CaniLeish. Τεχνικά χαρακτηριστικά του προϊόντος

Transcript

1 CaniLeish Τεχνικά χαρακτηριστικά του προϊόντος

2

3 Περιεχόμενα Σελίδα Η απειλή της λεϊσμανίωσης του σκύλου Παρουσιάζοντας το CaniLeish : Ένα εξαιρετικό, νέο εργαλείο για την πρόληψη της λεϊσμανίωσης του σκύλου CaniLeish : Αποδεδειγμένη αποτελεσματικότητα CaniLeish : Ένα εξαιρετικό προφίλ ασφαλείας Η χρήση του CaniLeish στην καθημερινή κλινική πράξη

4

5 Technical Product Profile Η απειλή της λεϊσμανίωσης 1του σκύλου 5

6

7 1 Η απειλή της λεϊσμανίωσης του σκύλου 1.1 Ένα συχνό και σοβαρό πρόβλημα Η «λεϊσμανίωση» (όπως ονομάζεται στην κτηνιατρική) και η «λεϊσμανίαση» (όπως ονομάζεται στην ιατρική) είναι παρασιτικές νόσοι, οι οποίες προκαλούνται από πρωτόζωα του γένους Leishmania και μεταδίδονται μέσω ενδιάμεσων ξενιστών. Τα παράσιτα αυτά προσβάλλουν διάφορα είδη σπονδυλωτών ζώων και μεταδίδονται με το τσίμπημα μιας μολυσμένης σκνίπας. Οι σκύλοι αποτελούν την κύρια δεξαμενή αυτής της ζωονόσου1,2, η οποία προκαλεί σοβαρό κτηνιατρικό πρόβλημα και επίσης, έχει ολοένα αυξανόμενη επίπτωση στη δημόσια υγεία2. Η λεϊσμανίωση του σκύλου είναι μια σοβαρή και θανατηφόρος νόσος, η οποία είναι ευρέως διαδεδομένη στη λεκάνη της Μεσογείου, σε μέρη της Ασίας και της Κεντρικής και Νότιας Αμερικής. Περιγράφηκε για πρώτη φορά στο σκύλο μόλις 100 χρόνια πριν3. Στη λεκάνη της Μεσογείου, η νόσος προκαλείται από τη L. infantum, η οποία είναι συνώνυμη με τη L. chagasi στην Κεντρική και Νότια Αμερική, παρόλο που υπάρχουν επίσης αναφορές απομονωμένων εστιών L. tropica στην Ελλάδα. Υπολογίζεται ότι τουλάχιστον 2,5 εκατομμύρια σκύλοι έχουν προσβληθεί μόνο στη νοτιοδυτική Ευρώπη (βλέπε σχήμα 1.2) και η νόσος επεκτείνεται βόρεια4-6. Η ανθρώπινη λεϊσμανίαση αποτελείται από μια ομάδα νόσων, οι οποίες στην πλειονότητά τους είναι ζωονόσοι. Περιλαμβάνει το σπλαγχνικό τύπο (γνωστό και ως καλα-αζάρ) που προσβάλλει τα εσωτερικά όργανα και είναι θανατηφόρος εάν δεν αντιμετωπιστεί θεραπευτικά, καθώς και το δερματικό και δερματοβλεννογόνιο τύπο, οι οποίοι ενδέχεται να αυτοϊαθούν αλλά αφήνουν παραμορφωτικές ουλές7. Περισσότεροι από 350 εκατομμύρια άνθρωποι σε 88 χώρες διατρέχουν τον κίνδυνο να προσβληθούν από λεϊσμανίαση (βλέπε σχήμα 1.1), ενώ τη συχνότητα θανάτων λόγω σπλαγχνικής λεϊσμανίασης, προκαλούμενης από το σύμπλοκο της Leishmania donovani (το οποίο περιλαμβάνει την L. infantum και την L. donovani), υπερβαίνει μόνο εκείνη της ελονοσίας, από όλες τις παρασιτικές νόσους9. Σχήμα 1.1 Σπλαγχνική λεϊσμανίαση στον άνθρωπο (από Rosenthal και Mart, 2004)8 Γεωγραφική κατανομή της σπλαγχνικής λεϊσμανίασης 7

8 1Η απειλή της λεϊσμανίωσης του σκύλου Κύρια σημεία: Η L. infantum, ο αιτιολογικός παράγοντας για τη λεϊσμανίωση του σκύλου, ανήκει στο σύμπλοκο της L. donovani (ορισμένες φορές η L. infantum αναφέρεται λανθασμένα ως L. donovani). Στη Νότια Αμερική αναφέρεται ως L. chagasi. Οι ονομασίες L. infantum και L. chagasi είναι ταυτόσημες και η ονομασία L. infantum θα έπρεπε να αντικαταστήσει την ονομασία L. chagasi. Η L. infantum είναι ευρέως διαδεδομένη και εμφανίζει σημαντικού βαθμού νοσηρότητα στον άνθρωπο και στο σκύλο στη λεκάνη της Μεσογείου. Ο σκύλος είναι η κύρια δεξαμενή της L. infantum στην Ευρώπη. 1.2 Επιδημιολογία της λεϊσμανίωσης του σκύλου Ένα πρόβλημα με υψηλό επιπολασμό Εκτός από τα εκτιμώμενα 2,5 εκατομμύρια προσβεβλημένων σκύλων που ζουν στις ενδημικές περιοχές, η νόσος έχει διαγνωστεί σε μη ενδημικές χώρες σε σκύλους, οι οποίοι στο παρελθόν είχαν ζήσει ή ταξιδέψει σε ενδημικές περιοχές 10. Ο αυξημένος αριθμός των σκύλων που ταξιδεύουν στη νότια Ευρώπη ή εισάγονται ως ζώα συντροφιάς από τις ενδημικές περιοχές, εγείρει σοβαρές ανησυχίες για την εξάπλωση νόσων, που μεταδίδονται μέσω ενδιάμεσων ξενιστών, όπως η λεϊσμανίωση του σκύλου, στις μη ενδημικές περιοχές της Ευρώπης 10. Ο αριθμός των προσβεβλημένων σκύλων στη Νότια Αμερική εκτιμάται, επίσης, σε εκατομμύρια. Η συχνότητα της λοίμωξης είναι υψηλή σε μερικές περιοχές της Βενεζουέλας και της Βραζιλίας, στις οποίες ο υψηλός επιπολασμός της λοίμωξης στο σκύλο συσχετίζεται με υψηλό κίνδυνο εμφάνισης της νόσου στον άνθρωπο 11. Έχει επίσης αναφερθεί λοίμωξη σε γάτες, άγριους κυνίδες και άλογα σε περιοχές όπου η νόσος είναι συχνή στο σκύλο Το σχήμα 1.2 (ευγενική παραχώρηση του καθηγητή P. Bourdeau) δείχνει την τρέχουσα εκτεταμένη επιδημιολογική κατάσταση στην Ευρώπη. Σχήμα 1.2 Λεϊσμανίωση του σκύλου στην Ευρώπη 2010* (Πρωτότυπο του καθ. P. BOURDEAU) Πολύ ή ιδιαίτερα ενζωοτική Ενζωοτική Ζώνη ενζωοτικής επέκτασης Δυναμικό επέκτασης λόγω ύπαρξης του ενδιάμεσου ξενιστή??????????? Χώρες/ζώνες όπου έχουν περιγραφεί αυτόχθονα περιστατικά (μη ενζωοτικές) Εισαγόμενα περιστατικά Ελλιπώς τεκμηριωμένες καταστάσεις:? Αυτόχθονα περιστατικά;? Ενζωοτικά;? Εισαγόμενα περιστατικά; *Τα σύνορα των ζωνών δε δίνονται με ακρίβεια *Ο χάρτης προέρχεται από εργασία ευρωπαϊκών μελετών και συνεδρίων (Bourdeau: EMOP 2004; WorldLeish4 2009; ECVD 2009; RESFIZ 2009) Κύπρος 8

9 Τεχνικά χαρακτηριστικά του προϊόντος Στις ενδημικές ή τις ενζωοτικές περιοχές, σημειώνονται επίσης τοπικές διαφοροποιήσεις. Μια επιλογή δημοσιεύσεων τα τελευταία 10 χρόνια, δείχνει μια ευρεία διαφοροποίηση ως προς τον επιπολασμό της λεϊσμανίωσης του σκύλου, όπως ανιχνεύεται μέσω ορολογικών μεθόδων, στις περιοχές της Ευρώπης που θεωρούνται ενδημικές. Το εύρος των αποτελεσμάτων κυμαίνεται από 1,4% στην επαρχία της Πίζας, στην Ιταλία και έως 30,3% σε περιοχές της Δυτικής Λιγουρίας 15,16. Επιπλέον, η υποψία ότι ο ορολογικός επιπολασμός υποεκτιμά τον πραγματικό αριθμό των προσβεβλημένων σκύλων, επιβεβαιώθηκε από τα αποτελέσματα των μελετών που βασίστηκαν στον έλεγχο με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) οροαρνητικών σκύλων. Τα δεδομένα κατέδειξαν έναν επιπολασμό της τάξης του 80% στη Μασσαλία της Γαλλίας και του 67% στο ισπανικό νησί της Μαγιόρκας 17,18. Κύρια σημεία: Ο αριθμός των προσβεβλημένων ή εκτεθειμένων σκύλων είναι αξιοσημείωτα υψηλός. Η κατάσταση της υγείας τους προκαλεί ιδιαίτερη ανησυχία στους ιδιοκτήτες. Επίσης, αποτελούν μια μεγάλη δεξαμενή μόλυνσης με δυναμικό ζωονόσου. Συμπέρασμα: Είναι αναγκαίο να βρεθούν νέοι τρόποι για την αντιμετώπιση του προβλήματος της λεϊσμανίωσης του σκύλου πριν φτάσει σε κλινικό στάδιο. Κάθε προληπτικό μέτρο πρέπει να βασίζεται στην κατανόηση του βιολογικού κύκλου του παρασίτου και των πιθανών αποτελεσμάτων από την έκθεση στο παράσιτο Η σημασία του βιολογικού κύκλου της Leishmania Ο σύνθετος βιολογικός κύκλος των παρασίτων της L. infantum περιλαμβάνει ένα στάδιο αμαστιγωτού σε ένα σπονδυλωτό τελικό ξενιστή (π.χ. σκύλο ή άνθρωπο) και ένα στάδιο προμαστιγωτού σε μια ασπόνδυλη σκνίπα ενδιάμεσο ξενιστή. Παρόλο που, μερικές μελέτες διερεύνησαν την πιθανότητα τα τσιμπούρια και οι ψύλλοι να αποτελούν φορείς μετάδοσης της Leishmania, αυτό δεν έχει αποδειχθεί ακόμη 19,20. Μόνο συγκεκριμένα είδη σκνίπας του γένους Phlebotomus (το οποίο ονομάζεται Lutzomyia στο Νέο Κόσμο) είναι δυνατόν να μεταδόσουν τη Leishmania (βλέπε πίνακα 1). Πίνακας 1 Γεωγραφική κατανομή ορισμένων ειδών Leishmania που προσβάλλουν το σκύλο και οι αντίστοιχες σκνίπες, ενδιάμεσοι ξενιστές τους (προσαρμοσμένο από Solano-Gallego et al, ) Είδη Leishmania Γεωγραφική κατανομή Διαπιστωμένοι ενδιάμεσοι ξενιστές Πιθανοί ενδιάμεσοι ξενιστές Λεκάνη Μεσογείου Phlebotomus perniciosus, P. ariasi, P. longicuspis, P. syriacus, etc. L. infantum Μέση Ανατολή Νότια Ασία, Ιράν, Αρμενία, Αφγανιστάν P. perfiliewi, P. neglectus, P. langeroni, P. tobbi P. kandelakii P. brevis, P. halepensis, etc. Κεντρική Ασία, Κίνα P. chinensis, P. alexandri P. smirnovi, P. transcaucasicus, P. longiductus L. infantum (= L. chagasi) Κεντρική και Νότια Αμερική Lutzomyia longipalpis, Lu. Evansi, Lu. Olmeca olmeca Lu. Antunesi, Lu. Shannoni L. donovani Ανατολική Αφρική P. orientalis, P. martini P. rodhaini L. tropica Βόρεια Αφρική P. sergenti, P. arabicus P. chabaudi, P. saevus 9

