ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΨΥΧΟΛΟΓΙΑΣ ΠΜΣ: «ΓΝΩΣΤΙΚΗ ΨΥΧΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ»

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΨΥΧΟΛΟΓΙΑΣ ΠΜΣ: «ΓΝΩΣΤΙΚΗ ΨΥΧΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ» Διερευνώντας τη σχέση μεταξύ εντερικού μικροβιώματος, στρες και συμπεριφοράς: ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ Αναστασία Χατζημέντωρ Επιβλέπουσα καθηγήτρια: Δέσποινα Τατά, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Θεσσαλονίκη, Ιούλιος

2 Περιεχόμενα 1. Εισαγωγή Μεθοδολογία Πρωτόκολλο της συστηματικής ανασκόπησης Στρατηγική αναζήτησης Κριτήρια Επιλογής Κριτήρια Αποκλεισμού Ποιοτική εκτίμηση των άρθρων Σύνθεση των δεδομένων από τα άρθρα Αποτελέσματα Η δυσβίωση του εντερικού μικροβιώματος ως αποτέλεσμα της έκθεσης σε στρες Τρόποι διερεύνησης απόκρισης μικροβίων στη φυσιολογία του ξενιστή Κύριες ομάδες βακτηρίων του εντερικού μικροβιώματος και η λειτουργικότητά τους Συνθήκες στρες και απόκριση του εντερικού μικροβιώματος Επίδραση του ψυχολογικού στρες στο μικροβίωμα Επίδραση του σωματικού στρες στο μικροβίωμα Μεταβολές στη συμπεριφορά και σωματικές παραμέτρους μετά από τη χορήγηση πρεβιοτικών, προβιοτικών και αντιβιοτικών παρουσία ή απουσία στρες Επιπτώσεις των πρεβιοτικών και προβιοτικών στη γνωστική λειτουργία Σωματικές, ενδοκρινικές και νευροχημικές επιδράσεις των πρεβιοτικών και προβιοτικών Επιπτώσεις των προβιοτικών και πρεβιοτικών στο ανοσοποιητικό σύστημα Επιπτώσεις των πρεβιοτικών και προβιοτικών σε συμπεριφορές που σχετίζονται με το συναίσθημα Επιδράσεις των αντιβιοτικών στη γνωστική λειτουργία και στη συμπεριφορά που σχετίζεται με το συναίσθημα και σε σωματικούς, ενδοκρινικούς και νευροχημικούς δείκτες Συζήτηση Το στρες επηρεάζει τη σύνθεση του εντερικού μικροβιώματος Τα προβιοτικά και τα πρεβιοτικά ως ψυχοδραστικές ουσίες Μετάφραση ερευνών πάνω σε ζώα εργαστηρίου Βιβλιογραφία Παράρτημα πινάκων

3 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η εντερική μικροχλωρίδα παίζει σημαντικό ρόλο στην αμφίδρομη επικοινωνία μεταξύ εντέρου και εγκεφάλου, μέσω πληθώρας μηχανισμών του ενδοκρινικού ανοσοποιητικού και νευρικού συστήματος. Οι εντερικοί μικροοργανισμοί απελευθερώνουν ουσίες όπως μεταβολίτες, τοξίνες και ορμόνες που μπορούν να επηρεάσουν τη διάθεση ενός ατόμου. Παράλληλα, η σύσταση του μικροβιώματος μπορεί να διαταραχθεί λόγω των ορμονών του στρες και της επαγόμενης φλεγμονώδους απόκρισης που προκαλεί η ενεργοποίηση του άξονα Υποθαλάμου- Υπόφυσης-Επινεφριδίων. Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η παρουσίαση των προτύπων απόκρισης του εντερικού μικροβιώματος σε ένα φάσμα στρεσογόνων συνθηκών, αλλά και των αλλαγών στη συμπεριφορά που παρατηρούνται ως απόκριση σε φαινόμενα δυσβίωσης και τροποποίησης του εντερικού μικροβιώματος. Πραγματοποιήθηκε μία συστηματική ανασκόπηση της σχετικής βιβλιογραφίας, η οποία περιλάμβανε έρευνες τόσο σε ζώα εργαστηρίου που εκτέθηκαν σε ποικίλες πειραματικές συνθήκες στρες όσο και σε ανθρώπους με ψυχικές διαταραχές που συνδέονται με μακροχρόνια έκθεση σε στρεσογόνες συνθήκες. Προκύπτει ότι η έκθεση σε στρες προκαλεί σημαντικές μεταβολές στην αφθονία και τη σύσταση των μικροοργανισμών στον εντερικό σωλήνα, και επηρεάζει τη μεταβολική τους δραστηριότητα. Σε συνθήκες σωματικού στρες, παρατηρήθηκε στις περισσότερες περιπτώσεις αύξηση στην αφθονία του φύλου Firmicutes και Bacteroidetes, κι αντίστοιχα, σε συνθήκες ψυχολογικού στρες, παρατηρήθηκε μείωση επί το πλείστον των ωφέλιμων γενών των φύλων Firmicutes (με πιο ενδεικτικό γένος το Lactobacillus) Actinobacteria και Proteobacteria. Επίσης, η χορήγηση πρεβιοτικών και προβιοτικών ουσιών που τροποποιούν το μικροβίωμα βελτιώνουν συμπεριφορές που εκδηλώνονται λόγω στρες, όπως ελλείμματα στη μνήμη, καταθλιπτικόμορφη και αγχώδη συμπεριφορά. Η μελέτη των μεταβολών του μικροβιώματος σε συνθήκες στρες θα συμβάλλει στη βαθύτερη κατανόηση του άξονα εγκεφάλου-εντέρου και μπορεί να βοηθήσει στην θεραπεία αγχωτικών διαταραχών μέσω της ανάπτυξης νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων. Λέξεις-κλειδιά: άξονας εγκεφάλου εντέρου, εντερικό μικροβίωμα, στρες, συμπεριφορά 2

4 SUMMARY Gut microbiome plays an essential role in the bidirectional communication between the brain and the enteric system, through a variety of mechanisms of the endocrine, immune and central nervous system. Enteric microbes release metabolites, toxins and hormones that can alter the mood, while stress hormones and the subsequent inflammatory response due to the activation of Hypothalamic-Pituary-Adrenal axis can disturb the composition of the gut microbiome. The aim of the present work is to assess existing evidence regarding the response of gut microbes under conditions of stress, as well as behavioural changes of individuals in response to alterations of their gut flora. To this end, a systematic review was conducted, in order to evaluate findings from preclinical studies in which various stress paradigms were applied, as well as human studies of psychological disorders associated with long-term exposure to stress conditions. Exposure to stress causes important changes in the abundance and composition of microorganisms in the gut and affects their metabolic activity. Under conditions of physiological stress, in most cases, the abundance of the phyla Firmicutes and Bacteroidetes increases, while under conditions of psychological stress, the abundance of the beneficial genera of the phyla Firmicutes (mainly, the genus of Lactobacillus), the Actinobacteria and Proteobacteria is reduced. Additionally, administration of prebiotics and probiotics, substances which modify the gut microbiome, improves stress-related behavioural deficits, such as memory deficits, anxiety and depression-like behaviours. Investigation of the gut microbiome alterations under stress conditions may contribute to a better understanding of the brain-gut axis and may lead to the development of more efficient therapeutic approaches for the treatment of stress-related disorders. Keywords: gut-brain axis, gut microbiome, stress, behaviour 3

5 1. Εισαγωγή Ο άνθρωπος, όπως και άλλα είδη, συμβιώνει με έναν τεράστιο αριθμό μικροοργανισμών, οι οποίοι ζουν στις διάφορες κοιλότητες που εντοπίζονται στο εσωτερικό περιβάλλον του οργανισμού, καθώς και στην εξωτερική επιφάνεια του σώματος. Οι μικροοργανισμοί αυτοί συνιστούν το ανθρώπινο μικροβίωμα (Shreiner, Kao, & Young, 2016). Υπολογίζεται ότι περίπου μικροοργανισμοί αποικίζουν συνολικά σχεδόν κάθε επιφάνειά του η οποία εκτίθεται στο εξωτερικό περιβάλλον, όπως είναι η στοματική και αναπνευστική οδός, ο γαστρεντερικός σωλήνας (κυρίως από το δωδεκαδάκτυλο και παρακάτω), η ουρογεννητική οδός και το δέρμα (Madigan, Martinko, & Parker, 2007). Ο ανθρώπινος οργανισμός διατηρεί μία σχέση αμοιβαιότητας με αυτούς τους μικροοργανισμούς, καθώς επιτρέπει να διαβιούν και να διατρέφονται στις επιφάνειές του. Ειδικότερα, το εντερικό μικροβίωμα αποτελεί το πιο πολυπληθές μικροβίωμα από όλα, περιέχοντας συνολικά μικροοργανισμούς. Ορίζεται ως το σύνολο γονιδίων των μικροβίων που υπάρχουν στο γαστρεντερικό σύστημα του ανθρώπου και είναι ευρέως γνωστό ως φυσιολογική μικροχλωρίδα. Το εντερικό μικροβίωμα δρα ευεργετικά στον ανθρώπινο οργανισμό καθώς ενισχύει το μεταβολισμό των πολύπλοκων υδατανθράκων στο έντερο, συμβάλλει στη βιοσύνθεση αρκετών βιταμινών (σύμπλεγμα βιταμινών Β, βιταμίνη Κ), ισχυροποιεί την άμυνα του οργανισμού και συμβάλλει στη διατήρηση της ομοιόστασης (Mentis, Gypas, & Mentis, 2013). Τα τελευταία χρόνια, ένας αυξανόμενος αριθμός ερευνών υποστηρίζει τη σημαντική επίδραση που ασκεί το εντερικό μικροβίωμα σε αρκετές πτυχές της ανθρώπινης φυσιολογίας. Μάλιστα, μελέτες έχουν δείξει ότι οι αλλαγές στη σύσταση των μικροβίων του εντέρου σχετίζονται με την παθογένεση εντερικών και μεταβολικών διαταραχών, όπως το σύνδρομο του ευερέθιστου εντέρου, ο διαβήτης και η παχυσαρκία (Kelly, Kennedy, Cryan, & Dinan, 2015). Σύμφωνα με πρόσφατα ερευνητικά δεδομένα, διαταραχές στο εντερικό μικροβίωμα συνδέονται και με την εμφάνιση ψυχιατρικών διαταραχών όπως η μείζων καταθλιπτική διαταραχή, οι αγχώδεις διαταραχές, αλλά και με την εμφάνιση διαταραχών του αυτιστικού φάσματος (Mayer, Savidge, & Shulman, 2014; Winter, Hart, Charlesworth, & Sharpley, 2018). Με βάση αυτά τα ευρήματα, οι ερευνητές υποστηρίζουν την ύπαρξη ενός άξονα αμφίδρομης επικοινωνίας μεταξύ εγκεφάλου - εντέρου στον οποίο σημαντικό ρόλο διαδραματίζει 4

