ΣΥΜΒΟΛΗ ΣΤΗΝ ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΚΑΡΚΙΝΙΚΟΥ ΠΗΚΤΙΚΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ ΣΤΗΝ ΟΞΕΙΑ ΛΕΥΧΑΙΜΙΑ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ ΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΧΡ. ΖΑΜΠΟΥΛΗΣ Πανεπ. Έτος: αριθµ ΣΥΜΒΟΛΗ ΣΤΗΝ ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΚΑΡΚΙΝΙΚΟΥ ΠΗΚΤΙΚΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ ΣΤΗΝ ΟΞΕΙΑ ΛΕΥΧΑΙΜΙΑ ΓΕΩΡΓΙΑΣ Ν. ΠΑΠΑΙΩΑΝΝΟΥ ΑΙΜΑΤΟΛΟΓΟΥ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΟ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2005

2

3 Η ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΚΛΩΝΙΖΑΚΗΣ ΙΩΑΝΝΗΣ ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΓΑΡΥΠΙ ΟΥ ΒΑΣΙΛΕΙΑ ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΧΑΡΑΛΑΜΠΙ ΟΥ-ΒΡΑΝΙΤΣΑ ΣΤΥΛΙΑΝΗ ΕΠΙΚ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Η ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΚΛΩΝΙΖΑΚΗΣ ΙΩΑΝΝΗΣ ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΓΑΡΥΠΙ ΟΥ ΒΑΣΙΛΕΙΑ ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΧΑΡΑΛΑΜΠΙ ΟΥ-ΒΡΑΝΙΤΣΑ ΣΤΥΛΙΑΝΗ ΕΠΙΚ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΖΑΜΠΟΥΛΗΣ ΧΡΥΣΑΝΘΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΚΑΡΑΜΗΤΣΟΣ ΗΜΗΤΡΙΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΓΙΑΝΝΟΥΛΗΣ ΕΛΕΥΘΕΡΙΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΠΑΠΑ ΟΠΟΥΛΟΣ ΑΘΑΝΑΣΙΟΣ ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ «Η έγκρισις της ιδακτορικής ιατριβής υπό της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης δεν υποδηλοί αποδοχήν των γνωµών του συγγραφέως» (Νόµος 5343/32, άρθρ. 202 παρ. 2 και ν. 1268/82, άρθρ. 50 παρ. 8). 3

4

5 Αφιερωµένο Στην κόρη µου Στον άνδρα µου Στους γονείς µου

6

7 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ. 9 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Α. ΟΞΕΙΑ ΛΕΥΧΑΙΜΙΑ. 15 Κατάταξη και διαφοροποίηση των οξειών λευχαιµιών.. 15 Οξεία λεµφοβλαστική λευχαιµία. 16 Οξεία µυελοβλαστική λευχαιµία. 18 Β. ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΑΙΜΟΣΤΑΣΗΣ.. 25 Αγγειοσύσπαση.. 26 ηµιουργία του αιµοπεταλιακού θρόµβου. 27 Η δηµιουργία της ινικής και η πήξη του αίµατος 28 Εξωγενής οδός. 29 Ενδογενής οδός 30 Το ινωδολυτικό σύστηµα 35 Γ. ΙΑΤΑΡΑΧΕΣ ΑΙΜΟΣΤΑΣΗΣ ΣΤΗΝ ΟΞΕΙΑ ΛΕΥΧΑΙΜΙΑ. 39. Ο ΚΑΡΚΙΝΙΚΟΣ ΠΗΚΤΙΚΟΣ ΠΑΡΑΓΩΝ Η ανακάλυψη του καρκινικού πηκτικού παράγοντα (CP) EC3,4,22, Ο καρκινικός πηκτικός παράγων σε ανθρώπινους και νεοπλασµατικούς ιστούς Χηµικές και ενζυµατικές ιδιότητες του καρκινικού πηκτικού παράγοντα Ο καρκινικός πηκτικός παράγων ως καρκινικός δείκτης Ο κυτταρικός ρόλος του καρκινικού παράγοντα στον καρκίνο Η συµβολή του ιστικού παράγοντα (TF) και του καρκινικού πηκτικού παράγοντα, στην ενεργοποίηση του πηκτικού µηχανισµού από τους νεοπλασµατικούς ιστούς Η δράση του all-trans-ρετινοϊκού οξέως (ATRA) στον καρκινικό πηκτικό παράγοντα και στον ιστικό παράγοντα Η ράση του All-trans-ρετινοϊκού οξέος (ATRA) στα ενδοθήλια. 59 7

8 ΕΙ ΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΣΚΟΠΟΣ. 63 ΥΛΙΚΟ 65 είγµατα ασθενών µε ΟΜΛ 65 Ασθενείς που πήραν µέρος στην µελέτη. 65 Συλλογή βλαστικών κυττάρων. 66 είγµατα ασθενών µε ΟΛΛ. 67 Ασθενείς που πήραν µέρος στην µελέτη.. 67 Συλλογή βλαστικών κυττάρων. 68 ΜΕΘΟ ΟΙ.. 69 οκιµασία µε εκχύλισµα κυττάρων σε veronal buffer 69 Μελέτες αναστολής.. 71 Με Concanavalin A Με χλωριούχο υδράργυρο (HgCl 2 ) Με ιωδοακεταµίδη ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΕΙΓΜΑΤΩΝ ΑΣΘΕΝΩΝ ΜΕ ΟΜΛ είγµατα ασθενών πριν την έναρξη της χηµειοθεραπείας 73 είγµατα ασθενών σε πλήρη ύφεση. 80 είγµατα ασθενών σε µερική ύφεση 82 είγµατα ασθενών σε υποτροπή.. 83 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΕΙΓΜΑΤΩΝ ΑΣΘΕΝΩΝ ΜΕ ΟΛΛ.. 85 είγµατα ασθενών πριν την έναρξη της χηµειοθεραπείας 85 είγµατα ασθενών σε πλήρη ύφεση. 91 είγµατα ασθενών σε µερική ύφεση 92 είγµατα ασθενών σε υποτροπή.. 94 ΣΥΖΗΤΗΣΗ 95 ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΚΑΙ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ SUMMARY AND CONCLUSIONS. 103 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 105 8

9 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η αιµορραγία είναι η πιο συχνή διαταραχή του αιµοστατικού µηχανισµού στην οξεία λευχαιµία. Εκτός της θροµβοπενίας που είναι η κύρια αιτία και άλλοι παράγοντες µπορούν να προκαλέσουν αιµορραγικές εκδηλώσεις, όπως η διάχυτη ενδαγγειακή πήξη (DIC). Η DIC, πιο συχνά συνοδεύει την οξεία προµυελοκυτταρική λευχαιµία, αλλά η ενεργοποίηση του πηκτικού µηχανισµού σε µικρότερη έκταση έχει παρατηρηθεί σε όλα τα είδη της οξείας λευχαιµίας. Η ενεργοποίηση της πήξης από το λευχαιµικό κύτταρο φαίνεται ότι παίζει σηµαντικό ρόλο στην πρόκληση διαταραχών της αιµόστασης, οι οποίες στην συνέχεια προκαλούν θροµβωτικές επιπλοκές. Μέχρι σήµερα έχουν ταυτοποιηθεί τρεις ενεργοποιητές της πήξης που προέρχονται από το λευχαιµικό κύτταρο 200 : 8. Ο ιστικός παράγων (TF), µια γλυκοπρωτείνη η οποία συνδέεται µε τον παράγοντα VII και ενεργοποιεί τους παράγοντες Χ και ΙΧ. Έχει αποµονωθεί τόσο από φυσιολογικούς όσο και από καρκινικούς ιστούς. 9. Ένας υποδοχέας για τον παράγοντα V στην επιφάνεια του λευχαιµικού κυττάρου, ο οποίος διευκολύνει την σύνδεση του συµπλέγµατος της προθροµβίνης, αυξάνοντας την αποδοτικότητά του κατά φορές, και 10. Ο καρκινικός πηκτικός παράγων, µια κυστεινική πρωτεάση, η οποία ενεργοποιεί άµεσα τον παράγοντα X, χωρίς την παρουσία του παράγοντα VII. Έχει περιγραφεί µόνο σε κακοήθεις ιστούς και ποτέ στους ανάλογους φυσιολογικούς. Οι µέχρι σήµερα µελέτες έδειξαν µια σχετική ανοµοιογένεια στην έκφραση του παράγοντα στις διάφορες µορφές οξείας λευχαιµίας. Έτσι ως συχνότερη αναφέρεται η εµφάνιση του παράγοντα στην οξεία µυελογενή λευχαιµία και αυτό συνδέεται ενδεχοµένως µε την συχνότερη 9

10 ανάπτυξη θροµβοεµβολικών επεισοδίων στη µορφή αυτή. Οπωσδήποτε τα ευρήµατα αυτά µπορούν να χαρακτηριστούν ως πρόδροµα, και παραµένει ευρύ πεδίο για περαιτέρω έρευνα. Πέραν αυτών όµως διαπιστώθηκε ότι ο παράγων αυτός εξαφανίζεται στην ύφεση της νόσου και επανεµφανίζεται πολύ πριν από την κλινική εκδήλωση της υποτροπής. Θα µπορούσε λοιπόν να θεωρηθεί ως πρώιµος δείκτης της υποτροπής, µε προφανές πρακτικό ενδιαφέρον. Όµως και εδώ, τα σχετικά δεδοµένα- χρόνος και συχνότητα εµφάνισης σε σχέση µε τις µορφές λευχαιµίας- είναι πολύ περιορισµένα. Ο καρκινικός πηκτικός παράγοντας, ανιχνεύεται σε πολλά άλλα νεοπλασµατικά νοσήµατα, και θεωρείται από βιβλιογραφικά δεδοµένα ως ένας νέος καρκινικός δείκτης. Η µέχρι τώρα µέθοδος ανίχνευσής του, που περιλαµβάνει αποµόνωση καρκινικών κυττάρων και επεξεργασία τους µε διεγέρτες και ανασταλτές, δεν επέτρεψε την ευρεία χρήση, αυτού του τόσο σηµαντικού παράγοντα στην πρώιµη διάγνωση του καρκίνου. Στην χώρα µας, µέχρι σήµερα, δεν έχει δηµοσιευθεί ή ανακοινωθεί καµιά αντίστοιχη µελέτη που να ερευνά την ανίχνευση του καρκινικού πηκτικού παράγοντα στην οξεία λευχαιµία Ελλήνων ασθενών, αλλά ούτε σε άλλη νεοπλασµατική νόσο. Η µελέτη αποτελείται από δύο µέρη: Το γενικό µέρος, στο ποίο περιγράφονται αναλυτικά οι µέχρι τώρα γνωστές διαταραχές της αιµόστασης στην οξεία λευχαιµία και τα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά του καρκινικού πηκτικού παράγοντα στην οξεία λευχαιµία και σε άλλους νεοπλασµατικούς ιστούς. Το ειδικό µέρος, που περιλαµβάνει το σκοπό της µελέτης, το υλικό, τις µεθόδους που χρησιµοποιήθηκαν και τα αποτελέσµατα. Ακολουθεί η συζήτηση. Τέλος παρατίθενται οι διεθνείς βιβλιογραφικές αναφορές και τα κυριότερα συµπεράσµατα. Το εργαστηριακό µέρος διενεργήθηκε στο Αιµατολογικό Εργαστήριο της Β Προπαιδευτικής Κλινικής του Α.Π.Θ. του Νοσοκοµείου «ΙΠΠΟΚΡΑΤΕΙΟ» Θεσσαλονίκης. 10

11 Στη συνέχεια θα ήθελα να αναφερθώ, µε ευγνωµοσύνη, σεβασµό και αγάπη, σε όλους αυτούς που µε βοήθησαν, µε ενέπνευσαν και µε στήριξαν στην ολοκλήρωση της µελέτης µου. Κατ αρχήν, θα ήθελα να ευχαριστήσω από βάθους καρδιάς, τον εµπνευστή αυτής της µελέτης, Καθηγητή κ. Ζαχαρία Σινάκο. Οφείλω να οµολογήσω ότι είναι ο άνθρωπος που σε πολλές στιγµές µε στήριξε, µε ενέπνευσε, µε παρότρυνε να συνεχίσω αυτό το έργο, το τόσο πολύπλοκο και δύσκολο. Είναι ο Καθηγητής που µέσα από αυτή την µελέτη µε ώθησε να ασχοληθώ ιδιαίτερα µε τον τοµέα της αιµόστασης, να τον κατανοήσω και να του αφιερώσω το µεγαλύτερο ενδιαφέρον µου. Τον ευχαριστώ. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω τον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Ιωάννη Κλωνιζάκη που δέχτηκε να αναλάβει ως επιβλέπων την διατριβή µου, αντικαθιστώντας τον κ Σινάκο. Με τον απλό και τόσο ανθρώπινο τρόπο του µε παρότρυνε να την ολοκληρώσω. Ευχαριστώ επίσης την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια κ. Βασιλεία Γαρυπίδου, όχι µόνο για την ουσιαστική βοήθεια που µου πρόσφερε στην πορεία της µελέτης, αλλά και για την συνεργασία που µας ενώνει από τα χρόνια της παραµονής µου στην Β Προπ Παθ. Κλινική. Ευχαριστώ επίσης την Επίκουρη Καθηγήτρια κ. Χαραλαµπίδου- Βρανίτσα Στυλιανή, που δέχτηκε να αναλάβει την µελέτη, αντικαθιστώντας τον κ. Χριστάκη. Ευχαριστώ επίσης όλα τα µέλη της επταµελούς επιτροπής, καθηγητές κ. Χρύσανθο Ζαµπούλη, ηµήτριο Καραµήτσο, Ελευθέριο Γιαννούλη, και Αθανάσιο Παπαδόπουλο για την πολύπλευρη στήριξη που µου προσέφεραν. Αισθάνοµαι ιδιαίτερη υποχρέωση να ευχαριστήσω τον Καθηγητή κ. Μενέλαο Παπαδηµητρίου, από την κλινική του οποίου προήλθε η ανάθεση, όχι µόνο για την οικονοµική και εργαστηριακή υποστήριξη της µελέτης, αλλά και για την αµέριστη ηθική συµπαράσταση που µου έδειξε όλα αυτά τα χρόνια που ήµουν κοντά του. 11

12 Τέλος θα ήθελα να ευχαριστήσω τον ιευθυντή της Αιµατολογικής Κλινικής και Κέντρου Μεταµόσχευσης του Νοσοκ. «Παπανικολάου», κ. Αθανάσιο Φάσσα, για την παροχή µέρους του υλικού για την µελέτη, αλλά και για την εµπιστοσύνη και συµπαράσταση που µου δείχνει όλα αυτά τα χρόνια. Πιστεύω ότι ως δάσκαλός µου, µε έκανε να αγαπήσω την Αιµατολογία από τα πρώτα µου βήµατα, να εργάζοµαι σκληρά για να ολοκληρώνω τους στόχους µου και να έχω πάντα υψηλά πρότυπα. Ειλικρινά νιώθω τυχερή που τον γνώρισα. Πολλά οφείλω στον καθηγητή κ Barbui Tiziano και την καθηγήτρια και φίλη κ. Anna Falanga, που µου δίδαξαν την µέθοδο για την ανίχνευση του CP, κατά την διάρκεια της µετεκπαίδευσής µου στην Αιµατολογική Κλινική και Εργαστήριο, του Bergamo της Ιταλίας. Στον διευθυντή του τοµέα Παθολογίας καθηγητή κ. Παρχαρίδη οφείλω θερµότατες ευχαριστίες για την αµέριστη βοήθειά του. Στην γραµµατέα του τοµέα Παθολογίας κ. Ευρυδίκη Καλούδη, οφείλω ένα µεγάλο ευχαριστώ για την πολύτιµη βοήθειά της σε όλες τις διαδικασίες παρουσίασης αυτής της µελέτης. 12

13 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

14

15 A. ΟΞΕΙΑ ΛΕΥΧΑΙΜΙΑ ΚΑΤΑΤΑΞΗ ΚΑΙ ΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΟΞΕΙΩΝ ΛΕΥΧΑΙΜΙΩΝ Εισαγωγή Η οξεία λευχαιµία είναι µια ετερογενής οµάδα νεοπλασιών 13,14, που προσβάλει µη προσανατολισµένα ή µερικώς προσανατολισµένα αρχέγονα αιµοποιητικά κύτταρα. Οι οµάδες διαφέρουν µεταξύ τους ως προς το κύτταρο προέλευσης, τις κλινικές εκδηλώσεις, της πορεία και την απάντηση στη θεραπεία. Πριν από την ανακάλυψη αποτελεσµατικής θεραπευτικής αγωγής, η διαφοροποίηση των οξειών λευχαιµιών δεν ήταν απαραίτητη. Η ανακάλυψη όµως όλο και πιο αποτελεσµατικών φαρµάκων, επέβαλε τον διαχωρισµό σε υποοµάδες της οξείας λευχαιµίας. Αρχικά δόθηκε έµφαση στη διαφοροποίηση της οξείας λεµφοκυτταρικής λευχαιµίας από τις άλλες µορφές, διότι η θεραπεία για αυτή τη µορφή, ήταν τελείως ανεπαρκής, σε σχέση µε τις άλλες µη λεµφοκυτταρικές λευχαιµίες 1. Στη συνέχεια, έγινε δυνατός ο καθορισµός των σταδίων διαφοροποίησης της λεµφικής αλλά και της µυελικής σειράς και αντίστοιχα χαρακτηρίστηκαν οι λευχαιµίες που αντιστοιχούν σ αυτά τα στάδια, λαµβάνοντας υπ όψη τα βιολογικά χαρακτηριστικά και τις ανάγκες για θεραπεία. Σήµερα η χορήγηση κατάλληλης θεραπευτικής αγωγής στηρίζεται στον χαρακτηρισµό του φαινοτύπου των λευχαιµικών κυττάρων, που περιλαµβάνει εκτός από την µορφολογική κατάταξη, κυτταροχηµικές, ανοσολογικές 111,138, ανοσοιστοχηµικές, κυτταρογενετικές 160,161,167,168 και µοριακές παραµέτρους. Κατάταξη κατά French- American British (FAB) Το 1976, αναπτύχθηκε ένα σύστηµα κατάταξης για τις οξείες λευχαιµίες 13,14,15 και τα Μυελοδυσπλαστικά σύνδροµα, από µία διεθνή οµάδα ερευνητών. Αυτό το σύστηµα είναι γνωστό σαν κατάταξη κατά FAB, και βασίζεται στα µορφολογικά χαρακτηριστικά των βλαστών στον µυελό και στο περιφερικό αίµα, σε δείγµατα επί πλακός που έχουν 15

