ΣΥΜΒΟΛΗ ΣΤΗΝ ΠΡΟΕΜΦΥΤΕΥΤΙΚΗ ΧΡΩΜΟΣΩΜΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΑΝΕΥΠΛΟΕΙΔΙΩΝ ΚΑΙ ΦΥΛΟΥ ΜΕ ΤΗΝ ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ ΣΥΓΚΡΙΤΙΚΟΥ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΙΚΟΥ ΥΒΡΙΔΙΣΜΟΥ (CGH)

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών Στις Εφαρμογές Βασικών Ιατρικών Επιστημών ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΓΕΝΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΣΥΜΒΟΛΗ ΣΤΗΝ ΠΡΟΕΜΦΥΤΕΥΤΙΚΗ ΧΡΩΜΟΣΩΜΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΑΝΕΥΠΛΟΕΙΔΙΩΝ ΚΑΙ ΦΥΛΟΥ ΜΕ ΤΗΝ ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ ΣΥΓΚΡΙΤΙΚΟΥ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΙΚΟΥ ΥΒΡΙΔΙΣΜΟΥ (CGH) ΜΑΡΙΑ Κ. ΚΕΡΑΜΥΔΑ Χημικός-Κλινικός Εμβρυολόγος 2006

2 ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ: ΔΙΟΝΥΣΙΟΣ ΣΠΑΘΑΣ ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΓΕΝΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΠΑΤΡΩΝ ΜΕΛΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ: ΙΩΑΝΝΗΣ ΒΑΡΑΚΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΑΝΑΤΟΜΙΑΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΠΑΤΡΩΝ ΖΩΗ ΛΥΓΕΡΟΥ ΕΠΙΚΟΥΡΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΓΕΝΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΠΑΤΡΩΝ 2

3 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ i-iv ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ ΜΕΛΗ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ ΕΙΚΟΝΕΣ ΣΧΗΜΑΤΑ ΠΙΝΑΚΕΣ-ΔΙΑΓΡΑΜΜΑΤΑ ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ v-ix ix ix x-xi Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Α.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΣΤΗΝ ΕΞΩΣΩΜΑΤΙΚΗ ΓΟΝΙΜΟΠΟΙΗΣΗ 1-8 Α.1.1. Λήψη ωαρίων 1 Α.1.2. In vitro γονιμοποίηση 2 Α.2. ΠΡΟΕΜΦΥΤΕΥΤΙΚΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ PGD 9-16 Α.2.1. Τι είναι η προεμφυτευτική γενετική διάγνωση 9 A.2.2. Μεθοδολογία της PGD 11 Α.2.3. Τεχνικές της PGD 14 Α.3. ΠΡΟΕΜΦΥΤΕΥΤΙΚΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ ΑΝΕΥΠΛΟΕΙΔΙΩΝ PGD-AS A.3.1. Τι είναι η PGD-AS 17 Α.3.2. Ενδείξεις για PGD-AS 18 3

4 Α.3.3. Σημασία της PGD-AS 20 Α.3.4. Μεθοδολογία της PGD-AS 24 A.4.Ο ΣΥΓΚΡΙΤΙΚΟΣ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΙΚΟΣ ΥΒΡΙΔΙΣΜΟΣ (CGH) ΣΤΗΝ ΠΡΟΕΜΦΥΤΕΥΤΙΚΗ ΧΡΩΜΟΣΩΜΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ Α.4.1. Αρχές της CGH 26 Α.4.2. Αξιολόγηση της CGH 34 Α.4.3. Σημασία της CGH 35 Α.5. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΠΑΡΟΥΣΑΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ 37 Β. ΥΛΙΚΑ-ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ Β.1. ΙΝ VITRO ΓΟΝΙΜΟΠΟΙΗΣΗ ΩΑΡΙΩΝ Β.1.1 Επεξεργασία σπερματοζωαρίων Η τεχνική swim up Η τεχνική φυγοκέντρησης βαθμίδωσης πυκνότητας 42 Β.1.2. In vitro γονιμοποίηση ωαρίων. 43 Β.1.3. Ενδοκυτταροπλασματική σπερματέγχυση ωαρίου-icsi Απομάκρυνση των κοκκιωδών κυττάρων από το ωάριο Μικρογονιμοποίηση- ICSI 49 Β.2. ΔΙΑΘΕΣΗ ΚΥΤΤΑΡΩΝ 50 Β.3. ΒΙΟΨΙΑ ΕΜΒΡΥΟΥ 51 B.4. ΛΗΨΗ DNA ΑΠΟ ΒΛΑΣΤΟΜΕΡΙΔΙΟ. 52 4

5 B.5. ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΤΟΥ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ Β.5.1.Προετοιμασία και επίστρωση μεταφασικών χρωμοσωμάτων σε αντικειμενοφόρες πλάκες. 52 Β.5.2. Απομόνωση DNA από λεμφοκύτταρα 54 Β.5.3. Ενίσχυση ολικού DNA με DOP-PCR 55 Β.5.4. Σήμανση ανιχνευτών 57 Β.5.4.1Μετάφραση δι-εγκοπής(nick-translation) 57 Β Σήμανση με DOP-PCR 59 Β.5.5. Κατακρήμνιση του DNA 60 B.6. ΠΕΙΡΑΜΑΤΑ CGH 61 B.6.1. Αποδιάταξη του DNA των μεταφασικών χρωμοσωμάτων 62 B.6.2. Αποδιάτηξη του DNA ανιχνευτή 62 Β.6.3. Υβριδισμός in situ. 63 Β.6.4. Πλύσεις μετά τον υβριδισμό 63 Β.6.5. Μικροσκοπία- Σύστημα ISIS 64 Γ. AΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Γ.1. ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΩΝ 67 Γ.1.1.Δειγμάτων DNΑ λεμφοκυττάρων 68 Γ.1.2. Δείγματα βλαστομεριδιακού DNA 69 Γ.2. BIOΨΙΑ ΕΜΒΡΥΟΥ 71 Γ.3. ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΩΝ ΣΤΑΔΙΩΝ ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑΣ ΓΙΑ ΤΑ ΠΕΙΡΑΜΑΤΑ CGH 77 5

6 Γ.3.1. Ενίσχυση ολικού DNA με DOP-PCR 77 Γ.3.2.Προετοιμασία σήμανσης ανιχνευτών 78 Γ.4. ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΩΝ ΣΤΑΔΙΩΝ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑΣ CGH 80 Γ.4.1 Προετοιμασία ανιχνευτή 80 Γ.4.2, Διαδικασία πειραμάτων CGH 81 Γ.4.3. Μικροσκοπία- Επεξεργασία αποτελεσμάτων CGH 82 Γ.5.AΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΠΕΙΡΑΜΑΤΩΝ CGH ΣΕ DNA ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΩΝ 84 Γ.5.1.Έλεγχος δείγματος DNA λεμφοκυττάρων 46ΧΥ 84 Γ.5.2. Έλεγχος δείγματος DNA λεμφοκυττάρων 46ΧΧ 90 Γ.5.3. Έλεγχος δείγματος DNA λεμφοκυττάρων Γ.5.4. Έλεγχος δείγματος DNA λεμφοκυττάρων 9p+ 97 Γ.6. ΠΕΙΡΑΜΑΤΑ CGH ΒΛΑΣΤΟΜΕΡΙΔΙΑΚΟΥ DNA 100 Γ.6.1. Έλεγχος του βλαστομεριδίου του εμβρύου-ι 100 Γ.6.1. Έλεγχος του βλαστομεριδίου του εμβρύου-ιι 104 Γ.7.ΣYMΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 109 Δ. BIΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

7 ΠΕΡΙΛΗΨΗ 126 ΕΙΚΟΝΕΣ Εικόνα 1 (σελ.2): Η διαδικασία του IVF περιλαμβάνει συνοπτικά τρια στάδια: α) την ωοληψία, β) την γονιμοποίηση ωαρίων και γ) την εμβρυομεταφορά. Εικόνα 2 (σελ.3): Ώριμο ωάριο αμέσως μετά την συλλογή του. Εικόνα 3 (σελ.5): Α) Το ώριμο ωάριο χωρίς τα κοκκιώδη κύτταρα, Β) επιλογή του σπερματοζωαρίου που θα πραγματοποιήσει την γονιμοποίηση, Γ) έγχυση του σπερματοζωαρίου στο ωάριο. Εικόνα 4 (σελ.6): α) Η παρουσία των δύο προπυρήνων μετά την γονιμποίηση στο IVF, β) η παρουσία 3 προπυρήνων οδηγεί στην απόρριψη του γονιμοποιημένου ωαρίου. Εικόνα 5 (σελ.6): α) Έμβρυο 2 κυττάρων, β) έμβρυο 4 κυττάρων. Εικόνα 6 (σελ.7): Έμβρυα με 8 κύτταρα, α) τα κύτταρα δεν συνδέονται ισχυρά και είναι η κατάλληλη στιγμή για βιοψία, β) τα κύτταρα αρχίζουν να ενώνονται εντονότερα, γ) το έμβρυο ετοιμάζεται για την επόμενη φάση, διαίρεση 16 κυττάρων. Όσο περνάει η ώρα τα κύτταρα συνδέονται ισχυρά και δεν είναι εύκολη η βιοψία του βλαστομεριδίου. Εικόνα 7 (σελ.8): Έμβρυα στο στάδιο της βλαστοκύστης. Εικόνα 8 (σελ.11): Βιοψία 1 ου και 2 ου πολικού σωματίου από γονιμοποιημένο ωάριο. 7

