ΕΞΑΜΗΝΟ Β ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΟΡΓΑΝΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΔΥΤΙΚΗΣ ΕΛΛΑΔΑΣ ΤΜΗΜΑ ΔΙΟΙΚΗΣΗΣ ΕΠΙΧΕΙΡΗΣΕΩΝ ΑΓΡΟΤΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΚΑΙ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΕΞΑΜΗΝΟ Β ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΟΡΓΑΝΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ

2 ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΛΙΠΟΥΣ ΣΤΟ ΤΥΡΙ Εισαγωγή Το λίπος είναι ένα συστατικό του γάλακτος, στο οποίο δίνεται μεγάλη σημασία και πολλές φορές συνδέεται με τη ποιότητα του. Στην κατανάλωση η διαφοροποίηση του γάλακτος γίνεται κυρίως με βάση την περιεκτικότητα του σε λίπος. Λεπτομερής ανάλυση του λίπους στο γάλα έδειξε την παρουσία 64 διαφορετικών λιπαρών οξέων με αριθμό ατόμων άνθρακα από 4 έως 26. Από τα κυριότερα λιπαρά οξέα είναι το βουτυρικό οξύ (C=4), η συγκέντρωση του οποίου κυμαίνεται μεταξύ 8 και 12%. Περίπου το 62% των λιπαρών οξέων είναι κορεσμένα και το 37% ακόρεστα. Το τυρί είναι το προϊόν της ωρίμανσης του πήγματος του γάλακτος. Η πήξη του γάλακτος επιτυγχάνεται με την οξίνιση του γάλακτος ή τη προσθήκη πυτιάς που περιέχει το ένζυμο ρεννίνη. Στην πρώτη περίπτωση η οξίνιση προκαλείται από τους οξυπαραγωγικούς μικροοργανισμούς που προστίθεται στο γάλα. Οι μικροοργανισμοί αυτοί κατεβάζουν το ph του γάλακτος έως το ισοηλεκτρικό σημείο της καζεΐνης (ph = 4.6) με αποτέλεσμα τη πήξη του τελευταίου. Στη δεύτερη περίπτωση η ρεννίνη της πυτιάς προσβάλλει καταρχήν την καζεΐνη και σχηματίζεται η παρα-κ-καζεΐνη και στη συνέχεια, παρουσία ιόντων ασβεστίου, ακολουθεί πήξη του γάλακτος. Πειραματικό μέρος Για τον προσδιορισμό του λίπους στο τυρί μπορούν να εφαρμοστούν οι μέθοδοι: a) Μέθοδος Schmidt Bondzynski ( Σταθμική) b) Μέθοδος Gerber Van Gulik (Ογκομετρική) c) Μέθοδος Werner Schmidt (Σταθμική) Ακολουθούμε την μέθοδο Gerber Van Gulik (Ογκομετρική) 1

3 Αντιδραστήρια Σκεύη Α. H 2 SO 4 με ειδικό βάρος 1,5 Β. Αμυλική αλκοόλη Γ. Σωλήνες βουτυρόμετρου Δ. Υδατόλουτρο 65 0 C Ε. Φυγόκεντρος Στ. Αναλυτικός ζυγός Ζ. Σιφώνιο 10ml Πορεία μεθόδου Σε ειδικό σωλήνα του βουτυρόμετρου ζυγίζονται ακριβώς 3 gr δείγματος τυρί Πωματίζεται ο σωλήνας και τοποθετείται στο βουτυρόμετρο. Στο άλλο ανοιχτό στόμιο του βουτυρόμετρου προστίθενται 10ml H 2 SO 4 με ειδικό βάρος 1,5 και το βουτυρόμετρο τοποθετείται σε υδατόλουτρο στους 70 0 C. Στη συνέχεια αναταράσσετε ζωηρά ώσπου να διαλυθεί εντελώς η μάζα του τυριού Προστίθεται 1 ml αμυλικής αλκοόλης και η ανατάραξη επαναλαμβάνεται Η στιβάδα του λίπους πρέπει να βρίσκεται μέσα στην κλίμακα του βουτυρόμετρου και αυτό ρυθμίζεται με προσθήκη θειικού οξέως. Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 10 λεπτά σε 1000στροφές/λεπτό και τοποθέτηση του βουτυρόμετρου σε υδατόλουτρο στους 65 0 C Σημειώνεται ο όγκος της στιβάδας λίπους και επαναλαμβάνεται η φυγοκέντρηση και η θέρμανση στους 65 0 C Ο τελικός όγκος της στιβάδας του λίπους δίνει την % κατά βάρος περιεκτικότητα λίπους στο τυρί, εφόσον αρχικά χρησιμοποιήθηκαν 3g τυρί. 2

4 3

5 ΚΡΑΣΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΑΛΚΟΟΛΙΚΩΝ ΒΑΘΜΩΝ Εισαγωγή-Θεωρητικό μέρος Κρασί είναι το προϊόν της ζύμωσης των σακχάρων, που υπάρχουν στο χυμό (μούστο) που προκύπτει από τη συμπίεση σταφυλιών. Η ζύμωση γίνεται παρουσία ζυμομυκήτων και τα κύρια προϊόντα της είναι αιθυλική αλκοόλη και διοξείδιο του άνθρακα. C 6 H 12 O 6 2C 2 H 5 OH + 2CO 2 Γενικά το κρασί παρασκευάζεται από ώριμα σταφύλια. Ο μούστος που προκύπτει μετά την έκθλιψη των σταφυλιών παραμένει σε θερμοκρασία περιβάλλοντος, για 4-6 εβδομάδες, μέχρι να ολοκληρωθεί η ζύμωση των σακχάρων. Για την παρασκευή λευκών κρασιών πρέπει να απομακρύνονται από τον μούστο τα στέμφυλα, διότι περιέχουν ανθοκυανίνες, χρωστικές που δίνουν το χρώμα τους στα κόκκινα κρασιά. Κρασί που παρασκευάσθηκε από μούστο που ζυμώθηκε μαζί με τα στέμφυλα, είναι χρωματισμένο και εμπλουτισμένο με τανίνες, ουσίες που προσδίδουν στο κρασί μια χαρακτηριστική στυφή γεύση. Μετά την ολοκλήρωση της ζύμωσης του μούστου το κρασί μπορεί να εμφιαλωθεί ή να παραμείνει για παλαίωση σε ξύλινα βαρέλια. Σύσταση του κρασιού Τα ξηρά κρασιά περιέχουν συνήθως λιγότερο από 0,2% σάκχαρα, τα γλυκά μέχρι 6% και οι σαμπάνιες μπορεί να περιέχουν μέχρι 16%. Το ph είναι σημαντικός παράγοντας κατά τη διάρκεια της ζύμωσης και της αποθήκευσης. Η επιτρεπόμενη περιοχή διακύμανσης τιμής ph, ανάλογα και με το είδος του κρασιού είναι 2,8-3,8. Τα περισσότερα κρασιά έχουν ολική οξύτητα (εκφρασμένη ως τρυγικό οξύ) 0,3-0,55% και πτητική οξύτητα (ως οξικό οξύ) 0,03-0,35%. Ο οξικός αιθυλεστέρας, εκτός του οξικού και άλλων οξέων, είναι ένας σημαντικός δείκτης για την αλλοίωση του κρασιού. Σε μικρές όμως συγκεντρώσεις μέχρι 0,02% του δίνει χαρακτηριστικό άρωμα. Σε αξιόλογες συγκεντρώσεις υπάρχουν στα κρασιά επίσης καρβονυλικές 4