6 το εντερικό μικροβίωμα (Kelly et al., 2015; Miller, 2018). Η σημασία του άξονα εγκεφάλου-εντέρου στη διατήρηση της ομοιόστασης αποτέλεσε εδώ και πολλά χρόνια κοινή άποψη πολλών επιστημόνων, με τον Ιπποκράτη να είναι ο πρώτος που ανέφερε ότι «όλες οι ασθένειες ξεκινούν από το έντερο» (Lyon, 2018). Η υπόθεση αυτή ενισχύθηκε από την ανίχνευση νευρορυθμιστικών ουσιών στον εντερικό σωλήνα, όπως νευροπεπτίδια και νευροδιαβιβαστές (π.χ., σεροτονίνη, παράγοντας GABA, νοραδρεναλίνη, ντοπαμίνη) (Holzer, 2016; Peter Holzer & Farzi, 2015), κάποιες από τις οποίες παράγονται από τα μικρόβια του εντέρου (Wang & Kasper, 2014). Η επιστημονική έρευνα στράφηκε προς τη μελέτη του εντερικού μικροβιώματος όταν, μέσω της πρόσφατης εφεύρεσης και χρήσης εργαλείων ανάγνωσης της αλληλουχίας του ανθρώπινου γονιδιώματος, αποκαλύφθηκε μία τεράστια ποικιλομορφία ειδών μέσα στο γαστρεντερικό σωλήνα (Weinstock, 2013). Η ποικιλότητα αυτή οδήγησε στον χαρακτηρισμό του εντερικού μικροβιώματος ως ένα οικοσύστημα με τις δικές του αλληλεπιδράσεις. Μάλιστα, από κάποιους θεωρήθηκε ως ένα ξεχωριστό «όργανο», λόγω της ανταπόκρισής του στα περιβαλλοντικά ερεθίσματα και της επικοινωνίας και αλληλεπίδρασής του με άλλα συστήματα, όπως το ανοσοποιητικό και το νευρικό σύστημα (Weinstock, 2013). Το ερευνητικό ενδιαφέρον επικεντρώνεται στη διερεύνηση της απόκρισης του εντερικού μικροβιώματος είτε σε φυσιολογικές συνθήκες είτε σε συνθήκες που διαταράσσουν την ομοιόσταση του οργανισμού (Dawson, Dash, & Jacka, 2016; Krueger & Opp, 2016; Voigt, Forsyth, Green, & Engen, 2016). Διαταραχή της ομοιόστασης παρατηρείται σε παθήσεις του γαστρεντερικού συστήματος (π.χ., σύνδρομο ευερέθιστου εντέρου, κολίτιδα, χρόνιες παθήσεις του ήπατος), ψυχικές και νευρολογικές διαταραχές (Mayer et al., 2014; Winter et al., 2018), αλλά, και σε παθολογικές καταστάσεις όπως, η παχυσαρκία και οι αλλεργίες (Mentis et al., 2013). Επιπλέον, οι επιστήμονες διερευνούν τα μοτίβα αλληλεπίδρασης του εντερικού μικροβιώματος με το στρες, και συγκεκριμένα με στρεσογόνες συνθήκες που έχουν σχέση είτε με την φυσιολογική λειτουργία του οργανισμού (σωματικό στρες) είτε με ψυχολογικούς παράγοντες (ψυχολογικό ή ψυχοκοινωνικό στρες) (Kelly et al., 2015). Πιο συγκεκριμένα, το σωματικό στρες συνιστά μία δυσάρεστη, αισθητηριακή και συναισθηματική υποκειμενική εμπειρία η οποία συνδέεται με πιθανή βλάβη σε κάποιον ιστό του σώματος ή αποτελεί απειλή για τη σωματική υγεία και ακεραιότητα του οργανισμού (Kogler et al., 2016; Peyron & Laurent, 2000; Price, 2000). 5

7 Καταστάσεις που πληρούν αυτά τα κριτήρια περιλαμβάνουν τον πόνο, την πείνα, το οξειδωτικό και το θερμικό στρες (Hylander & Repasky, 2019; Jose, Bhalla, & Suraishkumar, 2018). Το ψυχολογικό, ψυχοκοινωνικό ή συναισθηματικό στρες συνδέεται με καταστάσεις που απειλούν τη θέση του ατόμου στο κοινωνικό περιβάλλον, όπως η κοινωνική κριτική και διαμάχη/προστριβή με μέλη της ομάδας, ή με δυσάρεστες συνθήκες τις οποίες δυσκολεύεται να διαχειριστεί αποτελεσματικά. (Dayas, Buller, Crane, Xu, & Day, 2001; Kogler et al., 2016; Pruessner et al., 2010). Χαρακτηριστικά μίας στρεσογόνου κατάστασης αποτελούν η απουσία ελέγχου ως προς τη διαχείριση ενός στρεσογόνου παράγοντα, ο απρόβλεπτος χαρακτήρας του, και οι μη αποτελεσματικές στρατηγικές αντιμετώπισης του ατόμου (coping mechanisms) (Anisman & Merali, 1999). Παραδείγματα καταστάσεων ψυχολογικού στρες αποτελούν ο αποχωρισμός ή απώλεια κάποιου αγαπημένου προσώπου, η έκθεση σε βίαιη συμπεριφορά ή η απόρριψη στον επαγγελματικό χώρο (Wiley & Clarke, 2016). Ο όρος στρες σύμφωνα με τον Hans Selye, πρωτοπόρο ερευνητή o οποίος και εισήγαγε τον όρο, αναφέρεται σε μια εξειδικευμένη, ειδική απόκριση του σώματος σε κάποια πρόκληση που ασκείται στον οργανισμό (Selye, 1973). Ειδικότερα, η απόκριση σε ένα στρεσογόνο παράγοντα αποτελεί μία προσαρμοστική αντίδραση που αποσκοπεί στην επαναφορά της διαταραγμένης ομοιόστασης του οργανισμού στα φυσιολογικά επίπεδα (Sailesh & Srilatha, 2019). Η οδός ταχείας απόκρισης του οργανισμού σε μια στρεσογόνο συνθήκη περιλαμβάνει την ενεργοποίηση της συμπαθητικής μοίρας του αυτόνομου νευρικού συστήματος ( fight or flight response ). Συνιστά μία ταχύτατη αντίδραση που χαρακτηρίζεται από την έκκριση των ορμονών επινεφρίνης και νορεπινεφρίνης με αποτέλεσμα την αύξηση του μεταβολικού ρυθμού, της πίεσης του αίματος, του ρυθμού αναπνοής και της πρόσληψης οξυγόνου (Lucassen et al., 2014). Σε αντίθεση με τη συμπαθητική απόκριση, η οδός βραδείας δράσης περιλαμβάνει την ενεργοποίηση του άξονα Υποθαλάμου Υπόφυσης Επινεφριδίων (ΥΥΕ) και έχει ως τελικό προϊόν την απελευθέρωση γλυκοκορτικοειδών από τα επινεφρίδια (κορτιζόλη στον άνθρωπο, κορτικοστερόνη στα τρωκτικά). Ο άξονας ΥΥΕ ενεργοποιείται ως απόκριση σε σωματικούς ή ψυχολογικούς στρεσογόνους παράγοντες, αλλά μέσω διαφορετικών νευρικών κυκλωμάτων (Engelmann, Landgraf, & Wotjak, 2004; Godoy, Rossignoli, & Delfino-Pereira, 2018). Τα γλυκοκορτικοειδή αυξάνουν τις διαθέσιμες πηγές ενέργειας, προάγοντας τη γλυκονεογένεση, τη μετατροπή του γλυκογόνου σε γλυκόζη και τη λιπόλυση (Sailesh & Srilatha, 2019). Κατά τη στρεσογόνο απόκριση, 6

