ΑΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΡΑΝΕΡΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΑΝΑΡΤΥΞΗΣ ΚΑΙ ΜΟΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ

Transcript

1 ΑΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΡΑΝΕΡΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΑΝΑΡΤΥΞΗΣ ΚΑΙ ΜΟΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Μεταπτυχιακό πρόγραμμα ςπουδϊν: Εφαρμοςμζνθ Γενετικι και Βιοτεχνολογία Διπλωματικι Εργαςία: «Ανίχνευςθ των E6 και E7-mRNAs του ιοφ HPV με κυτταρομετρία ροισ: Διερεφνθςθ τθσ αξίασ τθσ μεκόδου ςτισ προκαρκινικζσ αλλοιϊςεισ του τραχιλου τθσ μιτρασ ςε ςχζςθ με τθν κυτταρομορφολογία και το HPV DNA test» Επιμζλεια: Zάχου Μαρία Επιβλζποντεσ: Γιάγκου Μθνάσ, Αναπλθρωτισ Κακθγθτισ Γιαννάκθ Ευκαλία, PhD Ανοςοβιολογίασ Θεςςαλονίκθ 2009

2 - 1 - Περιεχόμενα Πρόλογοσ..2 Περίλθψθ..4 Ειςαγωγι..5 ΗPV και καρκίνοσ τραχιλου.6 Επικράτθςθ του ιοφ των ανκρωπίνων Θθλωμάτων (ΗPV)-ιϊκοί τφποι.8 Δομι και βιολογικόσ κφκλοσ ιοφ..9 Ζκφραςθ γονιδίων HPV ςε καρκίνουσ τραχιλου 10 Η μετάδοςθ του ιοφ HPV ςτο κφτταρο ξενιςτι 12 Μθ παραγωγικι και παραγωγικι φλεγμονι.13 Ο καρκίνοσ του τραχιλου τθσ μιτρασ 15 Ρροκαρκινικζσ Αλλοιϊςεισ-Ενδοεπικθλιακι Νεοπλαςία Τραχιλου..17 Μαηικόσ Ζλεγχοσ για καρκίνο τραχιλου-ζλεγχοσ HPV..21 Μοριακζσ τεχνικζσ ανίχνευςθσ HPV 23 κοπόσ.27 Τλικά και Μζκοδοι.28 Δοκιμαςία HC2 28 ΗPV DNA μικροςυςτοιχίεσ..35 HPV Oncotect Test kit.43 Aποτελζςματα 48 Σφγκριςθ τθσ ανίχνευςθσ των Ε6 και Ε7-mRNAs με τθν κυτταρολογικι διάγνωςθ για τον εντοπιςμό ενδοεπικθλιακϊν αλλοιϊςεων (SIL).48 Σφγκριςθ τθσ ανίχνευςθσ ζκφραςθσ των ενδοκυττάριων Ε6 και Ε7 mrnas με τθ δοκιμαςία υβριδιςμοφ 2 θσ γενεάσ (HC2) 49 Συςχζτιςθ των επιπζδων HPV DNA με τθν κυτταρολογικι διάγνωςθ 53 Συςχζτιςθ των επιπζδων ζκφραςθσ των Ε6 και Ε7 mrnas με τθν κυτταρολογικιδιάγνωςθ 55 Συςχζτιςθ τθσ θλικίασ με τθ ςυχνότθτα HPV λοίμωξθσ και τθσ υπερζκφραςθσ των ενδοκυττάριων Ε6 και Ε7 μεταγραφθμάτων..57 Σφγκριςθ τθσ HPV mrna Flow FISH με τθ δοκιμαςία HC2 για τθν πρόβλεψθ του ιςτορικοφ τθσ HPV λοίμωξθσ ςε αρνθτικζσ διαγνϊςεισ..58

3 - 2 - Follow-up γυναικϊν με κωνοειδι εκτομι του τραχιλου ι με ιςτορικό αλλοίωςθσ LSIL/HSIL Μοριακι προςζγγιςθ 21 περιςτατικϊν 62 HPV τυποποίθςθ ςε follow up γυναικϊν με κετικι ζκφραςθ των ενδοκυττάριων Ε6 και Ε7-mRNAs. 72 Επαναλθψιμότθτα τθσ HPV mrna Flow FISH ςε κολποτραχθλικά επιχρίςματα υγρισ φάςθσ..75 υηιτθςθ..78 Βιβλιογραφία 97 Πρόλογοσ Η παροφςα διπλωματικι εργαςία πραγματοποιικθκε ςτο Αιματολογικό Eργαςτιριο του Αντικαρκινικοφ Νοςοκομείου Θες/νίκθσ «Θεαγζνειο» (Α.Ν.Θ.) ζπειτα από ςυνεργαςία με το Κυτταρολογικό Τμιμα, ςτα πλαίςια του Ρρογράμματοσ Μεταπτυχιακϊν Σπουδϊν του Τμιματοσ Βιολογίασ Α.Ρ.Θ. με κατεφκυνςθ «Εφαρμοςμζνθ Γενετικι και Βιοτεχνολογία» για το χρονικό διάςτθμα Θα ικελα να ευχαριςτιςω κερμά τον επιβλζποντα τθσ μεταπτυχιακισ διπλωματικισ μου εργαςίασ, Αναπλθρωτι Κακθγθτι Μοριακισ Βιολογίασ και Γενετικισ του Τμιματοσ Βιολογίασ του Α.Ρ.Θ., κ. Γιάγκου Μθνά για τθν κακοδιγθςι του και τισ πολφτιμεσ ςυμβουλζσ που μου προςζφερε κακϋόλθ τθν διάρκεια τθσ περιόδου. Η υπομονι και θ κατανόθςθ που ζδειξε βοθκϊντασ με ςτθν επίλυςθ των προβλθμάτων που προζκυπταν ιταν ιδιαίτερα ςθμαντικι για τθν πραγματοποίθςθ τθσ παροφςασ εργαςίασ κακϊσ και θ ψυχολογικι ςτιριξι του ςε κάκε μου βιμα κακϋόλθ τθ διάρκεια των φοιτθτικϊν μου χρόνων. Ζνα μεγάλο ευχαριςτϊ ςτθ Δρ. Ανοςοβιολογίασ και υπεφκυνθ του Τμιματοσ Κυτταρομετρίασ του Αιματολογικοφ Εργαςτθρίου του Α.Ν.Θ., κ.γιαννάκθ Ευκαλία, που ανζλαβε τθν εποπτεία τθσ παροφςασ μελζτθσ και για τθν εμπιςτοςφνθ που μου ζδειξε ανακζτοντάσ μου τθ ςυγκεκριμζνθ εργαςία. Θα ικελα ακόμθ να τθν ευχαριςτιςω για τθν άριςτθ ςυνεργαςία μασ, για τθν πολφτιμθ βοικειά τθσ ςτο πειραματικό μζροσ, ςτθν εκτίμθςθ και τθν αξιολόγθςθ των αποτελεςμάτων κακϊσ και για τισ απαντιςεισ ςτισ απορίεσ που ανζκυπταν.

4 - 3 - Οφείλω να ευχαριςτιςω τθν ΑϋΕπιμελιτρια του Αιματολογικοφ Τμιματοσ του Α.Ν.Θ., κ. Μαρκάλα Διμθτρα για τθ δυνατότθτα που μου ζδωςε να πραγματοποιιςω τθν παροφςα μελζτθ ςτο χϊρο του εργαςτθρίου και τθν Διευκφντρια του Κυτταρολογικοφ Τμιματοσ του Α.Ν.Θ., κ. Δεςτοφνθ-Ευτυχιάδου Χαρίκλεια για τθ δυνατότθτα που μου παρείχε να χρθςιμοποιιςω το χϊρο Tυποποίθςθσ και Μοριακισ Διερεφνθςθσ HPV, κυτταρολογικό υλικό (κολποτραχθλικά επιχρίςματα υγρισ φάςθσ) και κλινικζσ πλθροφορίεσ από το αρχείο του εργαςτθρίου, κακϊσ για τθν εμπιςτοςφνθ που ζδειξε ςτο πρόςωπό μου με τθν ανάκεςθ εκτζλεςθσ τεχνικϊν ανίχνευςθσ και τυποποίθςθσ HPV (HC2, HPV DNA μικροςυςτοιχίεσ). Δε κα μποροφςα να μθν ευχαριςτιςω όλο το προςωπικό τόςο του Αιματολογικοφ όςο και του Κυτταρολογικοφ Εργαςτθρίου για τθ βοικειά τουσ κατά τθν αρχικι εξοικίωςι μου ςτον εργαςτθριακό χϊρο, για το άριςτο και φιλικό κλίμα που επικράτθςε κακϋόλθ τθ διάρκεια εκπόνθςθσ τθσ παροφςασ μελζτθσ και ειδικά τουσ ειδικευόμενουσ κυτταρολόγουσ κ. Φυτιλι Ραναγιϊτα και κ. Μυγδάκο Νίκο για τθν άψογθ ςυνεργαςία μασ. Τζλοσ, κα ικελα να ευχαριςτιςω τον υποψιφιο διδάκτωρ του Τμιματοσ Βιολογίασ κ. Κοτηαμανίδθ Χαράλαμπο για τθν αμζριςτθ βοικειά του ςτο μζροσ τθσ ςτατιςτικισ ανάλυςθσ των αποτελεςμάτων.

5 - 4 - Περίλθψθ Η δεδομζνθ άμεςθ ςυςχζτιςθ του HPV με τθν τραχθλικι καρκινογζνεςθ επιβάλλει ςιμερα τθν ακριβζςτερθ ανίχνευςι του κακϊσ επίςθσ και τθ ςτενι παρακολοφκθςθ τθσ απρόβλεπτθσ βιολογικισ ςυμπεριφοράσ τθσ HPV λοίμωξθσ. Οι μζχρι ςιμερα τεχνικζσ ανίχνευςθσ DNA, όπωσ HC2 (hybrid capture 2) και PCR, ςτοχεφουν ςτθν ανίχνευςθ του L1 γονιδίου, που ςε περίπτωςθ ενςωμάτωςθσ του ιϊκοφ γονιδιϊματοσ ςτο χρωμόςωμα του ξενιςτι απορρυκμίηεται ι εξαλείφεται. Ωςτόςο, τα ογκογονίδια E6 και E7 είναι τα μόνα τμιματα του ιοφ που διατθροφν τθν ζκφραςι τουσ κατά τθν ενςωμάτωςθ του ιοφ ςτο κφτταρο ξενιςτι. Η ανίχνευςθ των mrnas των E6 και Ε7 γονιδίων του ιοφ HPV μασ δίνει πλθροφορίεσ ςχετικά με τθ φάςθ τθσ λοίμωξθσ (επιςωματικι ι ενςωματωμζνθ) και τθσ μθ αναςτρζψιμθσ αλλοίωςθσ. Στθν παροφςα μελζτθ αναφζρεται θ ανάπτυξθ μίασ τεχνικισ ανίχνευςθσ, με κυτταρομετρία ροισ (HPV mrna Flow FISH), των ενδοκυττάριων ιϊκϊν E6, E7 mrnas που εκφράηονται μετά από ενςωμάτωςθ του ιϊκοφ HPV γονιδιϊματοσ ςτα εξωτραχθλικά κφτταρα. Η τεχνικι αυτι αποτελεί δείκτθ κυτταρικοφ μεταςχθματιςμοφ κακϊσ διαπιςτϊνεται ςυςχζτιςθ κακοικειασ με τθν ενςωμάτωςθ του ιϊκοφ DNA ςτο γζνωμα του ξενιςτι. Από τθ ςυγκριτικι μελζτθ τθσ HPV mrna Flow FISH με τθν κυτταρομορφολογία και το HPV DNA test, προζκυψε ότι θ κετικι ζκφραςθ των ενδοκυττάριων Ε6/Ε7 mrnas ςυςχετίςτθκε πρωτίςτωσ με τθν κυτταρολογικι διάγνωςθ και κατά δεφτερον με το HPV DNA test. Eπειδι θ τεχνικι HPV mrna Flow FISH παρουςίαςε μεγαλφτερθ ευαιςκθςία ςε ςχζςθ με τον υβριδιςμό ΗC2, κυρίωσ ςε ςε ASCUS και ΗSIL αλλοιϊςεισ, θ ανίχνευςθ των Ε6/Ε7 mrnas των ογκογόνων ςτελεχϊν ίςωσ αποτελεί ζνα καλφτερο προγνωςτικό δείκτθ ςε ςχζςθ με τθν ανίχνευςθ του HPV DNA για τθν πρόβλεψθ μίασ μελλοντικισ εξζλιξθσ CIN2/CIN3 από ASCUS επιχρίςματα και τθν αναγνϊριςθ εκείνων των γυναικϊν με εμμζνουςεσ CIN3 αλλοιϊςεισ, που διατρζχουν υψθλό κίνδυνο

6 - 5 - εξζλιξθσ ςε διθκθτικό καρκίνωμα. Από τθν αξιολόγθςθ τθσ μεκόδου HPV mrna Flow FISH ωσ «κεραπευτικό τζςτ» ςυγκριτικά με τον υβριδιςμό HC2, διαπιςτϊκθκε ότι θ ανίχνευςθ των ενδοκυττάριων Ε6/Ε7 mrnas αποτελεί καταλλθλότερο δείκτθ επιτυχοφσ κεραπείασ περιορίηοντασ τον αρικμό των γυναικϊν που χριηουν ςτενισ παρακολοφκθςθσ μετά από κωνοειδι εκτομι τραχιλου. Πλα τα παραπάνω δείχνουν ότι θ παρουςία των ενδοκυττάριων Ε6/Ε7 mrnas του HPV, που εμπλζκεται ςτθν καρκινογζνεςθ, είναι πιο χριςιμθ ςε ςχζςθ με το HPV DNA test για τθν ανίχνευςθ ενεργϊν και πικανά εμμζνουςων λοιμϊξεων. Ειςαγωγι Γενικά Τα οξυτενι κονδυλϊματα αναφζρονται ιδθ από τθν εποχι του Ιπποκράτθ, όμωσ μόνο κατά τα τζλθ του 18 ου αιϊνα ζγινε κατανοθτι θ μολυςματικότθτά τουσ. Κακϊσ εγκαταλείφκθκε θ άποψθ ότι τα γεννθτικά κθλϊματα αποτελοφςαν ζνδειξθ ςφφιλθσ (Hunter, 1786) αναπτφχκθκε μια άλλθ λανκαςμζνθ αντίλθψθ, ότι αυτά προκαλοφνταν από τθ γονόρροια, γιατί ςυχνά θ εμφάνιςι τουσ ςυνζπιπτε με το τζλοσ μιασ τζτοιασ λοίμωξθσ, τθσ οποίασ θ χρονικι διάρκεια ιταν μεγαλφτερθ κατά τθν προ των αντιβιοτικϊν εποχι (Pirrie, 1852). Η άποψθ, ότι τα γεννθτικά κθλϊματα ιταν άμεςα ςυνδεδεμζνα με τθ γονοκοκκικι λοίμωξθ, παρζμεινε ζωσ και τθν τρίτθ δεκαετία του 20 ου αιϊνα. Ο Ciuffo ιταν ο πρϊτοσ ερευνθτισ που τεκμθρίωςε πειραματικά τθν ιογενι αιτιολογία των δερματικϊν μυρμθκιϊν με τον ενοφκαλμιςμό πεϊκϊν μυρμθκιϊν ςτο δζρμα άλλων τμθμάτων του ςϊματοσ, με αποτζλεςμα τθν ανάπτυξθ επιπζδων ι κοινϊν μυρμθκιϊν ςτισ κζςεισ ενοφκαλμιςμοφ (Ciuffo, 1907) (Εικόνα 1). Στα τζλθ τθσ δεκαετίασ του 1940 ο Strauss και οι ςυνεργάτεσ του απομόνωςαν τον υπεφκυνο παράγοντα, τον ιό των ανκρωπίνων κθλωμάτων (HPV) (Strauss και ςυν., 1949), ενϊ το 1970 ο Γερμανόσ ιολόγοσ Harald zur Hausen άρχιςε να μελετά τον HPV, τθν πικανι ςυςχζτιςι του με τα επικθλιακά καρκινϊματα και ανακοίνωςε τθν φπαρξθ τεςςάρων διαφορετικϊν τφπων του ιοφ (Gissman και ςυν., 1977).

7 - 6 - Ενϊ θ πρϊτθ περιγραφι των αλλοιϊςεων ςτα κφτταρα του τραχθλικοφ επικθλίου από τα οξυτενι κονδυλϊματα ζγινε, το 1960, από τον Γ. Ραπανικολάου (Papanicolaou, 1960), διαπιςτϊκθκε μετά από 15 χρόνια ότι ο HPV (Human Papillomavirus) προκαλεί τισ αναγνωριηόμενεσ κυτταρολογικά και ιςτολογικά αλλοιϊςεισ ςτο τραχθλικό επικιλιο (Meisels και Fortin, 1976). Το 1983 εντοπίηεται ο τφποσ HPV-16 ςε περιπτϊςεισ καρκινωμάτων τραχιλου τθσ μιτρασ (Durst και ςυν., 1983) και ζνα χρόνο αργότερα, θ ομάδα του Boshart ανιχνεφει τον HPV-18 (Boshart και ςυν., 1984). Ο 21 οσ αιϊνασ ςθματοδοτείται από τθν ανακάλυψθ των εμβολίων κατά του καρκίνου του τραχιλου τθσ μιτρασ, τα οποία ιρκαν να ςυμπλθρϊςουν τισ ιδθ υφιςτάμενεσ μεκόδουσ πρόλθψθσ και κυρίωσ το τεςτ Ραπανικολάου, το οποίο όχι μόνο δεν το υποκακιςτοφν και το καταργοφν αλλά το κεωροφν απαραίτθτο για τισ εφαρμογζσ τουσ. Εικόνα 1. Ιςτορικι αναδρομι του ιοφ των ανκρωπίνων κθλωμάτων (ΗPV) (Πανοτοποφλου,2007). HPV και καρκίνοσ του τραχιλου τθσ μιτρασ Ο ιόσ των ανκρϊπινων κθλωμάτων είναι το πιο κοινό ςεξουαλικά μεταδιδόμενο νόςθμα παγκοςμίωσ. Εκτιμάται ότι το 50% των ςεξουαλικά ενεργϊν ατόμων ζχουν μολυνκεί από ζνα τουλάχιςτον τφπο του ιοφ HPV. Ρερίπου 200 διαφορετικοί τφποι του ιοφ ζχουν χαρακτθριςτεί με μοριακζσ τεχνικζσ και νζοι τφποι προςτίκενται ςτο ςυνεχϊσ αυξανόμενο κατάλογο των ςτελεχϊν του ιοφ (zur Hausen,

8 ). O ιόσ μολφνει ιςότιμα τουσ άνδρεσ και τισ γυναίκεσ, αλλά ςυμπτϊματα νοςθρότθτασ εμφανίηουν κυρίωσ οι γυναίκεσ. Τα ποςοςτά τθσ HPV λοίμωξθσ ςτισ Η.Ρ.Α. κυμαίνονται από 1 ζωσ 5.5 εκατομμφρια ετιςια ενϊ θ ςυχνότθτα εμφάνιςθσ τθσ HPV λοίμωξθσ είναι 20 εκατομμφρια ετιςια (Cates et al., 1999). O ιόσ HPV είναι αιτιολογικόσ παράγοντασ του 99,7% και πλζον όλων των τφπων καρκίνου του τραχιλου τθσ μιτρασ, που αποτελεί το δεφτερο ςυχνότερο αίτιο κανάτου του γυναικείου πλθκυςμοφ παγκοςμίωσ, μετά τον καρκίνο του μαςτοφ (Ferlay et al, 2001). Ζχει υπολογιςτεί ότι κάκε θμζρα πεκαίνουν από τθ νόςο αυτι 40 γυναίκεσ ςτθν Ευρϊπθ. Κάκε χρόνο ανιχνεφονται προκαρκινικζσ αλλοιϊςεισ του τραχιλου τθσ μιτρασ (Clifford et al, 2003; Insigna et al, 2004) και χαμθλοφ βακμοφ ενδοεπικθλιακζσ αλλοιϊςεισ (Clifford et al., 2005). Μόνο για το ζτοσ 2002 ανιχνεφτθκαν περιπτϊςεισ διθκθτικοφ τραχθλικοφ καρκίνου ςτθν Ευρϊπθ (Ferray et al., 2004). Τα τραγικά αυτά δεδομζνα αφοροφν και τθν Ελλάδα όπου και αναφζρκθκαν 600 νζα περιςτατικά καρκίνου του τραχιλου για το ζτοσ 2007 ενϊ ςθμειϊκθκαν 250 κάνατοι (Panotopoulou et al., 2007). Δυςτυχϊσ, δεν ζχει ςθμειωκεί καμία μείωςθ των περιςτατικϊν καρκίνου του τραχιλου τθσ μιτρασ τα τελευταία 15 χρόνια ςτθν Ελλάδα, κακϊσ μόνο ζνα ποςοςτό τθσ τάξθσ του 20% των Ελλθνίδων γυναικϊν ελζγχονται τακτικά με τεςτ Ραπανικολάου (Agorastos et al, 1995; Agorastos et al., 2004). Το ενκαρρυντικό ςε όλα τα παραπάνω είναι ότι μόνο το 1-5% των γυναικϊν που μολφνκθκαν με ιό HPV κα αναπτφξουν κακοικεια. Συχνότερα, ο ιόσ ςυνδζεται με επανεμφανιηόμενα γενετικά κονδυλϊματα. Εκτιμάται ότι το 1% των ςεξουαλικά ενεργϊν ενθλίκων εμφανίηουν ορατι μόλυνςθ από γενετικά κονδυλϊματα, ενϊ το 15% ζχει κάποια υποκλινικι μόλυνςθ (Εικόνα 2). Αν και οι μζχρι ςιμερα ζρευνεσ του ιοφ ςυνδυάςτθκαν με τον καρκίνο του τραχιλου τθσ μιτρασ, υπάρχουν πολλά κζματα προσ διερεφνθςθ ςχετικά με τουσ τρόπουσ μετάδοςθσ και μολυςματικότθτασ του ιοφ, ιδιαίτερα ςτισ αναπτυςςόμενεσ χϊρεσ.

9 - 8 - Εικόνα 2: Συχνότθτα λοίμωξθσ από τον ΗPV (Koutsky et al, 1997) Επικράτθςθ του ιοφ των ανκρϊπινων κθλωμάτων (HPV)-ιικοί τφποι Οι 200 ζωσ πρόςφατα ιϊκοί τφποι που ζχουν αναγνωριςτεί, κατατάςςονται ςε βλεννογόνιουσ (mucosal) και επιδερμικοφσ (cutaneous). Οι επιδερμικοί τφποι ςτοχεφουν ςτα βαςικά επικθλιακά κφτταρα του δζρματοσ ενϊ οι βλεννογόνιοι μολφνουν το επικιλιο τθσ ςτοματικισ κοιλότθτασ, του οιςοφάγου, τθσ αναπνευςτικισ οδοφ ι του γεννθτικοφ ςυςτιματοσ. Με βάςθ τθ ςυςχζτιςθ των HPVs με τον καρκίνο του τραχιλου και των πρόδρομων αλλοιϊςεων, κατθγοριοποιοφνται ςε ςτελζχθ υψθλοφ (high-risk) και χαμθλοφ κινδφνου (low- risk) κακοικουσ εξζλιξθσ. Τα ςτελζχθ χαμθλοφ κινδφνου HPV περιλαμβάνουν τουσ τφπουσ 6,11,42,43 και 44 ενϊ ςτα ςτελζχθ υψθλοφ κινδφνου HPV κατατάςςονται οι τφποι 16, 18, 31, 33, 34, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 και 70. Στθν ομάδα υψθλοφ κινδφνου υπάρχουν μερικοί τφποι HPV που ςυςχετίηονται λιγότερο ςυχνά με τθν εμφάνιςθ καρκίνου, όμωσ ςυχνά προκαλοφν πλακϊδεισ ενδοεπικθλιακζσ αλλοιϊςεισ (SILs). Μερικοί ερευνθτζσ αναφζρουν αυτοφσ τουσ τφπουσ HPV ωσ ενδιάμεςου κινδφνου. Οι υπότυποι χαμθλοφ κινδφνου ζχουν επίςθσ ςυςχετιςτεί, αλλά πολφ πιο ςπάνια με τραχθλικά καρκινϊματα (Burd et al., 2003). Οι βλεννογόνιοι τφποι HPV χαμθλοφ κινδφνου, όπωσ οι τφποι HPV-6 και HPV- 11 προκαλοφν οξυτενι κονδυλϊματα (candyloma accuminata), ενϊ οι υψθλοφ κινδφνου HPV με κυριότερο εκπρόςωπο τον HPV-16 και ακολοφκωσ τουσ HPV-18, HPV-31 και άλλουσ, προκαλοφν πλακϊδεισ ενδοεπικθλιακζσ αλλοιϊςεισ που μποροφν να εξελιχκοφν ςε διθκθτικό πλακϊδεσ καρκίνωμα. Οι ιοί HPV 16 και HPV 18 αποτελοφν τουσ ςυχνότερουσ τφπουσ ιϊν υψθλοφ κίνδυνου, οι οποίοι είναι υπεφκυνοι για το 70-75% των περιπτϊςεων καρκίνου του τραχιλου τθσ μιτρασ (ο HPV 16 απαντά ςτο 50% και ο 18 ςτο 20% των περιςτατικϊν καρκίνου) και

10 - 9 - ακολουκοφν άλλοι λιγότερο ςυχνοί τφποι ογκογόνων ιϊν, όπωσ είναι ο HPV 31,33,45,52 και 58, οι οποίοι ακροιςτικά είναι υπεφκυνοι μόνοι ι ςε ςυνδυαςμό με άλλουσ HPV ιοφσ για τισ υπόλοιπεσ ςχεδόν περιπτϊςεισ καρκίνου ςτθν πρωκτογεννθτικι περιοχι τθσ γυναίκασ (Εικόνα 3). Eικόνα 3: Kατανομι των τφπων HPV ςτον καρκίνο τραχιλου τθσ μιτρασ (Burd et al, 2003) Δομι και βιολογικόσ κφκλοσ του ιοφ Ο HPV ανικει ςτθν οικογζνεια των ιϊν PAPOVA (Papovaviridae). Το όνομά τουσ προζρχεται από τα δφο αρχικά γράμματα των ονομάτων των ιϊν που περιλαμβάνονται ςτθν οικογζνεια αυτι: papilloma, polyoma και vacuolating (SV40). O HPV είναι ζνασ ςχετικά μικρόσ, μθ φακελωμζνοσ ιόσ, διαμζτρου 55nm. Ζχει ζνα εικοςαεαδρικό καψίδιο που αποτελείται από 72 καψομερίδια, κακζνα από τα οποία περιλαμβάνει τουλάχιςτον δφο καψιδιακζσ πρωτεΐνεσ, L1 και L2. Κάκε καψομερίδιο αποτελεί ζνα πενταμερζσ τθσ βαςικισ καψιδιακισ πρωτεϊνθσ L1 (Βaker et al., 1991). Κάκε ιικό καψίδιο περιλαμβάνει πολλά αντίγραφα (περίπου 12/ιοςωμάτιο) τθσ μικρότερθσ καψιδιακισ πρωτεϊνθσ L2 (Sapp et al., 1995). Το γονιδίωμα του HPV αποτελείται από ζνα απλό μόριο δίκλωνου κυκλικοφ DNA που περιζχει περίπου 7.900bp ςυνδεδεμζνου με ιςτόνεσ (Favre, 1985). Πλα τα ανοικτά αναγνωςτικά πλαίςια (ORFs) περιορίηονται ςτθ μια αλυςίδα. Το γονιδίωμα του ιοφ λειτουργικά διαιρείται ςε τρεισ κφριεσ περιοχζσ (Εικόνα 4): α) Η πρϊτθ είναι μια μθ κωδικι ανοδικι (upstream) ρυκμιςτικι περιοχι των 400 ζωσ 1000bp που αναφζρεται ωσ μακρά ρυκμιςτικι περιοχι (long control region, LCR). Αυτι θ περιοχι περιλαμβάνει