6 ενώσεις, φαινολικά και φλαβονοειδικά παράγωγα, όπως τανίνες και ανθοκυανίνες και πολλά φαινολοξέα. Αιθυλική αλκοόλη Οι αλκοολικοί βαθμοί είναι το κυριότερο χαρακτηριστικό ποιότητας του κρασιού και το πρώτο μέγεθος που συνήθως προσδιορίζεται. Αφορά τη συγκέντρωση της αιθυλικής αλκοόλης, που είναι το κυριότερο προϊόν της ζύμωσης και η σπουδαιότερη αλκοόλη του. Τα όρια της περιεκτικότητας του κρασιού σε αιθυλική αλκοόλη καθορίζονται σε τεχνικοοικονομική βάση. Χαμηλές συγκεντρώσεις αλκοόλης συντελούν στην ταχύτερη αλλοίωση του κρασιού, ενώ υψηλότερες αυξάνουν τη φορολογία του. Αλκοολικοί βαθμοί είναι ο αριθμός των όγκων καθαρής αλκοόλης που περιέχονται σε 100 όγκους κρασιού στους 20 ο C. Οι αλκοολικοί βαθμοί των κρασιών προσδιορίζονται συνήθως με τη μέτρηση του ειδικού τους βάρους με αραιόμετρα ή με αλκοολόμετρα, όπως περιγράφεται πιο κάτω. Πειραματικό μέρος 200 ml κρασιού αποστάζονται προσεκτικά, αφού μετρηθούν με κύλινδρο των 250 ml με εσμυρισμένο πώμα. Ο κύλινδρος χρησιμοποιείται ως υποδοχέας στην απόσταξη, η οποία πρέπει να ρυθμίζεται έτσι ώστε να αποφεύγεται ο αφρισμός του δείγματος. Αυτό επιτυγχάνεται με τη ρύθμιση της θερμοκρασίας στη φιάλη βρασμού και με την προσθήκη σε αυτήν κομματιών πορσελάνης ή τανίνης που δεσμεύει τις πρωτεΐνες του κρασιού που προκαλούν αφρισμό. Ο ψυκτήρας πρέπει να ψύχεται καλά και να έχει όσο το δυνατό μεγαλύτερη κλίση. Η απόσταξη διαρκεί, ώσπου να συγκεντρωθούν στον υποδοχέα 133 ml υγρού (περίπου τα 2/3 του αρχικού όγκου του δείγματος), οπότε έχει αποστάξει όλη η αλκοόλη. Στο σημείο αυτό η απόσταξη διακόπτεται και το περιεχόμενο του υποδοχέα συμπληρώνεται μέχρι 200 ml με απεσταγμένο νερό. Μετά την ανάμιξη του περιεχομένου του κυλίνδρου ακολουθεί ο προσδιορισμός των αλκοολικών βαθμών. Αυτό γίνεται με δύο τρόπους: α) Άμεσα με αλκοολόμετρο που μετράει απευθείας τους αλκοολικούς βαθμούς ή β) Έμμεσα με ένα αραιόμετρο που δίνει το ειδικό βάρος και από πίνακες αντιστοιχίας τους αλκοολικούς βαθμούς του δείγματος σε ορισμένη θερμοκρασία. 5

7 Σχήμα 1. Συσκευή απλής απόσταξης Σχήμα 2. α) Αραιόμετρο για τη μέτρηση του ειδικού βάρους, β) Αλκοολόμετρο περιοχής 0-10 βαθμών και γ) Αλκοολόμετρο με θερμόμετρο. 6

8 ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΑΣΠΙΡΙΝΗΣ Θεωρητικό μέρος Η απευθείας αντίδραση μεταξύ οξέων και αλκοολών, (εστεροποίηση), είναι ένας από τους πιο συνηθισμένους τρόπους παρασκευής εστέρων. RCOOH + HOR RCOOR + H 2 O (1) Όταν η (1) προχωρά από δεξιά προς αριστερά, ονομάζεται υδρόλυση. Η ισορροπία αποκαθίσταται συνήθως όταν καταναλώνονται τα 2/3 των αντιδρώντων και στο τέλος έχουμε μίγμα εστέρα, νερού, οξέος και αλκοόλης. Η απόδοση της αντίδρασης προς τα δεξιά, μπορεί να αυξηθεί, αν χρησιμοποιηθεί περίσσεια ενός από τα αντιδρώντα ή αν απομακρύνεται συνεχώς το νερό που σχηματίζεται. Στην περίπτωση αυτή είναι δυνατόν να παρασκευαστεί εστέρας με μεγάλη απόδοση. Οι περισσότεροι από τους εστέρες δεν είναι διαλυτοί στο νερό κι έτσι με τη βοήθεια ανακρυστάλλωσης μπορούν να διαχωριστούν από το μίγμα της αντίδρασης. Το ίδιο μπορεί να γίνει και με έκπλυση του μίγματος της αντίδρασης με κρύο νερό. Στο παρόν πείραμα, γίνεται παρασκευή του εστέρα ακετυλοσαλικυλικού οξέος που κοινά ονομάζεται ασπιρίνη και είναι φάρμακο ευρέως γνωστό για τις αναλγητικές και αντιπυρετικές του ιδιότητες. Η ασπιρίνη μπορεί να παρασκευαστεί με βάση τις αντιδράσεις (2) και (3) που ακολουθούν. 7