8 Εικόνα 9 (σελ.12): α,β) Βιοψία βλαστομεριδίου εμβρύου 8 κυττάρων γ) αφαίρεση 1 ου βλαστομεριδίου, δ) αφαίρεση 2 ου βλαστομεριδίου. Εικόνα 10 (σελ.24): FISH με 5 ανιχνευτές σε πυρήνα βλαστομεριδίου για ανίχνευση ανευπλοειδιών στα χρωμοσωματα Υ, Χ, 18, 13, 21 όπου φαίνεται η τρισωμία 13 και το φύλο ΧΧ του εμβρύου. Εικόνα 11(σελ.25) : Φωτογράφηση μεταφάσεων με την τεχνική CGH. Εικόνα 12 (σελ.27): Ενίσχυση του DNA του κυττάρου με DOP-PCR. Εικόνα 13 (σελ.29): H τεχνική nick-translation Εικόνα 14 (σελ.30): Φωτογράφηση με 1.κόκκινο φίλτρο, 2. πράσινο φίλτρο, 3. φίλτρο για DAPI, και 4. συνδυασμός των3 παραπάνω φωτογραφιών. Εικόνα 15 (σελ.31): Καρυότυπος στην CGH. Εικόνα 16 (σελ.32): Η τελική ανάλυση των αποτελεσμάτων της CGH για 20 μεταφάσεις.τα τμήματα των χρωμοσωμάτων που παρουσιάζουν πράσινο αφορούν μερικές ανευπλοϊδίες πλεονάσματος DNA στο υπό μελέτη δείγμα, όσα παρουσιάζουν κόκκινο αφορούν ελλείψεις. Για το χρωμόσωμα 7 η ανάλυση δείχνει μονοσωμία. Εικόνα 17 (σελ.33): Στάδια της CGH στην ανίχνευση ανευπλοειδιών. Εικόνα 18 (σελ.44): Εργαστηριακός χώρος πραγματοποίησης IVF (Μαιευτήριο Εικόνα 19 (σελ.50): Εργαστηριακός χώρος πραγματοποίησης ICSI (Μαιευτήριο ΗΩ ). Εικόνα 20 (σελ.72): Το ωάριο-ι πριν την γονιμοποίηση. Είναι εμφανή τα κύτταρα του ακτινωτού στεφάνου. Εικόνα 21 (σελ.72): H παρουσία 2 προπυρήνων 18 ώρες μετά την προσθήκη των σπερματοζωαρίων επιβεβαιώνει την γονιμοποίηση του ωαρίου-ι. Εικόνα 22 (σελ.73): To έμβρυο-ιι στο στάδιο των 2 κυττάρων. 8

9 Eικόνα 23 (σελ.73): Το έμβρυο-ιι στο στάδιο 8 κυττάρων μετά την καταστροφή (με χημική μέθοδο) της διαφανούς ζώνης (βέλος), πριν την βιοψία. Εικόνα 24 (σελ.74): To ωάριο-ιι πριν την πλήρη απομάκρυνση των κοκκιωδών κυττάρων και των κυττάρων του ακτινωτού στεφάνου. Εικόνα 25 (σελ.74): To ωάριο-ιι γονιμοποιήθηκε με μικρογονιμοποίηση : Α) Συλλογή του σπερματοζωαρίου με μικροπιππέτα, Β) Ακινητοποίηση του σπερματοζωαρίου με χρήση laser. Εικόνα 26 (σελ.75): Στις φωτογραφίες 26Α και 26Β παρουσιάζεται η διαδικασία μικρογονιμοποίησης του ωαρίου-ιι. Εικόνα 27 (σελ.76): Στο έμβρυο-ιι στο στάδιο των 8 κυττάρων πραγματοποιήθηκε άνοιγμα στην διαφανή ζώνη (βέλος) με την χρήση laser. Eικόνα 28 (σελ.76): Το έμβρυο-ιι κατά την διαδικασία της βιοψίας. Εικόνα 29 (σελ.85): Φωτογράφηση μετάφασης Ι με φίλτρο για Τexas Red. Εικόνα 30 (σελ.85): Μίξη φωτογράφησης μετάφασης Ι με φίλτρα για DAPI και FITC. Εικόνα 31(σελ.86): Μίξη φωτογράφησης μετάφασης Ι με φίλτρα για DAPI, FITC, TEXAS RED. 9

10 Eικόνα 32 (σελ.87): Εικόνα μετάφασης I (α) και ΙΙ (β) μετά την επεξεργασία και την απομάκρυνση αλληλοεπικαλυπτώμενων χρωμοσωμάτων. Εικόνα 33 (σελ.88): Kaρυότυπος της μετάφασης ΙΙ. Εικόνα 34 (σελ.89): Ανάλυση των αποτελεσμάτων του δείγματος 46ΧΥ. Χ,Υ. Εικόνα 35 (σελ.90,91): Φωτογράφηση των μεταφάσεων α)ι και β)ιι δείγματος ΧΧ μετά από επεξεργασία. Εικόνα 36 (σελ.92): Καρυότυπος της μετάφασης-ιι για το δείγμα ΧΧ. Εικόνα 37 (σελ.93): Ανάλυση των αποτελεσμάτων του δείγματος 46ΧΧ. Εικόνα 38 (σελ.94): Φωτογράφηση με τρια φίλτρα (DAPI, FITC, TEXAS RED) μετάφασης-ι του δείγματος 18+. Εικόνα 39 (σελ.95): Kaρυότυπος της μετάφασης-ι του δείγματος 18+. Εικόνα 40 (σελ.97): Ανάλυση των αποτελεσμάτων του δείγματος 18+. Eικόνα 41 (σελ.98): Φωτογράφηση μετάφασης-i δείγματος 9p+ με 3 φίλτρα DAPI. FITC, TEXAS RED. Eικόνα 42 (σελ.99): Ανάλυση των αποτελεσμάτων 8 μεταφάσεων του δείγματος 9p+. 10

11 Eικόνα 43 (σε.100): Φωτογράφηση μετάφασης Ι με 3 φίλτρα DAPI, TEXAS RED και FITC του βλαστομεριδιακού DNA πριν την επεξεργασία. Eικόνα 44 (σελ.101): Φωτογράφηση της μετάφασης-ι με 3 φίλτρα DAPI, TEXAS RED και FITC του βλαστομεριδιακού DNA μετά την επεξεργασία. Εικόνα 45 (σελ.102): Kαρυότυπος της μετάφασης-ι για το έμβρυο-ι. Εικόνα 46 (σελ.103): Ανάλυση αποτελεσμάτων από 7 μεταφάσεις του δείγματος του DNA βλαστομεριδίου Ι. Εικόνα 47 (σελ.104,105): 3 μεταφάσεις από πείραμα με το βλαστομεριδιακό DNA του εμβρύου ΙΙ. Εικόνα 48 (σελ.106,107): Φωτογραφίες μετάφασης βλαστομερίδιο του εμβρύου-ιι,(α) DAPI. (β) TEXAS RED, (γ) FITC. του πειράματος με το Εικόνα 49 (σελ.108): Aνάλυση των αποτελεσμάτων για το βλαστομερίδιο του εμβρύου-ιι. ΣΧΗΜΑΤΑ Σχήμα 1 (σελ.41): H απομόνωση σπερματοζωαρίων με την τεχνική swim up διαρκεί ~70 λεπτά. Σχήμα 2 (σελ.43): Απομόνωση σπερματοζωαρίων με φυγοκέντρηση βαθμίδωσης πυκνότητας. Η διαδικασία διαρκεί συνολικά ~40 λεπτά. 11

12 Σχήμα 3 (σελ.46): Τριβλία με καλλιεργητικό υλικό γιa πραγματοποίηση IVF. Σχήμα 4 (σελ.48): Τριβλίο για την απομάκρυνση των κοκκιωδών κυττάρων. ΠΙΝΑΚΕΣ-ΔΙΑΓΡΑΜΑΤΑ Πίνακας 1 (σελ.18): Πιθανότητα γέννησης παιδιού με τρισωμία 13,18 ή 21 σε σχέση με την ηλικία της γυναίκας. Πίνακας 2 (σελ.65): Τα φθοριοχρώματα που χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα CGH. Διάγραμμα 1 (σελ.22): Ποσοστά ανευπλοειδιών κατά την ανάπτυξη των εμβρύων. ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ ACD Αντιπηκτικό αίματος με σύσταση: Sodium Citrate, Glucose, Citrate acid ΑRT bp Assisted Reproduction Technologies base pair (s) 12

13 BSA CGH Bovine Serum Albumin Comparative Genomic Hybridization Cot-1 DNA DNA with a cot value of 1.0 (mole nucleotides s -1 l -1 ) DAPI ddh2o DNA dntps DOP-PCR DTT EBSS FISH FITC HAS HCG HEPES 4,6-diamino-2-phenylindole Δυσαπεσταγμένο νερό Deoxyribonucleic acid Deoxyribonucleotide triphpshate Degenerate oligonucleotide primed PCR Dithiothreitol (M=154.3) Earle's Balanced Salts Solution Fluorescence in situ hybridization Fluorescein isithiocyanate Human Albumin Serum Human chorionic gonadotropin 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid, Ρυθμιστικό διάλυμα ph:6,8-8,2. ICSI Intra Cellular Sperm Injection-Eνδοκυτταροπλασματική έγχυση σπερματοζωαρίου IVF PBS In Vitro Fertilization Phosphate buffer saline 13

14 PCR PGD Polymerase chain reaction Preimplantation Genetic Diagnosis-Προεμφυτευτική γενετική Διάγνωση PDG-AS Preimplantation Genetic Diagnosis-Aneuploidy Screening: Προεμφυτευτική γενετική διάγνωση ανίχνευσης ανευπλοειδιών PHA PVP SDS SSC Twen-20 UV v/v w/v WGA Phytohaemagglutinin Polyvinylpirrolidone Sodium dodecyl sulphate Standard saline citrate Polyoxyethylene-(20)-sorbitan monolaurate Υπεριώδες Όγκος/όγκο Bάρος/όγκο Whole Genome Amplification N: A,T,C,G Adenine, Thymine, Cytosine, Guanine 10-6 /ml Εκατομμύρια ανά μικρόλιτρο (M/ml ή Μ/cm 3 ) Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 14

15 Α.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΣΤΗΝ ΕΞΩΣΩΜΑΤΙΚΗ ΓΟΝΙΜΟΠΟΙΗΣΗ Α.1.1. Λήψη ωαρίων Στο χώρο της Γυναικολογίας ο τομέας που παρουσιάζει το μεγαλύτερο ενδιαφέρον και αναπτύσσεται με ταχύτατους ρυθμούς είναι η υποβοηθούμενη αναπαραγωγή. Οι τεχνικές υποβοηθούμενης αναπαραγωγής (ART-assisted reproduction technologies) περιλαμβάνουν ένα ευρύ πεδίο τεχνικών οι περισσότερες από τις οποίες αφορούν την εξωσωματική γονιμοποίηση. Με τον όρο εξωσωματική γονιμοποίηση ορίζουμε διαδικασίες που περιλαμβάνουν την in vitro γονιμοποίηση ωαρίων και την μεταφορά των εμβρύων (ανάπτυξης 2-5 ημερών) στη μήτρα της γυναίκας με σκοπό την επίτευξη κύησης. Στην εξωσωματική γονιμοποίηση αρχικά πραγματοποιείται στην γυναίκα ελεγχόμενη διέγερση των ωοθηκών με την χορήγηση εξωγενών γοναδοτροπινών για μέρες. Στο διάστημα αυτό, η πορεία παρακολουθείται από τον ειδικό γιατρό υπερηχογραφικά και με εξετάσεις ορμονών ώστε να χορηγούνται οι σωστές δόσεις φαρμάκων για την ανάπτυξη κατάλληλων πολλαπλών ωοθυλακίων. Όταν ο αριθμός (1-10) και το μέγεθος (~18mm) των αναπτυσσόμενων ωοθυλακίων είναι κατάλληλο τότε δίδεται χοριακή γοναδοτροπίνη (HCG) για την πρόκληση ωορρηξίας και ώρες μετά ακολουθεί ή ωοληψία. Κατά την ωοληψία ο γιατρός πραγματοποιεί αναρρόφηση του υγρού περιεχομένου των ωοθυλακίων με βελόνα υπό την καθοδήγηση του υπερήχου και ενώ η γυναίκα βρίσκεται υπό αναισθησία. Η διαδικασία είναι συνήθως αναίμακτη και διαρκεί 5-10 λεπτά (Εικόνα 1). 15

