Προεμφυτευτικός Γενετικός έλεγχος (ΠΓΔ) Ε.Καναβάκης Καθηγητής Ιατρικής Γενετικής

Transcript

1 Προεμφυτευτικός Γενετικός έλεγχος (ΠΓΔ) Ε.Καναβάκης Καθηγητής Ιατρικής Γενετικής Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής

2 Επίπτωση Γενετικών Νοσημάτων 50% αποβολών 1ου τριμήνου υπάρχει χρωμοσωμική ανωμαλία 2% νεογνών, χρωμοσωμική ανωμαλία ή μονογονιδιακό νόσημα 30% των εισαγωγών στα παιδιατρικά νοσοκομεία και 40-50% των θανάτων της παιδικής ηλικίας καλύπτουν οι γενετικές και συγγενείς ανωμαλίες

3 Γενετικά νοσήματα Χρονιότητα μονιμότητα Βαρύτητα κλινικών εκδηλώσεων Δυσκολία στη θεραπευτική αντιμετώπιση Συχνή συνύπαρξη αναπηριών & πνευματικής καθυστέρησης

4 ΠΡΟΛΗΨΗ ΓΕΝΕΤΙΚΩΝ ΝΟΣΗΜΑΤΩΝ

5 Η πρόληψη συμπεριλαμβάνει Εντόπιση φορέων Γενετική συμβουλευτική Προγεννητική διάγνωση Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής, Πανεπιστημίου Αθηνών

6 Μοριακές τεχνικές για ανίχνευση φορέων (WHO) 1. Η νόσος θα πρέπει λόγω της συχνότητας και της βαρύτητας της να αποτελεί μείζον πρόβλημα υγείας. 2. Να απαιτείται εφ όρου ζωής θεραπευτική υποστήριξη των ασθενών. 3. Να είναι γνωστή η βιοχημική και μοριακή διαταραχή του νοσήματος. 4. Να υπάρχει απλή, οικονομική και αξιόπιστη μοριακή μεθοδολογίαγιατονκαθορισμότωνφορέων. 5. Να υπάρχει δυνατότητα γενετικής παρέμβασης με ενημέρωση του κοινού, εφαρμογή προγεννητικού ελέγχου και διακοπή της κύησης σε περίπτωση άρρωστου εμβρύου.

7 Έλεγχος φορέων με μοριακές τεχνικές Σεόσοτοδυνατόμεγαλύτεροαριθμόμελών οικογενειών με γενετικό νόσημα. Στο άλλο μέλος του ζευγαριού που ο ένας είναι φορέας της νόσου. Σε όλα τα άτομα υψηλού κινδύνου όπως αυτά προκύπτουν από συγκεκριμένη κλινική συμπτωματολογία ή το ατομικό και κληρονομικό αναμνηστικό τους.

8 Σκοπός της Π Δ είναι να δοθεί στους γονείς εφ όσον οι ίδιοι το επιλέγουν η διαβεβαίωση ότι θα αποκτήσουν μη προσβεβλημένα παιδιά, για συγκεκριμένο γενετικό νόσημα για το οποίο υπάρχει αυξημένος κίνδυνος. Αυτό δεν προϋποθέτει ότι θα γεννήσουν φυσιολογικά παιδιά δεδομένου ότι δεν ελέγχονται όλες οι πιθανές συγγενείς ανωμαλίες ή γενετικές νόσοι.

9 Τα πρώτα βήματα της προγεννητικής διάγνωσης Αμνιοπαρακέντηση: διάγνωση φύλου εμβρύου (σ. Barr) Serr et al, Bull Res Council Isr, 58: 137, Fucks F & Riis R, Nature 177: Καλλιέργεια αμνιακών κυττάρων: καρυότυπος εμβρύου Steele MW & Brey WR, Lancet 1: Δειγματοληψία/καλλιέργεια τροφοβλάστης (CVS): καρυότυπος Niazi M et al, Br J Obstet Gynaecol 88: CVS 1ου τριμ. κύησης: άμεση χρωμοσωμική ανάλυση Simoni G et al, Hum Genet 63: 349

10 Amniocentesis & trophoblast (CVS) sampling Amniotic Fluid 15 ml amniotic fluid yields 5 mg of DNA (May be cultured) Chorionic Villi Typical yield 45 mg DNA Source: Recombinant DNA, Second Edition, Eds Watson JD, Gilman M, Witkowski J, Zoller M