9 Η (3) θεωρείται καλύτερη μέθοδος παρασκευής μια και ο οξικός ανυδρίτης αντιδρά με το παραγόμενο νερό της αντίδρασης εστεροποίησης και οδηγεί την αντίδραση δεξιά αυξάνοντας την απόδοση προς την κατεύθυνση αυτή. Σαν καταλύτης χρησιμοποιείται φωσφορικό οξύ, Η 3 ΡΟ 4 Πειραματικό μέρος 1. Σε φιάλη Erlenmeyer των 50ml, ζυγίζουμε 2gr σαλικυλικού οξέος 2. Στη φιάλη προσθέτονται 5ml οξικού ανυδρίτη, (ζυγισμένα με ογκομετρικό κύλινδρο) και 5 σταγόνες φωσφορικού οξέος. 3. Η φιάλη Erlenmeyer τοποθετείται σε ποτήρι ζέσης που περιέχει νερό, (αφού πρώτα στηριχτεί σε μεταλλικό δακτύλιο, ώστε να μην ακουμπά στον πυθμένα του ποτηριού), και βρίσκεται επάνω σε θερμαντική πλάκα. 4. Το σύστημα θερμαίνεται στους 75 C, ενώ το περιεχόμενο της φιάλης αναδεύεται περιοδικά, μέσα στη φιάλη έχει τοποθετηθεί μαγνητικός αναδευτήρας). 5. Εφόσον στο σύστημα έχει επέλθει η θερμοκρασία των 75 C, (θερμομετρούμε το νερό για να είμαστε σίγουροι), αυτή διατηρείται για περίπου 15 min, οπότε η αντίδραση ολοκληρώνεται. 6. Προληπτικά προστίθενται στη φιάλη 2ml νερού, ώστε να αδρανοποιηθεί πιθανή περίσσεια οξικού ανυδρίτη οπότε και παράγονται ζεστοί ατμοί οξικού οξέος. 7. Όταν οι ατμοί σταματήσουν να εκλύονται, η φιάλη απομακρύνεται από το υδρόλουτρο, σε αυτή προστίθενται 20ml νερού και τέλος αφήνεται να ψυχθεί ώστε να σχηματιστούν κρύσταλλοι ασπιρίνης. 8. Το περιεχόμενο της φιάλης διηθείται υπό κενό. Οι κρύσταλλοι πλένονται χωρίς κενό με περίπου 5ml πολύ παγωμένου νερού και στη συνέχεια μετά την πάροδο λίγων δευτερολέπτων ανοίγεται το κενό και απομακρύνονται τα υγρά εκπλύσεως και οι προσμίξεις. 9. Εφόσον το προϊόν ξηραθεί, ζυγίζεται σε μικρό προζυγισμένο ποτήρι ζέσεως. 10. Γίνεται ο προσδιορισμός του σημείου τήξεως. Προσοχή ο οξικός ανυδρίτης και το φωσφορικό οξύ προκαλούν εγκαύματα αν έρθουν σε επαφή με το δέρμα. Στην περίπτωση αυτή ρίξτε άφθονο νερό και πλύνετε με σαπούνι. Τοποθέτηση της φιάλης σε παγόλουτρο ή τρίψιμο των τοιχωμάτων αυτής με γυάλινη ράβδο, επιταχύνει τη διαδικασία εμφάνισης των κρυστάλλων. 8

10 11. Ελέγχεται η διαλυτότητα του προϊόντος στους εξής διαλύτες : - Τετραχλωράνθρακας, CCl 4, (μη πολική αλειφατική ένωση). - Βενζόλιο, C 6 H 6, (μη πολική αρωματική ένωση). - Οξικός αιθυλεστέρας, C 2 H 5 OCOCH 3, (αλειφατικός εστέρας). - Αιθυλική αλκοόλη, C 2 H 5 OH, (πολική αλειφατική ένωση με δεσμούς υδρογόνου). - Ακετόνη, CH 3 COCH 3, (πολική αλειφατική ένωση, χωρίς δεσμούς υδρογόνου). Εργασίες 1. Χρησιμοποιήστε τους παρακάτω πίνακες για να παρουσιάσετε τα αποτελέσματά σας. Βάρος Όγκος Βάρος Βάρος Θεωρητική % Απόδοση Σ.Τ. Σαλικυλικού Οξικού Οξικού ασπιρίνης που Απόδοση Ασπιρίνης οξέος Ανυδρίτη Ανυδρίτη d=1,08g/ml παρασκευάστηκε Δοκιμές Διαλυτότητας Η 2 Ο CCl 4 C 6 H 6 C 2 H 5 OCOCH 3 CH 3 COCH 3 C 2 H 5 OH Δ= Διαλυτή, Α= Αδιάλυτη, Ε.Δ.= Ελάχιστα διαλυτή 2. Σε περίπτωση που θα παίρνατε από την εργασία σας 2,2gr ασπιρίνης ποια θα ήταν η απόδοση της αντίδρασης ; 3. Ο οξικός ανυδρίτης αντιδρά με το νερό και δίνει οξικό οξύ. Γράψτε την αντίδραση. 9

11 ΟΞΕΟΒΑΣΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΤΩΝ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ Θεωρητικό μέρος Τα αμινοξέα θεωρούνται από τις πιο σημαντικές οργανικές ενώσεις γιατί : - Συμμετέχουν σε αρκετούς μηχανισμούς της ενδιάμεσης ανταλλαγής ύλης. - Είναι πρόδρομες ενώσεις πολλών βιολογικά σημαντικών ενώσεων. - Είναι δομικές μονάδες των πρωτεϊνών. Η γλυκίνη, είναι το πιο απλό αμινοξύ, με τύπο Η 2 Ν-CH 2 -COOH. Στην περίπτωση που αυτή διαλυθεί στο νερό, το ph του διαλύματος θα είναι περίπου 6 και η δομή της η εξής : Η + 3 Ν-CH 2 -COO -. Δηλαδή η καρβοξυλομάδα ελευθερώνει ένα πρωτόνιο που το προσλαμβάνει η αμινομάδα. Τα αμινοξέα είναι για τον παραπάνω λόγο, αμφολύτες και η μορφή (1), ονομάζεται ισοϊονική μορφή γιατί δεν έχει καθαρό φορτίο, ή ισοηλεκτρική γιατί αν διαβιβάσουμε από το διάλυμά της ηλεκτρικό ρεύμα, τότε αυτή δεν θα κινηθεί. Στην περίπτωση που στο διάλυμα προστεθεί ισχυρό οξύ, η καρβοξυλομάδα εξουδετερώνεται και το αμινοξύ έχει θετικό καθαρό φορτίο. Αν προστεθεί ισχυρή βάση, τότε εξουδετερώνεται η αμινομάδα και το αμινοξύ βρίσκεται στην ανιονική μορφή. Τα παραπάνω περιγράφονται από την ισορροπία που ακολουθεί. Η + 3 Ν-CH 2 -COOΗ Η + 3 Ν-CH 2 -COO - Η 2 Ν-CH 2 -COO - Κατιονική μορφή Ισοϊονική μορφή Ανιονική μορφή Η διάσταση κάθε μίας από τις ιονιζόμενες ομάδες, ορίζεται από την εξίσωση Handerson-Hasselbach. Αυτή για την περίπτωση της καρβοξυλομάδας, είναι : ph = pk 1 + log[rco - 2 ]/[RCO 2 H] όπου pk 1 είναι ο αρνητικός δεκαδικός λογάριθμος της καρβοξυλομάδας. Σε υδατικό περιβάλλον, η καρβοξυλομάδα ιονίζεται σύμφωνα με την ισορροπία που ακολουθεί : RCO 2 H + H 2 O RCO H 3 O + Ανάλογα βρίσκεται το pk 2 για την αμινομάδα που σε υδατικό περιβάλλον ιονίζεται σύμφωνα με την ισορροπία : RΝH 2 + H 3 O + RΝΗ H 2 O Η καμπύλη τιτλοδότησης ενός ουδέτερου αμινοξέος, φαίνεται στο σχήμα που ακολουθεί και είναι λίγο πολύ ίδια για όλα τα ουδέτερα αμινοξέα. 10