10 1Η απειλή της λεϊσμανίωσης του σκύλου Μόνο η θηλυκή σκνίπα τσιμπά για να τραφεί με αίμα. Τα αρσενικά είναι χορτοφάγα! Η θηλυκή σκνίπα προσβάλλεται από το παράσιτο όταν προσλαμβάνει τα αμαστιγωτά της Leishmania, που περιέχονται στο αίμα ενός μολυσμένου τελικού ξενιστή. Στη διάρκεια μιας περιόδου 4 έως 25 ημερών, το παράσιτο συνεχίζει να αναπτύσσεται μέσα στη σκνίπα, όπου υφίσταται μια μείζονα μετατροπή 22 (βλέπε σχήμα 1.3). Τα ακίνητα αμαστιγωτά απελευθερώνονται από τα κύτταρα του θηλαστικού ξενιστή τους και μετατρέπονται σε προμαστιγωτά, τα οποία πολλαπλασιάζονται και αναπτύσσονται στο πρόσθιο τμήμα του εντέρου 23. Σχήμα 1.3 Βιολογικός κύκλος της L. Infantum (προσαρμοσμένο από Roze, 2005) 24 Πολλαπλασιασμός ΣΚΝΙΠΑ Μετατροπή σε προμαστιγωτά Προμαστιγωτά ΓΕΥΜΑ ΑΙΜΑΤΟΣ ΔΕΡΜΑ ΞΕΝΙΣΤΗ Πρόσληψη από τα μακροφάγα ΞΕΝΙΣΤΗΣ Μόλυνση άλλων κυττάρων Εσωτερικά όργανα Πολλαπλασιασμός αμαστιγωτών Απελευθέρωση αμαστιγωτών Όταν μια σκνίπα που είναι φορέας του παρασίτου τσιμπάει έναν άλλο σπονδυλωτό ξενιστή, ενοφθαλμίζει την τελική μετακυκλική μορφή του προμαστιγωτού στο νέο ξενιστή. Αφού το παράσιτο εισχωρήσει στη δερμίδα, υφίσταται φαγοκυττάρωση από ένα μακροφάγο. Αυτό το μακροφάγο προσπαθεί να το θανατώσει μέσω μιας σειράς οξυγονούχων μεταβολιτών, όπως το μονοξείδιο του αζώτου. Τα παράσιτα διαθέτουν ειδικούς μηχανισμούς για να παρακάμπτουν αυτό τον αμυντικό μηχανισμό του ξενιστή, με αποτέλεσμα να μπορούν να συνεχίζουν να αυξάνονται, να αναπτύσσονται και να πολλαπλασιάζονται μέσα στο μακροφάγο στη μορφή ακίνητων αμαστιγωτών, ολοκληρώνοντας έτσι το βιολογικό κύκλο 21. Στο τέλος, όταν το μακροφάγο γεμίσει εντελώς με αμαστιγωτά διαρρηγνύεται, αφήνοντας τα παράσιτα ελεύθερα να προσβάλλουν άλλα μακροφάγα. Το αποτέλεσμα του ενοφθαλμισμού σε έναν σπονδυλωτό ξενιστή εξαρτάται από την αποτελεσματικότητα του ανοσοποιητικού του συστήματος

11 Τεχνικά χαρακτηριστικά του προϊόντος Η μετάδοση χωρίς ενδιάμεσο ξενιστή, ανεξάρτητα από τη σκνίπα, φαίνεται να είναι σπάνια, αλλά πιθανή. Έχουν αναφερθεί διαπλακουντιακή μετάδοση και μετάδοση με σεξουαλική επαφή 26,27. Υπάρχει η υποψία άμεσης μετάδοσης από σκύλο σε σκύλο στους κυνηγετικούς σκύλους Foxhounds στις ΗΠΑ 28 και έχει επιβεβαιωθεί μετάδοση μέσω μετάγγισης αίματος 29. Είναι σαφές ότι σε τέτοιες περιπτώσεις, οι στρατηγικές πρόληψης, οι οποίες επικεντρώνονται αποκλειστικά στον ενδιάμεσο ξενιστή, δεν πρόκειται να είναι αποτελεσματικές. Κύρια Σημεία: Το παράσιτο της Leishmania υπάρχει σε δύο μορφές: ως προμαστιγωτό (στη σκνίπα - ενδιάμεσο ξενιστή) και ως αμαστιγωτό (ενδοκυτταρικά παράσιτα του σπονδυλωτού τελικού ξενιστή). Το αποτέλεσμα του ενοφθαλμισμού στο σκύλο (ή στον άνθρωπο) εξαρτάται από την αποτελεσματικότητα της ανοσοαπόκρισης του τελικού ξενιστή Το αποτέλεσμα της έκθεσης στο παράσιτο ποικίλλει Οι μελέτες που πραγματοποιήθηκαν για τους παράγοντες κινδύνου που σχετίζονται με τη λεϊσμανίωση του σκύλου, κατέδειξαν διάφορα καίρια συμπεράσματα στις ενδημικές περιοχές 5 : Το φύλο δε φαίνεται να αποτελεί παράγοντα κινδύνου. Όλες οι φυλές είναι ευάλωτες. Ωστόσο, υπάρχουν μερικές φυλές, όπως Boxer, Cocker Spaniel, Rottweiler και German Shepherd, οι οποίες δείχνουν να είναι ευάλωτες ως προς την ανάπτυξη συμπτωματικής νόσου περισσότερο από το μέσο όρο. Άλλες φυλές, όπως η Ibiza Hound, σπάνια αναπτύσσουν κλινικά σημεία Ο επιπολασμός της λεϊσμανίωσης του σκύλου αυξάνεται έως την ηλικία των 3 ετών, στη συνέχεια μειώνεται μέχρι ο σκύλος να ξεπεράσει το 7 ο έως 8 ο έτος της ηλικίας του, οπότε και παρατηρείται μία ακόμη έξαρση. Ο κίνδυνος εξαρτάται από τις δραστηριότητες του σκύλου και τον επακόλουθο κίνδυνο έκθεσης σε τσίμπημα μολυσμένης σκνίπας. Η ατομική ανοσοαπόκριση του σκύλου και η παθογονικότητα του στελέχους της L. infantum παίζουν σημαντικό ρόλο. Η πλειονότητα των σκύλων που εκτίθενται στο παράσιτο δεν πρόκειται να αναπτύξουν κλινική λεϊσμανίωση. Παρόλο που, ένα ποσοστό σκύλων στη συνέχεια θα αναπτύξουν κλινικό σύνδρομο, μερικοί σκύλοι ενδέχεται να εξαλείψουν πλήρως το παράσιτο, ενώ ένας σημαντικός αριθμός σκύλων θα παραμείνουν υποκλινικοί 4,18. Ωστόσο, το υποκλινικό στάδιο στους σκύλους που είναι υγιείς παρότι έχουν μολυνθεί, δεν μπορεί να θεωρηθεί ως μόνιμο. Μερικοί σκύλοι στη συνέχεια θα εξαλείψουν τη λοίμωξη αφού περάσει αρκετός χρόνος, αλλά παράγοντες όπως η ανοσοκαταστολή και οι ταυτόχρονες νόσοι μπορεί να οδηγήσουν σε εξέλιξη σε κλινική νόσο 4. Θα πρέπει επίσης να ληφθεί υπόψη το γεγονός ότι οι σκύλοι οι οποίοι αν και ασυμπτωματικοί είναι μολυσμένοι, εξακολουθούν να αποτελούν πηγή μόλυνσης για τις σκνίπες, ακόμη και αν οι ίδιοι δεν εμφανίζουν συμπτώματα της νόσου 33. Λόγω αυτής της μεγάλης πολλαπλότητας εκβάσεων, η κατάταξη των σκύλων που έχουν εκτεθεί στα παράσιτα της Leishmania δεν είναι εύκολη. Αρκετές ομάδες ερευνητών έχουν ασχοληθεί με αυτό το πρόβλημα. Το σχήμα 1.4 είναι προσαρμοσμένο από δύο από αυτές τις πηγές 5,21. Το σύμβολο της σκνίπας αντιστοιχεί στην κατάσταση κατά την οποία ο σκύλος μπορεί να θεωρηθεί ως μολυσματικός για τις σκνίπες. Περαιτέρω ανάλυση για την κατάταξη των σκύλων δίδεται στην παράγραφο

