«ΠΡΟΕΜΦΥΤΕΥΤΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ: ΕΝΔΕΙΞΕΙΣ, ΣΚΟΠΙΜΟΤΗΤΑ, ΤΕΧΝΙΚΗ ΚΑΙ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ»

Transcript

1 «ΠΡΟΕΜΦΥΤΕΥΤΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ: ΕΝΔΕΙΞΕΙΣ, ΣΚΟΠΙΜΟΤΗΤΑ, ΤΕΧΝΙΚΗ ΚΑΙ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ» ΣΙΜΟΠΟΥΛΟΥ ΜΑΡΑ Κλινική Εμβρυολόγος/Γενετίστρια ΛΕΚΤΟΡΑΣ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΕΘΝΙΚΟ & ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ

2 ΠΓΔ Ανιχνεύει γενετικές ανωμαλίες σε έμβρυα προ της εμφύτευσης. Επιτρέπει επιλεκτική μεταφορά στη μήτρα φυσιολογικών εμβρύων. Απαιτεί δημιουργία εμβρύων in vitro. Πραγματοποιείται κατόπιν αφαίρεσης και γενετικής ανάλυσης πολικών σωματίων, 1-2 βλαστομεριδίων στο στάδιο της αυλάκωσης, ή τροφοεξωδέρματος στο στάδιο της βλαστοκύστης.

3 ΠΓΔ MΕΘΟΔΟΣ Δημιουργία εμβρύων in vitro με IVF Βιοψία πολικών σωματίων, βλαστομεριδίων FISH, PCR, CGH, ή microarrays για γενετική διάγνωση. ΑΣΘΕΝΕΙΣ Καθ έξιν αποβολές-αδιευκρίνιστης αιτιολογίας. Καθ έξιν αποβολές λόγω χρωμοσωμικής ανωμαλίας. Ηθικές η θρησκευτικές ενστάνσεις για διακοπή κυήσεως. Υπογόνιμα ζευγάρια.

4 ΠΓΔ Το ζευγάρι φέρει κάποια γενετική ανωμαλία. Έχουν ήδη ένα παιδί που νοσεί Άλλα μέλη της οικογένειας μπορεί να φέρουν τη νόσο. ΕΠΙΛΟΓΕΣ Παραμένουν άτεκνοι Αναπαραγωγική ρουλέτα Προγεννητική Διάγνωση Υιοθεσία Χρήση ξένων γαμετών ΠΓΔ

5 Είδη Ασθενειών Αυτοσωματική υπολειπόμενη (Κυστική Ίνωση, β-θαλασσαιμία, Δρεπανοκυτταρική αναιμία, Νόσος Tay-Sachs, κ.α.) Αυτοσωματική επικρατής (Νόσος Huntington, Μυοτονική Δυστροφία, κ.α.) X-φυλοσύνδετη (Μυϊκή Δυστροφία Becker, Duchenne, Σύνδρομο Εύθραυστου Χ, κ.α.). Χρωμοσωμικές ανωμαλίες (Δομικές & Αριθμητικές) Aνευπλοειδία

6 Γενετική Συμβουλευτική Όλοι οι ασθενείς το χρειάζονται πριν ξεκινήσουν ΠΓΔ. Η Αμερικάνικη Κοινότητα Ανθρώπινης Γενετικής όρισε τη Γενετική Συμβουλευτική ως: Μια διαδικασία επικοινωνίας που ασχολείται με τα ανθρώπινα προβλήματα που συνδέονται με περιστατικά γενετικής ανωμαλίας η την πιθανότητα περιστατικών μίας γενετικής ανωμαλίας σε μια οικογένεια.

7 Αναπαραγωγικό Ιστορικό Περιστατικών για ΠΓΔ Φυσιολογικό νεογνό 70% 7% 9%. 14% Νεογνό με χρωμοσωμική ανωμαλια Διακοπή κύησης λόγω χρωμοσωμικής ανωμαλίας Αυτόματη Αποβολή

8 ΒΙΟΨΙΑ 1. Πολικού Σωματίου 2. Στάδιο Αυλάκωσης 3. Βλαστοκύστης

9 Εξετάζει μόνο τα μητρικά χρωμοσώματα Θετικά: Preconception Diagnosis.Doesn t affect actual embryo Βιοψία Πολικού Σωματίου 2 ομάδες στις Η.Π.Α Χρειάζεται 1ο & 2ο σωμάτιο Χρονοβόρα & επίπονη διαδικασία

10 Βιοψία Πολικού Σωματίου

11 2 κύτταρα 2η Μέρα 4 κύτταρα

12 8 κύτταρα- 3η Μέρα

13 Δεν επηρεάζει μετέπειτα ανάπτυξη. Βιοψία στην 3η μέρα της ζωής Του εμβρύου Στάδιο ανάπτυξης 6-10 βλαστομερίδια. Βλαστομερίδια ολοδύναμα. Πρόβλημα: Συνείληση & πιθανότητα κυτταρικής διάσπασης 1-2 βλαστομερίδια απαραίτητα για ανάλυση.

