Προγεννητική και Προεμφυτευτική. νοσημάτων

Transcript

1 Προγεννητική και Προεμφυτευτική διάγνωση μονογονιδιακών νοσημάτων Joanne Traeger-Συνοδινού Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Ιατρικής Γενετικής Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών

2 Προγεννητική ιάγνωση -Γιατί; Η Θεραπεία (π.χ. χ γονιδιακή θεραπέια) δεν είναι ακόμα εφικτή Η ιατροφαρμακευτική υποστήριξη και αγωγή των πασχόντων δεν είναι απλή H πρόληψη αποτελεί την λύση για την αντιμετώπιση σοβαρών γενετικών νοσημάτων Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής, Πανεπιστημίου Αθηνών

3 Σκοπός της Προγεννητικής διάγνωσης Είναι να δοθεί στους γονείς, εφ όσον οι ίδιοι το επιλέγουν, η διαβεβαίωση ότι θα αποκτήσουν μη προσβεβλημένα παιδιά, για συγκεκριμένο γενετικό νόσημα για το οποίο υπάρχει αυξημένος κίνδυνος. Αυτό δεν προϋποθέτει ότι θα γεννήσουν φυσιολογικά παιδιά, δεδομένου ότι δεν είναι δυνατόν να ελεγχθούν όλες οι πιθανές συγγενείς ανωμαλίες ή γενετικές νόσοι. Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής, Πανεπιστημίου Αθηνών

4 Τα συχνότητερα μονογονιδιακά νοσήματα στην Ελλάδα Υπολειπόμενα μονογονιδιακά νοσήματα β Μεσογειακή αναιμία (& HbS) = ~10% φορείς Κυστική Ινωση (ΚΙΝ) = ~4 4 5% φορείς Νωτιαία Μυϊκή Ατροφία = ~2.5% φορείς Φυλοσύνδετα μονογονιδιακά νοσήματα Μυϊκές δυστροφίες (Duchenne) = ~1:3000 γεννήσεις αγοριών Εύθραυστο Χ = 1:4500 γεννήσεις αγοριών Εύθραυστο Χ = 1:7000 γεννήσεις κοριτσιών Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής, Πανεπιστημίου Αθηνών

5 Οι αιμοσφαιρινοπάθιες αποτελούν τα πιο συχνά μονογονιδιακά νοσήματα στον άνθρωπο Αιμοσφαιρίνη Τετραμερές μόριο (2 -τύπου αλυσίδες αιμοσφαιρίνης & 2 -τύπου αλυσίδες αιμοσφαιρίνης) Ομαδοποίηση της ΜΑ γίνεται σύμφωνα με την αλυσίδα της αιμοσφαιρίνης που εμφανίζει μειωμένη σύνθεση Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής, Πανεπιστημίου Αθηνών

6 Μοριακή βάση των Μεσογειακών συνδρόμων Μεσογειακή Αναιμία (~80 μεταλλάξεις) Κυρίως δ Μεσογειακή Αναιμία (~10 μεταλλάξεις) ελλείμματα -Μεσογειακή Αναιμία (~ 200 μεταλλάξεις) Κυρίως σημειακές μεταλλάξεις Το είδος όπως και η συχνότητα των μεταλλάξεων διαφέρουν από πληθυσμό σε πληθυσμό ρεπανοκυτταρική Αναιμία - HbS Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής, Πανεπιστημίου Αθηνών

7 Αιμοσφαιρινοπάθειες- Αυτοσωματικά υπολειπόμενα νοσήματα Η ετερόζυγη κατάσταση δεν συνοδεύεται από κλινικό φαινότυπο Ζευγάρια ετεροζυγωτών (φορέων) αντιμετωπίζουν πιθανότητα 1 στις 4 να αποκτήσουν πάσχον παιδί (για κάθε εγκυμοσύνη που ξεκινούν) Γονείς παιδιά φορέας φορέας πάσχον φυσιολογικός Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής, Πανεπιστημίου Αθηνών

8 Υπολειπόμενος φυλοσύνδετος τρόπος κληρονομικότητας 50% πιθανότητα γέννησης πάσχοντος άρρενος 50% πιθανότητα γέννησης ετεροζυγώτη θήλεος ΧΥ ΧΧ Γονείς ΧΥ ΧΥ ΧΧ Υγιές άρρεν Πάσχον άρρεν Υγιές θήλυ Παιδιά ΧΧ Φορέας θήλυ Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής, Πανεπιστημίου Αθηνών