11 τον κφριο προαγωγζα ρ97 μαηί με ζνα ενιςχυτι και ακολουκίεσ αποςιϊπθςθσ (silencer sequences) που ρυκμίηουν τθν αντιγραφι του DNA ελζγχοντασ τθ μεταγραφι των ORFs. Αυτι θ περιοχι παρουςιάηει επίςθσ τον υψθλότερο βακμό ποικιλομορφίασ του ιικοφ γονιδιϊματοσ (Apt et al., 1996), β) Η δεφτερθ είναι μια πρϊιμθ (early) περιοχι που αποτελείται από Ε1,Ε2,Ε3,Ε4,Ε5,Ε6 και Ε7 ORFs, τα οποία εμπλζκονται ςτθν ιικι αντιγραφι και ςτθν ογκογζνεςθ, γ) Η τρίτθ είναι μια όψιμθ (late) περιοχι, που κωδικοποιεί τισ L1 και L2 δομικζσ πρωτεϊνεσ του ιικοφ καψιδίου. Εικόνα 4: (Α) Σχθματικι αναπαράςταςθ του δίκλωνου κυκλικοφ DNA γενϊματοσ του ιικοφ ςτελζχουσ HPV-16, όπου φαίνονται τα αρχικά (Ε) και τα τελικά (L) γονίδια, θ ρυκμιςτικι περιοχι LCR και με βζλοσ o κφριοσ αρχικόσ υποκινθτισ/προαγωγζασ ( major early promoter p97). Μόνο θ μία αλυςίδα μεταγράφεται κατά τθ δεξιόςτροφθ φορά τθσ εικόνασ (Β). Σχθματικι δομι του ελ άχιςτου μζρουσ του γενϊματοσ του ςτελζχουσ HPV-16 (κόκκινο) που παραμζνει μετά τθν ενςωμάτωςθ του ιοφ ςτο χρωμόςωμα του ξενιςτι (μπλε). Τα γονίδια HPV E6/E7 εκφράηονται ςυςτθματικά, ενϊ τα υπόλοιπα γονίδια του HPV ςυχνά είτε εξαλείφονται είτε δε μεταγράφονται μετά τθν ενςωμάτωςθ. Ραράγονται δφο κφριεσ ομάδεσ HPV RNA. Η μια ζχει τθν ικανότθτα μεταγραφισ ολόκλθρων των πρωτεϊνϊν Ε6 και Ε7, και θ άλλθ ματιςμζνων μεταγράφων των πρωτεϊνϊν Ε6 (designated E6*) και ολόκλθρθσ τθσ πρωτεϊνθσ Ε7. Τα περιςςότερα μεταγραφικά προϊόντα του HPV ςε καρκινικά κφτταρα τραχιλου ματίηονται κάτωκεν του γονιδίου Ε7 και χρθςιμοποιοφν κυτταρικά ςινιάλα ματίςματοσ και πολυαδενυλίωςθσ που μπορεί να τουσ προςδίδει αυξθμζνθ ςτακερότθτα ( Münger et al., 2004). Ζκφραςθ γονιδίων HPV ςε καρκίνουσ τραχιλου Η ενςωμάτωςθ του ιοφ ςτο χρωμόςωμα του ξενιςτι ςυνοδεφεται από διατθροφμενθ ζκφραςθ των ιικϊν γονιδίων Ε6 και Ε7 ενϊ άλλεσ περιοχζσ του ιϊκοφ DNA εξαλείφονται ι θ ζκφραςι τουσ απορρυκμίηεται (Βaker et al, 1987) (Εικόνα 4Β). Η απϊλεια τθσ ζκφραςθσ του μεταγραφικοφ καταςτολζα του HPV E2 είναι ςθμαντικι κακϊσ απορυκμίηει τθν ζκφραςθ των γονιδίων Ε6 και Ε7 του HPV με παράλλθλθ αφξθςθ τθσ ςτακερότθτασ των Ε6/Ε7 HPV-16mRNAs μετά τθν ενςωμάτωςθ (Jean et al, 1995). Τα κφτταρα που εκφράηουν Ε6/Ε7 από ενςωματωμζνεσ αλλθλουχίεσ HPV ζχουν επιλεκτικό πλεονζκτθμα αφξθςθσ ςυγκριτικά με κφτταρα που φζρουν επιςωμικά γονιδιϊματα HPV (Jean et al, 1995). Το ότι θ απϊλεια τθσ καταςταλτικισ δράςθσ του

12 Ε2 μπορεί να είναι αποφαςιςτικισ ςθμαςίασ ςτθν εξζλιξθ κακοικειασ υποςτθρίηεται από πειράματα που δείχνουν ότι θ επανζκφραςθ του Ε2 ςε κυτταρικζσ ςειρζσ τραχιλου καταςτζλλει τθν αφξθςθ (Thierry et al, 1987). Φαίνεται ότι θ ςυνεχισ ζκφραςθ Ε6/Ε7 ςε καρκίνουσ τραχιλου είναι απαραίτθτθ για τθ διατιρθςθ του φαινομζνου του μεταςχθματιςμοφ (Wells et al, 2000). Ριο αναλυτικά, θ Ε7 ςτελεχϊν HPV υψθλοφ κινδφνου ςυνδζεται με τθν πρωτεϊνθ του ρετινοβλαςτϊματοσ prb και με άλλα μζλθ τθσ οικογζνειασ των pocket πρωτεϊνϊν και διακόπτει τθ ςφνδεςθ μεταξφ τθσ prb και τθσ οικογζνειασ των Ε2f μεταγραφικϊν παραγόντων, ανεξάρτθτα από τθν παρουςία εξωτερικϊν παραγόντων ανάπτυξθσ. Ο Ε2f μετζπειτα ενεργοποιεί κυτταρικζσ πρωτεΐνεσ που απαιτοφνται για τθν αντιγραφι του ιικοφ DNA όπωσ οι κυκλίνεσ Α και Ε. Η Ε7 επίςθσ ςυνδζεται και με άλλεσ πρωτεΐνεσ που εμπλζκονται ςτον κυτταρικό πολλαπλαςιαςμό όπωσ αποακετυλάςεσ ιςτονϊν, ςυςτατικά του ςυμπλόκου μεταγραφισ Α1 και τουσ παρεμποδιςτζσ (Funk et al, 1997) κυκλινο-εξαρτϊμενων κιναςϊν, p21 και p27. Κατά τθ φυςικι μόλυνςθ, ωςτόςο, θ ικανότθτά τθσ Ε7 να οδθγιςει ςε κυτταρικό πολλαπλαςιαςμό παρεμποδίηεται ςε μερικά κφτταρα και αυτό εξαρτάται από τα επίπεδα των παρεμποδιςτϊν κινάςθσ p21 και p27. Τα υψθλά επίπεδα των p21 και p27 ςε διαφοροποιθμζνα κερατινοκφτταρα μποροφν να οδθγιςουν ςτο ςχθματιςμό ανενεργϊν ςυμπλόκων με τθν Ε7 και τθν κυκλίνθ Ε μζςα ςτο κφτταρο. Φαίνεται ότι θ ικανότθτα τθσ Ε7 να οδθγιςει τα κφτταρα μζςω τθσ μίτωςθσ ςε διαφοροποιθμζνο επικιλιο ίςωσ περιορίηεται ςε εκείνα τα κφτταρα που εκφράηουν p21 και p27 ςε χαμθλά επίπεδα θ εκφράηουν επαρκϊσ τθν Ε7 για να ξεπεραςτεί θ παρεμπόδιςθ τθσ εξζλιξθσ του κυτταρικοφ κφκλου (Noya et al, 2001). Συνεπϊσ, θ απορρυκμιςμζνθ ζκφραςθ των ιϊκϊν ογκογονιδίων αποτελεί ζνα παράγοντα που προδιακζτει τθν ανάπτυξθ-ςυςχετιηόμενων με τον HPV-καρκίνων. Η λειτουργία τθσ ιϊκισ Ε6 πρωτεΐνθσ ςυμπλθρϊνει αυτι τθσ Ε7 και ςε τφπουσ HPV υψθλοφ κινδφνου, οι δφο πρωτεΐνεσ εκφράηονται μαηί ςε ομάδεσ από ζνα απλό πολυκιςτρονικό mrna (Stacey et al, 2000). Ο βαςικόσ ρόλοσ τθσ E6 είναι θ ςφνδεςι τθσ με τθν πρωτεϊνθ p53, και ςτθν περίπτωςθ τφπων HPV υψθλοφ κινδφνου, θ ρφκμιςθ τθσ ουβικουιτινίωςθσ και τθσ αποικοδόμθςθσ τθσ p53. Αυτό ζχει ωσ

13 επακόλουκο να παρεμποδιςτεί θ διακοπι τθσ αφξθςθσ ι θ απόπτωςθ ωσ απόκριςθ ςτθν ρφκμιςθ ειςόδου ςτον κυτταρικό κφκλο μζςω τθσ Ε7 ςτισ ανϊτερεσ επικθλιακζσ ςτιβάδεσ, κάτι που μπορεί διαφορετικά να ςυμβεί μζςω ενεργοποίθςθσ του μονοπατιοφ ARF (παράγοντασ ADP-ριβοςυλίωςθσ). Η Ε6 πρωτεΐνθ ςτελεχϊν HPV υψθλοφ κινδφνου παίηει επίςθσ ςθμαντικό ρόλο ςτθ ρφκμιςθ του κυτταρικοφ πολλαπλαςιαςμοφ ανεξάρτθτα τθσ Ε7 μζςω του καρβοξυτελικοφ τθσ μοτίβου πρόςδεςθσ PDZ (Thomas et al, 2002). Το μοτίβο αυτό ρυκμίηει τον κυτταρικό πολλαπλαςιαςμό του παραβαςικοφ επικθλίου (Nguyen et al, 2003) και ίςωσ ςυμβάλλει ςτθν ανάπτυξθ μεταςτατικϊν όγκων διαςπϊντασ τθ φυςιολογικι κυτταρικι προςκόλλθςθ. Από τθ μόλυνςθ ςτθ φλεγμονι H μετάδοςθ του ιοφ ΗPV ςτο κφτταρο ξενιςτι Στόχο του ιοφ ΗPV αποτελεί θ βαςικι ςτιβάδα του επικθλίου, όπου πραγματοποιοφνται οι κυτταρικζσ διαιρζςεισ (Εικόνα 5). Η πρόςβαςθ των ιϊν ςτθ ςτιβάδα αυτι εξαςφαλίηεται μζςω μικροτραυματιςμϊν του δζρματοσ ι του βλεννογόνου που ζχουν ωσ αποτζλεςμα τθ λφςθ τθσ ςυνζχειασ του επικθλίου. Ο τραυματιςμόσ του επικθλίου δίνει τθν ευκαιρία ςτον ιό να διειςδφςει ςτα κφτταρα τθσ βαςικισ ςτιβάδασ, ενϊ επιπλζον διευκολφνει τον πολλαπλαςιαςμό των κυττάρων λόγω τθσ διαδικαςίασ εποφλωςθσ και αποκατάςταςθσ του ιςτοφ που ακολουκεί (Ferenczy και Jenson, 1996). Τα γονίδια τθσ τελικισ περιοχισ (L) εκφράηονται ςτα διαφοροποιθμζνα κφτταρα που βρίςκονται κοντά ςτθν επιφάνεια του επικθλίου παρζχοντασ ζνα εφκολο τρόπο μετάδοςθσ του ιοφ. Τα γονίδια τθσ αρχικισ περιοχισ (E) εκφράηονται ςτα βαςικά κφτταρα του επικθλίου αλλά δεν μποροφν να παράγουν ιό αφοφ τα κφτταρα αυτά δεν εκφράηουν τισ καψιδιακζσ πρωτεΐνεσ που κωδικοποιοφνται από τα τελικά γονίδια (L) (Vamvakopoulos et al, 2007).

14 Eικόνα 5: Σχζςθ του κφκλου ηωισ του ΗPV με τθ διαφοροποίθςθ των επικθλιακϊν κυττάρων του τραχιλου. Μικροτραυματιςμόσ λφςθ ςυνζχειασ τθσ υπερκείμενθσ επιδερμίδασ επιτρζπει ςτον ιό να ειςζλκει ςτα κφτταρα τθσ βαςικισ ςτοιβάδασ. Το γζνωμα του ιοφ παραμζνει ωσ επίτοποσ ςτα βαςικά κφτταρα όπου τα ιικά γονίδια εκφράηονται κατά το ελάχιςτο. Η αντιγραφι του ιοφ ςυμβαίνει ςτθν υπερκείμενθ τθσ βαςικισ ςτοιβάδασ και ενςωματϊνεται ςτθ διαδικαςία διαφοροποίθςθσ των κυττάρων τθσ επιδερμίδασ. Η παρουςία του HPV προκαλεί μορφολογικζσ ανωμαλίεσ ςτο επικιλιο, όπωσ παρακεράτωςθ και κοιλοκυττάρωςθ. Οι νζοι ιοί απελευκερϊνονται ςτα κφτταρα που αποφολιδϊνονται (Vamvakopoulos et al, 2007). Πλοι οι τφποι του ιοφ πολλαπλαςιάηονται ςτον πυρινα του ξενιςτι αλλά ο μθχανιςμόσ μετατροπισ του από τον ιό δεν ζχει απόλυτα διευκρινιςτεί. Το γζνωμα του ιοφ πολλαπλαςιάηεται ςαν εξωχρωμοςωμικό επίςωμα ι πλαςμίδιο ςε καλοικεισ HPV-ςυνδεόμενεσ αλλοιϊςεισ ενϊ ςυχνά ενςωματϊνεται ςτο χρωμόςωμα του ξενιςτι ςε κακοικεισ αλλοιϊςεισ (Vamvakopoulos et al, 2007). Η μετάδοςθ του ιοφ ςτο δζρμα και ςτουσ βλεννογόνουσ γίνεται τόςο μζςω τθσ ςεξουαλικισ επαφισ, όςο και μζςω ετερο-ενοφκαλμιςμοφ, αυτο-ενοφκαλιςμοφ ι φομιτϊν. Μθ παραγωγικι και παραγωγικι φλεγμονι Οι δφο φάςεισ μεταγραφισ και μετάφραςθσ του ιικοφ ςωματιδίου (πρϊιμθ και όψιμθ) βρίςκονται ςε αρμονία με τθ διαδικαςία διαφοροποίθςθσ του πλακϊδουσ επικθλίου (Brescia et al, 1986). Στθ βαςικι ςτιβάδα του επικθλίου, ο ιόσ αναδιπλαςιάηεται ωσ επίςωμα εκμεταλλευόμενοσ τισ κυτταρικζσ διαιρζςεισ που πραγματοποιοφνται ςτθ ςτιβάδα αυτι, ενϊ ταυτόχρονα επιδρά ςτθν αφξθςθ του ρυκμοφ των κυτταρικϊν διαιρζςεων. Στο ςτάδιο αυτό (μθ παραγωγικι φλεγμονι) δεν ςυντίκενται δομικζσ πρωτεΐνεσ με αποτζλεςμα να είναι ανζφικτθ θ ςυναρμολόγθςθ ιικϊν ςωματιδίων και θ απελευκζρωςι τουσ ςτο εξωτερικό περιβάλλον του κυττάρου ξενιςτι (Chow και Broker, 1994). Σε δεφτερθ φάςθ, κακϊσ τα κφτταρα διαφοροποιοφμενα ανζρχονται ςτισ επιφανειακζσ ςτιβάδεσ, ςυντίκεται οι δομικζσ πρωτεΐνεσ τθσ κάψασ του ιοφ. Πταν πλζον το εκφυλιςμζνο ϊριμο κερατινοκφτταρο φκάςει ςτθν επιφανειακι ςτιβάδα, ζχει ολοκλθρωκεί θ ςυναρμολόγθςθ των νζων ιικϊν ςωματιδίων, τα οποία εγκαταλείπουν το κφτταρο ξενιςτι (παραγωγικι φλεγμονι). Με τθν παραγωγι

15 κυγατρικϊν κυττάρων και τθ μετανάςτευςι τουσ ςτισ επιπολείσ ςτιβάδεσ του επικθλίου ακολουκεί θ παραγωγικι φλεγμονι. Η εξζλιξθ τθσ λανκάνουςασ μόλυνςθσ ςε φλεγμονι παραγωγικοφ τφπου ςυμβαίνει ςυνικωσ μετά 2 εβδομάδεσ ζωσ 8 μινεσ από τθν αρχικι μόλυνςθ (φάςθ επϊαςθσ). Στθν παραγωγικι φλεγμονι το γονιδίωμα του ιοφ αναδιπλαςιάηεται ωσ πλαςμίδιο (επίςωμα) ξεχωριςτά από τα χρωμοςϊματα του ξενιςτι. Ραράγεται μεγάλοσ αρικμόσ ιικϊν γονιδιωμάτων ςτισ βαςικζσ ςτιβάδεσ, ενϊ παράλλθλα παράγονται πρωτεΐνεσ τθσ ιικισ κάψασ ςτισ επιφανειακζσ ςτιβάδεσ του επικθλίου. Η υπερπαραγωγι νζων ιικϊν ςωματιδίων HPV οδθγεί ςτθν εξάπλωςθ τθσ μόλυνςθσ αφενόσ και ςτθν εξζλιξι τθσ αφετζρου. Ιςτολογικά θ ενεργόσ φλεγμονι εκδθλϊνεται με ελαφριά πάχυνςθ τθσ κεράτινθσ ςτιβάδασ λόγω παρακεράτωςθσ. Υπάρχει ζντονθ ακάνκωςθ (υπερπλαςία του επικθλίου τθσ ακανκωτισ ςτιβάδασ) και κθλωμάτωςθ με πάχυνςθ και επιμικυνςθ των επικθλιακϊν καταδφςεων. Το πιο χαρακτθριςτικό εφρθμα, ςθμαντικό για τθ διάγνωςθ, είναι θ εμφάνιςθ περιοχϊν ςτισ οποίεσ τα επικθλιακά κφτταρα παρουςιάηουν περιπυρθνικι κενοτοπιϊδθ εκφφλιςθ (κοιλοκφτταρα) (Εικόνα 6). Τα κφτταρα αυτά είναι ςχετικά μεγάλα και ζχουν υπερχρωματικό, ςτρογγυλό πυρινα. Επειδι θ κενοτοπιϊδθσ εκφφλιςθ είναι φυςιολογικό φαινόμενο ςτα ανϊτερα ςτρϊματα τθσ ακανκωτισ ςτιβάδασ των βλεννογόνων, κεωρείται oτι οφείλεται ςε HPV μόλυνςθ, μόνο όταν αυτι επεκτείνεται και ςε κφτταρα των βακφτερων ςτρωμάτων τθσ επιδερμίδασ (Clavel et al, 2001). Εικόνα 6: Kοιλοκυττάρωςθ διάμεςων κυττάρων και χαρακτθριςτικι ομοιογενοποίθςθ χρωματίνθσ. Επίχριςμα κατά Ραπανικολάου, μεγζκυνςθ (Clavel et al, 2001). Ο καρκίνοσ του τραχιλου τθσ μιτρασ Στοιχεία ανατομίασ

16 Η μιτρα είναι ζνα κοίλο μυϊδεσ όργανο, το οποίο βρίςκεται ςτο πρόςκιο μζροσ τθσ πυελικισ κοιλότθτασ. Διαιρείται ςε τρία τμιματα: τον πυκμζνα, το ςϊμα και τον τράχθλο. Στον πυκμζνα τθσ μιτρασ ειςζρχονται ο δεξιόσ και ο αριςτερόσ ωαγωγόσ. Ο τράχθλοσ τθσ μιτρασ αποτελεί το χαμθλότερο τμιμα τθσ μιτρασ και καταλιγει ςτον κόλπο. Η κοιλότθτα του τραχιλου τθσ μιτρασ ζχει ςχιμα ατρακτοειδζσ και επικοινωνεί με τθν κοιλότθτα του ςϊματοσ με το ζςω ςτόμιο τθσ μιτρασ και με τθν κοιλότθτα του κόλπου με το ζξω ςτόμιο τθσ μιτρασ. Ο τράχθλοσ τθσ μιτρασ διακρίνεται ςτον εξωτράχθλο και ςτον ενδοτράχθλο. Ο εξωτράχθλοσ καλφπτεται από πολφςτιβο πλακϊδεσ επικιλιο, το οποίο αποτελείται από αρκετζσ ςτιβάδεσ επικθλιακϊν κυττάρων. Ο ενδοτράχθλοσ καλφπτεται από μονόςτιβο κυλινδρικό επικιλιο όπου τα κφτταρα ζχουν φψοσ 2 3 φορζσ μεγαλφτερο από το πλάτοσ τουσ. Στα ςθμεία όπου το κυλινδρικό μονόςτιβο επικιλιο του ενδοτραχιλου ςυνζχεται με το πολφςτιβο πλακϊδεσ επικιλιο του εξωτραχιλου ςυχνά παρατθρείται μεταπλαςία, αντικατάςταςθ δθλαδι του κυλινδρικοφ επικθλίου από πολφςτιβο πλακϊδεσ. Η ηϊνθ μετάπλαςθσ, μετάπτωςθσ ι μετατροπισ που ςχθματίηεται αποτελεί τθν πιο ςυχνι κζςθ ανάπτυξθσ του καρκίνου του τραχιλου τθσ μιτρασ κακϊσ και των αλλοιϊςεων τθσ ενδοεπικθλιακισ νεοπλαςίασ του τραχιλου τθσ μιτρασ. Το επικιλιο του τραχιλου τθσ μιτρασ προςκολλάται ςτον υποκείμενο ςτθρικτικό ιςτό του τραχιλου μζςω μιασ εξειδικευμζνθσ ςτιβάδασ εξωκυττάριασ κεμζλιασ ουςίασ, τθσ βαςικισ μεμβράνθσ. Η μελζτθ τθσ βαςικισ μεμβράνθσ ςτθ νεοπλαςία του τραχιλου τθσ μιτρασ είναι πρωταρχικισ ςθμαςίασ για τθ διάκριςθ μεταξφ ενδοεπικθλιακισ νεοπλαςίασ και διθκθτικοφ καρκίνου. Στθν ενδοεπικθλιακι νεοπλαςία του τραχιλου θ βαςικι μεμβράνθ παραμζνει ανζπαφθ, ενϊ όταν διαςπαςτεί και διθκθκεί με καρκινικά κφτταρα αναπτφςςεται διθκθτικό καρκίνωμα (Βupa s health information team, 2009). Ιςτοπακολογοανατομικά ςτοιχεία Στο μεγαλφτερο ποςοςτό (80%) ο καρκίνοσ του τραχιλου τθσ μιτρασ είναι ακανκοκυτταρικόσ και προζρχεται από το πολφςτιβο πλακϊδεσ επικιλιο τθσ ζξω επιφάνειασ τθσ ενδοκολπικισ μοίρασ του τραχιλου (Vizcaino και ςυν, 2000). Τα

17 αδενοκαρκινϊματα αντιπροςωπεφουν ποςοςτό 5-8% και προζρχονται από το μονόςτιβο κυλινδρικό επικιλιο του τραχθλικοφ ςωλινα και τουσ αδζνεσ του, ενϊ το υπόλοιπο ποςοςτό καλφπτεται από μικτζσ μορφζσ ι αδιαφοροποίθτεσ. Ηλικία εμφάνιςθσ Η μζςθ θλικία των γυναικϊν που προςβάλλονται από διθκθτικό καρκίνο είναι τα 47 ζτθ, ενϊ θ μζςθ θλικία προςβολισ από προδιθκθτικό καρκίνο είναι ςθμαντικά μικρότερθ (Waggoner, 2003). Ζχει υπολογιςτεί ότι περίπου 2% των γυναικϊν θλικίασ άνω των 40 ετϊν ζχουν πικανότθτα να αναπτφξουν καρκίνο του τραχιλου τθσ μιτρασ. Στισ Η.Ρ.Α. θ εφαρμογι των προγραμμάτων προςυμπτωματικοφ ελζγχου ζχει ωσ αποτζλεςμα το ½ των γυναικϊν, ςτισ οποίεσ γίνεται διάγνωςθ καρκίνου του τραχιλου τθσ μιτρασ να είναι μικρότερεσ από 35 χρονϊν, όμωσ αφορά πρϊιμα ςτάδια καρκίνου. Αντίκετα ςε γυναίκεσ μεγαλφτερεσ των 55 χρονϊν, θ διάγνωςθ πραγματοποιείται όταν ο καρκίνοσ βρίςκεται ςε προχωρθμζνο ςτάδιο, γεγονόσ που ζχει άμεςθ επίδραςθ ςτθν κνθςιμότθτα των γυναικϊν αυτϊν (Sung et al, 2000) (Eικόνα 7). Εικόνα 7: Επίπτωςθ HPV λοιμϊξεωσ του τραχιλου, προκαρκινικϊν καταςτάςεων και εμφανίςεωσ καρκίνου τραχιλου (ΚΤΜ). Η καμπφλθ HPV δείχνει τθν υψθλι επίπτωςθ τθσ λοιμϊξεωσ ςτθν ζναρξθ τθσ ςεξουαλικισ ηωισ και τθν μείωςι τθσ, ςτα επόμενα χρόνια, απότοκθ του αυτοπεριοριηόμενου των λοιμϊξεων. Η καμπφλθ επίπτωςθσ των προκαρκινικϊν βλαβϊν ακολουκεί αρκετά χρόνια μετά τθν HPV λοίμωξθ, διότι απαιτείται ζνα χρονικό διάςτθμα από τθν πρωτολοίμωξθ μζχρι τθν ανάπτυξθ προκαρκινικϊν βλαβϊν. Η καμπφλθ του ΚΤΜ ακολουκεί περιςςότερα χρόνια μετά, δεδομζνου του μεςοδιαςτιματοσ που απαιτείται για εξζλιξθ των προκαρκινικϊν βλαβϊν ςε διθκθτικό καρκίνωμα. Οςο θ θλικία των γυναικϊν πλθςιάηει τα 40, θ επίπτωςθ του ΚΤΜ φαίνεται να πλθςιάηει τθν επίπτωςθ των προκαρκινικϊν βλαβϊν (New England journal of Medicine 353: ). Ρροκαρκινικζσ αλλοιϊςεισ: Eνδοεπικθλιακι Νεοπλαςία Τραχιλου

18 O διθκθτικόσ καρκίνοσ αποτελεί το αποτζλεςμα τθσ εξζλιξθσ προκαρκινικϊν αλλοιϊςεων του τραχιλου τθσ μιτρασ, ςτισ οποίεσ περιλαμβάνονται θ δυςπλαςία και το καρκίνωμα in situ. Η δυςπλαςία χαρακτθρίηεται από διαταραχζσ ςτθ ωρίμανςθ των κυττάρων του πλακϊδουσ επικθλίου και διακρίνεται ςε ελαφροφ, μζςου και ςοβαροφ βακμοφ. Στο καρκίνωμα in situ οι δυςπλαςτικζσ αλλοιϊςεισ εντοπίηονται ςε όλο το πάχοσ του επικθλίου χωρίσ όμωσ να παρατθρείται διικθςθ τθσ βαςικισ μεμβράνθσ. Η δυςπλαςία και το καρκίνωμα in situ αποτελοφν τθν ενδοεπικθλιακι νεοπλαςία του τραχιλου τθσ μιτρασ (CIN), θ οποία διακρίνεται, όπωσ φαίνεται ςτθν Εικόνα 8 ςε τρείσ τφπουσ: α) τον Τφπο 1 (CIN 1), β) τον Τφπο 2 (CIN 2) και γ) τον Τφπο 3 (CIN 3). Εικόνα 8: Βακμοί ενδοεπικθλιακισ νεοπλαςίασ τραχθλικοφ επικθλίου CIN (από ιςτολογικζσ τομζσ). H βαςικι μεμβράνθ και ςτουσ τρείσ βακμοφσ CIN παραμζνει ακζραιθ (Μammas et al, 2006). Eνδοεπικθλιακι νεοπλαςία του τραχιλου Τφπου 1 (CIN1) Xαρακτθρίηεται από ελαφράσ μορφισ δυςπλαςτκζσ αλλοιϊςεισ του πλακϊδουσ επικθλίου του τραχιλου τθσ μιτρασ. Τα άνω 2/3 του πλακϊδουσ επικθλίου παρουςιάηουν καλι διαφοροποίθςθ των κυττάρων, ενϊ ςτο κατϊτερο 1/3 του επικθλίου υπάρχουν πακολογικοί πυρινεσ και μιτωτικζσ εικόνεσ, οι οποίεσ όμωσ είναι λίγεσ. Η διάγνωςθ τθσ ενδοεπικθλιακι νεοπλαςίασ του τραχιλου τθσ μιτρασ Τφπου 1 (CIN 1) απαιτεί ιδιαίτερθ προςοχι και εμπειρία κατά τθν ερμθνεία τθσ ιςτολογικισ εικόνασ δεδομζνου ότι ςυχνά ςυγχζεται με τισ αλλοιϊςεισ CIN 2 και CIN 3 κακϊσ και με τθν εικόνα του φυςιολογικοφ τράχθλου (Stoler et al, 2001). Στθν ενδοεπικθλιακι νεοπλαςία του τραχιλου Τφπου 1 (CIN 1) το ποςοςτό αυτόματθσ υποχϊρθςθσ των αλλοιϊςεων είναι υψθλό, ενϊ το ποςοςτό εξζλιξθσ τθσ

19 ςε καρκίνο του τραχιλου τθσ μιτρασ είναι ιδιαίτερα χαμθλό (Melnikow και ςυν, 1998). Ζχει υπολογιςτεί πωσ ςτο 57% των αςκενϊν με CIN 1 παρατθρείται αυτόματθ υποχϊρθςθ, ενϊ ςτο 11% των αςκενϊν θ αλλοίωςθ εξελίςςεται ςε CIN 2, CIN 3 ι καρκίνο. Το ποςοςτό εμφάνιςθσ διθκθτικοφ καρκίνου ςε αςκενείσ με CIN 1 είναι μόλισ 0,3% (Ostor, 1993). Ενδοεπικθλιακι νεοπλαςία του τραχιλου Τφπου 2 (CIN 2) Στο πλακϊδεσ επικιλιο του τραχιλου τθσ μιτρασ παρουςιάηονται μζτριασ μορφισ δυςπλαςτικζσ αλλοιϊςεισ. Το άνω ½ του επικθλίου είναι ϊριμο και καλά διαφοροποιθμζνο, αλλά με μερικι ατυπία ςτουσ πυρινεσ των κυττάρων. Οι πακολογικοί πυρινεσ είναι πιο εκςθμαςμζνοι και βρίςκονται πιο επιπολισ ςε ςχζςθ CIN 1. Ρακολογικζσ μιτωτικζσ εικόνεσ παρατθροφνται ςτα κατϊτερα 2/3 του επικθλίου. Η ενδοεπικθλιακι νεοπλαςία του τραχιλου Τφπου 2 (CIN 2) χαρακτθρίηεται από υψθλά ποςοςτά εξζλιξθσ τθσ ςε καρκίνο του τραχιλου τθσ μιτρασ. Ζχει υπολογιςτεί πωσ ςτο 43% των αςκενϊν με CIN 2 οι αλλοιϊςεισ υποχωροφν χωρίσ τθν εφαρμογι κεραπείασ, ςτο 35% των αςκενϊν επιμζνουν, ενϊ ςτο 22% εξελίςςονται ςε καρκίνωμα in situ (CIN3) ι ςε διθκθτικό καρκίνο (Mitchell et al, 1996). Ενδοεπικθλιακι νεοπλαςία του τραχιλου Τφπου 3 (CIN 3) Ρεριλαμβάνει τθ ςοβαρι δυςπλαςία του τραχιλου τθσ μιτρασ και το καρκίνωμα in situ. Χαρακτθρίηεται από τθν παρουςία ςε όλο το πάχοσ του επικθλίου πακολογικϊν πυρινων κακϊσ και μιτωτικϊν εικόνων. Η φπαρξθ ωριμότθτασ ςτα κφτταρα εντοπίηεται ςτο πάνω επιπολισ 1/3 του επικθλίου ι λείπει εντελϊσ. Στθν περίπτωςθ του καρκινϊματοσ in situ, εκτόσ από τθν προςβολι ολόκλθρου του επικθλίου από δυςπλαςτικά κφτταρα, υπάρχουν επίςθσ και αλλοιϊςεισ ςτθν πόλωςθ των κυττάρων, πολφ αυξθμζνεσ μιτωτικζσ εικόνεσ και πολυμορφιςμόσ. Ππωσ και ςτθν ενδοεπικθλιακι νεοπλαςία του τραχιλου Τφπου 2 (CIN 2), το ποςοςτό εξζλιξθσ τθσ αλλοίωςθσ ςε καρκίνο του τραχιλου τθσ μιτρασ είναι υψθλό. Ζχει υπολογιςτεί πωσ ςτο 32% των αςκενϊν με CIN 3, οι αλλοιϊςεισ υποχωροφν χωρίσ κεραπεία, ςτο 56% επιμζνουν, ενϊ ςτο 14% εξελίςςονται ςε καρκίνο του τραχιλου τθσ μιτρασ (Wright et al, 2002).