16 χρωστεί κατά Romanovsky, ή µε κυτταροχηµικές χρώσεις. Το 1981 και το 1985 έγιναν τροποποιήσεις προκειµένου να διερευνηθούν οι λεµφοκυτταρικές λευχαιµίες και να εισαχθεί στο σύστηµα η οξεία µεγακαρυοκυτταρική λευχαιµία. Το 1987, εισήχθηκε στο σύστηµα µια µορφή µυελογενούς λευχαιµίας που δεν έχει τα χαρακτηριστικά µυελογενούς διαφοροποίησης. Η κατάταξη κατά FAB υιοθετήθηκε σχεδόν από όλους, έτσι ώστε να επιτρέπει σήµερα, την σύγκριση των θεραπευτικών πρωτοκόλλων και τις βιολογικές διαφορές µεταξύ των διαφόρων υποτύπων 26. I. ΟΞΕΙΑ ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΛΕΥΧΑΙΜΙΑ. Η οξεία λεµφοκυτταρική λευχαιµία χωρίζεται σε τρεις υποοµάδες 15, µε βάση το µέγεθος του κυττάρου, το σχήµα του πυρήνα, τον αριθµό και την εµφάνιση των πυρηνίων, και την ύπαρξη κυτταροπλάσµατος. L1 Οι λεµφοβλάστες είναι µικρά κύτταρα µε υψηλή σχέση πυρήνακυτταροπλάσµατος, πυρήνες µε ή χωρίς εντοµή, και ένα ελάχιστα ή καθόλου διακριτό πυρήνιο. L2 Οι λεµφοβλάστες είναι µεγάλοι, µε ακανόνιστες πυρηνικές µεµβράνες, µε ένα ή περισσότερα εµφανή πυρήνια και άφθονο πρωτόπλασµα. L3 Οι λεµφοβλάστες είναι µορφολογικά ίδιοι µε τα κύτταρα που περιγράφονται στο λέµφωµα Burkitt. Πρόκειται για µεγάλα κύτταρα, µε στρογγυλούς ή ωοειδείς πυρήνες, µε εµφανή πυρήνια και βασεόφιλο κυτταρόπλασµα. Υπάρχουν πολλά κυτταροπλασµατικά κενοτόπια. Με αυτή την κατάταξη έχουµε την δυνατότητα να κάνουµε πρόγνωση, να καθορίσουµε την διάρκεια της ύφεσης και της επιβίωσης. Οι ασθενείς µε λευχαιµία τύπου L1, έχουν καλύτερη πρόγνωση από τους ασθενείς µε τύπο L2. Για τους ασθενείς µε τύπο L3, η επίτευξη ύφεσης είναι δύσκολη, αλλά και αν επιτευχθεί είναι µικρής διάρκειας. Χρειάζεται όµως προσοχή στην εκτίµηση των αποτελεσµάτων στην κατάταξη κατά FAB. Πρώτον γιατί οι L2 λεµφοβλάστες οµοιάζουν πολύ µε τους ΜO και Μ1 αδιαφοροποίητους µυελοβλάστες και σ αυτή την 16

17 περίπτωση χρειάζονται ταυτοποίηση µε κυτταροχηµικές και ανοσολογικές µεθόδους. Ένα δεύτερο πρόβληµα δηµιουργείται από το γεγονός ότι 10% των ασθενών µε οξεία λεµφοβλαστική λευχαιµία, έχουν έναν µορφολογικά ετερογενή πληθυσµό βλαστών, µερικοί των οποίων είναι L1 και άλλοι L2. Χρησιµοποιώντας τον κυρίαρχο πληθυσµό στην κατάταξη, δεν επιτυγχάνεται η αναγνώριση αυτής της διαφορετικότητας. Μερικοί συγγραφείς πιστεύουν ότι στην περίπτωση ετερογένειας των βλαστικών κυττάρων, θα έπρεπε αυτή να εκφράζεται µε ποσοστιαία αναλογία. Η κλινική σηµασία αυτής της προσέγγισης είναι ότι παιδιά µε ΟΛΛ τύπου L1, που έχουν πάνω από 10% βλάστες τύπου L2 έχουν χειρότερη πρόγνωση από τα παιδιά µε µικρότερο ποσοστό βλαστών τύπου L2. Ένα τελικό πρόβληµα είναι η συµφωνία µεταξύ έµπειρων µορφολογιστών σχετικά µε την µορφολογία των υπό εξέταση κυττάρων. Μάλλον µια ανάλυση µέσω ηλεκτρονικoύ µικροσκοπίου θα µπορούσε να επιλύσει το πρόβληµα. Η σχετική συχνότητα των µορφολογικών υποτύπων ποικίλει ανάλογα µε την ηλικία. Στα παιδιά µε ΟΛΛ, 85% είναι τύπου L1, 13% L2 και 1-2% L3 148,178.Αντιθέτως στους ενήλικες µε ΟΛΛ, το 67% είναι L2. Αυτό εξηγεί την πιο επιθετική µορφή της νόσου στην ενήλικο ζωή. εν υπάρχει συσχέτιση µεταξύ της κατάταξης L1 και L2 και του φαινοτύπου που καθορίζεται µε ανοσολογικές τεχνικές, δηλαδή αν πρόκειται για Τ ή Β λεµφοκυτταρικής προέλευσης 190. Πολλοί L3 λεµφοβλάστες όµως, έχουν επιφανειακές ανοσοσφαιρίνες, και ταυτοποιούνται ως Β λεµφοκύτταρα. Επί πλέον οι λεµφοβλάστες στην L3 εµφανίζουν µία συγκεκριµένη χρωµοσωµική µετάθεση [t(8;14)] 19,20, όµοια µε αυτή που παρατηρούµε στο λέµφωµα Burkitt

18 Χαρακτηριστικά των βλαστών της ΟΛΛ 24,25,30,32,33,38,57,72,98,102,149,192 προ-προ Β-κύτταρα Προ-Β κύτταρα Β-κύτταρα Ανασυνδιασµός Γόνων Βαριές αλυσίδες Ελαφρές αλυσίδες. + / - + / Ανοσολογικά χαρακτ/κά Κυτταροπλασµατική Ig Επιφανειακή Ig CD10 (CALLA) + + / - + / - + / - Ia/HLA-DR / - CD24, 19, CD2, 5, Kυτταροχηµικά χαρακτ/κά πυρηνικό Tdt νουκλεοτιδάση όξινη φωσφατάση Κυτταρογενετ. ανωµαλίες t(1;19)(q23;p13) t(8;14), t(2;8), t(8;22) Moρφολογία FAB L1 90% 90% 10% 95% FAB L2 10% 10% 15% 5% FAB L3 0% 0% 75% 0% Τ-κύτταρα t(1;14)t(11;14), τ(10;14)(24;11) II. OΞΕΙΑ ΜΥΕΛΟΒΛΑΣΤΙΚΗ ΛΕΥΧΑΙΜΙΑ (ΟΜΛ) [Οξεία µη λεµφοβλαστική λευχαιµία]. Η κατάταξη κατά FAB καθορίζει 8 υποοµάδες ΟΜΛ, που διαφέρουν µεταξύ τους σχετικά µε το κύτταρο προέλευσης και τον βαθµό διαφοροποίησης 26. Οι τέσσερις πρώτοι τύποι (Μ0, Μ1, Μ2, Μ3) χαρακτηρίζουν λευχαιµίες της κοκκιώδους σειράς, ενώ διαφέρουν µεταξύ τους από τον βαθµό της διαφοροποίησης του κυττάρου προέλευσης. Η λευχαιµία Μ4, σχετίζεται µε την κοκκιοκυτταρική και την µονοκυτταρική σειρά. Η Μ5 προέρχεται κυρίως από την µονοκυτταρική σειρά. Η Μ6 προέρχεται από την ερυθρά σειρά και η Μ7 έχει κυρίως µεγακαρυοκυτταρικά χαρακτηριστικά. Η Μ0, Μ1 και Μ2, καλύπτουν το 50% των ΟΜΛ, η Μ4 το 25%, η Μ3 το 10%, η Μ5 το 10%, η Μ6 το 5% και η Μ7 µόλις το 3%. Η δευτεροπαθής ΟΜΛ που οφείλεται στη χηµειοθεραπεία δεν µπορεί να καταταγεί στο FAB σύστηµα. 18

19 ΜΟ Το βλαστικό κύτταρο είναι σχεδόν αδιαφοροποίητο, όπως φαίνεται στο κοινό µικροσκόπιο και µε τις αντιδράσεις κυτταροχηµείας. Η ταυτοποίηση του κυττάρου γίνεται µε το ηλεκτρονικό µικροσκόπιο όπου φαίνονται κοκκία θετικά στην µυελουπεροξειδάση (ΜPO), καθώς και µε την ανίχνευση αντιγόνων ειδικών της µυελικής σειράς: MPO(+), CD13(+), CD33(+), CD34(++), HLA-DR(+/-), CD7(-/+), Tdt (++) 9,99. Υπάρχουν πολλαπλές καρυοτυπικές ανωµαλίες. Μ1 Χαρακτηρίζει την ΟΜΛ µε βλάστες µορφολογικά αδιαφοροποίητους ή πτωχά διαφοροποιηµένους. Σπανίως υπάρχουν µικρά αζουρόφιλα κοκκία. Σπάνια είναι και τα κοκκία Auer. Περίπου 10% των κυττάρων παρουσιάζουν ωρίµανση προς την προµυελοκυτταρική σειρά. Χρειάζονται κυτταροχηµικές χρώσεις για να διαφοροποιηθούν αυτά τα κύτταρα από την L2. Τουλάχιστον το 3% των Μ1 κυττάρων είναι θετικά στην υπεροξειδάση. Περισσότερα θετικά κοκκία στην υπεροξειδάση (MPO) µπορούµε να δούµε µε το ηλεκτρονικό µικροσκόπιο Η ειδική εστεράση για την κοκκιοκυτταρική σειρά naphthol AS-D chloroacetate, µπορεί να είναι θετική. Ανοσοφαινοτυπικά χαρακτηρίζεται από CD13(+), CD33(+), HLA-DR(+), CD34(+), Tdt(++), CD15(-), CD14(+/-). καρυοτυπικές ανωµαλίες υπάρχουν: t(9;22), +21, +8, -5 ή 5q-. Μ2 Οι βλάστες της Μ2 διαφέρουν σαφώς από την Μ1, ωρίµανσης. Μυελοβλάστες µε αζουρόφιλα κοκκία και προµυελοκύτταρα αποτελούν το 50% των εµπύρηνων κυττάρων, ενώ τα προγονικά κύτταρα της µονοκυτταρικής σειράς είναι λιγότερα από το 20%. Μπορεί να υπάρχουν αρκετά άωρα ηωσινόφιλα 5, καθώς και ψευδο- Pelger-Huet και άκοκκα ουδετερόφιλα. Η αντίδραση υπεροξειδάσης είναι έντονα θετική, ενώ η αντίδραση εστεράσης είναι αρνητική στα περισσότερα κύτταρα. Ανοσοφαινοτυπικά παρουσιάζει: CD13(+), CD33(+), CD15(+), HLA-DR(+), Tdt(-), CD34. Καρυοτυπικά χαρακτηρίζεται από πολλαπλά ευρήµατα: t(8;21), +8, t(9;11), t(9;22), t(6;9), -5 ή 5q-. 19

20 Μ3 Η οξεία προµυελοκυτταρική λευχαιµία 16 αναγνωρίζεται εύκολα από την κυριαρχία των προµυελοκυττάρων (περισσότερα από 50%), πολλά από τα οποία περιέχουν µεγάλα αζουρόφιλα και ροδόχροα ή πορφυρά κοκκία. Τα σωµάτια Auer είναι άφθονα. Ευκαιριακά, µπορεί να είναι συγκεντρωµένα σε σωρούς (κύτταρα Fagot). Η καταστροφή των κυττάρων κατά την προετοιµασία των πλακιδίων είναι συχνή, µε αποτέλεσµα να υπάρχει ένα υπόστρωµα κοκκίων και σωµατίων Auer. Η αντίδραση χλωροοξεικής εστεράσης είναι εντονότατα θετική, και δεν αναστέλλεται από φθοριούχο άλας (Fluoride). Μία µορφολογική ποικιλία της Μ3, εµφανίζει δίλοβους, πολύλοβους ή νεφροειδείς πυρήνες και ελάχιστα ή καθόλου κυτταροπλασµατικά κοκκία. Αυτή η επονοµαζόµενη µικροκοκκιώδης ποικιλία της οξείας προµυελοκυτταρικής λευχαιµίας, έχει τα ίδια κλινικά και κυτταρογενετικά χαρακτηριστικά, όπως η υπερκοκκιώδης. Η κλασική µορφή χαρακτηρίζεται ανοσοφαινοτυπικά από CD13(+) και CD33(+), ενώ η υποκοκκιώδης από CD14(+/-). Χαρακτηριστικά, είναι η µόνη ΑΜΛ µε τα HLA-DR(-) και CD34(-). Και οι δύο µορφές παρουσιάζουν την ίδια αντιµετάθεση t(15;17). Μ4 Στην οξεία προµυελοκυτταρική λευχαιµία, τα άωρα κύτταρα της µυελικής και µονοκυτταρικής σειράς παρουσιάζονται σε διάφορες αναλογίες. Κάθε κυτταρική σειρά αποτελεί τουλάχιστον το 20%, αλλά όχι περισσότερο από το 80%, των εµπύρηνων κυττάρων του µυελού των οστών. Επίσης παρατηρείται µια αύξηση του αριθµού των µονοκυττάρων και προµονοκυττάρων στο περιφερικό αίµα. Η ταυτοποίηση των κυττάρων χρειάζεται ειδικές χρώσεις. Η αντίδραση µη ειδικών εστερασών αναστέλλεται τουλάχιστον µερικώς από το φθοριούχο νάτριο (sodium fluoride). Ανοσοφαινότυπος: CD13(+), CD33(+), CD15(+), CD14(++), CD11b(+), Tdt(-), CD34(-). καρυότυπος: t(9;11), t(6;9), +8, -5 ή 5q-. Υπάρχει µια υποοµάδα της M4, που παρουσιάζει αύξηση των ηωσινοφίλων >5%. Έχει τα ίδια κλινικά χαρακτηριστικά, αλλά διαφορετικό φαινότυπο και καρυότυπο. Φαινότυπος: CD13(+), CD2(-/+), CD11b(-/+), CD11c(-/+), CD14(- /+), CD33(-/+), CD14(-/+), CD34(-/+), CD36(-/+), Tdt(-/+), HLA- DR(-/+). Καρυότυπος: Inv(16) (p13,q32). 20

21 Μ5 Υπάρχουν δύο τύποι οξείας µονοκυτταρικής λευχαιµίας. Στον τύπο Μ5α, τα βλαστικά κύτταρα είναι µεγάλα ( µε διάµετρο >30µm ), µε delicate lacy χρωµατίνη στον πυρήνα και βασεόφιλο αλλά χωρίς κοκκία πρωτόπλασµα. Xαρακτηρίζεται ανοσοφαινοτυπικά από CD14(++), CD11b(+), HLA-DR(+), Tdt(-/+), και καρυοτυπικά από t(9;11), +8, -5 ή 5q- 18. Στην ποικιλία Μ5β, το 20% ή περισσότερο των βλαστικών κυττάρων παρουσιάζουν κάποιου βαθµού ωρίµανση, µε αναδιπλωµένους (folded) πυρήνες, πρωτόπλασµα λιγότερο βασεόφιλο και αζουρόφιλα κοκκία. O Ανοσοφαινότυπος αυτής της υποοµάδας είναι: CD34(+/-), CD13(+/-), CD33(+/-), CD15(+/-) µε ίδιες καρυοτυπικές ανωµαλίες. Η αναλογία των µονοκυττάρων στο περιφερικό αίµα είναι µεγαλύτερη απ ότι στον µυελό. Και στους δύο τύπους, η αντίδραση υπεροξειδάσης είναι αρνητική ή µόνον ασθενώς θετική, ενώ οι αντιδράσεις µη ειδικών εστερασών είναι έντονα θετικές και αναστέλλονται από το φθοριούχο νάτριο (sodium fluoride). Μ6 Η οξεία ερυθρολευχαιµία χαρακτηρίζεται µορφολογικά από τις µεγαλοβλαστοειδείς αλλοιώσεις τις ερυθράς σειράς και τον αυξηµένο αριθµό µυελοβλαστών. Οι ερυθροβλάστες αποτελούν το 50% των εµπύρηνων κυττάρων τους µυελού, και µυελοβλάστες τουλάχιστον το 30%. Μπορεί να βρεθούν και δακτυλιοειδείς σιδηροβλάστες µε την χρώση σιδήρου. Η χρώση κατά PAS ( periodic acid Schiff), είναι θετική υπό µορφή µεγάλων βολίων στο πρωτόπλασµα των άωρων ερυθροβλαστών. Ανοσοφαινοτυπικά είναι θετικοί στην γλυκοφορίνη Α, CD71(+), CD45(+), CD34(-/+), CD11b(-/+), CD14(-/+), HLA- DR(-/+), CD13(+/-), CD33(+/-), Tdt(-), CD15(-). Χρωµοσωµικές ανωµαλίες παρουσιάζονται στα χρωµοσώµατα 5 και 7, καθώς και +8. Μ7 Η οξεία µεγακαρυοκυτταρική λευχαιµία 17, όπως και η Μ0, ταυτοποιείται κυρίως µε το ηλεκτρονικό µικροσκόπιο ή µε ανοσοφαινοτυπικές µεθόδους, παρά από τα µορφολογικά χαρακτηριστικά της στο κοινό µικροσκόπιο. Οι Μ7 βλάστες είναι ποικιλόµορφοι, και προσοµοιάζουν µε λεµφοβλάστες τύπου L1 ή L2. Μπορούµε να παρατηρήσουµε τµήµατα µεγακαρυοκυττάρου στο περιφερικό αίµα. Χαρακτηριστικά, ο αριθµός των κυκλοφορούντων βλαστών είναι µικρός, ενώ η αναρρόφηση του µυελού είναι δύσκολη 21