9 Η πρόληψη συμπεριλαμβάνει Εντοπισμός ζευγαριών με κίνδυνο να αποκτούν παιδί με σοβαρό γενετικό νόσημα Γενετική συμβουλευτική Προγεννητική ήή ή προεμφυτευτική διάγνωση Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής, Πανεπιστημίου Αθηνών

10 Ανίχνευση φορέων Βιοχημικός-Αιματολογικός έλεγχος Μοριακός έλεγχος Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής, Πανεπιστημίου Αθηνών

11 Η επιλογή της κατάλληλης προσέγγισης για εντοπισμό όζ ζευγαριών με κίνδυνο εξαρτάται απο: Το ιστορικό Οικογενειακό Ατομικό Μαιευτικό Το νόσημα Συχνότητα Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής, Πανεπιστημίου Αθηνών

12 Στόχος της Προγεννητικής διάγνωσης Αξιοπιστία, ταχύτητα όσο το δυνατό νωρίτερα στην κύηση Η διαδικασία περιλαμβάνει: A) Ασφαλή και εύκολη λήψη εμβρυϊκού ιστού B) Εφαρμογή αξιόπιστων και ταχέων αναλυτικών μεθόδων διάγνωσης Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής, Πανεπιστημίου Αθηνών

13 mid 1970 s Ιστορική Αναδρομή Εμβρυϊκός ιστός Ανάλυση Εμβρυϊκό αίμα Aνάλυση η πρωτεϊνών (τέλος 2ου τριμήνου) Πέψη με περιοριστικά ένζυμα Κύτταρα αμνιακού υγρού & Southern blotting late 1970 s Έλεγχος ελλειμμάτων (gene mapping) : (αρχή 2ου τριμήνου) Early 1980 s 1985 Τροφοβλάστη/Χοριακές λάχνες-cvs (1ο τρίμηνο) 1979: -Μεσογειακή Αναιμία Έμμεση διάγνωση μέσω συνδεόμενων δό (linked) πολυμορφισμών 1978: δρεπανοκυτταρική & 1980: -μεσογειακή Αναιμίαl Υβριδισμός με ολιγονουκλεοτίδια σε γενομικό DNA Αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (PCR) Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής, Πανεπιστημίου Αθηνών

14 Πηγές εμβρυϊκού DNA Αμνιακό υγρό >15 εβδομάδες 15 ml - 5 mg DNA (ίσως χρειάζεται καλλιέργεια) Χοριακές λάχνες (Τροφοβλάστη) εβδομάδα 45 mg DNA Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής, Πανεπιστημίου Αθηνών Source: Recombinant DNA, Second Edition, Eds Watson JD, Gilman M, Witkowski J, Zoller M

15 Οι γονεϊκές μεταλλάξεις ΠΡΕΠΕΙ να είναι γνωστές πριν την εφαρμογή PND Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής, Πανεπιστημίου Αθηνών

16 Σύγχρονες προσεγγίσεις στην ανάλυση του DNA και τον προγεννητικό έλεγχο (PND) Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής, Πανεπιστημίου Αθηνών

17 Μοριακός έλεγχος (ανάλυση DNA) Υπάρχουν πολλές μέθοδοι για μοριακή διάγνωση, αλλά σήμερα σχεδόν όλες βασίζονται στην αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (PCR) Denaturation 93 C - 95 C Annealing 37 C - 65 C Denaturation 93 C - 95 C CYCLES Extension 72 C Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής, Πανεπιστημίου Αθηνών

18 Μοριακός έλεγχος (ανάλυση DNA) Για την μέγιστη μγ ασφάλεια των αποτελεσμάτων, πρέπει να εξετάζεται το εμβρυϊκό δείγμα τουλάχιστον ΥΟ φορές, παράλληλα με δείγματα των γονέων και μαρτύρων, και, κατά προτίμηση με δύο ανεξάρτητες μεθοδολογίες Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής, Πανεπιστημίου Αθηνών

19 Μοριακός έλεγχος (ανάλυση DNA) Εάν οι γονεϊκές μεταλλάξεις είναι γνωστές πριν την εφαρμογή Π η απάντηση ολοκληρώνεται σε 1-5 εργάσιμες μέρες Γενετική συμβουλευτική Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής, Πανεπιστημίου Αθηνών