12 Από την καμπύλη είναι δυνατόν να βρεθούν τα pk των ιονιζόμενων ομάδων που σύμφωνα με την εξίσωση Handerson-Hasselbach, είναι τα σημεία στα οποία αντιστοιχούν ίσα ποσά συζυγούς οξέος και βάσης, μα και το ισοϊονικό σημείο του αμινοξέος, το οποίο δίνεται από τον τύπο Ι.Σ. = (pk 1 + pk 2 ) / 2 Πειραματικό μέρος 1. Σε ποτήρι ζέσης των 100ml, τοποθετούνται 10ml διαλύματος υδροχλωρικής γλυκίνης 0,1 Μ. 2. Γεμίζεται μια προχοΐδα με διάλυμα ΝαΟΗ 0,1 Μ. 3. Μεταφέρεται το ηλεκτρόδιο πεχάμετρου στο διάλυμα του αμινοξέος και αυτό τιτλοδοτείται με διάλυμα ΝαΟΗ 0,1 Μ. Προστίθενται δόσεις των 0,5ml διαλύματος βάσης όταν το ph δεν αλλάζει πολύ και 0,2ml όταν αυτό μεταβάλλεται αρκετά. Εργασίες - Να κατασκευαστεί η καμπύλη τιτλοδότησης. - Να βρεθεί το pi. 11

13 ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΟΡΓΑΝΙΚΩΝ ΡΥΠΩΝ ΣΤΟ ΝΕΡΟ Σκοπός της άσκησης Σκοπός της άσκησης είναι η εξοικείωση με μεθόδους διαχωρισμού που εφαρμόζονται στην περιβαλλοντική ανάλυση, όπως η εκχύλιση, για τον προσδιορισμό οργανικών μικρορυπαντών στο υδάτινο περιβάλλον. Θεωρητικό υπόβαθρο Ο προσδιορισμός των επιπέδων της ρύπανσης των φυσικών νερών που οφείλεται στην παρουσία οργανικών μικρορυπαντών (υπολείμματα φυτοφαρμάκων, πολυχλωριωμένα διφαινύλια, πολυαρωματικοί υδρογονάνθρακες κ.α) γίνεται με τη χρήση αναλυτικών τεχνικών που απαιτούν ένα πρώτο στάδιο απομόνωσης και προσυγκέντρωσης των ενώσεων αυτών. Η εκχύλιση είναι μια από τις κατεξοχήν χρησιμοποιούμενες μεθόδους διαχωρισμού. Η ευρεία χρήση της οφείλεται στο ότι είναι απλή και γρήγορη στην εφαρμογή, ενώ μέσω αυτής επιτυγχάνονται ποσοτικοί διαχωρισμοί. Η συνήθης περίπτωση διαχωρισμού με εκχύλιση είναι η εκχύλιση ενός διαλύματος ουσιών με χρήση ενός διαλύτη, η οποία βασίζεται στην κατανομή των διαλυμένων ουσιών μεταξύ δύο υγρών που πρακτικά δεν αναμειγνύονται (υγρή-υγρή εκχύλιση). Έτσι για την απομόνωση οργανικών ενώσεων από το νερό χρησιμοποιείται κατάλληλος οργανικός διαλύτης ( πχ. εξάνιο, διχλωρομεθάνιο ). Με την τεχνική αυτή δοσμένος όγκος του προς εκχύλιση υδατικού δείγματος φέρεται σε επαφή με δοθέντα όγκο οργανικού διαλύτη μέσα σε διαχωριστική χοάνη και αναταράσσεται μέχρι να αποκατασταθεί η ισορροπία. Μετά την αποκατάσταση της ισορροπίας οι δύο φάσεις διαχωρίζονται με εκροή της κάτω στοιβάδας από τη χοάνη. Η διαλυμένη οργανική ουσία Α κατανέμεται μεταξύ των δύο φάσεων και στην κατάσταση ισορροπίας ισχύει η σχέση (νόμος κατανομής): [Α] 2 /[Α] 1 =Κ D όπου [Α] 1 και [Α] 2 είναι οι συγκεντρώσεις της ουσίας Α στο νερό και τον οργανικό διαλύτη αντίστοιχα και Κ D η σταθερά ισορροπίας, γνωστή ως συντελεστής κατανομής. Η παραπάνω σχέση ισχύει όταν η διαλυμένη ουσία βρίσκεται με την ίδια μορφή και στα δύο μη αναμυγνυόμενα υγρά (φάσεις). Αλλιώς αν λαμβάνει χώρα 12

14 διάσταση ή σύζευξη ή πολυμερισμός ή συμπλοκοποίηση της διαλυμένης ουσίας μιλάμε για λόγο κατανομής D=C 2 /C 1. Αν υποθέσουμε ότι W o g της ουσίας Α περιέχονται αρχικά σε V 1 ml νερού και αυτά εκχυλίζονται διαδοχικά με ίσα κλάσματα V 2 ml του οργανικού διαλύτη, ο λόγος κατανομής είναι D=C 2 /C 1 και μετά την απομάκρυνση της οργανικής φάσης παραμένουν στην υδατική φάση W 1 g διαλυμένης ουσίας: W 1 =W o [V 1 /(DV 2 +V 1 )] Και κατόπιν n εκχυλίσεων: W n =W o [V 1 /(DV 2 +V 1 )] n Από την παραπάνω εξίσωση φαίνεται ότι το W n είναι τόσο μικρότερο, και επομένως η εκχύλιση τόσο αποτελεσματικότερη, όσο μεγαλύτεροι είναι ο λόγος κατανομής D και ο όγκος του εκχυλιστικού μέσου V 2. Για δοθέντα όγκο V εκχυλιστικού μέσου, η εκχύλιση είναι τόσο αποτελεσματικότερη όσο μεγαλύτερος είναι ο αριθμός των εκχυλίσεων n κάθε φορά με τον ίδιο όγκο V 2. Αντί για τη χρήση οργανικού διαλύτη ως εκχυλιστικού μέσου μπορεί να χρησιμοποιηθεί κατάλληλο στερεό προσροφητικό υλικό και η κατανομή της διαλυμένης ουσίας γίνεται πλέον μεταξύ του στερεού και της υδατικής φάσης μια διαδικασία γνωστή ως υγρή στερεά εκχύλιση (solid phase extraction). Η τεχνική αυτή έχει αναπτυχθεί τα τελευταία χρόνια για την εκχύλιση οργανικών μικρορυπαντών από το νερό και επιτυγχάνει και ταυτόχρονη προσυγκέντρωση των ουσιών που εκχυλίζονται. Το προσροφητικό υλικό είναι συνήθως κάποιο πολυμερές υλικό ή υποκατεστημένη σίλικα και βρίσκεται είτε μέσα σε μικροστήλη (SPEcartridge) είτε μέσα σε μεμβράνη που έχει μορφή δίσκου (SPE-disk). Η εκχύλιση και προσυγκέντρωση γίνεται σε τρία στάδια. Καταρχήν η μικροστήλη ή ο δίσκος εκχύλισης τοποθετούται σε κατάλληλη διάταξη διήθησης υπό κενό και έρχονται σε επαφή με μικρή ποσότητα οργανικού διαλύτη. Στο δεύτερο στάδιο διηθείται υπό κενό το δείγμα του νερού μέσα από τη μικροστήλη ή το δίσκο και οι ενώσεις που θέλουμε να απομονώσουμε συγκρατούνται από το προσροφητικό υλικό. Στο τελευταίο στάδιο επλένουμε το προσροφητικό υλικό με μικρή ποσότητα κατάλληλου οργανικού διαλύτη και συλλέγουμε σε δοκιμαστικό σωλήνα το 13