12 1Η απειλή της λεϊσμανίωσης του σκύλου Σχήμα 1.4 Τα αποτελέσματα στο σκύλο, μετά από έκθεση στο παράσιτο Μη μολυσμένος σκύλος σε ενδημική περιοχή Ελεύθερος παρασίτου (μη εκτεθειμένος) Εκτεθειμένος στο παράσιτο Το παράσιτο συνεχίζει να πολλαπλασιάζεται στον οργανισμό Το παράσιτο μπορεί να είναι ανενεργό για κάποιο διάστημα, (subpatent dog, βλέπε σελ. 35) Το παράσιτο τίθεται υπό έλεγχο και εξαλείφεται από τον οργανισμό Ασυμπτωματική ενεργός λοίμωξη Συμπτωματική ενεργός λοίμωξη Μακροχρόνια ασυμπτωματική ενεργός λοίμωξη Θεραπευμένος και ελεύθερος παρασίτου Χρόνια λοίμωξη (με μοιραία κατάληξη) 1.3 Ανοσολογία της λεϊσμανίωσης του σκύλου Πώς αντιστέκεται ένας σκύλος στο παράσιτο; Έχουν συγκεντρωθεί πολλά στοιχεία, τα οποία δείχνουν ότι ο προσανατολισμός της ανοσοαπόκρισης αποτελεί τον καίριο καθοριστικό παράγοντα για το αν ένας σκύλος θα είναι ανθεκτικός στο παράσιτο ή θα ακολουθήσει την οδό της ενεργού λοίμωξης των μακροφάγων, η οποία τελικά θα οδηγήσει σε κλινική νόσο 34,35. Αν και αποτελεί μεγάλη απλούστευση της πραγματικότητας, μπορεί να θεωρηθεί ότι φυσιολογικά η επίκτητη ανοσία δρα σε ισορροπία μεταξύ δύο κύριων τύπων 36 (βλέπε επίσης σχήμα 1.5). Το σκέλος των βοηθητικών T1 κυττάρων (Th1) του ανοσοποιητικού συστήματος δρα κυρίως μέσω κυτταρικής ανοσίας, με κύτταρα όπως τα κυτταροτοξικά Τ λεμφοκύτταρα (Tc) να αποτελούν τα κύρια δραστικά κύτταρα. Η παραγωγή μερικών αντισωμάτων ενδέχεται, επίσης, να διεγερθεί από τα B λεμφοκύτταρα, αλλά αυτό δεν είναι το κύριο χαρακτηριστικό μιας Th1 απόκρισης. Η Th1 ανοσοαπόκριση κατευθύνεται κυρίως έναντι ενδοκυτταρικών παθογόνων. Το σκέλος των βοηθητικών T2 κυττάρων (Th2) δρα κυρίως μέσω χυμικής ανοσίας, η οποία χαρακτηρίζεται από σημαντική παραγωγή αντισωμάτων από τα Β κύτταρα και από τα πλασματοκύτταρα. Είναι κυρίως αποτελεσματική έναντι των εξωκυτταρικών παθογόνων. Και τα δύο σκέλη της ανοσοαπόκρισης μπορούν, επίσης, να παράγουν κύτταρα μνήμης. Τα κύτταρα αυτά είναι ικανά να επάγουν τις δικές τους αντίστοιχες Th1 ή Th2 δράσεις, μετά από μεγάλο χρονικό διάστημα όταν υπάρξει εκ νέου επαφή με το αντιγόνο. Στα ποντίκια και στον άνθρωπο, γνωρίζουμε ότι τα αντισώματα του υποτύπου IgG1 σχετίζονται με μια Th2 απόκριση και τα αντισώματα του υποτύπου IgG2 σχετίζονται με μια Th1 απόκριση. Εντούτοις, παρόλο που μερικές αρχικές αναφορές υποστήριξαν πως συμβαίνει το ίδιο και στο σκύλο, αυτό δε φαίνεται να είναι αλήθεια και η αναλογία IgG1/IgG2 δε φαίνεται να συνδέεται με προστατευτική δράση

13 Τεχνικά χαρακτηριστικά του προϊόντος Η αντίσταση στη λεϊσμανίωση του σκύλου σχετίζεται με μια ισχυρή, Th1 κυτταρική ανοσία, όπου κυριαρχούν οι Th1 κυτταροκίνες στη μικτή Th1/Th2 συνολική απόκριση 34,35. Η εξέλιξη προς τη νόσο σχετίζεται με την κυριαρχία των Th2 κυτταροκινών και με μια έντονη χυμική απόκριση, απουσία μιας ισχυρής Th1 απόκρισης 38. Η παραπάνω ακατάλληλη ανοσοαντίδραση, με παραγωγή πολύ μεγάλης ποσότητας αντισωμάτων για μια εκτεταμένη χρονική περίοδο, συντελεί στο κλινικό σύνδρομο 39. Όταν ένα μακροφάγο εγκολπώνει ένα παθογόνο (μία διεργασία που ονομάζεται φαγοκυττάρωση), παρουσιάζει αντιγόνα από το παθογόνο στα αδιαφοροποίητα βοηθητικά Τ λεμφοκύτταρα (Th0 λεμφοκύτταρα) (βλέπε σχήμα 1.5). Τα T κύτταρα φυσιολογικά δεν είναι ικανά για απόκριση στα διαλυτά αντιγόνα και βασίζονται στην παρουσίαση των αντιγόνων από τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα (APCs), όπως είναι τα μακροφάγα και τα δενδριτικά κύτταρα 36. Ανάλογα με το τοπικό περιβάλλον, το είδος του αντιγόνου και διάφορους άλλους παράγοντες, αυτά τα Th0 λεμφοκύτταρα διεγείρονται για να διαφοροποιηθούν προς Th1 ή Th2 λεμφοκύτταρα. Σε αυτό το σημείο αρχίζει να αναπτύσσεται μια πολικότητα στην απόκριση 40. Μέσω της απελευθέρωσης ειδικών κυτταροκινών, τα Th1 κύτταρα στηρίζουν μια ως επί το πλείστον κυτταρική ανοσοαπόκριση και τα Th2 κύτταρα στηρίζουν μια χυμική κυρίως ανοσοαπόκριση. Σχήμα 1.5 Οι οδοί ανοσίας που οδηγούν στην υποχώρηση της λοίμωξης ή σε ενεργό νόσο Μολυσμένο μακροφάγο Διέγερση Ενεργοποίηση της οδού του μονοξειδίου του αζώτου Λύση παρασίτου Μακροφάγο IFN-γ Αδιαφοροποίητο T λεμφοκύτταρο (Th0) Διαφοροποίηση Διαίρεση Παραγωγή IgG2 B κύτταρο IFN-γ Th1 καταστολή Th2 B κύτταρο Παραγωγή IgG1 Tc IFN-γ Th1 μνήμη Th2 μνήμη Εξάληψη του παρασίτου Αντίσταση στη νόσο Εξέλιξη σε νόσο 13

14 1Η απειλή της λεϊσμανίωσης του σκύλου Στην περίπτωση της λεϊσμανίωσης, τα μακροφάγα δεν αποτελούν μόνο τα APCs, αλλά και τα κύτταρα-ξενιστές του παρασίτου. Οι κυτταροκίνες που απελευθερώνονται από τα λεμφοκύτταρα έχουν καθοριστική επίδραση στον τρόπο που αντιμετωπίζεται το παράσιτο από το μακροφάγο 41. Σε μια πολύ πρόσφατη μελέτη στον άνθρωπο, για δείκτες κυτταροκίνης κατάλληλους για χρήση στην αξιολόγηση δυνητικών υποψήφιων αντιγόνων εμβολίου για τη λεϊσμανίαση 42, μόνο η παραγωγή της ιντερφερόνης γ (IFN-γ) σχετίστηκε σε σημαντικό βαθμό με τα άτομα που είχαν προστασία έναντι της νόσου. Η παραπάνω έρευνα επιβεβαίωσε ότι, η IFN-γ αποτελεί μία κυτταροκίνη με καίρια σημασία για την εξακρίβωση της σωστής ανοσοαπόκρισης. Το παραπάνω εύρημα συμφωνεί με προηγούμενη εργασία σε σκύλους, η οποία είχε επίσης καταδείξει τη σχέση της έκφρασης της IFN-γ στους λεμφαδένες 43. Σε μια μελέτη που έγινε σε φυσικά μολυσμένους σκύλους, οι συμπτωματικοί σκύλοι είχαν παρασιτικό φορτίο στους λεμφαδένες τους, το οποίο ήταν 73 φορές υψηλότερο από ό, τι στους ασυμπτωματικούς σκύλους. Η έκφραση της IFN-γ στους λεμφαδένες όπως καταδείχθηκε, συνάδει με χαμηλότερα επίπεδα παρασίτων και προστασία έναντι της συμπτωματικής νόσου. Οι λόγοι για το σημαντικό ρόλο της IFN-γ διασαφηνίστηκαν περισσότερο τα τελευταία χρόνια. Όταν τα ενεργοποιημένα λεμφοκύτταρα διεγείρουν με τη σειρά τους τα μακροφάγα, χρησιμοποιώντας ένα από τα δύο εναλλακτικά προφίλ κυτταροκινών, η επιλογή Th1 ή Th2 προφίλ κυτταροκινών έχει πολύ σημαντική επίδραση στον τρόπο με τον οποίο το μακροφάγο αντιμετωπίζει το παράσιτο 41,44. Αυτό, εν μέρει, οφείλεται στις δράσεις που έχει αυτή η διέγερση επί του μεταβολισμού της L-αργινίνης. Η L-αργινίνη είναι ένα καίριας σημασίας θρεπτικό συστατικό, το οποίο χρησιμοποιείται τόσο από τα μακροφάγα, όσο και από τα παράσιτα της Leishmania. Διαθέτει δύο εναλλακτικές μεταβολικές οδούς με πολύ διαφορετικές εκβάσεις, όπως φαίνεται στο σχήμα 1.6. Ένα καίριο καθοριστικό βήμα για την έκβαση της λοίμωξης φαίνεται να είναι η ικανότητα των λεμφοκυττάρων να αποκρίνονται στην παρουσίαση αντιγόνων παράγοντας IFN-γ, μια καίριας σημασίας Th1 κυτταροκίνη. Κατά τη διέγερση από τις Th1 κυτταροκίνες ιδιαίτερα την IFN-γ το μακροφάγο δρα εντείνοντας τη δραστηριότητα ενός ενζύμου, που ονομάζεται επαγώγιμη συνθετάση του μονοξειδίου του αζώτου (inos). Αυτή η διεργασία έχει ως αποτέλεσμα το μεταβολισμό της L-αργινίνης προς λεϊσμανιοκτόνο μονοξείδιο του αζώτου (NO) και αναστέλλει τη δράση ενός άλλου ενζύμου, που ονομάζεται αργινάση 45. Ωστόσο, κατά τη διέγερση από τις Th2 κυτταροκίνες, το μακροφάγο ευνοεί τη δράση της αργινάσης. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή πολυαμινών, οι οποίες αποτελούν θρεπτική πηγή μείζονος σημασίας για τα παράσιτα της Leishmania, γεγονός που στην πραγματικότητα αυξάνει τον πολλαπλασιασμό και την αντοχή των παρασίτων 46,47. Έχει καταδειχθεί μια συσχέτιση σε σκύλους που προσβλήθηκαν από Leishmania μεταξύ του αριθμού των μακροφάγων που εκφράζουν την inos και μιας μείωσης του αριθμού των αμαστιγωτών της Leishmania στα μακροφάγα 48. Οι Th1 κυτταροκίνες, όπως η IFN-γ, παίζουν συνεπώς ρόλο καίριας σημασίας κατευθύνοντας στη σωστή οδό της ανοσοαπόκρισης. 14