20 Σφάλματα κατά την προγεννητική διάγνωση Μέθοδοι που βασίζονται στην PCR - <0.5% (Old et al, Prenatal Diagnosis, 20: 986, 2000) * Επιμόλυνση * Αδυναμία πολλαπλασιασμού του ενός από τα δυο αλληλόμορφα (Allele Drop Out, ADO) Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής, Πανεπιστημίου Αθηνών

21 Άλλα πιθανά σφάλματα στην προγεννητική διάγνωση Λανθασμένη διάγνωση στους γονείς Μη πατρότητα Ανθρώπινο σφάλμα Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής, Πανεπιστημίου Αθηνών

22 Νέες προσεγγίσεις στην προγεννητική διάγνωση Νέες τεχνολογίες για Νέες πηγές την ανάλυση του εμβρυϊκού DNA DNA Συνδυασμός Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής, Πανεπιστημίου Αθηνών

23 Νέες τεχνολογίες στην υπηρεσία της γενετικής ανάλυσης Υψηλό κόστος εγκατάστασης αλλά μακροπρόθεσμα χαμηλό κόστος/δείγμα Μικροσυστοιχίες DNA (DNA chips-microarrays) PCR πραγματικού χρόνου (Real-time PCR) Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής, Πανεπιστημίου Αθηνών

24 Νέες πηγές εμβρυϊκού DNA Κύτταρα εμβρύων από εξωσωματική γονιμοποίηση (IVF) Προεμφυτευτική γενετική διάγνωση (ΠΓ - PGD) Εμβρυϊκά κύτταρα στην μητρική κυκλοφορία ή Ελεύθερο εξωκυτταρικό εμβρυϊκό DNA στην μητρική κυκλοφορία Μη επεμβατική Π Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής, Πανεπιστημίου Αθηνών

25 Προεμφυτευτική Γενετική Διάγνωση (ΠΓΔ) Προσφέρει σε ζευγάρια που έχουν κίνδυνο να μεταβιβάσουν β κάποια γενετική διαταραχή, τη δυνατότητα γενετικής διάγνωσης και μεταφοράς στη μήτρα μόνο των υγιών από τα έμβρυα που γονιμοποιούνται εξωσωματικά Το πλεονέκτημα σε σχέση με την προγεννητική διάγνωση (ΠΔ) είναι η αποφυγή να διακοπεί μια εγκυμοσύνη

26 Προεμφυτευτική Γενετική Διάγνωση (ΠΓΔ) Έλεγχος διαταραχών που ευθύνονται για σοβαρά γενετικά νοσήματα Μονογονιδιακά Νοσήματα (Αυτοσωμικά άυπολειπόμενα, Αυτοσωμικά επικρατητικά, Φυλοσύνδετα) Χρωμοσωμικές Ανωμαλίες (Αριθμητικές Δομικές) θ έ έ Έλεγχος ανευπλοειδιών (PGD for Aneuploidy Screening, PGS) Εφαρμόζεται σε ζευγάρια με φυσιολογικό καρυότυπο με σκοπό την βελτίωση της επιτυχίας της IVF

27 Σύντομη αναδρομή 1990 Πρώτη επιτυχής κλινική εφαρμογή 1999 Προεμφυτευτικός έλεγχος χρωμοσωμάτων 2002 ΠΓΔ για ασθένειες όψιμης εμφάνισης 1992 ΠΓΔ για Κυστική Ίνωση 1998 ΠΓΔ για β μεσογειακή αναιμία, ΠΓΔ για προδιάθεση για καρκίνο 2001 ΠΓΔ με έλεγχο ιστοσυμβατότητας (HLA) 50,000 κύκλοι διεθνώς > 10,000 μωρά Kuliev 2012

28 Κέντρο Υποβοηθούμενης Αναπαραγωγής Εργαστήριo Γενετικής Αξιολόγηση του περιστατικού Αξιολόγηση του περιστατικού και γενετική συμβουλή ΗΜΕΡΑ Ωοληψία Γονιμοποίηση Βιοψία Σχεδιασμό του πρωτόκολλου διάγνωσης Γενετική διάγνωση ανά ωάριο/έμβρυο 5 Μεταφορά των υγιών 6 εμβρύων Προγεννήτικη διάγνωση και παρακολούθηση παιδιών

29 Εφαρμογή ΠΓΔ για Μονογονιδιακά Νοσήματα

30 Ενδείξεις για την εφαρμογή ΠΓΔ για μονογονιδιακά νοσήματα Κίνδυνος μεταβίβασης σοβαρού γενετικού νοσήματος Όταν συνυπάρχει Υπογονιμότητα Ενδοιασμοί για διακοπή κύησης Ιστορικό προηγουμένων διακοπών κυήσεων μετά από προγεννητική διάγνωση Hθικές αναστολές Kanavakis & Traeger Synodinos, J Med Genet, 2002 Traeger Synodinos et al, Mol Hum Reprod, 2003.