20 Κατθγοριοποίθςθ των ενδοεπικθλιακϊν αλλοιϊςεων του τραχιλου με το ςφςτθμα Bethesda To 1988 ςτθ Bethesda των H.Ρ.Α διακεκριμζνοι επιςτιμονεσ τροποποίθςαν ονομαςτικά τισ κατθγορίεσ CIN ςε χαμθλοφ βακμοφ (Low Grade Squamous Intraepithelial Lesions/LGSIL) και ςε υψθλοφ βακμοφ ενδοεπικθλιακζσ αλλοιϊςεισ (High Grade Squamous Intraepithelial Lesions/HGSIL), για να ενςωματϊςουν τισ νεότερεσ αντιλιψεισ των διαφόρων βιολογικϊν φαινομζνων, τα οποία είναι υπεφκυνα για τισ παρατθροφμενεσ ιςτολογικζσ διαφορζσ, δεδομζνου ότι το φάςμα των ιςτολογικϊν αλλοιϊςεων που είχαν περιλθφκεί κάτω από τον όρο CIN δεν ιταν ενιαίο, αλλά αντιπροςϊπευε δφο διαφορετικζσ βιολογικζσ οντότθτεσ: HPV λοίμωξθ (CINI) και μία πραγματικά προκαρκινικι βλάβθ (CIN II και CIN III) (NCI workshop, 1988). To ςφςτθμα τθσ Bethesda (The Bethesda System-TBS) παρουςιάηει το πλεονζκτθμα τθσ παρουςίασ μθ τυπικϊν κοιλοκυττάρων (Στακόπουλοσ, 1994). Με το ςφςτθμα TBS ειςάγεται ο όροσ «ASCUS» (Atypical Squamous Cells of Undetermined Significance), δθλαδι «άτυπα πλακϊδθ κφτταρα μθ κακοριςμζνθσ ςθμαςίασ», για να απαλειφκεί θ χριςθ του όρου «ατυπία», που χρθςιμοποιοφταν αρκετά ςυχνά, για τθν περιγραφι οιωνδιποτε καταςτάςεων, από τισ απλζσ καλοικεισ αντιδραςτικζσ αλλοιϊςεισ ζωσ τισ προδιθκθτικζσ κυτταρικζσ αλλοιϊςεισ. Υπάρχουν δφο περιπτϊςεισ ςτισ οποίεσ θ κατθγορία ASCUS αναφζρεται /εφαρμόηεται: Σε ςυνδυαςμό με HPV αλλοιϊςεισ (κοιλοκυτταρικι ατυπία) Στα επιχρίςματα ςτα οποία είναι πραγματικά δφςκολο να γίνει διάκριςθ μεταξφ καλοικουσ, αντιδραςτικισ ι εκφυλιςτικισ αλλοίωςθσ από LSIL, HSIL ι διθκθτικό καρκίνο Μελζτεσ κατά τθν παρακολοφκθςθ των γυναικϊν με ASCUS, με τθν βοικεια τθσ κολποςκόπθςθσ, τθσ βιοψίασ ι τθσ επανάλθψθσ τθσ κυτταρολογικισ εξζταςθσ ζχουν δείξει ότι αποτελοφν μια ομάδα με ποικιλία ευρθμάτων. Στο 50-60% καμία ςθμαντικι ανωμαλία δεν βρίςκεται, ενϊ ζχει αναφερκεί ότι μζχρι και 20% των περιπτϊςεων ζχει CIN2 ι CIN3. Αυτά τα ευριματα δείχνουν ότι οι γυναίκεσ με επίχριςμα ASCUS πρζπει να παρακολουκθκοφν προςεκτικά (ALTS Group, 2003).

21 Xρθςιμοποιϊντασ το ςφςτθμα Bethesda, o κυτταρολόγοσ είναι υποχρεωμζνοσ να γίνεται πιο ςαφισ με τθ χριςθ του όρου «ατυπία», κακϊσ θ ατυπία περιορίηεται πλζον μόνο ςτισ περιπτϊςεισ, ςτισ οποίεσ τα κυτταρομορφολογικά ευριματα είναι πράγματι αβζβαιθσ ςθμαςίασ και να μθν ενςωματϊνει ςτθν κατθγορία ASCUS τισ κυτταρικζσ αλλοιϊςεισ, οι οποίεσ κεωροφνται ωσ κακαρά αντιδραςτικισ φφςεωσ και ωσ τζτοιεσ κα πρζπει να περιγράφονται (ΑCOG, 1993). Με τθν επικράτθςθ του νζου ςυςτιματοσ ονοματολογίασ κατά Bethesda, ο όροσ «δυςκαρφωςθ» ζπαψε να χρθςιμοποιείται και πζραςε ςτο περικϊριο. Ραρ όλα αυτά, όμωσ, και ςιμερα ςυνεχίηεται θ χριςθ όλων των όρων, όπωσ προκφπτει τουλάχιςτον από τθ διεκνι βιβλιογραφία (Coleman και Evans, 1989). Στον Ρίνακα 1 παρουςιάηεται θ αντιςτοιχία τθσ κατά Ραπανικολάου ορολογίασ με τθν κυτταρολογικι διάγνωςθ με βάςθ το Σφςτθμα κατά Bethesda και με βάςθ τον Ραγκόςμιο Οργανιςμό Υγείασ ςτθ νεοπλαςία του τραχιλου τθσ μιτρασ. Πίνακασ 1. Αντιςτοιχία τθσ κατά Ραπανικολάου ορολογίασ με τθν κυτταρολογικι διάγνωςθ με βάςθ το Σφςτθμα κατά Bethesda και με βάςθ τον Ρ.Ο.Υ. ςτθν ενδοεπικθλιακι νεοπλαςία του τραχιλου τθσ μιτρασ. Μαηικόσ ζλεγχοσ για καρκίνο τραχιλου - ζλεγχοσ HPV Η κυτταρολογικι εξζταςθ με τθ μορφι του test Ραπανικολάου ςυνζβαλε αποφαςιςτικά ςτθ μείωςθ των κρουςμάτων καρκίνου του τραχιλου τθσ μιτρασ. Η ευαιςκθςία όμωσ τθσ κυτταρολογικισ εξζταςθσ ςιμερα δεν μπορεί να κεωρθκεί επαρκισ για τθν ζγκαιρθ διάγνωςθ του καρκίνου του τραχιλου. Σφμφωνα με μελζτθ μεγάλου αρικμοφ περιπτϊςεων, ςτθν εντόπιςθ τθσ δυςπλαςίασ υψθλοφ βακμοφ (HSIL) θ ςυμβατικι κυτταρολογικι εξζταςθ ζχει ευαιςκθςία 68,1% και θ κυτταρολογία υγρισ φάςθσ 87,8%, ενϊ ο ςυνδυαςμζνοσ ζλεγχοσ του HPV DNA με το test

22 Ραπανικολάου ςχεδόν 100% (εικόνα 9) (Clavel et al, 2001). Σε μία πρόςφατθ μετανάλυςθ (Nanda et al, 2000) προςδιορίηεται ότι ςε μερικζσ χϊρεσ θ ευαιςκθςία τθσ κυτταρολογικισ εξζταςθσ κατά Ραπανικολάου ζφτανε το 51% για ςτάδιο CIN1 ενϊ ο μζςοσ όροσ ειδικότθτασ αυτισ άγγιηε το 98%. Η περιοριςμζνθ ευαιςκθςία τθσ εξζταςθσ αυτισ μπορεί να εξθγιςει γιατί παρατθρικθκε, ςτο 66% των γυναικϊν που εμφάνιςαν καρκίνο τραχιλου το 2003 ςτθ Μ. Βρετανία, ότι είχε προθγθκεί αρνθτικόσ ζλεγχοσ Pap-test (Sasieni et al, 2003). Επιπρόςκετα θ περαιτζρω διερεφνθςθ πικανισ πακολογίασ του τραχιλου τθσ μιτρασ προκαλεί ςθμαντικι νοςθρότθτα και ανθςυχία ςε ζνα μεγάλο μζροσ των εξεταηόμενων γυναικϊν, αφοφ περίπου το 10% του ςυνόλου των κυτταρολογικϊν εξετάςεων κα βρεκοφν πακολογικζσ (Benard et al, 2004). Για παράδειγμα ςε πλθκυςμό 20 εκατομμυρίων ατόμων ςτθ Μ.Βρετανία, κατά το , διενεργικθκαν ςχεδόν 4 εκατομμφρια κυτταρολογικζσ εξετάςεισ επιχριςμάτων τραχιλου μιτρασ, οι οποίεσ οδιγθςαν ςε παραπομπζσ για περαιτζρω κολποςκόπθςθ λόγω πακολογικϊν ευρθμάτων (Office of National Statistics Cervical Cancer Screening Programme England ). Οι γυναίκεσ με χαμθλοφ βακμοφ δυςπλαςία τραχιλου φάνθκε πωσ βιϊνουν εξίςου το ίδιο άγχοσ με τισ γυναίκεσ με υψθλοφ βακμοφ δυςπλαςία και θ ανθςυχία είναι μεγαλφτερθ ςτισ μικρότερεσ θλικιακζσ ομάδεσ και ςχετίηεται με το φόβο υπογονιμότθτασ (Gray et al, 2006). Δεν πρζπει να παραγνωρίςουμε τθν παρατθροφμενθ χαμθλι ςυμμετοχι από οριςμζνεσ ομάδεσ γυναικϊν ςτον προλθπτικό ζλεγχο (Office of National Statistics Cervical Cancer Screening Programme England ), ακόμθ και ςτα καλφτερα οργανωμζνα προγράμματα, από μειονεκτοφςεσ ευπακείσ ομάδεσ και εκνικζσ μειονότθτεσ, που μπορεί να μθ φκάνει το 20-25%. Οι παραπάνω γυναίκεσ μπορεί να ςυναντοφν προβλιματα πρόςβαςθσ ςε τζτοια προγράμματα προλθπτικοφ ελζγχου λόγω γλωςςικισ ανεπάρκειασ, να απζχουν από φόβο για τισ ςυνζπειεσ τθσ ζρευνασ, ι να τίκεται κζμα χαμθλοφ επιπζδου πλθροφόρθςθσ ςε νεαρότερεσ κυρίωσ θλικίεσ(gray et al, 2006). Η Επιτροπι Φαρμάκων και Τροφίμων των HΡΑ (FDA) το Μάρτιο του 2003, λαμβάνοντασ υπόψθ τισ πρόςφατεσ μελζτεσ μαηικοφ ελζγχου προτείνει τθν κακιζρωςθ του ελζγχου του HPV DNA ωσ κφριου εργαλείου μαηικοφ ελζγχου ςε

23 γυναίκεσ θλικίασ άνω των 30 ετϊν, ςε ςυνδυαςμό βεβαίωσ με το Pap test (Richard et al, 2003). Ο ζλεγχοσ του HPV DNA προτείνεται να επαναλαμβάνεται κάκε τρία ζτθ. Η λογικι τθσ πρόταςθσ ζγκειται ςτο γεγονόσ ότι θ HPV λοίμωξθ ςε γυναίκεσ αυτισ τθσ θλικίασ αποτελεί τθν χρονίωσ παραμζνουςα κατάςταςθ θ οποία αποτελεί το κφριο υπόβακρο ςτθν ανάπτυξθ επικθλιακισ νεοπλαςίασ τραχιλου. Ο ζλεγχοσ του HPV DNA ςε ςυνδυαςμό με το Pap test προςφζρει ευαιςκθςία 100% και ςχεδόν 100% αρνθτικι προβλεπτικι αξία ςτθν ανίχνευςθ προκαρκινικϊν αλλοιϊςεων και καρκίνου τραχιλου τθσ μιτρασ. Αντίκετα ο ζλεγχοσ του HPV DNA δεν ςυνιςτάται ωσ πρωταρχικό εργαλείο μαηικοφ ελζγχου ςε γυναίκεσ θλικίασ κάτω των 30 ετϊν λόγω του υψθλοφ ποςοςτοφ και τθσ παροδικισ φφςθσ των HPV λοιμϊξεων ςε αυτι τθν ομάδα πλθκυςμοφ. Το Pap test αντίκετα κεωρείται ιδανικό για τθν ομάδα γυναικϊν κάτω των 30 ετϊν δεδομζνου ότι κα εντοπίςει τισ περιπτϊςεισ εκείνεσ ςτισ οποίεσ ζχει δθμιουργθκεί βλάβθ και χριηει περαιτζρω διερεφνθςθσ με κολποςκόπθςθ και βιοψία. Η μονιρθσ κυτταρολογικι εξζταςθ βεβαίωσ δεν είναι επαρκισ για τθν ανίχνευςθ των ςοβαρϊν προκαρκινικϊν αλλοιϊςεων του τραχιλου. Αποτελεςματικι παρακολοφκθςθ και πρόλθψθ επιτυγχάνεται ςιμερα μόνο με τθν κυκλικι εφαρμογι ολοκλθρωμζνου ςυςτιματοσ που περιλαμβάνει το Pap test ςε ςυνδυαςμό με τον ζλεγχο του HPV DNA, τθν κολποςκόπθςθ και ιςτολογικι εξζταςθ τθσ βιοψίασ και τθ κεραπεία τθσ προκαρκινικισ αλλοίωςθσ. Eικόνα 9: Γραφικι παράςταςθ τθσ ευαιςκθςίασ τθσ κυτταρολογικισ εξζταςθσ και του ελζγχου του HPVDNA ςτθν ανίχνευςθ ςοβαροφ βακμοφ ενδοεπικθλιακϊν αλλοιϊςεων πλακϊδουσ επικθλίου (Clavel et al,2001). Μοριακζσ τεχνικζσ ανίχνευςθσ HPV-Kυτταρομετρία ροισ

24 Οι HPV ταυτοποιοφνται με μοριακι ανίχνευςθ του γενετικοφ τουσ υλικοφ. Οι ςπουδαιότερεσ τεχνικζσ ανίχνευςθσ των HPV ςτθν κλινικι πρακτικι είναι θ αλυςιδωτι αντίδραςθ πολυμεράςθσ (PCR) και θ τεχνικι του in situ υβριδιςμοφ. Η τεχνικι PCR μπορεί εφκολα να εφαρμοςκεί ςε κφτταρα τα οποία λαμβάνονται με ειδικό βουρτςάκι από τθν περιοχι τθσ μεταβατικισ ηϊνθσ του τραχιλου. Τα πλακϊδθ κφτταρα τθσ επιφανείασ του τραχιλου που λαμβάνονται περιζχουν μεγάλο αρικμό ιϊν γεγονόσ που κακιςτά εφκολθ τθν ανίχνευςθ του ιοφ με τθν ενιςχυτικι ικανότθτα τθσ PCR (Κapranos et al, 1993).Ο in situ υβριδιςμόσ εφαρμόηεται ςε βιοψίεσ και κωνοειδείσ εκτομζσ κακϊσ και ςε επιχρίςματα κυττάρων τραχιλου. Η τεχνικι του in situ υβριδιςμοφ είναι θ μόνθ θ οποία εντοπίηει τον ιό μζςα ςτο κφτταρο ςτο οποίο βρίςκεται και για το λόγο αυτό παρζχει ςθμαντικζσ μορφολογικζσ πλθροφορίεσ, όπωσ ποια και πόςα κφτταρα εμφανίηουν λοίμωξθ από τον ιό, ςε ποιο υποκυτταρικό διαμζριςμα (πυρινα ι κυτταρόπλαςμα) ευρίςκεται ο ιόσ και τι είδουσ ανωμαλίεσ ςυνοδεφουν τθν παρουςία του ιοφ (υπερπλαςία, δυςπλαςία κ.λπ.). H Southern blot κεωρείται μια ευαίςκθτθ και ειδικι τεχνικι υβριδοποίθςθσ για τθν ανίχνευςθ και τυποποίθςθ των HPV ςτελεχϊν. Η ευαιςκθςία τθσ μεκόδου αυτισ κυμαίνεται μεταξφ 0,1-0,01 αντιγράφων ιικοφ γονιδιϊματοσ ανά κφτταρο και απαιτεί ποςότθτα ολικοφ κυτταρικοφ DNA τθσ τάξεωσ των 10ng. Στα πλεονεκτιματα τθσ μεκόδου ςυγκαταλζγεται θ δυνατότθτα ανίχνευςθσ νζων ι μεταλλαγμζνων μορφϊν διαφόρων HPV τφπων ι υπότυπων, θ διάκριςθ τθσ φυςικισ κατάςταςθσ του ιικοφ DNA (επιςωματικό ι ενςωματωμζνο ςτο κυτταρικό DNA) κακϊσ και θ ανίχνευςθ μολφνςεων με περιςςότερο από ζναν τφπο HPV. Τα κφρια μειονεκτιματα τθσ μεκόδου είναι θ μεγάλθ ποςότθτα κυτταρικοφ DNA που απαιτείται, ο παρατεταμζνοσ χρόνοσ εκτζλεςθσ και θ ανάγκθ υπάρξεωσ εξειδικευμζνου εργαςτθρίου. Για αυτοφσ τουσ λόγουσ δεν εφαρμόηεται ςτθν κακθμερινι πράξθ, αλλά μόνο για ποιοτικοφσ ελζγχουσ και ερευνθτικοφσ ςκοποφσ. (Σπάκθσ, 2007). H Dot blot αποτελεί εναλλακτικι μζκοδο τθσ Southern blot λόγω των προαναφερκζντων μειονεκτθμάτων τθσ τελευταίασ. Σφμφωνα με τθ μζκοδο αυτι το κυτταρικό DNA απομονϊνεται και τοποκετείται με τθ βοικεια μικρισ ςυςκευισ απευκείασ ςτθ μεμβράνθ τθσ νιτροκυτταρίνθσ χωρίσ να ζχει προθγθκεί πζψθ και διαχωριςμό με θλεκτροφόρθςθ. Στθ ςυνζχεια το DNA αποδιατάςςεται και ακολουκεί ο υβριδιςμόσ κάτω από αυςτθρζσ

25 ςυνκικεσ. Σε πρϊτθ φάςθ, χρθςιμοποιείται μίγμα DNA ανιχνευτϊν για τον προςδιοριςμό τθσ ενδεικτικισ παρουςίασ ομολόγων HPV τφπων ςτο δείγμα και όταν υπάρξει κετικι αντίδραςθ ακολουκεί θ τυποποίθςθ με τθ χριςθ μεμονωμζνων DNA ανιχνευτϊν. Η ευαιςκθςία τθσ αντιςτοιχεί ςε 1 αντίγραφο ιικοφ γονιδιϊματοσ ανά κφτταρο, ενϊ θ ποςότθτα του ολικοφ DNA πρζπει να είναι γφρω ςτα 500ngr. Στα μειονεκτιματα τθσ μεκόδου ςυγκαταλζγονται θ δυνατότθτα υβριδοποίθςθσ μόνο κάτω από ςυνκικεσ υψθλισ ειδικότθτασ, θ αδυναμία ανίχνευςθσ νζων ι μεταλλαγμζνων τφπων HPV, θ αδυναμία αξιολόγθςθσ τθσ διαμόρφωςθσ του ιικοφ DNA και τζλοσ, το υψθλό ςχετικά ποςοςτό ψευδϊσ κετικϊν δειγμάτων (Σπάκθσ, 2007). Μία τεχνικι που αποτελεί από τισ πλζον ςφγχρονεσ μεκόδουσ μοριακισ διερεφνθςθσ είναι θ NASBA. Λειτουργεί με παρόμοιο τρόπο με το PCR, με δφο ςθμαντικζσ, όμωσ, διαφορζσ. Αντί για DNA ι cdna ωσ αρχικι μιτρα για τθν επιλεκτικι ενίςχυςθ κάποιου τμιματοσ μπορεί να χρθςιμοποιθκεί RNA Η αντίδραςθ ενίςχυςθσ πραγματοποιείται ςε μια ςτακερι κερμοκραςία χωρίσ εναλλαγζσ, όπωσ υπάρχει ςτο PCR. Η διαδικαςία ξεκινά με τον υβριδιςμό του ςτόχου με κατάλλθλο εκκινθτι (1), ο ποίοσ διακζτει αλλθλουχία πρόςδεςθσ τθσ 17 RNA πολυμεράςθσ. Ακολουκεί θ αντίςτροφθ μεταγραφι του τμιματοσ με χριςθ τθσ AMV-RT. To RNA ςτο υβρίδιο RNA-DNA που ζχει προκφψει υδρoλφεται από τθν RNase H. Το γεγονόσ αυτό επιτρζπει ςτον δεφτερο εκκινθτι (2), ο οποίοσ είναι ςυμπλθρωματικόσ με ζνα το τμιμα του RNΑ ςτόχου, να προςδεκεί ςτθν cdna αλυςίδα, θ οποία είναι αντίγραφο τθσ αρχικισ RNA αλλθλουχίασ με ζναν πλιρωσ λειτουργικό υποκινθτι τθσ Τ7 RNA polymerase. Ο υποκινθτισ αναγνωρίηεται από τθν Τ7 RNA polymerase, θ οποία παράγει αντίςτροφα (anti-sense), μονόκλωνα RNA μετάγραφα του αρχικοφ ςτόχου. Αυτά τα μετάγραφα χρθςιμοποιοφνται ωσ μιτρα για τθν επανεκκίνθςθ του κφκλου τθσ διαδικαςίασ, με μόνθ διαφορά ότι οι εκκινθτζσ προςδζνονται με αντίκετθ ςειρά. Η όλθ διαδικαςία πραγματοποιείται ςτουσ 41 ο C και θ τυπικι τάξθ ενίςχυςθσ κυμαίνεται ςτα 109 αντίγραφα.

26 Το ΚΙΤ ανίχνευςθσ του HPV, με χριςθ τεχνολογίασ NASBA, βαςίηεται ςτθν ανίχνευςθ του mrna των Ε6 και Ε7 πρωτεϊνϊν των 5 HPV τφπων υψθλοφ κινδφνου (16,18,31,33 και 45), οι οποίοι ςχετίηονται με το 95% των HPV- εξαρτϊμενων καρκίνων του τραχιλου μιτρασ ςτθν Ευρϊπθ. Τα βαςικά πλεονεκτιματα τθσ μεκόδου είναι ότι, αφενόσ ανιχνεφονται τα επίπεδα ζκφραςθσ των ογκογόνων πρωτεϊνϊν και αφετζρου, ότι μπορεί να εκτιμθκεί θ φάςθ τθσ μόλυνςθσ (επιςωματικι ι ενςωματωμζνθ), κακϊσ ζχει δειχκεί πωσ ςε ενςωματωμζνεσ μορφζσ ι ζκφραςθ των Ε6 και Ε7 αυξάνεται, ενϊ το ιικό φορτίο, υπολογιςμζνο ςε αντίγραφα DNA του ιοφ, μειϊνεται ςθμαντικά (Hart et al, 2003). Δφο ακόμθ μοριακζσ τεχνικζσ που χρθςιμοποιοφνται ευρζωσ και αποτελοφν και αντικείμενο τθσ παροφςασ μελζτθσ είναι ο υβριδιςμόσ ςε διάλυμα δεφτερθσ γενιάσ (Hybrid Capture 2/HC2) και οι HPV DNA μικροςυςτοιχίεσ. Η δοκιμαςία hc2 είναι μια ενιςχυμζνου ςιματοσ δοκιμαςία υβριδιςμοφ με δζςμευςθ αντιςωμάτων θ οποία χρθςιμοποιεί τθ μζκοδο ανίχνευςθσ με χθμειοφωταφγεια μικροπλακιδίου. Τα τραχθλικά δείγματα τα οποία μποροφν να αναλυκοφν με τθ δοκιμαςία hc2 HPV DNA περιλαμβάνουν τα εξισ: Δείγματα που ςυλλζγονται με το δειγματολιπτθ DNAPap Cervical Sampler ι το δειγματολιπτθ HC Cervical Sampler Δείγματα που ςυλλζγονται με δειγματολιπτθ τφπου ςαρϊκρου ι με ςυνδυαςμό βοφρτςασ/ςπάτουλασ και τοποκετοφνται ςε διάλυμα Cytyc PreservCyt Δείγματα που ςυλλζχκθκαν ςε Υγρό ςυντιρθςθσ TriPath Imaging SurePath (μόνο για τθν εξζταςθ υψθλοφ κινδφνου HPV DNA). Βιοψίεσ που ςυλλζγονται με το μζςο μεταφοράσ δείγματοσ (Specimen Transport Medium,STM). Κατά τθ χριςθ των ανιχνευτϊν HPV χαμθλοφ και υψθλοφ κινδφνου, θ εφαρμογι αυτισ τθσ δοκιμαςίασ ενδείκνυται για τθ διαφοροποίθςθ μεταξφ δφο ομάδων HPV DNA: χαμθλοφ κινδφνου HPV των τφπων 6/11/42/43/44 και υψθλοφ κινδφνου HPV των τφπων 16/18/31/33/35/39/45/51/52/56/58/59/68, ωςτόςο δεν μπορεί να προςδιοριςτεί ο ςυγκεκριμζνοσ τφποσ HPV ο οποίοσ υφίςταται.