11 Γενετική συμβουλευτική πριν τον προγεννητικό έλεγχο 1. Αναλύεται η ειδική ένδειξη / αναμενόμενο όφελος/κίνδυνος αποβολής 2. Επεξηγούνται η αξιοπιστία/περιορισμοί της εργαστηριακής μεθόδου 3. Καθορίζεται ο προβλεπόμενος χρόνος μέχρι το αποτέλεσμα 4. Διευκρινίζεται ότι το φυσιολογικό αποτέλεσμα του εμβρύου δεν αποκλείει οποιαδήποτε άλλη γενετική διαταραχή ή συγγενή ανωμαλία ή νοητική υστέρηση Στο Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής Πανεπιστημίου Αθηνών ~35% των παραπομπών για προγεννητικό χρωμοσωμικό έλεγχο λόγω ηλικίας διαπιστώνεται κατά τη λήψη ιστορικού ότι έχουν επιπρόσθετους γενετικούς κινδύνους τους οποίους αγνοούν...

12 Νέες προσεγγίσεις στην προγεννητική διάγνωση Νέες τεχνολογίες για την ανάλυση του DNA Νέες πηγές εμβρυϊκού DNA Συνδυασμός Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής, Πανεπιστημίου Αθηνών

13 Νέες πηγές εμβρυϊκού DNA Κύτταρα εμβρύων από εξωσωματική γονιμοποίηση (IVF) Προεμφυτευτική γενετική διάγνωση (ΠΓΔ - PGD) Εμβρυϊκά κύτταρα ή Ελεύθερο εξωκυτταρικό εμβρυϊκό DNA στην κυκλοφορία τής εγκύου Μη η επεμβατική ΠΔ Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής, Πανεπιστημίου Αθηνών

14 Προεμφυτευτική Γενετική Διάγνωση (ΠΓΔ) Η πρώτη κλινική εφαρμογή ΠΓΔ έγινε στην Αγγλία το 1990 (Ομάδα του Handyside) Προσφέρει σε ζευγάρια φορέων γενετικών νοσημάτων τη δυνατότητα γενετικής διάγνωσης και μεταφοράς στη μήτρα μόνο των υγιών από τα έμβρυα που προέκυψαν από εξωσωματική γονιμοποίηση Πλεονέκτημα έναντι προγεννητικής διάγνωσης (ΠΔ): αποφυγή διακοπής εγκυμοσύνης Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής

15 Ενδείξεις για την εφαρμογή ΠΓΔ Κίνδυνος μεταβίβασης σοβαρού γενετικού νοσήματος Σε συνδυασμό με Υπογονιμότητα Ενδοιασμοί για διακοπή κύησης Ιστορικό πολλαπλών διακοπών κυήσεων μετά από προγεννητική διάγνωση Xρόνια ασθένεια της συζύγου (μεσογειακή αναιμία) Ηθικές- θρησκευτικές αναστολές Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής

16 Εξειδικευμένη μέθοδος Eξωσωματική γονιμοποίηση Εμβρυολογία Γενετική Διάγνωση Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής

17 Πηγές Γενετικού Υλικού στην ΠΓΔ 1 0 και 2 0 πολικό σωμάτιο Βλαστομερίδιο Κύτταρα από βλαστοκύστη 1 η ημέρα 3 η ημέρα 5 η ημέρα Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής

18 Βιοψία Πρώτου και εύτερου Πολικού Σωματίου Πλεονεκτήματα Βιοψία σε γαμετικά κύτταρα (ωάρια) αντί σε έμβρυα Τα πολικά σωμάτια θα απορρίπτονταν κατά την ανάπτυξη του εμβρύου Μειονεκτήματα υσκολία στην απομόνωση Μικρή ποσότητα γενετικού υλικού για διάγνωση Πολυπλοκότητα κατά τη γενετική διάγνωση (έμμεσος χαρακτηρισμός του γονοτύπου των ωαρίων και άγνωστος ο γονότυπος του πατρικού γαμετικού κυττάρου) Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής

19 Βλαστομερίδιο Μη διαφοροποιημένο εμβρυϊκό κύτταρο Ευκολία στην απομόνωση Xωρίς επίπτωση στο έμβρυο Μικρή ποσότητα γενετικού υλικού για διάγνωση1 ή 2 κύτταρα Προτιμώμενη πηγή εμβρυϊκού γενετικού υλικού από τα περισσότερα κέντρα ΠΓ

