ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΝΕΟΤΕΡΩΝ ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ΚΑΙ ΤΩΝ ΦΑΓΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΤΗΝ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΕΠΙΒΙΩΣΗ ΜΙΚΤΩΝ ΒΙΟΫΜΕΝΙΩΝ ΑΠΟ PSEUDOMONAS SPP. ΚΑΙ CANDIDA SPP.

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΙΑΤΡΙΚΟ ΤΜΗΜΑ ΤΟΜΕΑΣ ΥΓΕΙΑΣ ΤΟΥ ΠΑΙΔΙΟΥ Γ ΠΑΙΔΙΑΤΡΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΙΩΑΝΝΗΣ Ν. ΤΣΑΝΑΚΑΣ ΠΑΝΕΠ. ΕΤΟΣ Αριθμός 3518 ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΝΕΟΤΕΡΩΝ ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ΚΑΙ ΤΩΝ ΦΑΓΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΤΗΝ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΕΠΙΒΙΩΣΗ ΜΙΚΤΩΝ ΒΙΟΫΜΕΝΙΩΝ ΑΠΟ PSEUDOMONAS SPP. ΚΑΙ CANDIDA SPP. ΧΑΤΖΗΜΟΣΧΟΥ ΑΘΑΝΑΣΙΟΣ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΟ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2016

2 Η ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΕΜΜΑΝΟΥΗΛ ΡΟΗΛΙΔΗΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ THOMAS J. WALSH, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΝΟΡΜΑ ΒΑΒΑΤΣΗ-ΧΡΙΣΤΑΚΗ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Η ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΕΜΜΑΝΟΥΗΛ ΡΟΗΛΙΔΗΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ THOMAS J. WALSH, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΝΟΡΜΑ ΒΑΒΑΤΣΗ-ΧΡΙΣΤΑΚΗ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΙΩΑΝΝΗΣ ΤΣΑΝΑΚΑΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΤΙΜΟΛΕΩΝ ΑΧΙΛΛΕΑΣ ΒΥΖΑΝΤΙΑΔΗΣ, ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΧΑΡΑΛΑΜΠΟΣ ΑΝΤΑΧΟΠΟΥΛΟΣ, ΕΠΙΚ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΕΥΑΓΓΕΛΙΑ ΦΑΡΜΑΚΗ, ΕΠΙΚ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΙΩΑΝΝΗΣ ΤΣΑΝΑΚΑΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΤΙΜΟΛΕΩΝ-ΑΧΙΛΛΕΑΣ ΒΥΖΑΝΤΙΑΔΗΣ, ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΧΑΡΑΛΑΜΠΟΣ ΑΝΤΑΧΟΠΟΥΛΟΣ, ΕΠΙΚΟΥΡΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΓΕΛΙΑ ΦΑΡΜΑΚΗ, ΕΠΙΚΟΥΡΗ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ «Ἡ ἔγκρισις τῆς Διδακτορικῆς Διατριβῆς ὑπὸ τῆς Ἰατρικῆς Σχολῆς τοῦ Ἀριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης δὲν ὑποδηλοῖ ἀποδοχὴν τῶν γνωμῶν τοῦ συγγραφέως». (Νόμος 5343/32, ἄρθρ και ν. 1268/82, ἄρθρ. 50 8)

3 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΕΔΡΟΣ ΤΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΑΛΕΞΑΝΔΡΟΣ - ΑΝΑΣΤΑΣΙΟΣ Δ. ΓΑΡΥΦΑΛΛΟΣ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ ΤΟΜΕΑ ΥΓΕΙΑΣ ΠΑΙΔΙΟΥ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΦΩΤΗΣ ΠΑΠΑΧΡΗΣΤΟΥ

4

5 Στην Κατερίνα

6

7 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1. ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ ΠΡΟΛΟΓΟΣ ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΒΑΚΤΗΡΙΑ ΤΟΥ ΓΕΝΟΥΣ PSEUDOMONAS Ταξινόμηση και μορφολογικά χαρακτηριστικά των βακτηρίων του γένους Pseudomonas Οικολογία και Επιδημιολογία του βακτηρίου P. aeruginosa Παθογένεια και Λοιμογόνοι Παράγοντες Κυστική Ίνωση Αντιψευδομοναδικά Φάρμακα i. Πενικιλλίνες ii. Κεφαλοσπορίνες iii. Αμινογλυκοσίδες iv. Κινολόνες v. Πολυμυξίνες vi. Μακρολίδες ΜΥΚΗΤΕΣ ΤΟΥ ΓΕΝΟΥΣ CANDIDA Μορφολογία και Ταξινόμηση των μυκήτων του γένους Candida Οικολογία και επιδημιολογία του μύκητα C. albicans Παθογένεια και Λοιμογόνοι Παράγοντες Αντιμυκητιακά Φάρμακα i. Αμφοτερικίνη Β ii. Εχινοκανδίνες iii. Αζόλες ΒΙΟΫΜΕΝΙΑ Γενικά Δομή και χαρακτηριστικά των βιοϋμενίων Παράγοντες σχηματισμού βιοϋμενίων Στάδια σχηματισμού των βιοϋμενίων Βιοϋμένια P. aeruginosa Μικτά Βιοϋμένια Μηχανισμοί αντίστασης βιοϋμενίων σε αντιμικροβιακούς παράγοντες i. Πολυσακχαρίτες βιοϋμενίων ii. Δομή βιοϋμενίου

8 iii. Αντλίες εκροής iv. Εμμένοντα κύτταρα (Persister cells) v. Γονίδια βιοϋμενίων Ανοσία και λοιμώξεις που σχετίζονται με βιοϋμένια Μέθοδοι μελέτης των βιοϋμενίων , Σύνηθεις μέθοδοι ανίχνευσης και εκτίμησης ανάπτυξης βιοϋμενίων i. Μέθοδος του σωληναρίου (Tube Method)(155) ii. Μέθοδος πλακών μικροτιτλοποίησης(156) iii. Μέθοδος του ερυθρού του Congo(157) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΣΚΟΠΟΣ ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ Ανάπτυξη μικροοργανισμών: Pseudomonas aeruginosa και Candida albicans Συντήρηση και αναζωπύρωση μικροοργανισμών: Pseudomonas aeruginosa και Candida albicans Παραγωγή βιοϋμενίων Προετοιμασία αντιμικροβιακών παραγόντων Προσδιορισμός ελάχιστων ανασταλτικών συγκεντρώσεων και δράση των αντιμικροβιακών παραγόντων Απομόνωση ανθρώπινων ουδετεροφίλων (PMNs) Μελέτη της συνδυαστικής δράσης PMNs, αντιμικροβιακών φαρμάκων και μικροοργανισμών Ποσοτική δοκιμασία ΧΤΤ Μοριακή ανάλυση γονιδίων που σχετίζονται με την C. albicans ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Παραμετρικές Μέθοδοι ANOVA Εφαρμογή του μαθηματικού μοντέλου Bliss ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Επίδραση πέντε αντιψευδομοναδικών παραγόντων (αμικασίνης, κεφταζιδίμης, σιπροφλοξασίνης, κολιμυκίνης και κλαριθρομυκίνης) σε βιοϋμένια και πλανκτονικά κύτταρα P. aeruginosa Συνδυαστική δράση των ανθρώπινων πολυμορφοπύρηνων με αντιμικροβιακούς παράγοντες έναντι της P. aeruginosa iv. Συνδυαστική δράση αμικασίνης (ΑΜΚ) v. Συνδυαστική δράση κεφταζιδίμης (CEF) vi. Συνδυαστική δράση σιπροφλοξασίνης (CIP)

9 vii. Συνδυαστική δράση κολιμυκίνης (CST) viii. Συνδυαστική δράση κλαριθρομυκίνης (CLAR) Συνδυαστική δράση αντιμυκητιακών παραγοντων έναντι βιοϋμενίων της C. albicans Συνδυαστική δράση αντιμικροβιακών και αντιμυκητιακών παραγοντων έναντι μικτών βιοϋμενίων της P. aeruginosa και της C. albicans Επίδραση αντιμυκητιακών παραγόντων στην έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με την παραγωγή βιουμενίων στην C. albicans ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΠΕΡΙΛΗΨΗ ABSTRACT ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

10 10

11 1. ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ ANID Anidulafungin Ανιδουλαφουγκίνη BF-MIC Biofilm-Minimal Inhibitory Concentration Ελάχιστη ανασταλτική συγκέντρωση του βιοϋμενίου BF Biofilm Βιοϋμένιο CAS Caspofungin Κασποφουγκίνη CLSI Clinical and Laboratory Standard Institute Ινστιτούτο Κλινικών και Εργαστηριακών Προτύπων ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay Ενζυμοσυνδετική ανοσομέθοδος ΗBSS Hanks Buffered Salt Solution Hanks ρυθμιστικό διάλυμα αλάτων MIC Minimal Inhibitory Concentration Ελάχιστη ανασταλτική συγκέντρωση MNC Monocytes Μονοκύτταρα MOPS 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Ρυθμιστικό διάλυμα MH Mueller Hinton Ειδικό θρεπτικό υλικό PL-MIC Planktonic-Minimal Inhibitory Concentration Ελάχιστη ανασταλτική συγκέντρωση των πλανκτονικών κυττάρων PMN Polymorphonuclear Πολυμορφοπύρηνα PSC Posaconazole Ποσακοναζόλη RPMI-1640 Roswell Park Memorial Institute-1640 Ειδικό θρεπτικό υλικό VRC Voriconazole Βορικοναζόλη XTT 2,3-bis[2-methoxy-4-nitro-5-sul- fophenyl]2h-tetrazolium-5- carboxanilide Τετραζολικό άλας (χρωματομετρική αξιολόγηση καταστροφής των μυκήτων) YNB Yeast Nitrogen Base Αζωτούχος βάση ζύμης, θρεπτικό υλικό

12 12

13 2. ΠΡΟΛΟΓΟΣ Τα τελευταία χρόνια, στο χώρο της Ιατρικής, υπάρχει ένα συνεχώς αυξανόμενο ενδιαφέρον για την πολυπλοκότητα των διαδικασιών που διέπουν την ανάπτυξη των βιολογικών υμενίων ή βιοϋμενίων, όπως συχνά αναφέρονται στη διεθνή βιβλιογραφία. Τα βιοϋμένια είναι καλά δομημένες κοινότητες μικροοργανισμών που προσκολλώνται σε μια επιφάνεια μη αντιστρεπτά και περιβάλλονται από αυτo-παραγόμενη εξωκυττάρια ουσία. Σκοπός αυτού του σχηματισμού είναι η προστασία των μικροοργανισμών του βιοϋμενίου από δυσμενείς περιβαλλοντικές συνθήκες και η καλύτερη προσαρμογή τους στο περιβάλλον. Μέσα στο βιοϋμένιο, οι μικροοργανισμοί επικοινωνούν μεταξύ τους μέσω χημικών συστημάτων επικοινωνίας που σε πολλές περιπτώσεις μοιάζουν με κυτταρικά συστατικά ανώτερων πολυκύτταρων οργανισμών. Είναι επίσης γνωστό σήμερα ότι οι μικροοργανισμοί που ζουν στο βιοϋμένιο εκφράζουν ένα ξεχωριστό φαινότυπο που τους διακρίνει από τους αντίστοιχους πλανκτονικούς (ελεύθερους) μικροοργανισμούς. Στη φύση, οι μικροοργανισμοί ζουν κυρίως σε σύνθετες λειτουργικές κοινότητες, οι οποίες αποτελούνται από ένα ή περισσότερα είδη μικροβίων. Παραδείγματα τέτοιων μικτών κοινοτήτων είναι εκείνες που σχηματίζονται από μικροοργανισμούς του είδους Candida spp. και Pseudomonas spp. Τα βιοϋμένια, και ειδικότερα τα μικτά, συχνά σχετίζονται με τη χρήση επεμβατικών ιατρικών εργαλείων (π.χ. ενδοαγγειακοί καθετήρες, προθέσεις, βαλβίδες) ή με χρόνια βλάβη των ιστών, όπως στις περιπτώσεις χρόνιων λοιμώξεων (π.χ. ενδοκαρδίτιδα, χρόνια οστεομυελίτιδα, χρόνια προστατίτιδα κλπ.).

14 Τα βιοϋμένια αποτελούν πλέον μείζον πρόβλημα στην Ιατρική εξαιτίας της αυξημένης αντοχής τους σε πλήθος αντιμικροβιακών παραγόντων αλλά και στα κύτταρα της άμυνας του οργανισμού. Η ικανότητά τους να προκαλούν απειλητικές για τη ζωή ασθένειες με υψηλά ποσοστά θνησιμότητας δημιούργησε επιτακτική ανάγκη για τη μελέτη τους. Σε αντίθεση με τη μεγάλη έρευνα που έχει γίνει πάνω στα μικροβιακά και μυκητιακά βιοϋμένια τα τελευταία χρόνια, η μελέτη των μικτών υμενίων από μύκητες και βακτήρια βρίσκεται ακόμη στα πρώτα της βήματα. Η αντοχή των βιοϋμενίων σε αντιμικροβιακούς παράγοντες είναι γνωστή. Αντίθετα, η συνδυαστική δράση νέων α- ντιμικροβιακών παραγόντων καθώς και η ταυτόχρονη επίδραση των κυττάρων του συστήματος της φυσικής ανοσίας δεν έχει μελετηθεί ακόμη. Σκοπός αυτής της διδακτορικής διατριβής είναι η μελέτη του «άγνωστου κόσμου» των μικτών βιοϋμενίων. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε πειραματικό μοντέλο in vitro, που προσομοίαζε τις in vivo συνθήκες λοίμωξης σε καθετήρες. Τα συμπεράσματα που προέκυψαν από τη συγκεκριμένη μελέτη ήταν πολλά και αξιοσημείωτα. Το σημαντικότερο είναι ότι παρατηρήθηκε αυξημένη δραστικότητα μιας συγκεκριμένης κλάσης αντιμυκητιακών φαρμάκων, των εχινοκανδινών σε σχέση με τις αζόλες στην καταστροφή των βιοϋμενίων. Ένα ακόμη βασικό συμπέρασμα είναι ότι τα βιολογικά υμένια είναι ανθεκτικά και στη δράση των ανθρώπινων φαγοκυττάρων, τα οποία αδυνατούν να φαγοκυτταρώσουν το βιοϋμένιο. Διαπιστώθηκε επίσης, ότι από τους αντιμυκητιακούς παράγοντες που μελετήθηκαν, μόνο η ανιδουλαφουγκίνη είχε αθροιστική αλληλεπίδραση με τα φαγοκύτταρα έναντι των βιοϋμενίων. Επίσης, η συνδυαστική δράση των αντιμικροβιακών παραγόντων με φαγοκύτταρα είχε και συνεργητικά και αρνητικά αποτελέσματα στα μικτά βιοϋμένια. 14

15 Η παρούσα μελέτη διακρίνεται σε δύο μέρη, το Γενικό και το Ειδικό Μέρος. Στο πρώτο μέρος, γίνεται αναλυτική περιγραφή της ταξινόμησης και της μορφολογίας του μύκητα C. albicans καθώς επίσης και του βακτηρίου P. aeruginosa. Δίνεται, επίσης, ο ορισμός των βιοϋμενίων και περιγράφονται τα χαρακτηριστικά τόσο των απλών όσο και των μικτών βιολογικών υμενίων. Στη συνέχεια, γίνεται αναφορά στο ρόλο της φυσικής ανοσίας έναντι των μικτών και των απλών βιοϋμενίων. Το δεύτερο μέρος αφορά το πειραματικό μέρος της μελέτης. Σ αυτό παρουσιάζονται τα υλικά που χρησιμοποιήθηκαν και ο τρόπος παρασκευής τους, οι εργαστηριακές μέθοδοι που εφαρμόστηκαν και η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων. Στη συνέχεια παρουσιάζονται, αναλυτικά, τα αποτελέσματα που προέκυψαν, ξεκινώντας με τα αποτελέσματα της επίδρασης των αντιμικροβιακών παραγόντων στα βιοϋμένια. Ακολουθούν τα αποτελέσματα που προέκυψαν από την επίδραση των ανθρώπινων φαγοκυττάρων και έπειτα, τα αποτελέσματα της συνδυασμένης επίδρασης αντιμικροβιακών παραγόντων και φαγοκυττάρων. Επίσης, παρουσιάζονται και τα αποτελέσματα από τη μοριακή ανάλυση της έκφρασης των γονιδίων που σχετίζονται με τα βιοϋμένια. Στο τέλος, παρουσιάζεται η συζήτηση των αποτελεσμάτων. Στη συζήτηση, τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης συγκρίνονται με σύγχρονα βιβλιογραφικά δεδομένα με στόχο τη εξαγωγή σημαντικών συμπερασμάτων για την ορθή αντιμετώπιση των μικροβιακών βιοϋμενίων. Στο τελευταίο τμήμα της διατριβής παρατίθεται η Περίληψη στην Ελληνική και Αγγλική γλώσσα καθώς και η Βιβλιογραφία. Το σύνολο των πειραμάτων της μελέτης αυτής διενεργήθηκαν στο Ερευνητικό Εργαστήριο Λοιμώξεων της Γ Παιδιατρικής Κλινικής του ΑΠΘ, στο Ιπποκράτειο Νοσοκομείο Θεσσαλονίκης με ιδίους πόρους του Εργαστηρίου Λοιμώξεων, ενώ το μοριακό κομμάτι της χρηματοδοτήθηκε μερικά από τη φαρμακευτική εταιρεία Pfizer. 15

16 Στο σημείο αυτό θα ήθελα να ευχαριστήσω όλους εκείνους που συνέβαλαν στην πραγματοποίηση αυτής της μελέτης. Κυρίως, θα ήθελα να εκφράσω την ευγνωμοσύνη μου στον επιβλέποντα της Διατριβής Καθηγητή κ. Εμμανουήλ Ροηλίδη. Τον ευχαριστώ για την ανάθεση του θέματος, την αδιάκοπη βοήθειά του, τις υποδείξεις του και την επίβλεψή του κατά τη διάρκεια της εκπόνησης της διατριβής. Βαθιά ευγνωμοσύνη θα ήθελα να εκφράσω στην αξιόλογη συνάδελφο και α- κούραστη ερευνήτρια Δρα. Μαρία Σιμιτσοπούλου για την άριστη καθοδήγηση, το συνεχές ενδιαφέρον της και την αμέριστη συμπαράσταση που μου προσέφερε καθ όλη τη διάρκεια των πειραμάτων της διατριβής. Χωρίς τη δική της προσπάθεια, στήριξη αλλά και ανοχή όλα αυτά τα χρόνια η διατριβή αυτή δε θα μπορούσε όχι μόνο να ολοκληρωθεί αλλά και να ξεκινήσει. Η συμμετοχή της, ειδικότερα στο μοριακό κομμάτι της διατριβής, ήταν σημαντικότατη και χάρη σ αυτήν κατάφερε το συγκεκριμένο κομμάτι να ολοκληρωθεί. Ευχαριστώ, επίσης, θερμά τον Καθηγητή κ. Τhomas Walsh, Διευθυντή Ιατρικής Μικροβιολογίας και Ανοσολογίας στο Weill Cornell Medical College της Ν. Υόρκης των Ηνωμένων Πολιτειών, που πίστεψε στην ερευνητική μας προσπάθεια, την αγάπησε και την προώθησε εμπράκτως. Ευχαριστώ, επίσης, θερμά την Καθηγήτρια κ. Βαβάτση-Χριστάκη, μέλος της τριμελούς επιτροπής, για το ενδιαφέρον και την εμπιστοσύνη που έδειξε σε όλα τα στάδια της μελέτης. Ευχαριστώ, επίσης, την Καθηγήτρια και πρώην Διευθύντρια της Γ Παιδιατρικής Κλινικής του ΑΠΘ κ. Θεοδούλη Παπασταύρου-Μαυρουδή αλλά και τον Καθηγητή και νυν Διευθυντή της κ. Ιωάννη Τσανάκα για την ευκαιρία που μου έδωσαν, μαζί με τον 16

17 πρώτο επιβλέποντα, να εκπονήσω τη διδακτορική μου διατριβή στη Γ Παιδιατρική Κλινική του ΑΠΘ στο Ιπποκράτειο Νοσοκομείο. Θα ήθελα ακόμη να ευχαριστήσω τον Επίκουρο Καθηγητή κ. Χαράλαμπο Ανταχόπουλο αλλά και τη Δρα. Ασπασία Κατράγκου για τα πολύτιμα εφόδια ερευνητικής μεθοδολογίας αλλά και τις ατελείωτες ώρες που πέρασαν αναλύοντας τα αποτελέσματα πλήθους πειραμάτων της διατριβής. Εκ βαθέων, επίσης, ευχαριστίες οφείλω στο προσωπικό του Ερευνητικού Εργαστηρίου Λοιμώξεων της Γ Παιδιατρικής Κλινικής του ΑΠΘ και ιδιαίτερα στις τεχνολόγους κ. Ελπινίκη Γεωργιάδου, κ. Θωμαή Κωνσταντίνου και κ. Δανιηλία Κυρπιτζή για την τεχνική υποστήριξη και συνεργασία τους στην ολοκλήρωση των πειραμάτων της διατριβής. Κλείνοντας θα ήθελα να ευχαριστήσω την οικογένειά μου, που με βοήθησε η- θικά και με ενθάρρυνε να συνεχίσω όλα αυτά τα χρόνια. Αθανάσιος Χατζημόσχου Θεσσαλονίκη,