8 αναστέλλονται εσωτερικές λειτουργίες, όπως η πέψη, η ανάπτυξη και η αναπαραγωγή (Chrousos, 2009). Παράλληλα, ενεργοποιείται το ανοσοποιητικό σύστημα, καθώς κύτταρα της έμφυτης ανοσοποιητικής απόκρισης όπως τα μακροφάγα, απελευθερώνονται από το λεμφικό ιστό και τη σπλήνα και εισέρχονται στην κυκλοφορία του αίματος από όπου και μεταναστεύουν σε άλλους ιστούς (Mcewen, 2007; Sailesh & Srilatha, 2019; Κουνατιάδης, 2017). Επίσης, γνωστικές λειτουργίες όπως η μάθηση και η μνήμη ενισχύονται. Ένα πυκνό δίκτυο υποδοχέων κορτικοειδών, που εκφράζονται κυρίως στον ιππόκαμπο και το προμετωπιαίο φλοιό, έχει κυρίαρχο ρόλο στη ρύθμιση των επιπέδων έκκρισης των γλυκοκορτικοειδών μέσω ενός κυκλώματος αρνητικής ανάδρασης (Ann et al., 2011; Lucassen et al., 2014). Η ενεργοποίηση του άξονα ΥΥΕ, πέρα από τις προαναφερθείσες προσαρμοστικές επιπτώσεις, μπορεί να επιφέρει κόπωση, απώλεια μυϊκής μάζας, επιτάχυνση της γήρανσης, προβλήματα αναπαραγωγής όσο και καρδιαγγειακά προβλήματα (Chrousos, 2009). Επαναλαμβανόμενη ή παρατεταμένη ενεργοποίηση του άξονα ΥΥΕ συνδέεται με παθολογικές καταστάσεις όπως η κατάθλιψη, οι αγχώδεις διαταραχές και οι διαταραχές μετατραυματικού στρες, καθώς και γνωστικά ελλείμματα (Packard, Egan, & Ulrich-lai, 2016; Yuen et al., 2012). Η παρατεταμένη ενεργοποίηση του άξονα ΥΥΕ και η επακόλουθη αύξηση των επιπέδων των γλυκοκορτικοειδών έχει, επίσης, αρνητικές επιπτώσεις στο γαστρεντερικό σύστημα (Chrousos, 2009; Konturek, Brzozowski, & Konturek, 2011). Ειδικότερα, συνδέεται με την παθοφυσιολογία και συμπτωματολογία φλεγμονωδών διαταραχών του γαστρεντερικού συστήματος (π.χ., λειτουργική δυσπεψία, ελκώδης κολίτιδα, σύνδρομο του ευερέθιστου εντέρου) (Konturek et al., 2011; Niesler, Quigley, & Rajilić-stojanović, 2016). Στρες και εντερικό μικροβίωμα φαίνεται ότι συνδέονται. Σε προκλινικό επίπεδο, έχει παρατηρηθεί ότι τα αυξημένα επίπεδα στρες συνδέονται με μεταβολές στην αφθονία ορισμένων λειτουργικών ομάδων βακτηρίων στο εντερικό μικροβίωμα (Bercik et al., 2011; Sudo et al., 2004). Αυτό το φαινόμενο ονομάζεται δυσβίωση του εντερικού μικροβιώματος και περιλαμβάνει μεταβολές στην αφθονία αλλά και τη σύσταση των μικροοργανισμών στον εντερικό σωλήνα, καθώς και αλλαγές στη μεταβολική τους δραστηριότητα. Κατά κανόνα, συνοδεύεται από μείωση της βιοποικιλότητας στο εντερικό μικροβίωμα (Hawrelak, Hons, & Myers, 2004). Παράλληλα, η έκθεση σε στρες επηρεάζει και τη συμπεριφορά, όπως προκύπτει από την εμφάνιση γνωστικών ελλειμάτων και την εκδήλωση συμπεριφορών άγχους ή 7

9 κατάθλιψης σε ζώα εργαστηρίου. Αξίζει να σημειωθεί ότι οι αυτές οι συμπεριφορικές εκδηλώσεις λόγω έκθεσης σε στρες υποχωρούν με τη χορήγηση προβιοτικών ουσιών (Abdrabou, Osman, & Aboubakr, 2018; Kelly et al., 2015; Sun et al., 2018). Ως προβιοτικά ορίζονται «οι ζωντανοί οργανισμοί οι οποίοι, όταν χορηγούνται σε επαρκείς ποσότητες, έχουν ευεργετική δράση στην υγεία του ξενιστή» (Hill et al., 2015). Αποτελούν συχνά είδη του ανθρώπινου εντερικού μικροβιώματος και μπορούν να μεταβάλλουν τη σύσταση των κοινοτήτων του εντερικού μικροβιώματος και να καταστείλουν την ανάπτυξη και αύξηση των πληθυσμών των παθογόνων μικροβίων του (Plaza-Diaz, Ruiz-Ojeda, Gil-Campos, & Gil, 2019). Η χορήγησή τους συνδέεται με μείωση του άγχους σε ασθενείς με σύνδρομο χρόνιας κόπωσης και βελτίωση της διάθεσης σε συμμετέχοντες με αυτοαναφερόμενα συμπτώματα κατάθλιψης. Οι θετικές επιδράσεις των προβιοτικών παρατηρούνται και σε υγιή άτομα, καθώς η χορήγησή τους συνδέεται με μειωμένα επίπεδα θυμού, επιθετικότητας, καταθλιπτικής διάθεσης και άγχους (Kane & Kinzel, 2018; Sarkar et al., 2016). Η διερεύνηση της αλληλεπίδρασης στρες και εντερικού μικροβιώματος αποτελεί μία συνεχή πρόκληση για την ερευνητική κοινότητα, όπως προκύπτει και από την έντονη επιστημονική συγγραφική δραστηριότητα για τη μελέτη και κατανόηση του φαινομένου αυτού (Foster, Rinaman, & Cryan, 2017). Η έρευνα σχετικά με τις επιπτώσεις των φαινομένων δυσβίωσης του εντερικού μικροβιώματος στον οργανισμό μπορεί να συμβάλλει στην κατανόηση της αιτιοπαθογένεσης διαταραχών του γαστρεντερικού συστήματος. Ταυτόχρονα, υπάρχουν ψυχικές διαταραχές (κατάθλιψη, αγχώδεις διαταραχές) στις οποίες παρατηρούνται γαστρεντερικά συμπτώματα όπως αίσθηση «φουσκώματος», πόνου ή άλγους στην περιοχή του εντέρου, τα οποία θα μπορούσαν να συνδέονται με το εντερικό μικροβίωμα (Felice, Moloney, Cryan, Dinan, & Mahony, 2015; Kelly et al., 2015; Klukowski, 2015; Ma et al., 2019). Η έρευνα για τη σχέση εντερικού μικροβιώματος και στρες μπορεί να αποκαλύψει συνδέσεις και μηχανισμούς αιτιοπαθογένειας για παθήσεις του κεντρικού και του περιφερικού νευρικού συστήματος, όπως είναι η κατάθλιψη και το σύνδρομο του ευερέθιστου εντέρου, αντίστοιχα. Παράλληλα, μπορεί να συμβάλλει στον σχεδιασμό νέων θεραπειών με βάση τα προβιοτικά, για την αντιμετώπιση των διαταραχών που προαναφέρθηκαν. Αν και μεγάλο μέρος της γνώσης μας σχετικά με τις επιπτώσεις του στρες στο εντερικό μικροβίωμα προέρχονται από μελέτες σε ζώα εργαστηρίου, η μετάφραση των 8