20 Βιοψία κυττάρων από βλαστοκύστη Πλεονέκτημα Επιτρέπει την βιοψία περισσότερων κυττάρων (μέχρι ~20) Μειονεκτήματα υσκολία στην απομόνωση Μόνο το 40% των εμβρύων φτάνουν στο στάδιο της βλαστοκύστης Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής

21 Εξειδικευμένη μέθοδος Εμβρυολόγος - Βιοψίες εμβρύων Εργαστηριακός Γενετιστής Γενετική Διάγνωση Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής

22 Η ΠΓΔ εφαρμόζεται σε Νοσήματα Μονογονιδιακά (Φυλοσύνδετα, Αυτοσωμικά υπολειπόμεναεπικρατητικά, Μιτοχονδριακά) Χρωμοσωμικά (Αριθμητικές-Δομικές ανωμαλίες) Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής

23 Εφαρμογή ΠΓΔ για Μονογονιδιακά Νοσήματα Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής

24 Γενετική διάγνωση σε ένα κύτταρο Καλύτερα εργαλεία Βιοτεχνολογία Τεχνολογία

25 Ηλεκτρονικές βάσεις γενετικών δεδομένων και λογισμικών μέσω διαδικτύου Genome Browsers Ensembl Genome browser NCBI UCSC

26 Η ΠΓΔ μπορεί μ να εφαρμοστεί για οποιοδήποτε μονογονιδιακό νόσημα ΠΡΟΫΠΟΘΕΣΗ Γνωστή η γενετική διαταραχή (μετάλλαξη) που ευθύνεται για το νόσημα στη συγκεκριμένη οικογένεια

27 Η ΠΓΔ έχει ήδη εφαρμοστεί σε >30 μονογονιδιακά νοσήματα Αυτοσωματι ατικά υπολειπόμενα Cystic fibrosis b-thalassemia Sickle-cell anemia Spinal muscular atrophy Gaucher s disease Rhizomelic chondrodysplasia punctata 21-OHase deficiency Tay-Sachs Φυλοσύνδετα Duchenne s muscular dystrophy Becker muscular dystrophy Fragile-X syndrome Hemophilia Adrenoleukodystrophy Glucose-6-phosphatase deficiency Lesch-Nyhan disease Αυτοσωματικά επικρατητικά Myotonic dystrophy (DM1) Charcot-Marie-Tooth 1A and 2A Achondroplasia Huntington s disease Alport syndrome Autosomal dominant Polycystic Kidney BRCA1 Retinoblastoma Spinocerebellar ataxia type 7 Stickler syndrome Tuberous sclerosis Neurofibromatosis type 1 FAP-Gardner Syndrome Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής

28 Όλα τα πρωτόκολλα για χαρακτηρισμό του γονότυπου βασίζονται στην PCR Denaturation 93 C - 95 C Annealing 37 C - 65 C Denaturation 93 C - 95 C CYCLES Extension 72 C Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής

29 Σχεδιασμός μεθόδου ΠΓΔ για μονογονιδιακό νόσημα Λαμβάνονται υπ όψιν 1-5 κύτταρα διαθέσιμα για τη γενετική διάγνωση Το υπεύθυνο γονίδιο και οι ιδιαιτερότητές του Το είδος και η θέση της/των μεταλλάξεων στο γονίδιο Η δυνατότητα εφαρμογής μιας και μόνο αντίδρασης PCR

30 Σχεδιασμός μεθόδου ΠΓΔ για μονογονιδιακό νόσημα Προβλήματα Αποτυχία πολλαπλασιασμού του DNA Αποτυχία πολλαπλασιασμού από το ένα αλληλόμορφο (Allele( drop out) Επιμόλυνση από ξένο DNA Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής

31 Μεθοδολογία ΠΓΔ για μονογονιδιακό νόσημα Πολλαπλό PCR (multiplex( PCR) Γονίδιο άμεση διάγνωση Βιοψία εμβρύου p q Πολυμορφικές θέσεις ανάλυση σύνδεσης-έμμεση διάγνωση (linkage analysis) Πολυμορφικές περιοχές (SNPs ή μικροδορυφορικές αλληλουχίες) Π Φ γονίδιο Π Φ Ποιες είναι οι χρήσιμες (πληροφοριακές); Μητέρα φορέας Πατέρας φορέας