15 Τεχνικά χαρακτηριστικά του προϊόντος Σχήμα 1.6 Η επίδραση των Th1 και Th2 κυτταροκινών στο μεταβολισμό της L-αργινίνης στο μακροφάγο και η επακόλουθη επίπτωση στον έλεγχο του παρασίτου Μακροφάγο Th2 Κυτταροκίνες π.χ. IL-10 L-Αργινίνη Th1 Κυτταροκίνες π.χ. IFN-γ Αργινάση inos Πολυαμίδια Καίρια θρεπτικά συστ. παρασίτου Μονοξείδιο του αζώτου Πολλαπλ/σμός παρασίτου Θάνατος παρασίτου 1.4 Περιορισμοί των σύγχρονων στρατηγικών πρόληψης της λεϊσμανίωσης του σκύλου Η διακοπή του βιολογικού κύκλου του παρασίτου της Leishmania μπορεί να γίνει σε περισσότερα από ένα σημεία. Η ιδανική λύση πιθανότατα πρέπει να εμπεριέχει δράση σε περισσότερα από ένα σημεία, εάν είναι εφικτό. Μέχρι τώρα, η πρόληψη της λεϊσμανίωσης του σκύλου υποχρεωτικά επικεντρωνόταν σε μεθόδους ελέγχου της σκνίπας- ενδιάμεσου ξενιστή. Όταν χρησιμοποιούνται σε ιδανικές πειραματικές συνθήκες, τα σκευάσματα εντομοκτόνων και εντομοαπωθητικών είναι αρκετά αποτελεσματικά. Ωστόσο, σε συνθήκες πεδίου τα μεγαλύτερα προβλήματα που προκύπτουν με τις παραπάνω μεθόδους, προέρχονται από ελλιπείς παράγοντες συμμόρφωσης ως προς τα σκευάσματα, οι οποίοι δεν είναι εύκολο να ελεγχθούν 2. Τα περιλαίμια μπορεί να χαθούν και τα προϊόντα τοπικής εξωτερικής χρήσης (spot-on) συχνά δεν εφαρμόζονται σωστά, με επαρκή δερματική επαφή. Επίσης, οι ιδιοκτήτες συχνά ξεχνούν να εφαρμόσουν εκ νέου τα προϊόντα τοπικής εξωτερικής χρήσης ή να αντικαταστήσουν τα περιλαίμια τη σωστή χρονική στιγμή, αφήνοντας έτσι για κάποια χρονικά διαστήματα το σκύλο απροστάτευτο. Ακόμα και όταν γίνεται σωστή χρήση, κανένα από αυτά τα προϊόντα τοπικής εφαρμογής δεν είναι σε θέση να παρεμποδίσει εντελώς κάθε τσίμπημα σκνίπας 25. Τα προϊόντα αυτά, στην πλειονότητά τους, έχουν καλή αποτελεσματικότητα βραχυχρόνια, αλλά υπάρχουν μερικές ενδείξεις ότι μακροχρόνια η αποτελεσματικότητα μπορεί να είναι μειωμένη 49. Επιπλέον, από τη στιγμή που ο σκύλος μολυνθεί από το παράσιτο, το απωθητικό προϊόν δεν μπορεί να επηρεάσει περαιτέρω την έκβαση της μόλυνσης. 15

16 1Η απειλή της λεϊσμανίωσης του σκύλου Η υιοθέτηση ενός κατάλληλου τρόπου ζωής, μπορεί να βοηθήσει στη μείωση αυτής της πρόκλησης. Τα τσιμπήματα της σκνίπας σημειώνονται κυρίως την αυγή και το σούρουπο, συνεπώς η φύλαξη των σκύλων σε εσωτερικούς χώρους αυτές τις ώρες μπορεί να μειώσει τον αριθμό των τσιμπημάτων. Ωστόσο, επειδή συχνά τα παράθυρα αφήνονται ανοικτά για αερισμό και οι σκνίπες έλκονται από το φως, εξακολουθεί να υπάρχει τρόπος να εισέλθουν στα σπίτια και να τσιμπήσουν, παρόλη τη μεγάλη προσπάθεια για να μη συμβεί αυτό 50. Έχουν γίνει, επίσης, προσπάθειες πρόληψης της λεϊσμανίωσης και της λεϊσμανίασης σε επιδημιολογικό επίπεδο με τη διαχείριση των μολυσμένων σκύλων. Σε μερικές περιοχές του κόσμου, όπως στη Βραζιλία, δοκιμάστηκε για λόγους δημόσιας υγείας μια στρατηγική υποχρεωτικής ευθανασίας των οροθετικών σκύλων, με κάποια ενδεχομένως θετικά αποτελέσματα 51,52. Ωστόσο, αυτού του είδους οι στρατηγικές είναι πολύ δύσκολο να γίνουν κοινωνικά αποδεκτές σε άλλα μέρη του κόσμου. Επειδή, σε κάθε περίπτωση, ο σκύλος είναι μολυσματικός για τη σκνίπα πριν γίνει οροθετικός, αυτή η προσέγγιση δεν είναι επαρκής για τη διακοπή του κύκλου μετάδοσης 52,53. Άγριοι κυνίδες που είναι ξενιστές, όπως οι αλεπούδες, επίσης, μπορεί να συντηρούν τον κύκλο της μόλυνσης, παρά την απομάκρυνση των οικόσιτων σκύλων που φέρουν τα υψηλότερα παρασιτικά φορτία. Η θεραπεία των μολυσμένων σκύλων με χημειοθεραπευτικά φάρμακα, μπορεί να μειώσει σημαντικά το παρασιτικό φορτίο και πιθανότατα μειώνει την πίεση λοίμωξης στις σκνίπες που τσιμπούν αυτούς τους σκύλους. Ωστόσο, αυτού του είδους η θεραπευτική αντιμετώπιση δεν καθιστά το σκύλο εντελώς μη μολυσματικό για τις σκνίπες, με αποτέλεσμα, επίσης, να μην μπορεί να διακόψει τον κύκλο 21. Η ιδανική λύση είναι να κάνουμε τους σκύλους, στην πλειονότητά τους, ανθεκτικούς στη φυσική πρόκληση, χωρίς να πρέπει να βασιζόμαστε αποκλειστικά στη συμμόρφωση και στις ικανότητες του ιδιοκτήτη για την εφαρμογή των διαθέσιμων εντομοκτόνων. Ο επιπρόσθετος έλεγχος του ενδιάμεσου ξενιστή, προκειμένου να μειωθεί η δόση των παρασίτων που λαμβάνει ένας εμβολιασμένος σκύλος είναι, φυσικά, συμπληρωματικός αυτής της θεμελιώδους προσέγγισης. Αυτό έχει γίνει γνωστό εδώ και αρκετό καιρό και αρκετοί συγγραφείς έχουν εκφράσει την άποψη ότι, η καλύτερα προσαρμοσμένη μέθοδος στις ανάγκες ελέγχου αυτής της νόσου θα ήταν ένα εμβόλιο. Μέχρι σήμερα, αυτό που έλειπε ήταν η δυνατότητα αύξησης της αποτελεσματικότητας της ανοσοαπόκρισης, να αντιμετωπίσει την πρόκληση που δέχεται. Ωστόσο, παρά τη σημαντική επένδυση, δεν υπήρχε μέχρι τώρα διαθέσιμο κατάλληλο εμβόλιο στην Ευρώπη. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι η επίτευξη αποτελεσματικής ανοσοαπόκρισης ενάντια σε κάποιο παράσιτο αποτελεί εξαιρετικά πολύπλοκη διεργασία, όπως συνοψίστηκε από τον JF Williams σε ένα άρθρο ανασκόπησης των προοπτικών για την προφύλαξη έναντι των παρασίτων 54 Οι λόγοι για αισιοδοξία είναι λιγότερο προφανείς από τους λόγους για ενθουσιασμό Αυτό όμως ίσχυε, μέχρι τώρα! Περίληψη Η λεϊσμανίωση του σκύλου είναι ένα σοβαρό και εκτεταμένο παγκόσμιο πρόβλημα. Η εξάπλωσή της αυξάνεται συνεχώς σε μη ενδημικές περιοχές της Ευρώπης. Ο βιολογικός κύκλος της Leishmania αφορά στη μεταφορά της μόλυνσης μεταξύ της θηλυκής σκνίπας και ενός ευάλωτου θηλαστικού ξενιστή, όπως είναι ο σκύλος ή ο άνθρωπος. Η ευαισθησία ενός σκύλου στο παράσιτο εξαρτάται από μια σειρά παραγόντων, που περιλαμβάνουν τη φυλή, την ηλικία, την κατεύθυνση και την αποτελεσματικότητα του ανοσοποιητικού συστήματος. Η Th1 κυτταροκίνη, IFN-γ, παίζει καίριο ρόλο στην κατεύθυνση της σωστής ανοσοαπόκρισης. Αρκετοί συγγραφείς έχουν εκφράσει την άποψη πως ο εμβολιασμός θα μπορούσε να είναι το καλύτερα προσαρμοσμένο μέσο στις ανάγκες ελέγχου του προβλήματος της λεϊσμανίωσης του σκύλου.