16 Γ Α Β Εικόνα 1 : Η διαδικασία του IVF περιλαμβάνει συνοπτικά τρία στάδια: α) την ωοληψία, β) την γονιμοποίηση ωαρίων και γ) την εμβρυομεταφορά. Το ωοθυλακικό υγρό που περιέχει και τα ωάρια συλλέγεται σε δοκιμαστικούς σωλήνες και δίδεται στο εργαστήριο για την πραγματοποίηση της εξωσωματικής γονιμοποίησης. Παράλληλα πραγματοποιείται επεξεργασία του σπερματικού υγρού ώστε να απομονωθούν τα σπερματοζωάρια που έχουν καλή κινητικότητα και σωστή μορφολογία. Α.1.2. In vitro γονιμοποίηση Διεθνώς έχει καθιερωθεί ο όρος κλινική εμβρυολογία για το σύνολο των τεχνικών και διαδικασιών που πραγματοποιούνται σε ένα εργαστήριο εξωσωματικής γονιμοποίησης. Περιλαμβάνει τον χειρισμό ωαρίων, σπερματοζωαρίων, και εμβρύων μέχρι το στάδιο της βλαστοκύστης (Brain Dali& Kay Elder, Cambridge 16

17 University Press). Οι διαδικασιές που πραγματοποιούνται στο περιγράφονται παρακάτω: εργαστήριο 1 η Μέρα: Tα ωάρια που συλλέγονται κατά την ωοληψία (Εικόνα 2) και περιβάλλονται από κοκκιώδη κύτταρα (~3.000) αξιολογούνται στο μικροσκόπιο (βαθμός ωρίμανσης και μορφολογία), και μεταφέρονται σε καλλιεργητικό υλικό στον επωαστή μέχρι να γονιμοποιηθούν. Εικόνα 2: Ώριμο ωάριο αμέσως μετά την συλλογή του. Για την πραγματοποίηση της γονιμοποίησης και της επιτυχούς ανάπτυξης του εμβρύου θα πρέπει τα ωάρια που θα συλλεχθούν να είναι ώριμα, να έχει πραγματοποιηθεί δηλαδή η πρώτη μειωτική διαίρεση και να είναι ορατό το πολικό σωμάτιο. Στην περίπτωση της ενδοκυτταροπλασματικής σπερματέγχυσης (ICSI) ο εντοπισμός του πολικού σωματίου είναι απαραίτητος για να προσδιοριστεί το σημείο πάνω στο ωάριο που θα πραγματοποιηθεί η μικρογονιμοποίηση. Δύο τεχνικές γονιμοποίησης των ωαρίων μπορούν να χρησιμοποιηθούν : 17

18 1. Να προστεθούν ~ σπερματοζωάρια ανά ωάριο και να διαπιστωθεί η γονιμοποίηση μετά από 8-14 ώρες. Η διαδικασία αυτή ονομάζεται γονιμοποίηση in vitro (IVF). Κατά τη γονιμοποίηση το σπερματοζωάριο περνά τη στοιβάδα των κοκκιωδών κυττάρων αλληλεπιδρά με την ακροσωμική περιοχή στη διαφανή ζώνη του ωαρίου, συνδέεται και ελευθερώνεται στο κυτταρόπλασμα του ωαρίου. Μόλις ολοκληρωθεί η είσοδος του σπερματοζωαρίου στο ωάριο πραγματοποιείται και η δεύτερη μειωτική διαίρεση και εμφανίζεται το δεύτερο πολικό σωμάτιο. 2.Να εγχυθεί με μικροσύριγγα ένα σπερματοζωάριο μέσα στο ωάριο προκαλώντας την γονιμοποίηση του οπότε η διαδικασία ονομάζεται ενδοκυτταροπλασματική σπερματέγχυση ή ICSI (Intra Cellular Sperm Injection)- Εικόνα 3. Για να πραγματοποιηθεί η ICSI πρέπει να απομακρυνθούν όλα τα κοκκιώδη κύτταρα από το ωάριο. Η τεχνική ICSI πρωτοδημοσιεύτηκε σαν τεχνική το 1992 και από τότε βελτιώνεται συνεχώς. Αποτελεί μια από τις σημαντικότερες τεχνικές της υποβοηθούμενης αναπαραγωγής και μικρές διαφοροποιήσεις σε αυτή μπορούν να αυξήσουν σημαντικά την επιτυχία της μεθόδου και των ποσοστών επιτυχίας της μονάδας αναπαραγωγής. Η ICSI χρησιμοποιείται όταν ο διαθέσιμος αριθμός σπερματοζωαρίων είναι μικρός, όταν η IVF δεν αποδίδει ή δίνει μικρό ποσοστό γονιμοποίησης και σε περιπτώσεις γενετικού ελέγχου του γονιμοποιημένου ωαρίου όπου δεν πρέπει να υπάρξει πιθανότητα λανθασμένης διάγνωσης από πιθανή μόλυνση του δείγματος από κοκκιώδη κύτταρα ή προσκολλημένα σπερματοζωάρια στη διαφανή ζώνη του ωαρίου. 18

19 Α Β Γ Εικόνα 3: Α) Το ώριμο ωάριο χωρίς τα κοκκιώδη κύτταρα, Β) επιλογή του σπερματοζωαρίου που θα πραγματοποιήσει την γονιμοποίηση, Γ) έγχυση του σπερματοζωαρίου στο ωάριο. 2 η μέρα: Η γονιμοποίηση επιβεβαιώνεται με την παρουσία των δύο προπυρήνων του ωαρίου και του σπερματοζωαρίου μετά από 8-14 ώρες (Εικόνα 4). Στο στάδιο αυτό γίνεται αξιολόγηση των γονιμοποιημένων ωαρίων με βάση την μορφολογία τους και την μορφολογία των δύο προπυρήνων (μέγεθος, απόσταση μεταξύ τους, παρουσία και διάταξη των πυρηνίσκων). 19

20 Εικόνα 4: α) Η παρουσία των δύο προπυρήνων μετά την γονιμοποίηση στο IVF, β) η παρουσία 3 προπυρήνων οδηγεί στην απόρριψη του γονιμοποιημένου ωαρίου. Η πρώτη κυτταρική διαίρεση πραγματοποιείται ~36 ώρες μετά την γονιμοποίηση των ωαρίων. Τα έμβρυα θα πρέπει να βρίσκονται στο στάδιο των 4 κυττάρων εντός 48 ωρών (Εικόνα 5). Εικόνα 5: α) Έμβρυο 2 κυττάρων, β) έμβρυο 4 κυττάρων. Σε αυτό το σημείο θα πρέπει να επισημανθεί ότι όταν αναφερόμαστε σε έμβρυα στην κλινική εμβρυολογία εννοούμε γονιμοποιημένα ωάρια που έχουν 2-32 διαιρεμένα κύτταρα (1 η -3 η μέρα ανάπτυξης) και βλαστοκύστες με >32 κύτταρα (4 η - 20

21 6 η μέρα ανάπτυξης). Το 1991 καθιερώθηκε ο όρος προέμβρυα (British Human Fertilization, HFEA, 1991) για τα γονιμοποιημένα ωάρια από το στάδιο της γονιμοποίησης έως την 5 η μέρα, όμως εγκαταλείφθηκε. 3 η μέρα: Τα έμβρυα φτάνουν στο στάδιο των 8 κυττάρων στις 72 ώρες και από το σημείο αυτό και μετά αρχίζουν τα κύτταρα του εμβρύου να συνδέονται ισχυρότερα μεταξύ τους. Σχηματίζονται κανάλια επικοινωνίας που επιτρέπουν τη διακυτταρική επικοινωνία με μεταφορά μικρών μορίων που βρίσκονται στο κυτταρόπλασμα μεταξύ γειτονικών κυττάρων (Bennett et al, 1991). Στο στάδιο αυτό πραγματοποιείται εμβρυομεταφορά ή τα έμβρυα καλλιεργούνται για μία ή δύο παραπάνω μέρες (Εικόνα 6). Στο στάδιο των 8 κυττάρων τα έμβρυα μπορούν να καταψυχθούν με υψηλά ποσοστά επιβίωσης μετά την απόψυξη (85%) ή να πραγματοποιηθεί σε αυτά προεμφυτευτική γενετική διάγνωση (PGD). Εικόνα 6: Έμβρυα με 8 κύτταρα, α) τα κύτταρα δεν συνδέονται ισχυρά και είναι η κατάλληλη στιγμή για βιοψία, β) τα κύτταρα αρχίζουν να ενώνονται εντονότερα, γ) το 21

22 έμβρυο ετοιμάζεται για την επόμενη φάση, διαίρεση 16 κυττάρων. Όσο περνάει η ώρα τα κύτταρα συνδέονται ισχυρά και δεν είναι εύκολη η βιοψία του βλαστομεριδίου. 4 η & 5 η μέρα: Τα έμβρυα αναπτύσσονται στο στάδιο της βλαστοκύστης τις μέρες που ακολουθούν. Το 30% των εμβρύων φτάνει στο στάδιο της βλαστοκύστης και σε αυτό το στάδιο ανάπτυξης το έμβρυο θα πρέπει να μεταφερθεί ή να καταψυχθεί καθώς δεν είναι δυνατή περαιτέρω καλλιέργεια του in vitro. Mέχρι το στάδιο της βλαστοκύστης τα έμβρυα δεν αλλάζουν μέγεθος και έχουν την ίδια ποσότητα υγρού. Σε κάθε διαίρεση το κυτταρόπλασμα μοιράζεται σε δύο ίσα μέρη. Η διαίρεση είναι συμμετρική αλλά δεν είναι συγχρονισμένη και κάθε βλαστομερίδιο διαιρείται ανεξάρτητα από το άλλο. Από το στάδιο της βλαστοκύστης και μετά το έμβρυο αυξάνει το υγρό περιεχόμενο του και αρχίζει να μεγαλώνει (Εικόνα 7). Εικόνα 7: Έμβρυα στο στάδιο της βλαστοκύστης. 22

