ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ο ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΦΩΤΟΜΕΤΡΙΑΣ ΚΑΙ ΧΡΩΜΑΤΟΜΕΤΡΙΚΩΝ ΑΝΑΛΥΣΕΩΝ

Transcript

1 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ο ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΦΩΤΟΜΕΤΡΙΑΣ ΚΑΙ ΧΡΩΜΑΤΟΜΕΤΡΙΚΩΝ ΑΝΑΛΥΣΕΩΝ Σύνοψη Στο κεφάλαιο αυτό γίνεται εισαγωγή στις πιο ευρύτερα χρησιμοποιούμενες μεθόδους στη κλινική χημεία, τις φωτομετρικές ή αλλιώς χρωματομετρικές αναλύσεις. Βασίζονται στην ιδιότητα του φωτός να απορροφάται από συγκεκριμένα έγχρωμα μόρια μέσα σε διαφανή διάλυμα. Το κεφάλαιο επεκτείνεται στην κατασκευή των καμπυλών αναφοράς και στον υπολογισμό των άγνωστων συγκεντρώσεων με τη χρήση γνωστών συγκεντρώσεων προτύπων διαλυμάτων. Περιγράφονται αναλυτικά πολλά διαφορετικά μαθηματικά μοντέλα υπολογισμού των αγνώστων συγκεντρώσεων, καθώς και τα σημαντικότερα σημεία των καμπυλών αναφοράς (π.χ. όριο ανίχνευσης). Τέλος, γίνεται εισαγωγή στην έννοια της αβεβαιότητας των μετρήσεων και στους σχετικούς στατιστικούς υπολογισμούς. Προαπαιτούμενες γνώσεις Το πρώτο κεφάλαιο του βιβλίου βασίζεται σε βασικές γνώσεις φυσικής και ιδιαίτερα οπτικής (απορρόφηση φωτός) και ηλεκτρομαγνητικού φάσματος. Θα χρειαστούν, αν και περιγράφονται αναλυτικά, βασικές γνώσεις στατιστικής π.χ. μέθοδος ελαχίστων τετραγώνων, συντελεστής συσχέτισης, μέση τιμή, τυπική απόκλιση κ.α. 1.1 Η φύση του φωτός Οι James Clerk Maxwell και ο Μax Planck, διατύπωσαν τις θεωρίες τους για τη φύση του φωτός, στις αρχές του 20 ου αιώνα, οι οποίες είναι αποδεκτές μέχρι σήμερα από την επιστημονική κοινότητα. 1.2 Η Ηλεκτρομαγνητική θεωρία του Μaxwell Το 1873 o Μaxwell διατύπωσε την ηλεκτρομαγνητική του θεωρία σύμφωνα με την οποία: «Κάθε χρονικά μεταβαλλόμενο ηλεκτρικό πεδίο δημιουργεί ένα αλληλένδετο μεταβαλλόμενο μαγνητικό πεδίο και αντίστροφα. Το ηλεκτρομαγνητικό πεδίο που δημιουργείται με τον παραπάνω τρόπο διαδίδεται στο χώρο με τη μορφή ηλεκτρομαγνητικών κυμάτων τα οποία, όπως παρατήρησε ο Maxwell, διαδίδονται με την ταχύτητα του φωτός. Συνεπώς, το φως είναι ηλεκτρομαγνητικό κύμα». Φως ονομάζεται η ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία που ανιχνεύεται από τον ανθρώπινο οφθαλμό. Το ορατό φως αποτελεί ένα μικρό μέρος της ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας. Τα μήκη κύματος που είναι ορατά στο ανθρώπινο μάτι κυμαίνονται από 400 έως 700 nm περίπου. Συνεπώς, μόνο ένα μικρό μέρος της ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας γίνεται αντιληπτό από τον άνθρωπο. Ο παρακάτω πίνακας (Πίνακας 1.1) δείχνει τα χρώματα που αντιλαμβάνεται η ανθρώπινη όραση, ανάλογα με το μήκος κύματος της εκπεμπόμενης ακτινοβολίας (Παπαϊωάννου & Πλαγεράς, 2012). Μήκος κύματος (nm) Χρώμα Υπεριώδες (δεν είναι ορατό) Ιώδες Μπλε Πράσινο Κίτρινο προς πορτοκαλί Πορτοκαλί προς κόκκινο πάνω από 700 Σχεδόν υπέρυθρο (δεν είναι ορατό) Πίνακας 1.1 Μήκη κύματος και το αντίστοιχο χρώμα που αντιλαμβάνεται ο άνθρωπος με την όρασή του. 1

2 Σημείωση: Ένα χρώμα, π.χ. κίτρινο, δεν συνεπάγεται και γνώση του μήκους κύματος της ακτινοβολίας (590 nm), αλλά μπορεί να οφείλεται σε περισσότερες της μιας ακτινοβολίες με μήκη κύματος μεταξύ 590 και 600 nm). Φυσικά, ανάλογα με τον αριθμό των ακτινοβολιών και τα μήκη κύματος θα λαμβάνουμε κίτρινο χρώμα, αλλά διαφορετικών αποχρώσεων. 1.3 Ηλεκτρομαγνητικό Φάσμα Σχήμα 1.1 Ηλεκτρομαγνητικό φάσμα. Περιοχή φάσματος Ακτίνες Χ Υπεριώδες Ορατό Εγγύς Υπέρυθρο Υπέρυθρο Άπω Υπέρυθρο Μικροκύματα Ραδιοσυχνότητες Μήκος Κύματος 0,3 100 Α nm nm 0,75 2,5μm 2,5 15 μm μm 0,2 7,0 mm m Πίνακας 1.2 Επιμέρους περιοχές του ηλεκτρομαγνητικού φάσματος. Όπως ήδη γίνεται φανερό, τα ηλεκτρομαγνητικά κύματα διαφέρουν τόσο ως προς τη συχνότητα, όσο και ως προς το μήκος κύματός τους. Το σύνολο των συχνοτήτων των ηλεκτρομαγνητικών κυμάτων αποτελούν το ηλεκτρομαγνητικό φάσμα. Στον Πίνακα 1.2 παρουσιάζονται οι επιμέρους ζώνες του ηλεκτρομαγνητικού φάσματος. 1.4 Η Θεωρία του Planck (Θεωρία των κβάντα) Η θεωρία του Maxwell δεν κατάφερε να ερμηνεύσει φαινόμενα που σχετίζονται με την αλληλεπίδραση του φωτός και την ύλη (π.χ. φωτοηλεκτρικό φαινόμενο). Ο Planck, το 1900, για να εξηγήσει την ακτινοβολία που παράγει ένα θερμαινόμενο σώμα διατύπωσε τη θεωρία των κβάντα φωτός. Σύμφωνα μ αυτή: 1. Κάθε ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία εκπέμπεται και απορροφάται από τα άτομα της ύλης όχι με συνεχή αλλά με μη συνεχή τρόπο. Δηλαδή κάθε άτομο εκπέμπει ή απορροφά στοιχειώδη ποσά ενέργειας (κβάντα φωτός ή φωτόνια). 2