31 ΠΓΔ μπορεί να εφαρμοστεί, θεωρητικά, για οποιοδήποτε μονογονιδιακό νόσημα για το οποίο η αλληλουχία του υπεύθυνου γονιδίου είναι γνωστή ή υπάρχουν συνδεόμενοι πολυμορφισμοί (linked markers) rs)

32 Προδιαγραφές πρωτοκόλλου ΠΓΔ o Ταχύτητα: αποτέλεσμα μέσα σε ~24 36 ώρες o Ευαισθησία: εφαρμογή PCR σε ένα κύτταρο (~6pg) o Αξιοπιστία: Επιτυχής καθορισμός γονοτύπου o Ακρίβεια: : 100% ειδικότητα

33 Περιορισμοί από την βιολογία των εμβρυϊκών δειγμάτων 1. Υλικό για τη γενετική διάγνωση = 1 κύτταρο Δυνατότητα μιας & μόνο αρχικής αντίδρασης 2. Αρκετές φορές το γενετικό υλικό εμβρυϊκά κύτταρα είναι κακής ποιότητας στα 3. Πθ Πιθανότητα το εμβρυϊκό κύτταρο προς εξέταση να μην αντιπροσωπεύει το υπόλοιπο έμβρυο (μωσαϊκισμός)

34 Πηγές Γενετικού Υλικού στην ΠΓΔ 1 0 και 2 0 πολικό σωμάτιο 1 η ημέρα Βλαστομερίδιο 3 η ημέρα Κύτταρα από βλαστοκύστη ημ ρ 5 η ημέρα

35 Βιοψία Πρώτου και ύ εύτερου Πολικού Σωματίου Πλεονεκτήματα Βιοψία σε γαμετικά κύτταρα (ωάρια) αντί σε έμβρυα Τα πολικά σωμάτια θα απορρίπτονταν κατά την ανάπτυξη του εμβρύου Μειονεκτήματα υσκολία στην απομόνωση Μικρή ποσότητα γενετικού υλικού για διάγνωση Πολυπλοκότητα κατά τη γενετική διάγνωση (έμμεσος χαρακτηρισμός του γονοτύπου των ωαρίων και άγνωστος ο γονότυπος του πατρικού γαμετικού κυττάρου) Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής

36 Βιοψία Βλαστομεριδίου Προτιμώμενη πηγή εμβρυϊκού γενετικού υλικού από τα περισσότερα κέντρα ΠΓ Πλεονεκτήματα Μη η διαφοροποιημένο εμβρυϊκό κύτταρο Ευκολία στην απομόνωση Μειονέκτημα Μικρή ποσότητα γενετικού υλικού για διάγνωση (1 ή 2 κύτταρα) ) Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής

37 Βιοψία κυττάρων από βλαστοκύστη Πλεονέκτημα Επιτρέπει την βιοψία περισσότερων κυττάρων (μέχρι ~20) Μειονεκτήματα υσκολία στην απομόνωση Μόνο το 40% των εμβρύων φτάνουν στο στάδιο της βλαστοκύστης Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής

38 Όλα τα πρωτόκολλα για το χαρακτηρισμό του γονότυπου βασίζονται στην PCR Χαρακτηρίζεται από μεγάλη ευαισθησία και ειδικότητα και μπορεί να πολλαπλασιάσει το τμήμα DNA που ενδιαφέρει από ελάχιστη αρχική ποσότητα δείγματος Αποδιάταξη 93 C 95 C Υβριδισμός 37 C 65 C Αποδιάταξη 93 C 95 C Επέκταση 72 C

39 Περιορισμοί που συνδέονται με το PCR του DNA από 1 έως λίγα κύτταρα Αποτυχία πολλαπλασιασμού του DNA Αποτυχία πολλαπλασιασμού από το ένα αλληλόμορφο (Allele drop out, ADO) Επιμόλυνση