23 Α.2. ΠΡΟΕΜΦΥΤΕΥΤΙΚΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ PGD Α.2.1. Τι είναι η προεμφυτευτική γενετική διάγνωση Με τις καθιερωμένες μεθόδους προγεννητικής διάγνωσης (αμνιοπαρακέντηση ή δειγματοληψία χοριακών λαχνών) ο έλεγχος των εμβρύων για γονιδιακές ή χρωμοσωμικές ανωμαλίες γίνεται μόνο στην διάρκεια της κύησης. Εάν διαπιστωθεί ότι το έμβρυο φέρει γονιδιακή ή χρωμοσωμική ανωμαλία που δεν είναι συμβατή με την ζωή ή οδηγεί σε παθολογικό φαινότυπο τότε η κύηση διακόπτεται. Με την ανάπτυξη των νέων τεχνικών μοριακής βιολογίας και γενετικής και των τεχνικών υποβοηθούμενης αναπαραγωγής δόθηκε η ευκαιρία στα ζευγάρια για έλεγχο των εμβρύων τους πριν την εμφύτευση. Η προεμφυτευτική γενετική διάγνωση (Preimplantation Genetic Diagnosis-PGD) είναι ένα σύνολο τεχνικών οι οποίες εισήχθηκαν σχετικά πρόσφατα στον χώρο των τεχνικών υποβοηθούμενης αναπαραγωγής για διαγνωστικούς σκοπούς. Στόχος της PGD είναι η διάγνωση γενετικών ή χρωμοσωμικών ανωμαλιών που είναι υπεύθυνες για την αποτυχία εμφύτευσης του εμβρύου, την αποτυχία ολοκλήρωσης της κύησης ή την γέννηση ενός παιδιού με διανοητική ή σωματική ασθένεια. Πιο συγκεκριμένα η προεμφυτευτική γενετική διάγνωση (PGD) είναι η διαδικασία που επιτρέπει τον έλεγχο των εμβρύων για γενετικές ή χρωμοσωμικές ανωμαλίες πριν την είσοδο τους στην μήτρα και την επίτευξη της εγκυμοσύνης. Τα έμβρυα δημιουργούνται με in vitro γονιμοποίηση και ακολουθεί η διαδικασία της βιοψίας κατά την οποία ένα ή δύο βλαστομερίδια αφαιρούνται από το έμβρυο και ελέγχονται με την χρήση διαφόρων τεχνικών για γενετική ή χρωμοσωμική ανωμαλία. Όταν το κύτταρο διαγνωσθεί ως φυσιολογικό τότε το έμβρυο από το οποίο προέρχεται μπορεί να μεταφερθεί και να οδηγήσει σε εγκυμοσύνη (Thornhill et al, 2002). 23

24 Oι Edwards και Gardner πραγματοποίησαν με επιτυχία την πρώτη γνωστή βιοψία βλαστοκυττάρου σε έμβρυο κουνελιού το 1968 (Gardner R.L. & Edwards R.G., 1968). Η γέννηση του πρώτου παιδιού με εξωσωματική γονιμοποίηση το 1978 άνοιξε τον δρόμο για την ανάπτυξη των τεχνικών προεμφυτευτικής διάγνωσης και την εφαρμογή της δέκα χρόνια μετά. Η έρευνα για την προεμφυτευτική διάγνωση γενετικών ασθενειών σε ανθρώπινα έμβρυα ξεκίνησε στο Ηνωμένο Βασίλειο στα μέσα της δεκαετίας με σκοπό την βοήθεια ζευγαριών που προτιμούν τη διάγνωση κληρονομούμενης ασθένειας πριν την μεταφορά του εμβρύου ώστε να αποφευχθεί μια επισφαλής εγκυμοσύνη (Harper, 2001). Το 1989 στο Λονδίνο ανακοινώθηκαν από τoν A.Ηandyside οι πρώτες περιπτώσεις που αφορούσαν τις ασθένειες που συνδέονται με το Χ- χρωμόσωμα και περιελάμβαναν την βιοψία 1-2 βλαστομεριδίων από έμβρυο που ήταν στο στάδια των 6-8 κυττάρων (72 ωρών) (Handyside, 1989). To 1990 διαγνώσθηκαν ανωμαλίες με βιοψία πολικού σωματίου ωαρίου (Verlinski, 1990). Η πρώτη προεμφυτευτική διάγνωση για μονογονιδιακή αυτοσωμική ανωμαλία αφορούσε την κυστική ίνωση (CF) και δημοσιεύτηκε το 1992 (Ηandyside A.H., 1992). Σήμερα 50 κέντρα σε 20 χώρες στον κόσμο προσφέρουν υπηρεσίες PGD για διάγνωση: ανευπλοειδιών, φύλου σε οικογένειες με αυξημένες πιθανότητες εμφάνισης φυλοσύνδετων ασθενειών, δομικών χρωμοσωμικών ανωμαλιών και μονογονιδιακών νοσημάτων. Μέχρι το 2001 είχαν πραγματοποιηθεί 2000 PGD που οδήγησαν σε 500 εγκυμοσύνες και τη γέννηση 400 υγιών παιδιών. Περισσότερα από τα δύο τρίτα των διαγνώσεων αυτών πραγματοποιήθηκαν στις Ηνωμένες Πολιτείες Αμερικής (Οuhibi, 2001). Στην Ελλάδα μόνο πρόσφατα και σε περιορισμένη κλίμακα γίνεται παροχή υπηρεσιών PGD (μόνο FISH) από ορισμένους ιδιωτικούς φορείς. 24

25 Α.2.2. Μεθοδολογία της PGD Για για την πραγματοποίηση προεμφυτευτικής γενετικής διάγνωσης, μπορεί να χρησιμοποιηθούν σπερματοζωάρια, το πρώτο ή και το δεύτερο πολικό σωμάτιο ωαρίου, ένα ή δύο κύτταρα εμβρύου (ανάπτυξη από 2-16 κύτταρα) ή 1-4 βλαστομερίδια βλαστοκύστης (ανάπτυξη >32 κυττάρων). Συνήθως η διάγνωση γίνεται στο πρώτο πολικό σωμάτιο του ωαρίου, σε ένα βλαστομερίδιο 6-8 κυττάρων και σε 2-4 βλαστομερίδια βλαστοκύστης. Η PGD στα σπερματοζωάρια δείχνει τις χρωμοσωμικές ανωμαλίες πατρικής προέλευσης όχι όμως την εικόνα του εμβρύου. Η PGD σε πολικά σωμάτιο ωαρίων δείχνει χρωμοσωμικές ανωμαλίες μητρικής προέλευσης και οδηγεί στην απόρριψη ωαρίων των οποίων τα πολικά σωμάτια φέρουν ανευπλοειδίες, (Εικόνα 8). Χρησιμοποιείται σε λίγα κέντρα (Verlinsky Y, 1990, 1997) και μειονεκτεί στο ότι δεν δίνει την εικόνα του διαιρεμένου εμβρύου και μειώνει τα ποσοστά διαίρεσης και ανάπτυξης των μελετημένων ωαρίων. Εικόνα 8: Βιοψία 1 ου και 2 ου πολικού σωματίου από γονιμοποιημένο ωάριο. 25

26 Η PGD σε βλαστομερίδια εμβρύων είναι η πιο διαδεδομένη διαδικασία (ESHRE PGD Consortium Steering Committee, 1999). Για να επιλεχθεί το πιο κατάλληλο στάδιο ανάπτυξης του εμβρύου για PGD λαμβάνουμε υπόψη τρεις παραμέτρους: την αξιοπιστία της διάγνωσης, το ποσοστό επιτυχούς εμφύτευσης των εμβρύων που έχουν υποστεί βιοψία και το συνολικό κόστος της διαδικασίας. Συνήθως χρησιμοποιούνται έμβρυα που έχουν φτάσει στα 6-8 κύτταρα και μελετώνται 1 έως 2 κύτταρα (Εικόνα 9). Εικόνα 9:α,β) Βιοψία βλαστομεριδίου εμβρύου 8 κυττάρων γ) αφαίρεση 1 ου βλαστομεριδίου, δ) αφαίρεση 2 ου βλαστομεριδίου. 26

27 Σε αυτό το στάδιο ανάπτυξης έχουμε αξιόπιστη διάγνωση και υψηλά ποσοστά εμφύτευσης των υγιών εμβρύων γιατί: i) Η ανάπτυξη και η διαδικασία διάγνωσης ολοκληρώνονται σε 3 έως 4 μέρες και επομένως τα υγιή έμβρυα μετά τη διάγνωση μπορούν να μεταφερθούν στη γυναίκα την κατάλληλη μέρα. ii) Τα κύτταρα στο έμβρυο δεν είναι πολύ συνδεδεμένα μεταξύ τους και είναι ευκολότερο να απομακρυνθούν 1 έως 2 χωρίς να ταλαιπωρηθεί το έμβρυο με αποτέλεσμα να έχει περισσότερες πιθανότητες επιβίωσης (Hardy K, 1990). iii) Η αφαίρεση ενός κυττάρου σε αυτό το στάδιο δεν επηρεάζει την επιβίωση του εμβρύου. Για έμβρυα που έχουν διαφορετικό στάδιο ανάπτυξης συνήθως δεν υπάρχει αξιόπιστη διάγνωση με υψηλό ποσοστό εμφύτευσης για τους παρακάτω λόγους: A) Η βιοψία του εμβρύου για την αφαίρεση ενός κυττάρου όταν το έμβρυο βρίσκεται στο στάδιο 2-4 κυττάρων μειώνει τις πιθανότητες επιβίωσης του εμβρύου ίσως λόγω του ότι απομακρύνεται υψηλό ποσοστό του γενετικού του υλικού 50% (1 από τα 2 κύτταρα) και 25% (1 από τα 4 κύτταρα) αντίστοιχα. B) Η βιοψία του εμβρύου με την αφαίρεση ενός κυττάρου όταν βρίσκεται στο στάδιο των 8-16 κυττάρων δεν επιλέγεται συνήθως γιατί είναι δυσκολότερη η απομάκρυνση των κυττάρων από το έμβρυο και γιατί απαιτούνται 5-6 μέρες για την ολοκλήρωση της διαδικασίας με αποτέλεσμα να μην μπορεί να γίνει η μεταφορά του εμβρύου την κατάλληλη ημέρα για τη γυναίκα. Σε αυτές τις περιπτώσεις επιλέγεται η κατάψυξη των υγιών εμβρύων και η μεταφορά τους στη γυναίκα την κατάλληλη ημέρα επόμενου μήνα. Γενικά η κατάψυξη μειώνει το ποσοστό επιβίωσης των εμβρύων, τα έμβρυα που έχουν υποστεί βιοψία έχουν ακόμα μικρότερο ποσοστό 27