18 18

19 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 19

20 20

21 3. ΒΑΚΤΗΡΙΑ ΤΟΥ ΓΕΝΟΥΣ PSEUDOMONAS Το γένος Pseudomonas ανήκει στα γ-πρωτεοβακτήρια, στην οικογένεια των Pseudomonaceae και περιλαμβάνει 190 περίπου είδη. Μέλη του γένους Pseudomonas εμφανίζουν αξιοσημείωτη ποικιλομορφία, γεγονός που τους επιτρέπει να αποικίζουν διάφορα περιβάλλοντα όπως το χώµα και το νερό. Από αυτά, λίγα είδη (P. aeruginosa, P. fluorescens, P. putida, P. stutzeri, P. mendocina, P. alcaligenes και P. pseudoalgaligenes) παρουσιάζουν ενδιαφέρον για την Κλινική Μικροβιολογία ως αποικιστές του ανθρωπίνου σώματος, ως συμπαράγοντες νόσων ή ως καθαρά παθογόνοι παράγοντες (1). 1. Ταξινόμηση και μορφολογικά χαρακτηριστικά των βακτηρίων του γένους Pseudomonas Τα είδη του γένους Pseudomonas ταξινομήθηκαν προς τα τέλη του 19 ου αιώνα, ενώ η ετυμολογία του ονόματός τους είναι Ψευδή Μονάδα (2). Το γένος των ψευδομονάδων περιγράφηκε από τον Migula το Το τυπικό είδος P. aeruginosa απομονώθηκε για πρώτη φορά από τον άνθρωπο στο «κυανούν πύον» κατά το 1882 από τον Gessard. Αργότερα ο Migula (1895) κατέταξε τον Bacillus pyocyaneus του Gessard στο γένος των ψευδομονάδων υπό το όνομα Pseudomonas pyocyanea. Σήμερα αποκαλείται Pseudomonas aeruginosa προς τιμήν του Schroeter, ο οποίος πρώτος περιέγραψε το μικρόβιο υπό το όνομα Bacterium aeruginosum (1872). Η P. aeruginosa είναι ένα αντιπροσωπευτικό παράδειγμα ευκαιριακού παθογόνου βακτηριδίου για τον άνθρωπο. Αυτό σημαίνει ότι μπορεί να δημιουργήσει μια λοίμωξη εκμεταλλευόμενη οποιαδήποτε εξασθένηση του ανοσοποιητικού συστήματος του ανθρώπινου οργανισμού. Η P. aeruginosa αποτελεί μια από τις συχνότερες αιτίες

22 ενδονοσοκομειακών λοιμώξεων. Το πρόβλημα των λοιμώξεων αυτών συνεχώς μεγεθύνεται εξαιτίας της αυξανόμενης αντοχής του βακτηρίου στα αντιβιοτικά, που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την αντιμετώπιση των ψευδομοναδικών λοιμώξεων, όπως παρατηρείται από τις σύγχρονες μελέτες. Η ανακάλυψη και εφαρμογή των αντιβιοτικών στη θεραπεία των λοιμώξεων αποτέλεσε σταθμό της ιατρικής επιστήμης. Παράλληλα, όμως, ξεκίνησε και η μελέτη της μικροβιακής αντοχής η οποία αποτελεί σοβαρό εμπόδιο στην αποτελεσματική θεραπεία. Η συνεχής και απεριόριστη χρήση κάθε νέας αντιμικροβιακής ουσίας έχει ως φυσική συνέπεια την ανάπτυξη μικροβιακής αντοχής. Επομένως, αποτελεί πλέον επιτακτική ανάγκη η συνεχής επιτήρηση αλλά και η διερεύνηση των μηχανισμών αυτής. Η P. aeruginosa είναι ένα αποκλειστικά αερόβιο Gram-αρνητικό βακτήριο (Εικόνα 1). Δεν έχει έλυτρο, ούτε σχηματίζει σπόρους. Το μέγεθός της ποικίλλει από 1.5-3μm και κινείται με τη βοήθεια ενός πολικού μαστιγίου. Το κυτταρικό της τοίχωμα α- ποτελείται από λεπτό στρώμα πεπτιδογλυκάνης. Εξωτερικά περιβάλλεται από τρεις αλλεπάλληλες στοιβάδες: 1. Λιποπρωτεΐνη: αποτελεί συνδετικό κρίκο ανάμεσα στο στρώμα πεπτιδογλυκάνης και την εξωτερική μεμβράνη. 2. Εξωτερική μεμβράνη: αποτελείται από πόρους, που σχηματίζονται από ειδικές πρωτεΐνες, τις πορίνες και επιτρέπουν τη διέλευση μορίων μικρού μοριακού βάρους. 3. Λιποπολυσακχαρίτες: αποτελεί το σωματικό Ο αντιγόνο. 22

23 Εικόνα 1: Βακτήρια του γένους Pseudomonas και συγκεκριμένα, P. aeruginosa (3) 2. Οικολογία και Επιδημιολογία του βακτηρίου P. aeruginosa Η P. aeruginosa, όπως αναφερθηκε ήδη, είναι ένα Gram-αρνητικό βακτήριο. Ό- πως και άλλα μέλη του γένους, η P. aeruginosa ζει ελεύθερη και συχνά συναντάται στο έδαφος και στο νερό. Ωστόσο, παρατηρείται συχνά στις επιφάνειες των φυτών και περιστασιακά στα ζώα. Γενικά, προτιμά περιβάλλον με υγρασία. Αντέχει και ζει στο νερό για πολλούς μήνες. Διατηρείται και πολλαπλασιάζεται στις μικρές υγρές συλλογές και στις υγρές επιφάνειες, στα διάφορα θεραπευτικά υγρά, ακόμη και στα διαλύματα των περισσοτέρων αντισηπτικών ουσιών (4, 5). Ενίοτε αποικίζει το δέρμα, το έξω αυτί, τις ανώτερες αναπνευστικές οδούς και το παχύ έντερο υγιών ανθρώπων. Έχει απομονωθεί από πτύελα και κόπρανα ατόμων, που δεν έχουν νοσηλευτεί σε ποσοστό 5% και 3%, αντίστοιχα. Το ποσοστό απομόνωσης της P. aeruginosa στα κόπρανα, μετά από παραμονή 72 ωρών των ασθενών σε νοσοκομείο, ανέρχεται σε 20% (6). Τα ποσοστά φορείας 23

24 είναι χαμηλά, εκτός από τους ανοσοκατεσταλμένους ασθενείς με σοβαρή υποκείμενη νόσο ή τους ασθενείς που υποβάλλονται σε αγωγή με αντιβιοτικά ή έχουν εκτεθεί στο νοσοκομειακό περιβάλλον (5,13,14). Κάτω από αυτές τις συνθήκες, ο αποικισμός από την P. aeruginosa συχνά προηγείται της λοίμωξης. Ταυτόχρονα, οι παράγοντες που προδιαθέτουν τον αποικισμό αυξάνουν τις πιθανότητες της λοίμωξης. Η P. aeruginosa είναι υπεύθυνη για το 10% όλων των Gram-αρνητικών συστηματικών λοιμώξεων και η αιτία μετάδοσης του μικροοργανισμού στους ασθενείς είναι τα μολυσμένα αντικείμενα ή τα χέρια του νοσηλευτικού προσωπικού (7). Θα πρέπει να γίνει αντιληπτό ότι η P. aeruginosa είναι ένα δυνητικά θανατηφόρο παθογόνο βακτήριο που προκαλεί λοιμώξεις με ιδιαίτερα υψηλά ποσοστά θνησιμότητας σε νοσοκομειακούς ασθενείς. Ενοχοποιείται για το θάνατο ασθενών με βακτηριαιμίες σε ποσοστό 34%, ουδετεροπενικών ασθενών με βακτηριαιμίες σε ποσοστό 50%, ασθενών με βακτηριαιμική νοσοκομειακή πνευμονία κατά 45% και σε ποσοστό 69% για το θάνατο ασθενών με πνευμονία, οι οποίοι υποστηρίζονται μηχανικά (8-10). Η αυξημένη θνησιμότητα αποδίδεται: α. στην παραγωγή του βλεννώδους εξωπολυσακχαρίτη που παρέχει προστασία στο βακτήριο από τους ανοσιακούς μηχανισμούς του ξενιστή, β. στην παραγωγή από το βακτήριο μεγάλης ποικιλίας ενζύμων και τοξινών που είναι υπεύθυνα για την καταστροφή των ιστών του ξενιστή και την εισβολή της ψευδομονάδας, γ. στην ευπάθεια των ανοσοκατεσταλμένων ασθενών, όπως αυτών με εγκαύματα, κυστική ίνωση, προσθετικές καρδιακές βαλβίδες, παροχετεύσεις, τραχειοστομία, διάφορα υποκείμενα νοσήματα, και δ. στην παγκόσμια εμφάνιση πολυανθεκτικών νοσοκομειακών επιδημικών κλώνων (9, 11). Επίσης, η εμφάνιση ανθεκτικών 24

25 στελεχών κατά τη διάρκεια της θεραπείας συνδέεται με αύξηση της θνησιμότητας, υ- ψηλότερο ποσοστό δευτεροπαθούς βακτηριαιμίας, αύξηση του χρόνου παραμονής του ασθενή στο νοσοκομείο και φυσικά αύξηση του κόστους νοσηλείας (12). 3. Παθογένεια και Λοιμογόνοι Παράγοντες Η πολυμορφία των νοσημάτων που οφείλονται στην P. aeruginosa και το πλήθος των λοιμογόνων παραγόντων που συνθέτει αποδεικνύουν την πολυπλοκότητα της παθογένεσης των λοιμώξεων από το βακτήριο αυτό. Η P. aeruginosa είναι ένα ευκαιριακά παθογόνο βακτήριο που προκαλεί σοβαρές λοιμώξεις στον άνθρωπο κάτω από ορισμένες συνθήκες, όπως για παράδειγμα, όταν παραβιαστούν και παρακαμφθούν οι φυσιολογικοί δερματικοί ή βλεννογόνιοι φραγμοί (π.χ. μετά από έγκαυμα, διεισδυτικό τραύμα, χειρουργική επέμβαση, ενδοτραχειακή διασωλήνωση, καθετηριασμό της ουροδόχου κύστης ή ενδοφλέβια χρήση ναρκωτικών), όταν διαταραχθούν οι ανοσολογικοί αμυντικοί μηχανισμοί (π.χ. ουδετεροπενία λόγω χημειοθεραπείας, υπογαμασφαιριναιμία, ακραίες ηλικίες, σακχαρώδης διαβήτης, κυστική ίνωση, καρκίνος ή AIDS), ό- ταν η προστατευτική λειτουργία της φυσιολογικής μικροβιακής χλωρίδας έχει διαταραχθεί από αντιβιοτική θεραπεία ευρέως φάσματος ή/και όταν ο ασθενής έχει εκτεθεί σε δεξαμενή του μικροοργανισμού που έχει σχέση με το νοσοκομειακό περιβάλλον. Η ευρεία διάδοση του μικροοργανισμού, οι ελαστικές διαιτητικές και μεταβολικές απαιτήσεις του, η προσαρμοστικότητά του στο περιβάλλον και η σχετική αντοχή του στα αντιβιοτικά εξηγούν τη συχνότητα και την επιτυχία των εμφανίσεών του ως ευκαιριακού παθογόνου. Η έναρξη των λοιμώξεων που προκαλεί η P. aeruginosa συνήθως γίνεται με την προσκόλληση του βακτηρίου και με τον αποικισμό του δέρματος ή των βλεννογόνων, 25

26 ο οποίος συνεχίζεται με την τοπική εισβολή των βακτηρίων και με βλάβες των υποκείμενων ιστών. Η διεργασία αυτή μπορεί να συνεχιστεί με εισβολή στην κυκλοφορία του αίματος, διασπορά, σύνδρομο συστηματικής φλεγμονώδους αντίδρασης, δυσλειτουργία πολλών οργάνων και τελικά το θάνατο. Η λοίμωξη μπορεί να παραμείνει ανατομικά εντοπισμένη ή να εξαπλωθεί με άμεση επέκταση σε παρακείμενους ιστούς. Ο μικροοργανισμός και τα προϊόντα του μπορούν να προκαλέσουν βλάβη στους ιστούς στις πρωτογενείς και δευτερογενείς εστίες της λοίμωξης, ενώ η απελευθέρωση τοξινών, που δρουν συστηματικά ή διαμεσολαβητικά για τη φλεγμονή στον προσβεβλημένο ξενιστή, μπορεί να συμβάλουν αμέσως ή εμμέσως στην εμφάνιση σηπτικού συνδρόμου. Ορισμένοι από τους παράγοντες που ευθύνονται για την τοξικότητα και την παθογενετικότητα διαφόρων στελεχών της P. αeruginosa είναι: τα ινίδια, η επιφανειακή βλέννη, οι τοξίνες, οι αιμολυσίνες και οι πρωτεάσες. Όσον αφορά το αναπνευστικό σύστημα, η προσκόλληση της P. aeruginosa γίνεται αρχικά στο επιθήλιο με τη βοήθεια ινιδίων του βακτηρίου και της επιφανειακής βλέννης που παράγεται από βλεννώδη στελέχη. Η επιφανειακή αυτή βλέννη λειτουργεί ως παράγοντας προσήλωσης, ως αντιφαγοκυτταρικός παράγοντας αλλά κυρίως η παρουσία της είναι σημαντική για την επιβίωση της ψευδομονάδας σε υδατικό περιβάλλον. Με τη συμβολή της μοριακής ανάλυσης έχει αναθεωρηθεί η ταξινόμηση των ειδών της Pseudomonas και πολλά είδη έχουν κατανεμηθεί σε νέα γένη όπως Burkholderia, Brevundimonas, Comamonas, Chryseobacterium, Flavobacterium, Methylobacterium, Shewanella, Sphingobacterium και Stenotrophomonas. Όλα τα παραπάνω γένη α- 26

27 νήκουν στην οικογένεια Pseudomonadaceae (Πίνακας 1) και κατατάσσονται σε 5 ομάδες με βάση την ομολογία του rrna τους. Κάθε ομάδα περιλαμβάνει υποομάδες σύμφωνα με την ομολογία του DNA των μελών της (5). Το γένος Pseudomonas αποτελεί την rrna ομάδα Ι και περιλαμβάνει 3 επιμέρους ομάδες: την ομάδα fluorescent, την ομάδα stutzeri και την ομάδα alcaligenes. Ομάδα fluorescent: τα μέλη της χαρακτηρίζονται από την ικανότητα να παράγουν τη χρωστική πυοβερντίνη, η οποία φθορίζει κάτω από υπεριώδες φως με μήκος κύματος 400nm. Από τα τρία είδη της ομάδας μόνο η P. aeruginosa παράγει τη χαρακτηριστική κυανή, υδατοδιαλυτή χρωστική πυοκυανίνη. Ομάδα stutzeri: κύριο χαρακτηριστικό της είναι η ικανότητα των μελών της να αναπτύσσονται αναερόβια σε υλικά που περιέχουν νιτρικά άλατα παράγοντας οξείδιο του αζώτου. Ομάδα alcaligenes: περιλαμβάνει είδη που δεν μπορούν να διασπάσουν τη γλυκόζη σε υλικό οξείδωσης ζύμωσης της γλυκόζης (Oxidative - Fermentative glucose medium) (13, 14). 27

28 Πίνακας 1: Ταξινόμηση της οικογένειας Pseudomonadaceae Τα διάφορα είδη του γένους Pseudomonas εμφανίζουν τα παρακάτω χαρακτηριστικά: ραβδόμορφα αρνητικά κατά Gram με ένα ή περισσότερα μαστίγια αερόβια μη σπορογόνα 4. Κυστική Ίνωση Η Κυστική Ίνωση (ΚΙ, Cystic Fibrosis στα Αγγλικά) είναι η πιο συχνή, παγκοσμίως, κληρονομική νόσος της λευκής φυλής, που προκαλείται από τη μετάλλαξη ενός γονιδίου του εβδόμου χρωμοσώματος (CTFR- CF transmembrane conductance regula- 28

29 tor gene) και προσβάλλει πολλά ζωτικά όργανα και συστήματα του ανθρώπινου οργανισμού. Το συγκεκριμένο γονίδιο είναι υπεύθυνο για την παραγωγή μιας πρωτεΐνης (CFTR - Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator) που ελέγχει τη διέλευση του χλωρίου από τις μεμβράνες των επιθηλιακών κυττάρων διαφόρων οργάνων του σώματος, όπως των πνευμόνων, του παγκρέατος, των ιδρωτοποιών αδένων και του εντέρου. Η δυσλειτουργία του γονιδίου έχει ως συνέπεια την προβληματική παραγωγή ή λειτουργία της πρωτεΐνης, με αποτέλεσμα στα διάφορα όργανα να παράγεται από το επιθήλιο παχύρρευστη και κολλώδης βλέννη, που αποφράσσει τους πόρους των αδένων ή των αγωγών που υπάρχουν σε αυτά. Για παράδειγμα, στους πνεύμονες η βλέννη αποφράσσει τους αεραγωγούς με συνέπεια συχνές μικροβιακές λοιμώξεις και ανοσολογικές αντιδράσεις, που οδηγούν στην έκκριση περισσότερης βλέννης, που ευνοεί με τη σειρά της την εγκατάσταση μικροβίων (15). Η κακή πρόγνωση και η επικείμενη θνησιμότητα οφείλονται κατά κύριο λόγο σε εμμένουσες μικροβιακές λοιμώξεις και μειωμένη αντίδραση της άμυνας εναντίον των παθογόνων μικροοργανισμών κυρίως στους πνεύμονες (16). Παρόλο που από τους πνεύμονες ασθενών με ΚΙ μπορούν να απομονωθούν πλήθος μικροοργανισμών, ω- στόσο κυριαρχούν συγκεκριμένα μόνο βακτήρια όπως P. aeruginosa, Staphylococcus aureus, Burkholderia cepacia, Haemophilus influenzae, Stenotrophomonas maltophilia και Achromobacter xylosoxidans (17-19). Απο τους παραπάνω μικροοργανισμούς ο ρόλος της P. aeruginosa έχει μελετηθεί περισσότερο από τους υπόλοιπους καθώς ο συγκεκριμένος μικροοργανισμός σχετίζεται με αυξημένη ανθεκτικότητα σε αντιβιοτικά και τη δημιουργία βιοϋμενίων (16, 20, 21) καθώς και με μείωση της αναπνευστικής λειτουργίας των ασθενών. 5. Αντιψευδομοναδικά Φάρμακα Αντιβιοτικά με αντιψευδομοναδική δράση υπάγονται στις β-λακτάμες (πενικιλλίνες, κεφαλοσπορίνες γ και δ γενιάς, μονοβακτάμες, καρβαπενέμες), στις αμινογλυκοσίδες, στις κινολόνες και στις πολυμυξίνες. 29

30 i. Πενικιλλίνες Στην κατηγορία αυτή ανήκουν δύο βασικές ομάδες, οι οποίες έχουν μελετηθεί και εφαρμοστεί θεραπευτικά, οι καρβοξυπενικιλλίνες, που περιλαμβάνουν την τικαρκιλλίνη, και οι ουρεϊδοπενικιλλίνες, που περιλαμβάνουν την πιπερακιλλίνη. Η τικαρκιλλίνη παρουσιάζει υψηλή αντοχή, η οποία δεν επιτρέπει τη χρήση της σε εμπειρική θεραπεία. Οι ουρεϊδοπενικιλλίνες θεωρούνται πενικιλλίνες τέταρτης γενιάς και χορηγούνται ενδομυϊκά και ενδοφλέβια. Οι αντιψευδομοναδικές πενικιλλίνες περνούν ελάχιστα στις βρογχικές εκκρίσεις, γεγονός που πρέπει να λαμβάνεται σοβαρά υπόψη στη θεραπεία πνευμονικών λοιμώξεων, ιδιαίτερα σε ασθενείς με κυστική ίνωση. Επίσης, για την αντιμετώπιση λοιμώξεων που οφείλονται σε ψευδομονάδες, μπορεί να χορηγηθούν αντιψευδομοναδικές πενικιλλίνες συνδυαστικά με αναστολείς β-λακταμασών, όπως πιπερακιλλίνη-ταζομπακτάμη και τικαρκιλλίνη-κλαβουλανικό οξύ. Ο συνδυασμός τικαρκιλλίνη-κλαβουλανικό οξύ δεν είναι ιδιαίτερα αποδοτικός, σε αντίθεση με το συνδυασμό πιπερακιλλίνη-ταζομπακτάμη, γιατί το κλαβουλανικό οξύ επάγει την παραγωγή AmpC κεφαλοσπορινάσης από την P. aeruginosa (22). ii. Κεφαλοσπορίνες Έχουν αναπτυχθεί δύο κατηγορίες κεφαλοσπορινών με αντιψευδομοναδική δράση. Στην πρώτη κατηγορία ανήκουν οι κεφαλοσπορίνες 3ης γενιάς, όπως η κεφταζιδίμη και η κεφοπεραζόνη. Η κεφταζιδίμη αποτελεί την πιο δραστική κεφαλοσπορίνη έναντι της P. aeruginosa. Η κεφοπεραζόνη φαίνεται να έχει παρόμοια αντιψευδομοναδική δράση με την πιπερακιλλίνη. Στη δεύτερη ομάδα ανήκουν οι κεφαλοσπορίνες 4ης 30

31 γενιάς, όπως η κεφεπίμη και η κεφπιρόμη. Όλα τα αντιβιοτικά που ανήκουν στην ο- μάδα αυτή εμφανίζουν ευρύ φάσμα δράσης που περιλαμβάνει αερόβια και αναερόβια βακτήρια, όπως και την P. aeruginosa. iii. Καρβαπενέμες Οι καρβαπενέμες κατέχουν το ευρύτερο φάσμα αντιμικροβιακής δράσης ανάμεσα στα β-λακταμικά αντιβιοτικά. Συνήθως δεν παρατηρείται διασταυρούμενη α- ντοχή ανάμεσα στις καρβαπενέμες και τις υπόλοιπες ομάδες αντιμικροβιακών. Αντίθετα από τα υπόλοιπα β-λακταμικά αντιβιοτικά, τα οποία έχουν ως αρχικό στόχο την πενικιλλινοδεσμευτική πρωτεΐνη 3 (PBP-3) του βακτηριακού τοιχώματος, οι καρβαπενέμες, ιμιπενέμη και μεροπενέμη, στοχεύουν στις πενικιλλινοδεσμευτικές πρωτεΐνες 2 και 1 ή 2 και 3 με αποτέλεσμα την ταχεία λύση του βακτηριακού κυττάρου. Η ιμιπενέμη και η μεροπενέμη έχουν παρόμοια φαρμακοκινητική με σχεδόν ίδιες συγκεντρώσεις σε διάφορους ιστούς και υγρά του οργανισμού. Μοναδική, αλλά αξιοσημείωτη εξαίρεση αποτελεί η αδρανοποίηση της ιμιπενέμης, όχι όμως και της μεροπενέμης, από τη νεφρική αφυδροπεπτιδάση. Το γεγονός αυτό αντιμετωπίζεται με την παράλληλη χορήγηση σιλαστατίνης με την ιμιπενέμη. Έχει διαπιστωθεί ότι νεότερες καρβαπενέμες, ό- πως η μπιαπενέμη και η πανιπενέμη, έχουν ισχυρότερη δραστικότητα in vitro έναντι της P. aeruginosa, συμπεριλαμβάνοντας και στελέχη ανθεκτικά στην ιμιπενέμη και τη μεροπενέμη. Η ντοριπενέμη αποτελεί μια νέα καρβαπενέμη, οι ιδιότητες της οποίας είναι παρόμοιες με τη μεροπενέμη, αλλά με ισχυρότερη in vitro δραστικότητα έναντι της P. aeruginosa. Για την εδραίωση της αποτελεσματικότητάς της και της ασφάλειάς της για τη χορήγησή της για την αντιμετώπιση σοβαρών νοσοκομειακών λοιμώξεων α- παιτούνται κλινικές μελέτες (22-24). 31