40 Αποτυχία Πολλαπλασιασμού του DNA ΟΧΙ αποτέλεσμα Ανεπιθύμητο αλλά ακίνδυνο

41 Allele lele Drop Out και επιμόλυνση ΕΠΙΚΙΝΔΥΝΟ Λανθασμένη Γενετική Διάγνωση

42 Λύσεις για τους περιορισμούς 1. Αύξηση του DNA 2. Πολλαπλό PCR του αρχικού δείγματος

43 Whole genome amplification (WGA) Προηγείται το PCR και προσφέρει Πολλαπλασιασμό λ ό ολόκληρου λ του γονιδιώματος Αύξηση των διαθέσιμων αντιγράφων του DNA για τη γενετική ανάλυση που προσομοιάζει στη συνέχεια το γενομικό DNA Μειονεκτήματα Η διάγνωση γίνεται πιο χρονοβόρα WGA Ανάλυση ΠΓΔ Έχει υψηλό ADO (30%) ανάγκη ταυτόχρονης ανάλυσης πολλών γενετικών τόπων για να εξασφαλιστεί αξιοπιστία Le Caignec et al, Nucl Acids Res 34: e68 (2006) Renwick et al, Prenat Diagn 27: (2007)

44 Πολλαπλό PCR multiplex PCR με ή χωρίς WGA από πριν Σωστός σχεδιασμός και βελτιστοποίηση Γονίδιο άμεση διάγνωση Βιοψία εμβρύου p q Πολυμορφικές θέσεις ανάλυση σύνδεσης (linkage analysis) Γενετική Διάγνωση

45 Στρατηγική ανάπτυξης πρωτοκόλλων ΠΓΔ ESHRE (2011) & PGDIS (2008) Best Practice Guidelines

46 Η ΠΓΔ έχει εφαρμοστεί για >300 μονογονιδιακά νοσήματα Αυτοσωμικά υπολοιπόμενα Cystic fibrosis Beta thalassemia Sickle cell anemia Spinal muscular atrophy Gaucher s disease Rhizomelic chondrodysplasia punctata 21 OHase deficiency Tay Sachs Alpha thalassemia Φυλοσύνδετα Duchenne s muscular dystrophy Becker muscular dystrophy Fragile X syndrome Hemophilia Adrenoleukodystrophy Glucose 6 phosphatase deficiency Lesch Nyhan disease Αυτοσωμικά επικρατούντα Myotonic dystrophy (DM1) a Charcot Marie Tooth 1A and 2A Huntington s disease Achondroplsia Alport syndrome Autosomal dominant Polycytic Kidney BRCA1 Retinoblastoma Spinocerebellar ataxia type 7 Stickler syndrome Tuberous sclerosis Neurofibromatosis type 1 FAP Gardner Syndrome Goossens et al, ESHRE PGD consortium data VIIΙ Hum Reprod 2008 Harper et al, ESHRE PGD consortium Hum Reprod 2012 Simpson JL 2013

47 Άλλες ενδείξεις για ΠΓΔ Α. Προεμφυτευτική τυποποίηση HLA Επιλογή συμβατού αδελφού δότη Β. ΠΓΔ για κληρονομικούς καρκίνους όπως του μαστού, του παχέος εντέρου του συνδρόμου Li Fraumeni κ.α. Γ. ΠΓΔ για νοσήματα όψιμης εμφάνισης Όπως Huntington Δ. ΠΓΔ για μιτοχονδριακά νοσήματα E. ΠΓΔ για επιλογή φύλου κοινωνικοί ίλό λόγοι (social sexing)

48 Προεμφυτευτική τυποποίηση HLA Chromosome 6 6p p22.3 p 6p22.1 6p p21.1 6p12.3 6p12.1 q 6q12 6q14.1 6q15 6q16.3 6q22.1 HLA region HLA A HLA B HLA DRA HLA DQB Επιλογή συμβατού αδελφού δότη για μεταμόσχευση σε προϋπάρχον παιδί στην οικογένεια με ανίατη ασθένεια 6q q24.1 6q25.1 6q25.3 6q27

49 Επιλογή συμβατού αδελφού δότη με ΠΓΔ Περιορισμοί Γενετική ή πιθανότητα Απαιτητικός ο σχεδιασμός και η εφαρμογή Επιτυχία εξωσωματικής Ηθικοί προβληματισμοί