15 έκλουσμα που περιέχει πλέον τις οργανικές ενώσεις που συγκρατήθηκαν στο προσροφητικό υλικό. Πειραματική πορεία Υγρή-στερεή εκχύλιση φυτοφαρμάκου από υδατικό δείγμα και φασματοφωτομετρικός προσδιορισμός της συγκέντρωσης αυτού. 1. Τοποθετούμε στη συσκευή διήθησης ένα δίσκο εκχύλισης (C18 ή SDB) 2. Προσθέτουμε 5 ml ακετονιτρίλιο και αφήνουμε για 3 λεπτά 3. Ανοίγουμε την αντλία κενού και στεγνώνουμε το δίσκο 4. Κλείνουμε την αντλία προσθέτουμε 5ml μεθανόλη και αφήνουμε για 3 λεπτά 5. Ανοίγουμε την αντλία και προσθέτουμε 5ml απεσταγμένο νερό χωρίς να αφήσουμε το δίσκο να στεγνώσει και προσθέτουμε γρήγορα το δείγμα του νερού (500 ml) 6. Αφού περάσει το δείγμα στεγνώνουμε το δίσκο υπό κενό, τοποθετούμε στη συσκευή ένα δοκιμαστικό σωλήνα και εκπλένουμε 2 φορές με 5 ml ακετονιτρίλιο. 7. Συμπυκνώνουμε το δείγμα στα 5 ml σε ρεύμα αζώτου. 8. Μετράμε την απορρόφηση στο λ max και με τη βοήθεια πρότυπης καμπύλης υπολογίζουμε τη συγκέντρωση του φυτοφαρμάκου στο δείγμα. Ερωτήσεις 1. Πόσα mg πρέπει να ζυγίσετε για να παρασκευάσετε 50 ml πρότυπο διάλυμα σε ακετονιτρίλιο του φυτοφαρμάκου rimsulfuron συγκέντρωσης 100 ppm από στερεή καθαρή ουσία καθαρότητας 97%; 2. Πόσα mg πρέπει να ζυγίσετε για να παρασκευάσετε ανάλογο διάλυμα του φυτοφαρμάκου metalaxyl από στερεή καθαρή ουσία καθαρότητας 99% 3. Από το πρότυπο διάλυμα των 100 ppm να υπολογίσετε πώς μπορούμε με διαδοχικές αραιώσεις να παρασκευάσουμε πρότυπα διαλύματα συγκεντρώσεων 0,5 1 2,5 5 7,5 10 και 15 ppm 14

16 4. Να βρεθεί το λ max και να κατασκευαστεί η πρότυπη καμπύλη από τα πρότυπα διαλύματα 5. Πόσα ml πρότυπου διαλύματος φυτοφαρμάκου πρέπει να προσθέσω σε 500 ml νερού βρύσης ώστε να έχουμε τελική συγκέντρωση, 0,3 0,2 0,1 0,05 0,02 0,01 ppm; 6. Να υπολογίσετε την % ανάκτηση (R) της εκχύλισης για το δείγμα νερού που εκχυλίσατε (ένα από αυτά που παρασκευάσατε στην ερώτηση 5) ως εξής: % R=(Cτ ελ /C αρχ )x100 15

17 ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΟΡΓΑΝΙΚΩΝ ΡΥΠΩΝ Σκοπός της άσκησης Σκοπός της άσκησης είναι η εξοικείωση με τη χρήση του αέριου χρωματογράφου για τον ποιοτικό και ποσοτικό προσδιορισμό οργανικών ρύπων. Θεωρητικό υπόβαθρο Η χρωματογραφία είναι μια μέθοδος διαχωρισμού των συστατικών ενός μίγματος ενώσεων. Όλα τα συστήματα χρωματογραφίας περιλαμβάνουν μια στατική και μια κινητή φάση. Ο διαχωρισμός οφείλεται στη διαφορετική κατανομή που παρουσιάζει κάθε συστατικό του μίγματος μεταξύ των δύο φάσεων. Όλοι οι τύποι χρωματογραφικού διαχωρισμού βασίζονται στα εξής: προσρόφηση, κατανομή, ιοντικό φορτίο, μέγεθος του μορίου, σημείο ζέσεως. Μια ή περισσότερες από αυτές τις ιδιότητες αξιοποιούμε για την επίτευξη του διαχωρισμού στις διάφορες χρωματογραφικές τεχνικές. Όλοι οι τύποι χρωματογραφίας μπορούν να αποδοθούν με το παρακάτω σχήμα: Εισαγωγή δείγματος διαχωρισμός ανίχνευση Η αέρια χρωματογραφία είναι κατάλληλη για την ανάλυση δειγμάτων αερίων ή πτητικών υγρών. Για την εισαγωγή του δείγματος στη στήλη χρησιμοποιείται ένας θερμοστατούμενος εισαγωγέας. Οι ατμοί του δείγματος που παράγονται στον εισαγωγέα (όταν πρόκειται για πτητικά υγρά) παρασύρονται μέσα στη στήλη από το φέρον αέριο. Τα συστατικά του δείγματος αλληλεπιδρούν με τη στατική φάση της στήλης, συγκρατούνται περισσότερο ή λιγότερο χρόνο, διαχωρίζονται και εξέρχονται από αυτή. Η στήλη βρίσκεται μέσα σε ειδικό θερμοστατούμενο θάλαμο (φούρνος) Το δείγμα στη συνέχεια εισέρχεται στον ανιχνευτή ο οποίος παράγει ένα ηλεκτρονικό σήμα για κάθε ένωση που φτάνει σε αυτόν και μπορεί να την ανιχνεύσει. Το σήμα ψηφιοποιείται και είτε μέσα από το κατάλληλο λογισμικό απεικονίζεται στην οθόνη ενός υπολογιστή με τη μορφή μιας χρωματογραφικής κορυφής, είτε καταγράφεται 16

18 πάλι με την ίδια μορφή σε ένα καταγραφικό όργανο πάνω σε χαρτί. Με αυτόν τον τρόπο παράγεται ένα χρωματογράφημα για κάθε χρωματογραφική ανάλυση, το οποίο είναι η «γραφική παράσταση» της απόκρισης του ανιχνευτή στις ενώσεις που περιέχονται στο δείγμα, σε σχέση με το χρόνο. Κάθε αέρια χρωματογραφική ανάλυση χαρακτηρίζεται από τις χρωματογραφικές συνθήκες. Αυτές περιλαμβάνουν: Χαρακτηριστικά της στήλης: είδος (πχ. τριχοειδής), υλικό πλήρωσης (πχ. μεθυλ-σιλοξάνιο), μήκος, διάμετρος, πάχος φιλμ Είδος ανιχνευτή Αέρια: είδος και ροή του φέροντος και των βοηθητικών αερίων Θερμοκρασίες φούρνου: Ισόθερμη ανάλυση ή θερμοκρασιακό πρόγραμμα εισαγωγέα ανιχνευτή Όγκος και είδος έγχυσης του δείγματος Η επιλογή των χρωματογραφικών συνθηκών καθορίζεται από τις ιδιότητες των ενώσεων που θέλουμε να προσδιορίσουμε Α. ΠΟΙΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ Για να ταυτοποιήσουμε μια ένωση σε ένα δείγμα χρησιμοποιούμε το χρόνο συγκράτησης (retention time Rt) της αντίστοιχης κορυφής αυτής, που απεικονίζεται στο χρωματογράφημα το οποίο λαμβάνουμε κάτω από δεδομένες χρωματογραφικές συνθήκες. Για να προσδιορίσουμε το χρόνο συγκράτησης μιας συγκεκριμένης ένωσης σε ένα άγνωστο δείγμα, αναλύουμε στις ίδιες χρωματογραφικές συνθήκες ένα πρότυπο δείγμα που περιέχει την ένωση στόχο και συγκρίνουμε τις αντίστοιχες κορυφές στα δύο χρωματογραφήματα. Β. ΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ Το εμβαδό (ή το ύψος) της κορυφής που αντιστοιχεί σε μία ένωση που αναλύουμε είναι συνάρτηση της συγκέντρωσης της ένωσης στο δείγμα. Υπάρχουν δύο τρόποι να ποσοτικοποιήσουμε μια ένωση σε ένα άγνωστο δείγμα. 17