22 ή αδύνατη λόγω της µυελοίνωσης ή της αύξησης στο µυελό των δικτυωτών ινών. Οι µεγακαρυοβλάστες είναι αρνητικοί στην χρώση κατά Sudan black και στην υπεροξειδάση, αλλά είναι συχνά θετικοί στην αντίδραση a-naphthylacetate esterase και naphthol ASD acetate esterase. Σε αντίθεση µε τα µονοκύτταρα, οι µεγακαρυοβλάστες, είναι αρνητικοί και στην a-naphthyl-butyrate esterase. Τελικά η διάγνωση τίθεται µε την ανίχνευση δραστηριότητας αιµοπεταλιακής υπεροξειδάσης στο ηλεκτρονικό µικροσκόπιο, ή µε την ανίχνευση των αιµοπεταλιακών γλυκοπρωτεινών Ib ή IIb/IIIa, µε ανοσολογικό τρόπο(105). Επίσης είναι θετικά στα αντιγόνα CD41(++), HLA- DR(+), CD34(+), CD13(-/+), CD33(+/-), CD61(++). Παρουσιάζουν ποικίλες χρωµοσωµικές ανωµαλίες. Ορισµένες µορφές λευχαιµίας δεν συµπεριλαµβάνονται στην κατά FAB κατάταξη. Αυτές οι µορφές είναι: Η de novo οξεία βασεοφιλική λευχαιµία: Μορφολογικά παρουσιάζει βασεόφιλα κοκκία. Κυτταροχηµικά είναι αρνητική στην MPO και την SBB. Ο ανοσοφαινότυπος δεν παρουσιάζει ειδικά ευρήµατα και δεν ανιχνεύονται καρυοτυπικές ανωµαλίες. Θα πρέπει να γίνει διαφορική διάγνωση από την βλαστική κρίση της ΧΜΛ. Τα ευρήµατα του ηλεκτρονικού µικροσκοπίου είναι καθοριστικά για την διάγνωση. Μ2 baso: Παρουσία βλαστικών κυττάρων µε βασεόφιλα κοκκία. Χαρακτηρίζεται από ανωµαλίες του χρωµοσώµατος 12 ή t(6;9) (p23;q34). Oξεία ηωσινοφιλική λευχαιµία: Θα πρέπει να γίνει διαφορική διάγνωση από άλλα υπερηωσινοφιλικά σύνδροµα. ΟΜΛ CD7+. Αποτελεί το 10-38% των ΟΜΛ. Συνήθως πρόκειται για Μ0, Μ1 ή Μ5α: Ανοσοφαινότυπος: HLA-DR(+), CD34(+), Tdt(+). Ο καρυότυπος ποικίλει. Η πρόγνωση είναι αµφιλεγόµενη. ΟΜΛ/ΝΚ: Μορφολογικά οµοιάζει µε την υποκοκκιώδη Μ3. Η διαφορική διάγνωση είναι σηµαντική διότι πρόκειται για ιδιαίτερη νοσολογική οντότητα, µε επιθετική κατά κανόνα συµπεριφορά. Κυτταροχηµεία: MPO(+), SBB(+), PAS(+/-), NSE ασθενώς θετική. Ανοσοφαινότυπος 22

23 CD33(+), CD56(+), CD11a(+), CD34(+/-), HLA-DR(-), CD16(-), CD7(+), CD13(+/-). Ο καρυότυπος είναι συνήθως φυσιολογικός. Υποκυτταρική οξεία λευχαιµία: Συνήθως είναι Μ0, Μ1 ή Μ2. Παρατηρούνται συχνά καρυοτυπικές ανωµαλίες που αφορούν τα χρωµοσώµατα 5 ή 7, καθώς και τρισωµία 8. Θα πρέπει να γίνει διαφορική διάγνωση από απλαστική αναιµία και από υποπλαστικό µυελοδυσπλαστικό σύνδροµο. ΟΜΛ µε δυσπλασία τριών σειρών: Παρατηρείται δυσπλασία σε ποσοστό µεγαλύτερο από 25%των ερυθροβλαστών και του 50% των κοκκιοκυττάρων και µεγακαρυοκυττάρων. Τα αποτελέσµατα κλινικών ερευνών είναι αντιφατικά όσον αφορά την πρόγνωση. Μυελοδενδριτική λευχαιµία: (Myelo-dendritic cell-related leukemia). Ορισµένες ΟΜΛ (Μ2, Μ4 ή Μ5) πιθανόν -στην πραγµατικότητα- να αποτελούν υπερπλασία πρόδροµων δενδριτικών κυττάρων. ιφαινοτυπική ΟΜ: Αµφιλεγόµενο θέµα λόγω της έλλειψης απόλυτης ειδικότητας πολλών δεικτών. Υπάρχουν περιπτώσεις που στο ίδιο βλαστικό κύτταρο, εκφράζονται δείκτες που θεωρούνται ειδικοί για την µυελική και την λεµφική σειρά 51,107,184. Κριτήρια για τη διάγνωση της οξείας διφαινοτυπικής λευχαιµίας Σύστηµα βαθµολόγησης Βαθµοί Β-σειρά Τ-σειρά Μυελική σειρά 2 CD22 µ αλυσίδα mb1 CD3 MPO 1.5 CD10 CD19 CD2 CD5 CD13 CD33 c-kit 0.5 TdT TdT CD7 CD11b CD11c CD14 23

24 H διάγνωση της διφαινοτυπικής λευχαιµίας προϋποθέτει την παρουσία >2.0 βαθµών για τη µυελική σειρά και >2.0 βαθµών για µία από τις δύο λεµφικές σειρές. Οι ασθενείς µε οξεία λευχαιµία παρουσιάζουν πολλές κοινές χρωµοσωµικές ανωµαλίες µε ασθενείς µε προλευχαιµικές καταστάσεις (µυελοδυσπλαστικά και µυελοπαραγωγά σύνδροµα), στοιχείο ενδεικτικό της κοινής προέλευσης αυτών των νοσηµάτων 40. Μερικές από αυτές µάλιστα έχουν ιδιαίτερη κλινική σηµασία, λόγω του ότι σχετίζονται άµεσα µε την βιολογική συµπεριφορά και τον φαινότυπο του λευχαιµικού κυττάρου, αλλά και την πρόγνωση της νόσου. Έτσι οι γενετικές µεταβολές t(8;21), t(15;17) και inv(16) σε ασθενείς µε οξεία µυελογενή λευχαιµία και t(12;21) σε ασθενείς µε οξεία λεµφοβλαστική λευχαιµία, συσχετίζονται µε ευνοϊκή πρόγνωση, τόσο όσον αφορά την ανταπόκριση στην χηµειοθεραπεία, όσο και την συνολική επιβίωση. Από την άλλη, η παρουσία των κυτταρογενετικών ανωµαλιών 11q23, -7/7q- και -5/5q- σε ασθενείς µε οξεία µυελογενή λευχαιµία, και των t(1;19), t(9;22) και 11q23 σε ασθενείς µε οξεία λεµφοβλαστική λευχαιµία συσχετίζεται µε δυσµενέστερη πρόγνωση. Είναι δε σηµαντική η αναγνώριση τέτοιων αρρώστων, γιατί η χειρότερη πρόγνωση µπορεί ίσως να ξεπεραστεί µε την εφαρµογή εντατικότερης θεραπείας 27,42. 24

25 B. ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΑΙΜΟΣΤΑΣΗΣ Εισαγωγή Η διατήρηση του κυκλοφορούντος όγκου του αίµατος, µέσα στο κυκλοφορικό σύστηµα είναι προϋπόθεση για την φυσιολογική λειτουργία του οργανισµού. Κάθε σηµαντική τρώση του συστήµατος αυτού που έχει ως αποτέλεσµα την απώλεια µεγάλου όγκου αίµατος, µπορεί να προκαλέσει τον θάνατο, λόγω της χαµηλής προσφοράς αίµατος στα διάφορα ζωτικά όργανα. Ο οργανισµός προστατεύεται µε τους αιµοστατικούς µηχανισµούς. Οι αιµοστατικοί µηχανισµοί στοχεύουν: α) στην επαρκή επούλωση κάθε αγγειακής βλάβης, ώστε να διατηρηθεί ο όγκος του κυκλοφορούντος αίµατος και στην διατήρηση αυτής της επούλωσης µέχρι την αποκατάσταση του τοιχώµατος του αγγείου και β) στον καθαρισµό του αγγειακού αυλού από τον υπάρχοντα θρόµβο, ώστε να αποκατασταθεί πλήρως ή ροή του αίµατος στο συγκεκριµένο αγγείο 22,23,11. Ο πρώτος στόχος πραγµατοποιείται µε τρεις βασικούς µηχανισµούς: 1 Αγγειοσύσπαση 2 ηµιουργία αιµοπεταλιακού θρόµβου 3 ηµιουργία ινικής Ο δεύτερος στόχος πραγµατοποιείται µε έναν µηχανισµό: 1 Ινωδόλυση Αυτοί οι τέσσερις µηχανισµοί είναι πολύ στενά συνδεδεµένοι µεταξύ τους, µε αποτέλεσµα να είναι επαρκέστατοι για την διατήρηση του κυκλοφορούντος αιµατικού όγκου και την ακεραιότητα του αγγειακού συστήµατος. Σήµερα γνωρίζουµε πολλά σχετικά µε την λειτουργία αυτού του συστήµατος, αλλά υπάρχουν και ερωτήµατα αναπάντητα. Η αποτυχία οποιουδήποτε µηχανισµού από αυτούς που αναφέραµε, µπορεί να έχει ως 25

26 αποτέλεσµα την εκδήλωση αιµορραγίας ή θρόµβωσης. Οι ανωµαλίες που οδηγούν σε αιµορραγία έχουν µελετηθεί και είναι γνωστές, σε αντίθεση µε την θρόµβωση, όπου όλες οι διαταραχές που την προκαλούν δεν έχουν ακόµα αποκαλυφθεί. 1. Αγγειοσύσπαση Η βλάβη ενός αγγείου, έχει ως αποτέλεσµα την σύσπαση του αγγείου. Αυτή επιτυγχάνεται διαµέσου του µυϊκού χιτώνα του τοιχώµατος των αρτηριών και των φλεβών. Τα τριχοειδή δεν έχουν επαρκή µυϊκά στοιχεία, αλλά η αιµατική ροή µπορεί να τροποποιηθεί µε την σύσπαση των προτριχοειδικών σφιγκτήρων. Η µυϊκή σύσπαση των αγγείων προκαλείται µε δύο τρόπους: α) µε νευρογενή ερεθίσµατα, µέσω ολοκληρωµένων αντανακλαστικών και διαρκεί πολύ λίγο β) µέσω του µυϊκού σπασµού που πραγµατοποιείται από τον άµεσο ερεθισµό των αγγειακών µυϊκών στιβάδων, κατά την διάρκεια της βλάβης, που είναι πιο σταθερός και διαρκεί περισσότερο από µια ώρα. Κανείς από αυτούς τους µηχανισµούς, που πέραν των άλλων είναι σχετικά µικρής χρονικής διάρκειας, δεν παίζει µεγάλο ρόλο σε µια σοβαρή αιµορραγία, και για τον λόγο αυτόν δεν είναι αντικείµενο εκτεταµένων ερευνών. ιάφορα προϊόντα που θα παραχθούν από τις επόµενες φάσης της αιµόστασης, όπως θροµβοξάνες, βραδυκινίνη και ινωδοπεπτίδια, δρουν αγγειοσυσπαστικά και συµβάλουν σ αυτήν την φάση της αιµόστασης. Αυτός ο µηχανισµός υποστηρίζεται από τον περιβάλλοντα συνδετικό ιστό που ασκεί κάποια πίεση. Ανεπάρκεια αυτής της υποστήριξης µπορεί να προκαλέσει παθολογικές αιµορραγίες, όπως στο σύνδροµο Ehlers- Danlos, στο οποίο ο συνδετικός ιστός είναι εξαιρετικά ελαστικός. 26

27 2. ηµιουργία του αιµοπεταλιακού θρόµβου Σε φυσιολογικές συνθήκες η προσκόλληση των αιµοπεταλίων στα τοιχώµατα των αγγείων, αναστέλλεται από διάφορους παράγοντες όπως η συνεχής ροή του αίµατος, και η αντισυγκολλητική δράση της προστακυκλίνης που συντίθεται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα µέσω της µεταβολικής οδού της κυκλοοξυγενάσης, από το αραχιδονικό οξύ. Όταν έχουµε βλάβη των ενδοθηλιακών κυττάρων, το αίµα έρχεται σε επαφή µε τους υπενδοθηλιακούς ιστούς, από τους οποίους είναι σε φυσιολογικές συνθήκες αποµονωµένο. Αυτό οδηγεί σε µια σειρά από αντιδράσεις που οδηγούν στην δηµιουργία του αιµοπεταλιακού θρόµβου. Η πρώτη από αυτές τις αντιδράσεις είναι η προσκόλληση των αιµοπεταλίων στο υπενδοθήλιο. Τα αιµοπετάλια κολλούν στις ίνες κολλαγόνου και τις ελαστικές ίνες, µέσω δικών τους ιδιοτήτων, ιδιοτήτων των ιστών που έρχονται σε επαφή και τέλος µέσω πρωτεϊνών του πλάσµατος. Η αιµοπεταλιακή µεµβράνη περιέχει την γλυκοπρωτείνη Ib στην οποία προσκολλάται ο παράγων von Willebrand του πλάσµατος, που αποτελεί τον συνδετικό κρίκο µεταξύ των αιµοπεταλίων και των ινών κολλαγόνου. Η έλλειψη του παράγοντα von Willebrand, είναι υπεύθυνη για την παράταση του χρόνου ροής που παρατηρείται στην νόσο του von Willebrand, αφού η προσκόλληση των αιµοπεταλίων, το πρωταρχικό συµβάν στην δηµιουργία του αιµοπεταλιακού θρόµβου δεν µπορεί να επιτευχθεί. Η γλυκοπρωτείνη Ib δρα ως υποδοχέας του παράγοντα vwf και η ανεπάρκεια αυτού του υποδοχέα, όπως στην νόσο Bernard-Soulier, προκαλεί ανεπάρκεια στην προσκόλληση των αιµοπεταλίων και παράταση του χρόνου ροής. Μετά την προσκόλληση των αιµοπεταλίων στο υπενδοθήλιο, ακολουθεί η δεύτερη φάση της συγκόλλησης των αιµοπεταλίων. Τα αιµοπετάλια που έχουν κολλήσει στο υπενδοθήλιο, αλλάζουν το σχήµα τους από σφαιρικό σε δισκοειδές και παράγουν µια σειρά από χηµικούς παράγοντες που προάγουν την συγκόλληση άλλων αιµοπεταλίων, όπως η θροµβοξάνη Α2, η διφοσφορική αδενοσίνη, η σεροτονίνη και ο παράγοντας συγκόλλησης των αιµοπεταλίων (PAF). Την διαδικασία της συγκόλλησης των αιµοπεταλίων, ενισχύουν άλλοι παράγοντες στο σηµείο 27

28 της βλάβης, όπως το ινωδογόνο, διφωσφορική αδενοσίνη που προέρχεται από την καταστροφή των ερυθρών αιµοσφαιρίων, η θροµβίνη που παράγεται από την µηχανισµό της πήξης και οι κατεχολαµίνες. Η αλληλουχία αυτών των δύο µηχανισµών οδηγεί στην δηµιουργία του αιµοπεταλιακού θρόµβου, µε τον οποίο είναι δυνατό να σταµατήσει η αιµορραγία σε µικρά αγγεία, περιστασιακά, ακόµη και αν υπάρχει γνωστή αιµορροφιλία, αλλά δεν είναι δυνατό να εξασφαλιστεί αιµόσταση διαρκείας ή αιµόσταση σε µεγαλύτερα αγγεία. Η αιµόσταση διαρκείας χρειάζεται την δηµιουργία της ινικής. 3. Η δηµιουργία της ινικής και η πήξη του αίµατος Περίπου µια ώρα µετά την δηµιουργία του αιµοπεταλιακού θρόµβου, εάν δεν δηµιουργηθεί η θροµβίνη, η αιµορραγία τείνει να επανεµφανιστεί. Σε περίπτωση όµως µεγάλων ιστικών βλαβών, εάν η δηµιουργία ινικής είναι ανεπαρκής, η αιµορραγία θα είναι ένα µεγάλο πρόβληµα εξ αρχής. Η ινική προέρχεται από το ινωδογόνο. Σχηµατίζει ένα πυκνό πλέγµα από αδιάλυτα στρώµατα και ενισχύει κάθε σχηµατισµένο αιµοπεταλιακό θρόµβο, παράγοντας µία επαρκή προστασία στις πληγές, ούτως ώστε να διατηρείται η ακεραιότητα του αγγειακού δένδρου και να προλαµβάνεται η περαιτέρω απώλεια αίµατος. Το ινωδογόνο κυκλοφορεί υπό µορφή διµερών διαλυτών µορίων, και κάθε µονάδα του διµερούς αποτελείται από τρεις πολυπεπτιδικές αλύσους, γνωστές ως α-, β-, και γ- άλυσος. Κάτω από την δράση της θροµβίνης (πρωτεολυτικό ένζυµο που δεν υπάρχει υπό φυσιολογικές συνθήκες στο αίµα αλλά παράγεται µε µηχανισµούς που θα αναλυθούν παρακάτω) αποµακρύνεται ένα τµήµα από την άλυσο α- και ένα τµήµα από την άλυσο β-. Τα τµήµατα αυτά ονοµάζονται ινωδοπεπτίδια Α και Β. Αυτή η φαινοµενικά µικρή απώλεια του ινωδογόνου έχει ως αποτέλεσµα την δηµιουργία µονοµερών ινικής διαλυτών, τα οποία γρήγορα πολυµερίζονται και δηµιουργούν τα στρώµατα της ινικής που περιβάλουν in vivo τον αιµοπεταλιακό θρόµβο, ενσωµατώνοντας επιπλέον αιµοπετάλια, ερυθρά και λευκά αιµοσφαίρια 28