10 προκλινικών ευρημάτων παρουσιάζει προκλήσεις. Ειδικότερα, στις προκλινικές έρευνες που πραγματοποιούνται για το εντερικό μικροβίωμα χρησιμοποιούνται συνήθως οργανισμοί στείροι μικροβίων. Η πρόκληση που παρουσιάζει η χρήση των συγκεκριμένων οργανισμών, είναι ότι, λόγω της παντελούς απουσίας μικροβίων από την αρχή της ζωής τους, παρατηρείται αυξημένη διαστολή και κινητικότητα του παχέος εντέρου, καθώς και σημαντικές ελλείψεις στο εντερικό ανοσοποιητικό σύστημα, οι οποίες είναι ικανές να προκαλέσουν από μόνες τους κρίσιμες αλλαγές στη λειτουργία και φυσιολογία του γαστρεντερικού σωλήνα, ανεξάρτητα από τους πειραματικούς χειρισμούς που εφαρμόζονται (Loan, Nguyen, Vieira-Silva, Liston, & Raes, 2015; Turner, 2018). Ωστόσο, αξίζει να επισημανθεί ότι η συμβολή των ευρημάτων της προκλινικής έρευνας είναι ιδιαίτερα σημαντική για την κατανόηση των αποκρίσεων του εντερικού μικροβιώματος σε μεταβολές του εξωτερικού του περιβάλλοντος. Σκοπός της παρούσας ανασκόπησης είναι η παρουσίαση των διαθέσιμων ερευνητικών δεδομένων όσον αφορά στη σχέση ανάμεσα στο εντερικό μικροβίωμα, το στρες και τη συμπεριφορά, με στόχο τη σύνθεση και την κριτική αποτίμησή τους. Προκειμένου να συμπεριληφθεί το συνολικό φάσμα των πιθανών στρεσογόνων παραγόντων, επιλέχθηκαν τόσο έρευνες που αφορούν σε ψυχολογικούς και σωματικούς στρεσογόνους παράγοντες, αλλά και ψυχικές διαταραχές, όπως η κατάθλιψη, οι αγχώδεις διαταραχές, και οι διαταραχές μετατραυματικού στρες. Στόχος της εργασίας ήταν να αποτυπωθούν τα πρότυπα απόκρισης του εντερικού μικροβιώματος και της σύστασής του σε ένα φάσμα στρεσογόνων συνθηκών, καθώς και πρότυπα συμπεριφοράς που παρατηρούνται ως απόκριση σε φαινόμενα δυσβίωσης. Για το λόγο αυτό, πραγματοποιήθηκε συστηματική βιβλιογραφική ανασκόπηση ερευνών που διεξήχθησαν είτε σε ζώα εργαστηρίου, μέσω της έκθεσής τους σε συγκεκριμένα πειραματικά πρωτόκολλα στρες, είτε σε ανθρώπους που έχουν εκδηλώσει συγκεκριμένες ψυχικές διαταραχές που συνδέονται με μακροχρόνια έκθεση σε στρες. 2. Μεθοδολογία 2.1 Πρωτόκολλο της συστηματικής ανασκόπησης Η ανασκόπηση της υπάρχουσας βιβλιογραφίας πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο για τη διεξαγωγή συστηματικών ανασκοπήσεων PRISMA (Preferred Reporting Items for Systematic Reviews and Meta-Analyses). Επίσης, βασίστηκε και 9

11 στο πρωτόκολλο SYRCLE (Systematic Review Protocol for Animal Intervention Studies) (Petticrew, Shekelle, Stewart, & Group, 2015; Vries, Hooijmans, Langendam, Luijk, & Leenaars, 2015), λόγω του ότι συμπεριλήφθηκαν στην ανάλυση και προκλινικές έρευνες. 2.2 Στρατηγική αναζήτησης Πραγματοποιήθηκε αναζήτηση στις ηλεκτρονικές βάσεις δεδομένων Scopus, PubMed και APA μέχρι το Δεκέμβριο του 2020, χωρίς όριο στην αρχική χρονολογία της αναζήτησης των άρθρων. Οι λέξεις-κλειδιά που χρησιμοποιήθηκαν για την αναζήτηση ήταν οι εξής: stress, gut microbiome, gut microbiota, behaviour. Συνολικά, 1688 άρθρα εντοπίστηκαν από την αναζήτηση στις ηλεκτρονικές βάσεις δεδομένων. Από αυτά, αφαιρέθηκαν 593 διπλότυπα άρθρα, με αποτέλεσμα να απομείνουν 1095 άρθρα. Στη συνέχεια, τέθηκαν κάποια κριτήρια επιλογής και αποκλεισμού για τα άρθρα. 2.3 Κριτήρια Επιλογής Στα κριτήρια επιλογής συμπεριλήφθηκε ο τύπος του μικροβιώματος, ο τύπος του άρθρου, το είδος των συμμετεχόντων και η θεματική του κάθε άρθρου. Ως μικροβίωμα επιλέχθηκε μόνο το εντερικό και όχι το μικροβίωμα κάποιας άλλης περιοχής του οργανισμού. Ως προς τον τύπο των άρθρων, αυτά ήταν είτε προκλινικές είτε κλινικές έρευνες. Όσον αφορά στις προκλινικές μελέτες, τα ζώα εργαστηρίου ήταν τρωκτικά ή πρωτεύοντα θηλαστικά. Τέλος, το αντικείμενο διερεύνησης του άρθρου περιλάμβανε, μεταξύ άλλων, την εφαρμογή κάποιου παράγοντα στρες ή χορήγηση προβιοτικών, πρεβιοτικών ή αντιβιοτικών ουσιών και την εξέταση μεταβολών στο εντερικό μικροβίωμα ή/και αλλαγών στη συμπεριφορά. Ειδικότερα, οι προαναφερθείσες αλλαγές εξετάστηκαν σε σχέση με τις συνθήκες ψυχολογικού και σωματικού στρες, αλλά και σε σχέση με ψυχικές διαταραχές που συνδέονται με το στρες, όπως η κατάθλιψη, οι αγχώδεις διαταραχές, και η διαταραχή μετατραυματικού στρες. 2.4 Κριτήρια Αποκλεισμού Από την ανάλυση, αποκλείστηκαν άρθρα που έχουν δημοσιευτεί σε αρπακτικά περιοδικά (Predators Journals), καθώς και ερευνητικό υλικό που χαρακτηρίζεται ως γκρίζα βιβλιογραφία, όπως ορίζονται και τα δύο από την ιστοσελίδα της Κεντρικής Βιβλιοθήκης του Α.Π.Θ. ( Επίσης, αποκλείστηκαν άρθρα τα οποία δεν πληρούσαν τις βασικές μεθοδολογικές αρχές ή περιείχαν ασάφειες στην περιγραφή του πειραματικού τους σχεδιασμού. Στα κριτήρια αποκλεισμού 10

12 συμπεριλήφθηκε και η γλώσσα συγγραφής του άρθρου με αποτέλεσμα άρθρα τα οποία δεν ήταν γραμμένα στην Αγγλική ή Ελληνική γλώσσα να μην συμπεριληφθούν στην ανάλυση. Όσον αφορά στο περιεχόμενο των άρθρων, εξαιρέθηκαν άρθρα τα οποία δεν αφορούσαν συνθήκη στρες, και στα οποία οι αλλαγές του εντερικού μικροβιώματος μελετήθηκαν σε σχέση με εναλλακτικές διατροφικές συνθήκες/χειρισμούς ή σωματική άσκηση. Ως αποτέλεσμα, η ανασκόπηση βασίστηκε τελικά σε 184 άρθρα από το σύνολο των 1095 μελετών. Μετά από μελέτη του κειμένου των 184 άρθρων, εξαιρέθηκαν άρθρα τα οποία αφορούσαν νευρολογικές ή σωματικές διαταραχές ή ακόμη που αναφέρονταν σε διαφορετικό τύπο μικροβιώματος. Το σύνολο των εργασιών που συμπεριλήφθηκαν εν τέλει στην ανάλυση ήταν 79 (Διάγραμμα 1). Από αυτές, οι 36 αφορούν στις επιπτώσεις μίας συνθήκης στρες στην αφθονία του εντερικού μικροβιώματος, ενώ οι 36 αφορούν στις μεταβολές που προκαλεί η χορήγηση προβιοτικών ουσιών στο εντερικό μικροβίωμα και τη συμπεριφορά οργανισμών που είτε εκτέθηκαν σε στρες είτε όχι. Επτά έρευνες αφορούν στη σχέση μεταξύ της κοινωνικής συμπεριφοράς με τη σύσταση του εντερικού τους μικροβιώματος. 2.5 Ποιοτική εκτίμηση των άρθρων Η ποιοτική εκτίμηση των άρθρων πραγματοποιήθηκε παράλληλα με την ανάγνωσή τους με σκοπό να αποκλειστούν δημοσιεύσεις με μεθοδολογικές ασάφειες ή αστοχίες. Για αυτό η μεθοδολογική αρτιότητα των ερευνών αξιολογήθηκε με βάση τις αρχές και οδηγίες του εργαλείου SYRCLE Risk of Bias tool το οποίο αποτελεί προσαρμογή του Cochrane s Risk of Bias tool για τις προκλινικές έρευνες (Hooijmans et al., 2014). 2.6 Σύνθεση των δεδομένων από τα άρθρα Λόγω της ετερογένειας μεταξύ των διάφορων ερευνών ως προς τα ποικίλα πειραματικά σχέδια που εφαρμόστηκαν, η σύνθεση των αποτελεσμάτων της ανάλυσης έχει αφηγηματικό χαρακτήρα. Τα δεδομένα που συλλέχθηκαν από κάθε δημοσίευση αφορούν: 1) τον τύπο στρες, 2) γενικές μεθοδολογικές πληροφορίες, οι οποίες, στην περίπτωση των προκλινικών μελετών, αφορούν στο είδος των ζώων εργαστηρίου, τη διάρκεια παρέμβασης, το μέγεθος του δείγματος, τις μετρήσεις που πραγματοποιήθηκαν (τύπος ιστού που συλλέχθηκε, τύπος ανάλυσης στο εντερικό μικροβίωμα, τύπος φυσιολογικών παραμέτρων που ελέγχθηκαν, είδος συμπεριφορικών δοκιμασιών), 4) τις μεταβολές στη σύσταση του εντερικού μικροβιώματος (τύποι λειτουργικών ομάδων βακτηρίων οι μεταβολές στη σύνθεση και την αφθονία τους), 5) τις μεταβολές στη συμπεριφορά ή τη γνωστική λειτουργία, καθώς και 6) ευρήματα 11

13 σε σχέση με επιπτώσεις στο ανοσοποιητικό σύστημα και σωματικές, ενδοκρινικές και νευροχημικές μεταβολές. Οι πληροφορίες αυτές καταχωρήθηκαν για κάθε άρθρο σε βάση δεδομένων του Microsoft Excel (Microsoft Excel, 2016). 12