19 1. Με χρήση καμπύλης αναφοράς Αναλύουμε διαδοχικά τουλάχιστον 3 διαφορετικές συγκεντρώσεις της ένωσης σε πρότυπα δείγματα και κατασκευάζουμε διαγράμματα συγκέντρωσης-εμβαδού. Χαράσουμε την ευθεία με τη μέθοδο των ελαχίστων τετραγώνων. Όσο πιο κοντά στη μονάδα βρίσκεται ο συντελεστής συσχέτισης R 2 στη μονάδα τόσο πιο γραμμική είναι η απόκριση του ανιχνευτή για τη συγκεκριμένη ένωση και στη συγκεκριμένη περιοχή συγκεντρώσεων. Από το εμβαδό της κορυφής της ένωσης στο χρωματογράφημα του άγνωστου δείγματος και την εξίσωση της ευθείας υπολογίζουμε τη συγκέντρωση της ένωσης. 2. Με χρήση εσωτερικού προτύπου Στη μέθοδο αυτή τα εμβαδά (ή τα ύψη) των ενώσεων που θέλουμε να προσδιορίσουμε σε ένα άγνωστο δείγμα κανονικοποιούνται ως προς το εμβαδό (ή το ύψος) μιας ένωσης που χρησιμοποιείται σαν εσωτερικό πρότυπο και η οποία εισάγεται ακριβώς σε ίση ποσότητα τόσο στο άγνωστο δείγμα όσο και σε ένα πρότυπο διάλυμα που περιέχει τις ενώσεις στόχους. Από τις συγκεντρώσεις και τα εμβαδά των ενώσεων στο πρότυπο διάλυμα υπολογίζουμε ένα συντελεστή κανονικοποίησης ως εξής: C is Area A K C A Area is όπου C is,a, οι συγκεντρώσεις του εσωτερικού προτύπου και της ένωσης Α αντίστοιχα και Area s, A, το εμβαδό της κορυφής του εσωτερικού προτύπου και της ένωσης Α αντίστοιχα στο πρότυπο διάλυμα. Στο άγνωστο δείγμα με χρήση της παραπάνω εξίσωσης, όπου άγνωστο είναι πλέον το C A, μπορούμε να υπολογίσουμε τη συγκέντρωση της ένωσης στόχο. Πειραματική πορεία Α. Σύστημα αέριας χρωματογραφίας Shimadzu 2010-ECD Ανιχνευτής : θερμικού ιονισμού φλόγας (ECD) 18

20 Στήλη: τριχοειδής με πληρωτικό υλικό (5% διφαινυλο-95%διμεθυλο σιλοξάνιο) 30m x 0,25mm εσωτερική διάμετρο x 0,25μm πάχος φιλμ. Φέρον αέριο: He (και ως make up) Αέρια ανιχνευτή: αέρας, H 2 Έγχυση δείγματος: 1μl, split (10:1) B. Διαλύματα 1. Πρότυπο διάλυμα (μίγμα) φυτοφαρμάκων συγκέντρωσης 2ppm σε μεθανόλη 2. Άγνωστης συγκέντρωσης δείγμα σε μεθανόλη Γ. Λειτουργία οργάνου 1. Ανοίγουμε το διακόπτη του οργάνου, ανοίγουμε το ήλιο και το άζωτο, ανοίγουμε τον υπολογιστή. 2. Ορίζουμε από το πληκτρολόγιο του οργάνου θερμοκρασίες για τη στήλη, τον εισαγωγέα και τον ανιχνευτή: COL: 40 o C, INJ: 250 o C, DET: 280 o C 3. Από το πρόγραμμα λειτουργίας του οργάνου φορτώνουμε μια προϋπάρχουσα μέθοδο (method file) ή δημιουργούμε ένα καινούριο αρχείο μεθόδου. 4. Στο αρχείο μεθόδου εισάγουμε όλες τις παραμέτρους της χρωματογραφικής ανάλυσης (θερμοκρασίες εισαγωγέα, ανιχνευτή, θερμοκρασιακό πρόγραμμα στήλης, πιέσεις-ροές αερίων, χαρακτηριστικά στήλης, είδος έγχυσης κλπ) και στοιχεία για την ολοκλήρωση των κορυφών του χρωματογραφήματος (παράμετροι ολοκλήρωσης), και τη μορφή της αναφοράς που θα εκτυπωθεί. 5. Δημιουργούμε ένα αρχείο δεδομένων (data file) με στοιχεία για το δείγμα που θα αναλύσουμε και πατάμε Single Run, για να μας ανοίξει το σχετικό παράθυρο 6. Πατάμε OK οπότε διαβιβάζονται οι παράμετροι της ανάλυσης στον αέριο χρωματογράφο. 7. Με τη βοήθεια μιας μικροσύριγγας παίρνουμε 1μl από το δείγμα και το εισάγουμε στον εισαγωγέα. ΠΡΟΣΟΧΗ: Εισάγουμε κάθετα τη βελόνα, χωρίς μεγάλη πίεση προσέχοντας να μην στραβώσουμε τη βελόνα. 8. Πατάμε START στον χρωματογράφο και ξεκινά ή ανάλυση 19

21 Το χρωματογράφημα προβάλεται στην οθόνη του υπολογιστή 9. Μόλις ολοκληρωθεί η ανάλυση πατάμε analyze, για να γίνει η ολοκλήρωση των κορυφών σύμφωνα με τις παραμέτρους που έχουμε ορίσει στη μέθοδο. 10. Για να δούμε τα στοιχεία της ολοκλήρωσης επιλέγουμε report. 11. Για να τυπώσουμε το χρωματογράφημα και τα αποτελέσματα της ολοκλήρωσης επιλέγουμε print report. 12. Στο τέλος της ανάλυσης για να κλείσουμε το όργανο, θέτουμε Τ INJ =70 o C, T DET =100 o C, T COL =40 o C,. Μόλις επιτευχθουν οι θερμοκρασίες κλέινουμε το ήλιο, το άζωτο και το διακόπτη του οργάνου. Δ. Ανάλυση προτύπου διαλύματος 1. Με τη διαδικασία που περιγράφηκε προηγουμένως δημιουργούμε ένα αρχείο μεθόδου και ένα αρχείο δεδομένων. 2. Κάνουμε ένεση 1μl από πρότυπο διάλυμα φυτοφαρμάκων συγκεντρώσεων 2ppm για κάθε μια από τις ενώσεις. Λαμβάνουμε το χρωματογράφημα και τα αποτελέσματα της ολοκλήρωσης Συνθήκες λειτουργίας:τ INJ =280 o C, T DET =300 o C linear flow He=1ml/min, split ratio= 10:1 Πρόγραμμα θερμοκρασίας φούρνου: αρχική 100 ο C, με ρυθμό 10 o C/min στους 250 o C παραμονή 15 min. Να καταγράψετε τους χρόνους συγκράτησης Rt για κάθε ένωση. (Η σειρά που εκλούονται από τη στήλη θα δοθεί) Να υπολογίσετε τους συντελεστές Κ για κάθε μια από τις ενώσεις στο πρότυπο διάλυμα σε σχέση με την ένωση που θα ορισθεί ως εσωτερικό πρότυπο. Να επαναλάβετε την ανάλυση θέτοντας αρχική θερμοκρασία 150 o C στο θερμοκρασιακό πρόγραμμα. Τι παρατηρείτε σε σχέση με τους χρόνους συγκράτησης. 20