29 και σταθεροποιώντας τα στο σηµείο της αγγειακής βλάβης. Τα πολυµερή της ινικής που έχουν δηµιουργηθεί είναι σε θέση να σταµατήσουν την αιµορραγία, αλλά κινδυνεύουν να σπάσουν, µέχρι να συµβεί ένα άλλο χηµικό γεγονός. Πρόκειται για την σύνδεση παρακειµένων µορίων ινικής µε αµιδικούς δεσµούς µεταξύ των γ- και των α- αλύσων τους. Αυτοί οι δεσµοί, σταθεροποιούν την αδιάλυτη ινική, και συγχρόνως την καθιστούν, ανθεκτικότερη στην δράση της πλασµίνης που δηµιουργείται δια µέσου του ινωδολυτικού συστήµατος. Ο παράγων XIII, (σταθεροποιητικός παράγων της ινικής), ένας αδρανής παράγων που κυκλοφορεί στο αίµα, µετατρέπεται από την θροµβίνη σε ενεργό ένζυµο, και είναι ικανός να δηµιουργήσει αυτούς τους δεσµούς. Οι αιµοστατικοί µηχανισµοί που εµπλέκονται στη δηµιουργία της θροµβίνης και ως εκ τούτου και της ινικής, σκοπό έχουν την παραγωγή της θροµβίνης τοπικά, στο σηµείο της αγγειακής βλάβης, ενώ προλαµβάνουν µε ποικίλους τρόπους την διασπορά της στην κυκλοφορία. Υπάρχουν δύο δρόµοι, έκαστος των οποίων οδηγεί στην παραγωγή θροµβίνης. Ένα αρχικό ερέθισµα, συνήθως τοπική βλάβη, ενεργοποιεί µια σειρά από αντιδράσεις οι οποίες ενισχύουν το αρχικό τοπικό ερέθισµα, και οδηγούν σε µια εκρηκτική δηµιουργία θροµβίνης. Οι δύο δρόµοι που καθορίστηκαν στην δεκαετία του 1960, είναι γνωστοί µε τους όρους εξωγενής και ενδογενής οδός. Ξεκινούν ως δύο διαφορετικές οδοί και στη συνέχεια συγκλίνουν σε µία κοινή τελική οδό 117,155,163. Εξωγενής οδός: Η ενεργοποίηση αυτής της οδού αρχίζει όταν διάφορες θροµβοπλαστίνες, (ιστικός παράγων-tf) που προέρχονται από τους κατεστραµµένους εξωαγγειακούς ιστούς, έρχονται σε επαφή µε το αίµα. Το αίµα που εκτίθεται σ αυτές τις ουσίες, πήζει σε λίγα δευτερόλεπτα. Οι ιστικές θροµβοπλαστίνες που υπάρχουν σε όλους τους ιστούς, αποτελούνται από λιπίδια και πρωτεϊνικά στοιχεία, αµφότερα απαραίτητα για την λειτουργία τους. Σε απουσία των λιπιδίων, η πρωτεΐνη από µόνη της έχει περιορισµένη δράση. Η phosphatidylethanolamine, ένα αρνητικά φορτισµένο φωσφολιπίδιο, είναι ο πιο ενεργός παράγων να προσδώσει δραστικότητα σε κεκαθαρµένη πρωτεΐνη. Πιθανή δράση της είναι η 29

30 διευκόλυνση της σύνδεσης του πρωτεϊνικού παράγοντα µε το υπόστρωµά του. Ο παράγων VII, είναι µια πρωτεΐνη του πλάσµατος, µε µοριακό βάρος 48 kda, ο οποίος δηµιουργεί ένα σύµπλεγµα µε τον ιστικό παράγοντα, (TF - VIIa), παρουσία ιόντων ασβεστίου, και µε αυτή την διαδικασία µετατρέπεται από σχετικά αδρανής, µονής αλύσου πρωτεΐνη, σε ενεργό ένζυµο διπλής αλύσου. Αυτό το δραστικότατο σύµπλεγµα παίζει καταλυτικό ρόλο στη µετατροπή του παράγοντα Χ, από προένζυµο, σε ενεργή µορφή. ηλαδή, ο παράγοντας Χ, µια πρωτεΐνη διπλής αλύσου, µε µοριακό βάρος 60 kda, µετατρέπεται σε ενεργό µορφή, χάνοντας ένα µέρος της βαριάς αλύσου και αποκαλύπτοντας έτσι το ενεργό σηµείο του ενζύµου. Ο ενεργοποιηµένος παράγοντας Χa, από µόνος του είναι σε θέση να ενεργοποιήσει την προθροµβίνη, αλλά µε αργό ρυθµό. Η ενεργοποίηση της προθροµβίνης από τον παράγοντα Χa, επιταχύνεται σηµαντικά από την παρουσία του παράγοντα V, των φωσφολιπιδίων και των ιόντων ασβεστίου. Η παρουσία των τριών τελευταίων, επιτρέπει την σύνδεση της προθροµβίνης και του παράγοντα Χa στα φωσφολιπίδια και συγχρόνως την προσκόλληση του παράγοντα V µαζί τους. Η εναπόθεση αυτών των πρωτεϊνών στην επιφάνεια των φωσφολιπιδίων, επιταχύνει την αντίδραση και συγχρόνως τους προφυλάσσει από την δράση της αντιθροµβίνης ΙΙΙ. Ο ρόλος του παράγοντα V, µια βαριάς πρωτεΐνης, µε µοριακό βάρος 250 kda, δεν έχει πλήρως διευκρινιστεί, αλλά όταν ενεργοποιηθεί ακόµη και από ίχνη θροµβίνης, είναι ικανός να συνδεθεί µε το προθροµβινικό κλάσµα του συµπλέγµατος και να προκαλέσει σηµαντική ενίσχυση της ενεργοποίησης της προθροµβίνης. Η προθροµβίνη είναι µια πρωτεΐνη µονής αλύσου, µοριακού βάρους 70 kda, που όταν ενσωµατωθεί στο σύµπλεγµα, µετατρέπεται σε ενεργή θροµβίνη µε την αποµάκρυνση ενός µικρού τµήµατος του µορίου της. Η θροµβίνη θα προκαλέσει τη δηµιουργία ινικής από το ινωδογόνο, όπως περιγράφεται παρακάτω. Ενδογενής οδός: Η ενεργοποίηση αυτής της οδού αρχίζει µε την επαφή του αίµατος µε µια ξένη επιφάνεια, δηλαδή µε οποιαδήποτε επιφάνεια πέραν του 30

31 αγγειακού ενδοθηλίου. Πρόκειται ουσιαστικά για κολλαγόνο, ελαστικές ίνες, µύες, λίπος ή δέρµα. Αυτή η επαφή φέρνει κοντά τον παράγοντα ΧΙΙ (παράγων Hageman), την προκαλικρείνη, το υψηλού µοριακού βάρος κινινογόνο και τον παράγοντα ΧΙ. Η επαφή αυτών των τεσσάρων παραγόντων µε τα αρνητικά φορτισµένα φωσφολιπίδια των µεµβρανών των ενδοθηλιακών κυττάρων και των αιµοπεταλίων, έχει σαν συνέπεια την ενεργοποίηση του παράγοντα ΧΙ σε παράγοντα ΧΙα, από τον ΧΙΙ. Ο παράγων ΧΙ είναι µια πρωτεΐνη διπλής αλύσου, µε µοριακό βάρος 160 kda. Ο παράγοντας ΙΧ (παράγων των Χριστουγέννων), είναι µια πρωτεΐνη µονής αλύσου, µε µοριακό βάρος 55kDa, η οποία µετατρέπεται στην ενεργό µορφή της από τον ενεργοποιηµένο παράγοντα ΧΙa. Πρόκειται για την µετατροπή της πρωτεΐνης σε διπλής αλύσου πολυπεπτίδιο που δηµιουργείται από την αποµάκρυνση µικρών τµηµάτων από το αρχικό µόριο. Ο παράγων ΙΧa, µετατρέπει τον παράγοντα Χ σε ενεργή µορφή. Αυτή η µετατροπή, ενισχύεται σηµαντικά από την παρουσία φωσφολιπιδίων, του παράγοντα VIII (αντιαιµορροφιλικός παράγων) και ιόντων ασβεστίου. Αυτά δηµιουργούν µε τον παράγοντα ΙΧa και τον παράγοντα Χ, ένα πολυµοριακό σύµπλεγµα, συµπλησιάζοντας τους συµµετέχοντες και ενισχύοντας την δράση τους. Ο παράγων VIII, το µόριο που λείπει στην κλασική αιµορροφιλία, φυσιολογικά κυκλοφορεί στο αίµα, συνδεδεµένος µε τον παράγοντα vonwillebrand. Παίζει καταλυτικό ρόλο στην ενεργοποίηση του παράγοντα Χ από τον παράγοντα ΙΧ, µε τον ίδιο τρόπο που ο παράγοντας V προάγει την δηµιουργία θροµβίνης από την προθροµβίνη, µετά την δράση του παράγοντα Χa. Όπως η δραστικότητα του παράγοντα V, έτσι και η δραστικότητα του παράγοντα VIII, ενισχύεται ακόµη και από ίχνη θροµβίνης. Παρότι ο διαχωρισµός των δύο οδών είναι συµβατικός, βοηθάει στην κατανόηση του πηκτικού µηχανισµού και την ανάπτυξη ερευνητικών πρωτοκόλλων. Σήµερα, γνωρίζουµε ότι υπάρχει µεγάλη αλληλεπίδραση µεταξύ των δύο οδών. Το σύµπλεγµα TF-VIIa αρχίζει τον 31

32 πηκτικό µηχανισµό, ενεργοποιώντας όχι µόνον τον παράγοντα X, αλλά και τον παράγοντα ΙΧ. Οι παράγοντες ΙΧa και Χa παίζουν πολύ διαφορετικούς ρόλους στις ακολουθούµενες αντιδράσεις της πήξης. Ο ρόλος του παράγοντα Χa που δηµιουργήθηκε από το σύµπλεγµα TF-VIIa. O ενεργοποιηµένος παράγοντας Χa, παραµένει κοντά στον ιστικό παράγοντα και αλληλεπιδρά µε τον συµπαράγοντα του, παράγοντα V. Το σύµπλεγµα Xa-Va, µετατρέπει την προθροµβίνη σε θροµβίνη, πάντα κοντά στον TF. Το ποσοστό της θροµβίνης που δηµιουργείται είναι πολύ µικρό, της τάξης των picomol. Ωστόσο αυτό το ποσοστό της θροµβίνης είναι ικανό 1) να ενεργοποιήσει τα αιµοπετάλια, 2) να διαχωρίσει τον παράγοντα VIII από τον παράγοντα vonwillebrand, 3) να ενεργοποιήσει τους παράγοντες V και VIII, και 4) ίσως να ενεργοποιήσει τον παράγοντα ΧΙ. Το ποσοστό της θροµβίνης όµως είναι ανεπαρκές για να δηµιουργήσει σταθερό θρόµβο ινικής, αλλά είναι επαρκές να προετοιµάσει το σύστηµα για την ακολουθούµενη εκρηκτική δηµιουργία θροµβίνης. Ο ενεργοποιηµένος παράγων Χa που δηµιουργείται µε αυτήν την διαδικασία κοντά στον TF, συνδέεται στην συνέχεια µε τον αναστολέα του TF (TFPI), και απενεργοποιείται. Ο ρόλος του παράγοντα ΙΧa που δηµιουργείται από το σύµπλεγµα TF-VIIa: Ο παράγων ΙΧα που δηµιουργείται σ αυτό το µικροπεριβάλλον, φαινοµενικά δρα στην επιφάνεια των ενεργοποιηµένων αιµοπεταλίων, µε τα οποία συνδέεται, παρουσία του παράγοντα VIIIa. Το σύµπλεγµα IXa / VIIIa, συλλέγει τον διαλυτό παράγοντα Χ πάνω στην επιφάνεια των αιµοπεταλίων και τον µετατρέπει σε Χa. Αυτός ο συνδεδεµένος µε τα αιµοπετάλια παράγων Χa, παρουσία του συµπαράγοντα του Va, µετατρέπει την προθροµβίνη σε θροµβίνη, σε ποσότητες, ικανές να δηµιουργήσουν θρόµβο ινικής. Οι παράγοντες VIIIa και Va, προέρχονται από τις αρχικές µικρές ποσότητες θροµβίνης που δηµιουργήθηκε στο περιβάλλον του TF, και συνδέθηκαν µε τα ενεργοποιηµένα αιµοπετάλια πριν την σύνδεση σ αυτά του παράγοντα ΙΧ. Το σήµα της ενεργοποίησης των αιµοπεταλίων φαίνεται ότι είναι η θροµβίνη που δηµιουργείται από την προηγούµενη φάση που περιγράφηκε παραπάνω, ενώ η δηµιουργία του IXa από το TF/VIIa δρα σαν ερέθισµα για την δηµιουργία σηµαντικής ποσότητας θροµβίνης από τα ενεργοποιηµένα αιµοπετάλια. 32

33 Ο ρόλος του παράγοντα ΧΙ: Πρόσφατα αποδείχτηκε ότι η θροµβίνη και ο παράγων Χa, µπορούν να ενεργοποιήσουν τον παράγοντα ΧΙ, παρουσία ενεργοποιηµένων αιµοπεταλίων και εν τη απουσία των άλλων παραγόντων επαφής, όπως ο παράγων ΧΙΙ, η προκαλικρείνη (ΡΚ) και το κινινογόνο υψηλού µοριακού βάρους (ΗΚ). Η ενεργοποίηση του παράγοντα ΧΙ από την θροµβίνη είναι µία εναλλακτική οδός της ενεργοποίησης του παράγοντα ΧΙ και ενισχύεται από τις κλινικές παρατηρήσεις, ότι οι ασθενείς µε ανεπάρκεια του παράγοντα ΧΙΙ, ΡΚ και ΗΚ, δεν εκδηλώνουν αιµορραγική διάθεση. Επιπλέον, διαπιστώνουµε ότι ο ρόλος του παράγοντα ΧΙ, περιορίζεται απλά στην ενίσχυση της δηµιουργίας θροµβίνης, µετατρέποντας όλο και περισσότερο παράγοντα ΙΧ σε ΙΧa, µια αντίδραση που είναι προσθετική στην δηµιουργία ΙΧa από το σύµπλεγµα TF / VIIa. Θα πρέπει να σηµειώσουµε ότι υπάρχουν ποικίλοι µηχανισµοί ανάδρασης (feedback )στο σύστηµα που επηρεάζουν την λειτουργία του. Ο πιο σηµαντικός από αυτούς είναι αυτός της θροµβίνης, όπου ίχνη θροµβίνης, όταν αυτή δηµιουργηθεί, µπορούν να αυξήσουν την δραστικότητα των παραγόντων VIII και V πολλές χιλιάδες φορές και να προκαλέσουν έτσι την δηµιουργία και άλλης θροµβίνης. Όταν δηµιουργηθούν µεγάλες ποσότητες θροµβίνης, οι ενεργοποιηµένοι παράγοντες V και VIII καταστρέφονται. Αυτοί και άλλοι µηχανισµοί ανάδρασης παίζουν ένα ρόλο στην αυστηρά τοπικά δηµιουργία ινικής. Όλοι οι προαναφερόµενοι παράγοντες, εκτός από τον παράγοντα vonwillebrand, συντίθενται στο ήπαρ. Ο παράγων vonwillebrand συντίθεται στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Συνεπώς η λειτουργικότητα του ήπατος παίζει πρωταρχικό ρόλο στην σωστή λειτουργία του πηκτικού µηχανισµού. Σε φυσιολογικές συνθήκες, η ενεργοποίηση των παραγόντων της πήξης δεν παρατηρείται στην κυκλοφορία. Όπως δείξαµε προηγουµένως, ο καταρράκτης της πήξης αρχίζει τοπικά, στο σηµείο της βλάβης. Η διάχυτη ενεργοποίηση της πήξης στην κυκλοφορία, προλαµβάνεται από µια σειρά αναστολέων των ενεργοποιηµένων παραγόντων πήξης. Κυρίαρχος µεταξύ αυτών είναι η Αντιθροµβίνη ( παλαιός όρος 33

34 Αντιθροµβίνη ΙΙΙ), η οποία δηµιουργεί σύµπλεγµα µε τους ενεργοποιηµένους παράγοντες, αναστέλλοντας την δράση τους, και κυρίως της θροµβίνης και του παράγοντα Χa. Έτσι, ακόµη και ίχνη ενεργοποιηµένων παραγόντων, όταν εισέλθουν στην κυκλοφορία, γρήγορα απενεργοποιούνται. Άλλοι ανασταλτές είναι: Οι Πρωτεΐνες C και S οι οποίες συντίθενται στο ήπαρ υπό την επίδραση της βιταµίνης Κ. Φυσιολογικά είναι αδρανείς, αλλά ενεργοποιούνται από την δράση της θροµβίνης. Σε συνδυασµό, µπορούν να απενεργοποιήσουν τους παράγοντες Va και VIIIa. Σχετικά πρόσφατα ανακαλύφτηκε ένας καινούργιος ανασταλτής, πού αναστέλλει την δραστηριότητα της εξωγενούς οδού και ονοµάστηκε ανασταλτής της οδού του ιστικού παράγοντα (TFPI). Ο ρόλος του στον έλεγχο της αιµόστασης δεν έχει πλήρως διευκρινισθεί. Άλλοι ανασταλτές της αιµόστασης είναι: ο C1 ανασταλτής, η α2-µακροσφαιρίνη και η α1-αντιθρυψίνη. Αυτοί οι ανασταλτές, αναστέλλουν ενεργοποιηµένους παράγοντες πήξης in vitro και δρουν σαν επικουρικοί ανασταλτές όταν οι κύριοι ανασταλτές έχουν εξαντληθεί, όπως στην διάχυτη ενδαγγειακή πήξη. Η δράση των ανασταλτών διασφαλίζει τον σχηµατισµό ινικής τοπικά, στο σηµείο της αγγειακής βλάβης, και µ αυτόν τον τρόπο δεν διαχέεται το φαινόµενο της πήξης στην κυκλοφορία, διασφαλίζοντας έτσι τον οργανισµό από την διάχυτη ενδαγγειακή πήξη. Τα ενδοθήλια των αγγείων παίζουν τον ρόλο του φραγµού µεταξύ του κυκλοφορούντος αίµατος και των εξωαγγειακών ιστών. Το ενδοθήλιο επίσης, παράγει γλυκοσαµινογλυκάνες, ουσίες τύπου ηπαρίνης µε αντιπηκτική δράση, οι οποίες προφυλάσσουν από την ανεπιθύµητη δηµιουργία ινικής, και τέλος θροµβοµοδουλίνη, η οποία βοηθά την θροµβίνη στην ενεργοποίηση της πρωτεΐνης C, µε την ήδη αναφερόµενη αντιπηκτική δράση. Τελικά το ενδοθήλιο παράγει προστακυκλίνη (µέσω του µεταβολισµού του αραχιδονικού οξέως), που είναι ισχυρός ανασταλτής της συγκόλλησης των αιµοπεταλίων και ισχυρός αγγειοδιασταλτής. Τα αιµοπετάλια δεν είναι απαραίτητα για της δηµιουργία ινικής, αλλά η παρουσία τους ενισχύει σηµαντικά την ταχύτητα µε την οποία 34