3 2. Κάθε φωτόνιο μεταφέρει ενέργεια (Ε), η οποία υπολογίζεται από τη σχέση: E = h f, όπου h είναι η σταθερά του Planck (h = 6, J s). Σημείωση: Ο Εinstein, στηριζόμενος στη θεωρία του Planck, εξήγησε το φωτοηλεκτρικό φαινόμενο. Έτσι, η διπλή φύση του φωτός (κύμα και σωματίδιο) άνοιξε το δρόμο για την κατανόηση της συμπεριφοράς του μικρόκοσμου. 1.5 Η Φασματοσκοπία Όταν ένα σύστημα απορροφά ενέργεια, τότε διεγείρεται από τη βασική του κατάσταση σε μία διεγερμένη κατάσταση, ενώ, όταν από μία διεγερμένη κατάσταση επανέρχεται στη βασική ή σε μια άλλη ενδιάμεση ενεργειακή κατάσταση, τότε αποβάλλει ενέργεια. Έτσι, κάθε μεταπήδηση ηλεκτρονίων από μια ενεργειακή στάθμη σε μια άλλη (μέσα στα άτομα ή στα μόρια) και κάθε περιστροφική κίνηση και δόνηση ομάδων ατόμων και μορίων, έχει ως αποτέλεσμα την απορρόφηση ή την αποβολή ενέργειας. Οι ενεργειακές αυτές μεταβολές γίνονται με τη μορφή ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας με χαρακτηριστικό μήκος κύματος ή συχνότητα ανάλογα με το είδος της ηλεκτρονικής μετάπτωσης ή της μοριακής κίνησης. Η φασματοσκοπία ασχολείται με τον προσδιορισμό της συχνότητας ή του μήκους κύματος της απορροφούμενης ή εκπεμπόμενης ακτινοβολίας καθώς και με τον καθορισμό των σχέσεων και των νόμων που διέπουν τις μεταβολές αυτές. Η φασματοφωτομετρία είναι ένα τμήμα της φασματοσκοπίας, που μελετά τις ποσοτικές σχέσεις που διέπουν την ένταση της απορροφούμενης (ή εκπεμπόμενης) ακτινοβολίας και τους νόμους της απορρόφησης του φωτός. 1.6 Ο νόμος Lambert Beer Οι Lambert & Beer μελετώντας μονοχρωματικές ακτινοβολίες κατέληξαν στον παρακάτω νόμο (γνωστός και ως νόμος Beer Lambert), που αποτελεί την αρχή της φασματοφωτομετρίας: Σχήμα 1.2 Αναπαράσταση της απορρόφησης του φωτός σε κυβέττα με έγχρωμο διάλυμα. Η απορρόφηση (A) για σταθερό πάχος στοιβάδας (d) και ορισμένο μήκος κύματος φωτός είναι γραμμική συνάρτηση της συγκέντρωσης του διαλύματος (C) της ουσίας που απορροφά (Σχήμα 1.2). Συνεπώς: Α = -logτ = -log(i/i ο) = ε d C (Εξίσωση 1.1) Η διαπερατότητα (Τ) εκφράζεται σε % (Αν Τ = 0% τότε η Α = και αν Τ = 100% τότε η Α = 0). Η απεικόνιση της απορρόφησης (Α) σε συνάρτηση με το μήκος κύματος (λ) καλείται φάσμα απορρόφησης Οι προϋποθέσεις ισχύος του νόμου Lambert-Beer Γενικά θα πρέπει: τα διαλύματα να μην είναι πυκνά (0,1 < Α < 1), η ακτινοβολία να είναι μονοχρωματική, η κυψελίδα να έχει ομοιόμορφη διατομή, τα μόρια της διαλυμένης ουσίας να μην αντιδρούν μεταξύ τους, 3

4 η μέτρηση να γίνεται στο λmax (το μήκος κύματος μέγιστης απορρόφησης, χαρακτηριστικό για κάθε έ- νωση). 1.7 Το Φασματοφωτόμετρο Η μέτρηση της απορρόφησης του φωτός και η καταγραφή ενός φάσματος απορρόφησης, π.χ. στην περιοχή ορατού υπεριώδους (UV Vis), γίνεται με ειδικά όργανα, τα φασματοφωτόμετρα (Σχήμα 1.3). Σχήμα 1.3 Σχηματική παράσταση φασματοφωτόμετρου UV - Vis Τα κριτήρια επιλογής Φωτόμετρου Η επιλογή φωτόμετρου πραγματοποιείται με βάση τις ανάγκες του εργαστηρίου. Έτσι, όταν η χρήση του αφορά: ερευνητικούς σκοπούς: απαιτείται συνεχές φάσμα, μεγάλη ακρίβεια και επαναληψιμότητα, εξετάσεις καθημερινής χρήσης: απαιτείται ταχύτητα, επαναληψιμότητα, αυτοματοποίηση με φίλτρα, θερμοστατούμενη κυψελίδα, χρονόμετρο, μνήμη και καταγραφικό. Επίσης, θα πρέπει να λαμβάνονται υπόψη και άλλοι παράμετροι, όπως: ευκολία στη χρήση, όγκος, σχήμα, δυνατότητα συντήρησης κ.α Η διαδικασία της Φωτομέτρησης Γενικά πρέπει να ισχύουν τα παρακάτω: το διάλυμα που θα φωτομετρηθεί θα πρέπει να είναι σε ισορροπία. ο μηδενισμός του φωτόμετρου πραγματοποιείται με το τυφλό (blank) διάλυμα το οποίο περιέχει όλα τα αντιδραστήρια και έχει υποστεί την ίδια διαδικασία με το προς μέτρηση διάλυμα, δεν περιέχει όμως την ένωση που θέλουμε να προσδιορίσουμε. οι κυψελίδες που θα χρησιμοποιηθούν θα πρέπει να είναι ίδιες και καθαρές και κατάλληλες για το μήκος κύματος της μέτρησης (π.χ. στο υπεριώδες χρησιμοποιούνται κυψελίδες χαλαζία) Οι εφαρμογές της Φασματοφωτομετρίας Ο Ποιοτικός προσδιορισμός (ταυτοποίηση, ανίχνευση) Π.χ. Στα 280 nm πραγματοποιείται ανίχνευση πρωτεϊνών σε απομονωμένο DNA. 4

5 Ο Ποσοτικός Προσδιορισμός Ο ποσοτικός προσδιορισμός με Πρότυπο Διάλυμα Έστω ότι το πρότυπο διάλυμα Δ π έχει συγκέντρωση C π και η απορρόφησή του είναι ίση με Α π. Η απορρόφηση του άγνωστου διαλύματος Δ x συγκέντρωσης C x έστω ότι είναι ίση με Α x. Με εφαρμογή του νόμου των Lambert-Beer για τα δύο διαλύματα, έχουμε: Άγνωστο Διάλυμα: Αx = k l Cx (Εξίσωση 1.2) Πρότυπο Διάλυμα: A π = k l C π (Εξίσωση 1.3) Με διαίρεση κατά μέλη έχουμε: Αx / Aπ = Cx / Cπ Λύνοντας ως προς C x έχουμε: Cx = (Αx / Aπ) Cπ (Εξίσωση 1.4) Ο ποσοτικός προσδιορισμός με κατασκευή Πρότυπης Καμπύλης Χρησιμοποιούνται πρότυπα διαλύματα της ουσίας που θέλουμε να αναλύσουμε. Με φωτομέτρηση των πρότυπων διαλυμάτων λαμβάνουμε τις απορροφήσεις τους (Α i). Με γραφική παράσταση, σε σύστημα ορθογώνιων αξόνων, των ζευγών (Α i, C i) κατασκευάζεται η πρότυπη καμπύλη (Σχήμα 1.4). Σχήμα 1.4 Πρότυπη καμπύλη. 1.8 Φασματοφωτομετρικές μέθοδοι ανάλυσης στην κλινική βιοχημεία Στην κλινική βιοχημεία, όπως και στην αναλυτική χημεία, χρησιμοποιούνται διάφορες ενόργανες τεχνικές (Τietz, 1995ˑ Παπαϊωάννου & Πλαγεράς, 2012). Οι ενόργανες αναλύσεις διακρίνονται κυρίως σε: οπτικές μεθόδους, χρωματομετρικές μεθόδους, ηλεκτροχημικές μεθόδους, 5