22 E. Ανάλυση άγνωστου δείγματος 1. Προσθέστε από ένα πυκνό διάλυμα εσωτερικού πρότυπου που θα σας δοθεί, κατάλληλο όγκο ώστε να έχετε στο άγνωστο δείγμα συγκέντρωση 2 ppm εσωτερικού προτύπου. 2. Δημιουργείστε ένα καινούργιο αρχείο δεδομένων και κάντε ένεση 1μl από το άγνωστο δείγμα στις ίδιες συνθήκες που κάνατε την ανάλυση του πρότυπου διαλύματος (δηλαδή χρησιμοποιείστε το ίδιο method file). Να ταυτοποιήσετε τις ενώσεις που περιέχονται στο άγνωστο δείγμα Να υπολογίσετε τη συγκέντρωση κάθε ένωσης στο άγνωστο δείγμα χρησιμοποιώντας τη μέθοδο του εσωτερικού προτύπου Στην εργασία σας να παραδοθούν και τα χρωματογραφήματα μαζί με τα αποτελέσματα. 21

23 ΦΑΣΜΑΤΟΣΚΟΠΙΑ Οι φασματοσκοπικές μέθοδοι, ανήκουν στις οπτικές μεθόδους ανάλυσης. Σε αυτές μετριέται η ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία που προέρχεται από την ύλη ή αλληλεπιδρά με αυτή. Βασίζονται : α) στην ικανότητα που έχουν διάφορες ουσίες, να εκπέμπουν ή να αλληλεπιδρούν με ακτινοβολίες χαρακτηριστικών συχνοτήτων β) στην καταγραφή φασμάτων, ( μήκος κύματος, ένταση ακτινοβολίας) Κάποιες από τις φασματοσκοπικές τεχνικές οι οποίες χρησιμοποιούνται πολύ συχνά είναι οι πιο κάτω : - Υπεριώδους ορατού (Ultraviolet Visible, UV-Vis) Στα φάσματα υπεριώδους ακτινοβολίας, ( nm) και ορατού φωτός, ( nm), συμβαίνει εκλεκτική απορρόφηση ενέργειας από τα μόρια και διέγερση των ηλεκτρονίων σθένους από τη βασική τους στάθμη σε αντιδεσμική ψηλότερης ενέργειας. Για το λόγο αυτό τα συγκεκριμένα φάσματα ονομάζονται ηλεκτρονικά. - Υπερύθρου (Infra Red IR) Η απορρόφηση υπέρυθρης ακτινοβολίας προκαλεί διεγέρσεις δονήσεως, παραμόρφωσης και περιστροφής των μορίων. - Πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (Nuclear Magnetic Resonance NMR) Στην περίπτωση αυτή συμβαίνουν μεταβολές στην ενέργεια των πυρήνων Ηλεκτρομαγνητικό φάσμα Στον πίνακα που ακολουθεί παρουσιάζονται τα τμήματα ακτινοβολίας και τα μήκη κύματος που αντιστοιχούν σε αυτά. ΤΜΗΜΑ ΑΚΤΙΝΟΒΟΛΙΑΣ ΜΗΚΟΣ ΚΥΜΑΤΟΣ Ακτίνες Χ 0,3 100 Å Υπεριώδες nm Ορατό nm Εγγύς υπέρυθρο 0,8-2,5μm( cm -1 ) Υπέρυθρο 2,5 15 μm( cm -1 ) Άπω Υπέρυθρο μm( cm -1 ) Μικροκύματα 0,2 7,0 mm Ραδιοσυχνότητες m Φασματοσκοπία Υπεριώδους Ορατού (UV Vis, nm) Όταν καταγράφετε η απορροφημένη ενέργεια σε συνάρτηση με το μήκος κύματος, έχουμε τα ηλεκτρονικά φάσματα απορρόφησης που κύρια χρησιμοποιούνται στην οργανική. Όταν έχουμε διέγερση λόγω προσφοράς ενέργειας και καταγράφεται η ακτινοβολία που εκπέμπουν τα ηλεκτρόνια μεταπίπτοντας από τη διεγερμένη κατάσταση στη βασική, μιλάμε για ηλεκτρονικά φάσματα εκπομπής που δεν βρίσκουν μεγάλη εφαρμογή στα οργανικά μόρια γιατί αυτά καταστρέφονται λόγω των δραστικών συνθηκών διέγερσης που χρησιμοποιούνται. 22

24 Στις μεθόδους φασματοσκοπίας, μετριέται η απορρόφηση Α, ή η διαπερατότητα Τ του δείγματος και βάση αυτών, γίνεται άλλοτε ποιοτική και άλλοτε ποσοτική ανάλυση. Ισχύει η σχέση, Α = -logτ. Τα διαλύματα τοποθετούνται σε ειδικά δοχεία, τις κυψελίδες, που είναι διαφανή στο υπεριώδες φώς. Τα όργανα που χρησιμοποιούνται λέγονται φασματοφωτόμετρα υπεριώδους-ορατού και αποτελούνται από : - Πηγή ακτινοβολίας Λυχνία υδρογόνου ή υδραργύρου για το υπεριώδες και βολφραμίου για το ορατό. - Αναλυτή φωτός Δίνει μονοχρωματική δέσμη φωτός με συνεχώς μεταβαλλόμενο μήκος κύματος. - Ανιχνευτή έντασης έντασης ακτινοβολίας μετά τη δίοδο από το διάλυμα Φωτοκύτταρο - Καταγραφικό σύστημα. Φάσμα απορρόφησης Φάσμα απορρόφησης, ονομάζουμε την γραφική παράσταση της απορρόφησης, συναρτήσει του μήκους κύματος Α Π Ο Ρ Ρ Ο Φ Η Σ Η λmax ΜΗΚΟΣ ΚΥΜΑΤΟΣ(λ, nm) Με λmax, συμβολίζεται το μήκος κύματος στο οποίο παρατηρείται το μέγιστο της απορρόφησης. Νόμος των Beer-Lambert Η απορρόφηση Α, συνδέεται με τη συγκέντρωση c της ουσίας, με βάση το νόμο του Beer. Σύμφωνα με το νόμο του Beer, όταν η μονοχρωματική ακτινοβολία διέρχεται από διάλυμα που περιέχει ουσία που απορροφά, η ισχύς της ακτινοβολίας, ελαττώνεται προοδευτικά κατά μήκος της διαδρομής, λόγω απορρόφησής της από την ουσία. 23