28 επιβίωσης μετά την απόψυξη τους με αποτέλεσμα το σύνολο της διαδικασίας σε αυτή την περίπτωση να οδηγεί σε χαμηλά ποσοστά κύησης και υψηλό κόστος. Γ) Η PGD σε έμβρυο που βρίσκεται στο στάδιο της βλαστοκύστης είναι μία διαδικασία που έχει ξεκινήσει πρόσφατα στην προεμφυτευτική διάγνωση και στο μέλλον θα είναι πιο διαδεδομένη (Dokras A.1990, Pickering SI.1995, Veiga A.1997). Πλεονεκτεί στο γεγονός ότι μπορούμε να μελετήσουμε καλύτερα και με μεγαλύτερη αξιοπιστία το προς εμφύτευση έμβρυο αφαιρώντας έως και 4 κύτταρα και ελέγχοντας το πολύ κοντά στο στάδιο εμφύτευσης του. Προς το παρόν μειονεκτεί στο ότι δεν υπάρχουν ικανοποιητικά καλλιεργητικά διαλύματα για την ανάπτυξη των εμβρύων στο στάδιο της βλαστοκύστης με αποτέλεσμα να μην είναι υψηλό το ποσοστό των εμβρύων που φτάνουν in vitro σε αυτό το στάδιο. Το παραπάνω, σε συνδυασμό με την έλλειψη ικανοποιητικών προγραμμάτων κατάψυξης βλαστοκύστης και την αμφισβήτηση αρκετών γυναικολόγων για την καταλληλότητα αυτού του σταδίου ανάπτυξης του εμβρύου ως προς την εμφύτευση, περιορίζει αυτή τη στιγμή την εφαρμογή αυτής της διαδικασίας. Η αφαίρεση των βλαστομεριδίων πραγματοποιείται με μικροχειριστήρια αφού πρώτα πραγματοποιηθεί άνοιγμα στην διαφανή ζώνη του εμβρύου με μηχανικό, χημικό ή θερμικό τρόπο. A.2.3. Τεχνικές της PGD Οι τεχνικές που εφαρμόζονται στην PGD εξαρτώνται από την κατηγορία της πιθανής ασθένειας που πρόκειται να μελετηθεί. Τρεις μεγάλες κατηγορίες ασθενειών μελετώνται με PGD (Wells S, 2004) : 1) Φυλοσύνδετες ασθένειες (Ηandyside A.H.,1990). 28

29 Σε αυτές τις περιπτώσεις η ασθένεια συνδέεται με το φυλετικό χρωμόσωμα Χ αλλά δεν οφείλεται σε ένα συγκεκριμένο γονίδιο στο Χ. Είτε δεν είναι γνωστή η συγκεκριμένη γενετική ανωμαλία που την προκαλεί, ή έχει πολυπαραγοντικά αίτια, είτε δεν μπορεί εύκολα να προσδιοριστεί στο κύτταρο. Σε αύτη την περίπτωση γίνεται απόρριψη του εμβρύου με επιλογή φύλου. Παραδείγματα τέτοιων ασθενειών είναι η αιμορροφιλία, το σύνδρομο εύθραυστου Χ, οι περισσότερες νευρομυικές δυστροφίες και εκατοντάδες άλλες ασθένειες. 2) Γνωστές μονογονιδιακές ανωμαλίες (Ηandyside A.H.,1992). Παραδείγματα τέτοιων ασθενειών είναι η κυστική ίνωση, η β-μεσογειακή αναιμία, κ.α. 3)Χρωμοσωμικές ανωμαλίες (ESHRE PGD Consortium, 2002). Περιλαμβάνει διάφορες χρωμοσωμικές ανακατατάξεις όπως οι μεταθέσεις, οι αναστροφές, οι ελλείψεις κ.α καθώς και ανευπλοειδίες. Στις περισσότερες από αυτές τις περιπτώσεις το έμβρυο είναι χρωμοσωμικά ασταθές και είτε δεν θα εμφυτευτεί ή θα οδηγήσει σε αποβολή. Δύο είναι οι γενικές στρατηγικές μελέτης ενός κυττάρου εμβρύου στην προεμφυτευτική διάγνωση: i) To κύτταρο μονιμοποιείται σε αντικειμενοφόρο πλάκα και μελετάται. Η διάγνωση προκύπτει από την μελέτη του μεσοφασικού πυρήνα του κυττάρου και γίνεται με τεχνικές υβριδισμού in situ και ειδικότερα με φθορίζοντα υβριδισμό in situ. Με FISH μελετάται το κύτταρο στη μεσόφαση για προσδιορισμό του φυλετικού χρωμοσώματος, ανευπλοειδιών και δομικών ανωμαλιών. 29

30 ii) Το κύτταρο λύεται και απομονώνεται το DNA του κυττάρου. Η διάγνωση προκύπτει με μελέτη του γενετικού υλικού (DNA) του κυττάρου μετά από ενίσχυση του με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (PCR). Οι τεχνικές PCR χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση μονογονιδιακών νοσημάτων και τον προσδιορισμό φύλου. 30

31 Α.3. ΠΡΟΕΜΦΥΤΕΥΤΙΚΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ-ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΕΥΠΛΟΕΙΔΙΩΝ (Preimplantation Genetic Diagnosis-Aneuploidy Screening, PGD-AS) A.3.1. Τι είναι η PGD-AS Τα τελευταία χρόνια οι ασχολούμενοι με την προεμφυτευτική γενετική μελέτη εμβρυακών κυττάρων αναγνωρίζουν ότι η λέξη διάγνωση έχει νόημα μόνο εφόσον μελετάται μία συγκεκριμένη ανωμαλία και η PGD απαντά για το εάν το έμβρυο φέρει ή όχι τη συγκεκριμένη ανωμαλία για παράδειγμα μετάλλαξη σε συγκεκριμένο γονίδιο ή συγκεκριμένη μετάθεση αναμενόμενη από τον γονέα. Στις περιπτώσεις όμως των ζευγαριών που επιθυμούν PGD επειδή είναι υπογόνιμα ή έχουν αυτόματες αποβολές χωρίς συγκεκριμένη γενετική αιτία και η μελέτη αφορά γενικά το ερώτημα για την ύπαρξη ή όχι χρωμοσωμικών ανωμαλιών στο έμβρυο τότε η απάντηση μπορεί να μην είναι ακριβής γιατί: i. Δεν αφορά την μελέτη όλων των χρωμοσωμάτων (γίνεται επιλογή κάποιων από τα 23) και ii. μπορεί να μην αφορά την εικόνα του εμβρύου αλλά μόνο του βλαστομεριδίου που μελετήθηκε (π.χ μωσαϊκισμός). Για αυτές τις περιπτώσεις αντί του όρου PGD προτείνεται ο όρος προεμφυτευτική γενετική διάγνωση ανίχνευσης PGS, Preimplantation Genetic Screening). Στις περιπτώσεις που η μελέτη αφορά την παρουσία ή απουσία ανευπλοειδιών στο κύτταρο του εμβρύου τότε η διαδικασία ονομάζεται πλέον προεμφυτευτική γενετική διάγνωση-ανίχνευση ανευπλοειδιών (PGD-AS, Preimplantation Genetic Diagnosis-Aneuploidy Screening). Η PGD-AS αναπτύχθηκε κυρίως μαζί με τις τεχνικές υποβοηθούμενης αναπαραγωγής (ART) με σκοπό τη βελτίωση του ποσοστού εγκυμοσύνης και γέννησης υγιών παιδιών σε υπογόνιμα ζευγάρια, διευρύνεται όμως πλέον και εφαρμόζεται και σε ζευγάρια με ανεξήγητη υπογονιμότητα προκειμένου να 31

32 διερευνηθεί η παρουσία αυξημένων χρωμοσωμικών ανωμαλιών στα έμβρυα αυτών των περιστατικών. Οι τεχνικές της PGD-AS συνεχώς βελτιώνονται και αυξάνονται με στόχο την ακριβέστερη διαγνωστική προσέγγιση. Α.3.2. Ενδείξεις για PGD-AS Οι κατηγορίες ζευγαριών που μπορούν να ωφεληθούν από την PGD-AS είναι : i) Γυναίκες που έχουν ηλικία μεγαλύτερη των 35 ετών επειδή έχουν αυξημένο κίνδυνο να αποκτήσουν έμβρυο με ανευπλοειδίες και επομένως αυξημένο κίνδυνο για αδυναμία εμφύτευσης, αποβολή ή και γέννηση ασθενούς παιδιού (Πίνακας 1). ΗΛΙΚΙΑ ΤΡΙΣΩΜΙΑ 21 ΤΡΙΣΩΜΙΑ 18 ΤΡΙΣΩΜΙΑ : : : : : : : : : : : : : : : : 60 1 : : 1600 Πίνακας 1: Πιθανότητα γέννησης παιδιού με τρισωμία 13,18 ή 21 σε σχέση με την ηλικία της γυναίκας. ii) Σε ζευγάρια που έχουν επαναλαμβανόμενες αποτυχημένες προσπάθειες εξωσωματικής γονιμοποίησης. Η αποτυχημένη εμφύτευση μπορεί να οφείλεται σε ποικίλους λόγους, ένας από τους οποίους είναι το αυξημένο ποσοστό χρωμοσωμικών ανευπλοειδιών στα παραγόμενα έμβρυα. Τα έμβρυα μπορεί να 32

