νεοπλάσματος χαμηλής (Α) και υψηλής έκφρασης (Β) PCNA 36

54 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 2. Μετρήσεις Εξετάστηκαν συνολικά 60 άρρωστοι με καρκίνο της ουροδόχου κύστεως εκ μεταβατικού επιθηλίου. Η ηλικία τους κυμαινόταν από 46 έως 80 ετών (μέση ηλυχία 65,7). Η κατανομή των αρρώστων σύμφωνα με το grade και το στάδιο του όγκου και με την αντίστοιχη εκατοστιαία αναλογία τους παρουσιάζονται στον πίνακα 2... Πίνακας 2.. Απόλυτη και οχετική (%) κατανομή των ασθενών σύμφωνα με το grade και στάδιο του όγκου GRADE Στάδιο Αριθμός ασθενών Κατανομή κατά Grade (%) Κατανομή κατά Στάδιο (%) GRADE Ι 9 5,00 00,00 Ta 8 88,89 TI, GRADE II 3 5,67 00,00 Ta 23 74,9 TI 8 25,8 GRADE III 8 30,00 00,00 Ta 5,56 TI 4 22,22 T2 0 55,56 Τ3 5,56 T3b 5,56 Τ4 5,56 GRADE IV 2 3,33 00,00 Τ2 50,00 T3a 50,00 Ι Σύνολο Από τον πίνακα αυτό φαίνεται ότι στους αρρώστους που εξετάστηκαν το πιο συχνό grade ήταν το grade II με 3 αρρώστους (ποσοστό 5,67%), με δεύτερο το grade III με 8 αρρώστους (ποσοστό 30%). Ακολουθεί το grade Ι 37

55 με 9 αρρώστους (ποσοστό 5%) και τέλος το grade IV με 2 αρρώστους (ποσοστό 3,33%). Όσον αφορά τη σχέση του σταδίου προς τα grades του όγκου, το πιο συχνό στάδιο για το grade Ι και grade II είναι το Ta με ποσοστά 88,89% και 74,9% αντίστοιχα. Στο grade III το πιο συχνό στάδιο είναι το Τ2 με ποσοστό 55,56%, ενώ στο grade IV τα στάδια Τ2 και T3a απαντούν εξίσου με ποσοστό 50% το καθένα. Τα παραπάνω αποτελέσματα απεικονίζονται και γραφικά στα Σχήματα 2.. και Όσον αφορά τη διηθητικότητα του όγκου, οι όγκοι διακρίθηκαν σε επιφανειακούς (στάδια Ta και ΤΙ) και διηθητικούς (στάδια Τ2-Τ4). Στο σύνολο των όγκων που μελετήθηκαν (60), οι επιφανειακοί όγκοι ήταν 45 (75%) και οι διηθητικοί 5 (25%) (πίν. 2..4). Στο grade Ι και II το ποσοστό των επιφανειακών όγκων επί του συνόλου των όγκων των grades αυτών είναι 00%. Στα grades III και IV τα ανάλογα ποσοστά των επιφανειακών όγκων επί του συνόλου των όγκων των grades αυτών είναι αντίστοιχα 28% και 0%. Στο grade IV δεν υπάρχουν επιφανειακοί όγκοι. Οι διηθητυχοί όγκοι στο grade III είναι 72% και στο grade IV 00%. Τα αναλυτικά αποτελέσματα των μετρήσεων του δείκτη DNA και της έκφρασης του PCNA κατά grade και στάδιο των όγκων των πιο πάνω περιπτώσεων δίνονται στον πίνακα 2..2, ενώ οι παράλληλες μετρήσεις του δείκτη DNA και της έκφρασης του PCNA κατά grade και στάδιο του όγκου παρουσιάζονται στον πίνακα Με βάση το δείκτη DNA οι όγκοι διακρίθηκαν σε διπλοειδικούς, όταν ο δείκτης DNA ήταν μεταξύ 0,9-,, και σε ανευπλοειδυχούς όταν ο δείκτης DNA ήταν πάνω από,. Με βάση τα ευρήματα του προσδιορισμού της έκφρασης του PCNA στα δείγματα του φυσιολογικού ιστού, στον οποίο η θετικά χρωσμένη για PCNA επιφάνεια σε καμία περίπτωση δεν ήταν πάνω από 30% (σε σχέση με το σύνολο της μετρηθείσας επιφάνειας), οι όγκοι διακρίθηκαν σε χαμηλής (<30%) και υψηλής (>30%) έκφρασης. Η απόλυτη και σχετική (%) κατανομή των αρρώστων με επιφανειακούς και διηθητικούς όγκους κατά grade σύμφωνα με το δείκτη DNA (διπλοειδικοί και ανευπλοειδικοί όγκοι) και την έκφραση του PCNA (χαμηλής, <30%, και υψηλής, >30%, έκφρασης όγκοι) παρουσιάζονται στον πίνακα 2..4 και απεικονίζονται γραφικά στα σχήματα 2..3 και

56 Πίνακας 2..2 Αναλυτικά αποτελέσματα των μετρήσεων κατά ασθενή του δείκτη DNA και της έκφρασης του PCNA κατά grade και στάδιο No GRADE ΣΤΑΔΙΟ DNA PCNA No GRADE ΣΤΑΔΙΟ DNA PCNA III T2,53 60,64 3 II Ta,28 53,00 2 II TI,00 2,85 32 II Ta,00 25,93 3 I Ta,00 36,28 33 II Tl,3 27,69 4 IV T2,53 60,95 34 II Tl,77 83,08 5 I Ta,00,46 35 I Ta,00 23,00 6 III T3b,00 74,78 36 I Ta,00 2,30 7 III T2 2,87 94,07 37 III T2,00 58,7 8 III T2,00 25,28 38 II Ta,00 28,32 9 III TI 2,4 6,6 39 II Tl,00 28,20 0 II Ta,00 2,90 40 II Ta,00 29,50 II Ta,00,7 4 III Tl,6 28,2 2 II Ta,4 29,39 42 II Ta,00 36,26 3 III T2 2,23 3,42 43 II Ta 2,30 77,40 4 II Ta,7 30,04 44 II Tl 2,56 76,9 5 II Tl,95 5,83 45 II Ta,00 3,98 6 II Ta,00 9,86 46 II Ta,00 25,33 7 II Ta,00 20,95 47 II Ta 2,2 50,82 8 III Tl,45 4,20 48 II Ta,00 27,85 9 I Ta,00 2,65 49 I Ta,00 44,62 20 II Ta,77 23,79 50 III T2,59 98, III m Ta Tl,00 2,2 28,20 52, II m Ta T2,57,00 47,78 23,60 23 III T2,49 4,84 53 III T4 2,97 8,56 24 I Ta,00 8,20 54 IV T3a,00 68,40 25 I Tl,00 8,02 55 II Ta 2,08 32,44 26 Π Ta,00 3,22 56 III. T2,50 76,98 27 II Ta,73 62,00 57 II Ta,00 8,09 28 I Ta,00 4,0 58 II Tl,00 29, ra II T2 Ta,59,30 9,40 7, II m Tl T3,6,00 25,00 56,82 Το Σχήμα 2..3 παρουσιάζει την κατανομή των ασθενών με επιφανειακούς και διηθητικούς όγκους κατά grade σύμφωνα με το δείκτη DNA 39

57 Σχήμα 2.. Ιστόγραμμα ποσοστιαίας κατανομής των ασθενών σύμφωνα με το Grade του όγκου GRADEΙ GRADE II GRADE ΠΙ GRADE IV Σχήμα 2..2 Ιστόγραμμα ποσοστιαίας κατανομής των ασθενών σύμφωνα με το Grade και Στάδιβ του όγκου Ta ΤΙ Ta ΤΙ Ta ΤΙ Τ2 Τ3 T3b Τ4 Τ2 T3a Grade Ι Graden Grade III Grade IV