27 To HPV OncoTect Test Kit είναι μία in situ μζκοδοσ βαςιςμζνθ ςτθν κυτταρομετρία ροισ, για τθν ανίχνευςθ του HPV Ε6 και Ε7 mrna ςε άκικτα κφτταρα του ανκρϊπου. Το εμπορικό ςκεφαςμα μπορεί να εφαρμοςτεί ςε οποιαδιποτε διακζςιμα μονιρθ κφτταρα κατάλλθλα για το κυτταρόμετρο ροισ ι για οπτικι ανάλυςθ. Οι τφποι του δείγματοσ που μποροφν να χρθςιμοποιθκοφν είναι οι εξισ: κολποτραχθλικό επίχριςμα υγρισ φάςθσ, κυτταρικζσ ςειρζσ, απομονωμζνοσ ιςτόσ και υγρά του ςϊματοσ. Σε ςυνδυαςμό με τθν ανίχνευςθ των επιφανειακϊν δεικτϊν των κυττάρων, θ μζκοδοσ αυτι παρζχει χριςιμεσ πλθροφορίεσ για τθν εκτίμθςθ τθσ ιικισ παραγωγισ ςτο κυτταρικό επίπεδο. Ρρόςφατεσ ζρευνεσ προτείνουν ότι θ in situ ανίχνευςθ του ενεργοφ ιικοφ mrna προθγείται ι ςυμπίπτει με τισ μορφολογικζσ αλλαγζσ ςτα κφτταρα του τραχιλου τθσ μιτρασ υποδθλϊνοντασ είτε δυςπλαςία είτε καρκίνο του τραχιλου τθσ μιτρασ. Η ανίχνευςθ τθσ παρουςίασ του κθλωματοϊοφ και ςυγκεκριμζνα του ογκογόνου ορότυπου του HPV γίνεται ωσ τϊρα με μια ποικιλία τεχνικϊν οι οποίεσ βαςίηονται ςτθν κυτταρικι λφςθ. Κοινό χαρακτθριςτικό όλων αυτϊν είναι θ καταςτροφι των κυττάρων που περιζχουν τον ιό, απομόνωςθ και κακαριςμό του ςυνολικοφ DNA και τελικά ανίχνευςθ τθσ ιικισ αλλθλουχίασ DNA που κωδικοποιεί τθν L1 πρωτεΐνθ. Οι τεχνικζσ αυτζσ κατά κφριο λόγο είναι θ αλυςιδωτι αντίδραςθ τθσ πολυμεράςθσ(pcr), ο υβριδιςμόσ hybrid capture (HC2) και θ ανίχνευςθ κατά southern οι οποίεσ περιλαμβάνουν ςε γενικζσ γραμμζσ τθν καταςτροφι των κυττάρων, τθν ανίχνευςθ του HPV DNA και ανίχνευςθ των L1 γονιδίων. Το HPV OncoTect χρθςιμοποιεί μία καινοτόμο in situ τεχνικι υβριδιςμοφ με αποκλειςτικά δικό του ανιχνευτι και μια μζκοδο ταξινόμθςθσ ωσ πατενταριςμζνθ εφαρμογι. Σε αντίκεςθ με τισ άλλεσ μεκοδολογίεσ που ανιχνεφουν το L1 γονίδιο, θ ςυγκεκριμζνθ μεκοδολογία εκμεταλλεφεται το γεγονόσ ότι το DNA του ιοφ ενςωματϊνεται ςτο γονιδιωματικό DNA του μολυςμζνου κυττάρου και ακολουκεί θ μεταγραφι των Ε6 και Ε7- mrnas. Επιπλζον, ςε αυτιν τθν περίπτωςθ, το κφτταρο παραμζνει άκικτο και δεν καταςτρζφεται για να γίνει θ ανίχνευςθ. Ζνα ακόμθ πλεονζκτθμα είναι θ δυνατότθτα που προςφζρει για παράλλθλθ ανίχνευςθ πρωτεϊνϊν με τα νουκλεϊκά οξζα του HPV, ζνασ προςδιοριςμόσ που ξεχωρίηει από κάκε άλλθ μοριακι τεχνολογία.

28 κοπόσ Στθν παροφςα εργαςία τροποποιικθκε μία τεχνικι που χρθςιμοποιεί ταυτόχρονο ανοςοφκοριςμό και ευαίςκθτο φκορίηοντα in situ υβριδιςμό (HPV FISH). Συγκεκριμζνα μελετικθκε θ χριςθ τθσ κυτταρομετρίασ ροισ (HPV mrna Flow FISH) ωσ μζκοδοσ μαηικοφ ελζγχου (screening test) ςε κολποτραχθλικά επιχρίςματα υγρισ φάςθσ για τθν ανίχνευςθ των Ε6 και Ε7-mRNAs του ιοφ HPV. Για το ςκοπό αυτό προςδιορίςτθκε θ ευαιςκθςία και θ ειδικότθτα τθσ κυτταρομετρίασ ροισ ςε ςχζςθ με τθν κυτταρομορφολογία και το HPV DNA test για τθν ανίχνευςθ προκαρκινικϊν ενδοεπικθλιακϊν αλλοιϊςεων του τραχιλου τθσ μιτρασ. Ραράλλθλα, αξιολογικθκε θ προγνωςτικι αξία τθσ HPV mrna Flow FISH ςυγκριτικά με το HPV DNA test με ςκοπό να εκτιμθκεί θ ςυμβολι τθσ ςτθ διάκριςθ τθσ ομάδασ γυναικϊν υψθλοφ κινδφνου, που χριηει ςτενισ παρακολοφκθςθσ και ενδεχομζνωσ ειδικϊν κεραπευτικϊν χειριςμϊν. Τλικά & Μζκοδοι Δοκιμαςία Ηybrid Capture 2 Αρχι διαδικαςίασ (Kλινικό Ρρωτόκολλο Digene) Δείγματα τα οποία περιζχουν το DNA-ςτόχο υβριδοποιοφνται με ζνα ςυγκεκριμζνο ανιχνευτι HPV RNA. Τα παραγόμενα υβρίδια RNA:DNA δεςμεφονται ςτθν επιφάνεια ενόσ μικροπλακιδίου καλά επικαλυμμζνου με ςυγκεκριμζνα αντιςϊματα για υβρίδια RNA:DNA. Τα ακινθτοποιθμζνα υβρίδια αντιδροφν με ςυηευγμζνα με αλκαλικι φωςφατάςθ αντιςϊματα, ειδικά για υβρίδια RNA:DNA και ανιχνεφονται με ζνα υπόςτρωμα χθμειοφωταφγειασ. Αρκετά μόρια αλκαλικισ φωςφατάςθσ αντιςτοιχίηονται ςε κάκε αντίςωμα. Ρολλαπλά ςυηευγμζνα

29 αντιςϊματα ενϊνονται ςε κάκε δεςμευμζνο υβρίδιο προκαλϊντασ ςθμαντικι ενίςχυςθ ςιματοσ. Κακϊσ το υπόςτρωμα διαςπάται από τθ δεςμευμζνθ αλκαλικι φωςφατάςθ, εκλφεται φωσ, το οποίο μετράται ςε μονάδεσ μζτρθςθσ ςχετικισ φωτεινότθτασ (RLU) ςε ζνα λουμινόμετρο. Η ζνταςθ του φωτόσ που εκλφεται υποδθλϊνει τθν παρουςία ι απουςία του DNA-ςτόχου ςτο δείγμα. Μια μζτρθςθ RLU ίςθ ι μεγαλφτερθ τθσ τιμισ Cutoff υποδεικνφει τθν παρουςία αλλθλουχιϊν HPV DNA ςτο δείγμα. Μια μζτρθςθ RLU μικρότερθ τθσ τιμισ Cutoff υποδεικνφει τθν απουςία των ςυγκεκριμζνων αλλθλουχιϊν HPV DNA που εξετάηονται ι δθλϊνει ότι τα επίπεδα HPV DNA βρίςκονται κάτω του ορίου ανίχνευςθσ τθσ δοκιμαςίασ (Digene corporation, 1998). Yλικά και αντιδραςτιρια Σε κάκε κιτ δοκιμαςίασ hc2 HPV DNA περιζχονται 96 τεςτ. Ο αρικμόσ των αποτελεςμάτων αςκενϊν κυμαίνεται ανάλογα με τον αρικμό των χριςεων ανά κιτ: 1 χριςθ = 40 αποτελζςματα αςκενϊν (χαμθλοφ και υψθλοφ κινδφνου), 2 χριςεισ = 32 αποτελζςματα αςκενϊν (χαμθλοφ και υψθλοφ κινδφνου). 1 x 0,35 ml Χρωματικόσ Δείκτθσ (indic). Ρεριζχει 0,05% w/v αηίδιο του νατρίου. 1 x 50 ml Αντιδραςτιριο Αποδιάταξθσ (denaturation reagent). Διάλυμα αραιωμζνου υδροξειδίου του νατρίου (NaOH). 1 x 5 ml Αραιωτισ Ανιχνευτι (probe diluent). υκμιςτικό διάλυμα με 0,05% w/v αηίδιο του νατρίου. 1 x 150 μl Ανιχνευτισ HPV Χαμθλοφ Κινδφνου (probe HPV Low Risk). HPV 6/11/42/43/44 RNA μείγμα ανιχνευτϊν ςε ρυκμιςτικό διάλυμα. 1 x 100 μl Ανιχνευτισ HPV Υψθλοφ Κινδφνου(probe HPV High Risk). HPV 16/18/31/33/35/39/45/51/52/56/58/59/68 RNA μείγμα ανιχνευτϊν ςε ρυκμιςτικό διάλυμα. 1 x 1 ml Ζλεγχοσ ποιότθτασ HPV Χαμθλοφ Κινδφνου (Quality control HPV Low Risk). 5 pg/ml ( αντίγραφα/ml) κλωνοποιθμζνου HPV 6 DNA και DNA-φορζα ςε STM με 0,05% w/v αηίδιο του νατρίου. 1 x 1 ml Ζλεγχοσ Ροιότθτασ HPV Υψθλοφ Κινδφνου (Quality control HPV High Risk). 5 pg/ml ( αντίγραφα/ml) κλωνοποιθμζνου HPV 16 DNA και DNA-φορζα ςε STM με 0,05% αηίδιο του νατρίου.

30 x 2,0 ml Αρνθτικόσ Μάρτυρασ (negative calibrator). DNA-φορζασ ςε STM με 0,05% w/v αηίδιο του νατρίου. 1 x 1,0 ml Βακμονομθτισ HPV Χαμθλοφ Κινδφνου (HPV Low Risk calibrator). 1 pg/ml κλωνοποιθμζνου HPV 11 DNA και DNA-φορζασ ςε STM με 0,05% w/v αηίδιο του νατρίου. 1 x 1,0 ml Βακμονομθτισ HPV Υψθλοφ Κινδφνου (HPV High Risk calibrator). 1 pg/ml κλωνοποιθμζνου HPV 16 DNA και DNA-φορζασ ςε STM με 0,05% w/v αηίδιο του νατρίου. 1 x 1 Μικροπλακίδιο Δζςμευςθσ (capture plate). Επικαλυμμζνο με αντιςϊματα υβριδίου αντι- RNA:DNA. 1 x 12 ml Αντιδραςτιριο Ανίχνευςθσ 1 (Detection reagent 1). Συηευγμζνα με αλκαλικι φωςφατάςθ αντιςϊματα με υβρίδια RNA:DNA ςε ρυκμιςτικό διάλυμα με 0,05% w/v αηίδιο του νατρίου. 1 x 12 ml Αντιδραςτιριο Ανίχνευςθσ 2 (Detection reagent 2).Yπόςτρωμα χθμειοφωταφγειασ ( CDP-Star με Emerald II). 1 x 100 ml Συμπυκνωμζνο ρυκμιςτικό διάλυμα ζκπλυςθσ (Wash buffer 30). Ρεριζχει 1,5% w/v αηίδιο του νατρίου. Τραχθλικά δείγματα ςε διάλυμα Cytyc PreservCyt Στθν παροφςα εργαςία τα δείγματα ςυλλζχκθκαν με δειγματολιπτθ τφπου ςαρϊκρου ι με ςυνδυαςμό βοφρτςασ/ςπάτουλασ και τοποκετικθκαν ςε διάλυμα Cytyc PreservCyt (ΤhinPrep). Ρρζπει να υπολείπονται τουλάχιςτον 4 ml διαλφματοσ PreservCyt για τθ δοκιμαςία hc2 HPV DNA. Δείγματα με λιγότερο από 4 ml μετά τθν προετοιμαςία του τζςτ Pap μπορεί να περιζχουν ανεπαρκζσ υλικό και να δϊςουν ψευδϊσ αρνθτικά αποτελζςματα κατά τθ δοκιμαςία hc2 HPV DNA. Τα δείγματα ςε διάλυμα PreservCyt μπορεί να διατθρθκοφν ζωσ και τρεισ μινεσ ςε κερμοκραςίεσ μεταξφ 2 C και 30 C, μετά τθ ςυλλογι και πριν τθν επεξεργαςία τουσ με τθ δοκιμαςία hc2 HPV DNA. Ρροετοιμαςία δειγμάτων Ανακινοφμε δυνατά κάκε φιαλίδιο με διάλυμα PreservCyt μζχρι τα κφτταρα να εμφανίηονται ομοιογενϊσ κατανεμθμζνα.

31 Μεταγγίηoυμε 4ml από το διάλυμα PreservCyt ςτον πάτο κωνικοφ ςωλθναρίου των 15ml ϊςτε να αποφευχκεί θ προςκόλλθςθ κυτταρικοφ υλικοφ ςτο εςωτερικό του ςωλθναρίου. Ρροςκζτουμε 0,4ml από το ρυκμιςτικό διάλυμα μετατροπισ δείγματοσ (conversion buffer) ςε κάκε ςωλθνάριο Aναδεφουμε ςχολαςτικά (vortex) το περιεχόμενο κάκε ςωλθναρίου Φυγοκεντροφμε τα ςωλθνάρια ςτα ± 150 x g για 15 ± 2 λεπτά. Κατά τθ φυγοκζντρθςθ παραςκευάηουμε το μείγμα του μζςου μεταφοράσ δείγματοσ και αντιδραςτθρίου αποδιάταξθσ (STM/DNR) ςε αναλογία 2:1 (120μl STM + 60μl DNR για κάκε ςωλθνάριο) Ανακινοφμε το μείγμα ςχολαςτικά με ιςχυρι ανάδευςθ (vortex). Αφαιρoφμε τα ςωλθνάρια από τθ ςυςκευι φυγοκζντρθςθσ ζνα προσ ζνα και τα τοποκετοφμε ςε ςτατϊ μετατροπισ (Conversion Rack). Στθ βάςθ κάκε ςωλθναρίου πρζπει να υπάρχει ζνα ροη/πορτοκαλί ςφαιρίδιο. Δείγματα ςτα οποία δεν υπάρχει εμφανζσ ςφαιρίδιο μετά τθ φυγοκζντρθςθ δεν ενδείκνυνται για τθ δοκιμαςία και πρζπει να απορρίπτονται. Αδειάηουμε προςεκτικά το υπερκείμενο υγρό. Διατθροφμε το ςωλθνάριο ςε ανεςτραμμζνθ κζςθ, το ςτυπϊνουμε προςεκτικά (χτυπϊντασ περίπου 6 φορζσ) ςε απορροφθτικό χαρτοβάμβακα μζχρι να μθν ςτάηει υγρό από το ςωλθνάριο. Χρθςιμοποιοφμε μια κακαρι πλευρά του χαρτοβάμβακου κάκε φορά για να μθν υπάρξει κίνδυνοσ επιμόλυνςθσ. Στροβιλιςμόσ και αποδιάταξθ Ρροςκζτουμε 150μl μείγματοσ μζςου μεταφοράσ δείγματοσ και αντιδραςτθρίου αποδιάταξθσ (με 3 ςταγόνεσ χρωματικοφ δείκτθ) ςε κάκε ςφαιρίδιο και τουσ όγκουσ που παρατίκεται ςτον Ρίνακα για κάκε βακμονομθτι και ζλεγχο ποιότθτασ Εναιωροφμε κάκε ςφαιρίδιο μεμονωμζνα ςτροβιλίηοντασ κάκε ςωλθνάριο για τουλάχιςτον 30 δευτερόλεπτα ςτθ μζγιςτθ ταχφτθτα (vortex). Τοποκετoφμε το ςτατϊ με τα δείγματα και τουσ βακμονομθτζσ ςε υδατόλουτρο κερμοκραςίασ 65 ± 2 C για 15 ± 2 λεπτά

32 Απομακρφνουμε το ςτατϊ από το υδατόλουτρο και ςτροβιλίηουμε τα δείγματα μεμονωμζνα για δευτερόλεπτα. Πλα τα ςφαιρίδια πρζπει να ζχουν εναιωρθκεί πλιρωσ ςε αυτό το ςτάδιο. Επαναφζρουμε το ςτατϊ ςτο υδατόλουτρο κερμοκραςίασ 65 ± 2 C και ςυνεχίηουμε τθν αποδιάταξθ για άλλα 30 ± 3 λεπτά. Υβριδιςμόσ Μετά τθν επϊαςθ, αφαιροφμε τουσ βακμονομθτζσ, τουσ ελζγχουσ ποιότθτασ και τα δείγματα από το υδατόλουτρο Αναδεφουμε (vortex) κάκε ςωλθνάριο ξεχωριςτά για τουλάχιςτον 5 δευτερόλεπτα. Μεταφζρoυμε 75 μl από κάκε βακμονομθτι, ζλεγχο ποιότθτασ ι δείγμα ςτον πυκμζνα ενόσ κενοφ πθγαδιοφ μικροπλακιδίου υβριδιςμοφ, ακολουκϊντασ τθ διάταξθ που παρατίκεται ςτον Ρίνακα 2. Αποφεφγουμε τθν επαφι με τα τοιχϊματα των πθγαδιϊν και περιορίηουμε το ςχθματιςμό φυςαλίδων αζρα. Ραράδειγμα διάταξθσ για διεξαγωγι με 24 πθγαδάκια Στιλθ Σειρά Α NC Δείγμα 1 Δείγμα 9 B NC Δείγμα 2 Δείγμα 10 C NC Δείγμα 3 Δείγμα 11 D LRC ι HRC Δείγμα 4 Δείγμα 12 E LRC ι HRC Δείγμα 5 Δείγμα 13 F LRC ι HRC Δείγμα 6 Δείγμα 14 G QC1-LR Δείγμα 7 Δείγμα 15 H QC2-HR Δείγμα 8 Δείγμα 16 Ρίνακασ 2:Δθμιουργία διάταξθσ πλακιδίου με τθ χριςθ του λογιςμικοφ Digene Qualitative Software. Κατά τθ μεταφορά των δειγμάτων δεν αγγίηουμε το εςωτερικό του ςωλθναρίου με το ρφγχοσ τθσ πιπζττασ κατά τθν αναρρόφθςθ των 75μl υποπολλαπλαςίου. Είναι πικανό να προκφψουν ψευδϊσ κετικά αποτελζςματα εάν τα υποπολλαπλάςια των δειγμάτων δεν μεταφερκοφν προςεκτικά. Μετά τθ μεταφορά του τελευταίου δείγματοσ, καλφπτουμε το πλακίδιο με καπάκι και πραγματοποιοφμε κερμοκραςία C. επϊαςθ του μικροπλακιδίου υβριδιςμοφ για 10 λεπτά ςε

33 Υποπολλαπλαςιάηουμε το παραςκευαςμζνο και καλά ςτροβιλιςμζνο μείγμα ανιχνευτϊν ςε ζνα αναλϊςιμο δοχείο αποκικευςθσ αντιδραςτθρίων. Μεταγγίηουμε προςεκτικά 25 μl του μείγματοσ ανιχνευτϊν ςε κάκε μικροςωλθνάριο που περιζχει μάρτυρεσ, βακμονομθτζσ και δείγματα, χρθςιμοποιϊντασ μια 8-κάναλθ πιπζττα και κακαρά ρφγχθ για κάκε ςειρά. Ανακινοφμε το ςτατϊ των μικροςωλθναρίων με τον περιςτροφικό ανακινθτιρα ςτθ κζςθ 1100 ± 100 rpm για 3 ±2 λεπτά. Οι βακμονομθτζσ, οι Έλεγχοι ποιότθτασ και τα δείγματα πρζπει να αποκτοφν κίτρινο χρϊμα μετά τθν ανάδευςθ. Ακολουκεί επϊαςθ ςε υδατόλουτρο κερμοκραςίασ 65 ± 2 C για 60 ± 5 λεπτά. Δζςμευςθ υβριδίου Μεταφζρουμε το ςυνολικό περιεχόμενο (κατά προςζγγιςθ 100 μl) των μαρτφρων, των βακμονομθτϊν και των δειγμάτων από τα πθγαδάκια ι τα μικροςωλθνάρια του μικροπλακιδίου υβριδιςμοφ ςτο κάτω μζροσ του αντίςτοιχου πθγαδιοφ μικροπλακιδίου δζςμευςθσ χρθςιμοποιϊντασ μια 8-κάναλθ πιπζττα. Καλφπτουμε το μικροπλακίδιο δζςμευςθσ με το καπάκι του μικροπλακιδίου και ανακινοφμε με τον περιςτρεφόμενο ανακινθτιρα ςτθ κζςθ 1100 ± 100 rpm, ςε κερμοκραςία C και για 60 ±5 λεπτά. Μετά τθν ολοκλιρωςθ τθσ φάςθσ δζςμευςθσ, αφαιροφμε το υγρό που περιζχεται ςτα πθγαδάκια, απορρίπτοντάσ το ςε νιπτιρα. Στυπϊνουμε χτυπϊντασ ςτακερά 2-3 φορζσ επάνω ςε κακαρό χαρτοβάμβακο Ανίχνευςθ υβριδίου Υποπολλαπλαςιάηουμε τον κατάλλθλο όγκο Αντιδραςτθρίου Ανίχνευςθσ 1 ςε ζνα αναλϊςιμο δοχείο αποκικευςθσ αντιδραςτθρίων. Μεταγγίηουμε προςεκτικά 75 μl Αντιδραςτθρίου Ανίχνευςθσ 1 ςε κάκε πθγαδάκι του Μικροπλακιδίου δζςμευςθσ χρθςιμοποιϊντασ μια 8-κάναλθ πιπζττα και τθν τεχνικι ανάδρομθσ αναρρόφθςθσ. Καλφπτουμε τα μικροπλακίδια με καπάκι μικροπλακιδίων και επωάηουμε ςε κερμοκραςία C για λεπτά. Ζκπλυςθ

34 Απορρίπτουμε το αντιδραςτιριο ανίχνευςθσ 1 από τα πθγαδάκια και ςτυπϊνουμε καλά ςε κακαρό χαρτοβάμβακο. Κάκε πθγαδάκι πρζπει να ξεπλζνεται ( 6 φορζσ) προκαλϊντασ εκχείλιςθ ϊςτε να απομακρυνκεί το αντιδραςτιριο ανίχνευςθσ 1 από τα χείλθ των πθγαδιϊν. Η διαδικαςία ζκπλυςθσ ξεκινά με το πθγαδάκι A1 και ςυνεχίηεται με ελικοειδι κατεφκυνςθ προσ τα δεξιά και προσ τα κάτω. Αφοφ ζχουν γεμίςει όλα τα πθγαδάκια, αδειάηουμε το υγρό ςτο νιπτιρα με δυνατι κίνθςθ προσ τα κάτω. Μετά τθν ζκπλυςθ ςτυπϊνουμε το πλακίδιο αναςτρζφοντάσ το ςε κακαρό χαρτοβάμβακο και χτυπϊντασ το ςτακερά 3-4 φορζσ. Ενίςχυςθ ςιματοσ Μεταγγίηουμε προςεκτικά 75 μl αντιδραςτθρίου ανίχνευςθσ 2 ςε κάκε πθγαδάκι του μικροπλακιδίου δζςμευςθσ χρθςιμοποιϊντασ μια 8-κάναλθ πιπζττα. Πλα τα πθγαδάκια του μικροπλακιδίου πρζπει να αποκτιςουν ζνα κίτρινο χρϊμα παρόμοιασ ζνταςθσ. Καλφπτουμε τα μικροπλακίδια με μεμβράνθ (plate sealer) και επωάηουμε ςε κερμοκραςία C για 15 λεπτά. Ακολουκεί ανάγνωςθ του μικροπλακιδίου ςτο λουμινόμετρο Digene Microplate Luminometer 2000 (DML 2000 ) μετά τθν πάροδο των 15 λεπτϊν τθσ επϊαςθσ (και όχι πζραν των 30 λεπτϊν μετά τθν επϊαςθ). Ερμθνεία αποτελεςμάτων Η τιμι cutoff τθσ Δοκιμαςίασ hc2 HPV DNA τθσ τάξθσ του 1pg/ml ιςοφται με αντίγραφα HPV /ml ι με αντίγραφα HPV ανά δοκιμαςία. Δείγματα STM με λόγο RLU/τιμισ Cutoff 1,0 για ανιχνευτζσ HPV χαμθλοφ και υψθλοφ κινδφνου κεωροφνται «κετικά» ωσ προσ 1 ι περιςςότερουσ τφπουσ HPV τθσ κάκε ομάδασ ανιχνευτϊν. Κατά τθν εξζταςθ δειγμάτων ςε διάλυμα PreservCyt, εάν ο λόγοσ RLU/CO ενόσ δείγματοσ είναι 1,0 και <2,5, θ Digene ςυνιςτά τθν επανεξζταςθ του δείγματοσ. Εάν το αρχικό αποτζλεςμα τθσ επανεξζταςθσ είναι κετικό (( 1,0 RLU/CO), το δείγμα μπορεί να ανακοινωκεί ωσ κετικό και δεν απαιτείται περαιτζρω επανεξζταςθ. Ωςτόςο, εάν το

35 πρϊτο αποτζλεςμα τθσ επανεξζταςθσ είναι αρνθτικό (<1,0), τότε απαιτείται δεφτερθ επανεξζταςθ (τρίτο αποτζλεςμα) προκειμζνου να λθφκεί ζνα οριςτικό αποτζλεςμα. Δείγματα με λόγο RLU/τιμισ Cutoff <1,0 για το μείγμα ςυνδυαςμοφ ανιχνευτϊν ι για ανιχνευτζσ HPV χαμθλοφ και υψθλοφ κινδφνου κεωροφνται «αρνθτικά» ι «χωρίσ ανίχνευςθ HPV DNA»ωσ προσ τουσ 18 εξεταηόμενουσ τφπουσ HPV. Οι αλλθλουχίεσ HPV DNA είτε απουςιάηουν είτε τα επίπεδα του HPV DNA βρίςκονται κάτω του ορίου ανίχνευςθσ τθσ δοκιμαςίασ. Με τθ δοκιμαςία hc2 HPV DNA παρζχονται δείγματα ελζγχου ποιότθτασ. Αυτοί οι ζλεγχοι πρζπει να ςυμπεριλαμβάνονται ςε κάκε κφκλο δοκιμαςίασ και θ τιμι RLU/CO κάκε ελζγχου πρζπει να βρίςκεται εντόσ των παρακάτω επιτρεπτϊν ορίων (Ρίνακασ 3) ϊςτε θ δοκιμαςία να κεωρθκεί ζγκυρθ. Εάν οι ζλεγχοι ποιότθτασ δεν εμπίπτουν ςτα όρια αυτά, θ δοκιμαςία είναι άκυρθ και πρζπει να επαναλθφκεί. Κατά ςυνζπεια, δεν πρζπει να ανακοινωκεί κανζνα αποτζλεςμα ενόσ άκυρου κφκλου δοκιμαςίασ. Ρίνακασ 3: Aναμενόμενα αποτελζςματα μζςθσ τιμισ RLU/CO και ςυντελεςτι απόκλιςθσ (επαναλθψιμότθτα ςε κφκλουσ δοκιμαςιϊν, CV%) για κάκε ζλεγχο (Digene corporation, 1998). ΗPV DNA μικροςυςτοιχίεσ (clinical arrays) Αρχι διαδικαςίασ (Kλινικό πρωτόκολλο Genomica) Το CLINICAL ARRAYS Human Papillomavirus kit μπορεί να ανιχνεφςει τθν φπαρξθ 35 τφπων HPV με τθν μεγαλφτερθ κλινικι ςθμαςία (6, 11, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 56, 58, 59, 61, 62, 66,