33 παρουσιάζουν ίδιες ή διαφορετικές ανευπλοειδίες στα κύτταρα τους (μωσαϊκισμός) που συνήθως οδηγούν σε διακοπή της ανάπτυξης στα αρχικά στάδια (2-4 κύτταρα) και επομένως μη εμφύτευση. Πρόσφατα σε αυτή την ομάδα υπογόνιμων ζευγαριών μελετάται με την τεχνική CGH της PGD-AS, μια υποομάδα στην οποία όλα τα έμβρυα που προκύπτουν μετά την εξωσωματική γονιμοποίηση ενώ έχουν φυσιολογική μορφολογία και αναπτύσσονται μέχρι και το στάδιο της βλαστοκύστης, όταν ελέγχονται για χρωμοσωμικές ανωμαλίες παρουσιάζουν εκτεταμένες ελλείψεις και προσθήκες σε όλα σχεδόν τα χρωμοσώματα. Με δεδομένο ότι η ύπαρξη τέτοιων εμβρύων δεν μπορεί να οδηγήσει σε επιτυχή εμφύτευση, η διάγνωση τους βοηθάει τα ζευγάρια να αποφύγουν άσκοπες επαναλαμβανόμενες προσπάθειες IVF που θα τους ταλαιπωρήσουν ψυχικά και οικονομικά. iii) Ζευγάρια που παρουσιάζουν ιστορικό επαναλαμβανόμενων αποβολών πρώτου τριμήνου ή αυτόματων αποβολών. Τα ζευγάρια αυτά μπορούν να επιλέξουν να πραγματοποιήσουν εξωσωματική γονιμοποίηση και αφού πραγματοποιηθεί PGD- AS να μελετηθούν τα έμβρυα για την ύπαρξη ανευπλοειδιών και να διερευνηθεί η πιθανότητα οι ανευπλοειδίες να είναι ο λόγος της διακοπής της κύησης στις πρώτες βδομάδες. iv) Ζευγάρια στα οποία ο άντρας είναι υπογόνιμος και ακολουθούν κάποια θεραπεία υποβοηθούμενης αναπαραγωγής. Το 50% της υπογονιμότητας στους άντρες οφείλεται σε χρωμοσωμικές ανωμαλίες στα σπερματοζωάρια κυρίως σε ανευπλοειδίες. Σε γόνιμους άντρες το ποσοστό των ανευπλοειδιών στα σπερματοζωάρια είναι 3-8%. Στους υπογόνιμους άντρες (χαμηλός αριθμός, κακή κινητικότητα ή κακή μορφολογία σπερματοζωαρίων) το ποσοστό των ανευπλοειδιών στα σπερματοζωάρια είναι 27 έως 74%. Σε αυτά τα ζευγάρια 33

34 ενδείκνυται ο έλεγχος των σπερματοζωαρίων για ανευπλοειδίες και αποτελεί πρόβλεψη για την έκβαση της IVF αφού μορφολογικά φυσιολογικά σπερματοζωάρια μπορεί να έχουν χρωμοσωμικές ανωμαλίες. Α.3.3. Σημασία της PGD-AS Έχει προσδιοριστεί ότι η πιθανότητα μιας γόνιμης γυναίκας να τεκνοποιήσει είναι 25% για κάθε μηνιαίο κύκλο (Short, 1978). Στις περισσότερες περιπτώσεις που η εγκυμοσύνη οδηγείται σε αποβολή υπεύθυνη σε ποσοστό 60% είναι η παρουσία ανευπλοειδιών στο έμβρυο (Chandley, 1984; Jacobs, 1992; Zenses and Casper, 1992). Είναι μεγάλο το ποσοστό των εμβρύων που χάνεται στα αρχικά στάδια ανάπτυξης όπου είναι δύσκολο να απομονωθεί και να μελετηθεί το προϊόν αποβολής. Όμως σε αναλύσεις που πραγματοποιούνται σε προκαλούμενες διακοπές κύησης, το ποσοστό ανευπλοειδιών φτάνει το 5% σε έμβρυα 10 εβδομάδων και 9% σε έμβρυα 3 εβδομάδων (Boue,et al.,1985). Οι ανευπλοειδίες μπορούν να αφορούν ολόκληρο το χρωμόσωμα ή μέρος αυτού. Οι μερικές ανευπλοειδίες προκύπτουν με απαλοιφή, προσθήκη ή διπλασιασμό τμήματος του γενετικού υλικού του χρωμοσώματος. Οι περισσότερες χρωμοσωμικές ανευπλοειδίες δεν είναι συμβατές με την ζωή. Η τύχη των εμβρύων που φέρουν χρωμοσωμικές ανευπλοειδίες εξαρτάται από τα εμπλεκόμενα χρωμοσώματα. Τα έμβρυα που έχουν ανευπλοειδίες μπορεί να σταματήσουν να διαιρούνται πριν την εμφύτευση οπότε υπάρχει αποτυχία επίτευξης εγκυμοσύνης, να σταματήσουν αμέσως μετά την εμφύτευση οπότε έχουμε βιοχημική κύηση (biochemical pregnancy), να σταματήσει η ανάπτυξη αφού έχει εμφανιστεί καρδιακή λειτουργία (παρουσία σάκου), να σταματήσει στη διάρκεια της εγκυμοσύνης και τέλος να ολοκληρωθεί σε νεογνό. Στις περιπτώσεις αυτές το 34

35 παιδί ανάλογα με το είδος της ανευπλοειδίας παρουσιάζει δυσμορφίες, ή καθυστέρηση ή και πρόωρη θνησιμότητα. Στις αυτόματες αποβολές (συχνότητα 15%), η συχνότητα των χρωμοσωμικών ανωμαλιών είναι 50% και οι τύποι των ανωμαλιών διαφέρουν από αυτές που παρατηρούνται στα νεογνά. Το 18% των αποβολών που έχουν χρωμοσωμικές ανωμαλίες παρουσιάζουν το σύνδρομο Turner (45, ΧΟ) ενώ δεν παρατηρούνται συχνά σε αυτές ανευπλοειδίες με άλλο φυλετικό χρωμόσωμα που συναντάμε σε νεογνά. Σε μεγάλο ποσοστό αυτόματων αποβολών βρίσκεται ένα επιπλέον αυτοσωμικό χρωμόσωμα (τρισωμία 16) που δεν συναντάται καθόλου στα νεογνά. Από τις αριθμητικές ανευπλοειδίες, συμβατές με την κύηση είναι για τα αυτοσωμικά χρωμοσώματα οι τρισωμίες 13 (σύνδρομο Patau), 18 (σύνδρομο Edwards), 21 (σύνδρομο Down) και για τα φυλετικά τέσσερεις τύποι ανευπλοειδιών: 45, ΧΟ (σύνδρομο Turner), 47, ΧYΥ, 47,ΧXΥ (σύνδρομο Klinefelter) και ο 47, ΧΧΧ. Οι εμβρυϊκές ανευπλοειδίες μπορεί να κληρονομούνται από το ωάριο (συμβαίνουν κατά την μείωση και αυξάνονται με την ηλικία της γυναίκας) ή το σπερματοζωάριο ή να δημιουργούνται de novo μετά την γονιμοποίηση (μεταζυγωτικές διεργασίες). Όταν η αριθμητική ανισορροπία συμβεί σε κάποιο από τα αρχικά στάδια διαιρέσεων του εμβρύου, τότε στο έμβρυο υπάρχουν περισσότερες από μία ομάδες κυττάρων με διαφορετική χρωμοσωμική σύσταση και το φαινόμενο ονομάζεται μωσαϊκισμός, ενώ όταν συμβούν περισσότερα από ένα γεγονότα δημιουργίας ανευπλοειδίας τότε στο έμβρυο προκύπτουν πολλές ομάδες κυττάρων με ποικίλη χρωμοσωμική σύσταση που τις περισσότερες φορές δεν μπορεί να εξηγηθεί οπότε το έμβρυο ονομάζεται χαοτικό. Η ανάπτυξη και εφαρμογή των τεχνικών εξωσωματικής γονιμοποίησης σαν θεραπεία της υπογονιμότητας έδωσε την ευκαιρία της δυνατότητας διεξοδικής μελέτης εμβρύων για την ύπαρξη ανευπλοειδιών πριν, μετά την γονιμοποίηση και στα αρχικά στάδια ανάπτυξης τους (Διάγραμμα 1). 35

36 60% 60% 30-60% 30-60% ΧΡΩΜΟΣΩΜΙΚΕΣ ΑΝΕΥΠΛΟΕΙΔΙΕΣ ΣΕ ΕΜ ΒΡΥΑ ΧΡΩΜΟΣΩΜΙΚΕΣ ΑΝΕΥΠΛΟΕΙΔΙΕΣ ΣΕ ΕΜ ΒΡΥΑ 50% 50% 40% 40% 30% 30% 20% 20% 10% 10% 12% 12% 8% 8% 3% 3% 0% 0% 1η 1η ΒΔΟΜΑΔΑ ΒΔΟΜΑΔΑ 3η 3η ΒΔΟΜΑΔΑ ΒΔΟΜ ΑΔΑ 10η 10η ΒΔΟΜΑΔΑ ΒΔΟΜΑΔΑ 36η 36η ΒΔΟΜΑΔΑ ΒΔΟΜΑΔΑ Διάγραμμα 1 : Ποσοστά ανευπλοειδιών κατά την ανάπτυξη των εμβρύων. Οι μελέτες αυτές δείχνουν ότι τα έμβρυα με κακή μορφολογία που είναι γνωστό ότι έχουν χαμηλά ποσοστά εμφύτευσης παρουσιάζουν ανευπλοειδίες σε ένα ή περισσότερα βλαστομερίδια σε ποσοστό 35-70% (Munné et al., 1994a,b,1998a; Benadiva et al.,1996; Laverge et al.,1997; Magli et al.,2001). Έχει δειχθεί ότι αυτά τα έμβρυα είναι συνήθως μωσαϊκά (Munné et al., 1994a,b,1998a; Benadiva et al., 1996). Η φυσιολογική μορφολογία των εμβρύων όμως δεν υποδηλώνει και φυσιολογικό καρυότυπο (Magli et al., 1998, 2001; Voullaire et al., 2000). Έμβρυα που αναπτύσσονται φυσιολογικά και έχουν καλή μορφολογία δεν είναι συνήθως διαθέσιμα για μελέτη. Από τις λίγες μελέτες που έχουν γίνει σε αυτά φαίνεται ότι παρουσιάζουν χρωμοσωμική ανωμαλία σε ποσοστό 30-65% (Ηarper et al., 1995; Benadiva et al.,1996; Delhanty et al.,1997; Iwarsson et al.,1999) και συχνότητα μωσαϊκισμού 17-43% (Munné et al., 1994b, 1997; Ηarper et al., 1995; Benadiva et al.,1996; Delhanty et al.,1997). 36