17 Παρουσιάζοντας το CaniLeish : Ένα εξαιρετικό, νέο εργαλείο για την πρόληψη 2της λεϊσμανίωσης του σκύλου

18 18

19 2 Παρουσιάζοντας το CaniLeish : Ένα εξαιρετικό, νέο εργαλείο για την πρόληψη της λεϊσμανίωσης του σκύλου 2.1 Πρώτο κεφάλαιο Λύσεις από το επίκεντρο των ερευνητικών εξελίξεων Η ανάπτυξη αυτού του πρωτοποριακού εμβολίου είναι αποτέλεσμα συνεργασίας μεταξύ του Institut de Recherche pour le Dèvelopment (IRD), της Bio Véto Test (BVT) και των ομάδων R&D (έρευνας και ανάπτυξης) της Virbac. Βασίζεται σε μια πατενταρισμένη ανακάλυψη του IRD, που σχετίζεται με την καλλιέργεια της Leishmania. Το IRD είναι ένα γαλλικό δημόσιο ερευνητικό ινστιτούτο, το οποίο εργάζεται για την ανάπτυξη των χωρών του Νότου. Αντικείμενο της έρευνάς του αποτελούν μείζονες αναπτυξιακές προκλήσεις σχετικά με το περιβάλλον, την επαρκή ανάπτυξη των βιώσιμων πόρων, τις κοινωνικές μελέτες και την υγεία. Συνεπώς, έχει σημαντικά ερευνητικά ενδιαφέροντα στο πεδίο της λεϊσμανίασης. Στις αρχές της δεκαετίας του 1990, το IRD εργαζόταν πάνω σε έναν επαναστατικό νέο τρόπο για την αναπαραγωγή ολόκληρου του βιολογικού κύκλου των παρασίτων της Leishmania, χωρίς τη χρήση πειραματόζωων. Παρόλο που, η επαναλαμβανόμενη in-vitro καλλιέργεια προμαστιγωτών είναι δυνατή, έχει ως αποτέλεσμα την απώλεια της αντιγονικότητας καθώς και της μολυσματικότητας. Πρέπει να περάσουν στη φάση του αμαστιγωτού προκειμένου να επανακτήσουν τη μολυσματικότητα και την αντιγονικότητά τους. Στο IRD εκχωρήθηκε δίπλωμα ευρεσιτεχνίας για το ελεύθερο ορού και ελεύθερο κυττάρων σύστημα καλλιέργειας, που ανακαλύφθηκε από αυτή τη θεμελιώδη έρευνα. Το νέο αυτό σύστημα δεν κατάφερε μόνο να επιτύχει το στόχο της παραγωγής όλων των σταδίων ανάπτυξης του παρασίτου χωρίς τη χρήση πειραματόζωων, αλλά επίσης επέτρεψε την επίτευξη ενός σημαντικά ταχύτερου κύκλου παραγωγής παρασίτων καθώς και τη διατήρηση της μολυσματικότητας και της αντιγονικότητας των παρασίτων. Επιπρόσθετα, χάρη στα μοναδικά μέσα καλλιέργειας που χρησιμοποιήθηκαν, όλες οι πρωτεΐνες στο υπερκείμενο στρώμα της καλλιέργειας είχαν παραχθεί από τα παράσιτα οι επονομαζόμενες «απεκκρινόμενες-εκκρινόμενες πρωτεΐνες» (excreted-secreted proteins) ή ESP 55. Το IRD εκχώρησε κατά αποκλειστικότητα την άδεια στην BVT για χρήση στον τομέα της υγείας των ζώων. Η BVT είναι μια εταιρεία εξειδικευμένη στα διαγνωστικά προϊόντα, η οποία είναι 100% θυγατρική της Virbac. Αρχικά ιδρύθηκε ως μια ανεξάρτητη εταιρεία, επίσης στις αρχές της δεκαετίας του 1990, ανταποκρινόμενη στην ανάγκη του κτηνιατρικού επαγγέλματος για οικονομικές και γρήγορες διαγνωστικές τεχνικές. Τα πρώτα τεστ που παρήγαγε η BVT ήταν το Leishmatest (ένα γρήγορο τεστ συγκόλλησης) και το Fluoleish (μια IFAT εργαστηριακή μέθοδος αναφοράς). Καθώς η εταιρεία επέκτεινε το φάσμα των προϊόντων της, η χρήση αντιγόνων παραγόμενων μέσω πρωτοποριακών συνθηκών καλλιέργειας που είχαν αναπτυχθεί από το IRD οδήγησε στη στενή συνεργασία μεταξύ των δύο ομάδων. Το 1998, καθώς αυξάνονταν οι γνώσεις σχετικά με τους ανοσιακούς μηχανισμούς της λεϊσμανίωσης, η BVT και το IRD αποφάσισαν να εργαστούν μαζί προκειμένου να ερευνήσουν τη δυνατότητα χρήσης αντιγόνων ESP μαζί με ένα ανοσοενισχυτικό για τον ανοσοθεραπευτικό εμβολιασμό, σε περιπτώσεις κλινικής λεϊσμανίωσης του σκύλου. Κάθε προηγούμενη εργασία σχετικά με τις επιδράσεις των ESP στην ανοσιακή ισορροπία είχε πραγματοποιηθεί σε ποντικούς, όπου τα αποτελέσματα ήταν ενθαρρυντικά 56,57. Ενθαρρυντικά αποτελέσματα επιτεύχθηκαν σε μια μικρή μελέτη, όπου τα κλινικά περιστατικά έδειχναν ότι οι πρωτεΐνες ESP θα μπορούσαν να αντιστρέψουν την πορεία της ανοσοαπόκρισης προς έναν πιο κατάλληλο τύπο Th1 καθώς και να βελτιώσουν τη γενική κατάσταση υγείας των σκύλων 58. Οι πειραματικές μελέτες και οι μελέτες πεδίου σε υγιείς σκύλους με ένα πρωτότυπο εμβόλιο ESP, που περιείχε το ανοσοενισχυτικό μουραμικό διπεπτίδιο (muramyl dipeptide, MDP) επίσης έδωσαν ενθαρρυντικά αποτελέσματα, γεγονός που δείχνει ότι αυτές οι πρωτεΐνες θα μπορούσαν να παρέχουν προστασία έναντι της λεϊσμανίωσης του σκύλου 59,60. 19

20 2Ένα εξαιρετικό, νέο εργαλείο για την πρόληψη της λεϊσμανίωσης του σκύλου Το τμήμα έρευνας και ανάπτυξης (R&D) της Virbac εντάχθηκε στην ομάδα της BVT και του IRD το 2003 για την υποστήριξη του συγκεκριμένου έργου. Ακολούθησε σημαντική και συνεχής επένδυση εξειδικευμένων γνώσεων, χρόνου και χρήματος προκειμένου να προσδιοριστεί καλύτερα, να βελτιωθεί και να αναπτυχθεί περαιτέρω το προϊόν μέχρι να φτάσει στη σημερινή του μορφή. Κατά τη διάρκεια αυτής της περιόδου, ορίστηκαν επίσης οι παράμετροι για την παραγωγή σε βιομηχανική κλίμακα και το ανοσοενισχυτικό αντικαταστήθηκε από το QA-21, για το οποίο υπάρχουν λιγότερα ζητήματα ασφάλειας και είναι γνωστό πως αποτελεί ακόμη ισχυρότερο διεγέρτη της κυτταρικής ανοσίας τύπου 1 (Th1) από ό, τι το ανοσοενισχυτικό MDP Είμαστε υπερήφανοι που αυτή η εργασία μας επέτρεψε τελικά να διαθέσουμε στην κυκλοφορία αυτό το εξαιρετικό, νέο και πολυαναμενόμενο εμβόλιο. 2.2 CaniLeish Ένα ιδιαίτερα καινοτόμο εμβόλιο, υψηλής εξειδίκευσης Το CaniLeish αποτελείται από διάφορα συστατικά (βλέπε σχήμα 2.1). Κάθε ένα παίζει σημαντικό ρόλο στην παραγωγή και τη δραστικότητα αυτού του νέου εμβολίου. Σχήμα 2.1 Tο εμβόλιο Τα αντιγόνα τουλάχιστον 100µg ESP Το ανοσοενισχυτικό 60µg QA-21 Το έκδοχο λυοφιλοποίησης TMS Ο διαλύτης 1ml NaCl 0.9% Τι ακριβώς είναι οι ESP; Με την ανάλυση ενός πλήρους πρωτεϊνικού εκχυλίσματος προμαστιγωτών της L. infantum, μπορούν να ταυτοποιηθούν περισσότερες από πρωτεΐνες. Όμως, από αυτές μια μεγάλη αναλογία είναι εσωτερικές πρωτεΐνες και συνεπώς δεν είναι διαθέσιμες στο ανοσοποιητικό σύστημα ως θέσεις προσβολής του ζώντος παρασίτου. Πράγματι, υπάρχουν ενδείξεις ότι η ανοσοαπόκριση σε μερικά ανοσογόνα εσωτερικά αντιγόνα του παρασίτου (που εκλύονται με το θάνατο του παρασίτου) ενδέχεται να συμβάλλει στην εξέλιξη της νόσου 64. Ένα εμβόλιο, το οποίο θα χρησιμοποιούσε ολόκληρα νεκρά παράσιτα θα περιείχε όλες αυτές τις πρωτεΐνες, οι περισσότερες από τις οποίες δεν είναι χρήσιμες, ενώ κάποιες μπορεί να είναι και επιβλαβείς. Οι πρωτεΐνες ESP είναι απεκκρινόμενες-εκκρινόμενες πρωτεΐνες (excreted-secreted proteins), οι οποίες παράγονται από διάφορα πρωτοζωικά παράσιτα, όπως τα Toxoplasma, Plasmodium, Babesia, Leishmania και άλλα. Αυτή η ομάδα των πρωτεϊνών διαθέτει ποικίλες σημαντικές λειτουργίες, συμπεριλαμβανομένων κάποιων με ειδικό ενδιαφέρον για εμάς. Αυτές οι λειτουργίες περιλαμβάνουν τη συνεισφορά αυτής της ομάδας πρωτεϊνών στην προσβολή του κυττάρου από το παράσιτο και στον επακόλουθο ενδοκυτταρικό πολλαπλασιασμό του, καθώς και στη ρύθμιση της ανοσοαπόκρισης του τελικού ξενιστή 56. Από τις πρωτεΐνες που απελευθερώνονται, εκείνες που προσδίδουν εκλεκτικό πλεονέκτημα στο παράσιτο αποτελούν κατάλληλους στόχους για τις θεραπευτικές ή τις προληπτικές παρεμβάσεις. Επιπλέον, αρκετές από τις πρωτεΐνες αυτής της ομάδας απαντούν σε δύο μορφές την απεκκρινόμενη/εκκρινόμενη μορφή, όπως επίσης και μια μορφή που είναι συνδεδεμένη με την κυτταρική μεμβράνη 65. Αυτό σημαίνει ότι κάποιες από αυτές τις πρωτεΐνες αποτελούν, επίσης, κατάλληλους επιφανειακούς αντιγονικούς στόχους στο παράσιτο. Είναι σημαντικό το γεγονός ότι οι πρωτεΐνες μπορούν να υποστούν επεξεργασία από το ανοσοποιητικό σύστημα, προκειμένου να διεγείρουν τον πολλαπλασιασμό των Τ κυττάρων. Οι μελέτες για τον πολλαπλα- 20