32 iv. Αμινογλυκοσίδες Οι αμινογλυκοσίδες αποτελούν σημαντικό όπλο για την αντιμετώπιση των ψευδομοναδικών λοιμώξεων γιατί έχουν βασικά πλεονεκτήματα. Η εξαιρετική και ταχεία βακτηριοκτόνος δράση τους, που εξαρτάται από τη συγκέντρωση, αποτελεί καθοριστικό παράγοντα για την πρόγνωση σοβαρών λοιμώξεων σε ουδετεροπενικούς ασθενείς ή σε απειλητικές για τη ζωή νοσοκομειακές λοιμώξεις των μονάδων εντατικής θεραπείας. Όταν συνδυάζονται με αντιψευδομοναδικές πενικιλλίνες και κεφαλοσπορίνες, τόσο in vitro όσο και in vivo παρουσιάζουν συνεργική δράση. Αξιοσημείωτο είναι το γεγονός ότι δεν παρουσιάζουν το φαινόμενο του ενοφθαλμισμού κατά τον εργαστηριακό έλεγχο της αντιμικροβιακής τους δράσης. Τα μειονεκτήματα είναι ίδια για όλες τις αμινογλυκοσίδες, και αυτά είναι η νεφροτοξικότητα, η ωτοτοξικότητα, ο νευρομυϊκός αποκλεισμός και η φτωχή κινητικότητα στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό, σε τμήματα του οφθαλμού και στον προστάτη. Τέλος, in vivo παρατηρείται αδρανοποίηση σε υψηλή συγκέντρωση πενικιλλινών και κεφαλοσπορινών. Κυριότεροι εκπρόσωποι της κατηγορίας αυτής είναι η αμικασίνη, η γενταμυκίνη και η τομπραμυκίνη (22-24). v. Κινολόνες Ανάμεσα στις διαθέσιμες φλουοροκινολόνες, η σιπροφλοξασίνη παρουσιάζει τη μεγαλύτερη δραστικότητα ενάντια στην P. aeruginosa. Συνεργική ή αθροιστική δράση με αμικασίνη ή αντιψευδομοναδικές β-λακτάμες, συμπεριλαμβανομένης και της ιμιπενέμης, έχει αναφερθεί σε ποσοστό μικρότερο από 50% στις P. aeruginosa που ελέγχθηκαν in vitro. Ανάμεσα στις νεότερες κινολόνες (πχ. λεβοφλοξασίνη, λομεφλοξα- 32

33 σίνη, ρουφλοξασίνη, γκρεπαφλοξασίνη, μοξιφλοξασίνη, γκατιφλοξασίνη, σπαρφλοξασίνη, κλιναφλοξασίνη και τροβαφλοξασίνη) έχει διαπιστωθεί ότι μόνο οι 2 τελευταίες παρουσιάζουν αντιψευδομοναδική δράση, ενώ οι υπόλοιπες έχουν ενδιάμεση ή φτωχή δραστικότητα (22-24). vi. Πολυμυξίνες Οι πολυμυξίνες είναι μια ομάδα πολυπεπτιδικών αντιβιοτικών, που περιλαμβάνει 5 διαφορετικές χημικές ενώσεις (πολυμυξίνες Α-Ε). Μόνο η πολυμυξίνη Β και η πολυμυξίνη Ε (κολιμυκίνη) έχουν χρησιμοποιηθεί στην κλινική πράξη. Η κολιστίνη παρουσιάζει εξαιρετική βακτηριοκτόνο δράση ενάντια στην P. aeruginosa (25). vii. Μακρολίδες Οι μακρολίδες εμφανίζουν αντιφλεγμονώδη δράση στους ανοσιακούς μηχανισμούς. Στην ομάδα αυτή ανήκουν οι ουσίες ερυθρομυκίνη, σπιραμυκίνη και τα νεώτερα μακρολίδια κλαριθρομυκίνη, ροξιθρομυκίνη, αζιθρομυκίνη, μιντεκαμυκίνη και τελιθρομυκίνη. Η κλαριθρομυκίνη ασκεί την αντιμικροβιακή της δράση συνδεόμενη με τις ριβοσωμιακές υπομονάδες 50S των ευαίσθητων μικροβίων και καταστέλλει τη σύνθεση των πρωτεϊνών. Η κλαριθροµυκίνη είναι ένα αντιβιοτικό που χρησιµοποιείται για τη θεραπεία ποικίλλων διαφορετικών λοιµώξεων. Αυτές περιλαµβάνουν λοιµώξεις του δέρµατος και των µαλακών ιστών ή του αναπνευστικού συστήµατος (στη µύτη, στο λαιµό, στο θώρακα, στους πνεύµονες)(5). Μακρολίδες, που χορηγούνται από το στόμα, έχουν δείξει ότι βοηθούν σημαντικά στην βελτίωση της λειτουργίας των πνευμόνων ασθενών με ΚΙ επηρεάζοντας την 33

34 ικανότητα των μικροοργανισμών να σχηματίζουν βιοϋμένια χάρη στην αντιφλεγμονώδη δράση τους και τις αντιοξειδοτικές τους ικανότητες (26-28). Συνοψίζοντας, η επιλογή αντιβιοτικού με αντιψευδομοναδική δράση περιλαμβάνει αμινογλυκοσίδες (π.χ. αμικακίνη), ορισμένες κεφαλοσπορίνες τρίτης γενιάς (π.χ. κεφταζιδίμη, κεφοπεραζόνη), ορισμένες πενικιλλίνες εκτεταμένου φάσματος (π.χ. τικαρκιλλίνη/ κλαβουλανικό, πιπερακιλλίνη/ ταζοβακτάμη, μεζλοκιλλίνη, αζλοκιλλίνη), καρβαπενέμες (π.χ. ιμιπενέμη, μεροπενέμη), μονοβακτάμες (π.χ. αζτρεονάμη) και φθοριοκινολόνες (π.χ. σιπροφλοξασίνη, οφλοξασίνη, νορφλοξασίνη). Πρέπει να αναφερθεί ότι σε ορισμένες περιπτώσεις, τα διάφορα μέλη μιας συγκεκριμένης τάξης αντιβιοτικών δεν είναι πάντοτε ισότιμα στη θεραπεία των λοιμώξεων από P. aeruginosa. Αυτό οφείλεται στην ποικιλία της αντιμικροβιακής δραστικότητας τους εναντίον της P. aeruginosa ή των ιδιαίτερων φαρμακοκινητικών ιδιοτήτων τους. Για παράδειγμα, η σιπροφλοξασίνη παρουσιάζει υψηλότερη αποτελεσματικότητα σε in vitro μελέτες εναντίον πολλών κλινικών στελεχών της P. aeruginosa από τις υπόλοιπες φθοριοκινολόνες. Αντίθετα, ο- ρισμένα πολυανθεκτικά στελέχη της P. aeruginosa εμφανίζουν συνδυαστική δράση σε αντιβιοτικά διαφορετικών τάξεων. Άρα, οι τοπικοί τύποι ανθεκτικότητας στα αντιβιοτικά πρέπει να κατευθύνουν την αρχική επιλογή αντιβιοτικού, ενώ η οριστική αντιβιοτική θεραπεία θα πρέπει να καθορίζεται μετά τον προσδιορισμό της ευαισθησίας του συγκεκριμένου λοιμογόνου στελέχους. Στις περισσότερο σοβαρές και απειλητικές για τη ζωή λοιμώξεις από P. aeruginosa πρέπει να γίνεται συγχορήγηση δύο αντιβιοτικών, στα οποία το μολυσματικό στέλεχος παρουσιάζει ευαισθησία. Συνήθως, χρησιμοποιείται ο συνδυασμός αμινογλυκοσίδης και β-λακταμικού αντιβιοτικού. Στόχοι της συνδυασμένης θεραπείας είναι να επιτευχθεί αθροιστική ή συνεργική βακτηριοκτόνος δράση, 34

35 να αξιοποιηθούν οι φαρμακολογικές δυνατότητες και να αντισταθμιστούν οι φαρμακολογικοί περιορισμοί του κάθε φαρμάκου, ώστε να προληφθεί η εμφάνιση αντοχής στα αντιβιοτικά. 4. ΜΥΚΗΤΕΣ ΤΟΥ ΓΕΝΟΥΣ CANDIDA Οι μύκητες αποτελούν ένα ξεχωριστό βασίλειο από τα 5 των έμβιων όντων που περιλαμβάνει μονοκύτταρους ή πολυκύτταρους ευκαρυωτικούς οργανισμούς. Οι μύκητες εμφανίζουν τεράστια ποικιλία και υπάρχουν παντού. Οι περισσότεροι συναντιώνται στο έδαφος και τα φυτά και διατρέφονται από οργανικά συστατικά ζώντων ή νεκρών οργανισμών γι' αυτό και θεωρούνται το "βιολογικό εργαστήριο αποδόμησης των οργανικών ουσιών". Οι μύκητες θα μπορούσαν να διακριθούν σε ωφέλιμους και μη ωφέλιμους. Οι ωφέλιμοι μύκητες παράγουν αντιβιοτικά, ένζυμα και παρασιτοκτόνα, βοηθούν στην α- ποσύνθεση, στον καθαρισμό των θαλάσσιων υδάτων από το πετρέλαιο και συμμετέχουν στη βιομηχανία τροφίμων και ποτών. Οι μη ωφέλιμοι μύκητες συμμετέχουν στην καταστροφή ιστών και προκαλούν αλλεργίες και λοιμώξεις. Οι λοιμώξεις από μύκητες έχουν συγκεντρώσει μεγάλο ενδιαφέρον λόγω της αυξημένης συχνότητάς τους στους ανοσοκατασταλμένους ασθενείς. Μύκητες του γένους Candida είναι τα συχνότερα μυκητιακά παθογόνα. 1. Μορφολογία και Ταξινόμηση των μυκήτων του γένους Candida Οι μύκητες είναι ευκαρυωτικοί οργανισμοί και τα κύτταρα τους έχουν τουλάχιστον έναν πυρήνα. Περιβάλλονται εκτός από την κυτταρική τους μεμβράνη και από 35

36 κυτταρικό τοίχωμα. Η κυτταρική μεμβράνη τους περιέχει στερόλες και όχι πεπτιδογλυκάνες. Το κυτταρικό τοίχωμα αποτελείται από πολυσακχαρίτες, γλυκοπρωτεΐνες και λιπίδια. Στο κυτταρόπλασμα εντοπίζονται μιτοχόνδρια, ενδοπλασματικό δίκτυο και σωματίδια Golgi (16, 17). Οι μύκητες κατατάσσονται σε δύο βασικές κατηγορίες: α. ζυμομύκητες (yeasts) με κύριο εκπρόσωπο: Candida και β. νηματοειδείς μύκητες (moulds) με κύριους εκπροσώπους τους: Aspergillus, Zygomycetes, Fusarium, Scedosporium και Τrichophyton. Οι ζυμομύκητες έχουν σφαιρικό ή ελλειψοειδές σχήμα και πολλαπλασιάζονται με σχηματισμό εκβλαστήσεων (budding). Οι μύκητες του γένους Candida είναι μια ιδιαίτερα ετερογενής ομάδα οργανισμών που εμφανίζονται με διάφορες μορφές. Η συχνότερη μορφή, η οποία συναντάται είτε μετά από καλλιέργεια κλινικού δείγματος είτε κατά την άμεση μικροσκόπηση από συγκεκριμένες συνθήκες, όπως στη θερμοκρασία των 37 C του ανθρώπινου σώματος, απαντάται και ως πολυκύτταρος οργανισμός και παράγει ψευδοϋφές, δηλαδή αλυσίδα κυττάρων, τα οποία δεν αποχωρίζονται, αλλά μένουν ενωμένα μεταξύ τους. υφές ψευδοϋφές μονοκύτταρος μύκητας Εικόνα 2: Οι διαφορετικές μορφές της Candida albicans (29, 30). 36

37 Όταν οι συνθήκες του περιβάλλοντος όπου αναπτύσσονται είναι δυσμενείς επί των ψευδοϋφών παράγονται και ανθεκτικά σπόρια, που ονομάζονται χλαμυδοσπόρια. Η Candida albicans και η Candida dubliniensis σχηματίζουν επιπλέον και πραγματικές υφές (hyphae). Επομένως, τα δύο αυτά είδη θεωρούνται πολυμορφικά (31) (Εικ. 2). H C. αlbicans περιβάλλεται από ένα κυτταρικό τοίχωμα που αποτελείται από μαννοπρωτεΐνες, που αποτελούν το 35-40% της βιομάζας του κυτταρικού τοιχώματος, τη β-1,3-γλυκάνη, βασικό πολυσακχαρίτη, τη β-1,6-γλυκάνη και ένα μικρό ποσοστό χιτίνης. Το κυτταρικό τοίχωμα είναι απαραίτητο για την επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό της C. albicans. Το κυτταρικό τοίχωμα της C. albicans αποτελείται από μια εσωτερική στιβάδα που περιβάλλεται εξωτερικά από μια ινιδώδους υφής πρωτεϊνική στιβάδα. Αυτή η αρχιτεκτονική του κυτταρικού τοιχώματος αποτρέπει την αναγνώριση της β- 1,3-γλυκάνης από τον υποδοχέα της δεκτίνης-1 του συστήματος της φυσικής ανοσίας, κάνοντας την αντιμετώπιση της ακόμα πιο δύσκολη και επίπονη (32, 33). Η εφαρμογή της μοριακής φυλογενετικής αποτέλεσε ένα σημαντικό βήμα στην βελτίωση και τελειοποίηση του συστήματος ταξινόμησης των μυκήτων. Εξαιτίας των διάφορων προβλημάτων των παραδοσιακών συστημάτων ταξινόμησης, αρκετοί ερευνητές εφαρμόζουν μοριακές τεχνικές ταξινόμησης. Η τεχνική που αποδείχθηκε πιο χρήσιμη στον επακριβή καθορισμό των φυλογενετικών σχέσεων μεταξύ των διαφόρων ειδών Candida (Εικ. 3), είναι αυτή που αφορά τη σύγκριση νουκλεοτιδικών αλληλουχιών που κωδικοποιούν rrna γονίδια (34). 37

38 Εικόνα 3: Ένα φυλογενετικο δεντρο της C. albicans βασισμένο στο γονίδιο που κωδικοποιεί το rrna της μεγάλης υπομονάδας (Κλίμακα: 0, 01nt)(35). 2. Οικολογία και επιδημιολογία της C. albicans Τα τελευταία χρόνια, παρατηρείται αύξηση στις λοιμώξεις από ευκαιριακούς μύκητες. Η Candida albicans είναι ένα ευκαιριακό παθογόνο που αποτελεί μέρος της φυσιολογικής μικροχλωρίδας του γαστρεντερικού και του ουροποιογεννητικού συστήματος του ανθρώπου, όπου υπάρχει συνήθως χωρίς εμφανή συμπτώματα. Ιδιαίτερα σε νοσηλευόμενους ασθενείς οι συστηματικές μυκητιακές λοιμώξεις έχουν αυξηθεί περίπου % ανάλογα με την εστία λοίμωξης. Ο μύκητας που απομονώνεται συχνότερα στις συστηματικές μυκητιακές λοιμώξεις είναι η Candida με κυρίαρχο είδος την Candida albicans (36, 37). Η καντινταιμία έχει αυξηθεί τόσο στην Αμερική, όπου αποτελεί το τέταρτο σε συχνότητα παθογόνο μικροοργανισμό που προκαλεί λοιμώξεις του κυκλοφορικού συστήματος, όσο και στην Ευρώπη (38). Η συστηματική καντιντίαση είναι κυρίως νοσοκομειακή λοίμωξη και πλήττει το 1-8% των ασθενών που νοσηλεύονται στα νοσοκομεία ενώ εμφανίζει ιδιαίτερα μεγάλη θνητότητα που προσεγγίζει το 50%. 38

39 Στις μονάδες εντατικής θεραπείας το ποσοστό συστηματικής καντιντίασης είναι ψηλότερο και φτάνει το 10%, αποτελώντας το 15% όλων των νοσοκομειακών λοιμώξεων. Η C. albicans είναι ο πιο διαδεδομένος ζυμομύκητας που απομονώνεται από τον άνθρωπο (47-75%) ακολουθούμενη από την C. tropicalis (7%), την C. glabrata (7%), την C. krusei (5%), την C. parapsilosis (<5%) και την C. guillermondii (<5%) (39). Σε νεογνά και παιδιά, η C. parapsilosis απομονώνεται σχετικά πιο συχνά, σε σύγκριση με τους ενήλικες. Συχνά μεταβολές στην άμυνα του ξενιστή, στην βακτηριακή χλωρίδα ή σε περιβαλλοντικούς παραγόντες μπορει να οδηγήσουν τον πληθυσμό της C. albicans σε υπέρμετρη αύξηση, προκαλώντας ένα ευρύ φάσμα λοιμώξεων. Λοιμώξεις που σχετίζονται με εμφυτεύματα, όπως καθετήρες, βηματοδότες και προσθετικές αρθρώσεις αποτελούν ένα σημαντικό πρόβλημα στη σημερινή ιατρική (40, 41). Οι περιβαλλοντικοί παράγοντες, που ευνοούν τη δημιουργία εκβλαστήσεων και ψευδοϋφών, είναι υψηλές θερμοκρασίες (>35 C) και ph 6,5-7 ή ελαφρώς αλκαλικό. Χαμηλότερες θερμοκρασίες και όξινο ph ευνοούν το σχηματισμό βλαστοκυττάρων. Στην πραγματικότητα, η θερμοκρασία και το ph είναι μόνο κάποιοι από τους παράγοντες που επηρεάζουν την ανάπτυξη της C. albicans. Οι συστηματικές μυκητιακές λοιμώξεις αποτελούν μία από τις σημαντικότερες αιτίες για την αύξηση της θνητότητας στους ανοσοκατασταλμένους ασθενείς κάθε ηλικίας (42, 43). Η αντιμετώπισή τους αποτελεί μεγάλο πρόβλημα στα παιδιά που λαμβάνουν χημειοθεραπεία για την καταπολέμηση όγκων που βρίσκονται στο στάδιο ανοσοκαταστολής μετά από μεταμόσχευση πρόδρομων αιμοποιητικών κυττάρων και που α- ντιμετωπίζουν κακοήθειες του αίματος ή άλλες μορφές πρωτοπαθών ή επίκτητων ανοσολογικών ανεπαρκειών (32, 33). Η αύξηση του αριθμού των ασθενών με διεισδυτικές 39

40 μυκητιάσεις και η ανάπτυξη ανθεκτικότητας στα αντιμυκητιακά φάρμακα οδήγησε στην ανάγκη για μελέτη των παραγόντων που συντελούν στην αντιμετώπισή τους. 3. Παθογένεια και Λοιμογόνοι Παράγοντες Η παθογένεια της C. albicans οφείλεται σε πλήθος λοιμογόνων παραγόντων, οι σημαντικότεροι από τους οποίους παραθέτονται παρακάτω. Δημιουργία βιοϋμενίων και προσκόλλησή τους σε επιφάνειες. Το κυτταρικό τοίχωμα των μυκήτων του γένους Candida και συγκεκριμένα τα δομικά του συστατικά είναι κυρίως υπεύθυνα για την ικανότητα των μυκήτων αυτών να προσκολλούνται μη αντιστρεπτά πάνω σε επιφάνειες και κατ επέκταση να σχηματίζουν βιοϋμένια. Οι μαννοπρωτείνες είναι το συστατικό που παίζει τον κυριότερο ρόλο στην προσκόλληση αυτή, καθώς λειτουργούν ως σημεία πρόσδεσης μορίων που βρίσκονται στην επιφάνεια των επιθηλιακών κυττάρων του ξενιστή. Στα είδη C. albicans και C. glabrata, τα οποία εμφανίζουν τη μεγαλύτερη προσκολλητική ικανότητα συγκριτικά με άλλα είδη Candida, οι προσκολλητικές μαννοπρωτεΐνες κωδικοποιούνται από τα γονίδια ALS και ΕΡΑ, αντίστοιχα (44). Α- ξιοσημείωτο είναι το γεγονός ότι στην C. albicans παρατηρούνται ινίδια, τα ο- ποία επηρεάζουν την προσκόλληση, την αποφυγή φαγοκυττάρωσης και συνεπώς τη λοιμογόνο δράση αυτού του είδους. Σχηματισμός υφών. Όλα τα είδη Candida εμφανίζουν την ικανότητα σχηματισμού υφών εκτός από το είδος C. glabrata. Ο σχηματισμός τους κωδικοποιείται από το γονίδιο camp Efg. Η ανάπτυξη ψευδοϋφών/υφών αποτελεί σημαντικό λοιμογόνο παράγοντα για τους μύκητες του γένους Candida. Οι υφές αυτές προάγουν τη διείσδυση των μυκήτων και εμποδίζουν τη δράση των ουδετερόφι- 40