25 Η μείωση της ισχύος της ακτινοβολίας, εξαρτάται από τη συγκέντρωση της ουσίας που απορροφά και από την απόσταση που διανύει η δέσμη μέσα στο διάλυμα. Α = logpo/p = -logt = a.b.c g/l = ε.b.c moll/l όπου : - Α : Η απορρόφηση - Ρο : Η ισχύς της προσπίπτουσας ακτινοβολίας - Ρ : Η ισχύς της εξερχόμενης ακτινοβολίας, μετά τη δίοδο από το διάλυμα. - Τ : Η διαπερατότητα που εκφράζεται επί τοις εκατό %Τ. - b : Το μήκος της διαδρομής που διανύεται στο διάλυμα, (αναφέρεται και σαν εσωτερικό πάχος κυψελίδας). - α : Σταθερά αναλογίας, που ονομάζεται απορροφητικότητα και χρησιμοποιείται όταν η συγκέντρωση c του διαλύματος εκφράζεται σε g/l. - ε : Σταθερά αναλογίας, που ονομάζεται μοριακή απορροφητικότητα και χρησιμοποιείται όταν η συγκέντρωση c του διαλύματος εκφράζεται σε moll/l, (ε = α.μ.β., όπου Μ.Β. = το μοριακό βάρος της ουσίας που απορροφά). Πρότυπη καμπύλη Α Π Ο Ρ Ρ Ο Φ Η Σ Η (Α) ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ (C) Ο νόμος του Beer, προϋποθέτει, ότι : - Ο μόνος μηχανισμός αλληλεπίδρασης της ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας και της διαλυμένης ουσίας, είναι η απορρόφηση. - Η προσπίπτουσα ακτινοβολία, είναι μονοχρωματική. - Η απορρόφηση, γίνεται σε ομοιόμορφης διατομής όγκο διαλύματος. - Ότι τα σωματίδια που απορροφούν, δρουν ανεξάρτητα μεταξύ τους και άσχετα με τον αριθμό και το είδος τους. Έτσι ακόμη και στην περίπτωση μίγματος ουσιών, ο νόμος του Beer ισχύει με τη μορφή : Α ολ. = Α 1 + Α Α n = ε 1 bc 1 + ε 2 bc 2 + ε n bc n Πρέπει να τονιστεί πως ο νόμος του Beer, δεν ισχύει για πυκνά διαλύματα, c>0.01f, γιατί σε αυτά οι αποστάσεις μεταξύ των σωματιδίων που απορροφούν είναι τόσο μικρές, ώστε κάθε ένα από αυτά να επηρεάζει την κατανομή φορτίου στα γειτονικά σωματίδια και συνεπώς και την ικανότητά τους να απορροφούν ακτινοβολία ορισμένου μήκους κύματος. 24

26 Εφαρμογές φασματοσκοπικών τεχνικών Οι φασματοσκοπικές μέθοδοι, βρίσκουν πολλές εφαρμογές, όπως : - Στον προσδιορισμό δομής, (γίνεται στην περιοχή του υπέρυθρου). - Στην ποιοτική ανάλυση, (γίνεται στην περιοχή του υπέρυθρου). - Στην ποσοτική ανάλυση, (γίνεται στην περιοχή υπεριώδους ορατού). - Στην ανάλυση μίγματος ουσιών. - Στον προσδιορισμό του τύπου συμπλόκου ιόντος. - Στον προσδιορισμό της σταθεράς ιονισμού πρωτεολυτικού δείκτη. Οι φασματοσκοπικές μέθοδοι, είναι οι πιο συχνά χρησιμοποιούμενες στην ποσοτική ανάλυση. Αυτό οφείλεται στη μεγάλη ευαισθησία και εκλεκτικότητα, στην ταχύτητα και την απλότητα, στη δυνατότητα αυτοματοποίησης κλπ.. Χρωμοφόρες ομάδες Στη φασματοσκοπία αυτή χρωμοφόρο, ονομάζεται το τμήμα του μορίου το οποίο ευθύνεται για την απορρόφηση της ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας. Αυτό είναι δυνατόν να είναι μια χαρακτηριστική ομάδα, ένας απομονωμένος διπλός δεσμός ή ένα σύστημα πολλαπλών δεσμών. Αυξόχρωμες ομάδες, είναι ομάδες κορεσμένες με ελεύθερα ζεύγη ηλεκτρονίων όπως ΟΗ, -ΟR, -ΝΗ 2, αλογόνα κλπ. Κάποιες χαρακτηριστικές χρωμοφόρες ομάδες είναι οι : C=O, C=C, C=N, N=O, N=N κλπ. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Σκοπός : Ο ποσοτικός προσδιορισμός α- και β- χλωροφύλλης με φασματοσκοπική μέθοδο Χλωροφύλλη Xρωστική ονομάζεται κάθε ουσία που απορροφά το ορατό φως. Κάποιες χρωστικές απορροφούν το φως σε όλα τα μήκη κύματός του και είναι μαύρες, ενώ άλλες απορροφούν μερικά μόνο μήκη κύματος και αντανακλούν τα υπόλοιπα. Η χλωροφύλλη, στην οποία οφείλεται το πράσινο χρώμα των φύλλων, ενεργοποιείται κυρίως από την ιώδη, την κυανή και την ερυθρή ακτινοβολία, αντανακλά όμως το πράσινο φως (Σχήμα 2). Εκτός από τις χλωροφύλλες υπάρχουν οι δευτερεύουσες ή συμπληρωματικές χρωστικές που απορροφούν το φώς και είναι τα καροτενοειδή και οι φυκοβιλίνες. Υπάρχουν περισσότερα από ένα είδη χλωροφύλλης (χλωροφύλλη a, b, c, κλπ.) που διαφέρουν μεταξύ τους στη μοριακή τους δομή Η χλωροφύλλη a έχει μοριακό τύπο C 20 H 39 OH και συναντάται σε όλους τους φωτοσυνθετικούς οργανισμούς, ευκαρυωτικούς και προκαρυωτικούς (Σχήμα 1) 25

27 Σχήμα 1 Σχήμα 2 26

28 Πορεία - Κόβουμε και λειοτριβούμε σε ιγδίο πορσελάνης, 1gr φύλλων σπανακιού - Εκχυλίζουμε τις χρωστικές με προσθήκη 25ml ακετόνης - Κάνουμε διήθηση - Μεταφέρουμε το διήθημα σε ογκομετρική φιάλη των 100ml την οποία και συμπληρώνουμε με ακετόνη έως τη χαραγή - Μηδενίζουμε το φωτόμετρο με την ακετόνη - Φωτομετρούμε στα 645nm, 663nm και στα 652nm - Οι ποσότητες των α- και b- χλωροφυλλών καθώς και της ολικής χλωροφύλλης σε mg/l, δίνονται από τους τύπους που ακολουθούν Ca = 12,7A 663-2,69A 645 Cb = 22,9A 645-4,68A 663 C = Ca + Cβ = A 652 x 1000/34,5 27