50 Προεμφυτευτική τυποποίηση HLA Πιθανότητες εύρεσης συμβατού αδελφού δότη με βάση τη κληρονομικότητα ΠΓΔ για ιστοσυμβατότητα ΠΓΔ για ιστοσυμβατότητα σε συνδυασμό με υπολειπόμενο μονογονιδιακό νόσημα ΠΓΔ για ιστοσυμβατότητα σε συνδυασμό με επικρατητικό ή φυλοσύνδετο νόσημα 25% 18.8% 12.5%

51 Προεμφυτευτική τυποποίηση HLA Chromosome 6 Μεγάλο γ μέγεθος ς( (~4cM) 6p24.3 6p22.3 6p22.1 p 6p p21.1 6p12.3 6p12.1 HLA region HLA AA HLA B Έντονη πολυμορφικότητα του συστήματος HLA q 6q12 6q14.1 6q15 6q16.3 6q22.1 6q22.33 HLA DRA HLA DQB1 Άμεση τυποποίηση : δεν είναι πρακτικό να σχεδιαστεί καινούργιο πρωτόκολλο για κάθε περιστατικό (οικογένεια) 6q24.1 6q25.1 6q25.3 6q27 Harton et al., 2011; Cullen et al. 2003; Van de Velde et al. 2004; Fiorentino et al. 2005; Bick et al. 2008; Van de Velde et al. 2009

52 p q Chromosome 6 6p p22.3 6p22.1 6p p21.1 6p12.3 6p12.1 6q12 6q14.1 6q15 6q16.3 6q22.1 Σχεδιασμός multiplex PCR HLA HLA A region #39B HLA B HLA DRA HLA DQB1 6q q24.1 6q25.1 6q25.3 #31C MOG CA, #113 HLABC CA #47A, TNFa #153 D3A, 16A DQCAR II D6S1666 G51152 #148 RING3CA #138 #92 D6S1560 Έμμεση τυποποίηση HLA: Επιλογή πληροφοριακών ρ μικροδορυφορικών αλληλουχιών από περίπου 250 STRs κατά μήκος του συστήματος HLA Παράλληλη διάγνωση μονογονιδιακού νοσήματος: τουλάχιστον 3 5 γενετικών τόπων 6q27 Harton et al, 2011 Kakourou et al 2013, Accepted

53 Διεθνής εμπειρία για επιλογή συμβατού αδελφού δότη με ΠΓΔ ESHRE data collections 200 Αριθμός κύ κλων γι ια HLA ανά έτος Series1 0 I-V VI VII VIII IX X XI < Harper et al., 2010

54 Διεθνής εμπειρία για επιλογή συμβατού αδελφού δότη με ΠΓΔ 60 % ΖΕΥ ΥΓΑΡΙΩΝ ΑΡΙΘΜΩΝ ΚΥΚΛΩΝ Series1 Τα 50% των ζευγαριών κάνουν >1 προσπάθειες ~3 προσπάθειες για κάθε μωρόπουγεννιέται Ελάχιστες οι πληροφορίες για τις μεταμοσχεύσεις που έχουν γίνει για τη θεραπεία του πάσχοντος παιδιού στην οικογένεια Qureshi et al, 2005 Kahraman et al, 2011;

55 δεν δ είναι απλή αλλά είναι πολύτιμη όταν επιτυγχάνεται η θεραπεία του πάσχοντος παιδιού

56 Εφαρμογή ΠΓΔ για Χρωμοσωμικές Ανωμαλίες

57 Πρόληψη γνωστών χρωμοσωμικών ανωμαλιών στην οικογένεια Αμοιβαίες μεταθέσεις (reciprocal translocations) Μοναδικές σε κάθε οικογένεια Μεταθέσεις ακροκεντρικών χρωμοσωμάτων 13, 14, 15, 21, 22 (Robertsonian translocations) Η πιθανότητα δημιουργίας φυσιολογικού εμβρύου 1 στα 8 Η πιθανότητα δημιουργίας φυσιολογικού εμβρύου 1 στα 4