58 Πίνακας 2..3 Συστηματική παρουσίαση των παράλληλων τιμών του δείκτη DNA και της έκφρασης του PCNA σύμφωνα με το grade και στάδιο του όγκου GRADE Στάδιο GRADE Ι Διύπης DNA Έκφραση PCNA GRADE II Λιικτης DNA Έκφραση PCNA GRADE III Δ(ύπης DNA Έκφραση PCNA GRADE IV Διίκτης DNA TxfpOOT) PCNA Ta,0,0,0,0,0 ι,ο.0,0,46 2,65 4,0 8,20 2,30 23,00 36,28 44,62,00,00,00,00,00,00,00,00,00,00,00,00,00,4,7,28,30,57,73,77 2,08 2,2 2,30 9,86,7 2,90 3,22 8,09 20,95 25,33 25,93 27,85 28,32 29,50 3,98 36,26 29,39 30,04 53,00 7,49 47,78 62,00 23,79 32,44 50,82 77,40,00 28,20 ΤΙ,00 8,02,00,00,00,3,6,77,95 2,56 2,85 28,20 29,6 27,69 25,00 83,08 5,83 76,9,6,45 2,4 2,2 28,2 4,20 6,6 52,4 Τ2,00,00,00,49,50,53,59,59 2,23 2,87 23,60 25,28 58,7 4,84 76,98 60,64 9,40 98,22 3,42 94,07,53 60,95 Τ3,00 56,82 Τ3»,00 68,40 T3b,00 74,78 Τ4 2,97 8,56

59 < ζ α VC > ι ΗΝ li < Ρ -I *I = -* s Ν ". Ci so oo ο > f υ 'S a Q > Μ Ο 2 ο IS Is 9 ~i Ο ^^ (Ν Ov <N ' fn 2, Ο Λ 5 <N SO <s ο Ο I «ο St Si ο β * Is. ^ s η Q 2 ο II < Ρ M u g 2 >^ V> Ö w >" ->. VO 00 Ci o 00 > VO = > */ ν) Ο 00 «3 ^H» vo oo w 5 δ JA * > f > α S ö^»f it è* s a U] Û $ Ο *^ ω α ο < c β ο Β) g II ä ο «Ι» S >^ Os,< ν SO V O - WÌ OS ο o> oo * si s_^ ON Ο w^ -^ oo q oo «n ^^ 00 Tf >*-' (N «N «3 <N < -? «-«( I 8 Ν eo Ο L it s~* C «C à"» <J Ο Β 3-* w ^^ 5 Β v? X % Ν»Π 'S- ε? m «3 fi 2 uj ^ ζ

60 Σχήμα 2..3 Ιστόγραμμα κατανομής των ασθενών με επιφανειακούς και διηθητικούς όγκους κατά Grade σύμφωνα με το δείκτη DNA Π Σύνολο Διπλοβιδικοί Ανευπλοβιδικοί 0-Ε= Ι m Ι _ ExifavaMncot Διηθητικοί Ejnfavamcoi Διηθητικοί Εχιφαναακοί Διηθητικοί Επιφανβιακοί Διηθητικοί Gradel Graden Grade ΠΙ Grade IV 35 Σχήμα 2..4 Ιστόγραμμα κατανομής των ασθενών με επιφανειακούς και διηθητικούς όγκους κατά Grade σύμφωνα με την έκφραση του PCNA * 0 -. L-.JBBBBBB il &ηφαι«ακοί Διηθητικοί Ε»»>αιβ«κοί Διηθητικοί Esupavnaicoi Διηθητικοί Εκιφανβιακοί Διηθητικοί ^ L Gradel Grade Π Gradein I I Grade IV DΣύνολο Χαμηλ. Έκφρ. Υψηλ-Έκφρ.

61 (διπλοειδικοί και ανευπλοειδικοί όγκοι). Το Σχήμα 2..4 παρουσιάζει την κατανομή των ασθενών με επιφανειακούς και διηθητικούς όγκους κατά grade σύμφωνα με την έκφραση του PCNA (χαμηλής και υψηλής έκφρασης όγκους). Η μεταβολή των μετρήσεων του δείκτη DNA και της έκφρασης του PCNA με βάση τις μέσες τιμές, όπως υπολογίστηκαν κατά ασθενή για το δείκτη DNA (διπλοειδικοί και ανευπλοειδικοί όγκοι) και για την έκφραση του PCNA (χαμηλής και υψηλής έκφρασης όγκοι) σύμφωνα με το grade, το στάδιο και τη διηθητικότητα του όγκου (επιφανειακοί και διηθητικοί όγκοι) φαίνονται συγκριτικά στον πίνακα Τα δεδομένα του πίνακα αυτού απεικονίζονται γραφικά στα Σχήματα 2..5 και Οι μέσες τιμές για τους επιφανειακούς και διηθητικούς όγκους για το δείκτη DNA (διπλοειδικοί και ανευπλοειδικοί όγκοι) και την έκφραση του PCNA (χαμηλής και υψηλής έκφρασης) σύμφωνα με το grade του όγκου και αφετέρου τις αναλογίες (Ratios) που εκφράζουν τις μεταβολές των μέσων τιμών των μετρήσεων που παρουσιάζουν οι επιφανειακοί και διηθηηκοί όγκοι από grade σε grade φαίνοται στον πίνακα Για τον υπολογισμό των αναλογιών χρησιμοποιήθηκε ως βάση το grade Ι (=,00). Όπως φαίνεται από τον πίνακα αυτόν σε τιμές δείκτη DNA οι αναλογίες των επιφανειακών διπλοειδικών όγκων είναι σταθερές και ίσες με,00. Για τους επιφανειακούς ανευπλοειδικούς όγκους (μέση τιμή βάσης,2) οι αναλογίες δείχνουν σημαντυχή αύξηση του δείκτη DNA από grade σε grade. Η μέση τιμή του δείκτη DNA των όγκων με grade II είναι,39 φορές (39%) μεγαλύτερη από εκείνη των όγκων με grade Ι και των όγκων του grade III είναι,45 φορές (45%) μεγαλύτερη από εκείνη των όγκων του grade Ι. Για τους επιφανειακούς όγκους χαμηλής έκφρασης PCNA (μέση τιμή 6,95%) υπάρχει μεγάλη αύξηση της έκφρασης PCNA από grade σε grade. Για τους όγκους του grade II η μέση τιμή του PCNA είναι,3 φορές (3%) μεγαλύτερη από εκείνη των όγκων του grade Ι και για τους όγκους του grade III είναι,66 φορές (66%) μεγαλύτερη από εκείνη των όγκων του grade Ι. Όσον αφορά τους επιφανειακούς όγκους υψηλής έκφρασης PCNA (μέση τιμή 40,65%) το ποσοστό αύξησης της έκφρασης του PCNA για τους όγκους grade Π και grade ΠΙ σε σχέση με το grade Ι είναι της τάξης του 33% και 27% αντίστοιχα. Διηθητικοί όγκοι παρουσιάζονται στο υλικό μας μόνο στα grade III και IV. Για το grade IV το μέγεθος του δείγματος είναι πολύ μικρό (2 μόνο άρρωστοι) και αυτό επηρεάζει τη δυνατότητα σύγκρισης των 44

62 8 f Ö ^^ J; <C Ρ 5 Ο υ ä> ο a. 2 Ι i < ζ a. Η i ω F > S M < Ζ Q p,jî i g Β M κ tf g il ϊ I Ι" ο κ b- "Ì ^* «Ν Ι S C Μ«(β Q 2 M Q 2 Ο ti J Θ «i κ li 4 < C s- 4! ι * < < ζ i i Ε ι -a ο Ê Ξ < :* j m «(N 2Γa" «Su g.2 ï] 3 I lì Cl «J "". j Si s* ~4 C ni is* j ο - Sa à a ri < 2 ' w «00 <~> 2 'i so ο e 8.2 Il e oo ο Il e Λ Ä 0\ > vo 00 Γτ II î v ^ \ 8 s? ζ-' ~ a «* G ββ~*< 5 IBÌ-<U r» / ~^ oo ^-* s?»γί ίτ- «".τ 55 Γ» " > w CT* «> ^ ^tf ~ c ^w ^s?» 4 -s^ <N " * s-τ 22 e J^«, 8- _- il -i 00 / ""' (S 00 a* «(S β «*> α se Λ t 5- s 8.2 Il m ' ^ "i "" Il α / <" 2<S F- c» Il (S g / _ Ο II 3 8* «Il g