41 λων/μακροφάγων του ξενιστή, λόγω του μεγέθους των υφών που δυσχεραίνουν τη φαγοκυττάρωση. Όμοιο ρόλο παίζει και ο σχηματισμός του βλαστικού σωλήνα, ιδιότητα που χαρακτηρίζει τα είδη C. albicans και C. dubliniensis (45, 46). Η γενική παραδοχή είναι ότι η διεισδυτικότητα των στελεχών στους ιστούς επηρεάζεται θετικά από την παρουσία υφών. Αντίθετα, η παρουσία μόνο ή κυρίως βλαστοκυττάρων σχετίζεται και με αποικισμό. Οι παραπάνω παρατηρήσεις δεν μπορούν να θεωρηθούν απόλυτες. Σε ορισμένες έρευνες διαπιστώνεται ότι η παρουσία υφών στα αρχικά στάδια συστηματικής λοίμωξης σχετίζεται κυρίως με τη διείσδυση στους ιστούς, ενώ η παρουσία βλαστοκυττάρων σχετίζεται με τη διασπορά στην κυκλοφορία του αίματος (47). Έκκριση λυτικών ενζύμων και τοξινών. Οι μύκητες του γένους Candida παράγουν πρωτεϊνάσες, οι οποίες συμμετέχουν στη διαδικασία διείσδυσης στα κερατινοκύτταρα της επιδερμίδας, ενώ ταυτόχρονα μπορεί να αυξήσουν τη διαπερατότητα του αγγειακού τοιχώματος. Σχετικά με το είδος C. albicans, η πρωτεολυτική δράση αυτών των ενζύμων συμβάλλει στην ανάπτυξη καντιντιάσεων, καθώς ευθύνεται για τη διάσπαση πρωτεϊνικών μορίων του ξενιστή. Τα ένζυμα αυτά κωδικοποιούνται από τα γονίδια SAP1-SAP9, με σημαντικότερο από αυτά το SAP2 (48). Επίσης, σημαντικό ρόλο στην παθογένεια και στην εξέλιξη καντιντιάσεων παίζουν και οι λιπάσες και οι φωσφολιπάσες του είδους C. albicans. 4. Αντιμυκητιακά Φάρμακα Οι λοιμώξεις από μύκητες του γένους Candida συνεχώς αυξάνονται. Ένας παράγοντας που ευνοεί την εμφάνισή τους είναι η εξασθένιση των μηχανισμών άμυνας, ό- πως συμβαίνει σε διάφορες ασθένειες. Η αντιμυκητιακή θεραπεία των καντιτιάσεων 41

42 επηρεάζεται αρνητικά από διάφορους παράγοντες όπως ο περιορισμένος αριθμός α- ντιμυκητιακών παραγόντων καθώς επίσης και από την αντοχή του μύκητα στους παράγοντες αυτούς. Τα αντιμυκητιακά φάρμακα που χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία των μυκητιάσεων, συστηματικών και μη, διακρίνονται σε τέσσερις κατηγορίες σύμφωνα με τη χημική τους δομή και τις οδούς βιοσύνθεσης των μυκήτων στους οποίους στοχεύουν (49). 1. Πολυένια. Στην κατηγορία αυτή ανήκουν η αμφοτερικίνη Β και η νυστατίνη. Εκτός από τη συμβατική δεοξυχολική αμφοτερικίνη Β (DAMB, Fungizone), υπάρχουν σήμερα και τρία λιπιδικά φαρμακευτικά είδη αμφοτερικίνης Β: η λιποσωματική αμφοτερικίνη Β (LAMB, Ambisome), η αμφοτερικίνη Β σε μορφή λιπιδικών συμπλεγμάτων (ABLC, Abelcet) και η αμφοτερικίνη Β σε μορφή λιπιδικού κολλοειδούς (ABCD, Amphocil). 2. Εχινοκανδίνες. Οι σημαντικότερες είναι η κασποφουγκίνη, η μικαφουγκίνη και η α- νιδουλαφουγκίνη (50, 51). 3. Νουκλεοσιδικά ανάλογα. Κύριος εκπρόσωπος αυτής της κατηγορίας είναι η φλουκυτοσίνη. 4. Αζόλες. Ανήκουν οι παλαιότερες ημιδαζόλες (μικοναζόλη, κετοκοναζόλη και κλοτριμαζόλη), οι τριαζόλες α γενιάς (φλουκοναζόλη και ιτρακοναζόλη) και οι τριαζόλες β γενιάς (βορικοναζόλη, ποσακοναζόλη και ραβουκοναζόλη). Τα αντιμυκητιακά φάρμακα αν και έχουν κυρίως ανασταλτική ή μυκητοκτόνα δράση, παράλληλα αλληλεπιδρούν in vivo με τα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος, που συμμετέχουν στην άμυνα του ξενιστή ενάντια στους μύκητες. Οι αλληλεπιδράσεις αυτές βρίσκονται σε άμεση συνάρτηση με το φάρμακο, την ανοσολογική κατάσταση του ξενιστή και τη φύση του μύκητα. 42

43 i. Αμφοτερικίνη Β Η δεοξυχολική ή συμβατική αμφοτερικίνη Β είναι ένα σύμπλοκο αμφοτερικίνης Β που αποτελείται από μία υδρόφιλη πολυ-υδροξυλική αλυσίδα κατά μήκος της μιας πλευράς του μορίου και μια λιπόφιλη πολυενική υδροκαρβονική αλυσίδα στην άλλη πλευρά. Ο μηχανισμός δράσης της αμφοτερικίνης Β βασίζεται στην ικανότητα της να συνδέεται με τις στερόλες, και κυρίως με την εργοστερόλη της κυτταρικής μεμβράνης των μυκήτων. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα να μεταβάλλεται η οσμωτικότητα της κυτταρικής μεμβράνης μέσω της διάνοιξης πόρων σε αυτήν, με τελικό αποτέλεσμα τη διαρροή του ενδοκυττάριου καλίου, μαγνησίου, σακχάρων και άλλων μεταβολιτών και τελικά να πεθαίνει ο μύκητας (52). Η αμφοτερικίνη Β έχει μεγαλύτερη συγγένεια προς την εργοστερόλη της κυτταρικής μεμβράνης του μύκητα σε σύγκριση με τη χοληστερόλη της κυτταρικής μεμβράνης των ανθρωπίνων. Έτσι εξηγείται η ισχυρότερη δράση της ενάντια στους μύκητες. Η δεοξυχολική αμφοτερικίνη Β, μετά από ενδοφλέβια χορήγηση, συνδέεται σε μεγάλο ποσοστό με τις πρωτεΐνες του ορού και κατανέμεται κυρίως στους νεφρούς, το ήπαρ, το σπλήνα, το μυελό των οστών και τους πνεύμονες. Η απέκκριση του φαρμάκου είναι ταχύτερη στα βρέφη και στα παιδιά (53). Η δεοξυχολική αμφοτερικίνη Β χρησιμοποιείται κυρίως στην αρχική θεραπεία α- πειλητικών για τη ζωή μυκητιάσεων. Η συνιστώμενη δόση είναι 0,5-1,5 mg/kg/h ενδοφλέβια σε 2 έως 4 ώρες για βαριές συστηματικές μυκητιάσεις. Οι ενδείξεις χορήγησης της αμφοτερικίνης Β είναι οι συστηματικές λοιμώξεις από Candida, Aspergillus, 43

44 Cryptococcus, Mucor και οι ενδημικές μυκητιάσεις όπως ιστοπλάσμωση, βλαστομύκωση και κοκκιδιοειδομύκωση. Κύρια προϋπόθεση για τη χορήγηση του παραπάνω φαρμάκου είναι οι ασθενείς να έχουν καλή νεφρική λειτουργία. Οι κυριότερες ανεπιθύμητες ενέργειες της δεοξυχολικής αμφοτερικίνης είναι η νεφροτοξικότητα, ενώ κατά τη χορήγηση του φαρμάκου συνήθως παρατηρείται στους ασθενείς ορισμένα από τα παρακάτω συμπτώματα όπως πυρετός, ρίγος, κεφαλαλγία, ανορεξία, κακουχία, μυαλγίες, κοιλιακά άλγη, ναυτία, έμετοι και διάρροια. Τα νεογνά, λόγω της ανωριμότητας του νεφρικού συστήματός τους και της συνακόλουθης μη νεφροτοξικής δράσης της δεοξυχολική αμφοτερικίνης Β σε αυτά, δεν παρουσιάζουν ανεπιθύμητες ενέργειες. ii. Εχινοκανδίνες Οι εχινοκανδίνες είναι ημισυνθετικά κυκλικά λιποπεπτίδια που προκαλούν αναστολή της β-(1,3)-d-γλυκάνης του κυτταρικού τοιχώματος και μεταβολίζονται στο ήπαρ (54). Το πρώτο φάρμακο της κατηγορίας που χορηγήθηκε σε ενήλικες υπήρξε η κασποφουγκίνη (Cancidas), ενώ στην ίδια κατηγορία ανήκουν η μικαφουγκίνη και η ανιδουλαφουγκίνη. Το θεραπευτικό τους φάσμα περιλαμβάνει στελέχη Candida, Aspergillus και Pneumocystis jiroveci (55). 1. Κασποφουγκίνη Αποτελεί ένα ημισυνθετικό υδατοδιαλυτό λιποπεπτίδιο, το οποίο είναι προϊόν ζύμωσης του μύκητα Glarea lozoyensis. Ανήκει στην οικογένεια των εχινοκανδινών και είναι παράγωγο της πνευμονοκανδίνης Bo. Η αντιμυκητιακή δράση της κασπογουγκίνης εναντίον των μυκήτων Candida και Aspergillus έχει αποδειχθεί τόσο in vitro όσο και in vivo. Οι κλινικές μελέτες σχετικά με την κασποφουγκίνη δεν έχουν δείξει ιδιαίτερες ανεπιθύμητες ενέργειες (56). 44

45 Οι κύριες ενδείξεις χορήγησης της κασποφουγκίνης είναι σε συστηματικές α- σπεργιλλώσεις που δεν αντιμετωπίστηκαν επαρκώς, στην οισοφαγίτιδα από Candida και στις συστηματικές λοιμώξεις από Candida. Επίσης, έχει βρεθεί συνεργική δράση της κασποφουγκίνης με την αμφοτερικίνη Β σε in vitro πειράματα, εξαιτίας του διαφορετικού τρόπου δράσης τους, εναντίον των ειδών Aspergillus και Fusarium (57). Η χορήγηση κασποφουγκίνης ενδείκνυται ακόμη και στην αντιμετώπιση εμπύρετης ουδετεροπενίας, η οποία δεν ανταποκρίνεται σε αντιμικροβιακή θεραπεία (58). 2. Ανιδουλαφουγκίνη Πρόκειται για ένα ημισυνθετικό παράγωγο της εχινοκανδίνης Β και είναι προϊόν ζύμωσης του μύκητα Aspergillus nidulans. Τρόπος δράσης. Τα πολυμερή της γλυκάνης, η μαννόζη και η χιτίνη είναι υπεύθυνα για το σχήμα και την αντοχή του κυτταρικού τοιχώματος των μυκήτων. Η γλυκάνη αποτελείται από 3 ελικοειδή πολυμερή της γλυκόζης, τα οποία συνδέονται με β-1, 3-, α-1, 3 ή β-1,6 γλυκοσιδικούς δεσμούς. Η ανιδουλαφουγκίνη αναστέλλει τη λειτουργία του ενζυμικού συμπλόκου της 1,3-β-D συνθάσης, με αποτέλεσμα να αναστέλλεται η σύνθεση της 1,3-β-D- γλυκάνης του μύκητα. Αυτό οδηγεί σε λύση του κυτταρικού τοιχώματος, με αποτέλεσμα τη θανάτωση του μύκητα. Δεν αποτελεί έκπληξη το γεγονός ότι όταν αναπτύσσεται αντίσταση είτε στο εργαστήριο είτε σε ασθενείς με καντιντίαση, συχνά παρατηρείται μετάλλαξη στο FKS1 γονίδιο, το κύριο γονίδιο το οποίο είναι υπεύθυνο για την παραγωγή της 1,3-β-D συνθάσης της γλυκάνης (59). Μεταλλάξεις στο γονίδιο FKS1 οδηγούν σε αναστολή της δράσης της συνθάσης της γλυκάνης και κατά συνέπεια και σε διαταραχή της δομής του κυτταρικού τοιχώματος. 45

46 Πληθυσμιακή φαρμακοκινητική. Οι γιατροί πολύ συχνά χρειάζεται να ρυθμίζουν την θεραπεία κάθε ασθενή, λαμβάνοντας υπόψη τις δημογραφικές και παθοφυσιολογικές ιδιαιτερότητές του. Μελέτες έδειξαν ότι η απομάκρυνση της ανιδουλαφουγκίνης από τον οργανισμό αυξάνεται με την αύξηση του σωματικού βάρους, στις περιπτώσεις διηθητικής καντιντίασης, στα αρσενικά άτομα. Ωστόσο, το ποσοστό επίδρασης των χαρακτηριστικών αυτών στην απομάκρυνση της ανιδουλαφουγκίνης είναι πολύ μικρό και θεωρείται ασήμαντο (60). Αποτελεσματικότητα. Υπάρχουν πολλές μελέτες που αποδεικνύουν το ρόλο της ανιδουλαφουγκίνης ως πρωταρχική αντιμυκητιασική θεραπεία στις καντιντιάσεις. Πρώτον, in vitro μελέτες έχουν αποδείξει την μεγάλη ευαισθησία διαφόρων ειδών Candida στο φάρμακο. Δεύτερον, η ανιδουλαφουγκίνη έχει μυκητοκτόνο δράση ενάντια στην Candida. Το γεγονός αυτό κατατάσσει την ανιδουλαφουγκίνη και άλλες εχινοκανδίνες στην πρώτη θέση των αντιμυκητιακών φαρμάκων. Τρίτον, in vivo μελέτες φαρμακοκινητικής και φαρμακοδυναμικής αποδεικνύουν μέγιστη αποτελεσματικότητα, η ο- ποία ορίζεται ως η μέγιστη θανάτωση μικροβίων, συγκριτικά με τη φλουκοναζόλη ανεξάρτητα με την ευαισθησία των ειδών της Candida στο συγκεκριμένο φάρμακο. Τέταρτον, η αποτελεσματικότητα της ανιδουλαφουγκίνης συνοδεύεται από επαρκείς τυχαιοποιημένες μελέτες σε ενήλικες ασθενείς (5, 61-63). iii. Αζόλες Η κύρια δράση τους είναι η μετατροπή της λανοστερόλης σε εργοστερόλη, βασικό συστατικό της κυτταρικής μεμβράνης του μύκητα, δρώντας στο ένζυμο 14α-δεμεθυλάση της λανοστερόλης. Μεταβολίζονται στο ήπαρ με τα ισόμορφα ένζυμα CYP2C9 και CYP3A4 του κυτοχρώματος P-450, Η μικοναζόλη και η κετοκοναζόλη ανήκουν στις 46

47 παλαιότερες ημιδαζόλες. Οι πρώτες τριαζόλες ήταν η φλουκοναζόλη και η ιτρακοναζόλη (τριαζόλες α γενιάς). Στις νεότερες τριαζόλες (τριαζόλες β γενιάς) ανήκουν η βορικοναζόλη, η ποσακοναζόλη και η ραβουκοναζόλη. Οι τριαζόλες, εξαιτίας των ιδιοτήτων τους, χρησιμοποιούνται περισσότερο από τις ημιδαζόλες. Συγκεκριμένα: 1. παρουσιάζουν λιγότερες αλληλεπιδράσεις κατά τη συγχορήγησή τους με άλλα φάρμακα, 2. παρουσιάζουν μικρότερη ηπατοτοξικότητα, 3. ενδείκνυται και η παρεντερική τους χορήγηση, 4. έχουν ευρύτερο θεραπευτικό φάσμα, 5. κατανέμονται καλύτερα στα υγρά του οργανισμού και 6. εμφανίζουν λιγότερες ανεπιθύμητες εκδηλώσεις από το γαστρεντερικό σύστημα (64). 1. Φλουκοναζόλη Εμφανίζει δραστικότητα έναντι των περισσοτέρων ειδών Candida και άλλων ζυμομυκήτων. Αποτελεί ένα πολύ καλό αντιμυκητιακό φάρμακο για την αντιμετώπιση της στοματοφαρυγγικής και οισοφαγικής καντιντίασης ενώ παρουσιάζει ικανοποιητική δράση στη μηνιγγίτιδα από Cryptococcus. Η φλουκοναζόλη δεν εμφανίζει δράση απέναντι στη Candida krusei και η δράση της απέναντι σε στελέχη του είδους Candida glabrata είναι ποικίλη (65). 2. Βορικοναζόλη Η κύρια ένδειξή της είναι λοιμώξεις που οφείλονται στον Aspergillus, άλλους νηματοειδείς μύκητες και ανθεκτικά στελέχη Candida. Σε in vitro πειράματα έχει αποδειχθεί ότι η δράση της είναι ίδια ή ανώτερη με τη φλουκοναζόλη, την ιτρακοναζόλη ή την αμφοτερικίνη Β (66). Η βορικοναζόλη χορηγείται στις συστηματικές λοιμώξεις από Aspergillus συμπεριλαμβανομένων των λοιμώξεων του ΚΝΣ, των πνευμονικών λοιμώξεων και της ενδοκαρδίτιδας (66). Επίσης, χορηγείται στην πνευμονική λοίμωξη από 47

48 Cryptococcus και τη συστηματική λοίμωξη από είδη Candida, που περιλαμβάνουν την C. glabrata και την C. krusei (67). Η βορικοναζόλη έχει εγκριθεί πλέον ως φάρμακο πρώτης επιλογής για την αντιμετώπιση πνευμονικής λοίμωξης από Aspergillus. 3. Ποσακοναζόλη Η ποσακοναζόλη αποβάλλεται κυρίως με τα κόπρανα. Είναι καλά ανεκτή από τον παιδικό πληθυσμό, χωρίς να έχουν αναφερθεί περιπτώσεις ηπατικής ή νεφρικής τοξικότητας (68, 69). Διαχέεται πολύ καλά στους ιστούς και έχει ισχυρή in vitro δράση έναντι της Candida (70). Δεν έχει ένδειξη για παιδιά. 5. ΒΙΟΫΜΕΝΙΑ 1. Γενικά Η Μικροβιολογία μελετά τον τελευταίο αιώνα, τα μικρόβια που αναπτύσσονται ελεύθερα σε υγρά θρεπτικά υλικά καθώς επίσης και τις ιδιότητες και συμπεριφορές τους. Οι έρευνες αυτές δε μελετούν τις συμπεριφορές και ιδιότητες των μικροβίων, ό- ταν αυτές συγκροτούν οργανωμένες κοινότητες, οι οποίες ονομάζονται βιοϋμένια (biofilms). Σύμφωνα με μελέτες, η πλειοψηφία των μικροβίων επιβιώνει στη φύση με τη μορφή βιοϋμενίων και όχι ως ελεύθεροι μικροοργανισμοί (71). Παραδείγματα τέτοιων μικτών κοινοτήτων είναι εκείνες που σχηματίζονται από μικροοργανισμούς του είδους Pseudomonas spp. και Candida spp. Τα βιοϋμένια, συχνά σχετίζονται με τη χρήση επεμβατικών ιατρικών εργαλείων (π.χ. ενδοαγγειακοί καθετήρες, προθέσεις, βαλβίδες) ή με χρόνια βλάβη των ιστών, όπως στις περιπτώσεις χρόνιων λοιμώξεων (π.χ. ενδοκαρδίτιδα, χρόνια οστεομυελίτιδα, χρόνια προστατίτιδα κλπ). 48

49 Τα μικροβιακά κύτταρα επιβιώνουν σε δύο αναπτυξιακες μορφές, την ελεύθερη (planktonic) και την ακίνητη (sessile). Η πρώτη μορφή είναι σημαντική για το γρήγορο πολλαπλασιασμό και τη διασπορά των μικροβίων σε νέους χώρους, ενώ η δεύτερη μορφή είναι υπεύθυνη για τη διατήρηση και επιβίωσή τους κάτω από αντίξοες συνθήκες (αντιμικροβιακοί παράγοντες άμυνας). Τα τελευταία χρόνια υπάρχει ένα συνεχώς αυξανόμενο ενδιαφέρον για τα βιοϋμένια στον τομέα της Ιατρικής. Τα βιοϋμένια είναι καλά δομημένες κοινότητες μικροοργανισμών (βακτηρίων ή μυκήτων ή και μικτών πληθυσμών) που περιβάλλονται από μια αυτοπαραγόμενη εξωκυττάρια ουσία (72-74). Σκοπός του σχηματισμού αυτών των κοινοτήτων είναι η προστασία των μικροοργανισμών από τις αντίξοες περιβαλλοντικές συνθήκες προσδίδοντάς τους ταυτόχρονα και καλύτερες πιθανότητες επιβίωσης μέσω καλύτερης προσαρμογής στο περιβάλλον. Μέσα στο βιοϋμένιο οι μικροοργανισμοί επικοινωνούν μεταξύ τους και εκφράζουν ένα διαφορετικό και ξεχωριστό φαινότυπο σε σχέση με τους ελεύθερους μικροοργανισμούς (74). Λοιμώξεις που σχετίζονται με βιοϋμένια έχουν αποδειχτεί πολύ ανθεκτικές στους αντιμικροβιακούς παράγοντες (63, 75-78) και μπορούν να οδηγήσουν σε ασθένειες απειλητικές για τη ζωή με υψηλά ποσοστά θνησιμότητας. Τα πολυμορφοπύρηνα ουδετερόφιλα αποτελούν ένα σημαντικό συστατικό της έμφυτης ανοσίας και γενικά της άμυνας του ξενιστή έναντι στην Candida spp. και την Pseudomonas spp. Παρά την μεγάλη ικανότητα τους να καταστρέφουν πλανκτονικούς μικροοργανισμούς, τόσο τα πολυμορφοπύρηνα ουδετερόφιλα όσο και τα δενδριτικά κύτταρα και τα μακροφάγα αδυνατούν να αντιμετωπίσουν τους μικροοργανισμούς που προστατεύονται στα 49