32 Ανάλυση σύνδεσης (linkage analysis) των πολυμορφικών αλληλουχιών με το υπεύθυνο γονίδιο στην οικογένεια για τον εντοπισμό των πληροφοριακών θέσεων Π Φ γονίδιο Π Φ Πληροφοριακές Πολυμορφικές θέσεις Μητέρα φορέας Πατέρας φορέας Π Π Π Φ Φ Π Φ Φ Πληροφοριακές Πολυμορφικές θέσεις Έμβρυο πάσχον Έμβρυο φορέας Έμβρυο φορέας Έμβρυο φυσιολογικό

33 Άμεση διάγνωση της γενετικής διαταραχής και Ανάλυση σύνδεσης (έμμεση διάγνωση) linkage analysis Ο συνδυασμός επιτυγχάνει : Αύξηση της αξιοπιστίας και απόδοσης της ΠΓΔ Μείωση της πιθανότητας λανθασμένης διάγνωσης Έλεγχος επιμόλυνσης σε κάθε ένα έμβρυο ξεχωριστά Αύξηση του αριθμού των εμβρύων για εμφύτευση

34 Στρατηγική ανάπτυξης νέων πρωτοκόλλων ΠΓΔ για μονογονιδιακά νοσήματα 1. Θεωρητική προσέγγιση - Σχεδιασμός Εύρεση in silico του υπεύθυνου γονιδίου και των γονεϊκών μεταλλάξεων και εντοπισμός πολυμορφικών θέσεων που είναι σε σύνδεση (linked) με το γονίδιο Ανάλυση σύνδεσης (linkage analysis) των πολυμορφικών αλληλουχιών στην οικογένεια για τον εντοπισμό των πληροφοριακών πολυμορφισμών. Σχεδιασμός in silico της multiplex PCR μέσω λογισμικών

35 Εύρεση in silico του υπεύθυνου γονιδίου και των γονεϊκών μεταλλάξεων και εντοπισμός πολυμορφικών θέσεων που είναι σε σύνδεση (linked) με το γονίδιο

36 Σχεδιασμός in silico της multiplex PCR μέσω λογισμικών

37 H στρατηγική ανάπτυξης πρωτοκόλλων ΠΓΔ για μονογονιδιακά νοσήματα περιλαμβάνει 2. Εργαστηριακή Πράξη Βελτιστοποίηση της μεθόδου σε αραιωμένο γενομικό DNA των μελών της οικογένειας Εκτίμηση της αξιοπιστίας και της ευαισθησίας της μεθόδου σε DNA από μεμονωμένα λεμφοκύτταρα των υποψήφιων γονέων (σύμφωνα με τις προδιαγραφές του PGD Consortium της ESHRE (Thornhill et al. 2005) Κλινική εφαρμογή

38 Εμπειρία του Εργαστηρίου Ιατρικής Γενετικής στην ΠΓΔ Μονογονιδιακών νοσημάτων β-μεσογειακή Αναιμία (β-thal) και αιμοσφαιρινοπάθειες α-μεσογειακή Αναιμία (α-thal) Κυστική Ινωση Μυϊκή Δυστροφία Duchenne (DMD) Νωτιαία Μυϊκή Ατροφία (SMA) Συγγενής Λιποειδής Υπερπλασία των Επινεφριδίων (CLAH) Γλυκογονίαση τύπου ΙV (GSD-IV) Συγγενής Αμαύρωση Leber (LCA) Μυοτονική Δυστροφία τύπου 1 (DM1) Αυτοσωματική υπολειπόμενη πολυκυστική νόσος των νεφρών AR-PKD Σύνδρομο ευθραυστου Χ (Fragile X) Νευροινωμάτωση τύπου 1(NF1) Σύνδρομο Marfan Σκελετική Δυσπλασία HEM-Greenberg Σπαστική Παραπληγία 3Α HLA τυποποίηση για εύρεση ιστοσυμβατού αδελφού ως δότη Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής

39 ΠΓΔ για Χρωμοσωμικές διαταραχές Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής

40 ΠΓΔ για γνωστές χρωμοσωμικές ανωμαλίες στην οικογένεια (High risk PGD) Αμοιβαίες μεταθέσεις (reciprocal translocations) Μεταθέσεις ακροκεντρικών χρωμοσωμάτων 13, 14, 15, 21, 22 (Robertsonian translocations)