6 φασματοσκοπία μάζας, υπέρυθρη φασματοσκοπία, φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR), μοριακές μεθόδους. Οι οπτικές μέθοδοι ανάλυσης περιλαμβάνουν κυρίως τις μεθόδους: φασματοφωτομετρία UV Vis, φασματοσκοπία εκπομπής, φλογοφωτομετρία, πολωσιμετρία, κ.α. 1.9 Η Φασματοφωτομετρία UV-Vis Στην πράξη το φως που χρησιμοποιείται στο φασματοφωτόμετρο επιλέγεται να είναι συγκεκριμένου μήκους κύματος λ. Όπως ήδη γνωρίζουμε, το ορατό φως αποτελεί τμήμα ενός μεγάλου αριθμού ηλεκτρομαγνητικών ακτινοβολιών που καλύπτουν ένα πολύ μεγάλο φάσμα μηκών κύματος. Το φάσμα του φωτός που αξιοποιείται στα βιοϊατρικά εργαστήρια, μπορεί να διακριθεί σε δύο περιοχές: 1. στην υπεριώδη περιοχή (ultraviolet ή UV) που είναι αόρατη στον οφθαλμό, με μήκος κύματος nm, 2. στην ορατή περιοχή (visible ή Vis) που είναι ορατή στον οφθαλμό, με μήκος κύματος ακτινοβολίας nm. Τα πιο συνηθισμένα φασματόμετρα που συναντώνται στα βιοϊατρικά εργαστήρια είναι τα φασματοφωτόμετρα ορατής-υπεριώδους ακτινοβολίας, που χρησιμοποιούν τα μήκη κύματος nm. Το φάσμα της μετρούμενης ουσίας δίνεται συνήθως ως διάγραμμα της απορρόφησης συναρτήσει του μήκους κύματος, όπως φαίνεται στο Σχήμα 1.5. Σχήμα 1.5 Τυπικό φάσμα στο UV Vis. 6

7 1.10 Η Βαθμονόμηση των οργάνων Συχνά ο όρος «Βαθμονόμηση» συγχέεται με τον όρο «Διακρίβωση», επειδή ο αγγλικός όρος είναι ο ίδιος «Calibration». Η βαθμονόμηση (calibration) ενός οργάνου, είναι μια απαραίτητη διαδικασία για τον έλεγχο της αξιοπιστίας του οργάνου (εκτός λίγων περιπτώσεων, π.χ. σταθμική ανάλυση και κουλομετρία). Για να γίνει βαθμονόμηση πρέπει να υπάρχει αναμφισβήτητη εμπειρική ή θεωρητική σχέση μεταξύ αναλυτικής παραμέτρου (σήματος) και συγκεντρώσεως ή ποσότητας (x). Η σχέση αυτή καλείται αναλυτική συνάρτηση ή συνάρτηση βαθμονόμησης (calibration function): y = g(x). Παραδείγματα αναλυτικής συνάρτησης: Ποτενσιομετρία (Εξίσωση Nernst): E (δυναμικό) = E σταθ + S log α = E σταθ + S log C (Εξίσωση 1.5) Πολαρογραφία (Εξίσωση ρεύματος διαχύσεως Ilkovic): I d (ρεύμα διαχύσεως) = 708 n D 1/2 C m 2/3 t 1/6 = k C (Εξίσωση 1.6) Φασματοφωτομετρία (Νόμος Lambert Beer): Α (απορρόφηση) = ε b C Φθορισμομετρία: F (ισχύς φθορισμού) = 2.3 Φ P o ε b c = k C (Εξίσωση 1.7) Φλογοφασματομετρία εκπομπής: P (ισχύς εκπεμπόμενης ακτινοβολίας) = k C (Εξίσωση 1.8) Υγρή και Αέρια Χρωματογραφία: Α (εμβαδόν κορυφής) = k C (Εξίσωση 1.9) Ανοσοχημική τεχνική: Logit y = a + log C (Εξίσωση 1.10) όπου: logit y = ln [y/(1-y)] και y = B/B o (B: σήμα προτύπου, Β o: σήμα μηδενικού προτύπου). Παρόλο που η ακριβής διαδικασία της βαθμονόμησης μπορεί να ποικίλλει από όργανο σε όργανο, αυτή γενικά περιλαμβάνει τη χρήση ενός οργάνου, το οποίο θα προσδιορίσει την ποσότητα μιας γνωστής ουσίας, γνωστής ποσότητας, η οποία θα βρίσκεται σε ένα ειδικό δείγμα που ονομάζεται «βαθμονομητής». Η βαθμονόμηση είναι η διαδικασία ρύθμισης των παραμέτρων ενός οργάνου, ώστε το αποτέλεσμα μιας εξέτασης - παραμέτρου για ένα συγκεκριμένο δείγμα (βαθμονομητής) να βρεθεί εντός ενός αποδεκτού εύρους τιμών. Τα αποτελέσματα της βαθμονόμησης χρησιμοποιούνται για να δημιουργηθεί μια σχέση μεταξύ της μεθόδου προσδιορισμού μίας ουσίας που χρησιμοποιείται από το όργανο και των γνωστών τιμών (π.χ. συγκεντρώσεων) αυτής. Με αυτό τον τρόπο, το όργανο μπορεί να παρέχει πιο ακριβή αποτελέσματα, όταν προσδιορίζει άγνωστα δείγματα. Για παράδειγμα, η μέτρηση της συγκέντρωσης της γλυκόζης σε ένα δείγμα βαθμονομητή πρέπει να δώσει ένα συγκεκριμένο εύρος τιμών, σύμφωνα με την τιμή στόχο και την τυπική απόκλιση, που μας δίνονται από την εταιρεία κατασκευής του βαθμονομητή Τα υλικά Βαθμονόμησης (Calibrators) 7