36 , 70, 71, 72, 73, 81, 82, 83, 84, 85 και 89) ςε κολποτραχθλικά επιχρίςματα (ThinPrep) και τομζσ ιςτοφ μονιμοποιθμζνεσ ςε φορμόλθ και εγκλειςμζνεσ ςε παραφίνθ. Αυτό το κιτ είναι ςχεδιαςμζνο για τθν in vitro διάγνωςθ των διαφορετικϊν τφπων HPV, βαςιηόμενο ςτον πολλαπλαςιαςμό ςυγκεκριμζνων αλλθλουχιϊν του ιϊκοφ γενϊματοσ και ςτθν ανίχνευςθ μζςω υβριδοποίθςθσ με ςυγκεκριμζνουσ ανιχνευτζσ για τον κάκε τφπο. Η ανίχνευςθ επιτυγχάνεται με πολλαπλαςιαςμό αλλθλουχίασ 450 bp τθσ περιοχισ L1 του ιοφ. Αυτι είναι μια καλά διατθρθμζνθ αλλθλουχία, με μικρζσ παραλλαγζσ που εξαρτϊνται από τον τφπο του HPV. Αυτζσ οι παραλλαγζσ είναι αρκετά μεγάλεσ για να επιτρζψουν τθν ανίχνευςθ των διαφορετικϊν τφπων HPV με τθν χριςθ ςυγκεκριμζνων ανιχνευτϊν. Η ειδικότθτα τθσ ανίχνευςθσ λοιπόν είναι εγγυθμζνθ.τα πολλαπλαςιαςμζνα προϊόντα ανιχνεφονται με τθ χριςθ νζασ τεχνολογίασ που βαςίηεται ςε μικροςυςτοιχίεσ (microarrays) μικρισ πυκνότθτασ: το array tube (AT). Η πλατφόρμα του ΑΤ βαςίηεται ςε μια απλι αρχι που κακιςτά το ςφςτθμα πολφ αποτελεςματικό και εφκολο ςτθ χριςθ - τθ ςτερζωςθ ενόσ microarray ςτον πυκμζνα ενόσ ςωλινα eppendorf (Εικόνα 10). Σε ςφγκριςθ με τα κλαςςικά ςυςτιματα μικροςυςτοιχιϊν (microarray), αυτό το ςφςτθμα απλοποιεί ςθμαντικά τισ διαδικαςίεσ υβριδοποίθςθσ και ςχθματιςμοφ εικόνασ.αυτι θ τεχνολογία επιτρζπει τθν ταυτόχρονθ ανίχνευςθ πολλαπλϊν μοριακϊν δεικτϊν με διαγνωςτικι χριςθ (ςε αυτι τθ περίπτωςθ των παραλλαγϊν τθσ αλλθλουχίασ του γενϊματοσ L1 των 35 τφπων HPV) αλλά και παρζχει τουσ μάρτυρεσ που χρειάηονται για Σύνθετη Διάστικτη μικροσυστοιχία Εικόνα 10: Η πλαηθόρμα ΑΤ Το microarray έτει δι αζηάζει ς μόνο 3X3mm. Η δι άζηι κηη εκδοτή μεηαθέρει 120 ανι τνεσηές, η ζύνθεηη εκδοτή μεηαθέρει μέτρι και τθν εξαςφάλιςθ αξιόπιςτων αποτελεςμάτων. Η ανίχνευςθ τθσ υβριδοποίθςθσ βαςίηεται ςτο ςχθματιςμό αδιάλυτου προϊόντοσ ςτο microarray ςτισ περιοχζσ όπου τα πολλαπλαςιαςμζνα προϊόντα δεςμεφονται από τουσ ανιχνευτζσ. Κατά τθ διαδικαςία τθσ PCR, τα

37 πολλαπλαςιαςμζνα προϊόντα επιςθμαίνονται με βιοτίνθ. Αυτά τα επιςθμαςμζνα προϊόντα ςυνδζονται με τουσ ςυγκεκριμζνουσ ανιχνευτζσ του microarray κατά τθν υβριδοποίθςθ και ακινθτοποιοφνται. Κατόπιν επωάηονται με ςφμπλεγμα ςτρεπταβιδίνθσ-υπεροξειδάςθσ το οποίο ςυνδζεται με τα πολλαπλαςιαςμζνα προϊόντα με αντίδραςθ μεταξφ τθσ ςτρεπταβιδίνθσ και τθσ βιοτίνθσ.στθ ςυνζχεια, κατά τθν παρουςία τθσ ζνωςθσ 3,3', 5,5' με tetramethylbenzidine (TMB), θ δράςθ τθσ υπεροξειδάςθσ του ςυμπλζγματοσ προκαλεί τθν εμφάνιςθ αδιάλυτου προϊόντοσ, το οποίο κακιηάνει ςτισ περιοχζσ υβριδιςμοφ του microarray (Εικόνα 11). ΕEπιςθμαςμζνα προϊόντα ππολλαπλαςιαςμοφ Εικ.11. Μζκοδοσ ςχθματιςμοφ εικόνασ. Οι ανιχνευτζσ που είναι ακινθτοποιθμζνοι ςτο microarray,δεςμεφουν τα ςυγκεκριμζνα πολλαπλαςιαςμζνα προϊόντα τα οποία είναι επιςθμαςμζνα με βιοτίνθ. Το ςφμπλεγμα (ςτρεπταβιδίνθσ-υπεροξειδάςθσ) προςτίκεται ςτθ ςυνζχεια. Η αντίδραςθ μεταξφ τθσ ςτρεπταβιδίνθσ του ςυμπλζγματοσ και τθσ βιοτίνθσ επιτρζπει ςτο ςφμπλεγμα να ςυνδεκεί με το προϊόν πολλαπλαςιαςμοφ. Μζςω τθσ δράςθσ τθσ υπεροξειδάςθσ ςτο TMB, ζνα αδιάλυτο ίηθμα ςχθματίηεται ςτισ περιοχζσ υβριδιςμοφ. Η ευαιςκθςία που αρφεται από τον ςυνδυαςμό του πολλαπλαςιαςμοφ του γενϊματοσ και αυτισ τθσ μεκόδου ςχθματιςμοφ εικόνασ ςτον ςωλινα ΑΤ είναι τόςο υψθλι ϊςτε δεν χρειάηονται πολλαπλαςιαςμοί φωλιάσ (nested PCR). Μπορεί λοιπόν κανείσ να αποφφγει πλζον τθν επιμόλυνςθ που ςχετίηεται με τζτοιεσ διαδικαςίεσ. Ζνα από τα μειονεκτιματα του πολλαπλαςιαςμοφ του γενϊματοσ είναι θ εμφάνιςθ ψευδϊσ αρνθτικϊν αποτελεςμάτων. Αυτι μπορεί να προκλθκεί από δείγματα DNA κακισ ποιότθτασ (φτωχά ςε DNA, με αποικοδομθμζνο DNA, ι απϊλεια DNA κατά τθν απομόνωςθ) και από τθν παρουςία

38 αναςτολζων τθσ πολυμεράςθσ DNA (π.χ. αιμοςφαιρίνθ, υπολείμματα παραφίνθσ, άλατα κτλ.) ςτα δείγματα προσ ανάλυςθ. Ραρόλα αυτά, το CLINICAL ARRAYS ΗPV kit ελαχιςτοποιεί τα ψευδϊσ αρνθτικά αποτελζςματα με τθ χριςθ δειγμάτων εςωτερικοφ ελζγχου ςτον ίδιο τον ςωλινα ςτον οποίο αναλφεται το δείγμα. Ο πρϊτοσ ζλεγχοσ που περιλαμβάνει τον πολλαπλαςιαςμό του DNA του ιδίου του αςκενι, πρόκειται για ζλεγχο DNA του δείγματοσ. Αυτό είναι δυνατό διότι όλα τα reaction tubes ςτο κιτ περιζχουν ζνα ηεφγοσ εκκινθτικϊν μορίων (primers) τα οποία πολλαπλαςιάηουν μια αλλθλουχία 892bp του ανκρϊπινου γονιδίου CFTR. Ο δεφτεροσ ζλεγχοσ πρόκειται για ζλεγχο τθσ αντίδραςθσ του πολλαπλαςιαςμοφ και περιλαμβάνει τθν χριςθ τροποποιθμζνου πλαςμιδίου. Αυτό πολλαπλαςιάηεται από τα ίδια εκκινθτικά μόρια που χρθςιμοποιοφνται για τον πολλαπλαςιαςμό τθσ αλλθλουχίασ του γονιδίου CFTR. Πμωσ το μζγεκοσ του προιόντοσ διαφζρει (1202bp). Αυτά τα δφο δείγματα εςωτερικοφ ελζγχου πολλαπλαςιάηονται ταυτόχρονα με το οποιοδιποτε HPV DNA. Τλικά-Αντιδραςτιρια Το CLINICAL ARRAYS Human Papillomavirus kit περιζχει επαρκι αντιδραςτιρια για τθν απομόνωςθ και ανάλυςθ του DNA από 24 ι 48 κλινικά δείγματα. Αυτά τα αντιδραςτιρια προςφζρονται ςε δυο διαφορετικά κουτιά ανάλογα με τθν κερμοκραςία ςτθν οποία πρζπει να φυλαχτοφν. Αντιδραςτιρια απομόνωςθσ, κακαριςμοφ και πολλαπλαςιαςμοφ Το CLINICAL ARRAYS HPV Extraction and Purification kit (Κιτ Απομόνωςθσ και Κακαριςμοφ) παραδίδεται ςτουσ 4 C ι ςε περιβάλλουςα κερμοκραςία. Αφοφ διαλυτοποιθκεί το αντιδραςτιριο πρωτεϊνάςθ Κ πρζπει να φυλαχτεί ςτουσ 4 C. Συνιςτϊντα μζρθ: - Στιλεσ κακαριςμοφ που προςαρμόηονται ςε ςωλινεσ των 2 ml - Σωλινεσ ςυλλογισ 2 ml - υκμιςτικό διάλυμα Τ1 - υκμιςτικό διάλυμα Β1

39 υκμιςτικό διάλυμα Β2 - υκμιςτικό διάλυμα Β5 - υκμιςτικό διάλυμα BW - υκμιςτικό διάλυμα ΒΕ - Ρρωτεϊνάςθ Κ, λυοφιλιοποιθμζνθ Αντιδραςτιρια πολλαπλαςιαςμοφ: Σωλινεσ πολλαπλαςιαςμοφ. Είναι ζτοιμα προσ χριςθ. Οι ςωλινεσ του 0,5ml περιζχουν 45μΙ μίγματοσ αντιδραςτθρίων που καλφπτεται από 30 μl ορυκτζλαιου. Οι ςωλινεσ του 0,2 ml περιζχουν τθν ίδια ποςότθτα μίγματοσ αντιδραςτθρίων αλλά δεν καλφπτoνται από ορυκτζλαιο. Οι ςωλινεσ πρζπει να φυλάςςονται ςτουσ 20 C. Αντιδραςτιρια ανίχνευςθσ: 1.Array tubes (περιζχουν τουσ ςυγκεκριμζνουσ ανιχνευτζσ). Διατθροφνται ςε κερμοκραςία δωματίου, προςτατευμζνα από το φωσ. 2. SH (Διάλυμα υβριδιςμοφ). Φφλαξθ ςτουσ 4 C. 3. RE (Διάλυμα ςχθματιςμοφ εικόνασ). Φφλαξθ ςε κερμοκραςία δωματίου. 4. DC (Διαλφτθσ ςυμπλζγματοσ). Φφλαξθ ςτουσ 4 C. 5. CJ (Σφμπλεγμα). Φφλαξθ ςτουσ 4 C. Σφντομθ φυγοκζντρθςθ πριν τθ χριςθ. 6. TL (ρυκμιςτικό διάλυμα ζκπλυςθσ 5Χ). Φφλαξθ ςτουσ 4 C. Απομόνωςθ DNA του HPV Αναδεφουμε το τραχθλικό δείγμα και μεταφζρουμε 1ml ςε αποςτειρωμζνο ςωλινα μικροφυγοκζντρθςθσ. Φυγοκεντροφμε τα δείγματα για 10 min ςτα rpm και απομακρφνουμε το υπερκείμενο με μια μικροπιπζττα προςεκτικά. Διαλφουμε το ίηθμα ςε 1ml αποςτειρωμζνο νερό. Φυγοκεντροφμε τα δείγματα για 10 min ςτα rpm και απομακρφνουμε το υπερκείμενο προςεκτικά. Διαλφουμε το ίηθμα ςε 180μl διαλφματοσ Τ1.

40 - 39-1,5ml. Μεταφζρουμε το εναιϊρθμα ςε αποςτειρωμζνο ςωλινα φυγοκζντρθςθσ των Ρροςκζτουμε 25μl διαλφματοσ πρωτεϊναςθσ Κ. Ανάδευςθ με vortex. Επωάηουμε ςτουσ 56 C (1-3 ϊρεσ) ςε υδατόλουτρο ι thermoblock (υπό ανάδευςθ) μζχρι να γίνει λφςθ του δείγματοσ. Για επιτάχυνςθ τθσ λφςθσ αναδεφoυμε τα δείγματα με vortex για τουλάχιςτον 15 λεπτά. 180 μl T μl πρωηεϊνάζη K 1-3 h, 56 C Μετά τθ λφςθ, προςκζτουμε 200μl διαλφματοσ Β3 ςε κάκε δείγμα. Αναδεφουμε με vortex και επωάηουμε ςτουσ 70 C για 10 λεπτά. Ρροςκζτουμε 210μl αικανόλθσ 96% ςε κάκε δείγμα και αμζςωσ αναδεφουμε με vortex Ετοιμάηουμε μια ςτιλθ κακαριςμοφ γ ι α κ ά κ ε δ ε ί γ μ α κ α ι τθν τοποκετοφμε ςε ζνα ςωλινα μικροφυγοκζντρθςθσ των 2ml. Ρροςκζτουμε το δείγμα και φυγοκεντροφμε για 1 λεπτό ςτα rpm. Αν το υγρό δεν ζχει περάςει εντελϊσ τθ μεμβράνθ, επαναλαμβάνουμε το ςτάδιο φυγοκζντρθςθσ. Απορρίπτουμε το διικθμα. Προζθήκη 200 μl B3 70 C, 10 min. Προζθήκη δείγμαηος 1 min, 12,000 rpm Ρροςκζτουμε 500μl διαλφματοσ BW ςτθ ςτιλθ. Φυγοκεντροφμε ςτα 12000rpm για 1 λεπτό. Απορρίπτουμε το διικθμα. Ρροςκζτουμε 600μl διθκιματοσ B5 ςτθ ςτιλθ. Φυγοκεντροφμε ςτα 12000rpm για 1 λεπτό. Απορρίπτουμε το διικθμα. Προζθήκη 600 μl B5 1 min, 12,000 rpm.φυγοκεντροφμε ςτα rpm για 1 λεπτό για να ελαχιςτοποιιςουμε τυχόν υπολείμματα αικανόλθσ (μποροφν να 1 min, 12,000 rpm

41 αναςτείλουν τισ απαιτοφμενεσ ενηυμικζσ αντιδράςεισ) από το διάλυμα Β5. Τοποκετοφμε τθ ςτιλθ ςε κακαρό ςωλινα μικροφυγοκζντρθςθσ του 1,5 ml. Εκχυλίηουμε το DNA με 100μl δ ι α λ φ μ α τ ο σ ΒΕ ( π ο υ προθγουμζνωσ ζχει κερμανκεί ςτουσ 70 C). Επωάηουμε αυτό το κερμό διάλυμα ςτθ ςτιλθ ςε κερμοκραςία δωματίου για 1 λεπτό και μετά φυγοκεντροφμε ςτα rpm για 1 λεπτό. Ανακτοφμε το διικθμα (περίπου 100μl ςτο ςωλινα μικροφυγοκζντρθςθσ). Χρθςιμοποιoφμε 5 μl για τθν αντίδραςθ πολλαπλαςιαςμοφ και διατθροφμε το υπόλοιπο ςτουσ -20 C. Αντίδραςθ πολλαπλαςιαςμοφ Προζθήκη 100 μι BE 1 min Ρραγματοποιοφμε διατθροφμε ςε πάγο. τιξθ ενόσ reaction tube για κάκε δείγμα και τα Φυγοκεντροφμε τουσ reaction tubes ςε μια μικροφυγόκεντρο ζτςι ϊςτε το υγρό να πάει ςτον πυκμζνα Ρροςκζτουμε 5μl απομονωμζνου DNA από κάκε δείγμα ςτουσ reaction tubes (διαπερνϊντασ το ςτρϊμα από ζλαιο εάν πρόκειται για τουσ ςωλινεσ του 0,5 ml) και αναδιαλφουμε αρκετζσ φορζσ με μια μικροπιπζττα. Αφινουμε τουσ ςωλινεσ ςτον πάγο. Ρρογραμματίηουμε τον κερμικό κυκλοποιθτι ωσ εξισ: 1 κφκλοσ 95 C 9 min 45 κφκλοι 94 C 1min 55 C 1min 72 C 1min 1 κφκλοσ 72 C 9 min 20 C (διατιρθςθ) μζχρι τθν παραλαβι του ςωλινα (προαιρετικό) Αρχίηουμε το πρόγραμμα και τοποκετοφμε τουσ reaction tubes ςτον κερμικό κυκλοποιθτι όταν το block ζχει κερμοκραςία άνω των 90 C. Αυτό

42 ελαχιςτοποιεί μθ ειδικζσ αντιδράςεισ πολλαπλαςιαςμοφ που οφείλονται ςτθν υβριδοποίθςθ που κα ςυνζβαινε κάτω τθσ κερμοκραςίασ αντίδραςθσ. Ανίχνευςθ πολλαπλαςιαςμζνου προϊόντοσ Αποδιάταξθ: Χρθςιμοποιoφμε τον κερμικό κυκλοποιθτι για τον πολλαπλαςιαςμό (PCR) των προϊόντων. Γι' αυτό τοποκετοφμε τουσ ςωλινεσ που περιζχουν τα προϊόντα ςε κερμικό κυκλοποιθτι και επωάηουμε ςτουσ 95 C για 10 λεπτά. Ρρογραμματίηουμε τον κερμικό κυκλοποιθτι ςτα 15 λεπτά ζτςι ϊςτε μετά τθν αποδιάταξθ τα προϊόντα να παραμείνουν ςε αυτι τθ κερμοκραςία. Ετοιμάηουμε το αραιωμζνο διάλυμα TL: Ρροςκζτοντασ 3ml διαλφματοσ TL ςε 27ml απεςταγμζνου νεροφ. Ζκπλυςθ του array tube: Ρροςκζτουμε 300 μl αραιωμζνου διαλφματοσ TL ςε κάκε array tube και αναποδογυρίηουμε 4 ι 5 φορζσ. Απομακρφνουμε το διάλυμα αυτό με μικροπιπζττα ι κενό. Υβριδοποίθςθ: Το διάλυμα SH πρζπει να ζλκει ςε κερμοκραςία δωματίου πριν από τθ χριςθ. Ρροςκζτουμε 100μl του διαλφματοσ SH ςε κάκε array tube (αποφεφγουμε τον ςχθματιςμό φυςαλίδων). Ζπειτα προςκζτουμε 5μl αποδιατεταγμζνων πολλαπλαςιαςμζνων προϊόντων ςε κάκε array tube και αναδιαςπείρουμε πολλζσ φορζσ για να εξαςφαλίςουμε μίξθ. Επωάηουμε ςτο thermomixer ςτουσ 55 C για 1 ϊρα υπό ανάδευςθ ςτα 550 rpm. Μετά από αυτι τθ χρονικι περίοδο απομακρφνουμε τουσ ςωλινεσ και απορρίπτουμε το διάλυμα SH με μια μικροπιπζττα ι χρθςιμοποιϊντασ κενό. Ζκπλυςθ: Ρροςκζτουμε 300μl αραιωμζνου διαλφματοσ TL ςε κάκε array tube και αναςτρζφουμε 5-10 φορζσ. Απορρίπτουμε αυτό το διάλυμα με τθ χριςθ

43 μικροπιπζττασ ι ςυςτιματοσ κενοφ. Εάν το thermomixer δεν ζχει φτάςει τουσ 30 C ςε αυτό το ςτάδιο, το διάλυμα TL πρζπει να παραμείνει ςτο ΑΤ μζχρι να φτάςει αυτι τθ κερμοκραςία. Ρροςκικθ ςυμπλζγματοσ: Ετοιμάηουμε αραιωμζνο διάλυμα CJ. (για κάκε δείγμα προςκζτουμε 100 μl διαλφματοσ DC ςε ζναν ςωλινα και κατόπιν 0,75 μl του διαλφματοσ CJ). Το αραιωμζνο διάλυμα CJ κα παραμείνει ςτακερό για 4 ϊρεσ εάν διατθρθκεί ςτουσ 4 C. Σε κάκε array tube προςκζτουμε 100 μl του αραιωμζνου CJ. Επωάηουμε ςτουσ 30 C για 15 λεπτά ακριβϊσ υπό ανάδευςθ ςτα 550 rpm. Απομακρφνουμε όλο το υγρό από το array tube με τθ χριςθ μικροπιπζττασ ι ςυςτιματοσ κενοφ γριγορα. Στθ ςυνζχεια θ κερμοκραςία του thermomixer ρυκμίηεται ςτουσ 25 C λόγω του ότι κα χρθςιμοποιθκεί ςε επόμενο ςτάδιο. Ρροςκζτουμε 300μl αραιωμζνου διαλφματοσ TL ςε κάκε array tube και αναςτρζφουμε 5-10 φορζσ. Απομακρφνουμε αυτό το διάλυμα με μικροπιπζττα ι ςφςτθμα κενοφ. Εάν θ ζκπλυςθ δεν εκτελεςτεί γριγορα μπορεί να προκλθκεί μθ αναγνϊςιμο ςιμα. Ζκπλυςθ: Ρροςκζτουμε 300μl αραιωμζνου διαλφματοσ TL ςε κάκε array tube και αναςτρζφουμε 5-10 φορζσ. Απομακρφνουμε το CJ διάλυμα. Εάν παραμείνει μζςα κα αντιδράςει με το διάλυμα RE και κα δϊςει μθ ειδικό ςιμα. Εμφάνιςθ εικόνασ με τθ χριςθ του διαλφματοσ RE: Απομακρφνουμε το διάλυμα TL, προςκζτουμε 100μl διαλφματοσ RE ςε κάκε array tube και επωάηουμε για 10 λεπτά ςτουσ 25 C χωρίσ ανάδευςθ ςτο thermomixer. Ανάγνωςθ αποτελεςμάτων (ςτο array tube reader που καταςκευάηεται από τθν CLONDIAG Chip Technologies GmbH για αποκλειςτικι χριςθ τθσ Genomica). Η επεξεργαςία των ςτοιχείων που λαμβάνονται ςε κάκε ανάλυςθ είναι εντελϊσ αυτοματοποιθμζνθ. Ο εξοπλιςμόσ ανάγνωςθσ/ανάλυςθσ (χριςθ ειδικοφ λογιςμικοφ CLINICAL ARRAYS Human Papillomavirus Software) δίνει τθν ζκκεςθ

44 των αποτελεςμάτων. Στθν οκόνθ εμφανίηεται ζνασ πίνακασ με τρεισ ςτιλεσ. Η αριςτερι ςτιλθ δείχνει τουσ γενότυπουσ HPV που μποροφν να ανιχνευτοφν, θ μεςαία δίνει είτε κετικό είτε αρνθτικό αποτζλεςμα, και θ δεξιά δείχνει εάν τα δείγματα ελζγχου του πολλαπλαςιαςμοφ του DNA ζχουν εγκρικεί (Ρίνακασ 4). Θετικά δείγματα Ιόσ Αποτζλεςμα Ζλεγχοσ Τφποσ Θετικό Εγκρίκθκε Ακατάλλθλα δείγματα Ιόσ Αποτζλεςμα Ζλεγχοσ Τφποσ Αρνθτικό Μθ φπαρξθ DNA Δείγματα με αναςτολι πολλαπλαςιαςμοφ Ιόσ Αποτζλεςμα Ζλεγχοσ Τφποσ Αρνθτικό PCR αναςτάλκθκε Ρίνακασ 4 : Ζκκεςθ αποτελεςμάτων με τθ χριςθ του λογιςμικοφ CLINICAL ARRAYS Human Papillomavirus Software. HPV OncoTect Test Kit - Clinical Protocol τησ Invirion Γενικά χαρακτηριςτικά, διαφοροποίηςη και πλεονεκτήματα Ρλεονεκτιματα τθσ νζασ αυτισ μεκόδου για τθ διάγνωςθ του HPV μζςω τθσ ανίχνευςθσ των Ε6 και Ε7 mrnas είναι θ μεγάλθ ευαιςκθςία και θ εξαιρετικι ακρίβεια. Πςον αφορά τθν ευαιςκθςία, είναι δυνατόν να ανιχνευτεί mrna του HPV που βρίςκεται ςε 5-10 αντίγραφα ανά κφτταρο. Η ειδικότθτα ζγκειται ςτο ότι τα γονίδια Ε6 και Ε7 εκφράηονται ςε καρκινικζσ κυτταρικζσ ςειρζσ του τραχιλου τθσ μιτρασ, ςε κφτταρα μεταμορφωμζνα από τον HPV και ςε καρκινϊματα και προκαρκινικζσ καταςτάςεισ που ςχετίηονται με τον κθλωματοϊό. Επιπρόςκετα, ο ςυνολικόσ απαιτοφμενοσ χρόνοσ για τθν ολοκλιρωςθ τθσ εφαρμογισ είναι λιγότερο από τρεισ ϊρεσ, χρονικό διάςτθμα πολφ μικρό ςυγκρινόμενο με το αντίςτοιχο τθσ PCR και του HC2. Τζλοσ, τα κατάλλθλα επεξεργαςμζνα δείγματα μποροφν να χρθςιμοποιθκοφν ςε οποιονδιποτε κυτταρομετρθτι ροισ. Ρζντε είναι τα βαςικά βιματα του HPV OncoTect και είναι τα παρακάτω: 1. Ρροετοιμαςία των κυττάρων 2. Μονιμοποίθςθ και διαπερατότθτα των κυττάρων 3. Υβριδιςμόσ

45 Ζκπλυςθ 5. Κυτταρομετρικι ανάλυςθ Φςτερα από τθν κυτταρικι προετοιμαςία που μπορεί να περιλαμβάνει τθ ςιμανςθ των επιφανειακϊν αντιγόνων, τα κφτταρα μονιμοποιοφνται και γίνονται τα τοιχϊματα τουσ διαπερατά χωρίσ να καταςτρζφεται θ δομι τουσ. Ακολουκεί ο υβριδιςμόσ με ζνα κοκτζιλ 5, 3 ολιγονουκλεοτιδικϊν ανιχνευτϊν ειδικϊν για τα E6- και E7 mrnas του HPV, και τθν ζκπλυςθ για τθν απομάκρυνςθ εκείνων των ανιχνευτϊν που δεν προςδζκθκαν πουκενά. Ζπειτα, το δείγμα είναι ζτοιμο για κυτταρομετρικι ανάλυςθ. Ρίνακασ 5. Αντιδραςτιρια που περιλαμβάνει το kit Αντιδραςτιριο 1 Διάλυμα Μονιμοποίθςθσ (προςκικθ 15ml αποςτειρωμζνου νεροφ (sterile water) Αντιδραςτιριο 2 Ρυκμιςτικό Διάλυμα προ-τβριδιςμοφ 1 Αντιδραςτιριο 3 Ρυκμιςτικό Διάλυμα προ-τβριδιςμοφ 2 Αντιδραςτιριο 4 Αντιδραςτιριο 5 Ρυκμιςτικό Διάλυμα Τβριδιςμοφ (προςκικθ 3ml φορμαμίδιο) Κοκτζιλ HPV ανιχνευτι Αντιδραςτιριο 6 Διάλυμα Ζκπλυςθσ 1 Αντιδραςτιριο 7 Διάλυμα Ζκπλυςθσ 2 Μονιμοποίθςθ i. Μεταφορά 1x10 6 κφτταρα (προτεινόμενθ ςυγκζντρωςθ δείγματοσ 1x10 6 κφτταρα/ml) από κολποτραχθλικό δείγμα υγρισ φάςθσ ςε δοκιμαςτικό ςωλθνάκι των 15ml και φυγοκζντρθςθ ςτα 1000g για 5 λεπτά, ςε κερμοκραςία δωματίου. ii. Ζκπλυςθ των κυττάρων με 1ml 1xPBS, ρη7,4 και φυγοκζντρθςθ ςτα 1000~2800g για 5 λεπτά, ςε κερμοκραςία δωματίου. iii. Ήπια ανάδευςθ των κυττάρων του ιηιματοσ μζςα ςτο κατάλοιπο του υπερκείμενου. Επαναιϊρθςθ των κυττάρων ςε 80μl PBS, ρη 7,4 και προςκικθ από 10μL του CD16-PE/Cy5 και του CAM 5.2-Ε. Επϊαςθ ςτουσ 4 C για 20 λεπτά. Εναλλακτικά, θ επιλογι των κυττάρων μπορεί να γίνει με τθ