41 ΠΓΔ χρωμοσωμικών ανωμαλιών με Fluorescent In Situ Hybridization - FISH Έλεγχος χρωμοσωμάτων σε μεσοφασικούς πυρήνες εμβρυϊκών κυττάρων με DNA ανιχνευτές σημασμένους με φθοριοχρώματα FISH Φυσιολογικό Τρισωμία 22 Χρωμοσώματα

42 Προβλήματα της μεθόδου FISH Δυσκολίες μονιμοποίησης του πυρήνα στην αντικειμενοφόρο πλάκα Αποτυχία του υβριδισμού Μειωμένος φθορισμός - Διάχυση φθορισμού Αλληλεπικάλυψη του σήματος Έλεγχος έως 10 χρωμοσωμικών θέσεων

43 Έλεγχος Χρωμοσωμάτων με FISH Xρωμοσωμικοί ανιχνευτές εκατέρωθεν της θέσης θραύσης και για τα δυο χρωμοσώματα που εμπλέκονται στη μετάθεση Αμοιβαίες Μεταθέσεις (reciprocal translocations) Κοινοί ανιχνευτές που χρησιμοποιούνται για τα συγκεκριμένα χρωμοσώματα Μεταθέσεις ακροκεντρικών χρωμοσωμάτων (Robertsonian translocations) (13, 14, 15, 21, 22)

44 ΠΓΔ χρωμοσωμικών ανωμαλιών με Πολλαπλό PCR (multiplex PCR) Πολύ πρόσφατη εφαρμογή (Fiorentino et al 2010, Traversa Traversa et al 2010) πολλαπλασιασμός πληροφοριακών πολυμορφικών μικροδορυφορικών αλληλουχιών ταυτόχρονα με φθορίζον πολλαπλό PCR εκατέρωθεν της θέσης θραύσης και για τα δυο χρωμοσώματα που εμπλέκονται στη μετάθεση Αμοιβαίες Μεταθέσεις (reciprocal translocations) Κατά μήκος των χρωμοσωμάτων που μετατίθενται Μεταθέσεις ακροκεντρικών χρωμοσωμάτων (Robertsonian translocations) (13, 14, 15, 21, 22)

45 Αποδοτικότητα και Ασφάλεια στην ΠΓΔ Τεχνικά προβλήματα της μεθόδου PCR ή FISH Ποιότητα του κυττάρου που εξετάζεται Χρωμοσωμικός μωσαϊκισμός

46 Preimplantation Genetic Screening (PGS) Αύξηση της επιτυχίας της IVF με επιλογή ευπλοειδικών ωαρίων-εμβρύων (Low risk PGD)

47 Preimplantation Genetic Screening (PGS) Η PGS προτείνεται σε ζευγάρια με φυσιολογικό καρυότυπο με: α) πολλές παλίνδρομες κυήσεις β) περισσότερες από τρεις αποτυχημένες προσπάθειες IVF γ) προχωρημένη ηλικία της υποψήφιας μητέρας δ) όταν στην IVF χρησιμοποιείται βιοψία όρχεος

48 Preimplantation Genetic Screening (PGS) Μεθοδολογία FISH (μέθοδος ρουτίνας) Έλεγχος των πιο συχνών ανευπλοειδιών που συναντώνται στις αυτόματες αποβολές και σε παθολογικά έμβρυα (χρωμοσώματα Χ, Υ, 13, 15, 16, 18, 21, και 22) Συγκριτικός Γενομικός Υβριδισμός σε ένα κύτταρο Comparative Genomic Hybridization (CGH) (αναπτυσσόμενη μεθοδολογία) Έλεγχος όλων των χρωμοσωμάτων Έχει συνδυαστεί με κατάψυξη εμβρύων (4 ημέρες διάρκεια)

49 Συγκριτικός Γενομικός Υβριδισμός σε ένα κύτταρο Comparative Genomic Hybridization (CGH) Έλεγχος, ταυτόχρονα, όλων των χρωμοσωμάτων παλαιότερα Νέα τεχνολογία Wilton, 2005 Υβριδισμός στα χρωμοσώματα μεταφασικού πυρήνα μονιμοποιημένων σε αντικειμενοφόρο πλάκα Υβριδισμός σε μκροσυστοιχίες