14 Included Eligibility Screening Identification PRISMA 2009 Flow Diagram Άρθρα που έχουν συλλεχθεί από τις βάσεις δεδομένων του Scopus, PubMed (n = 1688) Σύνολο άρθρων μετά από αφαίρεση των διπλότυπων (n = 1095) Άρθρα που έχουν αποκλειστεί (n = 911) Γκρίζα βιβλιογραφία Γλώσσα συγγραφής Εναλλακτικές διατροφικές συνθήκες Σύνολο άρθρων που έχουν ελεγχθεί μέσω ανάγνωσης του τίτλου, περίληψης, λέξεων-κλειδιά (n = 209) Άρθρα που έχουν αποκλειστεί (n = 105) Νευρολογικές διαταραχές Σωματικές ασθένειες Άλλος τύπος μικροβιώματος Μεθοδολογικές ασάφειες Σύνολο άρθρων που έχουν αξιολογηθεί μέσω ανάγνωσης του κειμένου (n = 79) Διάγραμμα 1: Διάγραμμα Ροής της διαδικασίας της συστηματικής ανασκόπησης της βιβλιογραφίας με βάση το PRISMA statement ( 13

15 3. Αποτελέσματα 3.1 Η δυσβίωση του εντερικού μικροβιώματος ως αποτέλεσμα της έκθεσης σε στρες Ως δυσβίωση χαρακτηρίζονται οι αλλαγές στη σύσταση και τις μεταβολικές λειτουργίες του μικροβιώματος, όπως αλλαγές στην παραγωγή λιπιδίων βραχέας αλύσου (SCFAs - small chain fatty acids) ή άλλων νευροενεργών ουσιών (π.χ., νευροδιαβιβαστές, σεροτονίνη ή GABA) (Cresci, Clinic, Bawden, Intern, & Clinic, 2016; Strandwitz, 2019). Η δυσβίωση συνδέεται με δυσλειτουργία του εντερικού φραγμού λόγω της αυξημένης διαπερατότητάς του, καθώς και ενεργοποίηση του ανοσοποιητικού συστήματος (Das & Nair, 2019). Ένα κοινό εύρημα των ερευνών σε άτομα με διαταραχές της φυσιολογίας του εντέρου στα οποία διαπιστώνεται δυσβίωση, είναι η μείωση της βιοποικιλότητας του εντερικού σωλήνα και της αφθονίας ορισμένων λειτουργικών ομάδων των μικροβίων (Palma, Collins, Bercik, & Verdu, 2014). Η δυσβίωση μπορεί να περιλαμβάνει την απώλεια ωφέλιμων μικροοργανισμών στο εντερικό μικροβίωμα, με αποτέλεσμα την εξάπλωση παθογόνων ή εν δυνάμει επιβλαβών μικροοργανισμών ή/και τη διατάραξη της συνολικής μικροβιακής ποικιλότητας (Degruttola et al., 2016). Μπορεί να προκαλέσει δυσλειτουργίες στον εντερικό σωλήνα όπως είναι η αύξηση στη διαπερατότητα του εντερικού φραγμού, αλλαγές στη συνδεσμολογία, στα στρώματα της βλέννας και μείωση στα επίπεδα της ανοσοσφαιρίνης Α στο εντερικό βλεννογόνο του φραγμού (Zhu et al., 2020). Σε φαινόμενα δυσβίωσης παρατηρείται πιο συχνά αύξηση της αφθονίας του φύλου Proteobacteria και συγκεκριμένα της οικογένεια Enterobacteriaceae (Petersen & Round, 2014). Το συγκεκριμένο φύλο διαθέτει μία ποικιλία από παθογόνα γένη βακτηρίων (Mentis et al., 2013). Στις έρευνες στις οποίες εφαρμόζεται συνθήκη στρες (ψυχοκοινωνικό ή σωματικό), παρατηρούνται ενδείξεις δυσβίωσης στο εντερικό μικροβίωμα των συμμετεχόντων, όπως είναι η απώλεια της ποικιλότητας των ειδών ή/και η μείωση της αφθονίας ωφέλιμων βακτηρίων. Η εφαρμογή του στρες ταυτόχρονα συνδέεται με αλλαγές στη συμπεριφορά και στον εγκέφαλο των ατόμων, όπως αύξηση της αγχωτικής ή καταθλιπτικής διάθεσης, εξασθένιση των γνωστικών λειτουργιών, μείωση της νευρογένεσης και δενδριτική ατροφία στον ιππόκαμπο (Foster et al., 2017; Heim 14

16 & Binder, 2012; Martin, Osadchiy, Kalani, & Mayer, 2018; Yaribeygi, Panahi, Sahraei, & Johnston, 2017). Παρόλα αυτά, είναι δύσκολο να δοθεί μία ερμηνεία για το αν οι συμπεριφορικές και εγκεφαλικές αυτές μεταβολές προηγούνται της δυσβίωσης ή αν ακολουθούν τις αλλαγές στο μικροβίωμα (Palma et al., 2014). Δεν υπάρχει απόλυτη και καθολική συμφωνία ως προς το τι ορίζεται ως υγιές ή δυσβιοτικό εντερικό μικροβίωμα. Ωστόσο, υπάρχει μία σχετική συμφωνία ως προς τα χαρακτηριστικά ενός υγιούς κι ενός δυσβιοτικού εντερικού μικροβιώματος. Ως υγιές, θεωρείται ένα πολυποίκιλο μικροβίωμα τόσο σε σύσταση ειδών όσο και σε γονιδιακό περιεχόμενο. Μία πιθανή εξήγηση για αυτό είναι ότι η χαμηλή ποικιλότητα μπορεί να συνδεθεί με την απουσία σημαντικών μικροβιακών ειδών, τα οποία θα εξασφάλιζαν την ύπαρξη ενός υγιούς οικοσυστήματος στον εντερικό σωλήνα. Επιπρόσθετα, η ικανότητα ενός συστήματος να επανακάμψει μετά από κάποια διαταραχή (γνωστή ως σταθερότητα του συστήματος) (Βώκου, 2009), συνδέεται με την αυξημένη ποικιλότητα των ειδών του και θεωρείται ενδεικτική της καλής λειτουργίας του συστήματος (Karl et al., 2018). 3.2 Τρόποι διερεύνησης απόκρισης μικροβίων στη φυσιολογία του ξενιστή Τα άρθρα που μελετούν τη σχέση του εντερικού μικροβιώματος με τη φυσιολογία και τη συμπεριφορά των ζώων και του ανθρώπου, ακολουθούν συγκεκριμένα μεθοδολογικά πρότυπα για να διερευνήσουν την απόκριση του εντερικού μικροβιώματος. Οι μεθοδολογικές προσεγγίσεις που ακολουθούν διαφέρουν ως προς το χειρισμό των ζώων εργαστηρίου. Πρώτη μεθοδολογική προσέγγιση είναι η χρήση νεογέννητων τρωκτικών που είναι στείρα μικροβίων, τα οποία εκτρέφονται εξαρχής σε ένα περιβάλλον αποστειρωμένο, χωρίς μικρόβια. Οι ερευνητές παρατηρούν τη συμπεριφορά τους ή/και ορισμένους φυσιολογικούς δείκτες κι έπειτα εποικίζουν το εντερικό τους μικροβίωμα με επιλεγμένα βακτηριακά στελέχη, είτε με την από του στόματος χορήγηση είτε μέσω της διαβίωσης των οργανισμών σε μη αποστειρωμένο περιβάλλον (Neufeld, Kang, & Bienenstock, 2011). Σύμφωνα με τα ερευνητικά ευρήματα, παρατηρούνται σημαντικές διαφορές ανάμεσα σε τρωκτικά στείρων μικροβίων και σε αυτά που έχουν εποικιστεί. Ωστόσο σε αυτή τη μέθοδο υπάρχουν και κάποια μειονεκτήματα όπως είναι η δυσκολία που υπάρχει στη σωστή κι ολοκληρωτική αποστείρωση. Επίσης, στις μελέτες αυτές συνήθως τα τρωκτικά στείρα μικροβίων είναι μικρής ηλικίας, με αποτέλεσμα να είναι 15