14 Βιοψία στο στάδιο της αυλάκωσης Δύο στάδια: Διάνοιξη διάφανης ζώνης Αφαίρεση βλαστομεριδίων

15 Βιοψία Α Β Δ

16 Βιοψία στο στάδιο της αυλάκωσης Διάνοιξη διάφανης ζώνης Τρείς μέθοδοι έχουν αναφερθεί: 1.Acid Tyrodes (Οξύ) 2.Μηχανικά 3.Laser

17 Βιοψία στο στάδιο της αυλάκωσης Αφαίρεση Βλαστομεριδίου Τρείς μέθοδοι: 1.Αναρρόφηση (Aspiration) 2.Εξώθηση (Extrusion) 3.Εκτόπιση (Displacement)

18 Βιοψία στο στάδιο της αυλάκωσης Αφαίρεση Βλαστομεριδίου- Αναρρόφηση (Aspiration) Η περισσότερο κοινή μέθοδος μέχρι πρόσφατα Χρειάζονται 2 μικροπιππέτες. Είσοδος πιππέτας μέσα από το άνοιγμα & αναρρόφηση βλαστομεριδίου

19 Βιοψία Βλαστοκύστης 5-6 μέρα- Βιοψία κυττάρων από το τροφοεξώδερμα. Μειονεκτήματα Μόνο 40% των εμβρύων φτάνουν το στάδιο της βλαστοκύστης. Μη ικανοποιητικός αριθμός εμβρύων για ΠΓΔ. Ανεπαρκείς χρόνος για τη διάγνωση. Τα κύτταρα του τροφοεξωδέρματος μπορεί να διαφέρουν από αυτά της εσωκυτταρικής μάζας λόγω μωσαϊκισμού Μειωμένη διαγνωστική αξιοπιστία. Η διάφανη ζώνη είναι λεπτή & τα κύτταρα μπορεί ν διαφύγουν από το άνοιγμα.

20 Βιοψία Βλαστοκύστης 5-6 μέρα- Βιοψία κυττάρων από το τροφοεξώδερμα. Γιατί αποτελεί πλέον την καλύτερη επιλογή Περισσότερα κύτταρα μπορούν να αφαιρεθούν Περισσότερες πληροφορίες από την ανάλυση τους. Βελτιωμένες συνθήκες καλλιέργειας εμβρύων ενισχύουν τη δημιουργία βλαστοκύστης στο εργαστήριο Σε συνδυασμό με την εφαρμογή υαλοποίησης εξασφαλίζοντας εξαιρετικά ποσοστά επιβίωσης η βιοψία βλαστοκύστης γίνεται η καλύτερη επιλογή-το θέμα του χρόνου δεν αποτελεί πρόβλημα.

21 Διάγνωση 1. Ακριβής 2. Ευαίσθητη 3. Γρήγορη (όχι απαραίτητα λόγω υαλοποίησης)

22 Διάγνωση (αρχική προσέγγιση) Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR) Αναλύει τη συγκεκριμένη μετάλλαξη Μονογονιδιακά νοσήματα Χ-Φυλοσύνδετες ασθένειες Φθορίζων Υβριδισμός in situ (FISH) Χρωμοσωμική ανάλυση Χρωμοσωμικές ανωμαλίες PGD-AS (ΠΓΔ για ανευπλοειδία)

23 c Locus-specific ανιχνευτής- Ειδικών γονιδίων. d Sub-telomeric probes Ανιχνευτής τελομεριδίου. Ανιχνευτές Πολυχρωμικής FISH a Ανιχνευτής για ολόκληρο το χρωμόσωμα b α-satellite Αλφοειδής Ανιχνευτής επαναλαμβανομένων αλληλουχιών κεντρομεριδίων

24 Δομικές Χρωμοσωμικές Ανωμαλίες Μεταθέσεις Robertsonian-Κεντρική Σύντηξη Στα ακροκεντρικά χρωμοσώματα 13, 14, 15, 21, 22. Σπάσιμο στο κεντρομερίδιο Έλλειψη η Πλεονασμός ολόκληρου χρωμοσώματος. Αμοιβαίες Οποιαδήποτε χρωμοσώματα & σπασίματα Μετάθεση ένθεσης η παρεμβολής Αναστροφές (Περικεντρικές η παρακεντρικές) Δεν έχουν φαινοτυπικό αποτέλεσμα μόνο γονοτυπικό!