63 < ci» ' Si ve Ο? Β ο 00 fi ^ ο II c S (S S es * ca * α \0 w VO w Ο II ο II > it { ο vo -5 Ο ^ S" 00 c 00 **"* * a S es ai 2 ο à ϊ "Is Cl '""»T. 7 e ο II Cl "i7 ^ CI '"" «.7 < ili I s? ο ^ ~3 ο ^.7 Β«5 Cl <""> -- fi 5» _r il a» Il «a ϊ» ι i ι ϊ Γ < \ ί W Ω Ο < ϊ < c ί 8 ri «j s *8 «S ""S 5- = Â î 8 3 ο c ^«7 00 c CN w î 8~ î-î m w S5 ο CN w -T f ß ρ» CI _} «* * α in w oc β es >Ξ> 5" ii CI w 8- ~- Il -e -3 ON fi îî <S w -2 "7 ci 00 r * c --fi si 00 <Γ 00 ~* «Il in ο? C (S " > 00 * ' - Il in ο! H 8-7 OO ^v o fi 00 ^ 8- î 00 w f oo -C- Ä «7 «s e! s 7 S* >5?is ** il es >S S* il >5 8^ 5 φ Cl - II ι-- 2 Cl >5 ^ Ift- S3 D: ι 8 s 5 ^ 00 -" Il GRADE Στάδιο M * H «s H = - s - «Β- <<58«-< MO- 4 - S «X H - M O

64 3.00 τ Σχήμα 2..5 Ιστόγραμμα μέσων τιμών κατά ασθενή του δείκτη DNA για επιφανειακούς και διηθητικούς όγκους σύμφωνα με το Grade του όγκου Σύνολο Δοιλοϊΐδικοί Ανβυπλοειδικοί Εχιφαναακοί Διηθητικοί Εχιφαναακοί Διηθητικοί Επιφανειακοί Διηθητικοί Επιφανειακοί Διηθητικοί Grade Ι Graden Grade ΠΙ Grade IV Σχήμα 2..6 Ιστόγραμμα μέσων τιμών κατά ασθενή της έκφρασης του PCNA για επιφανειακούς και διηθητικούς όγκους σύμφωνα με το Grade του όγκου Σύνολο Χαμηλ. Έκφμ ΙΥψηλ-Έκψρ. Ewfgy«MMco( Διηθητικοί Ejoyavamcoi Διηθητικοί Επιφανειακοί Διηθητικοί Ειοφανειακοί Διηθητικοί Grade Ι Ι Ι Grade Π Grade ΠΙ Grade IV

65 > cd Q 2 *s <5 5 < lì κ - r» ci «Λ so «r νο so VC * vo ta Q. Ι # < li S * r- Γ η Cl " "" " ?. ri η Τ. 00 -Ο 5 Γ- * r-t 5-. Λ "" υ 3 ε Ë S M4 ta a ί ο 'δ Ι < 8.8. VO fi. 3.3 <*> «ri V Ο BE] α ο 5 β's h 8.8. ^ ^ ^H 8.8. r $8 2 " 2.8 S~ f< jsi t H Ü 3â -^ (S s w ^* f» II i<2 -"' «N i s^li ΓΝ eo l II S.2 ~ ri s Ο > 5 m Β ζ J Ι Η Is Sai "- ri I w * Ρ jf-s s «S! ri 2 r* MU ν μ ü s«s ri ΪΪ Cl *w

66 grade III και IV κυμαίνονται σε τιμή DNA για διηθητικούς ανευπλοειδικούς όγκους μεταξύ,53 και 2,40 και σε έκφραση PCNA για διηθητικούς όγκους υψηλής έκφρασης μεταξύ 64,68% και 70,56%. Η γραφική παρουσίαση των αποτελεσμάτων της ανάλυσης δίνεται στα Σχήματα 2..7, 2..8, 2..9 και Οι μέσες τιμές κατά ασθενή του δείκτη DNA για διπλοειδικούς και ανευπλοειδυχούς όγκους σύμφωνα με το grade του όγκου παρουσιάζονται στο Σχήμα Οι μέσες τιμές κατά ασθενή της έκφρασης του PCNA για όγκους με χαμηλή και υψηλή έκφραση σύμφωνα με το grade του όγκου παρουσιάζονται στο Σχήμα Οι μέσες τιμές κατά ασθενή του δείκτη DNA για διπλοειδικούς και ανευπλοειδικούς όγκους σύμφωνα με το grade και το στάδιο του όγκου παρουσιάζονται στο Σχήμα Οι μέσες τιμές κατά ασθενή της έκφρασης του PCNA για όγκους με χαμηλή και υψηλή έκφραση σύμφωνα με το grade και το στάδιο του όγκου παρουσιάζονται στο Σχήμα Τα δεδομένα του πίνακα 2..5 και η σχηματική παρουσίαση αυτών (Σχήματα ) δείχνουν τη μεταβολή των μέσων τιμών των μετρήσεων του δείκτη DNA (διπλοειδικοί και ανευπλοειδικοί όγκοι) και της έκφρασης του PCNA (χαμηλής και υψηλής) σύμφωνα με το grade και το στάδιο του όγκου. Ο δείκτης DNA δίνει ποσοτικές μετρήσεις μόνο για τους ανευπλοειδικούς όγκους, ενώ για τους διπλοειδικούς έχει ιδιότητες μιας απλής μεθόδου ταξινόμησης, δεδομένου ότι είναι σταθερός και ίσος πάντα με τη μονάδα. Στο Σχήμα 2..7 παρουσιάζεται η μεταβολή των μέσων τιμών ανά ασθενή του δείκτη DNA για ανευπλοειδικους όγκους, μεταξύ των grades II-IV, η οποία κυμαίνεται από,67 έως,89, ενώ στην περίπτωση των διπλοειδικών όγκων, για όλα τα grades, η μέση τιμή του δείκτη DNA είναι σταθερή και ίση με τη μονάδα. Το Σχήμα 2..8 παρουσιάζει τη μεταβολή των μέσων τιμών ανά ασθενή της έκφρασης του PCNA που κυμαίνεται από 6,95% έως 26,3% για όγκους χαμηλής έκφρασης, μεταξύ των grades Ι-ΠΙ, και από 40,45% έως 65,79% για όγκους υψηλής έκφρασης, μεταξύ των grades I-IV. Ο πίνακας 2..7 δίνει τις αναλογίες (Ratios) που εκφράζουν ποσοτυχά τις μεταβολές των μέσων τιμών ανά ασθενή των διπλοειδικών και ανευπλοειδικών όγκων καθώς και των όγκων με χαμηλή και υψηλή έκφραση PCNA 49

67 Σχήμα 2..7 Τρισδιάστατο ιστόγραμμα διπλής κλίμακας των μέσων τιμών κατά ασθενή του δείκτη DNA για διχλοειδικούς και ανευπλοειδικούς όγκους σύμφωνα με το Grade του όγκου DΣύνολο Διπλοειδικοί Ανευκλοειδικοί Ανευκλοειδικοί Δυιλοει&κοί GRADE Ι GRADEΠ GRADE ΙΠ GRADE IV Σύνολο Σχήμα 2..8 Τρισδιάστατο ιστόγραμμα διπλής κλίμακας των μέσων τιμών κατά ασθενή της έκφρασης του PCNA για όγκους χαμηλής και υψηλής έκφρασης σύμφωνα με το Grade του όγκου D Σύνολο Χαμηλής έκφρ. Μ Υψηλής έκφρ. GRADE Ι Υψηλής έκφρ. Χαμηλής έκφρ. Σύνολο

68 Σχήμα 2..9 Ιστόγραμμα μέσων τιμών κατά ασθενή του δείκτη DNA για διπλοειδικούς και ανευχλοειδικούς όγκους σύμφωνα με το Grade και Στάδιο του όγκου ZOO ^_ WÊ_ ^Λ Δαώοαδικοί Η~Ί I I I Ανεοχλοει&ηιί ΜΜΙΙΙΙΙΙΒΙΙΙΙΠ Τ«ΤΙ Τ» ΤΙ Τ» ΤΙ Τ2 Τ3 T3b Τ4 Τ2 Τ3» Grade Ι Grade Π ~] Gradem [[ GradelV Σχήμα 2..0 Ιστόγραμμα μέσων τιμών κατά ασθενή της έκφρασης του PCNA για όγκους χαμηλής και υψηλής έκφρασης σύμφωνα με το Grade και Στάδιο του όγκου < Grade Ι Graden Gladem Grade IV