8 Οι βαθμονομητές είναι διαλύματα που προσομοιάζουν με τα προς ανάλυση δείγματα. Στην κλινική χημεία, είναι διαλύματα με βάση το βόειο ή το ανθρώπινο αίμα. Στο εμπόριο υπάρχουν είτε σε υγρή μορφή έτοιμα προς χρήση, είτε σε λυοφιλοποιημένη μορφή, οπότε θα πρέπει να ανασυσταθούν πριν τη χρήση τους. Πλεονέκτημα των βαθμονομητών σε υγρή μορφή είναι ότι χρησιμοποιούνται χωρίς καμία άλλη ανθρώπινη ενέργεια, όμως έχουν μικρή σχετικά ημερομηνία λήξης. Αντίθετα, οι βαθμονομητές σε λυοφιλοποιημένη μορφή χρειάζονται ανασύσταση, έχουν όμως μεγαλύτερη ημερομηνία λήξης. Σήμερα, καλύτεροι θεωρούνται οι βαθμονομητές με βάση το ανθρώπινο αίμα, διότι προσομοιάζουν περισσότερο με τα προς ανάλυση δείγματα Η Βαθμονόμηση των Ενόργανων μεθόδων Όλοι οι τύποι αναλυτικών μεθόδων, με δύο εξαιρέσεις (σταθμική ανάλυση και κουλομετρία), απαιτούν βαθμονόμηση. Η καμπύλη βαθμονόμησης (calibration curve), κατασκευάζεται με τη βοήθεια πρότυπων διαλυμάτων με ακριβώς γνωστές συγκεντρώσεις του αναλύτη (προσδιοριζόμενη ουσία). Τα διαλύματα αυτά μετρούνται (π.χ. φωτομετρούνται) και καταγράφεται η ένδειξη του οργάνου (π.χ. Ρ). Με τις μετρήσεις που λαμβάνονται σχεδιάζεται διάγραμμα της ένδειξης του οργάνου (Ρ) ως προς τη συγκέντρωση της προσδιοριζόμενης ουσίας (C). Συνήθως τα διαγράμματα που προκύπτουν είναι γραμμικά σε μια αρκετά μεγάλη περιοχή συγκεντρώσεων (δυναμική περιοχή - γραμμικότητα). Τα διαγράμματα αυτά είναι επιθυμητό να είναι γραμμικά, επειδή έτσι έχουμε λιγότερα σφάλματα σε σχέση με τις μη γραμμικές καμπύλες. Δεν είναι όμως ασυνήθιστο να προκύπτουν και μη γραμμικά διαγράμματα, τα οποία απαιτούν μεγαλύτερο αριθμό δεδομένων βαθμονόμησης (περισσότερα πρότυπα διαλύματα), για να εξακριβωθεί ακριβέστερα η σχέση μεταξύ της ένδειξης του οργάνου και της συγκέντρωσης. Συνήθως από την καμπύλη βαθμονόμησης προκύπτει μια εξίσωση με τη μέθοδο ελάχιστων τετραγώνων, ώστε να είναι δυνατός ο άμεσος υπολογισμός των συγκεντρώσεων των δειγμάτων Οι Καμπύλες Βαθμονόμησης Όπως ήδη αναφέρθηκε, οι μετρήσεις των ενόργανων τεχνικών αναλύσεως (εκτός από ολιγάριθμες περιπτώσεις) είναι σχετικές και απαιτούν τη βαθμονόμηση των οργάνων με πρότυπα ή διαλύματα προτύπων παραπλήσιας συστάσεως με τα δείγματα. Οι κυριότερες μέθοδοι βαθμονόμησης που χρησιμοποιούνται είναι: Η καμπύλη Αναφοράς (ή Πρότυπη καμπύλη) Η κατασκευή της καμπύλης αναφοράς πραγματοποιείται με τα ακόλουθα βήματα: 1. Παρασκευάζονται πρότυπα διαλύματα του μετρούμενου συστατικού, κατά το δυνατόν παρόμοιας συστάσεως με τα διαλύματα των προς προσδιορισμό δειγμάτων (ιονική ισχύς, ph, παρουσία διαφόρων ουσιών, ιξώδες. κ.α.) στη χρήσιμη αναλυτική περιοχή, και μετρούνται οι τιμές της αναλυτικής παραμέτρου. 2. Από τις μετρήσεις των πρότυπων διαλυμάτων κατασκευάζεται η καμπύλη αναφοράς, δηλαδή γραφική παράσταση της αναλυτικής παραμέτρου (Ρ) ως προς συγκέντρωση (ή ποσότητα συστατικού) των προτύπων διαλυμάτων (Σχήμα 1.6). Θα πρέπει πάντα να έχουμε υπόψη ότι η ισχύς της πρότυπης καμπύλης είναι συγκεκριμένης χρονικής διάρκειας (πολλές φορές μικρής) και συνεπώς θα πρέπει η μέτρηση των αγνώστων διαλυμάτων να γίνεται έ- γκαιρα. Στην περίπτωση που η γραμμικότητα της καμπύλης αναφοράς διέρχεται από το μηδέν, τότε είναι δυνατή η χρησιμοποίηση ενός μόνο πρότυπου διαλύματος, συγκεντρώσεως C s, οπότε η συγκέντρωση του αγνώστου C x υπολογίζεται από την Eξίσωση 1.4. Για όσες ενόργανες τεχνικές απαιτείται μηδενισμός της κλίμακας, αυτή γίνεται με τη βοήθεια του τυφλού διαλύματος. 8

9 Animation 1.1 Κατασκευή καμπύλης αναφοράς με τη βοήθεια πρότυπων διαλυμάτων Η μέθοδος Προσθήκης Γνωστής Ποσότητας (standard addition method) Βήματα εφαρμογής Εφαρμόζεται στις περιπτώσεις στις οποίες το μητρικό υλικό του δείγματος ασκεί μεγάλη επίδραση στη συνάρτηση βαθμονόμησης (στατιστικά διαφορετική κλίση b) και είναι αδύνατη η παρασκευή πρότυπων διαλυμάτων παρόμοιας συστάσεως με τα διαλύματα των αγνώστων, είτε διότι είναι άγνωστη η σύστασή τους, ή ποικίλλει από δείγμα σε δείγμα, είτε επειδή υπάρχουν ουσίες που παρεμποδίζουν. Απαιτείται γραμμική σχέση της καμπύλης βαθμονόμησης και υποχρεωτική διέλευσή της από αρχή αξόνων (a = 0). Κατά τη μέθοδο αυτή, μετρείται το διάλυμα του άγνωστου δείγματος και στη συνέχεια μετρείται το ίδιο ή άλλο τμήμα του διαλύματος του δείγματος, στο οποίο έχει προστεθεί μικρός όγκος πρότυπου διαλύματος, ώστε να προκαλέσει αύξηση της συγκεντρώσεως του συστατικού κατά ΔC (θεωρείται μικρή ή αμελητέα η αύξηση του όγκου του διαλύματος). Συνεπώς, χρησιμοποιείται σε εκείνες τις περιπτώσεις που ισχύουν τα παρακάτω: 1. Εάν η σχέση που συνδέει τη μετρούμενη φυσική/χημική παράμετρο P και τη συγκέντρωση C X της ουσίας X που μας ενδιαφέρει να προσδιορίσουμε, είναι αναλογική, δηλ. εάν P = k C X. 2. Εάν ο συντελεστής αναλογίας k επηρεάζεται έντονα από τη σύσταση του δείγματος (όλες οι άλλες ουσίες που υπάρχουν στο μετρούμενο διάλυμα) του δείγματός μας. 3. Εάν έχουμε να αναλύσουμε πολλά δείγματα με διαφορετική σύσταση ή έστω και ένα δείγμα αλλά με άγνωστη σύσταση, τότε είναι πρακτικά αδύνατη η χρησιμοποίηση καμπύλης αναφοράς. Σχήμα 1.6 Αναπαράσταση του πειράματος προσδιορισμού συγκέντρωσης. 9

10 Βήμα 1 ο Από το άγνωστο διάλυμα της ουσίας Χ, με άγνωστη συγκέντρωση C X, λαμβάνουμε γνωστό όγκο V X δείγματος με σιφώνιο (π.χ. V X = 10,00 ml) και τον μεταφέρουμε σε δύο μικρά ποτήρια ζέσεως (Δ 0 και Δ 1), όπως φαίνεται στο Σχήμα 1.7. Βήμα 2 ο Με ένα σιφώνιο μεταφέρουμε ακριβώς γνωστό όγκο V S πρότυπου διαλύματος της ουσίας Χ, συγκέντρωσης C S (π.χ. C S = 1000 μg X/ ml) στο ποτήρι Δ 1. Ο όγκος αυτός θα πρέπει να είναι πολύ μικρότερος [τυπικά το 1/100 ή ακόμη λιγότερο] από τον όγκο V X (π.χ. V S = 0,100 ml). Σχήμα 1.7 Αναπαράσταση μέτρησης της απορρόφησης σε φωτόμετρο. Βήμα 3 ο Μετρούμε με το όργανο τη φυσική/χημική παράμετρο P στο ποτήρι Δ 0, όπως φαίνεται στην παραπάνω εικόνα. Στην περίπτωσή μας, δεν ενδιαφέρει η τεχνική που χρησιμοποιούμε και το όργανο ανάλυσης, αρκεί να ισχύει η αναλογική σχέση μεταξύ του μετρούμενου μεγέθους και της συγκέντρωσης. Έστω ότι βρίσκουμε P 0 = 35,0. Βήμα 4 ο Μετρούμε με το όργανο την παράμετρο P στο ποτήρι Δ 1. Προφανώς θα είναι P 1 > P 0, αφού στο ποτηράκι Δ 1 βάλαμε επιπλέον ποσότητα της ουσίας Χ («γνωστή προσθήκη»). Έστω ότι τη βρίσκουμε P 1 = 61,0. Επειδή προσθέσαμε πολύ μικρό όγκο προτύπου στο ποτήρι Δ 1, ουσιαστικά η αραίωση ήταν αμελητέα και δεν διαταράξαμε τη σύσταση του δείγματος. Οπότε ο συντελεστής k είναι ο ίδιος και στις δύο μετρήσεις. Η «γνωστή» αύξηση της συγκέντρωσης ΔC X υπολογίζεται εύκολα και ως εξής: H ποσότητα της Χ που προσθέσαμε στο ποτήρι Δ 1 είναι V S C S. Αυτή αραιώθηκε σε τελικό όγκο: V X + V S, οπότε η «γνωστή» αύξηση της συγκέντρωσης είναι: ΔC 1 = (V S C S) / (V X + V S) (Εξίσωση 1.11) και επειδή V X >> V S, πρακτικά είναι: ΔC 1 = (V S C S) / V X (Εξίσωση 1.12) Με τις τιμές που έχουμε δώσει σαν παράδειγμα θα είναι: ΔC 1 = (V S C S) / V X = (0,100 ml) (1000 μg X/mL) / (20,00 ml) = 5,00 μg X/mL Τότε θα είναι: P 0 = k C X 10