37 O χρωμοσωμικός μωσαϊκισμός στα αρχικά στάδια ανάπτυξης των εμβρύων είναι σαφέστατα ένα μεταζυγωτικό γεγονός. Από τα έμβρυα που αναπτύσσονται με σωστή μορφολογία, φαίνεται ότι είναι χρωμοσωμικά φυσιολογικά συνήθως όσα αναπτύσσονται συγχρονισμένα, όπως αναμένεται. Αντίθετα έμβρυα που διαιρούνται αργά (Munné et al.,1994a,b) ή πολύ γρήγορα ( Magli et al. 1998, 2001; Harper et al. 1994) είναι πιθανότερο να παρουσιάζουν την τρίτη ημέρα ανάπτυξης χρωμοσωμικές ανωμαλίες κυρίως πολυπλοειδία και μωσαϊκισμό, γεγονότα που συμβαίνουν μεταζυγωτικά (Magli et al., 2001). Από τις μελέτες που έχουν πραγματοποιηθεί μέχρι αυτή την στιγμή φαίνεται ότι: Με την PGD-AS μειώνεται το ποσοστό των γεννημένων παιδιών με τρισωμίες 13, 18, 21. Έχει δειχθεί (Munné et al, 2002) ότι με την PGD-AS μπορεί να μειωθεί στο 0,4% το ποσοστό των παιδιών που φέρουν ανευπλοειδίες στα χρωμοσώματα 13,18,21 σε σχέση με το 2,8% που αναμένεται στον γενικό πληθυσμό για τις ίδιες ηλικίες (Eiben B et al, 1994). Με την PGD-AS μειώνεται το ποσοστό των αυτόματων αποβολών. Έχει δειχθεί ότι το ποσοστό μειώνεται από 23% σε 9% ενώ αυξάνεται και το ποσοστό των γεννημένων παιδιών ( Munné S et al, 1999). Yπάρχουν αρκετές μελέτες που αφορούν τη συνεισφορά της PGD-AS στην αύξηση του ποσοστού εμφύτευσης σε ζευγάρια που πραγματοποιούν εξωσωματική γονιμοποίηση. Άλλες δείχνουν ότι δεν επηρεάζεται το ποσοστό εμφύτευσης, άλλες το αυξάνουν λίγο ή αρκετά. Γενικά φαίνεται ότι όσο αυξάνουμε τα χρωμοσώματα που μελετώνται και όσο αυξάνεται η ηλικία της γυναίκας, η PGD-AS αυξάνει το ποσοστό εμφύτευσης και γεννημένων παιδιών ( Munné S et al, 1999, 2002; Gianaroli L, 1997). 37

38 Α.3.4. Μεθοδολογία της PGD-AS Δύο είναι οι τεχνικές που χρησιμοποιούνται από τα εργαστήρια προεμφυτευτικής διάγνωσης για την διαπίστωση ανευπλοειδιών σε βλαστομερίδια εμβρύων, η FISH και η CGH. 1. Με τον φθορίζοντα υβριδισμό in situ (FISH-Fluorescence in situ hybridization) γίνεται διάγνωση στον μεσοφασικό πυρήνα του βλαστομεριδίου χρησιμοποιώντας χρωμοσωμικούς ανιχνευτές που φέρουν φθοριόχρωμα (FISH). Με την τεχνική μπορούν να μελετηθούν 1-15 χρωμοσώματα (Εικόνα 10). Χ Εικόνα 10: FISH με 5 ανιχνευτές σε πυρήνα βλαστομεριδίου για ανίχνευση ανευπλοειδιών στα χρωμοσώματα Υ, Χ, 18, 13, 21, όπου φαίνεται η τρισωμία 13 και το φύλο ΧΧ του εμβρύου. 2. Με τον συγκριτικό γονιδιωματικό υβριδισμό (CGH-comparative genomic hybridization) γίνεται απομόνωση του γενετικού υλικού του βλαστομεριδίου, ολική 38

39 ενίσχυση του DNA (WGA-whole genome amplification) με τεχνικές PCR, σήμανση του ενισχυμένου DNA του βλαστομεριδίου καθώς και του DNA λεμφοκυττάρων με φθοριοχρώματα και υβριδισμός in situ αυτών σε φυσιολογικές μεταφάσεις. Ο σκοπός της τεχνικής είναι η σάρωση και μελέτη του γενετικού υλικού όλων των χρωμοσωμάτων του βλαστομεριδίου. Η (CGH) τεχνική πραγματοποιείται σε φυσιολογικές μεταφάσεις. Η εκτίμηση των αποτελεσμάτων μετά την φωτογράφηση των μεταφάσεων (Εικόνα 11) βασίζεται στις διαφορές που προκύπτουν στις απορροφήσεις των φθοριοχρωμάτων του φυσιολογικού DNA σε σχέση με το βλαστομεριδιακό. Εικόνα 11 : Φωτογράφηση μεταφάσεων με την τεχνική CGH. 39

40 A. 4. Ο ΣΥΓΚΡΙΤΙΚΟΣ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΙΚΟΣ ΥΒΡΙΔΙΣΜΟΣ (CGH) ΣΤΗΝ ΠΡΟΕΜΦΥΤΕΥΤΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ Α Αρχές της CGH. Η CGH βασίζεται στην σύγκριση του υπό μελέτη DNA με φυσιολογικό DNA με σκοπό τον προσδιορισμό των αντιγράφων των χρωμοσωμάτων του δείγματος που μας ενδιαφέρει και τη διάγνωση μερικής ή ολικής ανευπλοειδίας. H τεχνική όπως αναπτύχθηκε το 1992 από τον Kallioniemi αφορούσε την ανίχνευση ανευπλοειδιών σε χρωμοσώματα καρκινικών κυττάρων. Στην τεχνική όπως αναπτύχθηκε από τον Kallioniemi χρησιμοποιείται ικανοποιητικός αριθμός κυττάρων αφού για την πραγματοποίηση της απαιτούνται 300ng-1μg DNA που αντιστοιχεί στο DNA περίπου κυττάρων. Στην προεμφυτευτική διάγνωση έχουμε 1-2 κύτταρα με αποτέλεσμα η ποσότητα του DNA να μην είναι αρκετή για την πραγματοποίηση της τεχνικής. Η πολλαπλή PCR χρησιμοποιείται τα τελευταία χρόνια (Wells D, book, 2001) για την ενίσχυση διάφορων γενετικών τόπων του DNA ενός κυττάρου. Όμως για την CGH απαιτείται μη ειδική ενίσχυση ολόκληρου του γονιδιώματος του κυττάρου (WGA-Whole Genome Amplification). Διάφορες τεχνικές PCR αναπτύχθηκαν και δοκιμάστηκαν για την ενίσχυση του DNA του κυττάρου πριν την CGH (Wells D, 1999). Δύο τεχνικές από αυτές μπόρεσαν να ενισχύσουν ικανοποιητικά ολόκληρο το γονιδίωμα η DOP-PCR (Degenerate Oligonucleotide Primer PCR), (Telenius, 1992) και η PEP- PCR (Primer Extention Preamplification PCR), (Zhang, 1992). Από τις δύο αυτές η DOP-PCR παράγει ικανοποιητική ποσότητα ενισχυμένου DNA για την χρήση της CGH. Στην πρώτη επίδειξη χρήσης της DOP-PCR και της CGH στην ανίχνευση ανευπλοειδιών σε ένα κύτταρο ανιχνεύτηκε με επιτυχία μονοσωμία 1 σε βλαστομερίδιο που επιβεβαιώθηκε στα υπόλοιπα βλαστομερίδια του εμβρύου 40

41 με FISH (Wells, 1999). Η τεχνική αξιολογήθηκε θετικά την ίδια χρονιά από την Voullaire, (Voullaire, 1999). Στην PGD-AS αρχικά προετοιμάζεται το DNA του κυττάρου για την CGH. α) Το βλαστομερίδιο μεταφέρεται σε μικροσωληνάριο και λύεται ώστε να ελευθερωθεί το DNA του κυττάρου. β) Το DNA του κυττάρου (~5pg) ενισχύεται με DOP-PCR ώστε να είναι στην κατάλληλη ποσότητα >300ng για την πραγματοποίηση της CGH, (Εικόνα 12). Εικόνα 12: Ενίσχυση του DNA του κυττάρου με DOP-PCR. 41

42 Στην DOP-PCR χρησιμοποιείται μίγμα εκφυλισμένων εκκινητών όπως οι εκκινητές τύπου 5 -CCGACTCGAG-NNNNNN-ATGTGG-3 (N: A,T,C,G), (Τelenius et al, 1992). Σε κάθε κύκλο PCR αρχικά αποδιατάσσεται το δίκλωνo DNA-στόχος που πρόκειται να ενισχυθεί. Ακολουθεί η σύνδεση των εκκινητών σε τυχαίες συμπληρωματικές θέσεις σε ολόκληρη την έκταση του γονιδιώματος και στην συνέχεια συντίθενται με την παρουσία της Taq πολυμεράσης στο DNA-μήτρα οι συμπληρωματικοί κλώνοι. Οι κύκλοι είναι αρκετοί και σε κάθε ένα από αυτούς πολλαπλασιάζεται το DNA. Στη συνέχεια το DNA σημαίνεται. Η σήμανση του ενισχυμένου DNA με φθοριόχρωμα μπορεί να πραγματοποιηθεί με δύο τρόπους: α) Πραγματοποιώντας μία δεύτερη DOP-PCR σε τμήμα του προηγούμενου ενισχυμένου DNA (1/10) χρησιμοποιώντας τους ίδιους εκκινητές. Στην δεύτερη όμως DOP-PCR χρησιμοποιείται και ένα dntp συνδεδεμένο με φθοριόχρωμα, dutp-φθοριόχρωμα. Σαν αποτέλεσμα το DNA-στόχος σημαίνεται με το φθοριόχρωμα και επιπλέον ενισχύεται ξανά η ποσότητα DNA-στόχου. β) Η σήμανση του DNA πραγματοποιείται με την τεχνική μετάφρασης δι εγκοπής nick-translation (Lichter, 1994). Στην nick-translation στο μίγμα των αντιδραστηρίων υπάρχουν δύο ένζυμα: α) Mία ενδονουκλεάση η οποία κόβει τους κλώνους του DNA σε διαφορετικά σημεία του δίκλωνου μορίου. Πιο συγκεκριμένα αφαιρείται τμήμα του ενός κλώνου έτσι ώστε να παραμένει ο συμπληρωματικός του κλώνος ανέπαφος και β) Μία εξωνουκλεάση-πολυμεράση η οποία συνθέτει με κατεύθυνση 5-3. Έχοντας στο μίγμα dntps τα οποία είναι συνδεδεμένα με φθοριόχρωμα πετυχαίνουμε την σύνθεση σημασμένων τμημάτων του DNA στόχου, (Εικόνα 13). Με την τεχνική αυτή δεν αυξάνεται η ποσότητα του DNA. Το μέγεθος των σημασμένων τμημάτων εξαρτάται από την συγκέντρωση και το χρόνο της 42