21 Τεχνικά χαρακτηριστικά του προϊόντος Figure 2.2 Προμαστιγωτά L. infantum σε καλλιέργεια Copyright: Virbac σιασμό ειδικών αντισωμάτων έναντι της Leishmania (αντι-leishmania) από λεμφοκύτταρα ποντικού, οι οποίες πραγματοποιήθηκαν από τους Rosa et al οδήγησαν στο συμπέρασμα ότι οι ESP της L. infantum αποτελούν καλύτερους διεγέρτες για τον πολλαπλασιασμό των T κυττάρων συγκριτικά με το σύνολο των πρωτεϊνών του παρασίτου 6. Χάρη στη μοναδική μέθοδο παραγωγής που χρησιμοποιείται για την παρασκευή του CaniLeish, όλες οι πρωτεΐνες στο υπερκείμενο στρώμα της καλλιέργειας είναι ESP. Σε αντίθεση με το μεγάλο αριθμό (πάνω από 2.000) πρωτεϊνών που περιέχονται σε ολόκληρο το εκχύλισμα του παρασίτου, η ανάλυση των ESP ταυτοποιεί μόνο 50 έως 100 πρωτεΐνες. Αυτό είναι σαφώς λιγότερο πολύπλοκο σε σύγκριση με το εκχύλισμα ολόκληρου του παρασίτου, καθιστώντας εφικτό τον περαιτέρω χαρακτηρισμό. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα, την επακόλουθη ταυτοποίηση των κύριων πρωτεϊνών. Είναι ενδιαφέρον το γεγονός ότι, ένα σημαντικό μέρος πρωτεϊνών στις ESP δημιουργήθηκαν από πρωτεΐνες της οικογένειας των αντιγόνων στην επιφάνεια του παρασίτου (Parasite Surface Antigen, PSA). Το PSA έχει ήδη χαρακτηριστεί ως μείζον αντιγόνο επιφάνειας, με το οποίο ασχολήθηκαν διάφορες δημοσιεύσεις Το PSA είναι μια οικογένεια μειζόνων γλυκοπρωτεϊνών, που αρχικά θεωρούνταν πως εκφράζονται μόνο στα προμαστιγωτά και για το λόγο αυτό ονομάστηκε αντιγόνο επιφάνειας προμαστιγωτού (Promastigote Surface Antigen). Ωστόσο, προτάθηκε αλλαγή της ονομασίας του, όταν ανακαλύφθηκε ότι τα αντιγόνα αυτά εκφράζονται επίσης και στα αμαστιγωτά, αν και το ακρωνύμιο PSA παραμένει αμετάβλητο, πράγμα το οποίο εξυπηρετεί 69! Οι πρωτεΐνες αυτές εκφράζονται στην επιφάνεια της μεμβράνης του παρασίτου, αλλά επίσης απεκκρίνονται από τα περισσότερα είδη του γένους Leishmania 65. Η περαιτέρω μελέτη κατέδειξε πως το PSA είναι προϊόν διαφόρων γονιδίων, τα οποία εντοπίζονται σε περισσότερα από ένα χρωμοσώματα σε οκτώ υπο-οικογένειες 70. Αυτά τα γονίδια PSA έχουν στην πλειονότητά τους υψηλό βαθμό διατήρησης μεταξύ των διαφορετικών στελεχών της L. infantum, καθώς και μεταξύ των ειδών L. infantum, L. major και L. braziliensis 70. Έχει, επίσης, καταδειχθεί ότι παρόλο που μερικά είδη της Leishmania διαφοροποιούν το επίπεδο του PSA στις διάφορες φάσεις της ζωής τους, αυτό εκφράζεται σταθερά τόσο στα προμαστιγωτά όσο και στα αμαστιγωτά της L. infantum 71. Αυτό έχει, φυσικά, εξαιρετική σημασία, καθώς το παράσιτο φτάνει στον οργανισμό με τη μορφή του προμαστιγωτού, αλλά περνά το μεγαλύτερο μέρος της ζωής του στον οργανισμό του σκύλου στη μορφή του αμαστιγωτού. Παρά το προφανές ενδιαφέρον για το PSA, η παρουσία ενός τέτοιου σύνθετου παρασίτου στον οργανισμό σε περισσότερα από ένα στάδια του βιολογικού κύκλου, συνεχίζει να αποτελεί πλεονέκτημα καθώς παρέχει μια σχετικά ευρεία επιλογή κατάλληλων αντιγονικών στόχων. Αυτό ισχύει στην περίπτωση των ESP, σε αντιδιαστολή με μία μόνο PSA πρωτεΐνη. 21

22 2Ένα εξαιρετικό, νέο εργαλείο για την πρόληψη της λεϊσμανίωσης του σκύλου Κύρια σημεία: Οι ESP αποτελούν καλύτερο διεγέρτη για την κυτταρική ανοσία από ό,τι τα εκχυλίσματα ολόκληρου του παρασίτου. Το κλάσμα PSA των ESP αποτελεί έναν γνωστό και επιθυμητό αντιγονικό στόχο και απαντά σε υψηλά επίπεδα. Είναι παρόν σε κάθε στάδιο του βιολογικού κύκλου και έχει υψηλό βαθμό διατήρησης μεταξύ των στελεχών του παρασίτου Παραγωγή ESP Ένα μοναδικό και κατάλληλα προσαρμοσμένο σύστημα παραγωγής αντιγόνων Η πρωτοποριακή διαδικασία παραγωγής των ESP που περιέχονται στο CaniLeish παρέχει μια μοναδική και κατάλληλη πηγή αντιγόνων για αυτό το εμβόλιο. Τα παράσιτα αναπτύσσονται σε ένα υπόστρωμα καλλιέργειας, το οποίο δεν περιέχει κύτταρα ή ορό. Εμπλουτίζονται με όλα τα μικρομοριακά θρεπτικά συστατικά (συνήθη άλατα, σάκχαρα, αιμίνη, ρυθμιστικά διαλύματα, νουκλεοτίδια, βιταμίνες και αμινοξέα), τα οποία απαιτούνται σε κάθε στάδιο ανάπτυξης σε αυτό το πλήρως καθορισμένο υπόστρωμα, ώστε τα παράσιτα να μπορούν να συνεχίσουν να αναπτύσσονται και να πολλαπλασιάζονται. Ξεκινώντας με ένα μικρό φιαλίδιο διασποράς, ο όγκος του υποστρώματος καλλιέργειας αυξάνεται διαδοχικά για να δώσει τελικά μια παρτίδα καλλιέργειας σε κλίμακα παραγωγής (βλέπε σχήμα 2.3). Σχήμα 2.3 Διαδοχική αύξηση του όγκου της καλλιέργειας για την παραγωγή των τελικών παρτίδων Φιαλίδια διασποράς Έχοντας αρχικά αναπτυχθεί και πατενταριστεί από το ινστιτούτο IRD στις αρχές της δεκαετίας του 1990, και στη συνέχεια προσαρμοστεί και τελειοποιηθεί για βιομηχανική χρήση από την ομάδα έρευνας και ανάπτυξης (R&D) της Virbac, αυτό το προηγμένο σύστημα καλλιέργειας παρέχει ένα υγρό κλάσμα, στο οποίο οι μόνες πρωτεΐνες που υπάρχουν είναι οι ESP του παρασίτου. Επειδή, όλες οι πρωτεΐνες παράγονται φυσιολογικά από τα ίδια τα παράσιτα της Leishmania, οι κατάλληλες μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις όπως η γλυκοζυλίωση, διασφαλίζουν τη διατήρηση της αρχικής μορφής της πρωτεΐνης. Αυτό είναι ιδιαίτερα σημαντικό, δεδομένου ότι σε μια μελέτη που έγινε με κάποιο άλλο υποψήφιο εμβόλιο, τα αρχικά πολλά υποσχόμενα αντιγόνα δεν κατάφεραν να παρέχουν προστασία, όταν αυτά παράχθηκαν στη μορφή ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης πολλαπλών υπομονάδων 72. Η εργασία με τη χρήση PSA από την L. major κατέδειξε ότι το PSA δρα προστατευτικά στους ποντικούς, όταν εκφράζεται σε παράσιτα της Leishmania, αλλά δε δρα προστατευτικά όταν εκφράζεται σε βακτήρια της Escherichia Coli (E. coli), παρόλο που εξακολουθεί να εκδηλώνει εκλεκτικότητα ως προς τη διέγερση απόκρισης Th1. Τα παραπάνω επιβεβαιώνουν την αναγκαιότητα διατήρησης της αρχικής μορφής της πρωτεΐνης