58 Προεμφυτευτικός Γενετικός Ελεγχος για ανευπλοειδίες (ΠΓΕ) (Preimplantation Genetic Screening, PGS) θεωρείται ΠΓΔ χαμηλής επικινδυνότητας, και αποσκοπεί στην αύξηση της επιτυχίας της IVF Ενδείξεις Συστήνεται σε ζευγάρια με φυσιολογικό καρυότυπο που έχουν: α) ) Ιστορικό παλίνδρομων κυήσεων β) >3 αποτυχημένες προσπάθειες IVF γ) προχωρημένη ηλικία της υποψήφιας μητέρας > 37 ετών δ) στις περιπτώσεις IVF που υπάρχει βαριά ανδρική υπογονιμότητα Kanavakis & Traeger Synodinos, J Med Genet, 2002 Harton et al, Hum Reprod 2011

59 Ανάλυση χρωμοσωμικών ανωμαλιών FISH Έλεγχος χρωμοσωμάτων μ σε μεσοφασικούς πυρήνες μεμονωμένων κυττάρων με DNA ανιχνευτές σημασμένους με φθοριοχρώματα Φυσιολογικό Τρισωμία 22 Χρωμοσώματα

60 Ανάλυση χρωμοσωμικών ανωμαλιών Γενομικός συγκριτικός υβριδισμός σε μικροσυστοιχίες Array CGH Ελέγχει όλα τα 24 χρωμοσώματα για ανευπλοειδίες (Στην acgh για ΠΓΔ προηγείται WGA)

61 FISH acgh ΠΓΔ Αξιόπιστα αποτελέσματα Τεχνικά απαιτητική Ελέγχει όλα τα 24 χρωμοσώματα Πολύ αποτελεσματική ΠΓΕ Περιορίζεται ο έλεγχος στα 9 12 χρωμοσώματα Τεχνικά απαιτητική Ελέγχει όλα τα 24 χρωμοσώματα Πολύ αποτελεσματική

62 Προεμφυτευτικό Γενετικός Έλεγχος για ανευπλοειδίες (Preimplantation Genetic Screening, PGS) Όμως υπάρχει προβληματισμός για την αξιοπιστία και τη χρησιμότητα του ΠΓΕ για τη βελτίωση της εξωσωματικής Πολυκεντρικές μελέτες βρίσκονται σε εξέλιξη για τη διερεύνηση της κλινική χρησιμότητας του ΠΓΕ

63 ESHRE PGD consortium

64 Steering Committee Joanne Traeger Synodinos, GR, Chair Edith Coonen, NL Chair elect Joyce Harper, UK, Past tchair Céline Moutou, FR Sioban SenGupta, UK MartineDeRycke Rycke, BE Veerle Goossens, BE

65 119 μέλη παγκοσμίως (June 2012) Total number of centres: 79 Total number ofcentres: 28 Total number of centres: 12

66 Ετήσια συλλογή στοιχείων από ΠΓΔ και ΠΓΕ Num mber of participat ting centr res Chart Title I II III IV V VI VII VIII IX X XI XII XIII Data collection Series1

67 Συνοπτικά δεδομένα I XIII. PGD PGS PGD PGD

68 Εξέλιξη των ενδείξεων PGS social sexing 3000 sexing for X linked disorders chromosomal abnormalities 2000 monogenic disease

69 ΠΓΔ για μονογονιδιακά νοσήματα

70 Data I XIII: Γεννήσεων 7190 παιδία: 56 (1%) 1521 (21%) 5613 (78%)

71 Κατευθυντήριες γραμμές Guidelines

72 H επιτυχία της ΠΓΔ (γέννηση υγιούς παιδιού) δεν βασίζεται μόνο στην επιτυχή γενετική διάγνωση αλλά και στην ανταπόκριση του ίδιου του ζευγαριού στην εξωσωματική γονιμοποίηση δεν ξεπερνά το ~30% των κύκλων που ξεκινούν Harper et al, ESHRE PGD consortium dt data VII Hum Reprod d Goossens et al, ESHRE PGD consortium data VIIΙ Hum Reprod 2008

73 ΠΓΔ Μελλοντικές προοπτικές Το επιθυμητό αποτέλεσμα στην ΠΓΔ είναι η γέννηση ενός υγιούς παιδιού. Το ιδεατό θα ήταν να μπορούσε να εξασφαλιστεί αυτή η θετική έκβαση εξωσωματικής σε κάθε κύκλο ΠΓΔ. Όμως η βιολογία της αναπαραγωγής είναι πολύπλοκη και θέτει περιορισμούς ρ στη ΠΓΔ.