69 σύμφωνα με το grade του όγκου. Για τον υπολογισμό των αναλογιών αυτών χρησιμοποιήθηκε ως βάση το grade Ι (=,00). Πίνακας 2..7 Υπολογισθείσες αναλογίες (Ratios) των μεταβολών του δείκτη DNA και της έκφρασης PCNA σύμφωνα με το grade του όγκου GRADE GRADE GRADE GRADE I Π III rv DNA. Σύνολο. Μέσες τιμές,00,33, Ratios,00.33,60,27 2Λιπλοειδικοί. Μέσες τιμές,00,00,00,00 2. Ratios,00,00,00,00 3Λνευπλοει-. Μέσες τιμές (.2)*,67,89,53 δικοί 2. Ratios,00,39,58,28 PCNA. Σύνολο. Μέσες τιμές 22,7 35,6 57,02 64,68 2. Ratios,00,6 2,57 2,92 2. Χαμηλής. Μέσες τιμές 6,95 22,2 26,30 έκφρασης 2. Ratios,00,3,55 3. Υψηλής. Μέσες τιμές 40,65 54,8 65,79 64,68 έκφρασης 2. Ratios,00,33,63,60 Λόγω έλλειψης πειραματικής μέσης τιμής, χρησιμοποιήθηκε η προσδοκόμενη εμπειρική τιμή,2 (dummy value) Οι παραπάνω υπολογισθείσες αναλογίες δείχνουν τις σχετικές μεταβολές των υπό θεώρηση μέσων τιμών ανά ασθενή. Συγκεκριμένα, για τους δυτλοειδικούς όγκους φαίνεται ότι δεν υπάρχει καμία μεταβολή των μέσων τιμών από grade σε grade. Για τους ανευπλοειδικους όγκους, η μέση τιμή του DNA των όγκων του grade Π είναι,39 φορές (39%) μεγαλύτερη από εκείνη των όγκων του grade Ι, η μέση τιμή του DNA των όγκων του grade III είναι,58 (58%) μεγαλύτερη από εκείνη του grade Ι και τέλος η μέση τιμή του DNA των όγκων του grade IV είναι,28 φορές (28%) μεγαλύτερη από εκείνη των όγκων του grade Ι (χαμηλός βαθμός αξιοπιστίας λόγω μικρού δείγματος [η=2]). 52

70 Ο πίνακας 2..7 δείχνει επίσης ότι για όγκους χαμηλής έκφρασης PCNA η μέση τιμή της έκφρασης του PCNA των όγκων του grade II είναι,3 φορές (3%) μεγαλύτερη από εκείνη των όγκων του grade Ι, η μέση τιμή της έκφρασης του PCNA των όγκων του grade III είναι,55 φορές (55%) μεγαλύτερη από εκείνη των όγκων του grade Ι. Στο grade IV δεν υπάρχουν όγκοι χαμηλής έκφρασης PCNA για να είναι δυνατή η σύγκριση. Όσον αφορά όγκους με υψηλή έκφραση PCNA, από τον πίνακα 2..7 προκύπτει ότι η μέση τιμή της έκφρασης του PCNA των όγκων του grade II είναι,34 φορές (34%) μεγαλύτερη από εκείνη των όγκων του grade Ι, η μέση τιμή της έκφρασης του PCNA των όγκων του grade III είναι,63 φορές (63%) μεγαλύτερη από εκείνη των όγκων του grade Ι και η μέση τιμή της έκφρασης του PCNA των όγκων του grade IV είναι,60 φορές (60%) μεγαλύτερη από εκείνη των όγκων του grade Ι. Επίσης, εξετάστηκαν οι μεταβολές των αναλογιών (Ratios) των μέσων τιμών του δείκτη DNA ανά ασθενή των παραπάνω όγκων μεταξύ σταδίων εντός των grades (βλέπε πίνακα 2..5). Παρατηρείται ότι δεν υπάρχει μεταβολή των μέσων τιμών μεταξύ σταδίων εντός των grades από Ι έως IV για τους διπλοειδικούς όγκους, γιατί στους όγκους αυτούς ο δείκτης DNA είναι ίσος με. Η σχετική μεταβολή των μέσων τιμών του δείκτη DNA ανά ασθενή για τους ανευπλοειδικούς όγκους του grade II (δεν υπάρχουν ανευπλοειδικοί όγκοι στο grade Ι) από το στάδιο Ta (=,66) στο στάδιο ΤΙ (=,7) είναι της τάξης του +3,0%. Στο grade III, η σχετική μεταβολή των μέσων τιμών του δείκτη DNA ανά ασθενή για τους ανευπλοειδικούς όγκους από το στάδιο ΤΙ (=,74) στο στάδιο Τ4 (=2,97) είναι της τάξης του +70,7%. Στο grade IV υπάρχει μία μόνο περίπτωση ανευπλοειδικού όγκου σταδίου Τ2 με τιμή δείκτη DNA,53. Όσον αφορά την ανάλυση των όγκων χαμηλής και υψηλής έκφρασης PCNA μεταξύ των σταδίων εντός των grades, διαπιστώνεται ότι (βλέπε πίνακα 2..8) στο grade Ι η σχετική μεταβολή των μέσων τιμών ανά ασθενή για όγκους χαμηλής έκφρασης PCNA από το στάδιο Ta (=6,77%) στο στάδιο ΤΙ (=8,02%) είναι της τάξης του +7,5%. Στο grade II, η αντίστοιχη σχετική μεταβολή από το στάδιο Ta (=2,30%) στο στάδιο ΤΙ (=24,58%) είναι της τάξης του +5,4% και για το grade III η σχετική μεταβολή από το στάδιο ΤΙ (=28,20%) στο στάδιο Τ2 (=24,44%) είναι της τάξης του -3,3% (μικρά δείγματα ασθενών). Στο grade IV δεν υπάρχει καμία περίπτωση χαμηλής έκφρασης PCNA. Όσον αφορά τη σχετική μεταβολή των μέσων τιμών ανά ασθενή για τους όγκους υψηλής έκφρασης PCNA διαπιστώνεται ότι στο grade Ι, υπάρχει μόνο μία μέση τιμή στο στάδιο Ta (=40,45%) και καμία στο στάδιο ΤΙ. Κατά συνέ- 53

71 sî o to -β e a υ i ο «2 * «gh M ο «β 'S H M o «c * «2 M VO 00 l/ì W> >Λ r» * ι * " Ρ-.q 00 * < ζ se Θ- 5 β if Ο S ^ β F- W o S <^ «gh M " 5 oo (S *"o* <Ν Ο *ί. ~ VO* * / Ον rf Ι Λ Ο ON " Ο* " VO VO i o» «5 cc tf i M (M r- o o 00 - ^ 4 oo </ > m Tt. (S r- ΓΊ N O η ^ < ο Ο 00 r» ÎS ξ 8. ^^»Λ ^-«β 3. 2 s Ì ο l s > a «O «β H M f=8. \0 < ^ i ïî 2 <S ~ CN 38 S8 " -.* -ί -Γ * (S ί! Il il I ai 2 al ri -! ri n o O S (Ν ο oc oo ~ * «Ν Il Hi 2 <2 2» ri ri Ι ϊ ί la II!j S j ri -^ ri ~ ri o ί W PS < g li * * If - 5 < < δ δ «. jf ο. If! ri 45 -ä >- ί X g: < < δ δ u. *" * > i xi ri «S < 48 < < < δ δ δ ^ Ίί «* li II II ri 43 -î 43 ri 43 s- g ο l-n ΗΝ W Ο NN NN «> Q 2 ο

72 πεια δεν μπορεί να γίνει αξιολόγηση της μεταβολής των μέσων τιμών στα στάδια αυτά για το grade Ι. Στο grade Π, η σχετική μεταβολή της μέσης τιμής ανά ασθενή από το στάδιο Ta (=49,32%) στο στάδιο ΤΙ (=70,37%) είναι της τάξης του +42,6%. Στο grade III, η αντίστοιχη σχετική μεταβολή από το στάδιο ΤΙ(=5,74%) στο στάδιο Τ4 (=8,56%) είναι της τάξης του +57,5%. Τέλος στο grade IV, η αντίστοιχη σχετική αύξηση από το στάδιο Τ2 (=60,95%) στο στάδιο T3a (=68,40%) είναι της τάξης του +2,2%. Ερευνήθηκε επίσης ο βαθμός της συσχέτισης που υπάρχει μεταξύ των τιμών των μετρήσεων του δείκτη DNA και της έκφρασης του PCNA και εκφράστηκε ποσοτικά με τον υπολογισμό του Συντελεστή Συσχέτισης (τύπος Spearman, r s ). Συντελεστές συσχέτισης υπολογίστηκαν για τα grades και grades/στάδια με αριθμό ζευγών τιμών επαρκή για τους υπολογισμούς (πίν. 2..3). Τα Διαγράμματα Διασποράς πιο κάτω (Σχήμα ) δίνουν τα σμήνη των σημείων στο χώρο (Σύστημα Καρτεσιανών Συντεταγμένων) που προσδιορίζουν τα ζεύγη των τιμών του δείκτη DNA και της έκφρασης του PCNA ως επίσης και τους υπολογισθέντες συντελεστές συσχέτισης (r s ) για τα grades Ι, Π, και ΠΙ, και για τα grades/στάδια I/Ta, Il/Ta, ΙΙ/Τ, και ΠΙ/ΤΙ. Ο πίνακας (2..9) δίνει τις τιμές των υπολογισθεντων συντελεστών συσχέτισης (r s ), τα επίπεδα σημαντικότητας σε,ιοσοστά α=5% και α =%, και τα μεγέθη των δειγμάτων των ασθενών που χρησιμοποιήθησαν στους υπολογισμούς. Πίνακας 2..9 Υπολογισθέντες Συντελεστές Συσχέτισης Spearman (r s ) και τα επίπεδα σημαντικότητας τους (α=0,05, 0,0) grade, grade/στάδιο n r «a=0,05 a=0.0 Συμπέρασμα grade I 9 0,50 Μη σημαντικός grade II 3 0,73 * * Πολύ σημαντυϊός grade III 8 0,55 * Σημαντικός grade I/Stage Ta 8 0,48 Μη σημαντικός grade Il/Stage Ta 23 0,66 * * Πολύ σημαντικός grade Il/Stage Tl 8 0,64 * Σημαντικός grade Ill/Stage T2 0 0,65 * - Σημαντικός Τα πιο πάνω δεδομένα δείχνουν ότι σε όλες τις περιπτώσεις, εκτός από εκείνες του grade Ι και grade Ι/στάδιο Ta, όπου η έλλειψη συσχέτισης οφείλεται 55