23 Τεχνικά χαρακτηριστικά του προϊόντος Αφού ολοκληρωθεί μία παρτίδα παραγωγής, η τελική καθαρότητα των ESP που απομονώθηκαν διασφαλίζεται μέσω διήθησης. Με αυτό τον τρόπο απομακρύνονται σίγουρα όλα τα παράσιτα, πράγμα το οποίο στη συνέχεια διασφαλίζεται με την καλλιέργεια του τελικού διηθήματος, σε ειδικό υπόστρωμα καλλιέργειας και με δοκιμασίες που διεξάγονται στη μεμβράνη διήθησης, για να επιβεβαιωθεί η ακεραιότητά της (βλέπε σχήμα 2.4). Η διήθηση επιτρέπει, επίσης, την απομάκρυνση από το υπόστρωμα καλλιέργειας λοιπών μικρών μορίων, που παρέμειναν σε αυτό, όπως αλάτων ή σακχάρων, καθώς και του πλεονάζοντος νερού προκειμένου να επιτευχθεί υψηλή συγκέντρωση πρωτεϊνών που παράγονται από τα παράσιτα κατά τη διάρκεια της ανάπτυξής τους (βλέπε σχήμα 2.5). Σχήμα 2.4 Μία διαδικασία διήθησης απομακρύνει τα παράσιτα και διατηρεί τις ESP Νερό Άλατα, Σάκχαρα, κλπ. Πρωτεΐνες Παράσιτα Μεμβράνη Σχήμα 2.5 Μία άλλη διαδικασία διήθησης επιτρέπει τη συμπύκνωση του προϊόντος ESP Νερό Άλατα, Σάκχαρα, κλπ. Πρωτεΐνες Μεμβράνη Αποτέλεσμα αυτή της διαδικασίας είναι ένα υψηλής συγκέντρωσης, αλλά στείρο διάλυμα πρωτεϊνών, οι οποίες δημιουργήθηκαν αποκλειστικά από παράσιτα της Leishmania και για το λόγο αυτό έχουν διατηρήσει την αρχική τους μορφή. Παρέχεται συνεπώς, ένα ιδανικό διάλυμα αντιγόνων που περιέχει παρασιτικές πρωτεΐνες επιλεγμένες, προκειμένου να μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη διέγερση της ανοσοαπόκρισης έναντι όλων των σταδίων του κύκλου ζωής του παρασίτου. 23

24 2Ένα εξαιρετικό, νέο εργαλείο για την πρόληψη της λεϊσμανίωσης του σκύλου Πώς μπορεί ένα τόσο ευαίσθητο παράσιτο να παράγει σταθερή ποιότητα ESP; Τα παράσιτα της Leishmania έχουν υψηλό βαθμό προσαρμογής και μπορούν να αλλάξουν σημαντικά τα χαρακτηριστικά τους ανταποκρινόμενα, σε πολύ μικρές αλλαγές που σημειώνονται στο άμεσο περιβάλλον τους στη συγκεκριμένη περίπτωση, το σύστημα καλλιέργειας. Είναι απαραίτητο να εξασφαλιστεί ότι δεν υπάρχουν αλλαγές στο στέλεχος του παρασίτου, λόγω των διαδοχικών διελεύσεων. Η χρήση ενός «συστήματος παρτίδας σποράς» αποκλείει την πιθανότητα αλλαγών στα χαρακτηριστικά του παρασίτου με την πάροδο του χρόνου και εξασφαλίζει την ποιοτική συνοχή της παραγωγής για περισσότερο από 100 χρόνια! Προκειμένου να εξασφαλιστεί ότι η απόδοση της κάθε παρτίδας θα είναι εξίσου καλή με εκείνη των παρτίδων που χρησιμοποιήθηκαν στα στάδια ανάπτυξης και δοκιμών του εμβολίου είναι, επίσης, απαραίτητο να εφαρμόζονται αυστηρά και προσαρμοσμένα στη διαδικασία στάδια ποιοτικού ελέγχου, κατά τη διάρκεια της παραγωγικής διαδικασίας. Κάθε στάδιο της παραγωγικής διαδικασίας ελέγχεται επισταμένα προκειμένου να εξασφαλιστεί ότι οι παράμετροι του περιβάλλοντος του παρασίτου διατηρούνται εντός ενός στενού εύρους. Επιπρόσθετα, αρκετές δοκιμές ποιοτικού ελέγχου ενσωματώθηκαν ειδικά στα στάδια ανάπτυξης του CaniLeish, προκειμένου να μπορούν να ανιχνευτούν ακόμη και μικρές αλλαγές στο προφίλ των παραγόμενων ESP και να απορριφθεί κάθε παρτίδα, που δεν εναρμονίζεται σύμφωνα με πολύ αυστηρές απαιτήσεις. Μία δοκιμή, η οποία αναπτύχθηκε ειδικά από το εργαστήριο βιολογικής ανάπτυξης της Virbac δίνει ένα «αποτύπωμα πρωτεΐνης», το οποίο μπορεί να ανιχνεύσει κάθε ενδεχόμενη αλλοίωση των χαρακτηριστικών των ESP (βλέπε σχήμα 2.6). Αυτό μπορεί να αποκαλύψει μη αναμενόμενες πρωτεϊνικές προσμίξεις ή να καταδείξει δευτερογενείς αλλοιώσεις στις πρωτεΐνες, για παράδειγμα λόγω θέρμανσης. Διεξάγεται ανάλυση του «δείκτη ομοιότητας» (similarity index) σε κάθε παρτίδα παραγόμενων ESP, προκειμένου να επιτρέψει την ανίχνευση οποιασδήποτε παρτίδας δεν ταιριάζει με το δείγμα αναφοράς. Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιείται, επίσης, για την αξιολόγηση της σταθερότητας του προϊόντος κατά τη διάρκεια της φύλαξής του και για την επιβεβαίωση της διάρκειας ζωής του. Κατά συνέπεια, διασφαλίζεται η παραγωγή ενός προϊόντος υψηλής σταθερότητας. Σχήμα 2.6 Παράδειγμα μιας μεθόδου πρωτεϊνικού αποτυπώματος με ηλεκροφόρηση, όπως χρησιμοποιείται στα στάδια του ποιοτικού ελέγχου Δείγμα αναφοράς Αποδεκτό Δείγμα αναφοράς με βλάβη Δείγμα αναφοράς με βλάβη παρόμοιο όχι παρόμοιο όχι παρόμοιο 24

25 Τεχνικά χαρακτηριστικά του προϊόντος 2.3 Γιατί επιλέχθηκε το QA-21 ως ανοσοενισχυτικό σε αυτό το εμβόλιο; Η κύρια προϋπόθεση για ένα εμβόλιο κατά της λεϊσμανίωσης του σκύλου, είναι η παραγωγή μιας ισχυρής Th1 κυτταρικής ανοσοαπόκρισης. Η ένεση μόνο νεκρών αντιγόνων σπάνια αποτελεί επαρκές μέσο για την επίτευξη αυτού του αποτελέσματος. Στην πραγματικότητα, πολλά συμβατικά ανοσοενισχυτικά είναι αποτελεσματικά μόνο στην πρόκληση χυμικής ανοσοαπόκρισης. Τα ανοσοενισχυτικά που ανήκουν στην κατηγορία των σαπωνινών διαθέτουν τη σπάνια ικανότητα να διεγείρουν την κυτταρική ανοσία, καθώς και τη χυμική ανοσία σε χαμηλές δόσεις 74,75. Η μοναδική ικανότητα που έχουν να διεγείρουν την Th1 απόκριση και την παραγωγή κυτταροτοξικών T λεμφοκυττάρων, τα καθιστά ιδανικά για χρήση σε εμβόλια έναντι ενδοκυτταρικών παθογόνων 75. Το Quil-A, ένα πρώιμο ανοσοενισχυτικό σαπωνίνης, είναι ένα μερικώς κεκαθαρμένο κλάσμα από το φλοιό του δέντρου Quillaja saponaria που περιέχει ένα σύνθετο μίγμα από διάφορα μόρια. Ωστόσο, θεωρείται πολύ τοξικό για χρήση σε ανθρώπινα εμβόλια, με σοβαρού βαθμού τοπικές αντιδράσεις, που σε πολλές περιπτώσεις συνοδεύονται από κοκκιώματα και αιμόλυση Μία στρατηγική που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να διατηρηθεί το όφελος που προσφέρουν οι σαπωνίνες ως ανοσοενισχυτικά, βελτιώνοντας ταυτόχρονα την ασφάλεια, είναι η χρήση ειδικών κλασμάτων υψηλής καθαρότητας με διαπιστωμένη δράση ανοσοενισχυτικού και χαμηλή τοξικότητα. Το QA-21 είναι ένα κεκαθαρμένο κλάσμα σαπωνίνης, που περιέχεται στο Quil-A. Διαθέτει αρκετά ικανοποιητικό συνολικό προφίλ ασφαλείας και έχει αποδειχθεί, σε μελέτες εμβολίων που έγιναν στον άνθρωπο (όπου είναι γνωστό ως QS-21), ως αποδεκτό και καλά ανεκτό 76,77. Σήμερα, στις μελέτες φάσης III το QA-21 είναι παγκοσμίως το καλύτερο υποψήφιο εμβόλιο, ανάμεσα στα εμβόλια της ελονοσίας 78. Έχει, επίσης, χρησιμοποιηθεί για χρόνια με εξαίρετο προφίλ ασφαλείας στο εμβόλιο Leucogen για τη FeLV στις γάτες. Το QA-21 είναι σημαντικά ασφαλέστερο από το Quil-A και επίσης στις μελέτες που πραγματοποιήθηκαν με ένα άλλο πρωτότυπο εμβόλιο για τη Leishmania, προκάλεσε το υψηλότερο επίπεδο παραγωγής IFN-γ από όλα τα ανοσοενισχυτικά που εξετάστηκαν στους εμβολιασμένους σκύλους συμπεριλαμβανομένων των σαπωνίνων Quil-A και Riedel de Haen 75. Αυτό σημαίνει ότι η σχέση οφέλους/ επικινδυνότητας είναι εξαιρετικά καλή. Σχήμα 2.7 Χημική δομή του QA-21 O OH OH O COOH O O O CHO O O O OH O O OH O OH O CH 2 OH OH OH OH O OH OH O OH O O OH OH O OH O O OH O OH O OH OH OH OH OH 25