11 P 1 = k (C X + ΔC 1) Από τις οποίες με διαίρεση κατά μέλη και επίλυση ως προς C x προκύπτει ότι: C x = [P 0 / (P 1 P 0)] / ΔC 1 (Εξίσωση 1.13) Αντικαθιστώντας τις πειραματικές τιμές, υπολογίζουμε τελικά την άγνωστη συγκέντρωση της ουσίας Χ στο δείγμα: C x = [35,0 / (61,0 35,0)] / (5,00 μg X/mL) = 6,73 μg/ml Ο Γραφικός Υπολογισμός Το παραπάνω αποτέλεσμα μπορεί να προκύψει και γραφικά (Σχήμα 1.8) ως εξής. Σχεδιάζουμε ένα διάγραμμα των τιμών της μετρούμενης παραμέτρου P ως προς τις τιμές ΔC X. Η προέκταση της ευθείας, η οποία ορίζεται από τα δύο πειραματικά σημεία (P 0, 0) και (P 1, ΔC 1), θα τμήσει τον άξονα των τιμών ΔC X σε σημείο (C) που αντιστοιχεί στην τιμή -C X. Σχήμα 1.8 Γραφική παράσταση της παραμέτρου P συναρτήσει του ΔC x. Η μέθοδος αυτή πρέπει να χρησιμοποιείται, όταν δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί κάποια καλύτερη τεχνική ποσοτικοποίησης. Γενικά, δεν είναι ιδιαίτερα ακριβής. Η γνωστή προσθήκη ΔC 1 δεν πρέπει να είναι ούτε μεγάλη, ούτε μικρή. Ιδανικά θα πρέπει η ΔC 1 να είναι στην περιοχή 0,5 C X < ΔC 1 < 1,5 C X. Συνεπώς τα όρια γραμμικότητας με τη μέθοδο αυτή είναι σχετικά περιορισμένα, οπότε υπάρχει ενδεχόμενο η μέτρηση της P 1 να πραγματοποιηθεί σε περιοχή συγκεντρώσεων της Χ, όπου δεν ισχύει πλέον η γραμμική σχέση, με αποτέλεσμα να έχουμε στη μέτρησή μας συστηματικά σφάλματα. Στο Σχήμα 1.10 παρουσιάζεται το σφάλμα που θα είχε το αποτέλεσμα της μέτρησής μας, αν οι τιμές P 0 και P 1 κυμαίνονταν γύρω από μια κεντρική τιμή. 11

12 Σχήμα 1.9 Σφάλμα μέτρησης λόγω κοντινών μετρήσεων Ρ 0 και Ρ 1. Από την παραπάνω γραφική παράσταση είναι προφανές πως μικρές σχετικά διακυμάνσεις στις τιμές P 0 μια P 1 δημιουργούν μια μεγάλη (σχετικά) διακύμανση στις τιμές C X Η μέθοδος των Πολλαπλών Προσθηκών Οι «πολλαπλές προσθήκες» αποτελούν μια βελτιωμένη εφαρμογή της μεθόδου προσθήκης γνωστής ποσότητας. Συχνά, αντί μίας γνωστής προσθήκης πραγματοποιούνται 2 ή 3 γνωστές προσθήκες για καλύτερη ακρίβεια και κυρίως για να είμαστε βέβαιοι ότι όλες οι μετρούμενες τιμές της φυσικής παραμέτρου (Ρ) βρίσκονται στο γραμμικό τμήμα της καμπύλης βαθμονόμησης (όλα τα σημεία θα βρίσκονται σε μία ευθεία). Στις περιπτώσεις αυτές προχωρούμε σε ανάλογο γραφικό υπολογισμό, όπως ανωτέρω. Το Σχήμα 1.11 παρουσιάζει την περίπτωση 3 γνωστών προσθηκών (ΔC 1, ΔC 2, ΔC 3). Σχήμα 1.10 Γραφική παράσταση της παραμέτρου P συναρτήσει του ΔCx με προσθήκη 3 γνωστών ποσοτήτων. 12

13 Από τη γραφική παράσταση του Σχήματος 1.10 με προέκταση της ευθείας μπορούμε να υπολογίσουμε και σε αυτή την περίπτωση τη ζητούμενη τιμή C X. Εναλλακτικά, μπορούμε να χρησιμοποιήσουμε τη μέθοδο των ελαχίστων τετραγώνων για τον υπολογισμό των συντελεστών α και b της εξίσωσης, που προσαρμόζεται στα πειραματικά σημεία: (0, P 0), (ΔC 1, P 1), (ΔC 2, P 2) και (ΔC 3, P 3) ως εξής: P = α ΔC + b (Εξίσωση 1.14) Από την οποία, για την τιμή P = 0, προκύπτει ότι: ΔC = C Χ = b / α (Εξίσωση 1.15) Η μέθοδος Παρεμβολής Χρησιμοποιείται, όταν η καμπύλη βαθμονόμησης δεν είναι γραμμική. πχ. στη φλογοφωτομετρία, όπου λόγω αυτο-απορρόφησης υπάρχει καμπύλωση προς τα κάτω. Για την κατασκευή της μη γραμμικής καμπύλης απαιτείται σχετικά μεγάλος αριθμός προτύπων. O υ- πολογισμός του αγνώστου γίνεται γραφικά, χρησιμοποιώντας το τμήμα της καμπύλης μεταξύ δυο σημείων / προτύπων που περικλείουν το σήμα του αγνώστου. Αυτό το τμήμα, χωρίς μεγάλο σφάλμα, θεωρείται γραμμικό. Εναλλακτικά, υπολογιστικά υπολογίζεται ως ακολούθως: Πρότυπο 1 με συγκέντρωση C 1 και απόκριση P 1 Πρότυπο 2 με συγκέντρωση C 2 και απόκριση P 2 Άγνωστο Χ με συγκέντρωση C x και απόκριση P x Ισχύει: (Ρ 2 - Ρ x) / (C 2 C x) = (P x P 1) / (C x C 1) C x = [C 1 (P 2 P x) + C 2 (P x P 1)] / (P 2 P 1) (Εξίσωση 1.16) Η μέθοδος της Μειώσεως κατά Γνωστή Ποσότητα Είναι παρόμοια με την προηγούμενη και διαφέρει μόνο κατά το ότι με την προσθήκη του προτύπου προκαλείται μείωση της συγκεντρώσεως του συστατικού κατά ΔC, λόγω στοιχειομετρικής αντιδράσεως, συμπλοκοποιήσεως ή καθιζήσεως. Χρησιμοποιείται κυρίως στην απόλυτη ποτενσιομετρία με εκλεκτικά ηλεκτρόδια ιόντων. Δίνονται και οι σχετικές εξισώσεις Η μέθοδος Κανονικοποίησης Χρησιμοποιείται στις χρωματογραφικές τεχνικές (π.χ. GLC, HPLC), για τον υπολογισμό της περιεκτικότητας των συστατικών ενός μείγματος. Χρησιμοποιούνται τα εμβαδά των κορυφών των συστατικών του δείγματος (κλάσμα εκάστου εμβαδού ως προς το συνολικό άθροισμα των εμβαδών): C = A i A i 100 (Εξίσωση 1.16) Στην περίπτωση που ο ανιχνευτής δεν παρουσιάζει την ίδια απόκριση για όλα τα συστατικά του μείγματος, είναι ανάγκη να υπολογισθεί για κάθε συστατικό ο πειραματικός παράγοντας απόκρισης F i ως προς ένα κύριο συστατικό (ουσία αναφοράς) χρησιμοποιώντας πρότυπα διαλύματα των ουσιών. Στην περίπτωση αυτή για τον υπολογισμό της περιεκτικότητας κάθε συστατικού λαμβάνονται τα μεγέθη F i A i και ΣF i A i: 13