50 βιοϋμένια. Οπότε τα βιοϋμένια, δεν εμφανίζουν μόνο αυξημένη αντίσταση σε αντιμικροβιακούς παράγοντες, αλλά είναι επίσης ανθεκτικά στην άμυνα του ξενιστή (62, 78, 79). Μόλις οι μικροοργανισμοί προσκολληθούν πάνω σε μια επιφάνεια ή σε κάποιο ιστό, καταφέρνουν να μεταβούν από την πλανκτονική τους μορφή σε μια νέα μορφή που προσομοιάζει σε μεγάλο βαθμό την επικοινωνία των κυττάρων σε ένα ιστό. Η διαλεύκανση αυτής της μεταβατικής κατάστασης θα μας βοηθήσει καλύτερα στη μελέτη και κατανόηση της συμπεριφοράς των βιοϋμενίων και θα μας επιτρέψει την ανάπτυξη νέων θεραπειών κατά των λοιμωδών νοσημάτων που σχετίζονται με βιοϋμένια. 2. Δομή και χαρακτηριστικά των βιοϋμενίων Οι μικροοργανισμοί αποτελούν συνήθως μικρό ποσοστό του βιοϋμενίου και δεν υπερβαίνουν το 35% του όγκου του ενώ το μεγαλύτερο ποσοστό το καταλαμβάνει η εξωκυττάρια ουσία. Η σύσταση και οι ιδιότητες της εξωκυττάριας ουσίας διαφέρουν ανάλογα με το είδος του μικροοργανισμού που συνιστά το βιοϋμένιο και το φυσικό περιβάλλον όπου αυτό αναπτύσσεται. Σε όλες όμως τις περιπτώσεις η εξωκυττάρια ουσία αποτελείται κατά κύριο λόγο από νερό (έως και 97%) και πολυσακχαρίτες (1-2%) και από πρωτεΐνες, νουκλεϊνικά οξέα, λιπίδια, φωσφολιπίδια, ιόντα και διάφορα συστατικά του αίματος (80). Η εξωκυττάρια ουσία περιβάλλοντας τις αποικίες των μικροοργανισμών, λειτουργεί ως «φίλτρο», όπου παγιδεύονται τα απαραίτητα για τη διατήρηση του βιοϋμενίου θρεπτικά συστατικά. Από σειρά μελετών είναι πλέον ξεκάθαρο ότι μεταλλαγμένοι οργανισμοί, που αδυνατούν να συνθέσουν εξωκυττάρια ουσία, δεν μπορούν να σχηματίσουν βιοϋμένιο. 50

51 Τα βιοϋμένια είναι πολύπλοκες τρισδιάστατες δομές, όπου οι μικροαποικίες των μικροοργανισμών περιβαλλόμενες από την εξωκυττάρια ουσία, εμφανίζονται ως «πύργοι» ή «μανιτάρια» (Εικ. 4). Επίσης οι «κοινότητες» των μικροαποικιών διασχίζονται από δίκτυο καναλιών στα οποία υπάρχει νερό, που συντελούν στη μεταφορά θρεπτικών συστατικών αλλά και στη διατήρηση μιας συγκεκριμένης συγκέντρωσης οξυγόνου και ph στο βιοϋμένιο. Γενικά, τα βιοϋμένια θεωρούνται «δυναμικές οντότητες», ετερογενείς στο χώρο και στο χρόνο, που υπόκεινται σε πολλαπλές ενδογενείς (μέσω συμμετοχής μορίων διακυτταρικής χημικής επικοινωνίας, quorum sensing) αλλά και περιβαλλοντικές επιδράσεις (81-83). Εικόνα 4. Δομή Βιοϋμενίων. (Center for Biofilm Engineering, Montana State University, Bozeman, Mont.) 3. Παράγοντες σχηματισμού βιοϋμενίων Οι παράγοντες που επηρεάζουν το σχηματισμό και τη δομή των βιοϋμενίων είναι πολλοί και οι περισσότεροι είναι κοινοί για όλα τα είδη βιοϋμενίων. Ορισμένοι από 51

52 τους παράγοντες αυτούς είναι το φυσικοχημικό περιβάλλον, το ανοσοποιητικό σύστημα του ξενιστή, η ικανότητα προσκόλλησης του οργανισμού. Στην εικονα που ακολουθεί (Εικ. 5) δίνονται όλοι οι παράγοντες που επηρεάζουν το σχηματισμό των βιοϋμενίων. Εικόνα 5. Παράγοντες που γενικά επηρεάζουν το σχηματισμό Βιολογικών Υμενίων Σχετικά με τη δημιουργία και τη δομή των βιοϋμενίων που σχηματίζονται από C. albicans και P. aeruginosa, οι φυσικοχημικές ιδιότητες της επιφάνειας προσκόλλησης επηρεάζουν σημαντικά το σχηματισμό βιοϋμενίων. Το στρώμα που σχηματίζεται προσδίδει νέες ιδιότητες στο υπόστρωμα, με αποτέλεσμα να επηρεάζει την ανάπτυξη του βιοϋμενίου (84-86). Η επιφάνεια προσκόλλησης, επίσης, επηρεάζει και τη δομή του βιοϋμενίου, αφού κάθε είδος επιφάνειας οδηγεί στην έκφραση διαφορετικών γονιδίων της C. albicans. Ένας άλλος παράγοντας που επηρεάζει τη δημιουργία βιοϋμενίου είναι η σύσταση των θρεπτικών συστατικών στο περιβάλλον ανάπτυξης του βιοϋμενίου (87-89). Γενικά έχει διαπιστωθεί ότι συστατικά της διατροφής έχουν καθοριστικό ρόλο στην α- νάπτυξη βιοϋμενίων (90-92). Έχει ακόμη παρατηρηθεί ότι βιοϋμένια από C. albicans 52

53 που αναπτύχθηκαν απουσία σιδήρου παρουσίασαν μια καθυστέρηση στην ωρίμανση και αποτελούνταν αποκλειστικά από κονίδια και καθόλου από υφές και ψευδοϋφές (93), όπως επίσης και η παρουσία Mg +2 και Ca +2 επηρεάζει την δημιουργία βιοϋμενίων από την P. aeruginosa. Τα υλικά καλλιέργειας που χρησιμοποιούνται για την ανάπτυξη βιοϋμενίων αποτελούν έναν ακόμη σημαντικό παράγοντα που επηρεάζει το σχηματισμό τους (94). Επομένως, τα βιοϋμένια C. albicans που καλλιεργήθηκαν σε θρεπτικό υλικό RPMI 1640, που ευνοεί το σχηματισμό υφών, αποτελούνταν από υφές (94), ενώ βιοϋμένια που καλλιεργήθηκαν σε ΥΝΒ (Yeast Nitrogen Base) αναπτύχθηκαν με τη μορφή βλαστοκονιδίων. Επισης, σε πρόσφατη έρευνα, τα βιοϋμένια P. aeruginosa αναπτύχθηκαν σε θρεπτικό υλικό RPMI 1640 και ωρίμασαν καλύτερα (95). Τέλος, οι συνθήκες επώασης επηρεάζουν τη ποσότητα εξωκυττάριας ουσίας που δημιουργείται κατά το σχηματισμό βιοϋμενίων από C. albicans. Έχει παρατηρηθεί ότι όταν βιοϋμένια από C. albicans αλλά και P. aeruginosa επωάζονται υπό ήπια ανακίνηση in vitro παράγονται μεγάλες ποσότητες εξωκυττάριας ουσίας παρά όταν η επώαση γίνεται υπό στατικές συνθήκες (95, 96). 4. Στάδια σχηματισμού των βιοϋμενίων Ο κύκλος ζωής των βιοϋμενίων διακρίνεται στα παρακάτω στάδια: τη μικροβιακή προσκόλληση, το σχηματισμό αποικιών, την ωρίμανση των βιοϋμενίων και την αποκόλληση (Εικ. 6-7). Τα βιοϋμένια, όπως και άλλες κοινότητες σχηματίζονται σταδιακά στο χρόνο. Η ανάπτυξη του βιοϋμενίου γίνεται σε πέντε στάδια ανεξάρτητα από το φαινότυπο των μικροοργανισμών. 53

54 Στάδιο 1. Πρόκειται για το στάδιο της προσκόλλησης, το οποίο μπορεί να ενεργοποιηθεί μέσα σε μερικά δευτερόλεπτα και η ενεργοποίησή του μπορεί να προκληθεί από ερεθίσματα του περιβάλλοντος όπως, αλλαγές στη θερμοκρασία, στο pη, στη συγκέντρωση του οξυγόνου. Στο σχηματισμό βιοϋμενίων περισσότερο επιρρεπείς είναι οι τραχείες επιφάνειες, γεγονός που οφείλεται στην ελάττωση των δυνάμεων συνάφειας. Έχει διαπιστωθεί ότι σχηματισμός βιοϋμενίων παρατηρείται περισσότερο σε υδρόφοβα υλικά. Αρχικά, η προσκόλληση είναι αναστρέψιμη καθώς κάποια κύτταρα αποκολλώνται και υπάρχει πιθανότητα ο σχηματισμός των βιοϋμενίων να υποχωρήσει. Στάδιο 2. Στο στάδιο αυτό, η προσκόλληση είναι μη αναστρέψιμη και ξεκινάει αμέσως μετά το στάδιο 1. Τα μικρόβια, αφού προσκολληθούν στην επιφάνεια των επιθηλιακών κυττάρων, αρχίζουν να πολλαπλασιάζονται και ταυτόχρονα επικοινωνούν μεταξύ τους στέλνοντας χημικά σήματα. Τη στιγμή που η ένταση των σημάτων αυτών ξεπεράσει ένα ανώτατο όριο, ενεργοποιούνται γενετικοί μηχανισμοί με σκοπό την έκκριση εξωπολυσακχαριδικών μορίων, με αποτέλεσμα να παγιδεύονται τροφικά συστατικά και πλανκτονικά μικρόβια. Στο σημείο αυτό σχηματίζονται αποικίες μικροβιακών κυττάρων και η κινητικότητά τους μειώνεται. Στάδιο 3. Όταν οι αποικίες αυτές σχηματίσουν στοιβάδα πάχους μεγαλύτερου από 10 μm, ξεκινάει η ωρίμανση του σχηματισμού των βιοϋμενίων (97). Το στάδιο αυτό ονομάζεται ωρίμανση 1. Στάδιο 4. Τη στιγμή όπου τα βιοϋμένια φθάσουν στο μεγαλύτερο πάχος τους, το οποίο πρέπει να ξεπερνά τα 100 mm βρίσκονται στο στάδιο της ωρίμανσης 2. Στάδιο 5. Στο στάδιο αυτό παρατηρείται διασκορπισμός των κυττάρων. Ορισμένα μικρόβια αναπτύσσουν τον πλανκτονικό φαινότυπο και αφήνουν τα βιοϋμένια. 54

55 Αν και για το σχηματισμό βιοϋμενίων, οι συνιστώσες είναι κοινές, θα πρέπει να τονιστεί ότι σημαντικό ρόλο έχει η συμβολή παραγόντων του ξενιστή, όπως τα συστατικά της άμυνάς του και οι φυσικές τοποθεσίες του. Επίσης, ο σχηματισμός βιοϋμενίων επηρεάζεται και από διάφορα συστατικά του περιβάλλοντος. Εικόνα 6. Σχηματική απεικόνιση του «κύκλου ζωής» του βιολογικού υμενίου στην P. aeruginosa (98). 55

56 Εικόνα 7. Στάδια ανάπτυξης βιοϋμενίου από Candida. Αριστερά: Α, Επιφάνεια καθετήρα χωρις μικροοργανισμούς. Β, Αρχική προσκόλληση μυκήτων με τη μορφή βλαστοκυττάρων τη (κόκκινο) στην επιφάνεια. Γ, Σχηματισμός της βασικής. Δ, Ολοκλήρωση σχηματισμού βιοϋμενίου με προσθήκη της εξωκυττάριας ουσίας (κίτρινο), που περιβάλλει και τα βλαστοκύτταρα (κόκκινο) και τις υφές (πράσινο). Δεξιά: εικόνες από συνεστιακό μικροσκόπιο βιοϋμενίου από C. albicans σε διάφορα στάδια ανάπτυξης. (40, 94). Σημαντικό είναι το γεγονός ότι τα βιοϋμένια χαρακτηρίζονται από αντοχή στα διάφορα αντισηπτικά, τα αντιμικροβιακά φάρμακα και την ικανότητά τους να ανθίστανται στους μηχανισμούς χυμικής και κυτταρικής ανοσίας της άμυνας του ξενιστή (81). Τα ακίνητα μικροβιακά κύτταρα ενός ώριμου βιοϋμενίου είναι ανθεκτικά στις συγκεντρώσεις αντιβιοτικών φορές περισσότερο από τις αντίστοιχες συγκεντρώσεις που απαιτούνται για την καταστροφή των πλανκτονικών κυττάρων. 5. Βιοϋμένια P. aeruginosa Τα βιοϋμένια που σχηματίζονται από τα στελέχη της P. aeruginosa αποτελούν σοβαρή αιτία επιπλοκών στην πορεία της νόσου ασθενών με πνευμονία, κυστική ί- νωση, ενδοκαρδίτιδες. Χάρη στην εντατική έρευνα, η γνώση γύρω από τους μοριακούς μηχανισμούς που συμβάλλουν στη δημιουργία, τη διατήρηση, και την αντοχή του πολυκυτταρικού αυτού σχηματισμού, των βιοϋμενίων της Pseudomonas, έχει εμπλουτιστεί σημαντικά. Η κινητικότητα του βακτηρίου είναι ένας παράγοντας που έχει σημαντικό ρόλο στο σχηματισμό και την ανάπτυξη του βιοϋμενίου (99). Σύμφωνα με πειραματικά δεδομένα έχει προκύψει ότι η έκφραση ομάδων γονιδίων που επιτρέπουν στο βακτήριο να προσαρμόζει τις ιδιότητες του βιοϋμενίου που σχηματίζεται ανάλογα με τις υπάρχουσες συνθήκες οφείλεται σε περιβαλλοντικούς παράγοντες (100). 56

57 Η πλέον σημαντική ιδιαιτερότητα των βιοϋμενίων είναι η ανθεκτικότητά τους στους αντιμικροβιακούς παράγοντες. Πολλές δημοσιεύσεις περιγράφουν και αναλύουν μοντέλα βιοϋμενίων της Pseudomonas, τα οποία βασίζονται στη θεωρία των ανθεκτικών μικροβίων που ερμηνεύουν το φαινόμενο της ανάπτυξης αντοχής (101). Σύμφωνα, λοιπόν, με τις έρευνες αυτές έχει διαπιστωθεί ότι ένα μικρό ποσοστό των κυττάρων μέσα στο βιοϋμένιο παραμένουν σε λανθάνουσα κατάσταση και δεν επηρεάζονται από την παρουσία αντιβιοτικών. Αυτό οφείλεται στο πολύ χαμηλό επίπεδο της μεταβολικής τους δραστηριότητας. Με τη μείωση των επιπέδων των αντιβιοτικών, τα ανθεκτικά αυτά κύτταρα ενεργοποιούνται, πολλαπλασιάζονται και επανασχηματίζουν τη μεμβράνη (102). Αξιοσημείωτο είναι, επίσης, το γεγονός ότι τα κύτταρα αυτά είναι φαινοτυπικές ποικιλίες του «άγριου τύπου» (wild type) των βακτηρίων (103). Σύμφωνα με πρόσφατες δημοσιεύσεις, επικρατεί η άποψη ότι τα ανθεκτικά μικρόβια αντιπροσωπεύουν φυσιολογικά μέλη ενός βακτηριακού πληθυσμού, τα οποία όμως βρίσκονται σε μια ιδιαίτερη φάση του κυτταρικού τους κύκλου (104). Αποτελούν σπάνια κύτταρα που η παραγωγή τους καθορίζεται από το ρυθμό ανάπτυξης του βιοϋμενίου και δεν πολλαπλασιάζονται. Αν και η βασική επιδίωξη ενός μικροβιακού πληθυσμού είναι ο πολλαπλασιασμός τους, τα ανθεκτικά αυτά κύτταρα δεν πολλαπλασιάζονται αλλά παραμένουν στάσιμα, διασφαλίζοντας, όμως, έτσι την επιβίωση του είδους. Η ικανότητα της P. aeruginosa να αμύνεται σθεναρά απέναντι στα ουδετερόφιλα με την παραγωγή ραμνολιπιδίων είναι μια βασική προϋπόθεση για την δημιουργία χρόνιων λοιμώξεων (95, 105, 106). Σε πρόσφατη έρευνα (95), διαπιστώθηκε ότι η κεφταζιδίμη αναστέλει την παραγωγή πρωτε- 57

58 ασών, ελαστάση, χιτινάσης και ραμνολιπιδίων από την P. aeruginosa. Όλα αυτά τα βακτηριακά προιόντα βοηθούν την P. aeruginosa να σχηματιζει βιουμένια και να τα προστατεύει από την δράση οξειδωτικων μηχανισμών αλλά και των ουδετεροφίλων. 6. Μικτά Βιοϋμένια Τα βιοϋμένια in vivo είναι συχνά πολυμικροβιακά. Συχνά, συνυπάρχουν βακτήρια με στελέχη του γένους Candida και η συνύπαρξη αυτή δημιουργεί πολλές αλληλεπιδράσεις. Για παράδειγμα, σε μικτά βιοϋμένια από C. albicans και P. aeruginosa παρατηρήθηκε ανταγωνιστική αλληλεπίδραση μεταξύ των δύο οργανισμών (73). Η P. aeruginosa αναπτύσσει πάνω στις υφές της C. albicans ένα πυκνό βιοϋμένιο και καταστρέφει το μύκητα. Στο στάδιο, όμως, που η C. albicans έχει τη μορφή βλαστοκυττάρου, η P. aeruginosa δεν παρουσιάζει ανάλογη δράση. Παρατηρήθηκε, επίσης, ότι λοιμογόνοι παράγοντες όπως φωσφολιπιδία C, έχουν συνεργητική δράση στην εξουδετέρωση των υφών της Candida. Η C. albicans και P. aeruginosa είναι σημαντικοί παθογόνοι μικροοργανισμοί που συναντώνται σε λοιμώξεις που συνδέονται με μόνιμες ιατρικές συσκευές (74, 107, 108). Έχει παρατηρηθεί ότι η P. aeruginosa και η C. albicans αυξάνουν τον κίνδυνο για πνευμονία σε ηλικιωμένους ασθενείς, όταν συνυπάρχουν στους ίδιους ασθενείς (109). Πρόσφατα, αναγνωρίστηκε ότι η P. aeruginosa και η C. albicans συνυπάρχουν σε παρόμοια περιβάλλοντα και έτσι μπορούν να αποτελέσουν εύκολα μικτές κοινότητες (73). Τα βιοϋμένια της Candida μερικές φορές υπάρχουν σε ένα ετερογενές μίγμα με πολλά 58

59 άλλα είδη μικροβίων. Αυτή η πολύπλοκη δομή του βιοϋμενίου επιτρέπει στην διαμικροβιακή επικοινωνία των μικροβίων που αποσκοπεί σε ανταγωνιστικές ή συμβιωτικές σχέσεις (110). Στην πραγματικότητα, στο περιβάλλον του ξενιστή, η C. albicans βρίσκεται συχνά σε μικτά βιοϋμένια με άλλα βακτηριακά είδη όπου οι εκτεταμένες μεταξύ των ειδών αλληλεπιδράσεις μπορούν να επηρεάσουν την μετάβαση της C. albicans από λοιμογόνα σε μη λοιμογόνα κατάσταση. Αξίζει επίσης να αναφερθει ότι μελέτες ευαισθησίας φαρμάκων ανέφεραν ότι κύτταρα μυκήτων μπορούν να ρυθμίζουν την δράση των αντιμικροβιακών παραγόντων και ότι, αντίστροφα, τα βακτήρια μπορούν να επηρεάσουν τη δραστηριότητα των αντιμυκητιακών παραγόντων (40, 41) Σε ένα βιοϋμένιο, οι μικροοργανισμοί βρίσκονται σε μία συνεχή αλλήλεπίδραση και επικοινωνία (quorum sensing=αίσθηση απαρτίας). Αυτή η λειτουργία βοηθά τους μικροοργανισμούς στο βιοϋμένιο καθώς τους αποτρέπει να αυξάνονται υπέρμετρα και με την έκφραση ειδικών γονιδίων τους αποτρέπει να ανταγωνίζονται για θρεπτικά συστατικά, παρέχοντας τους μικροοργανισμούς με ένα συλλογικό μηχανισμό άμυνας έ- ναντι των άλλων ανταγωνιστικών οργανισμών και παραγόντων. Ως εκ τούτου, οι μικροοργανισμοί στα βιοϋμένια είναι σε θέση να συνεργάζονται ως αποτέλεσμα του συντονισμού των δραστηριοτήτων των μεμονωμένων κυττάρων. Μολονότι η διακυτταρική χημική επικοινωνία έχει μελετηθεί σε βιοϋμένια αποτελούμενα απο ένα μόνο είδος μικροοργανισμών, υπάρχουν ενδείξεις ότι στα μικτά βιοϋμένια οι διαφορετικές κατηγορίες μικροοργανισμών μπορούν με την παραγωγή ειδικών χημικών μορίων να επικοινωνούν εξίσου καλά. Τα βακτήρια και οι μύκητες συναντιώνται μαζί στην φύση σε πάρα πολλά περιβάλλοντα. Αν και έχουν εξελιχθεί με 59