50 Συγκριτικός Γενομικός Υβριδισμός - CGH σε μικροσυστοιχίες: Πολλές παραλλαγές Α) ολιγονουκλεοτιδίων (array-cgh) Β) βακτηριδιακών συνθετικών χρωμοσωμάτων BAC-arrays Γ) βιβλιοθηκών DNA συμπληρωματικών στα χρωμοσώματα (Chromosome libraries). Δ) Ολιγονουκλεοτιδίων για σημειακές αλλαγές κατά μήκος ολόκληρου του γονιδιώματος (SNP-microarrays)

51 Συγκριτικός γενομικός υβριδισμός Comparative Genomic Hybridization (CGH) σε: 1. Γαμετικά κύτταρα (Πολικά σωμάτια-έλεγχος ωαρίων, σπερματοζωάρια) 2. Μεμονωμένα κύτταρα από έμβρυα σε στάδιο πριν την εμφύτευση Διαπιστώθηκε Υψηλή συχνότητα ανευπλοειδιών: >50% των ωαρίων (κυρίως γυναικών > 40 ετών) >60% των εμβρύων στα πρώτα στάδια ανάπτυξης Μόνο το 25% των εμβρύων στο στάδιο της αυλάκωσης αποτελούνται από αμιγώς ευπλοειδικά κύτταρα Ανευπλοειδίες σε όλα τα χρωμοσώματα (οι πιο συχνές είναι διαφορετικές από αυτές που στοχεύονταν στην PGS με FISH)

52 Preimplantation Genetic Screening (PGS) FISH Δεν αυξάνει την επιτυχία της IVF Λόγοι Έλεγχος έως 10 χρωμοσωμάτων Στόχευση των χρωμοσωμάτων Χ, Υ, 13, 15, 16, 18, 21, 22 Ανευπλοειδίες που συναντώνται σε γαμετικά κύτταρα και έμβρυα σε προεμφυτευτικό στάδιο

53 Εφαρμογή των CGH SNP-microarrays σε μεμονωμένα λεμφοκύτταρα για γενετική διάγνωση Κυστικής Ίνωσης μέσω ανάλυσης σύνδεσης (linkage analysis) Ο Handyside και συν. το 2009 Φαίνεται ότι η μέθοδος μπορεί να εφαρμοστεί στη γενετική διάγνωση οποιουδήποτε μονογονιδιακού νοσήματος σε ένα κύτταρο ενώ παράλληλα ελέγχει για ανευπλοειδίες όλα τα χρωμοσώματα

54 CGH υπόσχεται κυτταρογενετικό έλεγχο υψηλής ανάλυσης σε ένα κύτταρο Τα πρώτα δεδομένα είναι πολύ ενθαρρυντικά Δεν έχει γίνει ακόμα κλινική εφαρμογή Απαιτούνται δοκιμές και βελτιώσεις Ελκυστικός ερευνητικός στόχος Πλεονεκτήματα Έλεγχος όλων των χρωμοσωμάτων για ανευπλοειδίες και οποιαδήποτε γενετική διαταραχή παράλληλα Μειονεκτήματα Το αυξημένο κόστος/κύτταρο

55 Παρ όλα αυτά η ΠΓΔ - PGS δεν πρόκειται να υπερπηδήσει ποτέ τα προβλήματα: Α) του μωσαϊκισμού Β) της φυσικής διόρθωσης ανευπλοειδιών (chromosome rescue)

56 Ηθικοί προβληματισμοί στην εφαρμογή ΠΓΔ Α.. Επιλογή συμβατού αδελφού δότη (HLA typing) για μεταμόσχευση σε προϋπάρχον παιδί στην οικογένεια με ανίατη ασθένεια (Λευχαιμίες, Αναιμία Fanconi, Μεσογειακή Αναιμία) Παραγγελία ιστοσυμβατού παιδιού για να σωθεί κάποιο άλλο. Δίλλημα Είναι το ίδιο το παιδί επιθυμητό;? Ποια η ψυχολογική επίπτωση Αντίλογος Ήρθε στον κόσμο με σημαντική αποστολή Ιδιαίτερα ξεχωριστό αλλά και επιθυμητό αποδεκτό και αγαπητό από την οικογένεια

57 Επιλογή συμβατού αδελφού δότη με ΠΓΔ Ο Οργανισμός Εμβρυολογίας & Ανθρώπινης Γονιμοποίησης στην Αγγλία (ΗFEA -Human Fertilization and Embryology Authority, Δεν αποδέχεται την ΠΓΔ για επιλογή ιστοσυμβατού αδελφού δότη όταν αυτό δεν κινδυνεύει να νοσήσει (δεν υπάρχει κληρονομικότητα π.χ. λευχαιμία ή λέμφωμα) Ηθέση αυτή δεν υιοθετείται από άλλες χώρες όπως και την Ελλάδα όπου εφαρμόζεται ΠΓΔ ακόμη και με μόνη ένδειξη την HLA ιστοσυμβατότητα.