14 F ι = Cι C ref (Εξίσωση 1.17) Aι A ref 1.14 Η εξίσωση Αναφοράς ή Συνάρτηση Βαθμονόμησης Η συνάρτηση βαθμονόμησης είναι η προσαρμογή (fitting) ενός κατάλληλου μαθηματικού μοντέλου στα διαθέσιμα πειραματικά δεδομένα (Σήμα Υ Συγκέντρωση C). Η περισσότερο εύχρηστη συνάρτηση βαθμονόμησης είναι η γραμμική (linear), που διέρχεται από την αρχή των αξόνων (origin) και είναι εφαρμόσιμη σε μία ευρεία δυναμική περιοχή συγκεντρώσεων. Σημειώνεται ότι στην πράξη εμφανίζονται αποκλίσεις από ιδανική γραμμή βαθμονόμησης, όπως: αποκλίσεις νόμου Beer (πυκνά διαλύματα, χημική ισορροπία σωματιδίων, παράσιτη ακτινοβολία), καμπύλωση στην ποτενσιομετρία ιοντικών αισθητήρων σε πυκνές συγκεντρώσεις), καμπύλωση στη φλογοφωτομετρία λόγω αυτο-απορρόφησης. Για την πλειονότητα των αναλυτικών τεχνικών, χρησιμοποιείται η γραμμική εξίσωση βαθμονόμησης: y = a + b x (Εξίσωση 1.18) όπου: y το αναλυτικό σήμα, x η συγκέντρωση προτύπων, a η τομή στον άξονα των y, b η κλίση Ο έλεγχος της Καμπύλης Βαθμονόμησης ή Αναφοράς Ο έλεγχος περιλαμβάνει τα παρακάτω σημεία: εάν είναι γραμμική ή όχι και, εάν όχι, ποιάς μορφής είναι; ποιά είναι η καλύτερη ευθεία που πρέπει να χαραχθεί; ποιά είναι η γραμμική περιοχή (περιοχή εργασίας); ποιό είναι το σφάλμα και τα όρια εμπιστοσύνης των παραμέτρων της τομής και της κλίσεως της ευθείας; ποιό είναι το σφάλμα και τα όρια εμπιστοσύνης στην προσδιοριζόμενη συγκέντρωση του αγνώστου που λαμβάνεται από την καμπύλη βαθμονόμησης; Σημείωση: Στη βαθμονόμηση χρησιμοποιείται η μονο-παραμετρική παλινδρόμηση ή προσαρμογή (univariate regression), που σημαίνει ότι οι μετρούμενες τιμές του αναλυτικού σήματος εξαρτώνται από μία μόνο ανεξάρτητη (χωρίς σφάλμα) μεταβλητή, τη συγκέντρωση προτύπων Η αρχή της μεθόδου της Παλινδρόμησης Είναι η εκτίμηση μιας εξαρτημένης μεταβλητής από μία άλλη που ονομάζεται ανεξάρτητη μεταβλητή. Η μέθοδος ή η διαδικασία αυτή καλείται παλινδρόμηση. Εάν θεωρήσουμε ότι μία εξαρτημένη μεταβλητή Υ θα εκτιμηθεί από μία ανεξάρτητη μεταβλητή Χ με βάση μια εξίσωση, η εξίσωση αυτή ονομάζεται εξίσωση παλινδρόμησης της Υ ως προς Χ. Η καμπύλη που παριστάνει την Υ συναρτήσει της Χ την ονομάζουμε καμπύλη παλινδρόμησης. Γενικά τα μοντέλα που μπορούμε να βρούμε είναι: Y = α + βx + ε (απλή γραμμική παλινδρόμηση, simple linear regression). 14

15 Y = α + β 1X β kx k + ε (πολλαπλή παλινδρόμηση, multiple regression). Y = α + β 1X + β 2X β kx + ε (πολυωνυμική παλινδρόμηση, multinomial regression) Η εκτίμηση της Ευθείας Παλινδρόμησης με τη Μέθοδο Ελαχίστων Τετραγώνων (Least Squares Method) Αποδεχόμαστε ότι οι τιμές x στερούνται σφάλματος (η παρασκευή προτύπων είναι πολύ ακριβής με σφάλματα τη τάξεως 0,1%, δηλαδή μικρότερα από τα μετρήσιμα σφάλματα). Οι τιμές x τοποθετούνται στον οριζόντιο άξονα. Οι τιμές y (αναλυτικό σήμα), είναι η εξηρτημένη μεταβλητή, και εμπεριέχουν σφάλμα. Τοποθετούνται στο κάθετο άξονα. Στόχος της μεθόδου ελαχίστων τετραγώνων είναι να υπολογισθούν εκείνες οι τιμές των παραμέτρων a, b1,, bm, για τις οποίες το μοντέλο θα έχει την καλύτερη προσαρμογή στα πειραματικά δεδομένα (xi yi). Για τις περισσότερες αναλυτικές τεχνικές η καμπύλη βαθμονόμησης (πρότυπη καμπύλη ή καμπύλη αναφοράς) περιγράφεται από μια ευθεία γραμμή (γραμμικό μοντέλο) και έτσι χρησιμοποιείται η γραμμική μέθοδος προσαρμογής ελαχίστων τετραγώνων (linear least square regression). Η σχέση μεταξύ κάθε ζεύγους παρατηρήσεων (x i, y i) παριστάνεται ως: yi = a +bxi + ei (Εξίσωση 1.19) Δηλαδή το σήμα y i συνίσταται από ένα καθορισμένο μέγεθος (a + bx i) που προβλέπεται από το γραμμικό μοντέλο και ένα τυχαίο συστηματικό (σφάλμα) e i. Στόχος της μεθόδου ελαχίστων τετραγώνων είναι να βρεθούν οι εκτιμήτριες (estimates) των αληθινών τιμών a και b. Αυτό πετυχαίνεται με τον υπολογισμό τιμών a και b, για τις οποίες το άθροισμα των τετραγώνων των αποκλίσεων (δηλαδή των e i) να γίνεται ελάχιστο: e 2 0 Μετά από επεξεργασία λαμβάνονται οι σχέσεις: b = n i (x i x )(y i y ) n i (x i x ) 2 = n n x n n i iy i i x i i y i n n x 2 n i i ( x i i ) 2 (Εξίσωση 1.20) a = y bx = n y i n 2 n i i x i i x i y i n n x 2 n i i ( x i i ) 2 (Εξίσωση 1.21) y = n i y i n (Εξίσωση 1.22) x = n i x i n (Εξίσωση 1.23) 1.18 Η γραμμική Καμπύλη Παλινδρόμησης με Διαστήματα Εμπιστοσύνης Στο Σχήμα 1.11 παρουσιάζεται η αβεβαιότητα μιας μέτρησης, λόγου προσδιορισμού της μέσω πρότυπης καμπύλης. 15