35 δηµιουργείται η θροµβίνη, προσφέροντας τα φωσφολιπίδια της αιµοπεταλιακής µεµβράνης που είναι απαραίτητα σε διάφορες φάσεις του καταρράκτη της πήξης. Στις περιπτώσεις θροµβοπενίας, η αιµορραγία που παρατηρείται, οφείλεται κυρίως στην ανεπάρκεια δηµιουργίας αιµοπεταλιακού θρόµβου και λιγότερο στην ανεπάρκεια δηµιουργίας ινικής. 4. Το ινωδολυτικό σύστηµα Το ινωδολυτικό σύστηµα ευθύνεται για την αποδόµηση της ινικής, όταν η λειτουργία της ως επιδιορθωτής της αγγειακής βλάβης τελειώσει. Μ αυτόν τον µηχανισµό, αποκαθίσταται η κυκλοφορία στο προσβεβληµένο αγγείο που είχε αποφραχτεί από τον αιµοστατικό θρόµβο. Το τελικό προϊόν του συστήµατος είναι η δηµιουργία πλασµίνης, η οποία είναι ένα πρωτεολυτικό ένζυµο, που δρα στην ινική του θρόµβου. Ελεύθερη πλασµίνη στην κυκλοφορία σπανίως συναντάται, αλλά δηµιουργείται και δρα τοπικά στην επιφάνεια της δηµιουργηµένης ινικής. Ο πρώτος παράγων αυτού του συστήµατος είναι το πλασµινογόνο. Πρόκειται για ένα αδρανές προένζυµο, µονής αλύσου, µε µοριακό βάρος 80 kda. Πολλοί εσωτερικοί δισουλφιδικοί δεσµοί, προσδίδουν στο µόριο µοναδικές ιδιότητες. Το σπάσιµο ενός εξ αυτών των δεσµών (Arg Val 561), µετατρέπει την πρωτεΐνη της µονής αλύσου σε πρωτεΐνη διπλής αλύσου, από προένζυµο σε ενεργό ένζυµο, την πλασµίνη, µια πρωτεάση µε σερίνη ως ενεργό κέντρο, που µε την µετατροπή εµφανίζεται στην ελαφρά ή β-άλυσο της πρωτεΐνης. Η βαριά άλυσος της πρωτεΐνης περιέχει τον επίτοπο που ευθύνεται για την αλληλεπίδραση της πλασµίνης µε την επιφάνεια της ινικής και τον κύριο ανασταλτή της, την α2- αντιπλασµίνη. Έχουν ταυτοποιηθεί δύο κύριοι φυσιολογικοί ενεργοποιητές που µετατρέπουν το πλασµινογόνο σε πλασµίνη. Ο πρώτος ενεργοποιητής είναι η ουροκινάση (u-pa), που ανακαλύφτηκε αρχικά στα ούρα, αλλά είναι σήµερα γνωστό ότι κυκλοφορεί σε µικρές ποσότητες και στο αίµα. Υπάρχει σε δύο µορφές, ως προένζυµο (προ-u-pa), που έχει µεν συγγένεια για την ινική αλλά µικρή ενζυµατική δράση, και δεύτερον σαν 35

36 ενεργό ένζυµο, µε µοριακό βάρος από 50-30kDa. Η µετατροπή του προενζύµου σε ενεργό ένζυµο προάγεται από ίχνη πλασµίνης. Το u-pa µετατρέπει το πλασµινογόνο σε πλασµίνη, δεν έχει αντιγονικότητα στον άνθρωπο, είναι µία ανθρώπινη πρωτεΐνη, και γι αυτό χρησιµοποιείται θεραπευτικά. Η ενεργός µορφή, σε αντίθεση µε το προένζυµο, έχει µικρή ειδική συγγένεια για την ινική, και αυτό είναι ένα µειονέκτηµα στην θεραπευτική του χρήση. Ο δύτερος ενεργοποιητής του πλασµινογόνου είναι ο ιστικός ενεργοποιητής του πλασµινογόνου (t-pa). Παράγεται από το αγγειακό ενδοθήλιο αλλά βρίσκεται και σε πολλούς συµπαγείς ιστούς. Έχει µοριακό βάρος περίπου 70kDa, και είναι ο κύριος ενεργοποιητής του πλασµινογόνου που κυκλοφορεί στο αίµα. Τα φυσιολογικά επίπεδα στο αίµα είναι χαµηλά, εµφανίζει ηµερήσιο ρυθµό, και απελευθερώνεται στην κυκλοφορία από ερεθίσµατα, όπως η µυϊκή άσκηση και η οξεία φλεβική απόφραξη. Η κύρια ιδιότητα του t-pa είναι η µεγάλη του συγγένεια για την ινική, και απορροφάται γρήγορα από όλα τα µόρια που έχουν µια δοµή όµοια µε αυτή του πλασµινογόνου. Αυτή η µεγάλη συγγένειά του για την ινική, του προσδίδει ένα θεωρητικό πλεονέκτηµα στην χρήση του ως θεραπευτικός θροµβολυτικός παράγων. Έλεγχος του ινωδολυτικού συστήµατος στην κυκλοφορία. Τα ενεργά ένζυµα του ινωδολυτικού συστήµατος υπόκεινται σε έλεγχο στην κυκλοφορία από ανασταλτικές πρωτεΐνες. Ο σηµαντικότερος ανασταλτής της πλασµίνης είναι η α2- αντιπλασµίνη. Αυτή η πρωτεΐνη, µε µοριακό βάρος 70kDa, δηµιουργεί ένα µοριακό σύµπλεγµα 1/1 µε την πλασµίνη. Αυτή η αντίδραση είναι ταχύτατη, έτσι κάθε µόριο πλασµίνης που δηµιουργείται στην κυκλοφορία, εξουδετερώνεται άµεσα, προφυλάσσοντας έτσι τις πρωτεΐνες του πηκτικού µηχανισµού που κυκλοφορούν στο αίµα, (όπως το ινωδογόνο), από την πρωτεολυτική δράση της πλασµίνης. Το σύµπλεγµα πλασµίνης -α2 αντιπλασµίνης, αφού δηµιουργηθεί, αποµακρύνεται γρήγορα από την κυκλοφορία µέσω του ήπατος. Οι ανασταλτές των ενεργοποιητών του πλασµινογόνου, ανακαλύφτηκαν τα τελευταία χρόνια και είναι δύο τον αριθµό. Ο 36

37 κυριότερος είναι ο ανασταλτής του ενεργοποιητή του πλασµινογόνου 1 (PAI-1), ανιχνεύεται στο περιφερικό αίµα και σχηµατίζει αµέσως σύµπλεγµα µε κάθε µόριο t-pa που κυκλοφορεί. Σε φυσιολογικές συνθήκες, κάθε µόριο t-pa, είναι συνδεδεµένο µε το PAI-1, και δεν είναι διαθέσιµο για την µετατροπή του πλασµινογόνου σε πλασµίνη. Το PAI-1, εκτός από το πλάσµα βρίσκεται σε µεγάλες ποσότητες και στα αιµοπετάλια, και πιστεύεται ότι αυτό το µόριο που βρίσκεται στα αιµοπετάλια είναι πιο δραστικό από αυτό που κυκλοφορεί ελεύθερο στο αίµα. Οι µεγάλες ποσότητες PAI-1 που βρίσκονται στα αιµοπετάλια, σηµαίνουν ότι ο αιµοστατικός θρόµβος είναι πλούσιος σε ανασταλτές του ενεργοποιητή του πλασµινογόνου και είναι σχετικά ανθεκτικός στην λύση. Ο δεύτερος ανασταλτής του ενεργοποιητού του πλασµινογόνου (PAI-2), παράγεται στον πλακούντα και ανιχνεύεται σε µεγάλες ποσότητες στο αίµα των εγκύων γυναικών. Ίχνη αυτού του ανασταλτή υπάρχουν στα λεµφοειδή κύτταρα µη εγκύων γυναικών, αλλά η λειτουργία του είναι άγνωστη. Μια χαρακτηριστική ιδιότητα των πρωτεϊνών του ινωδολυτικού συστήµατος είναι η συγγένειά τους για την ινική. Το πλασµινογόνο και το t-pa, προσροφούνται από τις επιφάνειες της δηµιουργηµένης ινικής, µέσου των συνδετικών σηµείων της. Όταν προσροφηθούν από την ινική, δεν µπορούν πια να συνδεθούν µε τους ανασταλτές τους. Έτσι, στην επιφάνεια της ινικής, το πλασµινογόνο και ο ενεργοποιητής του, βρίσκονται πολύ κοντά ώστε να δηµιουργήσουν πλασµίνη τοπικά, η οποία λύει τις εναποθέσεις της ινικής. Αυτό αφήνει την δυναµικότητα του συστήµατος να εστιάζεται στην επιφάνεια των εναποθέσεων της ινικής. Οι ενεργοποιητές του πλασµινογόνου, και κάθε µόριο πλασµίνης που θα δηµιουργηθεί στην κυκλοφορία, γρήγορα δηµιουργεί σύµπλεγµα µε τον αναστολέα του στα σηµεία σύνδεσης της λυσίνης. Έτσι κάθε ανεπιθύµητη πρωτεολυτική δραστηριότητα της πλασµίνης εξουδετερώνεται στο περιφερικό αίµα. Ενίοτε, εάν µεγάλες ποσότητες ενεργοποιητών του πλασµινογόνου περάσουν στην κυκλοφορία, συνήθως σαν αποτέλεσµα εκτεταµένων ιστικών βλαβών, έχουµε κορεσµό των ανασταλτών, µε αποτέλεσµα να δηµιουργούνται κάποια ποσοστά ελεύθερης πλασµίνης. Αυτό έχει σαν αποτέλεσµα την άµεση πρωτεολυτική δράση της πλασµίνης στο ινωδογόνο και άλλους παράγοντες της πήξης, όπως οι 37

38 παράγοντες V και VIII, µε αποτέλεσµα την εκδήλωση αιµορραγικής διάθεσης όπως κατά την διάρκεια µεγάλων χειρουργικών επεµβάσεων. Ευκαιριακά, υπερινωδόλυση µπορεί να έχουµε σαν αποτέλεσµα απελευθέρωσης ενεργοποιητών του πλασµινογόνου από τα κακοήθη κύτταρα συµπαγών όγκων, µε αποτέλεσµα υπερινωδόλυση και αιµορραγία. Όταν οι κύριοι ανασταλτές της ινωδόλυσης, α2-αντιπλασµίνη και PAI-1, έχουν εξαντληθεί από καταστάσεις που προανέφερα, προσκαλούνται άλλοι ανασταλτές, εξουδετερώνοντας την δράση των ενεργοποιητών του πλασµινογόνου και της πλασµίνης: Τέτοιοι ανασταλτές είναι η α2-µακροσφαιρίνη και ο C1-ανασταλτής της εστεράσης. Το ήπαρ παίζει σηµαντικό ρόλο και στην ινωδόλυση. Το πλασµινογόνο, η α2-αντιπλασµίνη και ο PAI-1, συντίθενται στο ήπαρ. Η ηπατική ανεπάρκεια, έχει σαν αποτέλεσµα την µειωµένη παραγωγή αυτών των παραγόντων µε αποτέλεσµα παθολογική ινωδόλυση. Επί πλέον, το ήπαρ, αποµακρύνει από την κυκλοφορία τους ενεργοποιητές του πλασµινογόνου και ενδεχοµένως την πλασµίνη, σε µορφή ελεύθερη ή σε σύµπλεγµα µε τους ανασταλτές τους. Τα αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα παίζουν επίσης σηµαντικό ρόλο στην ινωδόλυση. Ο t-pa, συντίθεται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα, και είναι η κύρια πηγή του t-pa που κυκλοφορεί στην περιφέρεια. Σε περιπτώσεις φυσικής άσκησης και οξείας απόφραξης αγγείου, το ενδοθήλιο απελευθερώνει µεγάλες ποσότητες t-pa. 38

39 Γ. ΙΑΤΑΡΑΧΕΣ ΑΙΜΟΣΤΑΣΗΣ ΣΤΗΝ ΟΞΕΙΑ ΛΕΥΧΑΙΜΙΑ Οι αιµορραγικές και οι θροµβωτικές επιπλοκές παρατηρούνται συχνά στην οξεία λευχαιµία 75,164. Σήµερα το 15% περίπου των θανάτων από οξεία λευχαιµία, οφείλεται σε αιµορραγία. Οι µικρές αιµορραγίες είναι ένα πρώιµο σύµπτωµα της νόσου και συνήθως οφείλεται στην υπάρχουσα θροµβοπενία. Οι θροµβωτικές επιπλοκές είναι επίσης συχνές στην οξεία λευχαιµία, συµπεριλαµβανοµένου του συνδρόµου υπεργλοιότητας 145. Για τις διαταραχές αυτές υπεύθυνα είναι όλα τα µέρη της αιµόστασης, συµπεριλαµβανοµένων των αγγείων, των αιµοπεταλίων, του πηκτικού µηχανισµού και της ινωδόλυσης. Το 35% των ασθενών µε ΟΛ παρουσιάζουν υψηλά επίπεδα ινωδογόνου, ενώ µόνο το 8%, παρουσιάζει υποϊνωδογοναιµία, αλλά αυτό το ποσοστό αυξάνεται στο 85% εάν αναφερθούµε µόνο στην ΑML-M3. Χαµηλά επίπεδα των παραγόντων V, VII, X και ΧΙΙΙ, παρατηρήθηκαν στο 30% των ασθενών, ενώ δεν υπάρχουν ενδείξεις για έλλειψη του παράγοντα VIII. εν είναι πάντα γνωστό εάν αυτές οι αλλαγές οφείλονται σε διαταραχές της σύνθεσης των παραγόντων ή σε αντισώµατα που στρέφονται εναντίων αυτών των πρωτεϊνών (επίκτητη αιµορροφιλία). Μελέτες που αφορούν την ινωδόλυση στην ΟΛ, έδειξαν ότι στο 15% των ασθενών υπάρχει υπερινωδόλυση. Τα ίδια τα λευχαιµικά κύτταρα φαίνεται ότι ευθύνονται γι αυτό. Πράγµατι, σε διάφορες µελέτες έχει αποδειχτεί ότι κυτταρικά κοκκία που περιέχουν πρωτεολυτικά ένζυµα τύπου τρυψίνης, υπάρχουν στους µυελοβλάστες, στα προµυελοκύτταρα και τους µονοβλάστες. Άλλες µελέτες έχουν δείξει έλλειψη της α2-αντιπλασµίνης στην οξεία προµυελοκυτταρική λευχαιµία. Τα προµυελοκύτταρα της Μ3, περιέχουν ενεργοποιητές της ινωδόλυσης µε δράση τύπου πλασµίνης. Επίσης, ουσίες τύπου ελαστάσης, ικανές να αποδοµήσουν το ινωδογόνο, την ινική και τους παράγοντες V, VII, XI, και ΧΙΙ, υπάρχουν στα λευχαιµικά κύτταρα και πιστεύεται ότι συµβάλλουν στην ινωδόλυση που παρατηρείται. Η διάχυτη ενδαγγειακή πήξη (DIC) παρατηρείται µε αυξηµένη συχνότητα στην ΟΛ 146, κυρίως κατά την υποτροπή της νόσου, 39

40 όταν τα λευχαιµικά κύτταρα είναι άφθονα και οι ενδοκυττάριοι ενεργοποιητές της πήξης απελευθερώνονται σε µεγάλες ποσότητες στην κυκλοφορία. H DIC 191 είναι πιο συχνή επιπλοκή στην υπερκοκκιώδη οξεία προµυελοκυτταρική λευχαιµία, στην οποία µεγάλα πρωτοπαθή κοκκία και σωµάτια Auer είναι εµφανή. Η σπάνια υποκοκκιώδης µορφή της Μ3-ΟΜΛ, έχει όµως και αυτή την ίδια ροπή για την DIC. Η DIC είναι επίσης συχνή στην οξεία µονοκυτταρική λευχαιµία 162, αλλά µπορεί να συνοδεύει οποιονδήποτε τύπο λευχαιµίας, ακόµη και την οξεία λεµφοβλαστική 188. Η θεραπεία µε κυτταροτοξικά φάρµακα, µπορεί ευκαιριακά να αυξήσει την σοβαρότητα της DIC 156, αυξάνοντας την θνησιµότητα κατά την διάρκεια της προσπάθειας επίτευξης ύφεσης, εκτός και αν η διαταραχή έχει ελεγχθεί πριν την χορήγηση των κυτταροστατικών φαρµάκων. Τυπικά στην DIC έχουµε µειωµένα επίπεδα πολλών πηκτικών παραγόντων, όπως των V, VIII, X, της προθροµβίνης, του ινωδογόνου, καθώς και των αιµοπεταλίων. Η ινωδόλυση 73 ενεργοποιείται επίσης δευτερογενώς και απελευθερώνει στη κυκλοφορία προϊόντα αποδόµησης του ινωδογόνου και της ινικής (FDP) 175,176. Ενίοτε, επειδή τα αιµοπετάλια στην ΟΛ είναι µειωµένα λόγω της µη παραγωγής τους και το ινωδογόνο αυξηµένο, η διάγνωση της DIC διαφεύγει. Η ενεργοποίηση της πήξης από το λευχαιµικό κύτταρο 59 φαίνεται ότι παίζει σηµαντικό ρόλο στην πρόκληση διαταραχών στην αιµόσταση, οι οποίες στην συνέχεια προκαλούν θροµβωτικές επιπλοκές. Μέχρι σήµερα έχουν ταυτοποιηθεί τρεις ενεργοποιητές της πήξης που προέρχονται από το λευχαιµικό κύτταρο: Ο ιστικός παράγων (TF) και η έκφραση του γονιδιώµατος αυτού από λευχαιµικά κύτταρα 8,118, µια γλυκοπρωτείνη η οποία συνδέεται µε τον παράγοντα VII παρουσία ιόντων Ca, ενεργοποιούν τον παράγοντα Χ και ΧΙ, µε τελικό αποτέλεσµα την δηµιουργία θροµβίνης, ινικής, που παγιδεύουν τα αιµοπετάλια και επιβαρύνουν επί πλέον την θροµβοπενία. Ένας υποδοχέας για τον παράγοντα V στην επιφάνεια των λευχαιµικών κυττάρων, ο οποίος διευκολύνει την σύνδεση του 40