60 διαφορετικούς τρόπους και έχουν αναπτύξει διαφορετικούς μηχανισμούς επικοινωνίας, η διαδικασία της διακυτταρικής χημικής επικοινωνίας έχει πρόσφατα αποδειχθεί ότι συμβαίνει και ανάμεσα σε προκαρυωτικούς και ευκαρυωτικούς μικροοργανισμούς (73). Αν και η έρευνα στον συγκεκριμένο τομέα βρίσκεται ακόμα σε πρωταρχικά στάδια, υπάρχουν ήδη αρκετές εργασίες που αναφέρονται στις διακυτταρικές σχέσεις μικροοργανισμών μέσα στο βιοϋμένιο. Ένα απο τα πιο σημαντικά ευρήματα είναι η επίδραση των βακτηρίων στην παθογονικότητα της C. albicans. Ως εκ τούτου, μεταβολές στην κανονική βακτηριακή χλωρίδα ενός ξενιστή, συχνά αποτέλεσμα θεραπείας με α- ντιβιοτικά ευρέως φάσματος, επιτρέπουν την C. albicans να πολλαπλασιάζεται και να εισβάλλει σε ιστούς, επηρεάζοντας σε μεγάλο βαθμό την παθογένεια της (73). 7. Μηχανισμοί αντίστασης βιοϋμενίων σε αντιμικροβιακούς παράγοντες Η πιο σημαντική φαινοτυπική διαφορά μεταξύ πλανκτονικών κυττάρων και των μικροοργανισμών που βρίσκονται σε βιοϋμένιο είναι η εξαιρετική αντίσταση των βιοϋμενίων στους αντιμικροβιακούς παράγοντες. Σε μερικές περιπτώσεις στα βιοϋμένια έχει παρατηρηθεί αυξηση της ανασταλτικής ή/και φονικής συγκέντρωσης μέχρι και φορές σε σχέση με τα πλανκτονικά κύτταρα (111). Αν και η ικανότητα των βιοϋμενίων να αντιστέκονται σε αντιμικροβιακούς παράγοντες δεν είναι πλήρως κατανοητή, διάφορες εξηγήσεις έχουν δοθεί: i. Πολυσακχαρίτες βιοϋμενίων Τα βιοϋμένια είναι προστατευμένα μέσα σε ένα «κάλυμμα» από εξωκυττάρια ουσία το οποίο εμποδίζει τη διάχυση του φαρμάκου μέσα στο βιοϋμένιο. Αυτό μπορεί 60

61 να συμβαίνει είτε γιατί η αντιμικροβιακή ουσία δεν καταφέρνει να διαπεράσει το στρώμα της εξωκυττάριας ουσίας είτε γιατί ο αντιμικροβιακός παράγοντας προσδένεται απευθείας σε κάποιο συστατικό του «καλύμματος». Αρκετές μελέτες έχουν διεξαχθεί για να συσχετίσουν την παραγωγή εξωκυττάριας ουσίας με την αντίσταση των βιοϋμενίων. Σε μια από αυτές, το βιοϋμένιο που παράχθηκε σε συνθήκες συνεχούς α- νακίνησης περιείχε περισσότερη εξωκυττάρια ουσία σε σχέση με βιοϋμένιο που παράχθηκε σε στατική κατάσταση. Ωστόσο, και στις δύο περιπτώσεις δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές όσον αφορά την ευαισθησία τους σε οποιοδήποτε α- ντιμικροβιακό παράγοντα (112). Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης δείχνουν ότι η ευαισθησία των βιοϋμενίων σε διάφορους αντιμικροβιακούς παράγοντες δεν φαίνεται να σχετίζεται απευθείας με την ποσότητα της εξωκυττάριας ουσίας. Σε άλλες μελέτες, τα βιοϋμένια της Candida που δημιουργήθηκαν υπό συνθήκες συνεχούς ροής και συνεχούς επαναδιάλυσης έτσι ώστε ένα μεγάλο μέρος της εξωκυττάριας ουσίας τους να έχει χαθεί, παρατηρήθηκε ότι ήταν περίπου 20% πιο επιρρεπή στην αμφοτερικίνη Β, σχετικά με τα άθικτα βιοϋμένια (112). Κατά συνέπεια, η εξωκυττάρια ουσία φαίνεται να παίζει έναν δευτερεύοντα ρόλο στην αντίσταση των βιοϋμενίων. ii. Δομή βιοϋμενίου Διάφορες θρεπτικές ουσίες καθώς και αντιμικροβιακοί παράγοντες μπορούν να διαχέονται μέσα και έξω από τα βιοϋμένια μέσα σε δευτερόλεπτα ή λεπτά. Αυτό ισχύει μόνον εάν ο αντιμικροβιακός παράγοντας δεν αλληλεπιδρά με το βιοϋμένιο. Ωστόσο, η διάχυση μπορεί να καθυστερήσει πάρα πολύ εάν ο αντιμικροβιακός παράγοντας ε- ξουδετερώνεται καθώς διαχέεται εντός του βιοϋμενίου (113). Υπάρχουν μελέτες που κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι αρκετοί αντιμικροβιακοί παράγοντες μπορούν να ει- 61

62 σέλθουν στο βιοϋμένιο αλλά να μην μπορούν τελικά να σκοτώσουν τους μικροοργανισμούς ή να καταφέρνουν να τους σκοτώσουν σε πολύ χαμηλότερα ποσοστά σε σχέση με τα πλανκτονικά κύτταρα (114). iii. Αντλίες εκροής Ένας μηχανισμός που έχει πρόσφατα διερευνηθεί είναι ο ρόλος των αντλιών εκροής φαρμάκων, που κωδικοποιούνται από τα γονίδια CDR και MDR τόσο στα βιοϋμένια όσο και στα πλανκτονικά κύτταρα της C. albicans. Μέχρι στιγμής υπάρχουν πολύ λίγες μελέτες που έχουν διερευνήσει το ρόλο των αντλιών εκροής και κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι i) τα γονίδια των αντλιών εκροής υπερεκφράζονται κατά το σχηματισμό βιοϋμενίων και ii) αυτές οι αντλίες σχετίζονται με αντίσταση στην πρώιμη φάση της ανάπτυξης των βιοϋμενίων, αλλά όχι κατά τη διάρκεια των μεταγενέστερων σταδίων (22, 28). Στην P. aeruginosa έχουν βρεθεί 5 κατηγορίες αντλιών εκροής, με σημαντικότερη την οικογενεια αντλιών RND και ABC. Σκόπος τους είναι η μείωση της συγκέντρωσης των αντιμικροβιακών φαρμάκων που συσσωρεύονται στο εσωτερικό του κυτταρού. Αυτό επιτυγχάνεται με την ενεργή μεταφορά μέσω των διαμεμβρανικών καναλιών που εκτείνονται σε ολόκληρη την κυτταροπλασματική μεμβράνη και επιτρέπουν την μεταφορά λιποφιλικών και αμφιφιλικών φαρμάκων από το κυτταρόπλασμα στο εξωτερικό περιβάλλον ( ). iv. Εμμένοντα κύτταρα (Persister cells) Η παρουσία ανθεκτικών κυττάρων μέσα στο βιοϋμένιο είναι μια σχετικά πρόσφατη εξήγηση που αρχικά αναπτύχθηκε για να εξηγήσει την αυξημένη αντίσταση των βακτηριακών βιοϋμενίων σε διάφορους αντιμικροβιακούς παράγοντες (27). Αυτή η θε- 62

63 ωρία φαίνεται να ισχύει και στην περίπτωση των βιοϋμενίων της Candida (28). Τα ανθεκτικά κύτταρα, λειτουργούν όπως και τα ενδοσπόρια των βακτηριων. Δηλαδή, έχουν μειωμένους μεταβολικούς ρυθμούς και χαμηλούς ρυθμούς ανάπτυξης. Όταν ένα βιοϋμένιο επωάζεται με ένα αντιμικροβιακό παράγοντα, ένα μεγάλο μέρος των μικροοργανισμών εξουδετερώνονται εύκολα από αυτόν, ενώ ένα πολύ μικρό ποσοστό επιβιώνει και παραμένει "προστατευμένο" στο βιοϋμένιο. Τα κύτταρα που επιβιώνουν δεν είναι μεταλλαγμένα στελέχη του άγριου τύπου των μικροοργανισμών, αλλά συνιστούν φαινοτυπικές παραλλαγές του. Αυτή η θεωρία μπορεί να εξηγήσει την υποτροπιάζουσα φύση των λοιμώξεων που σχετίζονται με το σχηματισμό βιοϋμενίων. Αν και σε μικρούς σχετικά αριθμούς, τα ανθεκτικά κύτταρα έχουν την δυνατότητα να επανατροφοδοτούν το βιοϋμένιο με νέα κύτταρα μετά από μια καταστροφική επίθεση από κάποιο αντιμικροβιακό παράγοντα. v. Γονίδια βιοϋμενίων Υπάρχουν γονίδια που ανήκουν στην οικογένεια ALS, τα οποία κωδικοποιούν πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην προσκόλληση της C. albicans σε διάφορες επιφάνειες. Στα βιοϋμένια παρατηρείται διαφορική έκφραση αυτών των γονιδίων σε σχέση με τα πλανκτονικά κύτταρα (1, 3). Η έκφραση των ALS γονιδίων ρυθμίζεται διαφορικά κατά την διάρκεια της μετάβασης της Candida από την πλανκτονική της μορφή στο βιοϋμένιο. Ο σχηματισμός της εξωκυττάριας ουσίας που σχετίζεται με το σχηματισμό βιοϋμενίων στην C. albicans υποδηλώνει ότι τα γονίδια που κωδικοποιούν ένζυμα που εμπλέκονται στη σύνθεση υδατανθράκων ρυθμίζονται διαφορετικά κατά την ανάπτυξη του βιοϋμενίου. Είναι ε- πίσης δυνατό να υπερεκφράζονται γονίδια τα οποία σχετίζονται με την αυξημένη αντίσταση των βιοϋμενίων στα αντιμικροβιακά φάρμακα, γεγονός που σχετίζεται και με τις 63

64 αυξημένες MIC που παρατηρήθηκαν στα βιοϋμένια της C. albicans. Τέλος, η εμφάνιση μιας καλά διαμορφωμένης βασικής στιβάδας στη ζύμη που ακολουθείται και από αυξημένη παραγωγή εξωκυττάριας ουσίας υποδεικνύει επίσης ότι τα γονίδια που εμπλέκονται με αίσθηση απαρτίας (quorum sensing) είναι σημαντικά, όπως είναι η περίπτωση με το Pseudomonas spp. (9, 14, 33). Μπορεί επίσης να υπάρχει αυξημένη έκφραση των γονιδίων που σχετίζονται με την αντίσταση σε φάρμακα όπως τα CDR1, CDR2 και MDR. Η ύπαρξη του καλά χαρακτηρισμένου γονιδιώματος της C. albicans και ή ύπαρξη διαφόρων στελεχών Candida με μεταλλαγμένα γονίδια θα συμβάλει τα μέγιστα στην ταχεία μελέτη και αξιολόγηση των δυνατοτήτων αυτών. Είναι γενικά αποδεκτό ότι η αυξημένη αντίσταση των βιοϋμενίων σε διάφορους αντιμικροβιακούς / αντιμυκητιακούς παράγοντες είναι ένα πολυλειτουργικό φαινόμενο που δεν μπορεί να εξηγηθεί εξ ολοκλήρου από οποιαδήποτε από τις παραπάνω θεωρίες μεμονωμένα. H C. albicans είναι ένας αρκετά διαδεδομένος συμβιωτικός μικροοργανισμός του ανθρώπου. Παρόλα αυτά έχει την ικανότητα να προσβάλει πολλαπλούς ιστούς και να προκαλεί απειλητικές λοιμώξεις σε ανοσοκατεσταλμένους ασθενείς (66). Η μετάβαση αυτή από συμβιωτικό σε παθογόνο μικροοργανισμό σχετίζεται με πλήθος αλλαγών, συμπεριλαμβανομένων και αλλαγών στην έκφραση γονιδίων που κωδικοποιούν τις πρωτεΐνες του κυτταρικού τοιχώματος και διαφόρων ενζύμων που εκκρίνονται ( ). Για να επιτευχθεί αυτή η ακραία προσαρμοστικότητα, η C. albicans έχει αναπτύξει διάφορους γενετικούς μηχανισμούς που διαφοροποιούν τη συμπεριφορά και τη μορφολογία των κυττάρων της σε συνάρτηση με τις συνθήκες του περιβάλλοντος. Το πιο χαρακτηριστικό παράδειγμα θα μπορούσε να χαρακτηριστεί η μετάβαση από τον λευκό στον αδιαφανή τύπο κυττάρων (white-opaque switch). Πρόκειται για μια κληρονομική 64

65 και αναστρέψιμη μετάβαση στην οποία τα κύτταρα μεταβαίνουν από τον λευκό τους φαινότυπο, στον οποίο είναι σφαιρικά και σχηματίζουν λείες αποικίες, στον αδιαφανή τους φαινότυπο όπου εμφανίζονται επιμήκη σε πιο σκούρες και πεπλατυσμένες αποικίες (122). Η εναλλαγή ρυθμίζεται από ένα σύνολο μεταγραφικών παραγόντων που λειτουργούν σε συνδυασμό είτε θετικά είτε αρνητικά όσον αφορά την έκφραση κάποιων γονιδίων (123, 124). Παρόμοια δίκτυα έχουν παρατηρηθεί σε πολλά βιολογικά συστήματα και διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην γονιδιακή ρύθμιση των οργανισμών σε διάφορα στάδια της ανάπτυξής τους (124, 125). Οι δυο παραπάνω φαινοτυπικές παραλλαγές του μύκητα (white-opaque cells) έχουν σημαντικές διαφορές στην ανάπτυξη και στην συμπεριφορά τους με πιο σημαντική την ικανότητα τους να αναπαράγονται σεξουαλικά. Τα αδιαφανή (opaque) κύτταρα είναι ικανά να εκκρίνουν φερομόνες ικανές να προσελκύουν και να προκαλούν ζευγάρωμα ανάμεσα σε κύτταρα C. albicans διαφορετικού φύλου (126). Οι φερομόνες προκαλούν στα αδιαφανή κύτταρα μεταγωγή σημάτων που οδηγούν στην υπερέκφραση γονιδίων που σχετίζονται τόσο με την κυτταρική όσο και με την πυρηνική ένωση όσο και με το σχηματισμό αναπαραγωγικών προεκβολών ( ). Από την άλλη, τα λευκά (white) κύτταρα είναι λιγότερο αποτελεσματικά στο ζευγάρωμα (126) αλλά έ- χουν την ικανότητα, σε απάντηση των φερομονών που εκκρίθηκαν από τα αδιαφανή κύτταρα, να προσκολλούνται σε διάφορες επιφάνειες και να δημιουργούν βιοϋμένια (130). Τα βιοϋμένια σχηματίζονται όταν κύτταρα μικροοργανισμών κολλούν σε μια ε- πιφάνεια και στη συνέχεια ωριμάζουν εξαιτίας της παρουσίας υφών ή ψευδουφών που δημιουργούνται και της παραγωγής εξωκυττάριας ουσίας (131, 132). 65

66 Ο σχηματισμός υφών στην C. albicans έχει αποδειχτεί ότι είναι ένας απαραίτητος και σημαντικός λοιμογόνος παράγοντας με επιπτώσεις στην διεισδυτική ικανότητα του μύκητα και επίσης παίζει σημαντικό ρόλο στον σχηματισμό των βιοϋμενίων μιας και σε μεταλλαγμένα στελέχη η δημιουργία βιοϋμενίων ήταν προβληματική (131). Η δημιουργία υφών μπορεί να οδηγήσει άμεσα στην καταστροφή των ιστών του ξενιστή καθώς επιτίθονται στα επιθηλιακά ή στα δενδριτικά κύτταρα και διαφοροποιούν την αντιμυκητιακή δράση των μηχανισμών φυσικής ανοσίας (58, 59, 133, 134). Παρόλα αυτά, ο ακριβής αριθμός των γονιδίων που σχετίζονται με τον σχηματισμό υφών και ο μηχανισμός που διέπει την έκφρασή τους δεν είναι ακόμα πλήρως κατανοητός. Πρόσφατες έρευνες κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι μια ομάδα 6 διαφορετικών γονιδίων σχετίζονται άμεσα με τον σχηματισμό υφών. Αυτή η ομάδα περιλαμβάνει τα ALS3, ECE1, HGT2, HWP1, IHD1 και RBT1 γονίδια που σχετίζονται με την κωδικοποίηση και παραγωγή πρωτεϊνών του κυτταρικού τοιχώματος (64, 65, 135). Η εξωκυττάρια ουσία είναι πολύ σημαντική για το σχηματισμό του ώριμου βιοϋμενίου (2). Η εξωκυττάρια ουσία έχει αποδειχθεί ότι όχι μόνο βοηθά στην προσκόλληση του βιοϋμενίου σε μία επιφάνεια αλλά ταυτόχρονα προστατεύει τα κύτταρα από την αντιμικροβιακή δράση διαφόρων φαρμάκων αλλά και από τη δράση των κυττάρων της φυσικής ανοσίας του ξενιστή (101, ). Ένα βασικό συστατικό της εξωκυττάριας ουσίας του βιοϋμενίου της C. albicans είναι η β-1,3 γλυκάνη (140, 141) και έχει αποδειχθεί ότι η αύξηση της παραγωγής της γλυκάνης σχετίζεται άμεσα με την αύξηση του βιοϋμενίου (141). Η παραγωγή της γλυκάνης τόσο του κυτταρικού τοιχώματος όσο και της εξωκυττάριας ουσίας γίνεται από εξειδικευμένα μονοπάτια με κυριότερο το μονοπάτι που κωδικοποιείται από το γονίδιο FKS1 (101, 142). Παρόλα αυτά, η διαδικασία μεταφοράς της γλυκάνης από το κυτταρικό τοίχωμα και η εναπόθεση της 66

67 στην εξωκυττάρια ουσία παραμένει άγνωστη. Το γονίδιο BGL2 κωδικοποιεί μια γλυκανοτρανσφεράση που αποδείχθηκε ότι παίζει σημαντικό ρόλο στο επανασχηματισμό και μορφοποίηση του κυτταρικού τοιχώματος και ειδικότερα στην επιμήκυνση της αλυσίδας της γλυκάνης και στο σχηματισμό συνδέσεων κατά την ανάπτυξη των πλανκτονικών κυττάρων της C. albicans και στην S. cerevisiae (50-52, 100, ). Προηγούμενες μελέτες σε δύο βακτήρια (P. aeruginosa και Streptococcus spp) έδειξαν ότι παρόμοια γονίδια κωδικοποιούσαν ένζυμα τα οποία έπαιζαν σημαντικό ρόλο στην μεταφορά και εναπόθεση της γλυκάνης στην εξωκυττάρια ουσία κατά το σχηματισμό του βιοϋμενίου (139, 147). Επίσης πρέπει να τονιστεί ότι το ένζυμο που κωδικοποιεί το γονίδιο BGL2 επηρεάζει την μεταφορά γλυκάνης αλλά δεν έχει μεγάλο αντίκτυπό στην κατασκευή και στο σχήμα του κυτταρικού τοιχώματος ούτε στη συγκέντρωση της β-1,3 γλυκάνης, γεγονός που δείχνει ότι ο ρόλος τους περιορίζεται μόνο στη μεταφορά της γλυκάνης κατά τη διάρκεια σχηματισμού του βιοϋμενίου. Επίσης πρόσφατες έρευνες έδειξαν ότι κατά το σχηματισμό βιοϋμενίων in vivo παρατηρήθηκε αυξημένη έκφραση των γονιδίων που σχετίζονται με την μεταφορά της γλυκάνης όπως είναι το Bgl2 (18) γεγονός που αποδεικνύει την άμεση σχέση των γονιδίων αυτών με τον σχηματισμό της εξωκυττάριας ουσίας. Υπάρχουν δυο θεωρίες που εξηγούν το πιθανό μηχανισμό δράσης αυτών των ενζύμων. Ένας αναφέρει ότι τα ένζυμα απελευθερώνουν και τροποποιούν την γλυκάνη για να μπορέσει να εναποτεθεί στην εξωκυττάρια ουσία. Μια εναλλακτική ε- ξήγηση, αναφέρει ότι τα ένζυμα αυτά δουν στον εξωκυττάριο χώρο και αλλάζουν την δομή της γλυκάνης για να σχηματιστεί η εξωκυττάρια ουσία. Το γονίδιο BGL2 βρέθηκε στο κυτταρικό τοίχωμα ενισχύοντας την υπόθεση ότι δρα στο κυτταρικό τοίχωμα και επίσης ότι έχει εκκριτικές αλληλουχίες που σχετίζονται με την εξωκυττάρια του δράση (148). 67

68 Επίσης, το κυτταρικό τοίχωμα του παθογόνου μύκητα C. albicans, είναι διακλαδισμένο με β-1,3 (β-1,3 γλυκάνη) και β-1,6 δεσμούς (β-1,6 γλυκάνη). Το γονίδιο SKN1 είναι απαραίτητο για τη σύνθεση της β-1,6-γλυκάνης στους μύκητες, υπερεκφράζεται κατά το σχηματισμό των υφών (97) και είναι απαραίτητο για τα αρχικά στάδια παραγωγής της β-1,6-γλυκάνης (149). Τέλος, το βασικό δίκτυο γονιδίων που ελέγχει τον σχηματισμό βιοϋμενίων έχει πρόσφατα μελετηθεί και σε μεγάλο βαθμό αποσαφηνιστεί και περιλαμβάνει πλήθος μεταγραφικών παραγόντων που ελέγχουν τη δημιουργία βιοϋμενίων. Οι 6 πιο σημαντικοί μεταγραφικοί παράγοντες και ρυθμιστές είναι οι Bcr1, Brg1, Efg1, Rob1, Ndt80 και Tec1 που κωδικοποιούνται από τα αντίστοιχα γονίδια Bcr1, Brg1, Efg1, Rob1, Ndt80 και ΤΕC1 (150). Απώλεια κάποιου από αυτούς οδήγησε σε προβληματικό ή ελλιπές βιοϋμένιο τόσο σε in vitro όσο και σε in vivo μοντέλα (150). Οι Hwp1, Hwp2, και Rbt1 είναι τρεις ειδικές πρωτεΐνες του κυτταρικού τοιχώματος που σχετίζονται με τη δημιουργία υφών και υπερεκφράζονται κατά τη διάρκεια του ζευγαρώματος των κυττάρων του μύκητα (71, 81, 135, 151). Hwp2 είναι μια καλώς χαρακτηρισμένης πρωτεΐνη που σχετίζεται με την συγκόλληση των κυττάρων στα επιθηλιακα κύταρα του ξενιστή, έχει λοιμογόνο δράση (135) και συμμετέχει στο σχηματισμό βιοϋμενίων (71). 8. Ανοσία και λοιμώξεις που σχετίζονται με βιοϋμένια Οι μηχανισμοί άμυνας του ξενιστή έναντι μυκήτων και βακτηρίων είναι πολυάριθμοι, και αποτελούνται από: 68