73 Σχ. 2.. Διάγραμμα διασποράς για το Grade Ι με συντελεστή συσχέτισης r s =0,50 Σχ Διάγραμμα διασποράς για το Grade Π με συντελεστή συσχέτισης r s =0,73 Qfi e \t. * I ) : Σχ Διάγραμμα διασποράς για το Grade ΠΙ με συντελεστή συσχέτισης r s =0, Α * Η ι- Ο

74 5 0 Σχ Διάγραμμα διασποράς για το Grade Ι/στάδιο Ta με συντελεστή συσχέτισης Γ,=0, t } 50 { i Σχ Διάγραμμα διασποράς για το Grade ΙΙ/στάδιο Ta με συντελεστή συσχέτισης Γ,=0, Ι oi t 35 -i- 30 J 25 t 2θΙ Ι Ο Σχ Διάγραμμα διασποράς για το Grade ΙΙ/στάδιο ΤΙ με συντελεστή συσχέτισης r,=0, ι ι f 60 Ι 40 τ 20 τ Σχ Διάγραμμα διασποράς για το Grade ΙΙΙ/στάδιο Τ2 με συντελεστή συσχέτισης r s =0,65

75 στην ιδιαιτερότητα του δείκτη DNA, υπάρχει θετική συσχέτιση μεταξύ των τιμών των μετρήσεων του δείκτη DNA και της έκφρασης του PCNA. Ειδικότερα, η συσχέτιση είναι πολύ σημαντική στις περιπτώσεις του grade II και grade ΙΙ/στάδιο Ta και σημαντική στα grade III, grade Π/στάδιο ΤΙ και grade ΙΠ/στάδιο Τ2. Η θετική συσχέτιση στις πιο πάνω περιπτώσεις (σημαντικός και πολύ σημαντικός Συντελεστής Συσχέτισης Spearman) δηλώνει ότι οι τιμές της έκφρασης του PCNA αυξάνουν όταν αυξάνουν οι τιμές του δείκτη DNA, δηλαδή υπάρχει ομόρροπος μεταβολή των τιμών του δείκτη DNA και της έκφρασης του PCNA. 2.2 Στατιστική ανάλυση Στον πίνακα 2.2.a δίνονται τα ποσοστά των διπλοειδικών όγκων σε σχέση με το grade και το στάδιο του όγκου, όπως επίσης και τα αντίστοιχα ποσοστά των ανευπλοειδικών όγκων και των όγκων χαμηλής και υψηλής έκφρασης PCNA. Τα συνολικά ποσοστά ανεξαρτήτως grade και στάδιο είναι: διπλοειδικοί όγκοι 53,33% και ανευπλοειδικοί όγκοι 46,67%, χαμηλής έκφρασης PCNA 48,33% και υψηλής έκφρασης PCNA 5,67%. Η ανάλυση των δεδομένων του πίνακα με το κριτήριο ελέγχου χ έδειξε στατιστικά σημαντικές έως πολύ σημαντικές διαφορές των υπολογισθέντων ποσοστών μεταξύ των grades [διπλοειδικοί όγκοι - πολύ σημαντικές διαφορές (χ =6,268, D.F.=3, ρ=0,00), ανευπλοειδυχοί όγκοι - σημαντυχές διαφορές (χ =5,99, D.F.=2, ρ=0,05), όγκοι χαμηλής έκφρασης PCNA - πολύ σημαντικές διαφορές (χ =3,85, D.F =2, ρ=0,00) και όγκοι υψηλής έκφρασης PCNA - πολύ σημαντικές διαφορές (χ 2 =6,268, D.F.=3, ρ=0,00)]. Επίσης, η ανάλυση των δεδομένων του πίνακα με το κριτήριο ελέγχου χ έδειξε πολύ σημαντικές διαφορές των υπολογισθέντων ποσοστών μεταξύ των σταδίων (διπλοειδικοί όγκοι: χ =20,57, D.F.=5, ρ=0,00, ανευπλοειδικοί όγκοι: χ =6,268, D.F.=3, ρ=0,00, όγκοι χαμηλής έκφρασης PCNA: χ 2 =3,85, D.F.=2, ρ=0,00 και όγκοι υψηλής έκφρασης PCNA: χ 2 =22.457, D.F.=6, ρ=0,00). Η περιγραφική στατιστική παρουσίαση των μετρήσεων του δείκτη DNA και της έκφρασης του PCNA κατά grade δίνεται στον πίνακα 2.2.b, ο οποίος παρουσιάζει τις ακραίες τιμές των μετρήσεων (ελάχιστη και μέγιστη), τις μέσες τιμές, τη σταθερά απόκλιση (8.ϋ.=απόλυτο μέτρο διασποράς) και το συντελεστή μεταβλητικότητας ^.ν.=σχετικό μέτρο διασποράς (%) =(σταθερά απόκλιση/μέση τιμή) χ 00)]. 58

76 Πιν a Ποσοστά (%) των όγκων, διπλοειδικών και ανευηλοειδικών όγκων και χαμηλής και υψηλής έκφρασης PCNA, σε σχέση με το Grade και το στάδιο του όγκου Grade Stage * 2* 3* 4* 5* 6* 7* 8* 9* Ta , , ,00 Ι TI 00,00 00,00 II Ta , , , ,48 II TI , , , ,50 III Ta 00,00 00,00 III TI ,00 25, ,00 III T , , , ,00 III Τ3 00,00 00,00 III T3b 00,00 00,00 III Τ4 00,00 00,00 IV Τ2 00,00 00,00 IV T3a 00,00 00, , , ,33 3 5,67 8 * Στήλη : συνολικός αριθμός όγκων Στήλη 2: αριθμός διπλοειδικών όγκων Στήλη 3: εκατοστιαίο ποσοστό των όγκων της στήλης 2 σε σχέση με το συνολικό αριθμό των όγκων της στήλης Στήλη 4: αριθμός ανευπλοειδικών όγκων Στήλη 5: εκατοστιαίο ποσοστό των όγκων της στήλης 4 σε σχέση με το συνολικό αριθμό των όγκων της στήλης Στήλη 6: αριθμός όγκων χαμηλής έκφρασης PCNA Στήλη 7: εκατοστιαίο ποσοστό των όγκων της στήλης 6 σε σχέση με το συνολικό αριθμό των όγκων της στήλης Στήλη 8: αριθμός όγκων υψηλής έκφρασης PCNA Στήλη 9: εκατοστιαίο ποσοστό των όγκων της στήλης 8 σε σχέση με το συνολικό αριθμό των όγκων της στήλης Σημειώνεται ότι για τιμές του συντελεστή μεταβλητικότητας <5%, υπάρχει χαμηλή σχετική διασπορά, για τιμές του συντελεστή μεταβλητικότητας από 5% - 35%, υπάρχει μέτρια σχετυτή διασπορά και για τιμές του συντελεστή μεταβλητικότητας >35%, υπάρχει υψηλή σχετική διασπορά. 59