26 2Ένα εξαιρετικό, νέο εργαλείο για την πρόληψη της λεϊσμανίωσης του σκύλου Ποιος είναι ο ρόλος του εκδόχου λυοφιλοποίησης; Κατά την αποθήκευση των εμβολίων που περιέχουν πρωτεΐνες, τα αντιγόνα μπορεί να υποστούν ποικίλες αντιδράσεις πρωτεϊνικής αποδόμησης, οι οποίες θα μπορούσαν να εκμηδενίσουν την αποτελεσματικότητα του εμβολίου. Για να προληφθεί αυτό, μπορεί να χρησιμοποιηθεί ένα λυοφιλοποιημένο σκεύασμα, για το οποίο χρειάζεται να χρησιμοποιηθεί ένα κατάλληλο έκδοχο λυοφιλοποίησης. Το έκδοχο στο CaniLeish περιέχει ένα ρυθμιστικό διάλυμα (Tris) για τη διατήρηση του σωστού ph, ένα λυοπροστατευτικό (σακχαρόζη) για την πρόληψη πιθανής πρωτεϊνικής καταστροφής κατά τη διαδικασία της ψύξης και ένα πηκτικό μέσο για το λυοφιλοποιημένο σύμπηκτο (μαννιτόλη) Πώς επιλέχθηκαν οι συγκεντρώσεις του αντιγόνου και του ανοσοενισχυτικού; Κατά τη διάρκεια της εκτεταμένης φάσης ανάπτυξης του CaniLeish, εξετάστηκαν πολλά σκευάσματα εμβολίου, σε καθένα από τα οποία χρησιμοποιήθηκε διαφορετική ποσότητα ESP και διαφορετική ποσότητα QA-21. Οι δοκιμασίες για την ειδική αντιλεϊσμανιακή κυτταρική ανοσία κατέδειξαν ότι τα εμβόλια που περιείχαν στη σύνθεσή τους μόνο 60μg QA-21 έδωσαν αρκετά παρόμοια αποτελέσματα με εκείνα που περιείχαν στη σύνθεσή τους μεγαλύτερες ποσότητες, αλλά είχαν καλύτερη τοπική ανοχή. Οι ίδιες δοκιμασίες κατέδειξαν, επίσης, ότι απαιτούνταν τουλάχιστον 100μg ESP, σε συνδυασμό με το ανοσοενισχυτικό, προκειμένου να εξασφαλιστεί ότι όλοι οι σκύλοι εμφάνιζαν σταθερά ειδική κυτταρική ανοσία πάνω από τον ουδό. Συνεπώς, για την επίτευξη του μέγιστου προστατευτικού οφέλους με το υψηλότερο περιθώριο ασφάλειας, η περιεκτικότητα της τελικής σύνθεσης προσδιορίστηκε στα τουλάχιστον 100μg ESP σε συνδυασμό με 60μg QA Περίληψη Το CaniLeish είναι ένα εξαιρετικό, νέο εργαλείο για την πρόληψη της λεϊσμανίωσης του σκύλου. Οι ESP είναι καλύτεροι διεγέρτες για την κυτταρική ανοσία σε σύγκριση με τα εκχυλίσματα ολόκληρου του παρασίτου. Ως αποτέλεσμα της μοναδικής μεθόδου παραγωγής που χρησιμοποιείται για την παρασκευή του CaniLeish, όλες οι πρωτεΐνες στο υπερκείμενο στρώμα καλλιέργειας είναι ESP. Ένα σημαντικό μέρος των ESP σχηματίζονται από αντιγόνα της οικογένειας PSA έναν επιθυμητό αντιγονικό στόχο. Μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις όπως η γλυκοζυλίωση, εξασφαλίζουν τη διατήρηση της αρχικής δομής της πρωτεΐνης. Οι ESP μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη διέγερση της ανοσοαπόκρισης έναντι όλων των σταδίων του βιολογικού κύκλου του παρασίτου. Το QA-21 κατευθύνει το ανοσοποιητικό σύστημα προκειμένου να εξασφαλίσει την κατάλληλη Th1 απόκριση μνήμης. 26

27 CaniLeish : Αποδεδειγμένη 3αποτελεσματικότητα

28

29 3 CaniLeish : Αποδεδειγμένη αποτελεσματικότητα 3.1 Υπόβαθρο Κύριος στόχος του εμβολιασμού έναντι οποιασδήποτε πρωτοζωικής νόσου είναι η ελαχιστοποίηση του αριθμού των εμβολιασμένων σκύλων που θα μεταβούν στο στάδιο της συμπτωματικής νόσου, στην οποία κινδυνεύει η ζωή του σκύλου και απαιτείται θεραπεία. Ωστόσο, στα πλαίσια της εξαιρετικά ποικίλης φύσεως της λεϊσμανίωσης του σκύλου, έχει επίσης μεγάλη αξία η ελαχιστοποίηση του αριθμού των σκύλων που ανήκουν στην ομάδα της ασυμπτωματικής λοίμωξης (βλέπε σχήμα 1.4). Οι σκύλοι αυτοί, παρόλο που δεν εμφανίζουν τη νόσο και επομένως δεν προκαλούν ανησυχία στον ιδιοκτήτη τους, εξακολουθούν να είναι μολυσματικοί για τις σκνίπες και ως εκ τούτου, εξακολουθούν να συνεισφέρουν σημαντικά στην επιδημιολογία της νόσου 33. Επίσης, διατρέχουν κίνδυνο να περάσουν στη συμπτωματική φάση της νόσου 4,21. Προκειμένου να πετύχει τους παραπάνω στόχους, κύρια προϋπόθεση για ένα εμβόλιο έναντι της λεϊσμανίωσης του σκύλου είναι η επαγωγή σταθερής, ειδικής, κυτταρικής ανοσίας, κατάλληλης για την αντιμετώπιση ενός ενδοκυτταρικού παθογόνου 79. Μια τέτοια απόκριση θα είναι σε θέση να αναγνωρίσει το αντιγόνο και να αναπτύξει μια μακροχρόνια ανοσολογική μνήμη με ισχυρή πολικότητα Th1, η οποία θα είναι ικανή, με τη σειρά της, να πυροδοτήσει μια αποτελεσματική κυρίαρχη Th1 ενεργό απόκριση, αφού έρθει αντιμέτωπη με το παράσιτο. Αυτή η μορφή της απόκρισης περιγράφηκε λεπτομερέστερα στην παράγραφο 1.3. Τόσο ο στόχος (κλινική προστασία) όσο και η προαπαίτηση (ειδική διέγερση της κυτταρικής ανοσίας με απόκριση Th1 μνήμης) διερευνήθηκαν κατά την ανάπτυξη του CaniLeish. 3.2 Τεκμηριωμένη κλινική προστασία Το όφελος του CaniLeish καταδείχθηκε με δύο τρόπους, ώστε να τεκμηριωθεί η κλινική προστασία (στόχος του εμβολιασμού). Πρώτον, σε ένα πειραματικό μοντέλο πρόκλησης, το οποίο σχεδιάστηκε για να δείξει τη διάρκεια της ανοσίας και δεύτερον σε μια μελέτη σταθμού, κατά την οποία οι σκύλοι εκτέθηκαν σε υψηλή, συνεχή, φυσική πίεση λοίμωξης κατά τη διάρκεια 2 εποχών μετάδοσης της νόσου Ένα πειραματικό μοντέλο πρόκλησης καταδεικνύει την εξαιρετική προστατευτική ικανότητα του CaniLeish, ένα χρόνο μετά από τον τελευταίο εμβολιασμό Κάτω από φυσιολογικές συνθήκες, η απόλυτη δοκιμασία για ένα εμβόλιο, βάσει απαιτήσεων για την απόκτηση της έγκρισης, είναι μια μελέτη πειραματικής πρόκλησης. Εντούτοις, η παραγωγή ενός κατάλληλου μοντέλου πρόκλησης, για τη συγκεκριμένη νόσο αποτελεί από μόνη της μια σημαντική πρόκληση 35,72. Η κανονική πρόκληση πεδίου, συνίσταται στην επαναλαμβανόμενη έκθεση σε σχετικά μικρούς αριθμούς προμαστιγωτών, τα οποία ενοφθαλμίζονται ενδοδερμικά μαζί με σίελο σκνίπας. Η εργασία που έγινε σχετικά με τις φυσικές λοιμώξεις από L. infantum, υποδηλώνει πως κάτω από βέλτιστες συνθήκες ως προς τον ενδιάμεσο ξενιστή, οι σκύλοι σε μερικές αγροτικές περιοχές της Μεσογείου, μπορεί να δεχτούν έως και ένα μολυσματικό τσίμπημα την ώρα κατά τη διάρκεια της νύχτας, τους θερμούς μήνες 72. Η ανταπόκριση σε αυτή την έκθεση ποικίλλει σε μεγάλο βαθμό και πολλοί σκύλοι μπορούν να διαχειριστούν αποτελεσματικά αυτό το επίπεδο πρόκλησης. Αυτό σημαίνει, ότι σε ένα μεγάλο ποσοστό περιπτώσεων είναι δύσκολη η ανάπτυξη μοντέλων τεχνητής πρόκλησης που επάγουν επαναλαμβανόμενη, ενεργό λοίμωξη. Έχει καταδειχθεί ότι η ενδοφλέβια χορήγηση προμαστιγωτών μπορεί να αυξήσει τη μολυσματικότητά τους 80. Εξετάστηκαν αρκετά στελέχη του παρασίτου και τελικά επιτεύχθηκε η ανάπτυξη ενός χρήσιμου μοντέλου πρόκλησης, προσαρμοσμένου στην αξιολόγηση της διάρκειας της ανοσίας, που παρέχει ένα εμβόλιο έναντι της λεϊσμανίωσης του σκύλου. 29