69 i) τη φυσική ανοσία και τους προστατευτικούς μηχανισμούς που παρουσιάστηκαν νωρίς στην εξέλιξη των πολυκύτταρων οργανισμών και περιλαμβάνουν τα φυσικά εμπόδια του οργανισμού (δέρμα, βλεννογόνους), τη φυσιολογική μικροβιακή χλωρίδα και τα φαγοκύτταρα (ουδετερόφιλα, μονοπύρηνα λευκοκυττάρα) και τα δενδριτικά κύτταρα) (32, 33). ii) τους μηχανισμούς ειδικής άμυνας, οι οποίοι επάγονται κατά τη διάρκεια της ασθένειας (Τ-λεμφοκύτταρα και ειδικότερα τα CD4 + κύτταρα) (32, 34). Η φυσική ανοσία παραδοσιακά, θεωρείται μόνο ως μια πρώτη γραμμή άμυνας. Σκοπός της φυσικής ή μη-ειδικής ανοσίας (έλλειψη εξειδίκευσης) είναι να αναγνωρίζει τους μικροοργανισμούς, ανεξάρτητα αν είναι βακτήριο ή μύκητας, να τους καταστρέφει με τη βοήθεια των φαγοκυττάρων και να εκθέτει στην επιφάνεια των φαγοκυττάρων τμήματα νεκρών μικροοργανισμών. Στη συνέχεια, με την παραγωγή και έκκριση φλεγμονωδών μεσολαβητών, συμπεριλαμβανομένων χημειοκινών και κυτοκινών, συμμετέχει ενεργά στην ενεργοποίηση της ειδικής άμυνας. Η ανοσολογική απόκριση ποικίλει σε σχέση με τα είδη μυκήτων που συναντά ένας οργανισμός. Η σημασία των αμυντικών μηχανισμών (ειδικών και μη-ειδικών) διαφέρει, ανάλογα με τον οργανισμό και την ανατομική θέση της μόλυνσης. Μέσα σε ένα είδος, η αναπτυξιακή μορφή του μικροοργανισμού (π.χ. παρουσία υφών ή ψευδοϋφών της C. albicans) μπορεί να είναι ένας σημαντικός αλλά και καθοριστικός παράγοντας της απόκρισης του ξενιστή. Αν και οι ζύμες και τα σπόρια φαγοκυττάρωνονται σχετικά αποτελεσματικά, αυτό δεν συμβαίνει και με τις υφές καθώς το μεγάλο μέγεθος τους εμποδίζει την αποτελεσματική φαγοκυττάρωσή τους. Οι παθογόνοι μύκητες έχουν α- ναπτύξει μηχανισμούς για να αντιμετωπίζουν την άμυνα του ξενιστή. Πράγματι, ορι- 69

70 σμένοι μύκητες έχουν εξελιχθεί ως ενδοκυτταρικά παράσιτα και μπορούν να επιβιώσουν μέσα σε φαγοκύτταρα, να αποφύγουν την θανάτωσή τους μέσω της φαγοκυττάρωσης και στη συνέχεια να εξαπλωθούν σε ολοκληρο το ξενιστή (21). Ουδετερόφιλα και μονοκύτταρα αναγνωρίζουν και φαγοκυτταρώνουν οψονοποιημένα και μη-οψονοποιημένα κύτταρα ζύμης μέσω υποδοχέων στην κυτταρική επιφάνεια (PRRs), συμπεριλαμβανομένων των Toll-like υποδοχέων (TLRs) και των υποδοχέων μαννόζης και β-γλυκάνης. Η δέσμευση σε μεμονωμένους TLRs και IL-1 υποδοχείς (IL-1R) ενεργοποιεί εξειδικευμένες αντιμυκητιακές λειτουργίες των ουδετεροφίλων και άλλων φαγοκυττάρων (2). 9. Μέθοδοι μελέτης των βιοϋμενίων Οι τεχνικές που χρησιμοποιούνται για τη μελέτη του βιοϋμενίου σε όλες τις φάσεις ανάπτυξής του καθώς και για την αξιολόγηση της μικροβιακής προσκόλλησης είναι: o Υπολογισμός μικροβιακού φορτίου Το βακτηριακό φορτίο ενός βιοϋμενίου μπορεί να εκτιμηθεί με τις συμβατικές εργαστηριακές τεχνικές, οι οποίες βασίζονται στην αποκόλληση των μικροβίων που έ- χουν προσκολληθεί σε μια επιφάνεια, στην καλλιέργειά τους σε θρεπτικά υλικά και στην καταμέτρηση των αποικιών τους σε τριβλία. Οι περισσότερο διαδεδομένες τεχνικές αποκόλλησης είναι οι τεχνικές της άμεσης επαφής του υλικού με θρεπτικό υλικό (152), της φυγοκέντρησης (149) και της εφαρμογής υπερήχων (153, 154). Οι παραπάνω 70

71 μέθοδοι αποτελούν έμμεσο τρόπο μελέτης τους βιοϋμενίου γιατί αν και παρέχουν ε- παρκή εκτίμηση για τον υπολογισμό του βακτηριακού φορτίου του, δεν παρέχουν πληροφορίες για τη δομή του. o Μικροσκόπιο φθορισμού Το συγκεκριμένο μικροσκόπιο επιτρέπει την άμεση παρατήρηση και καταγραφή μικροβίων μέσα στο βιοϋμένιο μέσω της έκθεσής του υπό εξέταση δείγματος σε υπεριώδη ακτινοβολία, κάτω από την επίδραση χρωστικών φθορισμού. Τα μικρόβια, προσκολλημένα ή μη, σημαίνονται με χρωστική φθορισμού όπως είναι η ισοθειοκυανική φλουορεσίνη (FITC). Το απλό μικροσκόπιο φθορισμού έχει το μειονέκτημα της ταυτόχρονης διέγερσης του φθορισμού του περιβάλλοντος που βρίσκεται εκτός του εστιακού βάθους παρατήρησης. o Μικροσκόπιο συνεστιακής σάρωσης (CLSM, Confocal Laser Scanning Microscopy) Αποτελεί μια τρισδιάστατη μέθοδο απεικόνισης ενός αντικειμένου με τη χρήση χρωστικών φθορισμού και δέσμης laser. Η βασική αρχή και παράλληλα το πλεονέκτημα της μεθόδου είναι η διέγερση φθορισμού κάθε φορά από ένα σημείο του δείγματος με τη χρήση laser. Με τη σκόπευση ενός σημείου η ένταση της ακτινοβόλησης μειώνεται απότομα πάνω και κάτω από το επίπεδο εστίασης καθώς η δέσμη του φωτός συγκλίνει ή αποκλίνει. Έτσι, επιτυγχάνεται μείωση της διέγερσης του φθορισμού του περιβάλλοντος που βρίσκεται εκτός του εστιακού επιπέδου που εξετάζεται. Οι εικόνες συντίθενται από ηλεκτρονικό υπολογιστή και δημιουργούνται τρισδιάστατες απεικονίσεις πολύπλοκων δομών. 71

72 10. Σύνηθεις μέθοδοι ανίχνευσης και εκτίμησης ανάπτυξης βιοϋμενίων Η εμφάνιση λοιμώξεων που σχετίζονται με βιοϋμένια, δημιούργησε σημαντικά διαγνωστικά προβλήματα για το κλινικό εργαστήριο. Αυτά τα προβλήματα ταξινομούνται σε πέντε κατηγορίες: ψευδώς αρνητικές καλλιέργειες, ορατοί αλλά όχι καλλιεργήσιμοι μικροοργανισμοί, υποτίμηση ή χαμηλή εκτίμηση της αποικίας, ακατάλληλο δείγμα και απώλεια ή ελάττωση της ευαισθησίας σε αντιμικροβιακά. Στη συνέχεια α- ναφέρονται οι κυριότερες μέθοδοι ανίχνευσης των βιοϋμενίων. i. Μέθοδος του σωληναρίου (Tube Method) Αποτελεί μια ποιοτική εκτίμηση του σχηματισμού βιοϋμενίων κατά την οποία γίνεται ανάπτυξη των μικροβίων σε TSB (trypticase soy broth) με 1% γλυκόζη σε σωληνάρια για 24 ώρες. Στη συνέχεια τα σωληνάρια στεγνώνουν και ξεπλένονται με PBS (phosphate buffer saline) και χρωματίζονται με κρυσταλλικό ιώδιο (0,1%). Έπειτα, τα σωληνάρια ξεπλένονται και στεγνώνουν. Ένδειξη σχηματισμού βιοϋμενίων αποτελεί η παρουσία ορατών λεπτών γραμμών στο τοίχωμα και τον πάτο του σωληναρίου (155). ii. Μέθοδος πλακών μικροτιτλοποίησης Θεωρείται μια καθιερωμένη εξέταση για την ανίχνευση του σχηματισμού βιοϋμενίων και αποτελεί την περισσότερο χρησιμοποιούμενη μέθοδο. Οι μικρο- 72

73 οργανισμοί αναπτύσσονται σε πλάκες πολυστυρενίου για 24 ώρες, και αφού ξεπλυθούν χρωματίζονται με διάλυμα κρυσταλλικού ιώδους (0,1%). Η ανίχνευση του σχηματισμού βιοϋμενίων γίνεται με μέτρηση της οπτικής πυκνότητας με φασματοφωτόμετρο ELISA (156). iii. Μέθοδος του ερυθρού του Congo Η ανάπτυξη των μικροοργανισμών γίνεται σε ΒΗΙ (brain heart infusion) άγαρ με 5% σουκρόζη και κόκκινο του Congo. Η παρουσία μαύρων αποικιών με μια ξηρή κρυσταλλική υφή πιστοποιούν θετικά αποτελέσματα σχετικά με το σχηματισμό βιοϋμενίων (157). Για την αξιόπιστη ανίχνευση του βιοϋμενίου, πριν την καλλιέργεια του δείγματος συστήνεται να γίνει προσπάθεια απομάκρυνσης από το υπόστρωμα των μικροοργανισμών που είναι πιθανό να εμπλέκονται με βιοϋμένια. Η απομάκρυνση αυτή γίνεται με στροβιλισμό ή υπερήχους. Η τεχνική που χρησιμοποιείται περισσότερο για τη μέτρηση των βιοϋμενίων είναι η μέθοδος πλάκας μικροτιτλοποίησης, στην οποία τα διασκορπισμένα κύτταρα των βιοϋμενίων τοποθετούνται σε ένα στερεό μικροβιολογικό μέσο, ό- που επωάζονται και μετρώνται. Χρωματομετρική μέθοδος XTT Η μέτρηση της βιωσιμότητας και του πολλαπλασιασμού των κυττάρων αποτελεί τη βάση για πολυάριθμες ίη vitro μελέτες που κατευθύνονται προς την ποσοτικοποίηση της απόκρισης ενός κυτταρικού πληθυσμού σε εξωτερικούς παράγοντες. Μελέτες πολλαπλασιασμού κυττάρων έχουν πραγματοποιηθεί με πρόσληψη ραδιοεπισημασμένης θυμιδίνης στο κυτταρικό DNA, όμως, η μέθοδος αυτή είναι χρονοβόρα και συνεπάγεται 73

74 τη χρήση επικίνδυνων υλικών. Η χρήση αλάτων του τετραζολίου, συμπεριλαμβανομένου του ΧΤΤ (2,3-δις (2-μεθοξυ-4-νιτρο-5-σουλφοφαινυλο) -2Η-τετραζόλιο-5-καρβοξ-ανιλιδίου), για τη μελέτη του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, της κυτταρικής βιωσιμότητας, ή / και της κυτταροτοξικότητας είναι μια ευρέως διαδεδομένη μέθοδος. Η χρήση της μεθόδου ΧΤΤ επιτρέπει τον γρήγορο προσδιορισμό σε πλάκες κυτταροκαλλιεργειών, και δίνει αποτελέσματα με μεγάλη ευαισθησία. Η μετατροπή του άλατος του τετραζολίου σε φορμαζάνη πραγματοποιείται στα μιτοχόνδρια των μεταβολικά ενεργών κυττάρων. Η αντίδραση αποδίδεται κυρίως σε ένζυμα των μιτοχονδρίων και φορείς ηλεκτρονίων, αν και ένας αριθμός άλλων μη μιτοχονδριακών ενζύμων συμβάλλουν σε σημαντικό βαθμό. Το ΧΤΤ, από ένα κίτρινο άλας του τετραζολίου, διασπάται στη φορμαζάνη, μια διαλυτή πορτοκαλί χρωστική ουσία, η οποία μπορεί να μετρηθεί με την απορρόφηση στα 490 (ή 450) nm. Η αναγωγή του ΧΤΤ απαιτεί ένα αντιδραστήριο σύζευξης ηλεκτρονίων. Παρακάτω δίνεται η αντίδραση αναγωγής του XTT. 74

75 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 75

76 76

77 6. ΣΚΟΠΟΣ Τα βιοϋμένια έχουν λάβει κεντρική θέση στη σύγχρονη ιατρική. Τα τελευταία χρόνια υπάρχει ένα συνεχώς αυξανόμενο ενδιαφέρον για τον ρόλο της φυσικής ανοσίας και των νεότερων αντιμικροβιακών φαρμάκων στον περιορισμό των βιοϋμενίων. Στη βιβλιογραφία υπάρχουν πολλές αναφορές που αφορούν στην αντοχή των βιοϋμενίων σε αντιβακτηριακά ή αντιμυκητιακά φάρμακα αλλά πολύ λιγότερες που σχετίζονται με ξένα σώματα (π.χ. καθετήρες) και βιοϋμένια (61, 75-77, ). Δεν υπάρχουν δεδομένα στην βιβλιογραφία σχετικά με την δράση της φυσικής α- νοσίας όπως αυτή εκφράζεται από την αντιβακτηριακή ή αντιμυκητιακή δράση των πολυμορφοπυρήνων φαγοκυττάρων σε συνδυασμό μάλιστα με αντιμικροβιακά φάρμακα. Η παρούσα μελέτη προσπαθεί να καλύψει αυτό το κενό και να συμβάλει στην κατανόηση της επίδρασης νεότερων αντιβακτηριακών και αντιμυκητιακών φαρμάκων καθώς και της φυσικής ανοσίας στην παραγωγή και εξουδετέρωση βιοϋμενίων από δύο σημαντικούς μικροοργανισμούς όπως είναι η Candida και η Pseudomonas. Έτσι θα είναι δυνατό να αναπτυχθούν νέες θεραπευτικές και ανοσοτροποποιητικές παρεμβάσεις για τον περιορισμό των λοιμώξεων που σχετίζονται με τη δημιουργία μικτών βιοϋμενίων από τους δύο μικροοργανισμούς. Συγκεκριμένα διερευνήθηκαν: i) H δράση 5 αντιβακτηριακών παραγόντων (αμικασίνη, σιπροφλοξασίνη, κεφταζιδίμη, κολιμυκίνη και κλαριθρομυκίνη - ξεχωριστά και σε συνδυασμό) τόσο έναντι πλανκτονικών κυττάρων όσο και έναντι βιοϋμενίων από P. aeruginosa.

78 ii) Ο συνδυασμός αντιβακτηριακών και αντιμυκητιακών παραγόντων έναντι μικτών βιοϋμενίων από C. albicans και P. aeruginosa. iii) Η δράση των ανθρώπινων φαγοκυττάρων (πολυμορφοπυρήνων) έναντι της P. aeruginosa και η συνδυαστική τους δράση με αντιμικροβιακούς παράγοντες. iv) Η φαγοκυτταρική ικανότητα των ανθρώπινων φαγοκυττάρων (πολυμορφοπυρήνων) έναντι μικτών βιοϋμενίων από C. albicans και P. aeruginosa και η συνδυαστική τους δράση με αντιβακτηριακούς και αντιμυκητιακούς παράγοντες. v) Η έκφραση των γονιδίων BGL2, SUN41 και ECE1 σε στέλεχος C. albicans που αποδεδειγμένα παράγει βιοϋμένιο σε συνδυασμό με την δράση αντιμυκητιακών φαρμάκων. 78

79 7. ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ 1. Ανάπτυξη μικροοργανισμών: Pseudomonas aeruginosa και Candida albicans Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκαν 8 στελέχη P. aeruginosa. Όλα ήταν κλινικά στελέχη που απομονώθηκαν από ασθενείς με κυστική ίνωση γεγονός που δικαιολόγησε την παραγωγή βιοϋμενίων από όλα τους. Τρία ήταν ανθεκτικά και 3 ευαίσθητα σε κάθε ένα από τους αντιμικροβιακούς παράγοντες που χρησιμοποιήθηκαν. Τα στέλεχη ήταν τα εξής: το Αμικασίνη-Ανθεκτικό (ΑΜΚr) και το Αμικασίνη-Ευαίσθητο (ΑΜΚs), το Κεφταζιδίμη-Ανθεκτικό (CEFr) και το Κεφταζιδίμη-Ευαίσθητο (CEFs), το Σιπροφλοξασίνη-Ανθεκτικό (CIPr) και το Σιπροφλοξασίνη-Ευαίσθητο (CIPs), το Μεροπενέμη-Ανθεκτικό (MERr) και το Μεροπενέμη-Ευαίσθητο (MERs). Επίσης χρησιμοποιήθηκε ένα συγκεκριμένο κλινικό στέλεχος C. albicans (C. albicans Μ61), που απομονώθηκε από ενδοφλέβιο καθετήρα. 2. Συντήρηση και αναζωπύρωση μικροοργανισμών: Pseudomonas aeruginosa και Candida albicans Η συντήρηση των μικροοργανισμών έγινε σε διάλυμα 25% γλυκερόλης και 75% πεπτόνης στους -25 C. Τα βακτήρια αναζωπυρώθηκαν σε τρυβλία Muller-Hinton ενώ οι μύκητες σε τρυβλία με Sabouraud Dextrose Agar στους 37 C για 48 ώρες. Ακολούθησε συλλογή αποικιών και ανάπτυξή τους σε υγρό καλλιεργητικό υλικό RPMI-1640 (με L- γλουταμίνη και χωρίς διττανθρακικό νάτριο, Gibco BRL Life Technologies Ltd.,Europe, Basel, Switzerland) για 24 ώρες υπό ήπια ανακίνηση. Κάτω από αυτές τις συνθήκες σχεδόν όλοι (>90%) οι μύκητες αναπτύχθηκαν με τη μορφή εκβλαστήσεων (budding yeasts). Στη συνέχεια, έγινε «πλύσιμο» τους. Τα βακτήρια καταμετρήθηκαν με την βοήθεια νεφελόμετρου ενώ οι μύκητες με αιμοκυτταρόμετρο. Οι τελικές συγκεντρώσεις

80 των μικροοργανισμων ήταν 10 6 /ml και η αραίωσή τους έγινε με 0,15 M PBS [phosphate buffered saline με ph 7.2 (Biochrom KG, Berlin, Germany)] 3. Παραγωγή βιοϋμενίων Τα απλά βιοϋμένια και για τα δύο είδη μικροοργανισμών παράχθηκαν με σχεδόν ίδιο τρόπο έτσι ώστε να έχουμε παρόμοιες συνθήκες κατα την παραγωγή των μικτών βιοϋμενίων από C. albicans και Pseudomonas spp. προσομοιάζοντας τις φυσιολογικές συνθήκες σχηματισμού βιοϋμενίων στον αυλό των ενδοαγγειακών καθετήρων. Για τα βιοϋμένια που σχετίζονταν αποκλειστικά με ένα μικροοργανισμό, αρχικά χρησιμοποιήθηκαν 10 6 μικροοργανισμοί/ml ενώ για τα μικτά βιοϋμένια που σχετίζονταν και με C. albicans και με P. aeruginosa, αρχικά χρησιμοποιήθηκαν 10 6 μικροοργανισμοί/ml από το κάθε στελεχος. Και στις δύο περιπτώσεις οι μικροοργανισμοί αναπτύχθηκαν in vitro, σε θρεπτικό υλικό RPMI-1640, μέσα σε πλάκες κυτταροκαλλιεργειών 96-βοθρίων (Corning Inc., New York, NY) στους 37 C πάνω σε γραμμικό ανακινητήρα (rocker table) για 48 ώρες σε περιβάλλον 5% CO2. Κατά αυτόν τον τρόπο στην επιφάνεια των βοθρίων δημιουργήθηκε γραμμική ροή, παρόμοια με τη ροή του αίματος μέσα στον αυλό των ενδοαγγειακών καθετήρων. Ο τελικός όγκος του διαλύματος ήταν 200μL. 4. Προετοιμασία αντιμικροβιακών παραγόντων Στη συγκεκριμένη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν αντιμικροβιακοί παράγοντες κατά των μικροοργανισμών της P. aeruginosa και της C. albicans. Οι αντιβακτηριακοί παράγοντες που χρησιμοποιήθηκαν ήταν η αμικασίνη (ΑΜΚ, BRIKLIN, Βιανεξ A.E., Ελλάδα, Bristol- Myers Squibb Co, USA), η κεφταζιδίμη (CEF, SOLVETAN, GlaxoSmithKline Α.Β.Ε.Ε., Ελ- 80