77 Από τον πίνακα 2.2.b φαίνεται ότι η σχετική διασπορά των μετρήσεων (συντελεστής μεταβλητικότητας) κατά grade και για τις τιμές του δείκτη DNA και της έκφρασης του PCNA είναι χαμηλού ή μετρίου μεγέθους. Πιν. 2.2.b Περιγραφική στατιστική παρουσίαση των μετρήσεων του δείκτη DNA και της έκφρασης του PCNA κατά grade του όγκου GRADE Ι Πλοειδία/'Εκφραση PCNA Αριθ. Ελάχ. Μέγ. Μέση S.D. C.V.. Σύνολο 9,00,00,00 GRADE Ι 2. Διπλοειδικοι 3. Ανευπλοειδικοί 9,00,00, Ι. Σύνολο 9,46 44,62 22,7,23 50,65 2. Χαμηλ. έκφρ. PCNA 7,46 23,00 6,95 4,39 25,90 3.Υ*ηλ. έκφρ. PCNA 2 36,28 44,62 40,45 5,90 4,58. Σύνολο 3,00 2,56,33 0,47 35,34 GRADE II 2. Διπλοειδικοι 3. Ανευπλοειδικοί 6 5,00,3,00 2,56,00,67 0,47 28,4. Σύνολο 3 9,86 83,08 35,6 20,59 57,82 2. Χαμηλ. έκφρ. PCNA 8 9,86 29,50 22,2 7,0 3,97 3.Υ»ηλ. έκφρ. PCNA 3 30,04 83,08 54,8 8,59 34,3. Σύνολο 8,00 2,97,60 0,64 40,00 GRADE III 2. Διπλοειδικοι 6,00,00,00 3. Ανευπλοειδικοί 2,6 2,97,89 0,58 30,69. Σύνολο 8 23,60 94,07 57,02 24,9 43,69 2. Χαμηλ. έκφρ. PCNA 4 23,60 28,20 26,30 2,25 8,55 3.Υφηλ. έκφρ. PCNA 4 3,42 94,07 65,79 20,9 3,78. Σύνολο 2,00,53,27 0,37 29,3 GRADE rv 2. Διπλοειδικοί 3. Ανευπλοειδικοί,00,53. Σύνολο 2 60,95 68,40 64,68 5,27 8,5 2. Χαμηλ. έκφρ. PCNA 3.Υφηλ. έκφρ. PCNA Ι 2 60,95 68,40 64,68 5,27 8,5 60

78 Η μέτρηση της περιεκτικότητας των κυττάρων σε DNA (δείκτης DNA) και της έκφρασης του PCNA έγιναν κάτω από τις ίδιες συνθήκες. Δηλ. και για τις δύο μεθόδους χρησιμοποιήθηκαν όγκοι κύστεως από τους ίδιους αρρώστους και η μέτρηση των δειγμάτων έγινε στον ίδιο αναλυτή ευχόνας. Επομένως, τα αποτελέσματα των μετρήσεων των δύο μεθόδων είναι συγκρίσιμα μεταξύ τους και μπορούν να αξιολογηθούν στατιστικά. Για τον καθορισμό της ποιότητας των μετρήσεων των δύο μεθόδων αξιολογήθηκαν στατιστικά οι 3 παρακάτω βασικές ιδιότητες των μεθόδων κατά Gilchrist (984):. Η αποτελεσματικότητα (Efficiency) 2. Η συνέπεια (Consistency) και 3. Η ευαισθησία (Sensitivity) Για τη στατιστική ανάλυση χρησιμοποιήθηκαν τα δεδομένα του πίνακα /. Αποτελεσματικότητα (Efficiency) Για να καθοριστεί ο βαθμός αποτελεσματυχότητας των δύο μεθόδων εξετάστηκαν τα επίπεδα "Συμφωνίας (Concordance)" και "Ασυμφωνίας (Discordance)" των δεδομένων που προκύπτουν από τις παράλληλες μετρήσεις (ζεύγη τιμών) των δύο μεθόδων. Ειδικότερα, εφαρμόστηκε το παρακάτω πρότυπο σύγκρισης των τιμών των μετρήσεων των δύο μεθόδων. Μέθοδος DNA Α, (0,9-,) Διπλοειδυχοί Α 2 (>,) Ανευπλοειδικοί Β! (<30%) Χαμηλ. Εκφρ. PCNA Συμφωνία (Concordance) (Α,Β,) Ασυμφωνία (Discordance) (Α,Β,) Μέθοδος PCNA Β 2 (>30%) Υψηλ. Εκφρ. PCNA Ασυμφωνία (Discordance) (Α,Β,) Συμφωνία (Concordance) (Α,Β,) Οι κυψέλες του παραπάνω πίνακα δηλώνουν: AiB t : περιπτώσεις που με τη μέθοδο DNA αναγνωρίζονται ως όγκοι διπλοειδυχοί και με τη μέθοδο PCNA ως όγκοι με χαμηλή έκφραση PCNA (Συμφωνία) ΑιΒ 2 : περιπτώσεις που με τη μέθοδο DNA αναγνωρίζονται ως όγκοι διπλοειδυχοί και με τη μέθοδο PCNA ως όγκοι με υψηλή έκφραση PCNA (Ασυμφωνία) 6

79 A 2 BJ: περιπτώσεις που με τη μέθοδο DNA αναγνωρίζονται ως όγκοι ανευπλοειδικοί και με τη μέθοδο PCNA ως όγκοι με χαμηλή έκφραση PCNA (Ασυμφωνία) Α 2 Β 2 : περιπτώσεις που με τη μέθοδο DNA αναγνωρίζονται ως όγκοι ανευπλοειδικοί και με τη μέθοδο PCNA ως όγκοι με υψηλή έκφραση PCNA (Συμφωνία) Οι παραπάνω εκφράσεις, δηλ. τα επίπεδα συμφωνίας και ασυμφωνίας μεταξύ των δεδομένων των μετρήσεων των δύο μεθόδων, δίνονται ποσοτικά (%) με τις παρακάτω δύο εξισώσεις (= Συντελεστές, C, Συμφωνίας και D, Ασυμφωνίας): (nll+n22) Ciwwi«(%) = x 00 ( ) και n (nl2 + n2) ϋ Α(Μιφων(α (%) = x 00 (2) n Όπου, nil: αριθμός περιπτώσεων στην κυψέλη ΑΒ του πίνακα Μ2: αριθμός περιπτώσεων στην κυψέλη ΑΒ2 του πίνακα η2: αριθμός περιπτώσεων στην κυψέλη Α2Β του πίνακα η22: αριθμός περιπτώσεων στην κυψέλη Α2Β2 του πίνακα (n = nll+nl2 + n2+n22) Ο πίνακας 2.2.c δίνει τους υπολογισθέντες συντελεστές συμφωνίας και ασυμφωνίας, που εκφράζουν ποσοτικά (%) τα επίπεδα Συμφωνίας (Concordance) και Ασυμφωνίας (Discordance) μεταξύ των μετρήσεων των δύο μεθόδων κατά grade και στάδιο του όγκου. Τα δεδομένα του πίνακα 2.2.c και το Σχήμα 2.2., που παρουσιάζει γραφικά τα δεδομένα του πίνακα, δείχνουν την αποτελεσματικότητα (Efficiency) των δύο μεθόδων. Παρατηρείται ότι, στην περίπτωση των εξετασθέντων grades/στάδια, όπου τα μεγέθη των δειγμάτων είναι μεγαλύτερα του ενός αρρώστου, το επίπεδο συμφωνίας (Concordance) των δεδομένων των μετρήσεων κυμαίνεται από 75% έως 90%. Δηλ., το επίπεδο ασυμφωνίας (Discordance) των δεδομένων των μετρήσεων των δύο μεθόδων κυμαίνεται από 0% έως 25%. Για τις υπόλοιπες περιπτώσεις των grades/στάδια, όπου τα μεγέθη των δειγμάτων των ασθενών είναι ίσα με τη μονάδα, η ασυμφωνία (Discordance) των δεδομένων των μετρήσεων μεταξύ των δύο μεθόδων φθάνει το 00%. 62