41 συµπλέγµατος της προθροµβίνης, αυξάνοντας την αποδοτικότητά του κατά φορές, Ο καρκινικός πηκτικός παράγοντας, µια κυστεινική πρωτεάση για την ικανότητα του οποίου να προκαλεί θροµβωτικά φαινόµενα στην ΟΛ θα αναφερθούµε εκτενέστερα στην συνέχεια. Αντιπηκτικοί παράγοντες τύπου ηπαρίνης έχουν περιγραφτεί στην ΟΜΛ-Μ5, έλλειψη των πρωτεϊνών S και C, καθώς και της αντιθροµβίνης ΙΙΙ 76, έχουν επίσης περιγραφεί. Τα χηµειοθεραπευτικά φάρµακα µπορούν να επηρεάσουν την αιµόσταση 187. Η τοξική δράση των φαρµάκων στο ήπαρ 157 και στο γαστρεντερικό σύστηµα, µπορούν να ελαττώσουν την παραγωγή των πηκτικών παραγόντων, ενώ τα χαµηλά επίπεδα του ινωδογόνου και άλλων πηκτικών παραγόντων που συντίθενται στο ήπαρ µπορεί να είναι αποτέλεσµα ηπατοτοξικότητας οφειλόµενης σε αντιµεταβολίτες, στεροειδή, και ειδικά της L-ασπαραγινάσης. Συµπερασµατικά θα λέγαµε ότι κάθε µέρος της αιµόστασης συµµετέχει στην παθογένεση των διαταραχών της αιµόστασης που παρατηρούνται στην ΟΛ. 41

42 . ΚΑΡΚΙΝΙΚΟΣ ΠΗΚΤΙΚΟΣ ΠΑΡΑΓΩΝ Εισαγωγή Οι αιµοστατικές διαταραχές είναι ένα κοινό εύρηµα που συχνά συνοδεύει ποικίλες νεοπλασµατικές νόσους 150,151,139. Η υπερπηκτικότητα που παρατηρείται σ αυτούς τους ασθενείς, έχει σχέση µε την παρουσία καρκινικού ιστού και εξαφανίζεται µε την χειρουργική αφαίρεση του όγκου, όπως αποδείχτηκε και εργαστηριακά στα πειραµατόζωα 154,182. Οι νεοπλασµατικοί ιστοί µπορούν να παράγουν άµεσα ή έµµεσα ενεργοποιητές του πηκτικού µηχανισµού, καθώς και ανασταλτές ή ενεργοποιητές της ινωδόλυσης. Στον πίνακα που ακολουθεί αναφέρονται ορισµένες από αυτές τις ουσίες που λειτουργούν σαν ενεργοποιητές του πηκτικού µηχανισµού στους ασθενείς µε καρκίνο. Πίνακας 1: Ενεργοποιητές του πηκτικού µηχανισµού από κακοήθη κύτταρα Ιστικός παράγων (TF) 95, 103, 123, 179 Ιστικός παράγων / παράγων VII (TF/FVIII) 56, 60, 118 Καρκινικός πηκτικός παράγων (CP) ΕC 3,4,22,26 54, 61, 65, 80, 132 HLA-DR (;) 40 Συµπλήρωµα και ιστικός παράγων (CMTF) 185, 124, 34 Βλέννη (;) 147 Αιµοπετάλια /ενεργοποιητής του παράγοντα-χ(paa/pca)36, 37, 144, 94 Λιπαρά οξέα / αλβουµίνη (;) 140 Σερινική πρωτεάση ενεργοποιητής του παράγοντα Χ(;) 143 Σερινική πρωτεάση τύπου προθροµβινάσης (;) 173 Ενεργοποιητής καρκινικής προέλευσης. 108 Μακροφάγα 103 (;) Σηµειώνονται οι ενεργοποιητές των οποίων η ύπαρξη δεν έχει επιβεβαιωθεί. Στην παρούσα µελέτη θα αναφερθούν αναλυτικά οι βιοχηµικές και βιολογικές ιδιότητες του καρκινικού πηκτικού παράγοντα (CP) ΕC 3,4,22,26, καθώς και οι πιθανές διαγνωστικές και θεραπευτικές αξίες του. 42

43 1. Η ανακάλυψη του καρκινικού πηκτικού παράγοντα ΕC 3,4,22,26 Οι πρώτες δηµοσιεύσεις από διάφορα εργαστήρια, περιέγραψαν ενεργοποιητικές ουσίες του πηκτικού µηχανισµού, αλλά ποτέ δεν ταυτοποιήθηκαν πλήρως. Σε αυτές τις µελέτες αναφέρονται ουσίες από καρκινικούς ιστούς, µε µοριακό βάρος όµοιο µε την αλβουµίνη του ορού (ΜΒ = ), που είχαν την ιδιότητα να µικραίνουν τον χρόνο επανασβέστωσης του πλάσµατος 141. Άλλες µελέτες αναφέρονταν σε ουσίες που µπορούσαν να ενεργοποιούν άµεσα τον παράγοντα Χ, χωρίς όµως πρωτεολυτική δραστηριότητα 147. Οι πρώτες περιγραφές της δράσης του CP από εκχυλίσµατα κυττάρων του καρκίνου V2 των κουνελιών 83, το 1975, έδειξαν την ικανότητα αυτού του παράγοντα να µικραίνει τον χρόνο επανασβέστωσης του φυσιολογικού πλάσµατος καθώς και πλάσµατος µε έλλειψη του παράγοντα VII. Η δραστηριότητα αυτού, µπορούσε να ανασταλεί από διαλύµατα diisopropylfluorophosphate (DFP). Και τα δύο αυτά χαρακτηριστικά διαχώρισαν τον CP από τον ιστικό παράγοντα (TF), και παράλληλα απέδιδαν σ αυτόν πρωτεολυτικές ιδιότητες. Λόγω της αναστολής του παράγοντα από το (DFP), αρχικά θεωρήθηκε ότι ο CP ήταν µιά σερινική πρωτεάση. Αργότερα έγιναν προσπάθειες να ραδιοσηµάνουν τον ενεργό επίτοπο µε ραδιοσεσηµασµένο DFP και απέτυχαν. Παράλληλα διαπιστώθηκε ότι το ιδανικό ph δράσης αυτής της ουσίας ήταν χαµηλότερο από αυτό των σερινικών πρωτεασών. Το συµπέρασµα όλων αυτών των παρατηρήσεων ήταν ότι ο CP ήταν µια κυστεινική πρωτεάση, και η αναστολή του από τον DFP, είχε προκληθεί από µειωµένη καθαρότητα των διαλυµάτων του DFP 81. Αρχικά το όνοµά του ήταν CPA, πιστεύοντας ότι υπήρχαν περισσότεροι του ενός ισότυποι του ενζύµου στους διάφορους ιστούς και στα διαφορετικά είδη. Σήµερα είναι γνωστό ότι υπάρχει µόνο ένας τύπος, χαρακτηρίζοντας το ένζυµο ως καρκινικός πηκτικός παράγων (CP) ΕC 3,4,22,

44 2. Ο καρκινικός πηκτικός παράγων (CP) ΕC 3,4,22,26 σε φυσιολογικούς και νεοπλασµατικούς ιστούς Ο CP ταυτοποιήθηκε σε πολλά κακοήθη κύτταρα ανθρωπίνων ιστών καθώς και ιστών από πειραµατόζωα. Στον Πίνακα 2 αναφέρονται τα µέχρι σήµερα γνωστά. Τα ενζυµατικά και ανοσολογικά χαρακτηριστικά του CP από τα διάφορα είδη και τους διάφορους ιστούς είναι σχεδόν ίδια. Ο CP του ανθρωπίνου µελανώµατος 54, των ανθρώπινων λευχαιµικών κυττάρων 61, του µελανώµατος του ποντικού B16 74, του σαρκώµατος JW και του καρκινώµατος του πνεύµονος Lewis 65, έδειξαν µε την µέθοδο της ανοσοδιάχυσης, ανοσολογικές οµοιότητες, ενώ είναι ενζυµατικά αδιαχώριστοι από τον CP που αποµονώθηκε και καθαρίστηκε από το V2 καρκίνωµα του επίµυος. Εκχυλίσµατα από ανθρώπινο amnionchorion 85,66, ένας ιστός που προέρχεται από το έµβρυο, εµφανίζουν δραστηριότητα τύπου CP, µε σχεδόν ταυτόσηµα ενζυµατικά και ανοσολογικά χαρακτηριστικά µε τον CP από το V2 καρκίνωµα του επίµυος. Πρόκειται δια µικρές διαφορές στην σύνθεση των αµινοξέων µεταξύ του ενζύµου που προέρχεται από το V2 καρκίνωµα του επίµυος και αυτού που προέρχεται από τον amnio-chorion ιστό 66. Έτσι λοιπόν, µέχρι πρόσφατα, ο CP φαινόταν ότι είναι µια πρωτεΐνη που διατηρήθηκε µεταξύ των ειδών, και έχει τα χαρακτηριστικά µιας καρκινοεµβρυικής πρωτεΐνης. Νέα µονοκλωνικά αντισώµατα IgG, προελεύσεως ποντικού, κατά του ανθρώπινου CP, δεν αντιδρούν µε τον CP του µελανώµατος Β16 και του καρκινώµατος V2. Τα αρχικά αντισώµατα έναντι του CP, αντιδρούσαν µε επιτόπους της κεκαθαρµένης πρωτεΐνης που ήταν ανοσολογικά ίδιοι, ή πάρα πολύ όµοιοι, ενώ τα νέα αντισώµατα αντιδρούν µε επιτόπους που είναι διαφορετικοί. Αυτές οι πρόσφατες παρατηρήσεις, δείχνουν για πρώτη φορά, ότι µπορεί να υπάρχουν διαφορές στον CP µεταξύ των ειδών. 44

45 Πίνακας 2 Είδη / Κακοήθεις ιστοί Άνθρωπος Ηπάτωµα 81 Καρκίνωµα πνεύµονος 83, 91 Καρκίνωµα µαστού 94, 81, 129, 130, 181 Καρκίνωµα / αδενοκαρκίνωµα νεφρού 80 Καρκίνωµα / αδενοκαρκίνωµα παχέως εντέρου 81, 181 Καρκίνωµα / αδενοκαρκίνωµα λεπτού εντέρου 181 Χονδροσάρκωµα 80 Επιθηλιακό καρκίνωµα παροτίδος 181 Λιποσάρκωµα κοιλιάς 81, 181 Νευροβλάστωµα ήπατος 80 Καρκίνωµα γλώσσης 181 Μελάνωµα 54, 80 Κακόηθες ινώδες ιστιοκύττωµα 181 Γλοίωµα 140, 152 Βασικοκυτταρικό καρκίνωµα 181 Οξεία Μυελοβλαστική λευχαιµία 61 Λεµφοβλαστική λευχαιµία 2 Κουνέλι Καρκίνωµα V2 62, 90 Hamster Mεταλλαγµένοι ινωβλάστες SV-40 89, 171 Επίµυς Σάρκωµα Walker Επιθηλίωµα Guerin 129 Ποντικος Καρκίνωµα B16 78 Καρκίνωµα πνεύµονος Lewis 132, 65, 104 Σάρκωµα JW 65, 48 Καρκίνωµα Ehrlich 49 Έµβρυο Αµνιακοί και χοριακοί ιστοί 85, 66 Ο CP ανιχνεύτηκε σε εκχυλίσµατα από δείγµατα ανθρωπίνων νεοπλασµατικών ιστών παχέος εντέρου, µαστού, πνεύµονος και νεφρού, αλλά όχι σε εκχυλίσµατα από αυτόλογους φυσιολογικούς ιστούς 86. ιαπιστώθηκε επίσης από τους Donati και συν 54, ότι η δραστηριότητα τύπου CP από εκχυλίσµατα ανθρώπινου µεταστατικού µελανώµατος, ήταν περίπου τέσσερις φορές µεγαλύτερη από την αντίστοιχη του πρωτοπαθούς όγκου. Φυσικά δεν βρέθηκε δραστηριότητα CP σε 45

46 φυσιολογικούς σπίλους. Αντίστοιχες παρατηρήσεις για διαφορετικούς όγκους έχουν διαπιστωθεί και από άλλους ερευνητές 54,132. Από τα αναφερόµενα συµπεραίνουµε ότι ο CP παράγεται από κακοήθεις ιστούς και όχι από τα αντίστοιχα φυσιολογικά διαφοροποιηµένα κύτταρα. Στην πορεία των µελετών ως προς τον CP σε νεοπλασµατικά κύτταρα, χρησιµοποιήθηκαν δύο διαφορετικές προσεγγίσεις: 1) καλλιέργειες κυττάρων από πρωτοπαθείς όγκους ή διάφορες κυτταρικές σειρές που αναπτύχθηκαν σε ιστικές καλλιέργειες, και, στην συνέχεια είτε το υπερκείµενο των καλλιεργειών είτε τα εκχυλίσµατα των καλλιεργούµενων κυττάρων, ελέγχθηκαν για ενεργοποιητές της πήξης, και 2) ελέγχθηκαν άµεσα, τµήµατα όγκων ή εκχυλίσµατα αυτών προερχόµενα από πειραµατικούς όγκους. Παρ ότι η δεύτερη µέθοδος φαίνεται να έχει το πλεονέκτηµα της µελέτης καθαρού πληθυσµού καρκινικών κυττάρων, οι δύο µέθοδοι έδειξαν διαφορετικά αποτελέσµατα. Τα εκχυλίσµατα από φρέσκα κύτταρα κακοήθη ιστών, παρουσίασαν υψηλά επίπεδα δραστηριότητας CP, ενώ καλλιεργηµένα νεοπλασµατικά κύτταρα από ίδιες κυτταρικές σειρές παρουσίασαν ελάχιστη 84,47 ή καθόλου 135,47 δραστηριότητα CP. Έτσι, τα καρκινικά κύτταρα in vivo παράγουν CP, ενώ in vitro δεν φαίνεται να παράγουν αυτή την πρωτεινάση. Τα νεοσυλλεγόµενα κύτταρα από συµπαγείς όγκους, παράγουν κυρίως CP, ενώ τα ίδια κύτταρα σε καλλιέργειες κυττάρων παράγουν ιστικό παράγοντα 47,195. Η εξήγηση του φαινοµένου και ο µηχανισµός της έκφρασης των δύο διαφορετικών διεγερτών της πήξης, είναι άγνωστοι. Μία πιθανή εξήγηση µπορεί να συναχθεί από πρόσφατες µελέτες πάνω στην κυτταρική σειρά ΗΤ-29 του ανθρωπίνου καρκίνου του παχέως εντέρου. Η σύγχρονη καλλιέργεια αυτών των κυττάρων, µε ενδοθηλιακά κύτταρα, είχε σαν αποτέλεσµα την παραγωγή ενός διεγέρτη της πήξης όµοιου µε τον CP, και όχι του ιστικού παράγοντα όπως αναµενόταν. Από αυτό µπορούµε, εν µέρει, να υποθέσουµε ότι για την παραγωγή CP, χρειάζεται η συνεργασία των ενδοθηλιακών κυττάρων 120. Όπως φαίνεται από τον πίνακα 1, έχουν ταυτοποιηθεί πολλοί άλλοι ενεργοποιητές του πηκτικού µηχανισµού από διάφορους ερευνητές, στην προσπάθεια να ευρεθεί η αιτία της επιβεβαιωµένης ενεργοποίησης της 46

47 πήξης στις νεοπλασµατικές νόσους. Όµως, εκτός από τον ιστικό παράγοντα και τον CP, κανείς από αυτούς τους παράγοντες ή άλλως πρωτεϊνάσες, δεν έχει επιβεβαιωθεί, από ανεξάρτητους ερευνητές άλλων εργαστηρίων. Όλες αυτές οι παρατηρήσεις, έχουν όµως περιπλέξει πολύ την κατανόησή µας σχετικά µε τους καρκινικούς ενεργοποιητές. 3. Χηµικές και ενζυµατικές ιδιότητες του καρκινικού πηκτικού παράγοντα (CP) ΕC 3,4,22,26. O CP που αποµονώθηκε από το καρκίνωµα V2 του κουνελιού, είναι µια ενδοπεπτιδάση, µονής αλύσου, µοριακού βάρους kda, και ισοηλεκτρικού σηµείου pl = 4.8. Το µόριο του CP, περιέχει 19,1% σερίνη, 18,7% γλυκίνη, 12,5% γλουταµικό οξύ, 8,1% λυσίνη και 7,1% ασπαρτικό οξύ: δεν ανιχνεύτηκαν υδατάνθρακες 65. Η αλληλουχία των αµινοξέων του CP δεν έχει ακόµη καθοριστεί. Πίνακας 3 Αναστολή του CP ΕC 3,4,22,26 από ποικίλους ειδικούς και µη ιδικούς πρωτεϊνικούς ανασταλτές. Ανασταλτές ιάλυµα Ποσοστό αναστολής Iodoacetamide, 1.0mM 100, mM 85 Mercuric chloride, 0.1mM 100, mM 95 E-64, 0.1mM 86, 80 Peptidyl diazomethyl ketonates, 0.2mM , Peptidyl chloromethyl ketonates, 0,2mM Peptidyl dimethyl sulfonium salts 0.4mM Peptidyl trifluoromethyl ketones, 0.1mM Leupeptin 0.1mM 71 Antipain 0.1mM 87 PMSF 0.1mM 80 a1-antichymotrypsin, 20µg/ml 27 a2-macroglobulin, 20µg/ml 19 2-Vinylpyridine 0.1mM 55 Cystamine 0.1mM 0 CBZ-ValPheH 0.1mM 0 a1-antiprotease 20µg/ml 0 Antithrombin III/heparin 5µg/ml 0 Cystatin 100µg/ml 0 47