25 Αμοιβαία Μετάθεση - 46,XX,t(5:11)(q34;q25) 5q der 5 der q2 5 5p LSI D5S23 control chromosome 11 centromere 11q sub telomeric probe

26 Στρατηγική Χρήσης Ανιχνευτών Δοκιμάζονται σε λεμφοκύτταρα κανονικού καρυότυπου. Στα λεμφοκύτταρα του ατόμου που φέρει τη μετατόπιση. Προκειμένου να εξασφαλιστεί η αποτελεσματικότητα τους στο να μπορούν να δίνουν διαφορετικούς χρωματικούς συνδυασμούς στα κανονικά χρωμοσώματα & στα παράγωγα τους.

27 Αμοιβαία Μετάθεση - 46,XX,t(5:11)(q34;q25) - FISH work-up Φυσιολογικός πυρήνας μεσόφασης. Πυρήνας μεσόφασης που φέρει τη μετάθεση der11 der 5 der5 Χρωμοσώματα μετάφασης Χρωμοσώματα μετάφασης που φέρουν τη μετάθεση.

28 Aποτέλεσμα αναφορών για ΠΓΔ για χρωμοσωμικές ανωμαλίες. Στάδιο βιοψίας ΠΓΔ Αναμονή για ΠΓΔ 17% 3% 21% IVF/PGD ακύρωση για κλινικούς λόγους Φυσιολογικό κύημα 8% Απόφαση κατά ΠΓΔ για ηθικούς, οικογενειακούς η οικονομικούς λόγους. 3% 13% 7% 8% 20% Χρήση γαμετών δότη Αποφάσισαν υπέρ του Προγεννητικού Ελέγχου Έχασαν επαφή με το κέντρο

29 Ποσοστό Χρωμοσωμικά φυσιολογικών και μη εμβρύων από 11 κύκλους ΠΓΔ No εμβρύων Chromosomally Balanced Embryos* Chromosomally Abnormal Embryos Περιστατικά ΠΓΔ Για τα χρωμοσώματα που εξετάστηκαν

30 Περιορισμοί στην ΠΓΔ Οι ασθενείς πρέπει να υποβληθούν σε IVF Κόστος Όλα τα έμβρυα ενδέχεται να είναι ακατάλληλα προς εμβρυομεταφορά Τα ποσοστά επιτυχίας χαμηλότερα από IVF

31 Περιορισμοί στην ΠΓΔ Τυπικό περιστατικό 12 ωάρια 10 Γονιμοποιούνται 8 Κατάλληλα για βιοψία 7 Αποτέλεσμα από την ανάλυση 5 Μη φυσιολογικά 2 Φυσιολογικά 1 καλής μορφολογίας 1 κακής μορφολογίας

32 Ηθικά Διλήμματα IVF Έρευνα σε έμβρυα (Νομοθεσία, Θρησκευτικές ενστάσεις) ΠΓΔ Designer Babies Ασθένειες όψιμης έναρξης?? (Alzheimer s, Parkinson s) Εξισορρόπηση οικογενείας?? Xαρακτηριστικά?? Για όσο περισσότερα γονίδια μπορούμε να ελέγχουμε τόσο λιγότερα έμβρυα θα θεωρούνται κατάλληλα

33

34 AMA-RIF-RM Mεγαλύτερες σε ηλικία γυναίκες παράγουν μεγαλύτερο ποσοστό χρωμοσωμικά ανώμαλων ωοκυττάρων Χρωμοσωμικά ανώμαλα έμβρυα Χαμηλά ποσοστά κυήσεων αυξημένες αυτόματες αποβολές. Επιλογή κατάλληλων εμβρύων:μορφολογία & χρωμοσωμική κατάσταση. Χρωμοσωμικές ανωμαλίες συναντώνται σε αποβολές αφορούν τα χρωμοσώματα: 13, 16, 18, 21, X, Y. Χρησιμοποιούμε ανιχνευτές για αυτά τα χρωμοσώματα Βελτιώνοντας % επιτυχίας IVF με ΠΓΔ για ανευπλοειδία PGD-AS

35 ΠΓΔ για ανευπλοειδία Σκοπός Αύξηση ποσοστού εμφύτευσης Μείωση αυτομάτων αποβολών Ενδείξεις Άυξημένη ηλικία >35 ετών Προηγούμενες αποτυχημένες προσπάθειες IVF Καθ έξιν αποβολές. Προβλήματα σπερματικού ελέγχου.