80 / Πίνακας 2.2.c Υπολογισθέντες Συντελεστές Συμφωνίας (CJJ^BVÎO) και Ασυμφωνίας (^Ασυμφωνία) (%) μεταξύ των μετρήσεων των δόο μεθόδων κατά grade και στάδιο του όγκου GRADE GRADE I Στάδιο Ta A,B, nil 6 A,B 2 nl2 2 A 2 B, n2 A,B 2 n22 AjBi+A 2 B 2 Caou*Dvfa 6 75% AiB2+A2B, I*Aouu»«evia 2 25% n 8 00% GRADE II Ta % 3 3% 23 00% GRADE III Ta 00% 00% GRADE I TI 00% 00% GRADE II TI % 2 25% 8 00% GRADE III TI % 25% 4 00% GRADE III T % 0% 0 00% GRADE rv T2 00% 00% GRADE III T3 00% 00% GRADE IV T3a 00% 00% GRADE III T3b 00% 00% GRADE III T4 00% 00%

81 Λ * Ê S g é é é é ^ s é ^ g

82 GRADE/Στάδιο η Συμφωνία (Concordance) Ασυμφωνία (Discordance) I/Ta 8 75% 25% Il/Ta 23 87% 3% II/Tl 8 75% 25% III/Tl 4 75% 25% III/T2 0 90% 0% Συμφωνία GRADE/Στάδιο η (Concordance) I/Tl III/Ta III/T3 III/T3b III/T4 00% IV/T2 IV/T3a I 00% [ 00% 00% Ασυμφωνία (Discordance) 00% 00% 00% 2. Συνέπεια (Consistency) Για την αξιολόγηση της συνέπειας (Consistency) των δύο μεθόδων, διερευνήθηκαν οι διάφορες που παρατηρούνται στη συμπεριφορά των σειρών των μετρήσεων των δύο μεθόδων. Στα σχήματα παρουσιάζονται τα Διαγράμματα Εύρους (Range Charts) που δείχνουν τη διακύμανση των σειρών των μετρήσεων του δείκτη DNA και της έκφρασης του PCNA για επιλεγμένα grades και στάδια. Στα Σχήματα αυτά, η διαχωριστική περιοχή (Separation Area, SA) που διαμορφώνεται μεταξύ των δύο σειρών των δεδομένων (DNA και PCNA) παρουσιάζεται με κίτρινο χρώμα. Η περιοχή αυτή απεικονίζει την απόκλιση συμπεριφοράς μεταξύ των σειρών των μετρήσεων του δείκτη DNA και της έκφρασης του PCNA, από την οποία εκτιμάται η συνέπεια (Consistency) των δύο μεθόδων. 65

83 Q.C-OC- β. υ Ζ < J» > ι r ο F α. υ Ζ < i g i g s s s s «0 ΓΙ Ο S.«κ a e ο r Q Ζ <

84 S Λ ι αρ ο F α. ο % < Jj* l> F O Γ &. U Ζ < W σ* oo r~ vo «Λ 2» > ο = ο e Q Z <

85 Για την καλύτερη αξιολόγηση της συνέπειας, η διαχωριστική* περιοχή (Separation Area, SA) διαιρέθηκε σε δυο υπο-περιοχές, SA- και SA-2: SA-: η υπο-περιοχή αυτή βασίστηκε στις μετρήσεις του δείκτη DNA που αφορούν διπλοειδικούς όγκους (0,9-,) και τις αντίστοιχες μετρήσεις της έκφρασης του PCNA. SA-2: η υπο-περιοχή αυτή βασίστηκε στις υπόλοιπες μετρήσεις του δείκτη DNA που αφορούν ανευπλοειδικούς όγκους (>,) και τις αντίστοιχες μετρήσεις της έκφρασης του PCNA. Από το σύνολο των πιο πάνω Σχημάτων φαίνεται ότι για την υπο-περιοχή SA- υπάρχει ασυνέπεια (Inconsistency) στις μεταβολές των σειρών των μετρήσεων των δύο μεθόδων. Κάθε σειρά μετρήσεων παρουσιάζεται να έχει τη δική της συμπεριφορά. Αυτό οφείλεται στην ιδιαιτερότητα του δείκτη DNA, ο οποίος δεν παρουσιάζει διαφορές τιμών στις μετρήσεις για διπλοειδικούς όγκους, αλλά αντιθέτως εμφανίζεται πάντοτε με σταθερή τιμή και ίση με τη μονάδα. Αντίθετα, η έκφραση του PCNA δίδει ποσοτικές μετρήσεις, των οποίων οι μεταβολές αποτυπώνονται στα Σχήματα. Στην υπο-περιοχή SA-2 (ανευπλοειδυ^οί όγκοι), παρατηρείται κάποια συνέπεια ως προς την τάση των δύο σειρών μετρήσεων. Ωστόσο, υπάρχουν σημαντικές διαφορές στη συμπεριφορά των δύο σειρών όσον αφορά το μέγεθος των μεταβολών των μετρήσεων. Ειδικότερα, ο δείκτης DNA παρουσιάζει ένα στενό εύρος μεταβολής των τιμών των μετρήσεων (κόκκινο χρώμα), ενώ η έκφραση του PCNA παρουσιάζει ένα μεγάλο εύρος μεταβολής των τιμών των μετρήσεων (κίτρινο χρώμα). Συνέπεια των δύο μεθόδων υπάρχει, όταν το εύρος της περιοχής SA-2 μεταξύ των σειρών των μετρήσεων των δύο μεθόδων είναι μικρό. Αντίθετα δεν υπάρχει συνέπεια, όταν το εύρος της περιοχής SA-2 είναι μεγάλο. Στα πιο κάτω Σχήματα φαίνονται οι περιοχές σύγκλισης και απόκλισης των δύο σειρών των μετρήσεων, από τις οποίες παρατηρείται ότι από grade σε grade η SA-2 περιοχή μεγαλώνει και επομένως όσο αυξάνεται η κακοήθεια του όγκου τόσο μειώνεται ο βαθμός συνέπειας (Consistency) των δύο μεθόδων. 3. Ευαισθησία (Sensitivity) Για να αξιολογηθεί η ευαισθησία (Sensitivity) των δύο μεθόδων συγκρίθηκε η επί τοις εκατό μεταβολή κατά ασθενή των τιμών του δείκτη DNA με την αντίστοιχη μεταβολή κατά ασθενή της έκφρασης του PCNA. Η σύγκριση αυτή έγινε λαμβάνοντας υπόψη και τη σχέση grade/στάδιο του όγκου. 68

86 Για τον υπολογισμό του Συντελεστή Ευαισθησίας (Sensitivity Coefficient) ακολουθήθηκε η παρακάτω διαδικασία:. Προσδιορισμός της επί τοις εκατό μεταβολής κατά ασθενή (Ρ): Μεταβλητή-Χ (Variable-X): ορίζει τις τιμές του δείκτη DNA: Xm«: μέγιστη τιμή της Χ χ^: ελάχιστη τιμή της Χ Μεταβλητή-Υ (Variable-Υ): ορίζει τις τιμές του δείκτη PCNA: Ymax- μέγιστη τιμή της Υ y^: ελάχιστη τιμή της Υ η: ορίζει τον αριθμό των ασθενών PD (%) = χ 00 η Xmin (ymax - ymin) ρρ (ο /ο ) = Χ 0 0 η ymin Όπου, PD (%) και ΡΡ (%) εκφράζουν τις επί τοις εκατό μεταβολές κατά ασθενή των τιμών του δείκτη DNA και της έκφρασης του PCNA, αντίστοιχα. 2. Ο Συντελεστής Ευαισθησίας (SC P/D ) δίνεται από την πιο κάτω εξίσωση, η οποία εκφράζει τη σχέση των παραπάνω δύο μεγεθών: (SC P/D ) = ΡΡ (%) PD (%) Ο πίνακας δείχνει τους υπολογισθέντες Συντελεστές Ευαισθησίας (Sensitivity Coefficients) (SC P / D ) στα grades/στάδιο με αριθμό ασθενών επαρκή για την ανάλυση. Ο πίνακας και το Σχήμα 2.2.6, που απεικονίζει γραφικά τα δεδομένα του πίνακα, δείχνουν την ευαισθησία (Sensitivity) των δύο μεθόδων, η οποία έχει ως εξής: α) για όγκους χαμηλής έκτασης και κακοήθειας, grade I/Ta, η ευαισθησία της μεθόδου PCNA είναι απείρως μεγαλύτερη από εκείνη της μεθόδου DNA (τούτο οφείλεται στην ιδιαιτερότητα του δείκτη DNA), β) όσο αυξάνεται το grade, η έκταση και η κακοήθεια του όγκου, η διαφορά 69