46 βοικεια του πρόςκιου και πλάγιου ςκεδαςμοφ χωρίσ τθ χριςθ των μονοκλωνικϊν αντιςωμάτων. iv. Ζκπλυςθ των κυττάρων με 1ml 1xPBS, ρη 7,4 και φυγοκζντρθςθ ςτα 1000g για 5 λεπτά, ςε κερμοκραςία δωματίου. v. Ρροςκικθ 300μl από το Αντιδραςτιριο 1 ςε κάκε δοκιμαςτικό ςωλθνάκι και ιπια ανάδευςθ ϊςτε να μθν καταςτραφοφν τα κφτταρα. Για να γίνουν οπζσ ςτθν κυτταρικι μεμβράνθ ακολουκεί επϊαςθ ςε κερμοκραςία δωματίου για 1 ϊρα. Υβριδιςμόσ (Η προετοιμαςία απαιτεί τθν τοποκζτθςθ των Αντιδραςτθρίων 6 και 7 ςε υδατόλουτρο ςτουσ 43 C) i. Ζκπλυςθ των κυττάρων ςε 1 ml Αντιδραςτιριο 2, ιπια ανάδευςθ των κυττάρων και φυγοκζντρθςθ ςτα 1000 g για 5 λεπτά, ςε κερμοκραςία δωματίου. ii. Ήπια ανάδευςθ των κυττάρων του ιηιματοσ μζςα ςτο κατάλοιπο του υπερκείμενου. iii. Ρροςκικθ 1ml Αντιδραςτθρίου 3, απαλι ανάδευςθ των κυττάρων και φυγοκζντρθςθ ςτα 1000g για 5 λεπτά, ςε κερμοκραςία δωματίου. Απομάκρυνςθ υπερκειμζνου. iv. Ήπια ανάδευςθ των κυττάρων του ιηιματοσ μζςα ςτο κατάλοιπο του υπερκείμενου. v. Ρροετοιμαςία του κοκτζιλ υβριδιςμοφ με ανάμιξθ 100μl από το Αντιδραςτιριο 4 με 3μl από το Αντιδραςτιριο 5 (5ϋ-,3ϋφκοριοςθμαςμζνοι ανιχνευτζσ ειδικοί γα τα Ε6 και Ε7-mRNAs του HPV) για κάκε δείγμα που βρίςκεται ςε δοκιμαςτικό ςωλθνάκι των 15 ml. Ρροςκικθ 103μl του μείγματοσ ςε κάκε δοκιμαςτικό ςωλθνάκι. vi. Επϊαςθ ςτουσ 43 C μζςα ςτο υδατόλουτρο για λεπτά. Έκπλυςθ κυττάρων i. Ρροςκικθ 1ml του προκερμαςμζνου (43 C) αντιδραςτθρίου 6 ςε κάκε δοκιμαςτικό ςωλθνάκι και ιπια ανάδευςθ των κυττάρων,

47 ii. Φυγοκζντρθςθ ςτα 1000g για 5 λεπτά, ςε κερμοκραςία δωματίου. Ήπια ανάδευςθ των κυττάρων του ιηιματοσ μζςα ςτο κατάλοιπο του υπερκείμενου, iii. Ρροςκικθ 1 ml του Αντιδραςτθρίου 7 ςε κάκε δοκιμαςτικό ςωλθνάκι και ιπια ανάδευςθ των κυττάρων. ϊν. Επϊαςθ ςτουσ 43 C μζςα ςτο υδατόλουτρο για 15 λεπτά, ν. Φυγοκζντρθςθ ςτα 1000g για 5 λεπτά, ςε κερμοκραςία δωματίου. Ήπια ανάδευςθ των κυττάρων του ιηιματοσ μζςα ςτο κατάλοιπο του υπερκείμενου, νϊ. Επαναιϊρθςθ των κυττάρων ςε 400μλ 1xPBS, ρη7,4 που περιζχει 2% εμβρυϊκό ορό βοδιοφ (FCS) νίΐ. Τα κφτταρα είναι ζτοιμα για κυτταρομετρικι ανάλυςθ ι για επίςτρωςθ ςε πλακάκια και μικροςκοπικι εκτίμθςθ. Στθν παροφςα εργαςία για τθν κυτταρομετρικι ανάλυςθ ο διαχωριςμόσ των κυτταρικϊν τφπων (ενδοτραχθλικά κφτταρα, εξωτραχθλικά κφτταρα, πολυμορφοπφρθνα ουδετερόφιλα) ζγινε με τθ βοικεια του πρόςκιου και του πλάγιου ςκεδαςμοφ και ανάλογθ χάραξθ τθσ επικυμθτισ περιοχισ (gating). Ζτςι, ανάλογα με το μζγεκοσ και τθν κοκκίωςθ των κυττάρων γίνεται θ διάκριςθ των εξωτραχθλικϊν κυττάρων τα οποία είναι τα επικυμθτά υπό μελζτθ κφτταρα για τθν ζκφραςθ των Ε6 και Ε7 mrnas, εφόςον αποτελοφν το υπόςτρωμα του HPV. (Εικόνα 12). Μια εναλλακτικι ςτρατθγικι gating που κα μποροφςε να χρθςιμοποιθκεί είναι θ χριςθ των μονοκλωνικϊν αντιςωμάτων CD16 και CAM 5.2 κακϊσ CD16+ είναι μόνο τα πολυμορφοπφρθνα, CD16- και CAM5.2+ είναι τα ενδοτραχθλικά κφτταρα και τζλοσ CD16- και CAM5.2- είναι τα εξωτραχθλικά κφτταρα (HPV oncotect test kit, 2006). Debris R11 R1 PMNs R2 Endocervical cells R8 Ectocervical cells N u m b e r Probe 1- FITC -->

48 Εικόνα 12: Τα κφτταρα από το κολποτραχθλικό επίχριςμα απαρτίηονται από 4 πλθκυςμοφσ (ΜΝ:πολυμορφοπφρθνα endocervical: ενδοτραχθλικά ectocervical: εξωτραχθλικά debris: κυτταρικά ςκουπίδια). Στο πρϊτο διάγραμμα FS-SS φαίνεται ο διαχωριςμόσ των κυτταρικϊν πλθκυςμϊν και το gating ςτα εξωτραχθλικά κφτταρα. Στο δεφτερο ιςτόγραμμα παρουςιάηεται ο βακμόσ ανίχνευςθσ των Ε6 και Ε7 mrnas ςτα εξωτραχθλικά μόνο κφτταρα ( HPV oncotect test kit, 2006). To CAM5.2 αλλθλεπιδρά με τισ ανκρϊπινεσ πρωτεΐνεσ τθσ κερατίνθσ με χαμθλό μοριακό βάροσ 48 και 52kDa, ςυμπεριλαμβανομζνων και εκείνων που εκφράηονται ςτα εκκριτικά επικιλια εκτόσ από αυτζσ ςτα βλεννϊδθ επικιλια όπωσ αυτό του εξωτραχιλου (Grundhoefer et al, 2001). To CD16 είναι το μονοκλωνικό αντίςωμα που προςδζνεται μόνο ςτα πολυμορφοπφρθνα και ζτςι τα διαχωρίηει. Στατιςτικι ανάλυςθ Η ςτατιςτικι ανάλυςθ παρουςιάςτθκε με τθ χριςθ του πογράμματοσ SPSS (CROSSTABS, Ζκδοςθ 12). Η ςυςχζτιςθ μεταξφ HPV DNA, mrna και κυτταρολογικϊν μεταβλθτϊν μελετικθκε με χ 2 ςτατιςτικι. Μία ςφγκριςθ τθσ επικράτθςθσ του HPV E6/E7 mrna και του HPV DNA παρουςιάςτθκε με Pearson Chi-Square t-test. Oι κυτταρολογικοί και οι HPV παράμετροι ομαδοποιικθκαν με βάςθ τθν παρουςία ι τθν απουςία τουσ. P values <0.05 κεωρικθκαν ςτατιςτικά ςθμαντικζσ.

49 Αποτελζςματα φγκριςθ τθσ ανίχνευςθσ των Ε6 και Ε7-mRNAs με τθν κυτταρολογικι διάγνωςθ για τον εντοπιςμό ενδοεπικθλιακϊν αλλοιϊςεων (SIL) Για να προςδιοριςτεί θ ικανότθτα τθσ κυτταρομετρίασ ροισ να διακρίνει προκαρκινικζσ καταςτάςεισ ςε κολποτραχθλικά επιχρίςματα υγρισ φάςθσ εξετάςτθκαν 198 περιπτϊςεισ γυναικϊν θλικίασ ετϊν. Από αυτζσ τισ περιπτϊςεισ, οι 57 ιταν ASCus, οι 41 είχαν διάγνωςθ χαμθλοφ βακμοφ SIL (LSIL) και οι 13 διαγνϊςτθκαν ωσ υψθλοφ βακμοφ SIL (ΗSIL). Το ποςοτικό cutoff για ζνα κετικό κυτταρομετρικό αποτζλεςμα (υπερζκφραςθ Ε6 και Ε7 mrnas) προςδιορίςτθκε ςτο 1,5% από το μζςο όρο του ποςοςτοφ των κυττάρων που εκφράηουν Ε6 και Ε7 mrnas ςε αρνθτικά κυτταρολογικά δείγματα χωρίσ ιςτορικό HPV λοίμωξθσ (true negative). Η διάκριςθ των εξωτραχθλικϊν κυττάρων (ςτα οποία εντοπίηονται οι μεταμορφϊςεισ των κυττάρων που οφείλονται ςτον HPV και οδθγοφν ςε αζναεσ μορφολογικζσ μεταλλάξεισ) από τουσ άλλουσ κυτταρικοφσ πλθκυςμοφσ και το gating ζγινε με βάςθ τον πρόςκιο (FS) και τον πλάγιο ςκεδαςμό (SS) (Εικόνα 13). Εικόνα 13: Στο ςτικτόγραμμα FS-SS γίνεται gating ςτα εξωτραχθλικά κφτταρα με βάςθ τον πρόςκιο (FS) και πλάγιο (SS) ςκεδαςμό. Στο ιςτόγραμμα παρουςιάηεται ο βακμόσ ανίχνευςθσ των E6 και Ε7-mRNAs ςτα εξωτραχθλικά κφτταρα. Η μζκοδοσ HPV mrna Flow FISH ανίχνευςε υπερζκφραςθ των Ε6 και Ε7 mrnas ςε 19 από 87 αρνθτικζσ κυτταρολογικά περιπτϊςεισ, ςε 39 από 57 ASCUs, ςε 32 από 41

50 LSIL και ςε 12 από 13 HSIL (Ρίνακασ 6). Η εικόνα 14 παρουςιάηει αντιπροςωπευτικά ιςτογράμματα κυτταρομετρίασ ροισ από γυναίκεσ με κυτταρολογικζσ διαγνϊςεισ ASCus, LSIL και φυςιολογικζσ περιπτϊςεισ. Διαπιςτϊκθκε ότι το ποςοςτό των κυττάρων που εκφράηουν Ε6 και Ε7 mrnas ςε περιπτϊςεισ ASCUs, LSIL και HSIL ιταν ςθμαντικά μεγαλφτερο ςε ςχζςθ με το ποςοςτό κετικότθτασ ςτθν παρουςία των HPV E6 και Ε7 mrnas ςε αρνθτικζσ κυτταρολογικά περιπτϊςεισ (WNL) (Εικόνα 14). φγκριςθ τθσ ανίχνευςθσ ζκφραςθσ των ενδοκυττάριων Ε6 και Ε7 mrnas με τθ δοκιμαςία υβριδιςμοφ 2 θσ γενεάσ (HC2). Ο πίνακασ 6 απεικονίηει τθν ευαιςκθςία, τθν ειδικότθτα, τθ κετικι και τθν αρνθτικι προγνωςτικι αξία τόςο τθσ ανίχνευςθσ τθσ ζκφραςθσ των ενδοκυττάριων Ε6 και Ε7 mrnas με κυτταρομετρία ροισ όςο και τθσ ανίχνευςθσ του ιικοφ φορτίου με τθ δοκιμαςία HC2 ςε γυναίκεσ θλικίασ ετϊν. Σε αυτό τον πίνακα ζχουν λθφκεί υπόψθ μόνο τα αποτελζςματα τθσ κυτταρολογίασ, τθσ δοκιμαςίασ HC2 και τθσ κυτταρομετρίασ ροισ από τθν πρϊτθ εξζταςθ για τθν εκτίμθςθ αυτϊν των τεχνικϊν, κακϊσ μερικζσ γυναίκεσ βρίςκονται κυτταρολογικά υπό ςτενι παρακολοφκθςθ (follow-up). Η δοκιμαςία HC2 ιταν κετικι ςε 2 επιπλζον αρνθτικζσ κυτταρολογικά περιπτϊςεισ (21/87) ςυγκριτικά με τθν κυτταρομετρία ροισ. Το ιικο φορτίο του HPV (ςτελεχϊν χαμθλοφ/υψθλοφ κινδφνου) ανιχνεφτθκε ςε επίπεδο DNA με τθν HC2 ςτο 49,1% των περιπτϊςεων ΑSCUs, ςτο 68,3% των περιπτϊςεων LSIL και ςτο 76,9% των HSIL περιπτϊςεων (Ρίνακασ 6). Η μζκοδοσ HPV mrna flow FISH παρουςίαςε μεγαλφτερθ ευαιςκθςία ςε περιπτϊςεισ ASCUS (68,4%) και LSIL (78%) ςυγκριτικά με τθ δοκιμαςία HC2 ενϊ ανίχνευςε 2 επιπλζον περιπτϊςειs HSIL (12/13) ςε ςχζςθ με τθν HC2 εκτινάςςοντασ ζτςι τθν ευαιςκθςία τθσ ωσ προσ τθν ανίχνευςθ HSIL κυτταρολογικϊν ευρθμάτων ςτο 92,3%. Η ειδικότθτα και των δφο μεκόδων παρζμεινε ςχετικά χαμθλι και κυμάνκθκε ςτα ίδια επίπεδα (78,1% HPV mrna flow FISH vs 75,8% HC2) λόγω των ψευδϊσ κετικϊν αποτελεςμάτων τθσ κάκε δοκιμαςίασ ςε ςχζςθ πάντα με τα αρνθτικά αποτελζςματα τθσ κυτταρολογίασ υγρισ φάςθσ ωσ gold standard μεκόδου. Η κετικι

51 διαγνωςτικι αξία (positive predictive value, p.p.v) τθσ HPV mrna Flow FISH ιταν μεγαλφτερθ ςτισ περιπτϊςεισ ASCUS, LSIL και HSIL ςυγκριτικά με τθν κετικι προγνωςτικι αξία τθσ δοκιμαςίασ HC2 (Ρίνακασ 6). Ωςτόςο, οι κετικζσ διαγνωςτικζσ αξίεσ,και ςτισ δφο μεκόδουσ, ιταν ςχετικά χαμθλζσ ςτισ περιπτϊςεισ ΑSCUS, LSIL και ειδικά ςτισ HSIL κυτταρολογικζσ διαγνϊςεισ, θ κετικι προγνωςτικι αξία τθσ HPV mrna Flow FISΗ ιταν μόνο τθσ τάξθσ του 39% και θ αντίςτοιχθ τθσ HC2 του 32% λόγω του μικροφ επιπολαςμοφ των κυτταρολογικά διαγνωςμζνων ωσ HSIL περιπτϊςεων.

52 ASCUS LSIL LSIL ASCUS 28.7% 0.7% Εικόνα 14: Αντιπροςωπευτικά ιςτογράμματα κυτταρομετρίασ από γυναίκεσ με κυτταρολογικζσ διαγνϊςεισ ASCUs, LSIL (πάνω και μεςαία ςειρά) και WNL (μζςα ςτα φυςιολογικά όρια) (κάτω). Στα ιςτογράμματα παρουςιάηεται το ποςοςτό κετικότθτασ τραχθλικϊν επιχριςμάτων ςτθν παρουςία των HPV Ε6 και Ε7 mrnas.

53 Θετικά Κυτταρολογικι Διάγνωςθ ΗPV mrna Flow FISH Θετικά Ευαιςκθςία (%) ΗPV mrna Flow FISH Θετικι Διαγνωςτικι Αξία (p.p.v. %) ΗPV mrna Flow FISH Aρνθτικι Διαγνωςτικι Αξία (n.p.v. %) ΗPV mrna Flow FISH Yβριδιςμόσ HC2 Yβριδιςμόσ Yβριδιςμόσ Yβριδιςμόσ Αρνθτικά HC2 HC2 HC2 ASCUS ,4 49,1 67,2 57,1 78,2 69,4 LSIL ,3 62,7 57,1 88,3 83,5 HSIL ,3 76, ,5 95,6 φνολο Ειδικότθτα (%) 78,1 75,8 Ρίνακασ 6. Ευαιςκθςία, ειδικότθτα, κετικι και αρνθτικι προγνωςτικι αξία τθσ ανίχνευςθσ τθσ ζκφραςθσ των ενδοκυττάριων Ε6 και Ε7 mrnas με κυτταρομετρία ροισ και τθσ ανίχνευςθσ του ιικοφ φορτίου με τθ δοκιμαςία HC2. Η αρνθτικι διαγνωςτικι αξία (negative predictive value, n.p.v) τθσ HPV mrna Flow FISH ιταν μεγαλφτερθ ςε ΑSCUS περιπτϊςεισ ςυγκριτικά με τθν αρνθτικι προγνωςτικι αξία τθσ HC2. Σε περιπτϊςεισ LSIL και HSIL, οι αρνθτικζσ διαγνωςτικζσ αξίεσ ιταν υψθλζσ και κυμάνκθκαν ςτα ίδια επίπεδα και με τισ δφο μεκόδουσ (Ρίνακασ 6). Ειδικότερα, ςτισ περιπτϊςεισ HSIL το αρνθτικό HPV DNA τεςτ παρουςίαςε πολφ υψθλι αρνθτικι προγνωςτικι αξία, τθσ τάξθσ του 95,6% (δθλαδι θ πικανότθτα μιασ γυναίκασ να εμφανίςει HSIL αλλοίωςθ που πικανά κα εξελιχκεί ςε καρκίνο είναι πράγματι πολφ χαμθλι) και θ αρνθτικι προγνωςτικι αξία τθσ HPV mrna Flow FISH άγγιξε το 98,5% Aρνηηικά ASCUS LSIL HSIL HPV mrna Flow FISH HC2 Εικόνα 15. Ο αρικμόσ των κετικϊν περιπτϊςεων που ανιχνεφτθκαν με τθ δοκιμαςία HC2 και τθν HPV mrna Flow FISH για κάκε κυτταρολογικι διάγνωςθ. Ρζραν των 198 περιπτϊςεων που διαγνϊςτθκαν από αρνθτικζσ μζχρι τα αρχικά ςτάδια τθσ HSIL νόςου, παρουςιάςτθκαν άλλεσ 4 περιπτϊςεισ διαγνωςμζνεσ

54 ωσ τελικοφ ςταδίου διθκθτικό πλακϊδεσ καρκίνωμα τραχιλου (Ca τραχιλου). Από αυτζσ τισ περιπτϊςεισ, ςτισ 3 από τισ 4 ανιχνεφτθκε το DNA ςτελεχϊν υψθλοφ κινδφνου με τθ δοκιμαςία HC2, ενϊ ςε καμία περίπτωςθ δεν ανιχνεφτθκε κετικότθτα ςτθν παρουςία ενδοκυττάριων Ε6 και Ε7 mrnas με τθν HPV mrna Flow FISH. υςχζτιςθ τθσ ανίχνευςθσ υπερζκφραςθσ των ενδοκυττάριων Ε6 και Ε7 mrnas με τθν ανίχνευςθ ςτελεχϊν χαμθλοφ/υψθλοφ κινδφνου Επειδι θ μζκοδοσ HPV mrna Flow FISΗ δείχνει, με τθ μεταγραφι των Ε6 και Ε7 mrnas, τθν ενςωμάτωςθ του DNA του HPV ςτο γονιδίωμα του κυττάρου ξενιςτι που ςυχνά ςυνδζεται με κακοικεισ αλλοιϊςεισ υποκζςαμε ότι εξετάηοντασ τισ περιπτϊςεισ με κετικότθτα ςτθν παρουςία των ενδοκυττάριων Ε6, Ε7 mrnas ίςωσ διαπιςτωκεί μία ιςχυρι ςυςχζτιςι τουσ με τθν ανίχνευςθ υψθλοφ κινδφνου οροτφπων HPV που εμπλζκονται ςτθν ανάπτυξθ του τραχθλικοφ καρκίνου. Συνεπϊσ από τα 198 περιςτατικά που εξετάςτθκαν, απομονϊκθκαν 56 περιπτϊςεισ (28%) ςτισ οποίεσ ανιχνεφτθκε υπερζκφραςθ των Ε6 και Ε7 mrnas αλλά και κετικότθτα ςτθν ανίχνευςθ ιικοφ φορτίου ςτελεχϊν υψθλοφ ι/και χαμθλοφ κινδφνου. Οι ογκογόνοι HPV τφποι ανιχνεφτθκαν ςε 26 από τισ 56 αυτζσ περιπτϊςεισ (46,6%), ενϊ οι τφποι χαμθλοφ κινδφνου εντοπίςτθκαν ςε 9 περιπτϊςεισ (16,1%). Συνδυαςμόσ ογκογόνων και χαμθλοφ κινδφνου ςτελεχϊν ανιχνεφτθκε ςε 21 περιςτατικά (37,6%). Συνεπϊσ ςτισ 56 περιπτϊςεισ γυναικϊν με υπερζκφραςθ Ε6 και Ε7 mrnas αλλά και με ανίχνευςθ HPV DNA, οι 47 (83,9%) ςυνδζκθκαν με ογκογόνουσ HPV τφπουσ (Εικόνα 16). Εξετάηοντασ μόνο εκείνεσ τισ κετικζσ με HPV mrna Flow FISΗ περιπτϊςεισ που ςυνδζονται με ογκογόνουσ οροτφπουσ HPV παρατθρικθκε μια αφξθςθ ςτθ ςυχνότθτα ανίχνευςθσ ςτελεχϊν υψθλοφ κινδφνου κατά τθ μετάβαςθ από ASCUS ςε LSIL και κυρίωσ ςε HSIL περιπτϊςεισ. Από τισ 8 περιπτϊςεισ HSIL που βρζκθκαν κετικζσ τόςο με τθν HPV mrna Flow FISH όςο και με το HPV DNA test, όλεσ ςυνδζκθκαν με ογκογόνουσ HPV τφπουσ (Ρίνακασ 7). Το 85,7% των περιπτϊςεων LSIL (18/21) βρζκθκε κετικό ςτθν ανίχνευςθ ογκογόνων HPVs που εντοπίςτθκαν μόνοι τουσ ι ςε ςυνδυαςμό με χαμθλοφ κινδφνου

55 υχνότθτα (%) τφπουσ HPV, ενϊ το 14,3% (3/21) ιταν κετικό ςτθν ανίχνευςθ μόνο χαμθλοφ κινδφνου τφπων HPV. Ωςτόςο, βρζκθκαν και 8 αρνθτικζσ κυτταρολογικά περιπτϊςεισ (με ιςτορικό LSIL ι μετά από κωνοειδι εκτομι) με κετικότθτα ςτθν παρουςία των ενδοκυττάριων Ε6 και Ε7 mrnas και ςτθν ανίχνευςθ του HPV DNA. Το 87,5% αυτϊν των περιπτϊςεων (7/8) ςυνδζκθκαν με ογκογόνουσ HPV τφπουσ, που εντοπίςτθκαν μόνοι τουσ ι ςε ςυνδυαςμό με χαμθλοφ κινδφνου HPVs, ενϊ το 12,5% (1/8) ιταν κετικό ςτθν ανίχνευςθ μόνο χαμθλοφ κινδφνου HPVs. ενδοκυττάρια Ε6, Ε7 mrnas+/υ.κ ΗPV DNA+ ενδοκυττάρια E6,E7mRNAs+/Χ.Κ.HPV DNA Aρνθτικά ΑSCUS LSIL HSIL Σφνολο Κυτταρολογικι διάγνωςθ Εικόνα 16: Συςχζτιςθ τθσ ανίχνευςθσ υπερζκφραςθσ των ενδοκυττάριων Ε6 και Ε7 mrnas με τθν ανίχνευςθ του DNA ςτελεχϊν υψθλοφ (Υ.Κ) ι χαμθλοφ κινδφνου (Χ.Κ). Ενδοκυττάρια Ε6, Ε7 mrnas+/υ.κ. HPV DNA +: περιπτϊςεισ κετικζσ ςτθν ανίχνευςθ ογκογόνων τφπων HPV, που εντοπίςτθκαν μόνοι τουσ ι ςε ςυνδυαςμό με Χ.Κ. τφπουσ HPV. Αποτζλεςμα ΗPV DNA test Kυτταρολογικι Διάγνωςθ (+) Χαμθλοφ Κινδφνου (+) Υψθλοφ Κινδφνου (+) Χαμθλοφ και Υψθλοφ Κινδφνου Σφνολο Αρνθτικά* 1 (12,5%) 3(37,5%) 4 (50%) 8 (100%) ASCUS 5 (26,3%) 8 (42,1%) 6 (31,5%) 19 (100%) LSIL 3 (14,3%) 8 (38,1%) 10 (47,6%) 21 (100%) HSIL 0 (0,0%) 7 (87,5%) 1(12,5%) 8 (100%) Σφνολο ΗPV τφπων 9 (16,1%) 26 (46,4%) 21 (37,5%) 56 (100%) Πίνακασ 7: Συχνότθτα ανίχνευςθσ ςτελεχϊν HPV υψθλοφ ι/και χαμθλοφ κινδφνου ςε περιπτϊςεισ που βρζκθκαν κετικζσ με τθν HPV mrna Flow FISH. * με ιςτορικό LSIL ι μετά από κωνοειδι εκτομι λόγω HSIL αλλοίωςθσ. υςχζτιςθ των επιπζδων HPV DNA με τθν κυτταρολογικι διάγνωςθ Η ενίςχυςθ ςιματοσ που προκαλείται κατά τον υβριδιςμό HC2 για τα ογκογόνα ςτελζχθ ςυςχετίςτθκε ιςχυρά με τθν κυτταρολογικι διάγνωςθ τθσ τραχθλικισ ενδοπεπικθλιακισ αλλοίωςθσ (Εικόνα 17, p<0,001). Σε αντίκεςθ, τα αυξανόμενα επίπεδα του HPV DNA ςτελεχϊν χαμθλοφ κινδφνου δεν μπόρεςαν να

56 προβλζψουν τθν τραχθλικι ενδοεπικθλιακι νεοπλαςία (p for trend= 0,83). Συνεπϊσ, τα αυξανόμενα επίπεδα του HPV DNA ςτελεχϊν υψθλοφ κινδφνου αποτζλεςαν τουσ κφριουσ δείκτεσ πρόβλεψθσ των ενδοεπικθλιακϊν αλλοιϊςεων (βακμοφ 2 ι 3, CIN2 ι CIN3) ςτθν παροφςα μελζτθ. Οι υψθλοφ βακμοφ αλλοιϊςεισ (HSIL) ζτειναν να παρουςιάηουν μεγαλφτερθ ενίςχυςθ ςιματοσ (ςχετικζσ μονάδεσ φωτόσ/κετικά controls, RLU/PC) για υψθλοφ κινδφνου τφπουσ HPV ςε ςχζςθ με τισ χαμθλοφ βακμοφ αλλοιϊςεισ (LSIL). Συγκεκριμζνα, το 71,4% των HSIL αλλοιϊςεων παρουςίαςε ζνταςθ ςιματοσ >5RLU/PC για ογκογόνουσ τφπουσ HPV. Ωςτόςο, 3 περιπτϊςεισ HSIL (21,4%) βρζκθκαν αρνθτικζσ με τθ δοκιμαςία HC2. Ζνταςθ ςιματοσ >20RLU/PC για ογκογόνα ςτελζχθ HPV παρουςίαςε το 64,3% (9/14) των περιπτϊςεων HSIL. Συγκριτικά, υψθλά επίπεδα του HPV DNA τφπων υψθλοφ κινδφνου ανιχνεφτθκαν ςτο 51,2% (21/41) των LSIL αλλοιϊςεων και μόνο ςτο 18,5% (10/54) των ASCUS περιπτϊςεων (Ρίνακασ 8). Συνεπϊσ οι τραχθλικζσ ενδοεπικθλιακζσ αλλοιϊςεισ (χαμθλοφ και κυρίωσ οι υψθλοφ βακμοφ) παρουςίαςαν μεγαλφτερθ ενίςχυςθ ςιματοσ για ογκογόνα ςτελζχθ HPV ςε ςχζςθ με τισ ASCUS περιπτϊςεισ. Το 57,4% (31/54) των ΑSCUS βρζκθκε αρνθτικό με τθ δοκιμαςία HC2 ενϊ ςτο 22,2% (12/54) ανιχνεφτθκαν χαμθλά επίπεδα HPV DNA. H ςυςχζτιςθ μεταξφ των υψθλότερων επιπζδων τφπων HPV υψθλοφ κινδφνου και των κυτταρολογικά διαγνωςμζνων ενδοτραχθλικϊν αλλοιϊςεων HSIL ιταν ιςχυρι (p<.001). Εικόνα 17: Σωρευμζνο γράφθμα που δείχνει τθν κατανομι των κυτταρολογικϊν διαγνϊςεων ςε ςχζςθ με τα επίπεδα HPV DNA ογκογόνων ςτελεχϊν. Χαμθλό επίπεδο HPV DNA: 1-4,99 RLU/PC, μζτριο επίπεδο HPV DNA: 5.0 ζωσ RLU/PC και υψθλό επίπεδο HPV DNA: >20RLU/PC. Οι αρικμοί δειγμάτων ςε κάκε κατθγορία HPV DNA επιπζδου είναι οι ακόλουκοι : αρνθτικά=119, χαμθλό επίπεδο