17 δύσκολο τα ευρήματα που αφορούν αυτούς τους ανώριμους οργανισμούς να αναχθούν σε συμπεράσματα για την ενήλικη ζωή τους. Εναλλακτική μεθοδολογική προσέγγιση αποτελεί η χρήση υγιών ενήλικων τρωκτικών και η πρόκληση διαταραχής στο εντερικό τους μικροβίωμα μέσω ενός περιβαλλοντικού ή ενδογενούς παράγοντα με στόχο τη μετέπειτα παρατήρηση αλλαγών στη φυσιολογία και τη συμπεριφορά των ζώων (Chi, Bian, et al., 2017). Με βάση αυτή τη μεθοδολογική προσέγγιση, οι ερευνητές χορηγούν στα ζώα αντιβιοτικά συνήθως για 1-2 εβδομάδες ή πραγματοποιούν χειρισμούς στη διατροφή των ζώων, όπως χορήγηση διατροφής με υψηλή περιεκτικότητα σε λιπαρά ή προβιοτικά. Μειονέκτημα αυτής της μεθοδολογικής προσέγγισης είναι ότι η καταγραφή και αξιολόγηση των αλλαγών που επιφέρουν τέτοιου είδους χειρισμοί στον ξενιστή θα πρέπει να πραγματοποιούνται κατά τη διάρκεια ή αμέσως μετά την παρέμβαση καθώς η σύσταση των μικροβίων είναι ευμετάβλητη (Chi, Bian, et al., 2017). Τέλος, η διαταραχή του εντερικού μικροβιώματος μπορεί να επιτευχθεί μέσω της μεταφοράς περιττωμάτων, και ως εκ τούτου, εντερικών μικροβίων, από έναν οργανισμό με διακριτό συμπεριφορικό φαινότυπο, π.χ. επιθετική συμπεριφορά, σε έναν άλλο οργανισμό με διαφορετικό φαινότυπο. Στόχος είναι να διερευνηθεί αν είναι δυνατό να επηρεαστούν χαρακτηριστικά της συμπεριφοράς λόγω των μεταβολών στο εντερικό μικροβίωμα (Amato et al., 2020). 3.3 Κύριες ομάδες βακτηρίων του εντερικού μικροβιώματος και η λειτουργικότητά τους Η συστηματική ταξινόμηση των βακτηρίων περιλαμβάνει τις ακόλουθες ταξινομικές ομάδες: συνομοταξία ή φύλο (phylum), ομοταξία ή κλάση (class), τάξη (order), οικογένεια (family), γένος (genus) και είδος (species) (Alias, Lagier, Pontarotti, Raoult, & Fournier, 2015). Για διευκόλυνση, στην παρούσα εργασία δίνονται πληροφορίες μόνο για το ανώτατο επίπεδο διάκρισης, το φύλο. Από τα 50 γνωστά φύλα μικροβίων που υπάρχουν, μόνο τα 4 επικρατούν στους βλεννογόνους και στο δέρμα των ανθρώπων. Συγκεκριμένα τα μικρόβια των φύλων Firmicutes (με χαρακτηριστικά γένη τα Lactobacillus, Clostridium, Enterococcus), Bacteroidetes (με χαρακτηριστικά γένη τα Bacteroides), Actinobacteria και Proteobacteria. Αυτό αποτελεί ένδειξη ότι η φυσική επιλογή έχει περιορίσει τη μικροβιακή βιοποικιλότητα στο ανθρώπινο σώμα κατά τη διάρκεια των δεκάδων χιλιάδων χρόνων συν-εξέλιξης μικροοργανισμών και ανθρώπου (Alias et al., 2015). 16

18 Στην παρούσα εργασία πέρα από τα τέσσερα φύλα που προαναφέρθηκαν, έχουν καταγραφεί και δύο ακόμη και συγκεκριμένα τα φύλα Verrucomicrobia και Tenericutes (Πίνακας 1). Τα δύο τελευταία φύλα συναντώνται σε έρευνες που διεξάγονται σε μη-ανθρώπινους οργανισμούς. Γενικά, τα φύλα αυτά είναι δύσκολο να κατηγοριοποιηθούν ανάλογα με το αν έχουν θετική ή αρνητική επίδραση στον οργανισμό των ζωικών οργανισμών. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι κάθε φύλο έχει ένα μεγάλο ταξινομικό πλούτο, δηλαδή περιλαμβάνει πολλές επιμέρους ταξινομικές ομάδες, και αξίζει να αναφερθεί ότι η διαδικασία εντοπισμού νέων ειδών βρίσκεται ακόμη σε εξέλιξη (Wakita, Shimomura, Kitada, Yamamoto, & Ohashi, 2018). Ωστόσο, στην παρούσα εργασία επιχειρήθηκε να υιοθετηθεί μία αδρή ταξινόμηση έτσι ώστε να διευκολυνθεί η ερμηνεία των αποτελεσμάτων μας. Αρχικά, στο φύλο των Firmicutes υπάρχουν γένη όπως το γένος Lactobacillus και το γένος Ruminococcaceae που περιλαμβάνουν είδη με αντιφλεγμονώδη δράση, λειτουργούν ως προβιοτικά αλλά και ως ρυθμιστές της χοληστερόλης. Παράλληλα, περιλαμβάνονται οικογένειες, όπως τα Erysipelotrichaceae, που θεωρούνται ανοσογονικές (Kho & Lal, 2018). Έπειτα, τα βακτήρια τoυ φύλου των Actinobacteria συντελούν στην καταστολή των φλεγμονών, συμβάλλουν στην ωρίμανση του ανοσοποιητικού συστήματος και διαθέτουν είδη που λειτουργούν ως προβιοτικά (Thursby & Juge, 2017). Λαμβάνοντας υπόψη τα παραπάνω, είναι πιθανό η αυξημένη αφθονία τους να σχετίζεται με θετικές επιδράσεις για τον οργανισμό. Από την άλλη, το φύλο Proteobacteria διαθέτει παθογόνα στελέχη για τους ζωικούς οργανισμούς, με αποτέλεσμα η αύξηση στην αφθονία τους να θεωρείται αρνητική για τον οργανισμό (Fan & Pedersen, 2020). Το φύλο Verrucomicrobia συμβάλλει στην αποδόμηση της βλέννας στη βλεννογόνο του εντέρου και κάποια από τα στελέχη τους διαθέτουν αντιφλεγμονώδη δράση. Συνεπώς, η αυξημένη αφθονία των βακτηρίων αυτών στο εντερικό μικροβίωμα θα μπορούσε να θεωρηθεί ότι έχει από ουδέτερες έως θετικές επιδράσεις για τον οργανισμό, αν και η βιβλιογραφία που αφορά στο φύλο αυτό είναι περιορισμένη (Tailford, Crost, Kavanaugh, & Juge, 2015). Τέλος, το φύλο Bacteroidetes διαθέτει γένη όπως το γένος Flavobacteria και το γένος Porphyromonas, τα οποία αποτελούν ευκαιριακά παθογόνα. Επίσης, καταθλιπτικά άτομα έχουν αυξημένα επίπεδα του γένους Parapedobacter, και το γένος Bacteroides αποτελεί δείκτη ανθυγιεινούς διατροφής. Συνεπώς, αυξημένη αφθονία του φύλου Bacteroidetes στο εντερικό μικροβίωμα θα μπορούσε να χαρακτηριστεί ως αρνητική 17

19 για τον οργανισμό, αν και το ίδιο φύλο περιλαμβάνει και το γένος Prevotella που συνδέεται με μια ισορροπημένη και υγιεινή διατροφή (Thursby & Juge, 2017). Το φύλο Bacteroidetes, επίσης, έχει συνδεθεί με το μικροβίωμα ατόμων με διαταραχή ευερέθιστου εντέρου και διαβήτη τύπου 1 και 2 (Pittayanon et al., 2019; Rajili & Vos, 2014), αλλά και με προστατευτικές επιδράσεις για το κόλον (παχύ έντερο) και περιορισμό των φλεγμονών (Maltz et al., 2019). Για το φύλο Tenericutes δεν υπάρχουν ερευνητικά δεδομένα για το ρόλο του στη λειτουργία του στο έντερο μέχρις στιγμής. Συχνά ένα υγιές εντερικό μικροβίωμα σχετίζεται με την ύπαρξη μικροοργανισμών όπως αυτοί του γένους Bifidobacterium (φύλο Actinobacteria) και του γένους Lactobacillus (φύλο Firmicutes). Οι οργανισμοί αυτοί χρησιμοποιούνται ως προβιοτικά και έχουν ευεργετική δράση στον οργανισμό καθώς αυξάνουν την ανθεκτικότητά του έναντι των λοιμώξεων, ενισχύουν το ανοσοποιητικό σύστημα και προάγουν την παραγωγή βιταμινών και αντιμικροβιακών παραγόντων. Τα γένη Roseburia, Eubacterium, Faecalibacterium και Clostridium (φύλο Firmicutes) παράγουν βουτυρικό οξύ, ένα από τα λιπαρά οξέα βραχέας αλύσου, η παραγωγή του οποίου είναι ευεργετική για τον οργανισμό. Η αυξημένη παραγωγή βουτυρικού οξέος συντηρεί το προστατευτικό στρώμα βλέννας του εντέρου, είναι πηγή ενέργειας και καλής λειτουργίας για τα εντεροκύτταρα, παρεμποδίζει την εισβολή παθογόνων, βελτιώνει την απορρόφηση μετάλλων στο έντερο και βοηθάει στην αποκατάσταση της ισορροπίας των μικροβίων μετά από φαινόμενα δυσβίωσης (Canani et al., 2011). Ένα μη υγιές μικροβίωμα συνδέεται συνήθως με το φύλο Proteobacteria, οι μικροοργανισμοί του οποίου παράγουν προφλεγμονώδεις λιποπολυσακχαρίτες και στο οποίο συμπεριλαμβάνονται οικογένειες μικροοργανισμών που παράγουν τοξικό υδρόθειο (Kho & Lal, 2018; Shreiner et al., 2016). 3.4 Συνθήκες στρες και απόκριση του εντερικού μικροβιώματος Σύμφωνα με την ανασκόπηση, τα πιο συχνά αναφερόμενα φύλα που υπόκεινται σε μεταβολές της αφθονίας τους υπό συνθήκες στρες είναι με φθίνουσα σειρά: το φύλο Firmicutes, και ακολουθούν το φύλο Bacteroidetes, το φύλο Actinobacteria, το φύλο Proteobacteria και, τέλος, τα φύλα Verrucomicrobia και Tenericutes (Πίνακας 1). Σε συνθήκες στρες παρατηρείται αύξηση και μείωση της αφθονίας για τα ίδια φύλα. Για το φύλο Actinobacteria, σε μερικές έρευνες παρατηρείται αύξηση της αφθονίας τους (6 από τις 11 έρευνες), ενώ σε άλλες έρευνες παρατηρείται μείωση της 18