87 στην ευαισθησία μεταξύ των δύο μεθόδων παρουσιάζει φθίνουσα τάση. Συγκεκριμένα, για grade Il/Ta όγκους η ευαισθησία της μεθόδου PCNA είναι 5,27 φορές μεγαλύτερη από τη μέθοδο DNA, για grade Π/ΤΙ όγκους η ευαισθησία της μεθόδου PCNA είναι 3,6 φορές μεγαλύτερη από τη μέθοδο DNA και για grade ΙΙΙ/Τ2 η ευαισθησία της μεθόδου PCNA είναι,69 φορές μεγαλύτερη από τη μέθοδο DNA. Πίνακας Υπολογισθέντες Συντελεστές Ευαιοθησίας SCp.D κατά Grade και Στάδιο του όγκου GRADE/S TAGE n *rain DNA-INDEX *max PD(%) ymin PCNA-INDEX ymax Pp(%) Συντιλεοτής Ευαισθησίας SCp,n GR-I/Ta 8.00,00 0,00,46 44,62 36,7 ( ) GR-II/Ta 23,00 2,30 5,65 9,86 77,40 29,78 5,27 GR-H/Tl 8,00 2,56 9,50 2,85 76,9 6,6 3,6 GR-III/T2 0,00 2,87 8,70 23,60 98,22 3,62,69 Ζχ Μεταβολές των Συντελεστών Ευαισθησίας (SOS κατά Grade και στάδιο του όγκου GR-I/Ti GR-n/Ta GR-Π/Τ! GR-III/T2 70

88 ΣΥΖΗΤΗΣΗ Οι καρκίνοι της κύστεως από μεταβατικό επιθήλιο αποτελούν μία ετερογενή ομάδα όγκων με απρόβλεπτη κλινική εξέλιξη (Whitmore, 978, Weinstein, 979). Σε ορισμένες περιπτώσεις ο όγκος μπορεί να εμφανίσει τοπική υποτροπή ή σε άλλες μπορεί να εξελιχθεί σε διηθητικό καρκίνο. Μέχρι ακόμα πρόσφατα η πρόγνωση των όγκων αυτών στηριζόταν στο βαθμό διαφοροποίησης και στο στάδιο του όγκου. Στην εργασία αυτή με βάση το βαθμό διαφοροποίησης (grade) οι περιπτώσεις διακρίθηκαν σε 4 ομάδες σύμφωνα με την ταξινόμηση κατά Bergkvist (965). Με grade Ι βρέθηκαν 9 περιπτώσεις (5%), με grade II 3 περιπτώσεις (5,67%), με grade III 8 περιπτώσεις (30%) και με grade IV 2 περιπτώσεις (3,33%). Παρόμοια αποτελέσματα αναφέρουν και οι Shiina, Igawa, Nagami και συν. (996). Όσον αφορά το στάδιο του όγκου και σύμφωνα με την ταξινόμηση κατά U.I.C.C. (979) οι όγκοι με στάδιο Τα και ΤΙ χαρακτηρίστηκαν ως επιφανειακοί και με στάδιο Τ2-Τ4 ως διηθητυχυί. Στο σύνολο των όγκων που εξετάστηκαν οι 45 (75%) όγκοι ήταν επιφανειακοί και οι 5 (25%) διηθητικοί. Αυτό έρχεται σε συμφωνία με τα αποτελέσματα που αναφέρουν οι Hattori, Uchida, Akaza και συν. (995) και οι Kruger και Muller (995) σε αντίθεση με τους Lipponen και Eskelinen (992), οι οποίοι βρήκαν διαφορετικό ποσοστό (50,6%) επιφανειακών και (49,4%) διηθητυχών όγκων. Όσον αφορά τη σχέση της διηθητυχότητας των όγκων με το βαθμό διαφοροποίησης των κυττάρων, στο grade Ι και II βρέθηκαν επιφανειακοί όγκοι στα 00% των περιπτώσεων, ενώ στο grade III και IV τα αντίστοιχα ποσοστά ήταν 28% και 0%. Τα αποτελέσματα αυτά δεν συμφωνούν με εκείνα άλλων ερευνητών, οι οποίοι έχουν βρει μεγάλο ποσοστό διηθητικών όγκων σε περιπτώσεις καρκίνων της κύστεως με grade II (Gustafson, Tribukait και Esposti, 982, Chin, Pontes και Frankfurt, 985). Όσον αφορά την κατανομή των διαφόρων σταδίων μέσα στα grades, το πιο συχνό στάδιο για το grade Ι και grade II ήταν το στάδιο Ta, για το grade III το στάδιο Τ2 και για το grade IV το στάδιο Τ2 και T3a σε ίση αναλογία. Από αυτό προκύπτει ότι, όσο αυξάνεται ο βαθμός διαφοροποίησης του όγκου (grade), δηλ. όσο περισσότερο τα καρκινικά κύτταρα διαφέρουν από τα φυσιολογυχά, τόσο αυξάνεται και η διηθητυχότητα του όγκου, άρα και ο βαθμός κακοήθειας γενυχότερα. 7

89 Ωστόσο η ταξινόμηση που βασίζεται σε μορφολογικά και κλινικά κριτήρια δεν είναι απόλυτα ικανοποιητική για την επαρκή περιγραφή της ετερογένειας και της βιολογικής συμπεριφοράς αυτών των όγκων. Ιδιαίτερα η εκτίμηση του βαθμού διαφοροποίησης χαρακτηρίζεται από μεγάλη υποκειμενικότητα και συνοδεύεται από αξιόλογες διαφορές που παρατηρούνται τόσο μεταξύ των εξεταστών, αλλά και μεταξύ εξετάσεων που γίνονται από τον ίδιο εξεταστή (Ooms, Anderson και Alons, 983, Kruger και Muller, 995). Έτσι με τον τρόπο αυτό δεν μπορεί να καθοριστεί με ακρίβεια η πρόγνωση της νόσου. Η ανάπτυξη των τεχνικών αυτοματοποιημένης κυτταρολογίας έχει προσφέρει νέες μεθόδους ποσοτικής και ανηκειμενικής εκτίμησης της βιολογικής συμπεριφοράς των διαφόρων νεοπλασμάτων. Η μέτρηση της περιεκτικότητας των κυττάρων σε DNA είναι μία από τις πρώτες εφαρμογές αυτών των τεχνικών. Ωστόσο στη βιβλιογραφία υπάρχουν αντιφατικά αποτελέσματα ως προς την αξία της χρησιμοποίησης της περιεκτικότητας των κυττάρων σε DNA ως προγνωστικού δείκτη. Συγκεκριμένα ο Levi και οι συνεργάτες του (969) βρήκαν ότι δεν υπάρχει σχέση μεταξύ της πλοειδυχότητας του DNA και του βαθμού διαφοροποίησης τωμ όγκων της ουροδόχου κύστεως. Επίσης ο Fossa και οι συνεργάτες του (993) δεν βρήκαν συσχέτιση της πλοειδικότητας του DNA με το στάδιο και την πρόγνωση των διηθητικών όγκων. 'Αλλοι όμως ερευνητές έχουν βρει ότι η συχνότητα της ανευπλοειδίας αυξάνεται με το grade και το στάδιο του όγκου (De Vita, Forte, Maggi και συν., 99, Goulandris, Karakitsos, Georgoulakis και συν., 996), ευρήματα με τα οποία τα αποτελέσματα της δικής μας εργασίας έρχονται σε συμφωνία. Επιπλέον, άλλοι συγγραφείς έχουν διαπιστώσει ότι η πλοειδία του DNA και κυρίως η εκτίμηση της S- φάσης έχει αξία στην πρόγνωση της επιβίωσης των αρρώστων, παρά την έλλειψη συσχέτισης με το grade και το στάδιο της νόσου (Tribukait, 984). θα πρέπει πάντως να σημειωθεί ότι ορισμένοι ερευνητές έχουν παρατηρήσει διαφορές στην πλοειδία των κυττάρων σε διαφορετικά τμήματα του ίδιου όγκου, πράγμα που χαρακτηρίζει την ετερογένεια όλων των νεοπλασμάτων και κατ' επέκταση και των όγκων της κύστεως (Lipponen, Eskelinen και Nordling, 99). Οι διχογνωμίες αυτές μεταξύ των ερευνητών οδήγησαν στην αναζήτηση άλλων δεικτών με βάση τους οποίους θα μπορούσε να εκτιμηθεί με μεγαλύτερη ακρίβεια ο βαθμός κακοήθειας της νόσου. Γενυχά, ο καρκίνος της κύστεως περιλαμβάνει ένα ευρύ φάσμα όγκων που κυμαίνεται από τους επιφανειακούς που χαρακτηρίζονται από βραδείς 72