57 HPV DNA= 26, μεςαίο επίπεδο=6 και υψθλό επίπεδο =45. Τα επίπεδα DNA τφπων HPV χαμθλοφ κινδφνου δεν μποροφν να προβλζψουν τθν τραχθλικι ενδοεπικθλιακι νεοπλαςία τφπου 2 και 3 και ςυνεπϊσ ζχουν αποκλειςτεί από αυτό το γράφθμα. RLU/PC: ςχετικζσ μονάδεσ φωτόσ/κετικά controls. Kυτταρολογικι διάγνωςθ ΗPV DNA Αρνθτικά ASCUS LSIL HSIL επίπεδο Aρνθτικό 70 (80,5%) 31 (57,4%) 15 (36,6%) 3 (21,4%) Χαμθλό 10 (11,5%) 12 (22,2%) 3 (7,3%) 1 (7,1%) Μεςαίο 2 (2,3%) 1 (1,9%) 2 (4,9%) 1 (7,1%) Υψθλό 5 (5,7%) 10 (18,5%) 21 (51,2%) 9 (64,3%) Σφνολο Πίνακασ 8: Η κυτταρολογικι διάγνωςθ ςυςχετίςτθκε ιςχυρά με τα επίπεδα HPV DNA ογκογόνων ςτελεχϊν (p<0.001). Συγκεκριμζνα οι ενδοεπικθλιακζσ αλλοιϊςεισ κυρίωσ υψθλοφ βακμοφ ςυςχετίςτθκαν κετικά με τα αυξανόμενα επίπεδα HPV DNA. υςχζτιςθ των επιπζδων ζκφραςθσ των Ε6 και Ε7 mrnas με τθν κυτταρολογικι διάγνωςθ Ρροκειμζνου να διερευνθκεί θ φπαρξθ μιασ πικανισ ςυςχζτιςθσ του ποςοςτοφ των κυττάρων που εκφράηουν τα Ε6 και Ε7 mrnas του HPV με τισ κυτταρολογικζσ διαγνϊςεισ, 196 περιπτϊςεισ που προθγουμζνωσ εξετάςτθκαν ωσ προσ τθν ανίχνευςθ υψθλοφ κινδφνου HPV-DNA, κατανεμικθκαν ςε 3 επίπεδα υπερζκφραςθσ (χαμθλό, μεςαίο και υψθλό) με βάςθ το ποςοςτό κετικότθτασ ςτθν παρουςία των ενδοκυττάριων Ε6, Ε7 mrnas. Οι LSIL αλλοιϊςεισ ςυςχετίςτθκαν κυρίωσ με τα χαμθλά επίπεδα ζκφραςθσ των Ε6 και Ε7 mrnas του HPV κακϊσ αυτά ανιχνεφτθκαν ςτο 34,1% (14/41) των περιπτϊςεων LSIL, ςτο 24,1% (13/54) των ΑSCUS, και μόνο ςτο 14,3% (2/14) των HSIL αλλοιϊςεων. Κατά τθ μετάβαςθ από τα χαμθλά ςτα μεςαία επίπεδα ζκφραςθσ οι HSIL περιπτϊςεισ παρουςιάηουν μεγαλφτερο ποςοςτό κυττάρων που εκφράηουν Ε6 και Ε7 mrnas ςε ςχζςθ με τισ αλλοιϊςεισ LSIL ι τισ αρνθτικζσ κυτταρολογικά περιπτϊςεισ. Συγκεκριμζνα, το 71,4% (10/14) των HSIL παρουςίαςε ποςοςτό κετικϊν κυττάρων από 3 ζωσ 6%. Συγκριτικά, μζτρια επίπεδα ζκφραςθσ των Ε6 και Ε7 mrnas ανιχνεφτθκαν ςτο 29,3% (12/41) των LSIL αλλοιϊςεων και ςτο 14,8% (8/54) των ΑSCUS. Συνεπϊσ, κατά τθ μετάβαςθ από τα χαμθλά ςτα μεςαία επίπεδα ζκφραςθσ των Ε6 και Ε7 mrnas, οι HSIL αλλοιϊςεισ παρουςιάηουν μεγαλφτερο ποςοςτό κετικότθτασ ςτθν παρουςία των Ε6, Ε7 mrnas ςε ςχζςθ με τισ ASCUS περιπτϊςεισ. Ραρόμοια, οι

58 αλλοιϊςεισ LSIL παρουςιάηουν μεγαλφτερο ποςοςτό κυττάρων που εκφράηουν Ε6 και Ε7 mrnas ςε ςχζςθ με τισ ASCUS ι τισ αρνθτικζσ κυτταρολογικά περιπτϊςεισ. Πλα τα παραπάνω δείχνουν ότι το ποςοςτό των κυττάρων που εκφράηουν Ε6 και Ε7 mrnas του HPV ςυςχετίςτθκε κετικά με τθν κυτταρολογικι διάγνωςθ (p<0.001) (Εικόνα 18). Ωςτόςο, υψθλότερα επίπεδα ζκφραςθσ Ε6 και Ε7 mrnas παρουςίαςε το 29,6% (16/54) των ASCUS περιπτϊςεων. Συγκριτικά, ποςοςτό κετικϊν κυττάρων >6% ανιχνεφτθκε ςτο 12,2% (5/41) των αλλοιϊςεων LSIL και μόνο ςτο 7,1% (1/24) των HSIL. Η ςυςχζτιςθ μεταξφ των υψθλϊν επιπζδων ζκφραςθσ των Ε6 και Ε7 mrnas και των κυτταρολογικά διαγνωςμζνων ΑSCUS περιπτϊςεων ςε ςφγκριςθ κυρίωσ με τισ HSIL αλλοιϊςεισ ιταν ξεκάκαρθ. Εικόνα 18: Σωρευμζνο γράφθμα που δείχνει τθν κατανομι των κυτταρολογικϊν διαγνϊςεων ςε ςχζςθ με τα επίπεδα ζκφραςθσ των Ε6 και Ε7 mrnas του HPV. Χαμθλό επίπεδο ζκφραςθσ Ε6 και Ε7 mrnas: 1,5-3% (κετικϊν κυττάρων), μζτριο επίπεδο ζκφραςθσ 3,1-5,9% και υψθλό επίπεδο ζκφραςθσ >6%. Οι αρικμοί δειγμάτων ςε κάκε κατθγορία επιπζδου ζκφραςθσ των ενδοκυττάριων Ε6, Ε7 mrnas είναι οι ακόλουκοι: αρνθτικά= 98, χαμθλό επίπεδο ενδοκυττάριων Ε6, Ε7 mrnas= 34, μεςαίο επίπεδο= 38 και υψθλό επίπεδο= 26. Kυτταρολογικι διάγνωςθ επίπεδο Αρνθτικά ASCUS LSIL HSIL ζκφραςθσ Ε6, Ε7-mRNAs Aρνθτικό 70(80,5%) 17 (31,5%) 10 (24,4%) 1 (7,1%) Χαμθλό 5 (5,7 %) 13 (24,1%) 14 (34,1%) 2 (14,3%) Μεςαίο 8 (9,2%) 8 (14,8%) 12 (29,3%) 10 (71,4%) Υψθλό 4 (4,6%) 16 (29,6%) 5 (12,2%) 1 (7,1%) Σφνολο

59 Πίνακασ 9. Κατά τθ μετάβαςθ από τα χαμθλά ςτα μεςαία επίπεδα ζκφραςθσ των E6- και Ε7-mRNAs,το ποςοςτό των κυττάρων που εκφράηουν E6- και Ε7-mRNAs ςυςχετίςτθκε κετικά με τθν κυτταρολογικι διάγνωςθ (p<0.001). Ωςτόςο, οι ASCUs περιπτϊςεισ παρουςίαςαν υψθλότερα επίπεδα ζκφραςθσ E6- και Ε7-mRNAs (>6%) ςε ςφγκριςθ με τισ LSIL και κυρίωσ τισ HSIL αλλοιϊςεισ. υςχζτιςθ τθσ θλικίασ με τθ ςυχνότθτα HPV λοίμωξθσ και τθσ υπερζκφραςθσ των ενδοκυττάριων Ε6 και Ε7 μεταγραφθμάτων Σε ζνα πλθκυςμό 198 γυναικϊν, οι 77 (38,9%) παρουςίαςαν HPV λοίμωξθ υψθλοφ κινδφνου κατά τθν πρϊτθ τουσ εξζταςθ. Ο πίνακασ 10 παρουςιάηει τθν ςυχνότθτα τθσ HPV λοίμωξθσ από υψθλοφ κινδφνου ςτελζχθ ςε 198 γυναίκεσ ςφμφωνα με τθν θλικία τουσ, κατά τθν πρϊτθ εξζταςθ όςων γυναικϊν βρίςκονται κυτταρολογικά υπό ςτενι παρακολοφκθςθ (follow-up). Σε γυναίκεσ θλικίασ θ ςυχνότθτα τθσ HPV λοίμωξθσ κυμάνκθκε ςτο 42,8% ενϊ ςθμείωςε μια προοδευτικι μείωςθ μετά από 30 χρόνια. Για τισ θλικίεσ <20 ετϊν δεν υπάρχουν αποτελζςματα κακϊσ ιταν ελάχιςτοσ ζωσ ανφπαρκτοσ ο αρικμόσ των περιπτϊςεων αυτισ τθσ θλικιακισ κλάςθσ που υποβλικθκαν ςε ζλεγχο με τεςτ Ραπανικολάου. Στον ίδιο πλθκυςμό γυναικϊν, οι 98 (49,5%) παρουςίαςαν υπερζκφραςθ των ενδοκυττάριων Ε6 και Ε7 mrnas κατά τθν πρϊτθ τουσ εξζταςθ. Στισ γυναίκεσ θλικίασ ετϊν παρατθρικθκε μια ςυχνότθτα κετικότθτασ ςτθν παρουςία των ενδοκυττάριων Ε6 και Ε7-μεταγραφθμάτων τθσ τάξθσ του 55,2%, με μια δραματικι μείωςθ μετά από 30 χρόνια (Ρίνακασ 10). Hλικία Γυναίκεσ 105 (53%) 80 (40,4%) 13 (6,6%) Σφνολο 198 ΗPV υψθλοφ κινδφνου 45 (42,8%) 29 (36,3%) 3 (23,1%) 77 (38,9%) Υπερζκφραςθ ενδοκυττάριων Ε6,Ε7 mrnas ΗPV Υπερζκφραςθ ενδοκυττάριων Ε6,Ε7 mrnas ΗPV ςτθν ομάδα υψθλοφ κινδφνου 58 (55,2%) 31(29,5%) 37 (46,2%) 15(18,7%) 2 (15,4%) 2(15,3%) 98 ( 49,5%) 48 (24,2%) Πίνακασ 10: Συχνότθτα των HPV λοιμϊξεων υψθλοφ κινδφνου και τθσ υπερζκφραςθσ των ενδοκυττάριων Ε6 και Ε7 μεταγραφθμάτων του HPV ςφμφωνα με τθν θλικία κατά τθν πρϊτθ εξζταςθ.

60 Ει κό να 19. Συχνότθτα των HPV λοιμϊξεων υψθλοφ κινδφνου και τθσ υπερζκφραςθσ των ενδοκυττάριων Ε6 και Ε7 μεταγραφθμάτων του HPV ςφμφωνα με τθν θλικία κατά τθν πρϊτθ εξζταςθ. υςχζτιςθ τθσ θλικίασ με τθν κυτταρολογικι διάγνωςθ Ρροκειμζνου να εξεταςτεί θ φπαρξθ ςυςχζτιςθσ τθσ θλικίασ με τθν εμφάνιςθ προκαρκινικϊν αλλοιϊςεων και τθσ προςβολισ από διθκθτικό καρκίνο τραχιλου που υποςτθρίηεται βιβλιογραφικά, μελετικθκε ζνασ πλθκυςμόσ 202 γυναικϊν θλικίασ ετϊν. Στο ςφνολο του πλθκυςμοφ, ο επιπολαςμόσ των ASCUS περιπτϊςεων ιταν 28,2% (57/202) των αλλοιϊςεων LSIL 20,3% (41/202) και των HSIL 6,9% (14/202). Επιπλζον, διαγνϊςτθκαν 4 περιπτϊςεισ διθκθτικοφ καρκίνου του τραχιλου τθσ μιτρασ ενϊ το 43,1% (87/202) του ςυνολικοφ πλθκυςμοφ αφοροφςε αρνθτικζσ κυτταρολογικζσ περιπτϊςεισ. Οι ASCUS διαγνωςμζνεσ περιπτϊςεισ ςυςχετίςτθκαν κυρίωσ με τθν θλικιακι κλάςθ ετϊν. Ειδικότερα, το 70,4% (40/57) των ASCUS, το 65,95% (27/41) των LSIL αλλοιϊςεων και το 35,7% (5/41) των HSIL διαγνϊςτθκαν ςε γυναίκεσ θλικίασ ετϊν. Ωςτόςο, ςτισ νεαρζσ αυτζσ ετϊν Διθκθτικόσ καρκίνοσ τραχιλου; 75% ΑSCUS; 0% Αρνθτικά; 8% LSIL; 7,30% HSIL; 0% Πίνακασ 11: Συχνότθτεσ των κυτταρολογικϊν διαγνϊςεων/θλικιακι κλάςθ. Η θλικία ςυςχετίςτθκε ιςχυρά με τθν κυτταρολογικι διάγνωςθ (p<.001).

61 γυναίκεσ δεν υπιρξε διάγνωςθ διθκθτικοφ καρκίνου τραχιλου.οι διαγνϊςεισ αλλοιϊςεων υψθλοφ βακμοφ (HSIL) ςυςχετίςτθκαν κυρίωσ με τθν θλικιακι κλάςθ ετϊν. Το 25% (1/4) των περιπτϊςεων διθκθτικοφ καρκίνου διαγνϊςτθκε ςε γυναίκεσ αυτϊν των θλικιϊν, ενϊ οι ςυχνότθτεσ διάγνωςθσ LSIL και ASCUS κυμάνκθκαν ςτα ίδια επίπεδα (Ρίνακασ 12). Το 53,8% (43/80) των γυναικϊν αυτισ τθσ θλικιακισ κλάςθσ παρουςίαςε αρνθτικι διάγνωςθ ςυγκριτικά με το 34,6% (37/109) των γυναικϊν θλικίασ Οι διαγνϊςεισ διθκθτικοφ καρκίνου τραχιλου τελικοφ ςταδίου ςυςχετίςτθκαν με θλικίεσ >50 ετϊν κακϊσ το 75% (3/4) των διθκθτικϊν καρκινωμάτων διαγνϊςτθκαν ςε γυναίκεσ αυτϊν των θλικιϊν. Συγκεκριμζνα, το 23,1% (3/13) των γυναικϊν > 50 ετϊν παρουςίαςε διθκθτικό καρκίνο, ενϊ το 53,8% (7/13) είχε αρνθτικι διάγνωςθ. Πλα τα παραπάνω δείχνουν ότι θ θλικία ςυςχετίςτθκε ιςχυρά με τθν κυτταρολογικι διάγνωςθ (p<.001) (Εικόνα 20). Εικόνα 20: Κατανομζσ κυτταρολογικϊν διαγνϊςεων (%) ςφμφωνα με τθν θλικία των γυναικϊν. Οι αρικμοί δειγμάτων ςε κάκε θλικιακι κλάςθ είναι οι ακόλουκοι: θλικία 20-35: 107, ετϊν: 80, ετϊν: 13. Κυτταρολογικι διάγνωςθ Hλικία Αρνθτικά ASCUS LSIL HSIL Διθκθτικόσ καρκίνοσ τραχιλου (42,5%) 40(70,2%) 27(65,9%) 5(35,7%) 0 (0,0%) (49,4%) 16(29,6%) 11(13,8%) 9(64,3%) 1 (25%) (8%) 0 (0,0%) 3 (7,3%) 0 (0,0%) 3 (75%) Σφνολο υςχζτιςθ του HPV DNA test με τθν ενδοκυττάρια ανίχνευςθ των Ε6/Ε7 mrnas. Από τα δείγματα που αναλφκθκαν με HC2, θ ςυχνότθτα του HPV DNA που ανιχνεφτθκε ιταν 40% (80/200). Ενϊ, θ HPV mrna Flow FISH ανίχνευςε κετικι ζκφραςθ των ενδοκυττάριων Ε6/Ε7 mrnas ςτο 49,5% των περιπτϊςεων (99/200). Η ανάλυςθ τθσ ςυςχζτιςθσ μεταξφ των αποτελεςμάτων του HC2 και τθσ HPV Flow FISH ζδειξε ότι από τισ 80 κετικζσ ωσ προσ τθν ανίχνευςθ HPV DNA περιπτϊςεισ, οι 50 (62,5%) βρζκθκαν επίςθσ κετικζσ ωσ προσ τθν ανίχνευςθ των Ε6/Ε7 mrnas (Ρίνακασ 13). Επιπλζον, 49 δείγματα (40,8%) που βρζκθκαν αρνθτικά με τθ δοκιμαςία HC2, παρουςίαςαν κετικι ζκφραςθ των ενδοκυττάριων Ε6/Ε7 mrnas. Ρίνακασ 12. Συςχζτιςθ ανίχνευςθσ Ε6/Ε7 mrnas HPV με υβριδιςμό HC2 (p=0.003).

62 HPV m RNA F lo w F I S H Αρν θτι κ ά % ςυχ νότ θτ α ανίχν ευ ςθ σ Ε 6/ Ε7 m R N As % ςυχ νότ θτ α ανίχν ευ ςθ σ HP V D N A % το υ ς υν όλ ου Υβρι δις μό σ HC2 Αρν θ τικ ά Θετ ικά φ νο λ ο ,3 % 29,7 % 100,0 % 59,2 % 37,5 % 50,5 % 35,5 % 15,0 % 50,5 % Θετικ ά % ςυχ νότ θτ α ανίχν ευ ςθ σ Ε 6/ Ε7 m R N As 49,5 % 50,5 % 100,0 % % ςυχ νότ θτ α ανίχν ευ ςθ σ HP V D N A 40,8 % 62,5 % 49,5 % % το υ ς υν όλ ου 24,5 % 25,0 % 49,5 % Σφν ολ ο % ςυχ νότ θτ α ανίχν ευ ςθ σ Ε6 / Ε7 m R N As 60,0 % 40,0 % 100,0 % % ςυχ νότ θτ α ανίχν ευ ςθ σ HP V D N A 100,0 % 100,0 % 100,0 % % το υ ς υν όλ ου 60,0 % 40,0 % 100,0 % φγκριςθ τθσ HPV mrna Flow FISH με τθ δοκιμαςία HC2 για τθν πρόβλεψθ του ιςτορικοφ τθσ HPV λοίμωξθσ ςε αρνθτικζσ διαγνϊςεισ Για να προςδιοριςτεί θ ευαιςκθςία τόςο τθσ μεκόδου HPV mrna Flow FISH όςο και τθσ δοκιμαςίασ HC2 ςτθν ανάδειξθ του φυςικοφ ιςτορικοφ τθσ HPV λοίμωξθσ, εξετάςτθκαν 87 περιςτατικά αρνθτικισ κυτταρολογικισ διάγνωςθσ ςε ζνα πλθκυςμό 198 γυναικϊν. Από αυτά τα περιςτατικά, τα 34 (39,1%) είχαν διαγνωςμζνο ιςτορικό HPV λοίμωξθσ, ενϊ ςτο 60,9% (53/87) των περιπτϊςεων υπιρχε άγνοια ιςτορικοφ κακϊσ οι γυναίκεσ αυτζσ υποβλικθκαν ςτθν πρϊτθ τουσ εξζταςθ και ςυνεπϊσ δεν βρίςκονταν ςτο παρελκόν υπό κλινικι παρακολοφκθςθ. Το 23,5% (8/34) των αρνθτικϊν κυτταρολογικά περιπτϊςεων παρουςίαςε ιςτορικό ASCUS, το 53,0% (18/34) είχε ιςτορικό χαμθλοφ βακμοφ αλλοίωςθσ LSIL ενϊ ιςτορικό υψθλοφ βακμοφ αλλοίωςθσ HSIL παρουςιάςτθκε ςτο 23,5% (8/34) των περιπτϊςεων. Υπερζκφραςθ των ενδοκυττάριων Ε6, Ε7-mRNAs ανιχνεφτθκε ςε 2 περιπτϊςεισ με ιςτορικό ASCUS (25%), ςε 6 περιςτατικά ιςτορικοφ LSIL (33,3%) και ςε 3 περιπτϊςεισ με ιςτορικό HSIL (37,5%). Η δοκιμαςία HC2 παρουςίαςε μεγαλφτερθ

63 ευαιςκθςία ςτθν ανάδειξθ του ASCUS ιςτορικοφ ςυγκριτικά με τθ μζκοδο HPV mrna Flow FISH κακϊσ ανιχνεφτθκε HPV DNA ςε 1 επιπλζον περίπτωςθ (3/8). Ραρόμοια, θ ευαιςκθςία τθσ HC2 ςτθν αποκάλυψθ του ιςτορικοφ LSIL ιταν τθσ τάξθσ του 38,9% (7/18) ενϊ θ ευαιςκθςία τόςο του υβριδιςμοφ HC2 όςο και τθσ κυτταρομετρίασ ροισ ςτθν ανάδειξθ ιςτορικοφ HSIL ιταν ίδια (37,5%). Συνεπϊσ, από τισ 34 αρνθτικζσ κυτταρολογικά περιπτϊςεισ με ιςτορικό HPV λοίμωξθσ, θ μζκοδοσ HPV mrna Flow FISH ςυνζβαλε ςτθν ανάδειξθ του ιςτορικοφ 11 περιςτατικϊν (32,4%) ενϊ θ δοκιμαςία HC2 ανίχνευςε HPV DNA ςε 2 επιπλζον περιςτατικά (38,2%) (Εικόνα 23). Εικόνα 23. Ευαιςκθςία τθσ HPV mrna Flow FISH και τθσ δοκιμαςίασ HC2 για τθν ανάδειξθ ιςτορικοφ ASCUS, LSIL και HSIL ςε αρνθτικζσ διαγνϊςεισ. φγκριςθ τθσ ευαιςκθςίασ τθσ HPV mrna Flow FISH με το HPVDNA test για τθν παρακολοφκθςθ γυναικϊν μετά από κεραπεία Ρροκειμζνου να διερευνθκεί θ ευαιςκθςία τόςο τθσ κυτταρομετρίασ ροισ όςο και του υβριδιςμοφ HC2 ςτθ διάγνωςθ υπολειμματικισ νόςου ι πικανισ υποτροπισ εξετάςτθκαν 36 (18,2%) περιπτϊςεισ γυναικϊν οι οποίεσ είχαν διαγνωςτεί ωσ CIN2 ι CIN3 και είχαν υποβλθκεί ςε χειρουργικι κεραπεία ι κωνοειδι εκτομι. Ενϊ το 56,7% (24/36) αυτϊν των περιςτατικϊν βρζκθκαν κυτταρολογικά αρνθτικζσ μετά από τθ κεραπεία, 8 περιπτϊςεισ (22,2%) διαγνϊςτθκαν ωσ ASCUS και 4 (11,1%) παρουςίαςαν πικανά υποτροπι κακϊσ διαγνϊςτθκαν χαμθλοφ βακμοφ αλλοιϊςεισ (LSIL). Από τισ 24 αρνθτικζσ περιπτϊςεισ, ςτισ 5 (20,8%) ανιχνεφτθκε υπερζκφραςθ των ενδοκυττάριων Ε6 και Ε7-mRNAs του HPV ενϊ οι 6 (25%) βρζκθκαν κετικζσ με τθ

64 δοκιμαςία HC2. Η μζκοδοσ HPV mrna Flow FISH παρουςίαςε μεγαλφτερθ ευαιςκθςία ςτα περιςτατικά που διαγνϊςτθκαν ωσ ASCUS και LSIL μετά από τθ κεραπεία ςυγκριτικά με τθ δοκιμαςία HC2. Ειδικότερα, HPV DNA ανιχνεφτθκε ςτο 50% των ASCUS περιςτατικϊν (4/8), ενϊ υπερζκφραςθ των ενδοκυττάριων Ε6 και Ε7-mRNAS ςτο 75% (6/8) των ASCUS διαγνϊςεων. Ραρόμοια, ςτισ περιπτϊςεισ που παρουςίαςαν υποτροπι και διαγνϊςτθκαν ωσ LSIL, όλεσ (4/4) βρζκθκαν κετικζσ ςτθν παρουςία των ενδοκυττάριων Ε6 και Ε7-mRNAs, ενϊ μόνο ςτισ 2 (50%) ανιχνεφτθκε HPV DNA με τθ δοκιμαςία HC2 (Εικόνα 24). Εικόνα 24: Ευαιςκθςία τθσ HPV mrna Flow FISH και τθσ δοκιμαςίασ HC2 ςε αρνθτικά διαγνωςμζνεσ περιπτϊςεισ κακϊσ και ςε διαγνϊςεισ ASCUS και LSIL μετά από κεραπεία. Follow-up γυναικϊν με κωνοειδι εκτομι του τραχιλου ι με ιςτορικό αλλοίωςθσ LSIL/HSIL Μοριακι προςζγγιςθ 21 περιςτατικϊν Η κωνοειδισ εκτομι αποτελεί τθ μζκοδο εκλογισ χειρουργικισ αντιμετϊπιςθσ του ςοβαροφ βακμοφ αλλοιϊςεων του τραχιλου τθσ μιτρασ. Ωςτόςο, ο κίνδυνοσ υποτροπισ των βλαβϊν αυτϊν μετά τθ κεραπεία παραμζνει, κζτοντασ ζτςι επιτακτικι τθν ανάγκθ για τακτικό και πλιρθ επανζλεγχο (follow-up). Στθν παροφςα εργαςία διερευνικθκε θ αξία των μοριακϊν τεχνικϊν ςυμπλθρωματικά του κυτταρολογικοφ ελζγχου ςτθν διαχείριςθ των γυναικϊν μετά τθν κωνοειδι εκτομι ι περιςτατικϊν με ιςτορικό μζτριασ και ςοβαροφ βακμοφ δυςπλαςίασ με ςκοπό τθν εκτίμθςθ τθσ υποςτροφισ ι τθσ πικανισ εξζλιξθσ τθσ νόςου. Στο υλικό τθσ μελζτθσ μασ περιλάβαμε κολποτραχθλικά επιχρίςματα 21 γυναικϊν θλικίασ ετϊν με ιςτορικό κωνοειδοφσ εκτομισ τραχιλου μιτρασ, αλλοίωςθσ LSIL ι HSIL. Στα περιςτατικά αυτά υπιρξε θ

65 δυνατότθτα ελζγχου με υβριδιςμό HC2 και κυτταρομετρία ροισ παράλλθλα με τθν κυτταρομορφολογία ανά 6μθνο (2 επιςκζψεισ των γυναικϊν) ι ανά 4μθνο (3 επιςκζψεισ) προκειμζνου να μελετθκεί θ μεταβολι τόςο του ιϊκοφ φορτίου όςο και των επιπζδων ζκφραςθσ των ενδοκυττάριων Ε6 και Ε7-mRNAs του HPV (Εικόνα 25). Στον αςκενι 1 με κυτταρομορφολογικι διάγνωςθ αλλοίωςθσ LSIL ςτθν πρϊτθ εξζταςθ, παρατθρικθκε υποςτροφι τθσ νόςου ςε ASCUS ςτθν επαναλθπτικι κυτταρολογία υγρισ φάςθσ μετά από 6 μινεσ. Ραρόλο που θ υποςτροφι τθσ αλλοίωςθσ διαπιςτϊκθκε κυτταρομορφολογικά, παρατθρικθκε αφξθςθ του ιϊκοφ φορτίου για ςτελζχθ υψθλοφ κινδφνου με τθ δοκιμαςία HC2. Η κυτταρομετρία ροισ φάνθκε να ταυτίηεται πιο πολφ με τθν κυτταρομορφολογία κακϊσ διαπιςτϊκθκε παρουςία ενεργοφσ λοίμωξθσ μόνο ςτθν πρϊτθ εξζταςθ. Ο αςκενισ 2 θλικίασ 25 ετϊν παρουςίαςε κυτταρομορφολογικά ευριματα CIN1/CIN2 με κετικό HPV DNA test για ςτελζχθ υψθλοφ κινδφνου και κετικι HPV mrna Flow FISH ςτθν πρϊτθ εξζταςθ. Αφοφ υποβλικθκε ςε κωνοειδι εκτομι, ζγινε διάγνωςθ κυτταρικισ ατυπίασ (ASCUS) ςτισ 2 επόμενεσ επιςκζψεισ. Μετά τθν κωνοειδι εκτομι παρατθρικθκε μείωςθ του ιϊκοφ φορτίου για ςτελζχθ υψθλοφ κινδφνου με τθ δοκιμαςία HC2. Ραρόλο που τα αποτελζςματα του HPV DNA test ταυτίςτθκαν με τθσ κυτταρομορφολογίασ, διαπιςτϊκθκε ςταδιακά αφξθςθ του ποςοςτοφ των κυττάρων που εκφράηουν ενδοκυττάρια Ε6 και Ε7-mRNAs μετά τθν κωνοειδι εκτομι. Συνεπϊσ, θ παρουςία τθσ ενεργοφ λοίμωξθσ δείχνει ότι το ςυγκεκριμζνο περιςτατικό πρζπει να τεκεί υπό τακτικι παρακολοφκθςθ τόςο κυτταρομορφολογικά όςο και κυτταρομετρικά κακϊσ υπάρχει πικανότθτα εκδιλωςθσ υποτροπιάηουςασ βλάβθσ ςοβαροφ βακμοφ μελλοντικά. Ο αςκενισ 3 θλικίασ 27 ετϊν, παρουςίαςε αρνθτικι κυτταρομορφολογία, κετικό HPV DNA test ενϊ δεν ανιχνεφτθκε υπερζκφραςθ των ενδοκυττάριων Ε6, Ε7- mrnas κατά τθν πρϊτθ εξζταςθ. Η ανίχνευςθ HPV DNA υψθλοφ κινδφνου ςε χαμθλά επίπεδα (πικανϊσ και εξωκυττάρια) αποκαλφπτει το ιςτορικό αλλοίωςθσ LSIL αυτοφ του περιςτατικοφ. Στθν επόμενθ εξζταςθ, τα αρνθτικά κυτταρολογικά αποτελζςματα ταυτίςτθκαν με τα αρνθτικά αποτελζςματα του HPV DNA test και τθσ HPV mrna Flow FISH.