48 Ο CP (EC ) είναι µια κυστεινική πρωτεινάση, ικανή να ενεργοποιήσει in vitro και in vivo, τον πηκτικό παράγοντα X. Το σηµείο της ενζυµατικής σχάσης του παράγοντα Χ από τον CP, είναι διαφορετικό από το σηµείο σχάσης άλλων γνωστών ενεργοποιητών αυτού του παράγοντα Το κυριότερο σηµείο σχάσης του παράγοντα Χ από τον CP, είναι ο πεπτιδικός δεσµός µεταξύ Tyr-21 και Asp-22 µε προλίνη στην προτελευταία θέση 88. Το δηλητήριο της οχιάς Russel (RVV), το σύµπλεγµα παραγόντων VII/TF και ο παράγων IXa, τέµνουν τον δεσµό µεταξύ Arg-52 και Ile-53. H ενεργοποίηση του παράγοντα Χ από τον CP in vitro, δεν χρειάζεται την παρουσία φωσφολιπιδίων. Η δραστηριότητα είναι πλήρως εξαρτηµένη από τα ιόντα Ca. Το ιδανικό ph είναι µεταξύ 6,9 και 7, Η δραστικότητα του CP έναντι του παράγοντα Χ, ενισχύεται από την παρουσία µαγγανίου ( µm) στο µείγµα της αντίδρασης, αλλά ελαττώνεται από την παρουσία ψευδαργύρου και ιόντων σιδήρου 126. Έχει ελεγχθεί η δυνατότητα του παράγοντα να ενεργοποιεί τους παράγοντες της εξωγενούς οδού της πήξης, της προθροµβίνης και της µετατροπής του ινωδογόνου σε ινική, αλλά καµιά από αυτές τις δραστηριότητες δεν αποδείχτηκε 90,126. Έχει επίσης µελετηθεί η δράση του CP στην συγκολλητικότητα και την εκκριτική ικανότητα των αιµοπεταλίων χοίρου. Τα αποτελέσµατα έδειξαν ότι τα αιµοπετάλια που επωάστηκαν µε CP σε διαφορετικές πυκνότητες απελευθερώνουν αδενικά νουκλεοτίδια και πρωτεΐνες, χωρίς παράλληλα την λύση των αιµοπεταλίων. Σε σύγκριση µε την θροµβίνη, η εκκριτική αντίδραση των αιµοπεταλίων είναι µικρότερη. Η δράση της θροµβίνης, παρουσία του CP, αναστέλλεται. Ο CP δεν προκαλεί την συγκόλληση των αιµοπεταλίων 153. Όλες οι πρωτεϊνάσες που εξαρτώνται από τα ιόντα Ca, είναι επίσης εξαρτώµενες από την βιταµίνη Κ και περιέχουν γ-καρβοξυλ-γλουταµινικό οξύ (Gla) 158,101. Η χορήγηση βαρφαρίνης, σε πειραµατόζωα µε κακοήθεις όγκους, αλλοιώνει τις ενζυµατικές ιδιότητες του CP 44. Τα εκχυλίσµατα του καρκινώµατος V2, από κουνέλια στα οποία είχε χορηγηθεί βαρφαρίνη, δεν παρουσίαζαν δραστηριότητα τύπου CP, ενώ το αντιγόνο ανιχνεύτηκε µε διασταυρούµενη ανοσοδιάχυση

49 Η ενζυµατική δραστηριότητα του CP, αναστέλλεται από διάφορους φυσικούς και συνθετικούς ανασταλτές των πρωτεϊνασών. Η αποτελεσµατικότητα αυτών των ανασταλτών, εξαρτάται από την παρουσία αναγωγικών ουσιών στο περιβάλλον της αντίδρασης 128. Ο CP αναστέλλεται από αλκυλιωτικούς παράγοντες, όπως η ιωδοακεταµίδη (ΙΑΑ), υδραργυρικά σκευάσµατα (ΗgCl 2, p-chloromercuric benzoate), peptidyl diazomethyl ketones (PDK), peptidyl sulfonium salts (PSS) και trans-epoxysuccinyl-l-leucilamido(4-guanidino)-butane (E-64). Στον πίνακα 3 αναφέρονται όλοι οι ανασταλτές των πρωτεϊνασών. Βασιζόµενοι σε αυτές τις φυσικοχηµικές και ενζυµατικές ιδιότητες, είναι πολύ δύσκολο να εντάξουµε τον CP, σε µια από τις γνωστές υποκατηγορίες ή οικογένειες των κυστεινικών πρωτεϊνασών. Το µοριακό βάρος, τα απαιτούµενα υποστρώµατα και το ιδανικό ph για τον CP, είναι διαφορετικά και από αυτά των καθεψινών (cathepsins) B,H και L 65. Η παπαίνη αναγνωρίζει διαφορετικές πεπτιδικές οµάδες στο PDK και PSS από τις οµάδες που αναγνωρίζονται από τον CP 7. Επίσης τα δισθενή ιόντα που χρειάζονται για τον CP, είναι διαφορετικά από τα απαιτούµενα από άλλες γνωστές πρωτεϊνάσες 127. Φαίνεται ότι η πεπτιδική αλληλουχία που αναγνωρίζεται από τον CP στο πεπτιδικό του υπόστρωµα, οµοιάζει µε αυτό που αναγνωρίζεται από την θροµβίνη, µε την προλίνη στην θέση Ρ2 και την αργινίνη στην θέση Ρ1. ιάφορα συνθετικά χρωµογόνα υποστρώµατα ελέγχθηκαν, ως προς την ικανότητά τους να υδρολυθούν από τον CP, συµπεριλαµβανοµένου ενός που είχε την αλληλουχία των αµινοξέων του παράγοντα Χ, στην περιοχή που δρα ο CP και στην περιοχή που δρα η θροµβίνη όπως αποδείχτηκε από τον Moore και συν 132. Κανένα από αυτά τα υποστρώµατα δεν ήταν ιδανικό υπόστρωµα για τον CP, συγκρινόµενο µε την θροµβίνη ή άλλες πρωτεϊνάσες 126. Αφού αυτά τα χρωµογόνα υποστρώµατα µιµούνται το σηµείο σχάσης του ινωδογόνου από την θροµβίνη, µελετήθηκε η πιθανότητα δράσης του CP στο ινωδογόνο, και διαπιστώθηκε ότι δεν υπάρχει µετρούµενη δράση 125. Έτσι, ο παράγων Χ τέµνεται από τον CP, αλλά το συνθετικό υπόστρωµα, µε την αλληλουχία των αµινοξέων που έχει το σηµείο σχάσης του παράγοντα Χ από τον CP, δεν υδρολύεται. Τα συνθετικά υποστρώµατα µε την αλληλουχία των αµινοξέων που έχει το 49

50 σηµείο σχάσης του ινωδογόνου από την θροµβίνη, υδρολύονται από τον CP, αλλά όχι από την φυσική πρωτεΐνη. Αυτά τα στοιχεία µας κάνουν να υποθέσουµε ότι το σηµείο που αναγνωρίζει ο CP, έχει σχέση µε την δευτερογενή ή τριτογενή µορφή της πρωτεΐνης, παρά στην πρωτογενή της δοµή. Εναλλακτικά, θα πρέπει να υπάρχει µια αλληλεπίδραση µεταξύ των πρωτεϊνών πέραν του σηµείου δράσης, η οποία ικανοποιείται από τον παράγοντα Χ και όχι από το ινωδογόνο. Αν και οι πληροφορίες που αφορούν την ενζυµατική φύση του CP δεν είναι ακόµη πλήρεις, οι µοναδικές ιδιότητες του CP σε σχέση µε άλλες γνωστές πρωτεϊνάσες, µας οδηγούν στο συµπέρασµα ότι ο CP πρέπει να είναι ένα µέλος µιας νέας οικογένειας πρωτεϊνασών. 4. Ο καρκινικός πηκτικός παράγων ΕC 3,4,22,26 ως καρκινικός δείκτης Αφού ο CP εκφράζεται από τους κακοήθεις ιστούς και πιθανόν να παίρνει µέρος στις διαταραχές της αιµόστασης που συνοδεύουν τον καρκίνο, φαίνεται λογικό ότι ο CP πρέπει να είναι παρών στο αίµα των ανθρώπων και των ζώων που πάσχουν από καρκίνο. Πρόσφατα αναπτύχθηκε µια µέθοδος, προκειµένου να εξαχθεί και να µετρηθεί η προπηκτική δραστηριότητα του πλάσµατος ασθενών µε ή χωρίς καρκίνο. Με αυτή την µέθοδο, στο πλάσµα επιµύων κατά την το 92% των ασθενών µε καρκίνο (ευαισθησία), είχαν υψηλά επίπεδα δραστηριότητας CP, και το 75% των µη καρκινοπαθών (ειδικότητα), είχαν φυσιολογική προπηκτική δραστηριότητα 79. Μία αντίστοιχη µέθοδος αναπτύχθηκε, προκειµένου να µετρηθεί η δραστηριότητα τύπου CP, διάρκεια ανάπτυξης επιθηλιώµατος Guerin. ιαπιστώθηκε µια υψηλή συσχέτιση µεταξύ του επιπέδου της δραστηριότητας του CP και του καρκινικού φορτίου (το µέγεθος του όγκου) 130, µέχρι του σταδίου IV της νόσου, που στο τελευταίο στάδιο τα επίπεδα του CP µειώνονται. Σε µια άλλη µελέτη, τα επίπεδα του αντιγόνου του CP, µετρούµενα µε ανοσολογική µέθοδο, σε ποντίκια κατά την διάρκεια ανάπτυξης καρκινώµατος V2, διαπιστώθηκε εξαιρετική συσχέτιση µεταξύ που µεγέθους του όγκου και των επιπέδων του CP

51 Μια ευαίσθητη ανοσοενζυµατική µέθοδος (Elisa), αναπτύχθηκε προκειµένου να µετρηθεί το αντιγόνο του CP, σε δείγµατα ορού 82,115 Η χρήση του CP ως καρκινικού δείκτη, εκτιµήθηκε σε 128 τυχαία δείγµατα ορού 79. Η µέθοδος Elisa ταυτοποίησε ακριβώς ως θετικά το 81% από τους 54 ορούς ασθενών µε καρκίνο, ως αρνητικά το 91% των 46 φυσιολογικών ορών και ως αρνητικά το 80% των ορών των 20 ασθενών µε καλοήθεις νόσους. Ιδιαίτερα ενδιαφέρουσα ήταν η παρατήρηση, ότι 100% των δειγµάτων από ασθενείς µε πρώιµα στάδια καρκίνου, ήταν θετικά ως προς τον CP. Σε δεύτερη µελέτη µε 818 δείγµατα ορού 114, 139 δείγµατα φυσιολογικά, 102 δείγµατα ασθενών µε καλοήθη νοσήµατα και 561 δείγµατα καρκινοπαθών ασθενών, η ευαισθησία της µεθόδου ήταν 80%, και σ αυτήν την µελέτη φαίνεται ότι για ορισµένους καρκίνους, όπως ωοθηκών, παχέως εντέρου, µελανώµατος, νεφρών, µικροκυτταρικού καρκίνου πνεύµονος και µαστού, η ευαισθησία της µελέτης είναι ακόµη µεγαλύτερη. Μια δεύτερη παρατήρηση είναι, ότι η µέθοδος είναι ικανή να ταυτοποιήσει το 88%των ασθενών µε στάδιο Ι του καρκίνου. Τα αποτελέσµατα και των δύο µελετών, µας δείχνουν ότι ο CP θα µπορούσε να χρησιµοποιηθεί σαν ένας νέος καρκινικός δείκτης των πρώιµων σταδίων του καρκίνου. Παρ ότι δεν είναι ειδικός του είδους του καρκίνου, ο έλεγχος των ασθενών υψηλού κινδύνου, µαζί µε άλλες διαγνωστικές τεχνικές, µπορεί να βελτιώσει σηµαντικά την επιβίωση των καρκινοπαθών ασθενών. Από τις µελέτες που υπάρχουν για τον έλεγχο του CP-Elisa, διαπιστώθηκε ότι η µέθοδος είναι πιο αποτελεσµατική στα πρώιµα στάδια του καρκίνου απ ότι στα προχωρηµένα στάδια της νόσου. Ήταν πολύ δύσκολο να δοθεί µια λογική εξήγηση, ιδιαίτερα σε σχέση µε άλλους καρκινικούς δείκτες. Μια πιθανή εξήγηση είναι, ότι στα προχωρηµένα στάδια της νόσου, αναπτύσσονται ενδογενή αντισώµατα εναντίον του CP, και το σύµπλεγµα CP-αντισώµατα δεν αναγνωρίζεται από τα αντι-cp της µεθόδου. Για να ελεγχθεί αυτή η εκδοχή, αναπτύχθηκαν αντισώµατα κατά του CP-ανοσοσυµπλέγµατος (CPIC). ιαπιστώθηκε λοιπόν η ύπαρξη τέτοιων ανοσοσυµπλεγµάτων (CPIC) στον ορό των ασθενών µε 51

52 προχωρηµένο στάδιο καρκίνου. Με αυτήν την νέα τεχνική τροποποίηση, η Elisa ήταν ικανή να ταυτοποιήσει πολλά από τα δείγµατα ορών ασθενών µε προχωρηµένο στάδιο της νόσου ως θετικά, ενώ µε την προηγούµενη µέθοδο ήταν ψευδώς αρνητικά Ο κυτταρικός ρόλος του καρκινικού πηκτικού παράγοντα ΕC 3,4,22,26 στον καρκίνο. Η αυξηµένη δηµιουργία και εναπόθεση ινικής µέσα και γύρω από τους νεοπλασµατικούς ιστούς, µπορεί να παίξει κάποιο ρόλο στην ανάπτυξη του όγκου και στην µεταστατική διασπορά του καρκίνου. Η εναπόθεση της ινικής γύρω από τα νεοπλασµατικά κύτταρα, πιστεύεται ότι τα προστατεύει από την δράση των φυσικών κυτταροκτόνων κυττάρων (ΝΚ), ή άλλων κυτταροτοξικών κυττάρων. Η ινική δρα σαν ένα είδος ασπίδας, απέναντι στο αµυντικό αυτόλογο ανοσολογικό σύστηµα 97. Η έννοια της προφύλαξης των καρκινικών κυττάρων από πρωτεΐνες του ξενιστή είναι πολύ ελκυστική και υπάρχουν αρκετά δεδοµένα που υποστηρίζουν αυτήν την άποψη 91,173. Υπάρχουν όµως και ερευνητές που δεν υποστηρίζουν αυτήν την άποψη, και εστιάζουν στο γεγονός ότι πολλοί όγκοι δεν συνοδεύονται από εναπόθεση ινικής ή υπερπηκτικότητα, αλλά παρουσιάζουν µεταστάσεις, όπως ακριβώς και οι όγκοι που χρησιµοποιούν την ινική. Αυτοί πιστεύουν, ότι ο πηκτικός µηχανισµός δεν παίζει καθοριστικό ρόλο στην εξέλιξη της κακοήθους νόσου. Ένα από τα χαρακτηριστικά του αιµοστατικού συστήµατος, που µέχρι σήµερα δεν δόθηκε πολύ προσοχή, είναι ο ρόλος της πήξης και της ινωδόλυσης στην προαγωγή της ανάπτυξης των όγκων, στην διείσδυση και στην µετάσταση. Πολλά πρωτεολυτικά ένζυµα 119, έχουν σηµαντική δράση στην βιωσιµότητα και την λειτουργία φυσιολογικών και καρκινικών κυττάρων 84,85. Για παράδειγµα, η ουροκινάση και ο t-pa, παίζουν σηµαντικό ρόλο στην αποδόµηση του εξωκυττάριου υλικού γύρω από τα καρκινικά κύτταρα, διευκολύνοντας έτσι την εισβολή και την µεταστατική διασπορά 3,122. Άλλες εξωκυττάριες πρωτεϊνάσες, όπως η θροµβίνη, έχουν µιτογόνο δράση σε φυσιολογικά και κακοήθη κύτταρα 133,189. Ενδοκυττάριες πρωτεϊνάσες, παίρνουν µέρος σε 52