16 Σχήμα 1.11 Αβεβαιότητα μέτρησης Σύνοψη της πορείας της Προσαρμογής (Παλινδρόμησης) 1. Επιλογή του μοντέλου (συνήθως γραμμικό). 2. Υπολογισμός (εκτίμηση) των παραμέτρων του μοντέλου με τη μέθοδο των ελαχίστων τετραγώνων. 3. Αξιολόγηση του μοντέλου. 4. Υπολογισμός ορίων εμπιστοσύνης των παραμέτρων για τη συνάρτηση παλινδρόμησης και για το αναλυτικό αποτέλεσμα Τα Διαστήματα Εμπιστοσύνης Η ακρίβεια της προσδιοριζόμενης συγκέντρωσης του αγνώστου εξαρτάται από: το σφάλμα μέτρησης, από το διάστημα εμπιστοσύνης (confidence interval) της καμπύλης βαθμονομήσεως στο σημείο του αγνώστου, που εξαρτάται από τις αβεβαιότητες των εκτιμητριών των α και b. Ο υπολογισμός διακυμάνσεων των α και b δίνεται από τους τύπους: Sy x = n i (yi y ) 2 n 2 (Εξίσωση 1.24) S a = Sy x = n i x i 2 (Εξίσωση 1.25) n n i (x i x ) 2 S b = Sy x n i (x i x ) 2 (Εξίσωση 1.26) 1.21 O Συντελεστής Συσχετίσεως (Correlation Coefficient) 16

17 Ο συντελεστής συσχετίσεως (r) παίρνει τιμές από: -1 r +1 και είναι μέτρο της γραμμικότητας της καμπύλης βαθμονόμησης. Έχει περισσότερη αξία στην ανάλυση συσχετίσεως πειραματικών δεδομένων (correlation analysis) Η Μη Γραμμική Παλινδρόμηση Σχήμα 1.12 Μη γραμμικό μοντέλο. Στην περίπτωση του Σχήματος 1.12 το βέλτιστο μοντέλο προκύπτει να είναι: Y = 1,73 0,2συν(0,63X) 1,41ημ(0,63X) 0,77συν(2 0,63X) 1,31ημ(2 0,63X) (Εξίσωση 1.27) το οποίο ένα έμπειρο μάτι ίσως τα αναγνωρίζει ως τους πρώτους 4 όρους μίας σειράς Fourier! Πολλές φορές, ιδιαίτερα στις βιολογικές επιστήμες, το διάγραμμα διασποράς συνηγορεί σε μία μη γραμμική σχέση (Σχήμα 1.13). Στην περίπτωση του Σχήματος 1.13 το βέλτιστο μοντέλο είναι: u = V maxx K m +X (Εξίσωση 1.28) 17

18 Σχήμα 1.13 Μη γραμμικό μοντέλο. Η ακρίβεια της προσδιοριζόμενης συγκέντρωσης του αγνώστου εξαρτάται από: το σφάλμα μέτρησης, από το διάστημα εμπιστοσύνης της καμπύλης βαθμονομήσεως στο σημείο του αγνώστου, που εξαρτάται από τις αβεβαιότητες των εκτιμητριών των α και b. Ο υπολογισμός διακυμάνσεων των α και b δίνεται από τους τύπους: 1.23 Η Γραμμικότητα της Μεθόδου Ανάλυσης Είναι εκείνο το τμήμα της καμπύλης, στο οποίο το μετρούμενο μέγεθος είναι ανάλογο με τη συγκέντρωση της προς προσδιορισμό ουσίας. Όταν αναφερόμαστε στη Φασματοφωτομετρία UV Vis, είναι το τμήμα της καμπύλης, στο οποίο ισχύει ο νόμος του Beer Το Όριο Ανίχνευσης (Limit of Detection) Το όριο ανίχνευσης ή αναλυτική ευαισθησία (Analytical Sensitivity) μιας μεθόδου είναι η ελαχίστη συγκέντρωση μιας παραμέτρου που μπορεί να ανιχνευθεί «αξιόπιστα» από τη μέθοδο αυτή. Ως όριο ανίχνευσης ορίζουμε τη συγκέντρωση ενός αναλύτη (π.χ. μιας ουσίας) σε διάλυμά του, που ανιχνεύεται με βεβαιότητα 95%. Ισοδύναμα μπορούμε να πούμε πως είναι η ποσότητα του αναλύτη που δίνει μία τιμή στο όργανο μέτρησης ίση με το διπλάσιο (ή το τριπλάσιο κατ άλλους) της σταθερής τυπικής απόκλισης (SD), μιας σειράς δηλαδή, δέκα τουλάχιστον προσδιορισμών με διάλυμα μηδενικής συγκέντρωσης (τυφλό). Στην περίπτωση της φλογοφωτομετρίας το όριο ανίχνευσης φτάνει τα μg/ml. Για τις ανοσοχημικές μεθόδους, αραιώνεται ορός ασθενούς με βαθμονομητή μηδενικής συγκέντρωσης ή κατάλληλο αραιωτικό, σε τέτοιο βαθμό, ώστε ο συντελεστής διακύμανσης (CV), ο οποίος προκύπτει από είκοσι μετρήσεις, που πραγματοποιούνται κατά τη διάρκεια της ίδιας ημέρας να είναι ίσος με την τιμή 20. Η συγκέντρωση αυτή αντιστοιχεί στο όριο ανίχνευσης της μεθόδου. Όμως η διαδικασία των αραιώσεων δύσκολα εφαρμόζεται σε ένα κλινικό εργαστήριο με πρόγραμμα μέτρησης δειγμάτων ασθενών. Στην πράξη, για τον προσδιορισμό του ορίου ανίχνευσης των βιοχημικών κλινικών δοκιμών, των ο- ποίων η καμπύλη βαθμονόμησης είναι γραμμική, χρησιμοποιείται ως πειραματικό υλικό αραιωμένος ορός ε- λέγχου χαμηλής συγκέντρωσης και εκτελούνται τουλάχιστον 15 μετρήσεις μεταξύ διαδοχικών ημερών. Υπολογίζεται η τυπική απόκλιση των μετρήσεων και το όριο ανίχνευσης (LOD) από τον μαθηματικό τύπο: 18