66 Ο αςκενισ 4 θλικίασ 30 ετϊν υποβλικθκε ςε κωνοειδι εκτομι λόγω κυτταρολογικϊν ευρθμάτων CIN1/CIN2 αλλοίωςθσ. Μετά τθν κωνοειδι εκτομι, ζγινε διάγνωςθ κυτταρικισ ατυπίασ (ΑSCUS) ςτισ 2 επόμενεσ επιςκζψεισ. Σε κάκε εξζταςθ διαπιςτϊκθκε το ενδεχόμενο πλιρουσ HPV ενςωμάτωςθσ (μόνο mrna) με αφξθςθ του ποςοςτοφ των κυττάρων που εκφράηουν ενδοκυττάρια Ε6, Ε7 mrnas ςτθ δεφτερθ επίςκεψθ. Ωςτόςο, δεν αποκλείεται και θ πικανότθτα τθσ ενεργοφ λοίμωξθσ με τθν παρουςία διαφορετικϊν HPV τφπων υψθλοφ κινδφνου από εκείνων που ανιχνεφονται με το HPV DNA test. Συνεπϊσ, θ παρουςία HPV ενςωματωμζνθσ λοίμωξθσ δείχνει ότι το ςυγκεκριμζνο περιςτατικό χριηει ςτενισ παρακολοφκθςθσ με επανάλθψθ τθσ HPV mrna Flow FISH παράλλθλα με τθν επαναλθπτικι κυτταρολογία υγρισ φάςθσ. Ο αςκενισ 5 υποβλικθκε ςε κωνοειδι εκτομι λόγω κυτταρολογικϊν ευρθμάτων CIN1/CIN2. Στθν πρϊτθ επίςκεψθ μετά τθν κωνοειδι ο αςκενισ παρουςίαςε αρνθτικι κυτταρομορφολογία θ οποία ταυτίςτθκε με τα αποτελζςματα του HPV DNA test και τθσ κυτταρομετρίασ ροισ. Ωςτόςο, ςτθ δεφτερθ εξζταςθ εκδθλϊκθκε υποτροπι τθσ νόςου θ οποία εκφράςτθκε τόςο κυτταρομορφολογικά (ωσ αλλοίωςθ LSIL) όςο και ςτο HPV DNA test με τθν ανεφρεςθ ςτελεχϊν του ιοφ υψθλοφ κινδφνου. Η παρουςία ενεργοφ λοίμωξθσ που διαπιςτϊκθκε με τθν υπερζκφραςθ των ενδοκυττάριων Ε6 και Ε7-mRNAs κζτει αυτό το περιςτατικό υπό τακτικι παρακολοφκθςθ. Ο αςκενισ 6 θλικίασ 45 ετϊν υποβλικθκε ςε κωνοειδι εκτομι λόγω κυτταρολογικϊν ευρθμάτων CIN2. Εντφπωςθ προκάλεςε το γεγονόσ ανεφρεςθσ ποςοςτοφ 5,04% κυττάρων που εκφράηουν ενδοκυττάρια Ε6 και Ε7-mRNAs κακϊσ ο αςκενισ παρουςίαςε αρνθτικι κυτταρομορφολογία και αρνθτικό HPV DNA test ςτθν πρϊτθ εξζταςθ μετά τθν κωνοειδι εκτομι. Θετικότθτα των HPV mrnas παρατθρικθκε και ςτθ δεφτερθ εξζταςθ, ωςτόςο μειϊκθκαν τα επίπεδα ζκφραςθσ των ενδοκυττάριων E6, E7-mRNAs. Η παρουςία τθσ ενεργοφ λοίμωξθσ και ςυγκεκριμζνα θ υπερζκφραςθ των ενδοκυττάριων mrnas διαγιγνϊςκει πικανά το κατάλοιπο τθσ νόςου μετά τθν κωνοειδι εκτομι. Γι αυτό το λόγο, το περιςτατικό αυτό πρζπει να τεκεί ςε κυτταρολογικό και κυτταρομετρικό επανζλεγχο παρ όλο που

67 παρουςιάηει αρνθτικι κυτταρομορφολογία κακϊσ υπάρχει πικανότθτα εκδιλωςθσ υποτροπιάηουςασ βλάβθσ. Ο αςκενισ 7 θλικίασ 47 ετϊν υποβλικθκε ςε κωνοειδι εκτομι λόγω κυτταρομορφολογικϊν ευρθμάτων CIN2. Και ςτισ 2 επιςκζψεισ μετά τθν κωνοειδι εκτομι, ζγινε διάγνωςθ κυτταρικισ ατυπίασ (ASCUS). Σε κάκε εξζταςθ θ κυτταρομορφολογία ταυτίςτθκε με τα αποτελζςματα τθσ κυτταρομετρίασ ροισ και διαπιςτϊκθκε το ενδεχόμενο πλιρουσ HPV ενςωμάτωςθσ (μόνο mrna) με ελαφρά μείωςθ του ποςοςτοφ των κυττάρων που εκφράηουν ενδοκυττάρια Ε6, Ε7-mRNAs ςτθ δεφτερθ επίςκεψθ. Ωςτόςο, πιο πικανι κεωρείται θ παρουςία ενεργοφ λοίμωξθσ που οφείλεται ςε διαφορετικοφs HPV τφπουσ υψθλοφ κινδφνου από τα 13 ςτελζχθ που ανιχνεφονται με τθ δοκιμαςία HC2. Η υπερζκφραςθ των ενδοκυττάριων Ε6, Ε7-mRNAs διαγιγνϊςκει πικανά το κατάλοιπο τθσ νόςου μετά τθν κωνοειδι εκτομι. Συνεπϊσ, το περιςτατικό χριηει ςτενισ παρακολοφκθςθσ με επανάλθψθ τθσ HPV mrna Flow FISH παράλλθλα με τθν επαναλθπτικι κυτταρολογία υγρισ φάςθσ. Ο αςκενισ 8 θλικίασ 44 ετϊν παρουςίαςε αρνθτικι κυτταρομορφολογία, κετικό HPV DNA test ενϊ δεν ανιχνεφτθκε υπερζκφραςθ των ενδοκυττάριων Ε6, Ε7- mrnas κατά τθν πρϊτθ εξζταςθ. Η παρουςία HPV DNA υψθλοφ κινδφνου που ανιχνεφτθκε ςε αυξθμζνα επίπεδα (πικανϊσ και εξωκυτταρικά) αποκαλφπτει το ιςτορικό υψθλοφ βακμοφ αλλοίωςθσ (HSIL) αυτοφ του περιςτατικοφ. Στθν επόμενθ εξζταςθ, ο αςκενισ παρουςίαςε κυτταρομορφολογία ASCUS θ οποία ταυτίςτθκε με το κετικό HPV DNA test. Ωςτόςο, δεν ανιχνεφτθκε υπερζκφραςθ των ενδοκυττάριων mrnas του HPV. Η απουςία ενεργότθτασ τθσ λοίμωξθσ δείχνει ότι το γονιδίωμα του ιοφ πολλαπλαςιάςτθκε ςαν εξωχρωμοςωμικό επίςωμα κακϊσ δεν ανιχνεφτθκε ενςωματωμζνο HPV DNA. O αςκενισ 9 θλικίασ 32 ετϊν παρουςίαςε εμμζνουςα HPV λοίμωξθ κακϊσ εξελίχκθκε ςε ενδοεπικθλιακι αλλοίωςθ χαμθλοφ βακμοφ ςτθ δεφτερθ εξζταςθ. Συγκεκριμζνα, ςτθν πρϊτθ επίςκεψθ ο αςκενισ παρουςίαςε κυτταρομορφολογία ASCUS θ οποία ταυτίςτθκε με τα κετικά αποτελζςματα του HPV DNA test και τθσ κυτταρομετρίασ ροισ. Στθ δεφτερθ επίςκεψθ εκδθλϊκθκε εξζλιξθ τθσ λοίμωξθσ θ οποία εκφράςτθκε τόςο κυτταρομορφολογικά (ωσ LSIL) όςο και με τθν αφξθςθ του

68 ιικοφ φορτίου ςτελεχϊν υψθλοφ κινδφνου που ανιχνεφτθκε με τθ δοκιμαςία HC2. Η παρουςία τθσ ενεργοφσ επίμονθσ λοίμωξθσ επιβεβαιϊκθκε με τθ ςτακερι ζκφραςθ των ενδοκυττάριων E6, E7-mRNAS του HPV. O αςκενισ 10 θλικίασ 28 ετϊν παρουςίαςε αρνθτικι κυτταρομορφολογία θ οποία ταυτίςτθκε με το αρνθτικό HPV DNA test. Ωςτόςο, παρατθρικθκε υπερζκφραςθ των ενδοκυττάριων mrnas θ οποία αποκαλφπτει το ιςτορικό αλλοίωςθσ LSIL αυτοφ του περιςτατικοφ και ςυνεπϊσ δείχνει μια πικανι μελλοντικι υποτροπι τθσ νόςου. Ρράγματι, ςτθ δεφτερθ εξζταςθ ο αςκενισ παρουςίαςε κυτταρομορφολογικά ευριματα LSIL τα οποία ταυτίςτθκαν με τα κετικά αποτελζςματα του HPV DNA test και τθσ κυτταρομετρίασ ροισ. Ραρά τθ μείωςθ του ποςοςτοφ των κυττάρων που εκφράηουν ενδοκυττάρια mrnas ςτθ δεφτερθ επίςκεψθ, θ ενεργόσ λοίμωξθ ιταν ζκδθλθ. Η παραμονι τθσ ενεργοφσ λοίμωξθσ ι πικανι υποςτροφι τθσ αλλοίωςθσ λόγω του νεαροφ τθσ θλικίασ (<35 ετϊν) πρζπει να εξεταςτεί με επανάλθψθ τθσ κυτταρομετρίασ ροισ παράλλθλα με τθν επαναλθπτικι κυτταρολογία υγρισ φάςθσ (Eικόνα 33). Ο αςκενισ 11 παρουςίαςε κυτταρικι ατυπία ( ASCUS) θ οποία ταυτίςτθκε με τα χαμθλά επίπεδα HPV DNA ςτελεχϊν υψθλοφ κινδφνου ςτθν πρϊτθ εξζταςθ. Η παρουςία ενεργοφ λοίμωξθσ διαπιςτϊκθκε με τθν υπερζκφραςθ των ενδοκυττάριων Ε6 και Ε7-mRNAs. Στθν δεφτερθ επίςκεψθ εκδθλϊκθκε εξζλιξθ τθσ κυτταρικισ ατυπίασ ςε εμμζνουςα λοίμωξθ θ οποία εκφράςτθκε τόςο κυτταρομορφολογικά (ωσ LSIL) όςο και με τθν αφξθςθ των επιπζδων ζκφραςθσ των mrnas του HPV.Η μθ ανίχνευςθ HPV DNA ςτθ δεφτερθ εξζταςθ δείχνει το ενδεχόμενο πλιρουσ ΗPV ενςωμάτωςθσ. Ωςτόςο, δεν αποκλείεται και πάλι θ πικανότθτα ενεργοφ λοίμωξθσ με τθν παρουςία διαφορετικϊν HPV τφπων υψθλοφ κινδφνου από τα 13 ςτελζχθ που ανιχνεφονται με το HPV DNA test. Συνεπϊσ, το ενδεχόμενο HPV ενςωματωμζνθσ λοίμωξθσ δείχνει ότι το περιςτατικό χριηει ςτενισ παρακολοφκθςθσ με κυτταρολογικό και κυταρομετρικό επανζλεγχο.

69 Ο αςκενισ

70 Εικόνα 25. Μεταβολι του ιϊκοφ φορτίου και των επιπζδων ζκφραςθσ των ενδοκυττάριων Ε6 και Ε7- mrnas του HPV ςε follow-up γυναικϊν με κωνοειδι εκτομι του τραχιλου ι με ιςτορικό αλλοίωςθσ LSIL/HSIL. Ο αςκενισ 12 θλικίασ 26 ετϊν παρουςίαςε κυτταρομορφολογικά ευριματα αλλόιωςθσ χαμθλοφ βακμοφ (LSIL) τα οποία ταυτίςτθκαν με τα κετικά αποτελζςματα του HPV DNA test και τθσ HPV mrna Flow FISH. Η παραμονι τθσ ενεργοφ λοίμωξθσ με διάγνωςθ LSIL διαπιςτϊκθκε ςτθ δεφτερθ εξζταςθ όπου παρατθρικθκε μείωςθ του ιικοφ φορτίου για υψθλοφ κινδφνου ςτελζχθ και ελαφρά αφξθςθ των επιπζδων ζκφραςθσ των ενδοκυττάριων Ε6, Ε7-mRNAs. Ο αςκενισ 13 θλικίασ 48 ετϊν υποβλικθκε ςε κωνοειδι εκτομι λόγω κυτταρολογικϊν ευρθμάτων CIN2. Στθν πρϊτθ εξζταςθ μετά τθν κωνοειδι εκτομι παρουςίαςε κυτταρομορφολογία ΑSCUS θ οποία ταυτίςτθκε με τα χαμθλά επίπεδα HPV DNA. Ωςτόςο, δεν ανιχνεφτθκε υπερζκφραςθ των ενδοκυττάριων Ε6, Ε7-mRNAs. Η απουςία ενεργοφ λοίμωξθσ δείχνει τθν πικανι υποχϊρθςθ τθσ νόςου (παρουςία μόνο επιςωματικοφ HPV DNA). Ρράγματι, ςτθ δεφτερθ εξζταςθ ο αςκενισ παρουςίαςε αρνθτικι κυτταρομορφολογία θ οποία ταυτίςτθκε με τα αρνθτικά αποτελζςματα του HPV DNA test και τθσ κυτταρομετρίασ ροισ. Ο αςκενισ 14 με ιςτορικό αλλοίωςθσ LSIL παρουςίαςε αρνθτικι κυτταρολογικι διάγνωςθ που ταυτίςτθκε με τα αρνθτικά αποτελζςματα του HPV DNA test και τθσ HPV mrna Flow FISH ςτθν πρϊτθ εξζταςθ. Ωςτόςο, ςτθ δεφτερθ επίςκεψθ διαπιςτϊκθκε υποτροπι τθσ νόςου θ οποία εκφράςτθκε τόςο κυτταρομορφολογικά (ωσ LSIL) όςο και κυτταρομετρικά με τθν υπερζκφραςθ των ενδοκυττάριων Ε6 και Ε7-mRNAs του HPV. Η μθ ανίχνευςθ HPV DNA δείχνει το ενδεχόμενο πλιρουσ ενςωμάτωςθσ (μόνο mrna) ι τθν πικανότθτα ενεργοφ λοίμωξθσ που οφείλεται ςε διαφορετικά ςτελζχθ υψθλοφ κινδφνου από εκείνα που ανιχνεφονται με το HPV DNA test. Ο αςκενισ 15 με ιςτορικό αλλοίωςθσ LSIL παρουςίαςε υποςτροφι τθσ νόςου θ οποία εκφράςτθκε κυτταρομορφολογικά ωσ κυτταρικι ατυπία (ASCUS) και ςτισ δφο επιςκζψεισ. Η κυτταρομορφολογία ταυτίςτθκε με τθν υπερζκφραςθ των ενδοκυττάριων Ε6, E7-mRNAs, ενϊ δεν ανιχνεφτθκε HPV DNA. Επιπλζον, παρατθρικθκε αφξθςθ του ποςοςτοφ των κυττάρων που εκφράηουν τα ενδοκυττάρια

71 mrnas ςτθ δεφτερθ επίςκεψθ. Τα υψθλά επίπεδα ζκφραςθσ των mrnas που παρατθρικθκαν και ςτισ δφο επιςκζψεισ αποκαλφπτουν το ιςτορικό ςοβαρότερθσ αλλοίωςθσ (LSIL) αυτοφ του περιςτατικοφ ι τθν φπαρξθ μιασ υποκρυπτομζνθσ προχωρθμζνθσ αλλοίωςθσ CIN2/CIN3, παρόλο που το κολποτραχθλικό επίχριςμα παρουςίαςε ASCUS αλλοιϊςεισ. Συνεπϊσ, θ μθ ανίχνευςθ HPV DNA και θ παρουςία εμμζνουςασ HPV ενςωματωμζνθσ λοίμωξθσ κζτει το περιςτατικό ςε τακτικό κυτταρολογικό και κυτταρομετρικό επανζλεγχο κακϊσ υπάρχει ςοβαρι πικανότθτα επιδείνωςθσ τθσ νόςου. Ο αςκενισ 16 θλικίασ 30 ετϊν με ιςτορικό αλλοίωςθσ LSIL παρουςίαςε αρνθτικι κυτταρομορφολογία θ οποία ταυτίςτθκε με τα αρνθτικά αποτελζςματα του HPV DNA test και τθσ κυτταρομετρίασ ροισ ςτθν πρϊτθ εξζταςθ. Ωςτόςο, θ ανίχνευςθ HPV DNA υψθλοφ κινδφνου και θ υπερζκφραςθ των ενδοκυττάριων Ε6, Ε7-mRNAs ςτθν δεφτερθ εξζταςθ δε ςυμφωνοφν με τα αρνθτικά αποτελζςματα τθσ επαναλθπτικισ κυτταρολογίασ υγρισ φάςθσ. Η αυξθμζνθ μεταγραφικι δραςτθριότθτα του ιοφ ςυνάδει με τθ μετατροπι του επικθλίου ςε διάφορο βακμό δυςπλαςίασ πριν αυτι εμφανιςτεί με κυτταρομορφολογικζσ αλλοιϊςεισ. Συνεπϊσ, θ παρουςία ενεργοφ λοίμωξθσ δείχνει τθν φπαρξθ ςοβαρισ πικανότθτασ εκδιλωςθσ υποτροπιάηουςασ βλάβθσ, θ οποία κζτει το περιςτατικό ςε επανζλεγχο παρά τθν αρνθτικι κυτταρολογικι διάγνωςθ. Ο αςκενισ 17 θλικίασ 38 ετϊν παρουςίαςε κυτταρολογικά ευριματα CIN3 τα οποία ταυτίςτθκαν με τθν ανίχνευςθ HPV DNA υψθλοφ κινδφνου και τθν υπερζκφραςθ των ενδοκυττάριων Ε6, Ε7-mRNAs. Για τθν αντιμετϊπιςθ τθσ ςοβαροφ βακμοφ αλλοίωςθσ, ο αςκενισ υποβλικθκε ςε κωνοειδι εκτομι τραχιλου. Στθν πρϊτθ επίςκεψθ μετά τθν κεραπεία, ζγινε διάγνωςθ ASCUS θ οποία ταυτίςτθκε με το κετικό HPV DNA test. Ραρόλο που μειϊκθκαν τα επίπεδα του HPV DNA μετά τθν χειρουργικι αφαίρεςθ τθσ υψθλοφ βακμοφ ενδοεπικθλιακισ αλλοίωςθσ, θ ανίχνευςθ ιικοφ φορτίου διαγιγνϊςκει πικανά το κατάλοιπο τθσ νόςου. Ωςτόςο, δεν παρατθρικθκε κετικότθτα ςτθν παρουςία των ενδοκυττάριων Ε6, Ε7-mRNAs του HPV (ενςωματωμζνο HPV DNA). Στθ δεφτερθ εξζταςθ, διαπιςτϊκθκε ίαςθ με τθν κυτταρολογικι διάγνωςθ θ οποία όμωσ δεν επιβεβαιϊκθκε με το HPV DNA test (αν

72 και ανιχνεφτθκε ςε μειωμζνα επίπεδα) και τθν κυτταρομετρία ροισ. Η παρουςία ενεργοφ λοίμωξθσ και εδικά θ αυξθμζνθ μεταγραφικι δραςτθριότθτα του ιοφ κζτει το περιςτατικό ςε κυτταρολογικό και κυτταρομετρικό επανζλεγχο κακϊσ υπάρχει πικανότθτα εκδιλωςθσ υποτροπιάηουςασ βλάβθσ. Ο αςκενισ 18 θλικίασ 36 ετϊν με ιςτορικό CIN1 παρουςίαςε κυτταρομορφολογικά ευριματα ASCUS ςτθν πρϊτθ εξζταςθ, τα οποία ταυτίςτθκαν με τθ κετικότθτα ςτθν παρουςία των Ε6, Ε7-mRNAs του HPV. Ωςτόςο, δεν ανιχνεφτθκε HPV DNA υψθλοφ κινδφνου με τθ δοκιμαςία HC2. Στθν δεφτερθ επίςκεψθ διαπιςτϊκθκε κυτταρολογικά υποςτροφι τθσ νόςου θ οποία επιβεβαιϊκθκε με το αρνθτικό HPV DNA test. Αν και παρατθρικθκε μείωςθ του ποςοςτοφ των κυττάρων που εκφράηουν ενδοκυττάρια Ε6, Ε7-mRNAs HPV ςτθ δεφτερθ εξζταςθ, θ αυξθμζνθ μεταγραφικι δραςτθριότθτα του ιοφ διαγιγνϊςκει πικανά το κατάλοιπο τθσ νόςου. Γι αυτό το λόγο, το περιςτατικό χριηει παρακολοφκθςθσ με επανάλθψθ τθσ κυτταρομετρίασ ροισ παράλλθλα με τθν επαναλθτπικι κυτταρολογία υγρισ φάςθσ. Ο αςκενισ 19 θλικίασ 33 ετϊν παρουςίαςε κυτταρομορφολογία αλλοίωςθσ χαμθλοφ βακμοφ (LSIL) θ οποία ταυτίςτθκε με τα υψθλά επίπεδα ανίχνευςθσ HPV DNA υψθλοφ κινδφνου. Ωςτόςο, δεν παρατθρικθκε ενεργότθτα λοίμωξθσ κακϊσ δεν ανιχνεφτθκε υπερζκφραςθ Ε6, Ε7-mRNAs HPV ενδοκυττάρια. Η αρνθτικι HPV FISH Ε6 και Ε7 ανίχνευςθ δείχνει τθν πικανι υποχϊρθςθ τθσ νόςου και τθν ανίχνευςθ μόνο επιςωματικισ μορφισ HPV DNA. Μετά από 4 μινεσ, παρατθρικθκε υποςτροφι τθσ λοίμωξθσ ςε ASCUS, όπωσ διαγνϊςτθκε ςτθν επαναλθπτικι κυτταρολογία υγρισ φάςθσ. Η κυτταρομορφολογικι διάγνωςθ ταυτίςτθκε με τθ κετικι ζκφραςθ των ενδοκυττάριων Ε6, Ε7-mRNAs, ενϊ δεν ανιχνεφτθκε HPV DNA υψθλοφ κινδφνου. Στθν τρίτθ εξζταςθ, ο αςκενισ παρουςίαςε αρνθτικι κυτταρομορφολογία. Ραρόλο που ανιχνεφτθκαν χαμθλά επίπεδα HPV DNA και παρατθρικθκε μείωςθ του ποςοςτοφ των κυττάρων που εκφράηουν ενδοκυττάρια Ε6, Ε7-mRNAs, θ ανίχνευςθ επιςωματικοφ και κυρίωσ ενςωματωμζνου HPV DNA διαγιγνϊςκει πικανά τθν φπαρξθ υπολλειματικισ νόςου. Ο αςκενισ 20 παρουςίαςε κυτταρομορφολογικά ευριματα CIN3 τα οποία ταυτίςτθκαν με τθν ανίχνευςθ υψθλϊν επιπζδων HPV DNA υψθλοφ κινδφνου και τθν

73 υπερζκφραςθ των ενδοκυττάριων Ε6, Ε7-mRNAs του HPV. Λόγω τθσ ςοβαροφ βακμοφ εμμζνουςασ δυςπλαςίασ, ο αςκενισ υποβλικθκε ςε κωνοειδι εκτομι τραχιλου. Στθν πρϊτθ επίςκεψθ μετά τθ κεραπεία, διαπιςτϊκθκε ίαςθ τθσ νόςου κυτταρομορφολογικά θ οποία επιβεβαιϊκθκε τόςο με το αρνθτικό HPV DNA test όςο και με HPV mrna Flow FISH. HPV τυποποίθςθ ςε follow up γυναικϊν με κετικι ζκφραςθ των ενδοκυττάριων Ε6 και Ε7-mRNAs Ρροκειμζνου να επιβεβαιωκεί το ενδεχόμενο πλιρουσ ενςωμάτωςθσ (μόνο mrna) ςε αρνθτικζσ Υ.Κ. ΗC2 περιπτϊςεισ ι θ παρουςία ενεργοφ λοίμωξθσ που οφείλεται ςε διαφορετικοφσ HPV τφπουσ Υ.Κ. από τα 13 ςτελζχθ που ανιχνεφονται με τθ δοκιμαςία HC2, επελζγθςαν 13 περιπτϊςεισ γυναικϊν (που βρίςκονταν ςε followup μετά από κωνοειδι εκτομι τραχιλου ι με ιςτορικό αλλοίωςθσ LSIL/HSIL) ςτισ οποίεσ εφαρμόςτθκε θ μζκοδοσ CLART HPV2 Genotyping assay για HPV τυποποίθςθ (ανίχνευςθ 18 ςτελεχϊν υψθλοφ κινδφνου ςε ςφνολο 35 υποτφπων) με τθν τεχνικι των μοριακϊν μικροςυςτοιχιϊν. Πλεσ οι περιπτϊςεισ παρουςίαςαν αρνθτικό HPV DNA test και κετικι ζκφραςθ των ενδοκυττάριων Ε6, Ε7-mRNAs. Στο ςφνολο των 13 περιςτατικϊν, οι 4 είχαν αρνθτικι κυτταρομορφολογία (περιπτϊςεισ 2,5,6,7 Ρίνακα 17 ), οι 7 ιταν ASCUS (περιπτϊςεισ 4,11,12,14,16,18,20 Ρίνακα 17) και οι δφο είχαν διάγνωςθ LSIL (περιπτϊςεισ 17,21). Μεταξφ HPV mrna Flow FISH και CLART HPV 2 Genotyping υπιρξε ταφτιςθ ςτο 92,3% των περιπτϊςεων (12/13), ενϊ πλιρθσ ενςωμάτωςθ του HPV (μόνο mrna) παρατθρικθκε ςε 1 περίπτωςθ LSIL όπου υπιρξε ταφτιςθ μεταξφ των αρνθτικϊν αποτελεςμάτων του Υ.Κ. ΗC2 και του CLART HPV2 Genotyping assay. Μεταξφ των αρνθτικϊν κυτταρολογικά περιπτϊςεων, όλεσ οι περιπτϊςεισ που βρζκθκαν κετικζσ με τθ HPV mrna Flow FISH και το HPV2 Genotyping assay «ξζφυγαν» ουςιαςτικά από τθ δοκιμαςία HC2 κακϊσ οι τφποι του ιοφ που ανιχνεφτθκαν με τθν τεχνικι των μικροςυςτοιχιϊν (τφποι: 33,59,58,31,51,16) ανικουν μεταξφ των 13 ςτελεχϊν υψθλοφ κινδφνου που ανιχνεφονται με τον υβριδιςμό HC2.

74 Εικόνα 1 0: Μεταβολι του HPV D