53 αυτοκρινείς λειτουργίες του κυττάρου, ώστε να διευκολύνουν ην βιωσιµότητα των νεοπλασµατικών κυττάρων, την ανάπτυξη, την κινητικότητα και τον πολλαπλασιασµό τους 183,169. Αναστολείς των πρωτεϊνασών, αποδείχτηκε ότι προλαµβάνουν την κακοήθη εξαλλαγή, την ανάπτυξη των όγκων, καθώς και την µεταστατική διασπορά1 66,112,170. Αφού ο CP είναι µια κυστεινική πρωτεάση, θα ήταν ενδιαφέρον να καθοριστεί εάν έχει µιτογόνες ή άλλες αυξητικές ιδιότητες πάνω στα καρκινικά κύτταρα. Το ερώτηµα δεν είναι υποθετικό, αφού διαπιστώθηκε ότι υπάρχει µια στενή σχέση (r 2 =0,88) µεταξύ της δραστικότητας του CP και της µεταστατικής ικανότητας του Β16 µελανώµατος του ποντικού 54, υποθέτοντας ότι τα κύτταρα Β16 µε µεγάλη προπηκτική δραστηριότητα έχουν µεγαλύτερη µεταστατική ικανότητα. Πράγµατι, τα ανοσοποιηµένα ποντίκια έναντι του CP, µετά την έγχυση καρκινικών κυττάρων, ανέπτυξαν πολύ λιγότερες αποικίες µεταστατικών όγκων, σε σχέση µε τα µη ανοσοποιηµένα 116. Με πρώτη µατιά αυτά τα δεδοµένα δείχνουν ότι η έκφραση του CP στα καρκινικά κύτταρα θα µπορούσε να προκαλέσει την ενεργοποίηση του πηκτικού µηχανισµού και την εναπόθεση ινικής πάνω στα καρκινικά κύτταρα ώστε να τα προφυλάξει, να προάγει την επιβίωσή τους και να επιτρέψει τον αποικισµό τους στον πνεύµονα. των µη ανοσοποιηµένων ποντικών. Σε καλλιέργειες καρκινικών κύτταρων, η χορήγηση αντι- CP IgG αντισωµάτων, περιόρισε κατά 50% την βιωσιµότητα των καρκινικών κυττάρων σε σχέση µε την βιωσιµότητα των κυττάρων σε καλλιέργειες χωρίς την χορήγηση αυτών των αντισωµάτων 87. Από αυτά τα δεδοµένα, συνάγεται το συµπέρασµα, ότι 3. Ο CP διατηρείται µεταξύ των ειδών και των ιστικών σειρών. 4. Ανιχνεύεται πριν την εµφάνιση της καρκινικής µάζας. 5. Η έκφρασή του έχει σχέση µε την διαφοροποίηση του κυττάρου. 6. Τα αντισώµατα κατά του CP έχουν µια κυτταροτοξική δράση πάνω στα καρκινικά κύτταρα. Εµείς συνάγουµε το συµπέρασµα ότι ο CP είναι µια αυτοκρινής πρωτεϊνάση που µπορεί να παίξει έναν σηµαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και την βιωσιµότητα των καρκινικών και αδιαφοροποίητων κυττάρων. 53

54 6. Η συµβολή του ιστικού παράγοντα (TF) και του καρκινικού πηκτικού παράγοντα (CP) ΕC 3,4,22,26 στην ενεργοποίηση του πηκτικού µηχανισµού από τους νεοπλασµατικούς ιστούς Ο ιστικός παράγων είναι µια γλυκοπρωτείνη της κυτταρικής µεµβράνης που εκφράζεται από τα περισσότερα φυσιολογικά κύτταρα. Πολλά κύτταρα που δεν εκφράζουν ιστικό παράγοντα σε φυσιολογικές συνθήκες, τον εκφράζουν κάτω από παθολογικές συνθήκες. 45,110. Ο TF είναι ο υποδοχέας του FVII/VIIa και το σύµπλεγµα TF-FVIIa είναι ένας ισχυρός ενεργοποιητής των παραγόντων IX και X 142. Ο έλεγχος του TF γίνεται σε διάφορα επίπεδα και η δραστηριότητα του συµπλέγµατος TF- VIIa εξουδετερώνεται από τον ανασταλτή της οδού του ιστικού παράγοντα (TFPI) 121. Πολλές µελέτες έχουν εξερευνήσει την σχέση του TF και άλλων παραγόντων πήξης µε τα κακοήθη κύτταρα και τους ιστούς. Με διάφορες εργαστηριακές µεθόδους διαπιστώθηκε ότι κυτταρικές σειρές από καρκίνο µαστού εκφράζουν TF1 34,71, ενώ τα κύτταρα της οξείας λεµφοκυτταρικής λευχαιµίας δεν εκφράζουν 31. Το 60% των νεοπλασµάτων επιθηλιακής προέλευσης εκφράζουν TF, ενώ µόνον το 16% των µη επιθηλιακής προέλευσης 28,31. Η έκφραση του TF από τα καρκινικά κύτταρα 106 και από τα µονοκύτταρα-µακροφάγα καρκινοπαθών ασθενών 193, πιστεύεται ότι είναι µια αιτία των διαταραχών της αιµόστασης στους καρκινοπαθείς ασθενείς. Πολλά καρκινικά κύτταρα έχουν στην επιφάνειά τους όλα τα ένζυµα για την ενεργοποίηση του πηκτικού µηχανισµού 194. Ανασταλτικά αντί-tf αντισώµατα, καταστέλλουν την προπηκτική δραστηριότητα των καρκινικών κυττάρων στα εκχυλίσµατα, αλλά και σε καλλιεργηµένα κακοήθη κύτταρα. Μελέτες από τους Ruf και συν. δείχνουν ότι υπάρχουν δύο δεξαµενές από TF στα καρκινικά κύτταρα. Πρόκειται για την ενεργό δεξαµενή µε FVII/VIIa και την ανενεργό µε TG-FVIIa-FXa-TFPI, οι οποίες ανακυκλώνονται στην επιφάνεια του κυττάρου, χωρίς την επιπλέον σύνθεση του παράγοντα. 54

55 7. Η δράση του All-trans-ρετινοϊού οξέως (ΑΤΡΑ) στον καρκινικό πηκτικό παράγοντα και τον ιστικό παράγοντα. Στην Εικόνα 1, φαίνονται οι κύριες αιµοστατικές ιδιότητες των Μ3 λευχαιµικών κυττάρων. Σε αυτές περιλαµβάνονται τα ακόλουθα: 1) Έκφραση της προπηκτικής δραστηριότητας. 2) Έκφραση των ινωδολυτικών και προπηκτικών δραστηριοτήτων. 3) Έκκριση κυττοκινών όπως η Ιντερλευκίνη 1β (IL-1β) και ο παράγων νέκρωσης του όγκου (TNF), οι οποίοι επηρεάζουν το αιµοστατικό σύστηµα δρώντας στο αγγειακό ενδοθήλιο και στα λευκά αιµοσφαίρια 46. Εικόνα 1: Φαίνονται οι κύριοι δρόµοι που αλληλεπιδρούν µε τα κύτταρα της Μ3 ΟΜΛ και επηρεάζονται από το ATRA. Τα Μ3 ΟΜΛ κύτταρα εκφράζουν: α) Παράγοντες προδιαθέτοντες σε πήξη (TF και CP) οι οποίοι ενεργοποιούν τον καταρράκτη της πήξης. Το ATRA µειώνει την έκφραση αυτών των παραγόντων και µειώνει έτσι την προπηκτική δραστηριότητα των κυττάρων. β) Ινωδολυτικές πρωτεΐνες (u-pa, t-pa, PAI) και τον υποδοχέα (u- PAR). Το ATRA αυξάνει τους ενεργοποιητές του πλασµινογόνου 55

56 και τους αναστολείς, µε αποτέλεσµα να αφήνει ανεπηρέαστη την ινωδολυτική δραστηριότητα. γ) Μη ειδικές πρωτεάσες, συµπεριλαµβανοµένων των κοκκίων ελαστάσης που πρωτεολύει ινωδογόνο / ινική και άλλους πηκτικούς παράγοντες. Το ATRA δεν επηρεάζει αυτούς τους κυτταρικούς µηχανισµούς. δ) Κυτταροκίνες όπως IL-1β και TNF που αυξάνουν την θροµβογονικότητα του ενδοθηλίου. Το ATRA αυξάνει την παραγωγή κυτταροκινών. Α. Προπηκτικές δραστηριότητες. Η αγωγή µε ATRA προκαλεί διαφοροποίηση των Μ3 λευχαιµικών κυττάρων σε καλλιέργεια 197 και επηρεάζει την προπηκτική τους δραστηριότητα. Αυτή η διαφοροποίηση συνοδεύεται από απώλεια της ικανότητας των κυττάρων να εκφράσουν τον CP 67 αλλά και τον TF 113,50. Το ATRA προκαλεί την ίδια διαφοροποίηση των λευχαιµικών κυττάρων και in vivo, µε αποτέλεσµα να παρατηρείται η σταδιακή απώλεια των CP και TF από τα βλαστικά κύτταρα κατά την θεραπεία εφόδου 68. Με την παράλληλη παρατήρηση ότι µετά από θεραπεία µε ATRA, µαζί µε την απώλεια των CP και TF από τα βλαστικά κύτταρα έχουµε και την βελτίωση των υπερπηκτικών παραµέτρων στην Μ3, έχουµε την πρώτη απόδειξη του ρόλου των καρκινικών προπηκτικών παραγόντων στις πηκτικές επιπλοκές που συνοδεύουν τις κακοήθειες. Συνεπώς, η µείωση των προπηκτικών παραγόντων από το ATRA, φαίνεται ότι είναι ο κύριος µηχανισµός που βελτιώνει την υπερπηκτικότητα στην Μ3 ΟΜΛ. Β. Ινωδολυτικές και πρωτεολυτικές δραστηριότητες. Οι ινωδολυτικές και πρωτεολυτικές δραστηριότητες των λευχαιµικών κυττάρων περιγράφηκαν πρώτες από τους Gralnick και Abrell 92. Τα λευχαιµικά προµυελοκύτταρα περιέχουν ενεργοποιητές του πλασµινογόνου τύπου ουροκινάσης και ιστικού τύπου (u-pa, t- PA) 10,73,174. Πρωτεάσες των κοκκιοκυττάρων, όπως η ελαστάση και η χυµοθρυψίνη, βρίσκονται στα κοκκία των µυελοβλαστών. Αυτές οι πρωτεάσες όταν απελευθερώνονται στο περιφερικό αίµα, εξουδετερώνονται από τον κύριο αναστολέα τους την α-1-αντιθριψίνη. 56

57 Στην οξεία λευχαιµία έχουν ανιχνευτεί υψηλά επίπεδα συµπλεγµάτων ελαστασών-αναστολέων 63,59. Αυτά τα ένζυµα αποδοµούν πολλούς πηκτικούς παράγοντες in vitro 165 και ενισχύουν το ινωδολυτικό σύστηµα, πρωτεολύοντας τους δύο αναστολείς της πλασµίνης, την α-2- αντιπλασµίνη και C1-εστεράση 29.Επίσης η ελαστάση µπορεί άµεσα να σπάσει το µόριο του ινωδογόνου απελευθερώνοντας FDP 176. Αυτές οι δραστηριότητες των λευχαιµικών προµυελοκυττάρων πιστεύεται ότι παίζουν µεγάλο ρόλο στην παθογένεση των αιµορραγικών συµπτωµάτων στην Μ3 ΟΜΛ. Η διαφοροποίηση των λευχαιµικών προµυελοκυττάρων από το ATRA, δεν συνοδεύονται από µείωση ή αλλαγή αυτών των δραστηριοτήτων in vivo 50. Αντιθέτως το ATRA προκαλεί µια άµεση αύξηση του u-pa στην επιφάνεια των κυττάρων ΝΒ4 (κυτταρική σειρά Μ3 προµυελοκυττάρων) η οποία καταστέλλεται 24 ώρες µετά, από την παραγωγή ΡΑΙ 180. Συνεπώς, παρά τις αλλαγές στο ινωδολυτικό σύστηµα που παρατηρούνται µετά την χορήγηση ATRA, η όλη ινωδολυτική απάντηση παραµένει ανεπηρέαστη, όπως φαίνεται από τη δοκιµασία των ευσφαιρινών 67. Τα επίπεδα των κυκλοφορούντων ελαστασών είναι υψηλά στην φάση εκδήλωσης της νόσου, πιθανόν ως αποτέλεσµα της λύσης των κυττάρων και των κοκκίων τους. Μετά από θεραπεία µε ATRA, αυτά τα επίπεδα δεν αλλάζουν 64. εν υπάρχει συσχέτιση µεταξύ των επιπέδων των ελαστασών στο πλάσµα και των επιπέδων των - ιµερών και άλλων αιµοστατικών παραµέτρων µετά από αγωγή µε ATRA. Φαίνεται λοιπόν ότι αυτά τα ένζυµα δεν συµβάλουν στις αιµορραγικές διαταραχές της Μ3 ΟΜΛ. Γ. Απελευθέρωση κυτταροκινών. Τα λευχαιµικά κύτταρα παράγουν κυτταροκίνες της φλεγµονής, συµπεριλαµβανοµένου του TNF και IL-1β 93. Τα λευχαιµικά προµυελοκύτταρα παράγουν περισσότερες κυτταροκίνες στους ασθενείς που εκδηλώνουν DIC παρά σ αυτούς που δεν εκδηλώνουν. Υπάρχει µία αλληλεπίδραση µεταξύ των κυτταροκινών και των αιµοστατικών ιδιοτήτων του αγγειακού ενδοθηλίου. Οι κυτταροκίνες και οι ενδοτοξίνες προκαλούν την παραγωγή TF 43,21 από τα ενδοθηλιακά κύτταρα ενώ µειώνουν την παραγωγή θροµβοµοδουλίνης 52, που είναι υψηλής συγγένειας υποδοχέας της θροµβίνης. Το σύµπλεγµα 57

58 θροµβίνης-θροµβοµοδουλίνης, ενεργοποιεί την πρωτεΐνη C, η οποία δρα σαν ισχυρό αντιπηκτικό. Αυτή η αύξηση του TF και η µείωση της θροµβοµοδουλίνης από τα ενδοθηλιακά κύτταρα οδηγεί στη προθροµβωτική διέγερση του αγγειακού τοιχώµατος 131. Όµως οι κυτταροκίνες µπορούν να διεγείρουν τα ενδοθηλιακά κύτταρα να παράγουν t-pa και PAI 137 προκαλώντας αναστολή της ινωδόλυσης και αυξάνοντας τις προθροµβωτικές ιδιότητες των ενδοθηλιακών κυττάρων. Αυτό έχει παρατηρηθεί και στους υγιείς εθελοντές, στους οποίους χορηγήθηκε ενδοτοξίνη ή TNF-α. Οι εθελοντές άµεσα ανέπτυξαν αυξηµένα επίπεδα t-pa, και ακολούθησε µια ακόµη πιο µεγάλη αύξηση PAI-1 177,186. Από όλα αυτά προκύπτει ότι µια αρχική αύξηση της ινωδόλυσης, ακολουθείται από µια παρατεταµένη αναστολή της. Το ATRA αυξάνει την ικανότητα των λευχαιµικών κυττάρων να παράγουν κυτταροκίνες 58,77. Θεωρητικά, αυτή η δράση θα µπορούσε να αυξήσει την προθροµβωτική ικανότητα του ενδοθηλίου, αλλά αυτό δεν συµβαίνει λόγω του προστατευτικού ρόλου του ATRA οστά ενδοθηλιακά κύτταρα. Το ATRA εξουδετερώνει τη αυξηµένη παραγωγή TF και την µειωµένη παραγωγή θροµβοµοδουλίνης από το ενδοθήλιο που προκάλεσε ο TNF-α 109. Η Falanga A και οι συνεργάτες 68 διαπίστωσαν ότι η αύξηση του TF στα ενδοθηλιακά κύτταρα που προκάλεσε το υπερκείµενο της καλλιέργειας κυττάρων Μ3 ΝΒ4 που τους είχε χορηγηθεί ATRA, προλαµβάνεται από την σύγχρονη παρουσία ATRA στο ενδοθήλιο. Συνεπώς παρ ότι το ATRA αυξάνει την σύνθεση κυτταροκινών από τα λευχαιµικά προµυελοκύτταρα, εν τούτοις προφυλάσσει το ενδοθήλιο από την προθροµβωτική επίθεση αυτών των ουσιών.. Άλλες ιδιότητες. Η παραγωγή θροµβοµοδουλίνης από τα λευχαιµικά προµυελοκύτταρα µετά την χορήγηση ATRA, αυξάνει τις αντιπηκτικές τους ιδιότητες 113. Τα λευχαιµικά προµυελοκύτταρα είναι ικανά να συνθέσουν και να εκκρίνουν καθεψίνη G 6. Αυτό το πρωτεολυτικό ένζυµο που φυσιολογικά αποθηκεύεται στα αζουρόφιλλα κοκκία των ώριµων κοκκιοκυττάρων τέµνει το ινωδογόνο και το PAI-1, εξουδετερώνει τον TFPI, και είναι ο διαβιβαστής µε τον οποίο τα ουδετερόφιλα προκαλούν συγκόλληση των αιµοπεταλίων. Το ATRA µειώνει την παραγωγή καθεψίνης G από τα 58

59 λευχαιµικά προµυελοκύτταρα 172. Αυτό το εύρηµα δείχνει µια όλο και µεγαλύτερη αντιθροµβωτική δράση αυτού του φαρµάκου στα λευχαιµικά κύτταρα. Το γονιδίωµα της ανεξίνης VIII, υπερεκφράζεται στα λευχαιµικά προµυελοκύτταρα και καταστέλλεται από το ATRA 39. H ανεξίνη VIII είναι µέλος των εξαρτηµένων πρωτεϊνών που συνδέονται µε τα φωσφολιπίδια της µεµβράνης. Όπως και η ανεξίνη V, αναστέλλει την - εξαρτηµένη από τα φωσφολιπίδια - ενεργοποίηση του πηκτικού µηχανισµού, µε αποτέλεσµα να συµβάλει στην αιµορραγική διάθεση αυτών των αρρώστων. 8. Η ΡΑΣΗ ΤΟΥ All-trans-ρετινοϊκού οξέως (ATRA) ΣΤΑ ΕΝ ΟΘΗΛΙΑ Εικόνα 2. Σχηµατικά η κύριες δράσεις του ATRA στο αγγειακό ενδοθήλιο. 1) Προκαλεί την έκφραση θροµβοµοδουλίνης από τα ενδοθηλιακά κύτταρα, που είναι ο υποδοχέας της µεµβράνης που συνδέει και απενεργοποιεί την θροµβίνη. Το σύµπλεγµα θροµβοµοδουλίνης / θροµβίνης, ενεργοποιεί τις πρωτεΐνες C/S, που είναι ένα ισχυρό αντιπηκτικό σύστηµα. 2) Αναστέλλει την έκφραση TF στα ενδοθηλιακά κύτταρα. 3) Προκαλεί την παραγωγή t-pa και λιγότερο PAI-1, διευκολύνοντας την ινωδολυτική δραστηριότητα. 4) Εξουδετερώνει την προθροµβωτική δράση των κυτταροκινών IL-1β και TNFα, στα ενδοθηλιακά κύτταρα. 59