20 αφθονίας τους σε συνθήκες στρες (5 από τις 11 έρευνες). Το ίδιο παρατηρείται και για το φύλο Firmicutes για το οποίο αναφέρουν αύξηση στην αφθονία του 16 από τις 27 έρευνες, ενώ οι υπόλοιπες 11 αναφέρουν μείωση. Όσον αφορά στο φύλο Proteobacteria, οι 5 από τις 9 έρευνες αναφέρουν αύξηση στην αφθονία του σε συνθήκες στρες, ενώ οι υπόλοιπες 4 μείωση. Τέλος, για το φύλο Bacteroidetes 10 έρευνες από τις 16 αναφέρουν αύξηση, ενώ οι υπόλοιπες 6 αναφέρουν μείωση στην αφθονία του υπό συνθήκη στρες. Τα αντιφατικά αυτά ευρήματα των ερευνών μπορεί να οφείλονται στον τεράστιο ταξινομικό πλούτο που χαρακτηρίζει μέσα το κάθε φύλο βακτηρίων, στο οποίο ενυπάρχουν πολλά επιμέρους είδη με διακριτές λειτουργίες και επιδράσεις στον οργανισμό. Επομένως, κάτω από μία συνθήκη στρες, μπορεί να αυξηθεί η αφθονία για ορισμένα είδη του φύλου, λόγου χάριν, Firmicutes και για άλλα είδη που ανήκουν στο ίδιο φύλο να παρατηρηθεί μείωση της αφθονίας τους. Παρακάτω, ακολουθεί παρουσίαση των ευρημάτων σχετικά με τις επιπτώσεις του στρες στο μικροβίωμα διακριτά για κάθε είδος στρεσογόνων παραγόντων (ψυχολογικούς και σωματικούς) Επίδραση του ψυχολογικού στρες στο μικροβίωμα Τα τελευταία χρόνια αυξάνεται ο αριθμός των ευρημάτων που συνδέουν το ψυχολογικό στρες με αλλαγές στο εντερικό μικροβίωμα. Οι περισσότερες μελέτες σχετικά με τις επιπτώσεις των συνθηκών του ψυχολογικού στρες στο εντερικό μικροβίωμα προέρχονται από προκλινικές μελέτες σε ενήλικα τρωκτικά (Chunyu et al., 2019) (μύες-επίμυες), ενώ πολύ λιγότερες (6 δημοσιεύσεις) σε ανθρώπους (Lv et al., 2020). Σε πειραματικά σχέδια, τα οποία αφορούν σε ζώα εργαστηρίου, οι πιο συνήθεις συνθήκες πρόκλησης στρες, στην παρούσα ανασκόπηση ήταν το χρόνιο απρόβλεπτο ψυχολογικό στρες, το κοινωνικό στρες, ο περιορισμός κίνησης και η κοινωνική ήττα. Οι συνθήκες αυτές επάγουν συμπεριφορές άγχους, ενεργοποιούν το ΠΝΣ και τον άξονα ΥΥΕ, μεταβάλουν τη λειτουργία και τη διαπερατότητα του γαστρεντερικού σωλήνα και προάγουν την παραγωγή φλεγμονωδών κυτοκινών. Το μέγεθος των επιδράσεων εξαρτάται τόσο από συγκεκριμένα χαρακτηριστικά της εκάστοτε συνθήκης ψυχολογικού στρες όσο και από τη διάρκεια εφαρμογής του (Gareau, Silva, & Perdue, 2008). 19

21 Σε συνθήκες χρόνιου στρες περιορισμού, αλλά και απρόβλεπτου στρες παρατηρείται, γενικά, αύξηση στην αφθονία φύλων που έχουν συσχετισθεί με αρνητικές επιδράσεις στον οργανισμό, ενώ μειώνεται ο πληθυσμός των φύλων που θεωρούνται ευεργετικά για την εντερική μικροχλωρίδα. Πιο συγκεκριμένα, σε συνθήκες χρόνιου ψυχολογικού στρες περιορισμού σε τρωκτικά για 6 ημέρες παρατηρήθηκε αύξηση της αφθονίας στο φύλο Firmicutes, το οποίο έχει συνδεθεί σε προηγούμενες έρευνες με ύπαρξη εντερικής φλεγμονής, και μείωση αφθονίας στο φύλο Actinobacteria (συγκεκριμένα του γένους Bifidobacterium), το οποίο έχει χαρακτηριστεί ως επωφελές για τον οργανισμό (Galley, Parry, Ahmer, Fox, & Bailey, 2017). Σε άλλες έρευνες, εφαρμογή στρες περιορισμού για τρεις εβδομάδες προκάλεσε αύξηση στην αφθονία των βακτηρίων που ανήκουν στα φύλα Verrucomicrobia και Proteobacteria, των οποίων η αύξηση σχετίζεται με την εμφάνιση παθογένειας. Μείωση, επίσης, στην αφθονία του φύλου Actinobacteria, (συγκεκριμένα στο γένος Bifidobacterium του οποίου η αύξηση αφθονίας έχει συνδεθεί με αυξημένη ανθεκτικότητα σε χρόνιο στρες κοινωνικής ήττας) έχει παρατηρηθεί και σε εφαρμογή συνθήκης χρόνιου απρόβλεπτου ψυχολογικού στρες (διάρκειας 4 εβδομάδων) (Inserra, Choo, Lewis, & Rogers, 2019). Και στις δύο συνθήκες στρες (στρες περιορισμού και απρόβλεπτο στρες) τα ζώα εργαστηρίου εκδήλωσαν καταθλιπτικόμορφη συμπεριφορά και συμπεριφορά άγχους. Επίσης, παρατηρήθηκε μείωση στην αφθονία του γένους Lactobacillus (φύλο Firmicutes) σε μύες που είχαν εκτεθεί για 3 5 εβδομάδες σε χρόνιο απρόβλεπτο στρες. Το γένος Lactobacillus αποτελεί προβιοτικό μικροοργανισμό με θετικές επιδράσεις για τον άνθρωπο, όπως θα εξηγηθεί λεπτομερέστερα παρακάτω. Η αποκατάσταση των επιπέδων του Lactobacillus, μέσω της χορήγησης του είδους L. Reuteri, μείωσε την καταθλιπτικόμορφη συμπεριφορά των τρωκτικών (Bridgewater et al., 2017; Marin et al., 2017). Ωστόσο, έκθεση ποντικιών σε στρες κοινωνικής ήττας προκάλεσε αύξηση βακτηρίων του φύλου Firmicutes (γένος Lactobacillus και Clostridia), και παράλληλα τα ζώα αυτά εκδήλωσαν συμπεριφορά άγχους/κατάθλιψης. Το στρες κοινωνικής ήττας θα μπορούσε να παρομοιαστεί με τη συνθήκη εκφοβισμού (bullying) στους ανθρώπους. Στη συνθήκη αυτή, μικρόσωμοι αρσενικοί μύες τοποθετούνται στον ίδιο χώρο με μεγαλόσωμα αρσενικά τρωκτικά τα οποία λόγω του σωματικού τους μεγέθους μπορούν να τα εκφοβίσουν. Η αύξηση της αφθονίας του γένους Lactobacillus σε 20