43 δράσης των δύο ενζύμων που για τους σκοπούς της CGH θα πρέπει να είναι της τάξης των bp. Εικόνα 13: H τεχνική nick-translation. H CGH περιλαμβάνει τα παρακάτω στάδια: 1) Το ενισχυμένο DNA από το βλαστομερίδιο σημαίνεται με nick-translation ή DOP-PCR με πράσινο φθοριόχρωμα (FITC). 2) Ίδια ποσότητα DNA από λεμφοκύτταρα φυσιολογικού άρρενος σημαίνεται με nick-translation ή DOP-PCR με κόκκινο φθοριόχρωμα (Rhodamine ή TEXAS RED). 3) Προετοιμάζονται αντικειμενοφόρες πλάκες με μεταφάσεις φυσιολογικού άρρενος ( Lichter, 1990). 4) Το μίγμα από τα δύο σημασμένα DNA αποτελεί τον ανιχνευτή που εναποθέτουμε για υβριδισμό στις μεταφάσεις για 72 ώρες. 5) Ακολουθεί φωτογράφηση της κάθε μετάφασης με φίλτρα για τα φθοριοχρώματα χωριστά (Εικόνα 14). 43

44 Με υπολογιστικό σύστημα συνθέτονται οι φωτογραφίες κάθε μετάφασης για τα 3 φίλτρα DAPI, FITC, Rhodamine. Στα χρωμοσώματα στα τμήματα που δεν παρουσιάζουν ανευπλοειδία και η αναλογία πράσινου-κόκκινου είναι ίδια το χρώμα του τμήματος φαίνεται κίτρινο, όταν υπάρχει ολική ανευπλοειδία όπως τρισωμία ή μερική ανευπλοειδία, όπως διπλασιασμός περιοχής του DNA του βλαστομεριδίου, τότε η αναλογία πράσινου-κόκκινου είναι προς το πράσινο ενώ όταν υπάρχει μονοσωμία ή έλλειψη τότε η αναλογία πράσινου-κόκκινου είναι προς το κόκκινο. Εικόνα 14: Φωτογράφηση με 1.κόκκινο φίλτρο, 2. πράσινο φίλτρο, 3. φίλτρο για DAPI, και 4. συνδυασμός των3 παραπάνω φωτογραφιών. 6) Πραγματοποιείται ο καρυότυπος για κάθε μετάφαση, (Εικόνα 15).. 44

45 Εικόνα 15: Καρυότυπος στην CGH. 7) Με υπολογιστικό σύστημα προσδιορίζεται κατά μήκος κάθε χρωμοσώματος, για κάθε μετάφαση η αναλογία κόκκινου-πράσινου. Γίνεται συνολική αξιολόγηση των αποτελεσμάτων από μεταφάσεις και τα τελικά αποτελέσματα συγκεντρώνονται σε στατιστικές καμπύλες (Εικόνα 16). 8) Η μελέτη της τελικής ανάλυσης δίνει τις πληροφορίες που χρειαζόμαστε για όλα τα χρωμοσώματα του κυττάρου. 45

46 Εικόνα 16: Η τελική ανάλυση των αποτελεσμάτων της CGH για 20 μεταφάσεις. Τα τμήματα των χρωμοσωμάτων που παρουσιάζουν πράσινο αφορούν μερικές ανευπλοειδίες πλεονάσματος DNA στο υπό μελέτη δείγμα, όσα παρουσιάζουν κόκκινο αφορούν ελλείψεις. Για το χρωμόσωμα 7 η ανάλυση δείχνει μονοσωμία. Ακολουθεί συνοπτική παρουσίαση των σταδίων της CGH για ανίχνευση ανευπλοειδιών σε ένα κύτταρο, (Eικόνα 17). 46

47 ΕΝΑ ΒΛΑΣΤΟΜΕΡΙΔΙΟ, ΛΥΕΤΑΙ ΣΕ PCR ΜΙΚΡΟΣΩΛΗΝΑΡΙΟ. ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΙΚΟ DNA ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΟΥ ΑΡΡΕΝΟΣ ENΙΣΧΥΣΗ ΤΟΥ ΟΛΙΚΟΥ DNA ME DOP-PCR TO YΠΟ ΕΛΕΓΧΟ DNA ΣΗΜΑΙΝΕΤΑΙ ΠΡΑΣΙΝΟ. ΤΟ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΟ DNA ΣΗΜΑΙΝΕΤΑΙ ΚΟΚΚΙΝΟ. ΤΟ ΥΠΟ ΕΛΕΓΧΟ DNA ΚΑΙ ΤΟ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΟ DNA YBΡΙΔΟΠΟΙΟΥΝΤΑΙ ΜΑΖΙ ΣΕ ΜΕΤΑΦΑΣΕΙΣ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΟΥ ΑΡΡΕΝΟΣ Η ΑΝΑΛΟΓΙΑ ΠΡΑΣΙΝΟΥ-ΚΟΚΚΙΝΟΥ ΣΕ ΚΑΘΕ ΧΡΩΜΟΣΩΜΑ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΕΙΤΑΙ ΓΙΑ ΝΑ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΤΕΙ Ο ΑΡΙΘΜΟΣ ΤΩΝ ΑΝΤΙΓΡΑΦΩΝ ΣΤΟ ΥΠΟ ΕΛΕΓΧΟ DNA. Εικόνα 17: Στάδια της CGH στην ανίχνευση ανευπλοειδιών. 47

48 Α.4.2. Αξιολόγηση της CGH. Με την FISH μπορεί να ανιχνευθεί συνήθως ένας σχετικά περιορισμένος αριθμός χρωμοσωμάτων όμως στα έμβρυα των πρώτων ημερών είναι πιθανές ανευπλοειδίες σε όλα τα χρωμοσώματα. Για να είμαστε σίγουροι ότι στα περιστατικά IVF μεταφέρονται έμβρυα χωρίς αριθμητικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες θα πρέπει να μπορούμε να ελέγξουμε όλα τα χρωμοσώματα του βλαστομεριδίου. Η ανάγκη αυτή ώθησε τους κυτταρογενετιστές στο να βρουν τρόπο ελέγχου όλων των χρωμοσωμάτων. Οι περισσότερες κυτταρογενετικές τεχνικές απαιτούν κύτταρα που βρίσκονται σε μετάφαση, δυστυχώς τα βλαστομερίδια συνήθως βρίσκονται σε μεσόφαση όπου τα χρωμοσώματα μέσα στον πυρήνα δεν είναι ευδιάκριτα. Έχουν γίνει αρκετές προσπάθειες δημιουργίας μεταφασικών χρωμοσωμάτων από το βλαστομερίδιο με κλασικούς τρόπους π.χ παρουσία μιτογόνου σε συνδυασμό με χρήση κολχικίνης (Wilton, 1993; Jamieson, 1994; Santalo, 1995; Clouston, 1997) αλλά και πιο σύγχρονους όπως σύντηξης του βλαστομεριδίου με ωάριο και κατόπιν προσδιορισμό των μεταφασικών χρωμοσωμάτων (Verlinski, 1999; Willadsen, 1999) με διάφορες συμβατικές ή μοριακές τεχνικές. Oι τεχνικές αυτές δεν βρήκαν εφαρμογή στην PGD-AS γιατί δίνουν αποτέλεσμα μόνο μέχρι το 50% των αναλυόμενων βλαστομεριδίων και δεν δίνουν πληροφορίες για όλα τα χρωμοσώματα (Fung, 2000; Weier, 2001). Η ποιότητα των χρωμοσωμάτων, η ανάλυση τους και ο μικρός αριθμός μελετούμενων κυττάρων (1-2 βλαστομερίδια) δεν δίνει αξιόπιστη διάγνωση. Τα τελευταία χρόνια για αυτό το σκοπό ερευνήθηκε η δυνατότητα σάρωσης (screening) όλων των χρωμοσωμάτων του βλαστομεριδίου με την τεχνική του συγκριτικού γονιδιωματικού υβριδισμού CGH (Comparative Genomic Hybridization). Η CGH πρωτοεμφανίστηκε το 1992, ( Kallioniemi, 1992) και 48

49 τελειοποιήθηκε σαν τεχνική δύο χρόνια αργότερα (Kallioniemi, 1994). Από το 1992 μέχρι σήμερα χρησιμοποιείται στην κυτταρογενετική του καρκίνου για τη σάρωση όλων των χρωμοσωμάτων κυττάρων καρκινικών όγκων (Ashton KJ, 2001). Είναι ένα πολύτιμο εργαλείο στην βασική έρευνα της γενετικής των καρκινικών όγκων για την μελέτη της χρωμοσωμικής σύστασης των κύττάρων τους. Με την μέθοδο αυτή είναι δυνατός ο προσδιορισμός ανευπλοειδιών, προσθηκών, διπλασιασμών ή ελλείψεων σε χρωμοσώματα. Ειδικότερα μπορούν να προσδιοριστούν διπλασιασμοί ή ελλείψεις που μπορούν να συσχετισθούν με την ύπαρξη κυτταρικών ογκογονιδίων ή ογκοκατασταλτικών γονιδίων σε αυτά τα τμήματα των χρωμοσωμάτων. Επιπλέον γίνεται κατηγοριοποίηση των καρκινικών όγκων σε υποκατηγορίες με βάση τα αποτελέσματα της CGH και προσπάθεια συσχέτισης των αποτελεσμάτων με το φάσμα του φαινότυπου ανά κατηγορία καρκινικού όγκου αλλά και πιθανή αξιοποίηση των αποτελεσμάτων για προγνωστικούς σκοπούς (Gebhart E, 2004). Ο λόγος που η τεχνική βρίσκει εφαρμογή σε αυτό το πεδίο είναι γιατί στα καρκινικά κύτταρα εμφανίζεται πολύπλοκος καρυότυπος και συνήθως σε αυτά τα κύτταρα δεν μπορούμε να πάρουμε εύκολα μεταφασικά χρωμοσώματα και όταν συμβεί είναι κακής ποιότητας. Τα τελευταία 6 χρόνια γίνονται προσπάθειες σε λίγα επιλεγμένα κέντρα προεμφυτευτικής διάγνωσης να χρησιμοποιηθεί η μέθοδος CGH στην πλήρη σάρωση των χρωμοσωμάτων του βλαστομεριδίου (Voullarie L, 1999; Wells D, 2000) ή και πολικών σωματίων (Wells D, 2002). Α.4.3. Σημασία της CGH. Η πρώτη εκτεταμένη μελέτη βλαστομεριδίων (>60) με την CGH (Voullaire, 2000) έγινε σε 12 έμβρυα με φυσιολογική μορφολογία που είχαν διαγνωστεί ως 49