36 FISH 5 χρωμάτων Έλεγχος ανευπλοειδίας a b X (χρυσό), Y (μπλέ), 13 (πράσινο), 18 (τυρκουάζ) and 21 (κόκκινο) 13(κόκκινο), 16(τυρκουάζ), 18(μπλέ) 21(πράσινο) and 22(χρυσό) From Santiago Munne

37 Χρωμοσώματα σε Χαοτικά- Διαφορετική χρωμοσωμική διάταξη σε κάθε πυρήνα έμβρυα αυλάκωσης Φυσιολογικά Όλα τα κύτταρα είναι ομοιόμορφα διπλοειδή Aνώμαλα - Όλα τα κύτταρα είναι ομοιόμορφα ανώμαλα π.χ.:μονοσωμία 18. Μωσαϊκά Δύο η περισσότερες κυτταρικές σειρές που διαφέρουν χρωμοσωμικά συνυπάρχουν στο έμβρυο. Συνήθως απλοειδή η τετραπλοειδή κύτταρα παρατηρούνται.

38 Παράγοντες που επηρεάζουν τις χρωμοσωμικές Ηλικία ανωμαλίες. Μορφολογία εμβρύου Προδιάθεση ασθενών Έμβρυα ανεσταλμένης ανάπτυξης. Κύτταρα με πολλαπλούς πυρήνες.

39 Ηλικία & το επίπεδο των χρωμοσωμικών ανωμαλιών Ηλικία % Ανώμαλα % % % Munne et al, Fert and Sterl 1995

40 Φυσιολογικά αναπτυσσόμενα έμβρυα Φυσιολογικά Ανώμαλα Μωσαϊκά Χαοτικά 1 45% 6% 49% 2 69% 2% 22% 7% 3 48% 2% 24% 26% 1. Munne et al, Fert and Ster, Harper et al, Prenatal Diagnosis, Delhanty et al, Human Genetics, 1997

41 Μορφολογία & Χρωμοσωμικές ανωμαλίες Φυσιολογικά Ανώμαλα Μωσαϊκά Χαοτικά I 69% 0 19% 2% II 42% 4% 31% 23% III 48% 0 12% 40% Delhanty et al, Human Genetics, 1997

42

43 To Μέλλον είναι εδώ! Εξάλειψη αιτιών εσφαλμένης διάγνωσης Μέθοδοι προς εξέταση όλων των ρωμοσωμάτων

44 SKY FISH στο 1ο πολικό σωμάτιο

45 Συγκριτικός Γενομικός Υβριδισμός Comparative Genomic Hybridisation (CGH)

46 Συγκριτικός Γενομικός Υβριδισμός (CGH) Test DNA (Πρός έλεγχο) Normal/Control DNA 46 XY (Φυσιολογικό) Φυσιολογικό Τρισωμία 21 Μονοσωμία 21 1:1 3:2 1:2

47 CGH ανάλυση

48 CGH σε προεμφυτευτικά έμβρυα CGH πείραμα ανακαλύπτοντας μονοσωμία 1 σε ένα θηλυκό έμβρυο.

49 Microarrays DNA chips DNA επισυνάπτεται σε μία αδιάλυτη επιφάνεια. Δυνατή η ανάλυση για: 1. Gene expression-γονιδιακή έκφραση 2. DNA sequence-αλληλουχία DNA 3. Ανευπλοειδία. Ταυτόχρονη ανάλυση χιλιάδων αλληλουχιών DNA

50 Microarrays Test DNA DNA προς έλεγχο Control DNA Φυσιολογικό DNA Μειωμένη έκφραση Ίση έκφραση Αυξημένη έκφραση.

51 Microarrays DNA chips Ακριβή τεχνική Όχι διαθέσιμο εμπορικά για χρήση ρουτίνας Τεχνολογικά προβλήματα υποστήριξης ΌΧΙ ΠΛΕΟΝ

52 ΠΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ Η διαγνωστική ποιότητα της τεχνικής πρέπει να δοκιμαζεται σε κυτταρικές σειρές που φέρουν γνωστές ανευπλοϊδίες, επιθηλιακά κύτταρα και καρκινικές σειρές

53

54

55

56

57

58 Καίρια ερωτήματα Είναι ασφαλές για τα έμβρυα? Σε ποιο στάδιο να πραγματοποιείται η βιοψία Τελευταίες τάσεις προς blastocyst and PB biopsy Issues surrounding bl. Biopsy is it right for PGD? Μπορεί ο ΠΓΕ να αυξήσει τα ποσοστά εγκυμοσύνης? Το ζητούμενο παραμένει Take home healthy baby rate More Data is required ESHRE task force

59