19 LOD = 3 SD, για στάθμη εμπιστοσύνης 99,9% (Εξίσωση 1.29) ή LOD = 2 SD, για στάθμη εμπιστοσύνης 95% (Εξίσωση 1.30) 1.25 Το Όριο Ποσοτικοποίησης (Limit of Quantitation) Το όριο ποσοτικοποίησης ή λειτουργική ευαισθησία (Functional Sensitivity) είναι η ελαχίστη συγκέντρωση της μετρούμενης παραμέτρου, που μπορεί να ποσοτικοποιηθεί (να προσδιορισθεί ποσοτικά) με αποδεκτή ακρίβεια και επαναληψιμότητα. Το όριο ποσοτικοποίησης (LOQ) δίδεται από τον τύπο: LOQ = 10 SD (Εξίσωση 1.31) Ένας τρόπος προσδιορισμού του ορίου ποσοτικοποίησης για τις αναλύσεις που οι καμπύλες αναφοράς τους δεν είναι γραμμικές (π.χ. ανοσοχημικές), είναι ο εξής: πραγματοποιούνται 10 μετρήσεις των παρεχομένων βαθμονομητών, στα χαμηλότερα διαθέσιμα επίπεδα συγκεντρώσεων και υπολογίζεται η μέση τιμή και η τυπική απόκλιση SD ανά επίπεδο, τα αποτελέσματα τοποθετούνται σε διάγραμμα δύο αξόνων. Στον άξονα των x εμφανίζονται οι τιμές των συγκεντρώσεων και στον άξονα των y οι τιμές της τυπικής απόκλισης, υπολογίζεται με τη βοήθεια της μεθόδου ελαχίστων τετραγώνων η εξίσωση γραμμικής καμπύλης της μορφής y = αx + β, προσδιορίζεται η τιμή της τυπικής απόκλισης (SD) για μηδενική συγκέντρωση (y = β). Το όριο ανίχνευσης προκύπτει από την εξίσωση LOD= 3 x SD, για στάθμη εμπιστοσύνης 99,9% ή LOD = 2 SD, για στάθμη εμπιστοσύνης 95% Εφαρμογές 1 η Εφαρμογή Φασματοφωτομετρία Υπεριώδους Ορατού (UV-Vis) Κατασκευή Φάσματος Απορρόφησης Στόχος της συγκεκριμένης εργαστηριακής άσκησης είναι η κατασκευή φάσματος απορρόφησης γνωστής ουσίας με τη φασματοφωτομετρία UV Vis. Ρυθμίζουμε το φασματοφωτόμετρο και ορίζουμε το μήκος κύματος στα 600 nm. Η φωτομέτρηση θα πραγματοποιηθεί από τα 600 nm και κατεβαίνοντας κάθε 10 nm προς τα μικρότερα μήκη κύματος, μετρώντας κάθε φορά την απορρόφηση μέχρι τα 410 nm. Ιδιαίτερη προσοχή πρέπει να δοθεί στο μηδενισμό του οργάνου με το τυφλό, πριν από τη λήψη κάθε επιμέρους μέτρησης για κάθε μεταβολή του μήκους κύματος. Στη συνέχεια κατασκευάζουμε το φάσμα απορρόφησης, για να προσδιοριστεί το μήκος κύματος στο οποίο παρατηρείται η μέγιστη απορρόφηση. Για την κατασκευή του φάσματος απορρόφησης, καταγράφουμε στον παρακάτω πίνακα τις τιμές Α που αντιστοιχούν σε κάθε μήκος κύματος. λ (nm) Απορρόφηση (Α) 600 0, , , , , , , , , ,40 19

20 500 0, , , , , , , , , , ,08 Πίνακας 1.3 Παράδειγμα υπολογισμού του λ max λαμβάνοντας φάσμα απορρόφησης. Στη συνέχεια κατασκευάζουμε το φάσμα απορρόφησης της ουσίας σε χιλιοστομετρικό χαρτί και σημειώνουμε το λ max που βρήκαμε (Σχήμα 1.14). Στο παράδειγμα το λ max ισούνται με 510 nm. Σχήμα 1.14 Ο υπολογισμός του λ max από την καμπύλη του φάσματος απορρόφησης. 2 η Εφαρμογή Φασματοφωτομετρία Υπεριώδους Ορατού (UV-Vis) Κατασκευή Πρότυπης Καμπύλης & Υπολογισμός Συγκέντρωσης Άγνωστου Διαλύματος Στόχος της συγκεκριμένης εργαστηριακής άσκησης είναι ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης διαλύματος γνωστής ουσίας με τη φασματοφωτομετρία UV Vis. Με φωτομέτρηση και προσδιορισμό της απορρόφησης Α = f (C) μιας σειράς προτύπων διαλυμάτων σε ένα ορισμένο εύρος συγκεντρώσεων, μπορούμε να κατασκευάσουμε την καμπύλη αναφοράς ή βαθμονόμησης (calibration curve). 20

21 Ακολούθως, μετρώντας την απορρόφηση ενός διαλύματος άγνωστης συγκέντρωσης, της ίδιας με τα πρότυπα διαλύματα ουσίας, σε συγκεκριμένο μήκος κύματος και με χρήση της καμπύλης αναφοράς, μπορούμε να προσδιορίσουμε τη συγκέντρωση του άγνωστου διαλύματος. Στάδια προσδιορισμού 1. Παρασκευάζουμε μία σειρά τεσσάρων πρότυπων υδατικών διαλυμάτων μιας ουσίας (Π i) που απορροφά στο UV Vis (π.χ. ουσία Α). 2. Φωτομετρούμε τα πρότυπα διαλύματα στο λmax για να προσδιορίσουμε τις απορροφήσεις τους. Εάν διαθέτουμε φωτόμετρο απλής δέσμης, τότε κάθε φορά μηδενίζουμε το φωτόμετρο με διαλύτη (στη περίπτωσή μας νερό), ενώ, εάν διαθέτουμε φωτόμετρο διπλής δέσμης, τότε στη μία κυψελίδα τοποθετούμε το τυφλό διάλυμα (νερό) και στην άλλη το πρότυπο ή το προς μέτρηση διάλυμα. 3. Καταγράφουμε τα αποτελέσματα στον ακόλουθο πίνακα: Διάλυμα Συγκέντρωση (Μ) Απορρόφηση Π 1 Π 2 Π 3 Π 4 Άγνωστο 1. Κατασκευάζουμε την καμπύλη αναφοράς Α = f (C) (Σχήμα 1.4). 2. Φωτομετρούμε το άγνωστο διάλυμα. 21

22 Βίντεο που δημιουργήθηκε για αυτό το Κεφάλαιο Ο υπολογισμός του λ max από την καμπύλη του φάσματος απορρόφησης, Σχετικό οπτικό υλικό από το διαδίκτυο Λειτουργία σπεκτροφωτoμέτρου: (τελευταία προσπέλαση 1/4/2015). Ερμηνεία του νόμου Lambert-Beer: (τελευταία προσπέλαση 1/4/2015). Προσδιορισμός συγκέντρωσης με χρωματομετρία: (τελευταία προσπέλαση 1/4/2015). Αρχή μεθόδου της χρωματομετρίας: (τελευταία προσπέλαση 1/4/2015). Πηγές φωτογραφιών με προέλευση το διαδίκτυο Σχήμα 1.1 Ηλεκτρομαγνητικό φάσμα, (τελευταία προσπέλαση 1/4/2015). Aναφορές 1. ΠΑΠΑΪΩΑΝΝΟΥ, A. & ΠΛΑΓΕΡΑΣ, Π. (2012) Εξειδικευμένα Θέματα Κλινικής Χημείας. Aθήνα: Εκδόσεις Π.Χ. Πασχαλίδης. 2. ΠΑΠΑΪΩΑΝΝΟΥ, A. & ΠΛΑΓΕΡΑΣ, Π. (2012) Ειδικά Θέματα Βιοχημείας. Aθήνα: Εκδόσεις Π.Χ. Πασχαλίδης. 22

23 3. ADERSON, S & COCKAYNE, S. (1993) Clinical Chemistry Concepts and Applications. Philadelphia: W. B. Sauders Company Ltd. 4. ALEXANDER, R. & GRIFFIT, M. (1993) Basic Biochemical Methods. New York: Wiley-Liss Inc. 5. BURGOSS, C. & KNOWLES A. (1984) Techniques in Vis and UV Spectroscopy Series. London: Chapman and Hall. 6. MARHALL, J., BOTHAM, M., RODWELL, W., BENDER, A., KENNELLY, J., ANTHONH, P. (2011) Harper s Εικονογραφημένη Βιολογική Χημεία. Aθήνα: Εκδόσεις Π.Χ. Πασχαλίδης. 7. TIETZ, W. (1995) Clinical Guide to Laboratory Tests. 3 rd ed. Philadelphia: W.B. Sauders Company Ltd. 23