58 Επιλογή συμβατού αδελφού δότη με ΠΓΔ Πιθανότητες εύρεσης συμβατού αδελφού δότη ΠΓΔ για ιστοσυμβατότητα ΠΓΔ για ιστοσυμβατότητα σε συνδυασμό με υπολειπόμενο μονογονιδιακό νόσημα ΠΓΔ για ιστοσυμβατότητα σε συνδυασμό με φυλοσύνδετο νόσημα 25% 18.8% 12.5% Επίτευξη εγκυμοσύνης 30% Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής

59 Ηθικοί προβληματισμοί στην εφαρμογή ΠΓΔ Β.. ΠΓΔ για κληρονομικούς καρκίνους Ενδείκνυται Στους διαπιστωμένα κληρονομούμενους καρκίνους όπως του μαστού, του παχέος εντέρου του συνδρόμου Li- Fraumeni κ.α. Προϋποθέσεις για την εφαρμογή Να υπάρχει οικογενειακό ιστορικό με μέλη της οικογένειας που έχουν νοσήσει για δυο - τρεις γενιές σε νεαρή ηλικία Να είναι χαρακτηρισμένη η γενετική διαταραχή που ευθύνεται για την εμφάνιση της νόσου στην οικογένεια. (BRCA 1, BRCA2, Li-Fraumeni Fraumeni,, neurofibromatosis) Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής

60 Ηθικοί προβληματισμοί στην εφαρμογή ΠΓΔ Γ.. ΠΓΔ για νοσήματα όψιμης εμφάνισης Οι υποψήφιοι γονείς ζητούν ΠΓΔ όταν στον ένα έχει ήδη εκδηλωθεί η νόσος και αντιμετωπίζει μικρό προσδόκιμο επιβίωσης. Είναι ηθικό το παιδί που θα γεννηθεί να χάσει σύντομα το γονιό του που πάσχει. Είναι σίγουρο πως δεν θα έχει βρεθεί η θεραπεία σε χρόνια όταν αναμένεται να εκδηλωθεί το νόσημα στο παιδί; Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής

61 Ηθικοί προβληματισμοί στην εφαρμογή ΠΓΔ Δ.. ΠΓΔ για επιλογή φύλου κοινωνικοί λόγοι (social sexing) Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής

62 Στην Ελλάδα απαγορεύεται η επιλογή φύλου Ν.3305/2005 για την εφαρμογή της ιατρικώς υποβοηθούμενης αναπαραγωγής. Άρθρο 2 παρ3. «Επιτρέπεται η έρευνα στα ανθρώπινα γονιμοποιημένα ωάρια υπό ειδικές προϋποθέσεις που ορίζονται στα άρθρα 11 και 12. Απαγορεύονται η κλωνοποίηση για αναπαραγωγικούς σκοπούς, η δημιουργία χιμαιρών και υβριδίων και η επιλογή φύλου, εκτός αν πρόκειται να αποφευχθεί σοβαρή κληρονομική νόσος που συνδέεται με το φύλο.»

63 Κλινική εφαρμογή ΠΓΔ ESHRE Στοιχεία από 102 κέντρα έως το 2008 ΕΙΓ Κύκλοι Χρωμοσωμικά νοσήματα Μονογονιδιακά νοσήματα Επιλογή φύλου για: Φυλοσύνδετο νόσημα 1243 κοινωνικούς λόγους (2,4%) 0 PGS (66%) 0 Εγκυμοσύνες (ολοκληρωμένες) Φυσιολογικά νεογνά Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής

64 Έκβαση των κύκλων ΠΓΔ συνολικά ESHRE PGD Consortium data collection IX 25% των κύκλων διακόπτονται λόγω φτωχής ορμονικής απόκρισης ή κακής ποιότητας εμβρύων 28% των εμβρύων που μεταφέρονται εμφυτεύονται 21% των κύκλων που ολοκληρώνονται οδηγούν σε εγκυμοσύνη 25% των κυήσεων οδηγούνται σε αυτόματη αποβολή 1 ου και 2 ου τριμήνου Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής

65 Γενικά η επιτυχία της εξωσωματικής γονιμοποίησης (γέννηση υγιούς παιδιού) εξαρτάται από ιδιοσυστασιακούς παράγοντες για κάθε ζευγάρι και δεν ξεπερνά το 25-30% των κύκλων που ξεκινούν 32% των ζευγαριών που ξεκινούν έναν τουλάχιστο κύκλο ΠΓΔ αποκτούν υγιές παιδί Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής

66 Η ΠΓΔ είναι διαδικασία: πολύπλοκη / πολυσταδιακή με τεχνικούς περιορισμούς έχει υψηλό κόστος η η επιτυχία της εξαρτάται από την ανταπόκριση του κάθε ζευγαριού στα στάδια της IVF Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής

67 Κατά την κλινική εφαρμογή της ΠΓΔ αναδεικνύονται ηθικοί προβληματισμοί που αφορούν τόσο το είδος της ΠΓΔ όσο και το κοινό που πραγματικά την έχει ανάγκη Μεγάλη σημασία θα πρέπει να δίνεται στην αποφυγή υπερβολών στην χρήση μιας τόσο ευαίσθητης, ακριβής αλλά και χρήσιμης Ιατρικής Πράξης Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής

68 Ευχαριστώ πολύ

69 ζευγάρια ενημερώθηκαν (256 ζευγάρια) 452 κύκλοι* Βιοψίες Διαγνώστηκαν (93%) 385 (70%) κύκλοι κατέληξαν σε εμβρυομεταφορά 136 φυσιολογικά νεογνά Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής *Κύκλος: Εξωσωματική Γονιμοποίηση IVF - σε συνδυασμό με ΠΓΔ

70 Σφάλματα στο ΕΙΓ 1 Πιθανή Eπιμόλυνση ή Η λάθος στη σειρά των εμβρύων Διακοπή κύησης (μετά ΠΔ) 2 Το κύτταρο που αναλύθηκε δεν αντιπροσώπευε το γενετικό υλικό του εμβρύου που τελικά αναπτύχθηκε (Συχνή η ύπαρξη ανευπλοειδιών, χαοτικά έμβρυα, μηχανισμοί επιδιόρθωσης χρωμοσωμικών ανωμαλιών) Διακοπή κύησης (μετά ΠΔ) Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής

71 Σφάλματα ESHRE: Wilton et al 2009 (δεδομένα από το κύκλοι) Αιτίες Α) ) Ανθρώπινο σφάλμα στην αρίθμηση κατά τη γενετική διάγνωση ή την εμβρυομεταφορά στην επιλογή των εκκινητών στην PCR ή των ανιχνευτών στην FISH Αξιολόγηση των αποτελεσμάτων Β) Τακτική-Μεθοδολογία επιμόλυνση πατρική, μητρική ή από ξένο DNA ADO PCR 12 / 2538 FISH 12 / / (0.16%) Αντιμετώπιση Εκπαίδευση Εφαρμογή γραπτών οδηγιών Δυο άτομα σε όλα τα στάδια (ο ένας παρατηρητής) Αξιολόγηση των αποτελεσμάτων από 2 εργαστηριακούς Απομόνωση των μητρικών κυττάρων που περιβάλλουν το ωάριο εφαρμογή αυστηρών κανόνων για την επιμόλυνση Χρήση 3 τουλάχιστο πολυμορφικών θέσεων σε σύνδεση με το γονίδιο Διπλή βιοψία / έμβρυο Γ) Φύση Ε) Χρωμοσωμικός μωσαϊκισμός Χρήση 3 τουλάχιστο πολυμορφικών θέσεων σε σύνδεση με το γονίδιο Διπλή βιοψία / έμβρυο

72 CGH ανάλυση σε 400 εμβρυϊκά κύτταρα από 200 ανθρώπινα έμβρυα (Wilton Wilton L. ESHRE Campus 2010 London UK) FISH 13, 14, 15, 16, 21, 22, X/Y Ανευπλοειδίες που διέφυγαν 63 % Κύτταρα με λανθασμένη διάγνωση 40 %