74 Μελλοντικές μέθοδοι? Εντοπισμός εμβρύων γενετικά φυσιολογικά καλύτερα ποιοτικώς ικανά για εμφύτευση

75 Karyomapping Μια παραλλαγή του μοριακού καρυότυπου ελέγχει: όλα τα χρωμοσώματα για ανευπλοϊδίες ανασυνδιασμούς μεταξύ των γονεϊκών απλοτύπων και ανάλυση σύνδεσης μονογονιδιακά νοσήματα (όταν υπάρχει ένδειξη) Handyside et al, J Med Genet. 2010

76 Αλληλούχηση επόμενης γενιάς και ΠΓΔ Nextgeneration sequencing andpgd Treff et al, Fertil Steril, 2013

77 Φωτογραφική παρακολούθηση της εμβρυϊκής ανάπτυξης Embryoscope Montag M. Reprod Biomed Online. 2013

78 ΠΓΔ και Νομοθεσία Η νομοθεσία διαφέρει πολύ από χώρα σε χώρα της ΕΕ. Σε μερικές χώρες η ΠΓΔ απαγορεύεται. α α Σε χώρες που επιτρέπεται, η νομοθεσία αναπροσαρμόζεται σύμφωνα με νέες επιστημονικές εξελίξεις και τις καινούριες εφαρμογές. Στην Ελλάδα επιτρέπεται η ιατρικώς υποβοηθούμενη αναπαραγωγή βάση νόμου (Ν.3305/2005) και ως εκ τούτου και η ΠΓΔ. Απαγορεύεται αυστηρά η ΠΓΔ για επιλογή φύλου για κοινωνικούς λόγους (Ν.3305/2005).

79 Η ΠΓΔ είναι διαδικασία: πολύπλοκη / πολυσταδιακή με τεχνικούς και βιολογικούς περιορισμούς έχει υψηλό κόστος Παραμένει το ερώτημα εάν και κατά πόσο οι διαδικασίες εξωσωματικής προκαλούν επιγενετικές αλλαγές?

80 Μεγάλη σημασία θα πρέπει να δίνεται στην αποφυγή υπερβολών στην χρήση μιας τόσο ευαίσθητης, ακριβής αλλά και χρήσιμης Ιατρικής Πράξης Πάντα η ΠΓΔ πρέπει να εφαρμόζεται με των υψηλότερων προδιαγραφών Εργαστηριακά ά Κλινικά Ηθικά ά

81 Νέες προσεγγίσεις στην προγεννητική διάγνωση Νέες τεχνολογίες για Νέες πηγές την ανάλυση του εμβρυϊκού DNA DNA Συνδυασμός Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής, Πανεπιστημίου Αθηνών

82 Νέες πηγές εμβρυϊκού DNA Κύτταρα εμβρύων από εξωσωματική γονιμοποίηση (IVF) Προεμφυτευτική γενετική διάγνωση (ΠΓ - PGD) Εμβρυϊκά κύτταρα ή Ελεύθερο εξωκυτταρικό εμβρυϊκό DNA στην κυκλοφορία του εγκύου Μη επεμβατική Π Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής, Πανεπιστημίου Αθηνών

83 ΜΗ ΕΠΕΜΒΑΤΙΚΗ ΠΡΟΓΕΝΝΗΤΙΚΗ ΙΑΓΝΩΣΗ Non Invasive Prenatal Diagnosis i Εμβρυϊκά κύτταρα Ελεύθερο εμβρυϊκό DNA στην στην μητρική κυκλοφορία μητρική κυκλοφορία Simpson & Elias, JAMA, Bianchi, J Pediatr, Lo, J Histochem Cytochem, 2005 Kolialexi et al, Noninvasive prenatal diagnosis of -thalassaemia using individual id fetal erythroblasts t isolated from maternal blood after enrichment. Prenat Diagn Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής, Πανεπιστημίου Αθηνών

84 Eργαστήριο Ιατρικής Γενετικής, Πανεπιστημίου Αθηνών Διευθυντής: Καθηγητής Εμμανουήλ Καναβάκης Χριστίνα Βρεττού, PhD Ασπασία Δεστούνη,, PhD Γεωργία Κάκουρου, PhD Άλλα μέλη του Εργαστηρίου Ιατρικής Γενετικής Οι γιατροί και εμβρυολόγοι στα κέντρα υποβοηθούμενης αναπαραγωγής