22 συνθήκες στρες κοινωνικής ήττας μπορεί ίσως να αποτελεί έναν προστατευτικό μηχανισμό ενάντια στις αρνητικές επιδράσεις των αυξημένων επιπέδων των Clostridia (Chunyu et al., 2019). Παρόλα αυτά, η παρέμβαση χρονικά διήρκησε λίγες μέρες (12 μέρες). Το γένος Lactobacillus φαίνεται ότι βελτιώνει τη λειτουργία του ανοσοποιητικού συστήματος, περιορίζει τον αποικισμό του εντερικού σωλήνα με παθογόνα στελέχη και επιδρά ευνοϊκά στη φυσιολογία του γαστρεντερικού σωλήνα (Galley et al., 2014). Μείωση στην αφθονία του γένους Lactobacillus έχει παρατηρηθεί σε νεογνά πιθήκων που έχουν εκτεθεί σε προγεννητικό στρες ως αποτέλεσμα της έκθεσης των εγκύων μητέρων τους σε έντονο θόρυβο (Bailey, Lubach, & Coe, 2004). Πέρα από τα Το ψυχολογικό στρες επηρεάζει και άλλα φύλα του εντερικού μικροβιώματος. φύλα Firmicutes και Actinobacteria, επηρεάζεται και το φύλο Bacteroidetes. Μελέτες που εφαρμόζουν συνθήκη κοινωνικού στρες μέσω της εισαγωγής ενός επιθετικού αρσενικού μυός στο χώρο ενός μυός με παρόμοια/πανομοιότυπα χαρακτηριστικά αλλά μη επιθετική συμπεριφορά, αναφέρουν μείωση των επιπέδων αφθονίας των βακτηρίων του φύλου Bacteroidetes (γένος Parabacteroidetes), τα οποία έχουν προστατευτικές επιδράσεις για το κόλον (παχύ έντερο) και σχετίζονται με περιορισμό των φλεγμονών (Maltz et al., 2019). Η μείωση της αφθονίας εντερικών τάξων που έχουν ευεργετικές επιδράσεις για τον οργανισμό δείχνουν την δυσπροσαρμοστική επίδραση του κοινωνικού στρες στο εντερικό μικροβίωμα. Μείωση της αφθονίας του φύλου Bacteroidetes έχει παρατηρηθεί επίσης και σε συνθήκες προγεννητικού στρες περιορισμού σε τρωκτικά, με αντίστοιχες εκδηλώσεις συμπεριφορών, όπως μειωμένη κοινωνικότητα κατά την ενηλικίωση και αυξημένα επίπεδα κορτικοστερόνης μετά από κοινωνική επαφή, σε σχέση με τα τρωκτικά που δεν είχαν εκτεθεί σε αυτή τη συνθήκη (Bailey et al., 2012; Gur et al., 2019). Έχει παρατηρηθεί ότι σε νεογνά τρωκτικά τα οποία είχαν εκτεθεί προγεννητικά σε συνθήκη ενεργοποίησης του ανοσοποιητικού συστήματος της μητέρας τους, η χορήγηση βακτηρίων του είδους Bacteroides fragilis (φύλο Bacteroidetes) περιορίζει τις συμπεριφορικές επιπτώσεις σε σχέση με τα νεογνά στα οποία δεν θα χορηγούνταν αυτά τα βακτήρια (Hsiao et al., 2013). Οι σχετικές έρευνες σε ανθρώπους εξετάζουν τη συσχέτιση μεταξύ ομάδων του εντερικού μικροβιώματος και της εκδήλωσης κάποιας ψυχικής διαταραχής, όπως η μείζων καταθλιπτική διαταραχή (Lv et al., 2020), η διαταραχή μετατραυματικού στρες (Hemmings et al., 2017), η γενικευμένη αγχώδης διαταραχή (Yi-huan et al., 2019) και 21

23 η σχιζοφρένεια (Tanya T. Nguyen, Tomasz Kosciolek, Yadira Maldonado, 2020). Το τυπικό μικροβιακό προφίλ ανθρώπων με μείζονα καταθλιπτική διαταραχή (ΜΚΔ) χαρακτηρίζεται από αυξημένη αφθονία στα επίπεδα των βακτηρίων των φύλων Bacteroidetes, Proteobacteria και Actinobacteria και μειωμένα επίπεδα στο φύλο Firmicutes. Ωστόσο, δεν υπάρχει συμφωνία μεταξύ των ερευνών, καθώς σε ορισμένες μελέτες, άτομα με ΜΚΔ έχουν αυξημένα επίπεδα του φύλου Firmicutes, ενώ σε άλλες παρατηρούνται μειωμένα επίπεδα του φύλου Bacteroidetes (Lv et al., 2020). Οι μεταβολές στην αφθονία του εντερικού μικροβιώματος καταγράφονται συνήθως σε επίπεδο γένους, δηλαδή στη χαμηλότερη ταξινομική κλίμακα. Επομένως, είναι πιθανό τα αντικρουόμενα αποτελέσματα να οφείλονται στη μεγάλη ποικιλομορφία ειδών που υπάρχουν μέσα στα φύλα, με αποτέλεσμα σε κάποια να παρατηρείται αύξηση, σε κάποια μείωση, ενώ σε άλλα καμία σημαντική μεταβολή. Παρόλα αυτά, οι επιδράσεις του ψυχολογικού στρες στο ανθρώπινο εντερικό μικροβίωμα δεν έχουν ερευνηθεί επαρκώς. Μία από τις έρευνες αφορά στις μεταβολές που παρατηρήθηκαν στο εντερικό μικροβίωμα προπτυχιακών φοιτητών κατά τη διάρκεια μίας εβδομάδας εξετάσεων, μία τυπική συνθήκη στρες για τους φοιτητές. Σε αυτούς εντοπίστηκαν αυξημένα επίπεδα κορτιζόλης και αυξημένα επίπεδα του αυτοαναφερόμενου άγχους (μέσω χορήγησης ερωτηματολογίων καθημερινά) καθώς και μειωμένη αφθονία των βακτηρίων του γένους Lactobacillus (φύλο Firmicutes) στα κόπρανά τους (Knowles, Nelson, & Palombo, 2008). Ωστόσο, σε άλλη αντίστοιχη έρευνα δεν παρατηρήθηκε καμία σημαντική αλλαγή στη σύσταση του εντερικού μικροβιώματος των συμμετεχόντων (Kato-kataoka et al., 2016). Συμπερασματικά, τα αυξημένα επίπεδα ψυχολογικού στρες σχετίζονται με μείωση στην αφθονία φύλων βακτηρίων που κατά πλειοψηφία συνδέονται με θετικές επιδράσεις, όπως είναι το φύλο Firmicutes, το φύλο Actinobacteria, και οικογενειών του φύλου Bacteroidetes με ευεργετικές επιδράσεις για τον οργανισμό. Παρόλα αυτά, σε κάποιες έρευνες με εφαρμογή στρες παρατηρούνται και αντίθετα αποτελέσματα, όπως για παράδειγμα, αύξηση στην αφθονία του φύλου των Actinobacteria, το οποίο κατά κανόνα σχετίζεται με θετικές επιδράσεις στην υγεία του γαστρεντερικού συστήματος. Ωστόσο, μπορεί να συνδέεται με συγκεκριμένα είδη, όπως αυτά της οικογένειας Coriobacteriaceae, τα οποία συνδέονται με μεταβολικές διαταραχές (Na Zhang et al., 2017). Επομένως, τα αποτελέσματα πολλές φορές είναι αντικρουόμενα. 22

24 3.4.2 Επίδραση του σωματικού στρες στο μικροβίωμα Το σωματικό στρες μπορεί να οριστεί ως μία δυσάρεστη, αισθητηριακή και συναισθηματική υποκειμενική εμπειρία η οποία συνδέεται με πιθανή βλάβη σε κάποιον ιστό του σώματος ή αποτελεί απειλή για τη σωματική υγεία και ακεραιότητα. Συνθήκες που ικανοποιούν αυτά τα κριτήρια είναι ο πόνος, η πείνα, το οξειδωτικό στρες, η διαταραχή των κιρκάδιων ρυθμών του σώματος, η εξαντλητική άσκηση, καθώς και η μεταβολή της θερμοκρασίας του σώματος (Kogler et al., 2016). Οι περισσότερες έρευνες αφορούν σε πειραματικούς χειρισμούς σε τρωκτικά (Peterson et al., 2018) και λιγότερες σε ανθρώπους και πρωτεύοντα (2 δημοσιεύσεις) (Smith et al., 2019; X Zhang et al.,2020). Συνολικά, σε συνθήκες σωματικού στρες παρατηρείται μείωση της αφθονίας στα φύλα Actinobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes, και Proteobacteria (Πίνακας 1). Αρχικά, όσον αφορά στο σωματικό στρες λόγω εξαντλητικής άσκησης, τα ευρήματα στο εντερικό μικροβίωμα διαφέρουν μεταξύ των διαφόρων μελετών. Σε έρευνα εφαρμογής σωματικού στρες παρατηρήθηκε αύξηση στην αφθονία του φύλου Proteobacteria (φύλο με παθογόνα στελέχη) (F. Liu et al., 2019). Η εξαντλητική άσκηση μπορεί να επιφέρει αλλαγές στο εντερικό μικροβίωμα, αυξάνοντας τον πληθυσμό των παθογόνων βακτηρίων και ελαττώνοντας την αφθονία των προβιοτικών βακτηρίων. Αύξηση στην αφθονία των παθογόνων βακτηρίων παρατηρείται στις οικογένειες Erysipelotrichaceae (φύλο Firmicutes), Prevotellaceae (φύλο Bacteroidetes) και Coriobacteriaceae (φύλο Actinobacteria), οι οποίες συνδέονται με μεταβολικές διαταραχές (Na Zhang et al., 2017). Παρόλα αυτά, η εξαντλητική άσκηση στους ανθρώπους σχετίζεται με αύξηση της ποικιλότητας στο εντερικό μικροβίωμα και αύξηση ωφέλιμων ειδών του φύλου Firmicutes. Τα είδη αυτά συνδέονται με την παραγωγή βουτυρικού οξέος καθώς και με περιορισμό της φλεγμονής και του οξειδωτικού στρες. Ωστόσο, τα ευρήματα αυτά αφορούν στο εντερικό μικροβίωμα καλά προπονημένων αθλητών (Keohane et al., 2019). Από την άλλη, σε έρευνα σε ανθρώπους που είχαν υποβληθεί σε εξαντλητική άσκηση βρέθηκε μείωση στην αφθονία κυρίαρχων οικογενειών οι οποίες έχουν ευεργετική δράση, όπως η οικογένεια Bacteroidaceae (του φύλου Bacteroidetes) και η οικογένεια Lachnospiraceae (του φύλου Firmicutes) (Karl et al., 2021). 23