81 λάδα), η σιπροφλοξασίνη (CIP, CIPROXIN, Bayer Hellas A.B.E.E., Ελλάδα), η κλαριθρομυκίνη (CLA, KLARICID, Abbott Hellas Α.Β.Ε.Ε., Ελλάδα) και η κολιμυκίνη (CST, Norma Hellas A.E., Ελλάδα). Τα αντιμυκητιακά φάρμακα που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη ήταν η βορικοναζόλη (VRC, VFEND, Pfizer Inc., Groton, CT), η ποσακοναζόλη (PSC, NOXAFIL, Merck Sharp & Dohme Ltd, NJ), η κασποφουγκίνη (CAS, CANCIDAS, Merck, Whitehouse Station, NJ) και η ανιδουλαφουγκίνη (ANID, ECALTA, Pfizer Inc., Groton, CT). H ανασύσταση όλων των φαρμάκων έγινε με απεσταγμένο νερό. Τα διαλύματα των φαρμάκων διαχωρίστηκαν σε μικρές ποσότητες (aliquots των 15 ml) που φυλάχθηκαν για 2 μήνες στους -25 C. Οι τελικές αραιώσεις των φαρμάκων στα πειράματα έγιναν σε RPMI-1640 που ρυθμίστηκε σε ph 7,4 με 0,165 MOPS (morpholinepropanesulfonicacid, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Germany). 5. Προσδιορισμός ελάχιστων ανασταλτικών συγκεντρώσεων και δράση των αντιμικροβιακών παραγόντων Ο προσδιορισμός της ευαισθησίας των μικροοργανισμών έγινε μέσω προσδιορισμού της ελάχιστης ανασταλιτικής συγκέντρωσης (MIC, minimal inhibitory concentration) των φαρμάκων. Στην περίπτωση των πλανκτονικών οργανισμών προσδιορίστηκαν οι PL-MIC (planktonic MIC) με τη μέθοδο των μικροαραιώσεων CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute: το CLSI πρωτόκολλο Μ7-Α4 χρησιμοποιήθηκε για τα στελέχη της Pseudomonas, ενώ το CLSI πρωτόκολλο Μ27-Α2 χρησιμοποιήθηκε για τα στελέχη της Candida). Σύμφωνα με τα κριτήρια CLSI η PL-MIC ορίστηκε ως η ελάχιστη συγκέντρωση του φαρμάκου που προκάλεσε μακροσκοπικά «σημαντική αναστολή στην ανάπτυξη» του μικροοργανισμού. Η σημαντική αυτή αναστολή στην ανάπτυξη του μικροοργανισμού, που διαπιστώθηκε μακροσκοπικά, αντιστοιχούσε φωτομετρικά περίπου σε «50% αναστολή της ανάπτυξης» του μικροοργανισμού. Στην περίπτωση των βιοϋμενίων ως 81

82 ΜΙC (BF-MIC), ορίστηκε η ελάχιστη συγκέντρωση των φαρμάκων που προκαλούσε τουλάχιστον 50% ελάττωση στη μεταβολική δραστηριότητα των βιοϋμενίων σε σχέση με τα βιοϋμένια-μάρτυρες (control, ΒΥ που επωάστηκαν χωρίς φάρμακο). Στην παρούσα μελέτη, μετά το σχηματισμό τους, τα ώριμα βιοϋμένια πλύθηκαν με διάλυμα 0,15 M PBS. Στη συνέχεια σε κάθε βοθρίο προστέθηκαν 200 μl RPMI-1640 και 100 μl της αντίστοιχης συγκέντρωσης αντιμικροβιακής ουσίας και επωάστηκαν για α- κόμα 24 ώρες. Οι συγκεντρώσεις που χρησιμοποιήθηκαν σε όλα τα πειράματα κυμάνθηκαν για όλα τα αντιβακτηριακά από mg/l και για όλα τα αντιμυκητιακά από 0, mg/l, ανάλογα με το πείραμα και τις συνθήκες και πάντα σε υποδιπλάσιες συγκεντρώσεις για όλα τα φάρμακα. Ως μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν βιοϋμένια που επωάστηκαν χωρίς φάρμακο μόνο με RPMI-1640, Κάθε συνθήκη αντιπροσωπεύτηκε 8 φορές. Η δράση των αντιμικροβιακών φαρμάκων εκτιμήθηκε ως ποσοστό (%) καταστροφής των βιοϋμενίων (ελάττωση της μεταβολικής δραστηριότητάς τους) σε σχέση με το μάρτυρα (100% μεταβολική δραστηριότητα ή 0% καταστροφή) και έγινε με τη χρωματομετρική μέθοδο ΧΤΤ. 6. Απομόνωση ανθρώπινων ουδετεροφίλων (PMNs) Η απομόνωση των PMNs έγινε από περιφερικό αίμα υγιών εθελοντών δοτών. Από κάθε δότη ελήφθησαν 20 ml ολικού αίματος και συλλέχθηκαν σε ηπαρινισμένα σωληνάρια (10 IU Heparin/mL αίματος) και τα κύτταρα που απομονώθηκαν από κάθε δότη χρησιμοποιήθηκαν άμεσα και σε ένα πείραμα. Η επεξεργασία του αίματος έγινε κάτω από άσηπτες συνθήκες σε θάλαμο κάθετης νηματικής ροής (laminar flow hood). Η απομόνωση των PMNs έγινε με διαχωριστική φυγοκέντρηση διαβάθμισης πυκνότητας (gradient 82

83 centrifugation), όπου το δείγμα αίματος τοποθετήθηκε σε διάλυμα διαβάθμισης πυκνότητας έτσι ώστε τα κύτταρα σχηματίζαν διαφορετικά στρώματα (ζώνες) λόγω της διαφορετικής πυκνότητάς τους. Η διαδικασία που ακολουθήθηκε περιλάμβανε την τοποθέτηση του αίματος σε κωνικό σωληνάριο όπου προστέθηκε 3% δεξτράνη T500 (Pharmacia Biotech AB) σε αναλογία όγκων 2:1. Μετά από 20 λεπτά και αφού είχαν καθιζάνει τα ερυθροκύτταρα, α- φαιρέθηκε το υπερκείμενο διάλυμα και τοποθετήθηκε προσεκτικα πάνω από 10 ml διαλύματος φικόλης (Gibco BRL Life Technologies Ltd., Europe, Basel, Switzerland). Το φιαλίδιο φυγοκεντρήθηκε στα 400 x g για 30 λεπτά σε ψυχόμενη φυγόκεντρο (4 C) ώ- στε να διαχωριστούν τα λεμφοκύτταρα και μονοκύτταρα που σχημάτισαν ένα νεφελώδες στρώμα πάνω από το στρώμα της φικόλης, ενώ τα PMNs κατακρημνίστηκαν κάτω από τη φικόλη μαζί με τα ερυθρά αιμοσφαίρια. Στη συνέχεια, το υπερκείμενο πλάσμα απομακρύνθηκε και απέμεινε η στιβάδα με τα PMNs και τα ερυθρά. Ακολούθησε λύση των ερυθρών με προσθήκη απεσταγμένου νερού για 20 δευτερόλεπτα και στη συνέχεια διόρθωση της τονικότητας του διαλύματος με προσθήκη υπέρτονου ΝaCl 3%. Tα PMNs του εναιωρήματος αυτού αραιώθηκαν τελικά σε διάλυμα Hanks BSS (Hanks buffered salt solution, HBSS) που δεν περιείχε Ca 2+ και Mg 2+ (HBSS ) (Gibco BRL Life Technologies Ltd., Europe, Basel, Switzerland). Aκολούθησε φυγοκέντρηση στα 250 x g για 10 λεπτά. Στη συνέχεια, αφού απομακρύνθηκε το υπερκείμενο υγρό, το ίζημα των κυττάρων ε- παναδιαλύθηκε σε HBSS, καταμετρήθηκαντα κύτταρα στο μικροσκόπιο και διαλύθηκαν αναλόγως έτσι ώστε η τελική συγκέντρωση να είναι 10 6 κύτταρα/ml διαλύματος. 83

84 7. Μελέτη της συνδυαστικής δράσης PMNs, αντιμικροβιακών φαρμάκων και μικροοργανισμών Οι μικροοργανισμοί και των δυο ειδών (P. aeruginosa και C. albicans) και στις δυο αναπτυξιακές μορφές τους (ώριμα βιοϋμένια και πλανκτονικά κύτταρα) επωάστηκαν με ανθρώπινα πολυμορφοπύρηνα (PMNs). Η διαδικασία που ακολουθήθηκε ήταν παρόμοια. Τα ουδετερόφιλα (ΡΜΝ) που χρησιμοποιήθηκαν σε ένα εύρος E:T αναλογιών (effector : target, εκτελεστικό κύτταρο (PMN) : κύτταρο-στόχος (P. aeruginosa ή/και C. albicans) από 1:10 εως 10:1. Στη μελέτη της συνδυασμένης επίδρασης φαγοκυττάρων και αντιβακτηριακών παραγόντων επιλέχθηκαν δύο E:T αναλογίες (1:20 και 1:10) ενώ στην περίπτωση των αντιμυκητιακών φαρμάκων επιλέχθηκαν δύο E:T αναλογίες (1:1 και 5:1) και συγκεκριμένες συγκεντρώσεις φαρμάκων σε όλους τους δυνατούς συνδυασμούς. Η επιλογή έγινε με βάση αρχικά πειράματα ώστε η καταστροφή των βιοϋμενίων που προκαλούν τα φαγοκύτταρα, στις επιλεγμένες E:T αναλογίες, να μην ξεπερνούσε το 50% και επίσης ο αριθμός των φαγοκυττάρων, που απαιτήθηκε στο σύνολο των συνθηκών του πειράματος, να είναι πρακτικά επιτεύξιμος. Οι συγκεντρώσεις των αντιβακτηριακών φαρμακων που επιλέχθηκαν ήταν για όλους τους παράγοντες 2, 8 και 32 mg/l εκτός από την κλαριθρομυκίνη που ήταν 2, 20 και 200 mg/l, ενώ των αντιμυκητιακών φαρμάκων που επιλέχθηκαν ήταν: για τη VRC, 0,5, 2 και 32 mg/l για την PSC, 0,25, 1 και 16 mg/l για την CAS, 0,01, 0,06 και 1 mg/l και για την ANID 0,06, 0,12 και 0,5 mg/l. Η επιλογή των συγκεντρώσεων έγινε με βάση τις προσδιοριζόμενες MIC τόσο για τα πλανκτονικά (PL-MIC) όσο και για τα βιοϋμένια (BF-MIC) και με το σκεπτικό να βρίσκονταν στα κλινικά αποδεκτά όρια. Συνοπτικά η πειραματική διαδικασία περιλάμβανε τα παρακάτω βήματα. Αρχικα τα ώριμα ΒΥ που σχηματίστηκαν σε πλάκες κυτταροκαλλιεργειών με 96 βοθρία 84

85 πλύθηκαν με PBS. Παράλληλα, πλανκτονικά κύτταρα από την αρχική υγρή καλλιέργεια με μέγεθος ενοφθαλμίσματος 10 6 βλαστοκονίδια/ml τοποθετήθηκαν σε πλάκες κυτταροκαλλιεργειών με 96 βοθρία. Ακολούθησε προσθήκη του διαλύματος των φαγοκυττάρων στην κατάλληλη E:T αναλογία και επώαση για 24 ώρες ή/και προσθήκη φαρμάκου και επώαση για 24 ώρες σε θερμοκρασία 37 C και σε περιβάλλον 5% CO2. Στις βραχείες επωάσεις των οργανισμών με φαγοκύτταρα, τα διαλύματα γίνονταν σε RPMI- 1640, Στα πειράματα μελέτης της συνδυαστικής επίδρασης φαγοκυττάρων με καθένα από τα αντιμυκητιακά φάρμακα οι συνθήκες που ελέγχθησαν στα πειράματα ήταν οι εξής: τα PMNs χρησιμοποιήθηκαν σε αναλογία 1:1 και 5:1 για την Candida και σε αναλογία 1:20 και 1:10 για την Pseudomonas και συνδυάστηκαν με τρείς διαφορετικές συγκεντρώσεις φαρμάκων, C1, C2, και C3 mg/l, όπου C καθεμία από τις παραπάνω αναφερόμενες συγκεντρώσεις του κάθε αντιμικροβιακού. Παρακάτω είναι όλοι οι δυνατοί συνδυασμοί μεταξύ PMNs και φαρμάκων: PMNs (1:1) + C1, PMNs (1:1) + C2, PMNs (1:1) + C3, PMNs (5:1) + C1, PMNs (5:1) + C2, για Candida και PMNs (1:20) + C1, PMNs (1:20) + C2, PMNs (1:20) + C3, PMNs (1:10) + C1, PMNs (1:10) + C2, για PMNs (1:10) + C3 για Pseudomonas. Οι παραπάνω συνθήκες επωάστηκαν με ΒΥ και πλανκτονικά κύτταρα και κάθε συνθήκη μελετήθηκε τέσσερις φορές. Ως μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν ΒΥ και πλανκτονικά κύτταρα, ανάλογα, που ε- πωάστηκαν μόνο με RPMI-1640, Η επίδραση των φαγοκυττάρων μόνων ή σε συνδυασμό με τα φάρμακα εκτιμήθηκε ως ποσοστό (%) καταστροφής των μικροοργανισμών (ελάττωση της μεταβολικής δραστηριότητάς τους) σε σχέση με τους «μάρτυρες» (0% καταστροφή) με τη χρωματομετρική μέθοδο ΧΤΤ. 85

86 8. Ποσοτική δοκιμασία ΧΤΤ Η επίδραση των φαγοκυττάρων ή/και των αντιμικροβιακών φαρμάκων στη μεταβολική δραστηριότητα των μικροοργανισμών έγινε φωτομετρικά με τη χρήση του τετραζολικού άλατος ΧΤΤ 2, 3 - bis [2 methoxy 4 nitro 5 - sulfophenyl] 2H tetrazolium carboxanilide, 0,25 mg/ml; Sigma) μαζί με το συνένζυμο Q0 (2, 3 dimethoxy 5 methyl - 1, 4 - benzoquinone, 40 μg/ml; Sigma). Τα άλατα τετραζολίου διείσδυσαν γρήγορα στην κυτταρική μεμβράνη των ζωντανών κυττάρων και των μιτοχονδρίων όπου και ανάχθηκαν σε έγχρωμα προϊόντα φορμαζάνης. Η αντίδραση αυτή καταλύθηκε από το ενζυμικό σύστημα των αφυδρογονασών και συνεπώς η αναγωγή αυτή (αλλαγή χρώματος) αποτέλεσε δείκτη μεταβολικής δραστηριότητας (ή αντίστροφα καταστροφής) των κυττάρων. Διάφοροι τεχνητοί μεταφορείς ηλεκτρονίων (όπως η μεναδιόνη ή το συνένζυμο Q0) ενίσχυσαν την αντίδραση αυτή. Μετά την επώαση των μυκήτων με τα φαγοκύτταρα ή/και τα αντιμικροβιακά για 24 ώρες, οι πλάκες κυτταροκαλλιεργειών με 96 βοθρία φυγοκεντρήθηκαν στα 400 x g στους 10 C για 30 λεπτά. Το υπερκείμενο απορρίφθηκε και στη θέση του τοποθετήθηκε νερό για να γίνει λύση των φαγοκυττάρων και επαναλήφθηκε η φυγοκέντρηση. Το πλύσιμο αυτό έγινε άλλη μία φορά και στην συνέχεια στη θέση του νερού τοποθετήθηκαν 200 μl διαλύματος XTT-συνενζύμου Q0, Στη συνέχεια, οι πλάκες επωάστηκαν στο σκοτάδι για 30 λεπτά στους 37ºC και στη συνέχεια τα ελευθερα κύτταρα ιζηματοποιήθηκαν με νέα φυγοκέντρηση. Τέλος, μεταφέρθηκε από κάθε βοθρίο 100 μl από το υπερκείμενο (που ήταν προϊόν μεταβολισμού του ΧΤΤ δηλαδή προϊόντα φορμαζάνης) σε νέες πλάκες κυτταροκαλλιεργειών με 96 βοθρία και επίπεδο πυθμένα και μετρήθηκε η οπτική πυκνότητα στο φασματοφωτόμετρο (Anthos Labtech, Vienna, Austria) ρυθμισμένο στα 450/690 nm. Η αντιμικροβιακή δραστηριότητα εκφράστηκε σαν ποσοστό (%) της καταστροφής των μικροοργανισμών και υπολογίστηκε από τον τύπο: 100 (1-X/C), όπου Χ ο μέσος 86

87 όρος της οπτικής πυκνότητας από το μύκητα (ΒΥ ή πλανκτονικά) που επωάστηκε με φαγοκύτταρα ή/και φάρμακα και C ο μέσος όρος της οπτικής πυκνότητας των μαρτύρων (η καταστροφή τους θεωρείτο 0%). 9. Μοριακή ανάλυση γονιδίων που σχετίζονται με την C. albicans Αρχικά, εναιώρημα 106 βλαστοκονίδια/ml τοποθετήθηκε σε πλάκες κυτταροκαλλιεργειών 96-βοθρίων και επωάστηκε στους 37οC με συνεχή ανακίνηση. Το ΒΥ ε- πωάστηκε με RPMI-1640 για 12 και 18 ώρες αντιστοιχα για να σχηματιστούν ενδιάμεσα (intermediate) ΒΥ ή για 48 ώρες για να σχηματιστούν ώριμα ΒΥ. Στην συνέχεια, τα κύτταρα που δεν προσκολλήθηκαν και δεν συμμετείχαν στο ΒΥ ξεπλύθηκαν με PBS. Επίσης, παρασκεύαστηκαν διαλύματα αντιμυκητιακών φαρμάκων, VRC και ANID. Για την ANID, οι συγκεντρωσεις που χρησιμοποιήθηκαν ήταν 0,25 και 1 mg/l (ΑΝΙD ΒFMIC: 0,5 mg/l) και 128 και 512 mg/l (VRC BFMIC:512 mg/l). Η επώαση των ΒΥ με τα αντιμυκητιακά ήταν ανάλογη της ηλικίας των ΒΥ: Τα ΒΥ των 12 και 18 ωρών (BF12h και BF18h) επωάστηκαν 12 ώρες με το αντιμυκητιακό ενώ τα ΒΥ των 48 ωρών (ΒF48h) για 24 ώρες. Μετά την προσθήκη των αντιμυκητιακών ή του RPMI (control) στα πιάτα έγινε επώαση στους 37 o C. Τα ΒΥ, στη συνέχεια, πλύθηκαν με 0,2 ml παγωμένο PBS και αποκολλήθηκαν από τις πλάκες των 96-βοθρίων. Τα ΒΥ στη συνέχεια διαλύθηκαν σε 50 mm sodium acetate, 10 mm EDTA και στη μετά προστέθηκε 25% SDS και οξική φαινόλη (acid phenol). Το διάλυμα των κυτταρων στην συνέχεια επωάστηκε σε κυκλικές διαδικασίες στους 65 o C με ανακίνηση και στη συνέχεια ψύξη στους 5 o C. Κάθε βήμα διήρκησε μόνο ένα λεπτό οπότε η συνολική διάρκεια όλων των βημάτων ήταν 10 λεπτά. Στο υπερκέιμενο (0,5 ml), στη συνέχεια, προστέθηκε ίση ποσότητα χλωροφορμίου. Το συνολικό RNA που βρισκόταν στην υδατική φάση καθίζανε με ίση ποσότητα ισοπροπανόλης και 2Μ sodium acetate (ph 5,0). Μετά από φυγοκέντρηση το RNA πλύθηκε με 70% παγωμένη αιθανόλη 87

88 και διαλύθηκε σε 50 μl αποστειρωμένο RNA-free νερό. Το ποσό και η καθαρότητα του RNA μετρήθηκε με φασματοφωτόμετρο στα Α260 και Α260/280, Τα δείγματα στη συνέχεια αποθηκεύθηκαν στους -70 o C για λιγότερο από μια βδομάδα. Οι εξειδικευμένοι εκκινητές για τη PCR σχεδιάστηκαν με το πρόγραμμα Oligo7 primer analysis software. Προτεραιότητα δόθηκε σε εκκινητές με Tm ανάμεσα σε o C και με γονιδια bp. Η σύνθεση του cdna και η ενίσχυση έγινε με τη βοήθεια της SuperScriptIII One-step RT-PCR και σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστη, InVitrogen. Οι αντιδράσεις PCR περιείχαν 10 mμ από τον κάθε εκκινητή, 2x διάλυμα μίξης, 2 μl superscript III RT/platinum Taq και 500 ng συνολικό RNA. To cdna συντεθηκε σε ένα κύκλο στους 53 ο C για 30 λεπτά μετά από ένα βήμα στους 94 o C για 10 λεπτά. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκαν 40 κύκλοι στους 94 ο C (15sec), 55 ο C (30 sec) και 72 ο C (60 sec). Ένα τελικό βήμα 5 λεπτών στους 72 ο C ολοκλήρωσε τη διαδικασία. Τα προιόντα της PCR στη συνέχεια διαχωρίστηκαν με 1,5% gel αγαρόζης και στη συνέχεια ιχνηθετήθηκαν με βρωμιούχο αιθίδιο. Η ποσότητα του DNA στη συνέχεια ποσοτικοποιήθηκε με το πρόγραμμα UviDoc (DOC-008, TFT; UVItec, Cambridge, UK). Η υπερέκφραση ή υποεκφραση των γονιδίων υπολογίστηκε μετρώντας την ένταση του σήματος ανάμεσα σε κύτταρα που επωάστηκαν με φάρμακα και σε αυτά που δεν επωάστηκαν. Τρία ανεξάρτητα πειράματα με PCR πραγματοποιήθηκαν σε κάθε περίπτωση. Μεταβολή της έκφρασης κατά 2-φορές θεωρήθηκε σημαντική. Εσωτερικό control χρησιμοποιήθηκε το mrna της ακτινης. 88

89 8. ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Για την καταχώρηση και ανάλυση των αποτελεσμάτων χρησιμοποιήθηκε το λογισμικό Microsoft Excel. Για την στατιστική ανάλυση των δεδομένων της μελέτης χρησιμοποιήθηκε το στατιστικό πρόγραμμα Instat (GraphPad Inc, San Diego, CA). Σε κάθε σκέλος της εργασίας έγινε ικανός αριθμός πειραμάτων, με σκοπό την ανάδειξη στατιστικά σημαντικών διαφορών. Κάθε πείραμα έγινε με τη χρήση πολυμορφοπύρηνων που προήλθαν από ένα δότη σε 6 επαναλήψεις για την κάθε συνθήκη. 1. Παραμετρικές Μέθοδοι ANOVA Για την ανάλυση των αποτελεσμάτων των πειραμάτων χρησιμοποιήθηκε η παραμετρική ανάλυση ANOVA με διόρθωση για πολλαπλές συγκρίσεις κατά Dunnett (πολλαπλό συγκριτικό τεστ). Όλες οι τιμές P είναι αμφίπλευρες και τιμές P<0,05 δείχνουν στατιστικά σημαντικές διαφορές. Η συνδυασμένη επίδραση των φαγοκυττάρων με τα αντιμυκητιακά φάρμακα εκτιμήθηκε ως εξής: υπολογίστηκε το ποσοστό (%) της ελάττωσης της μεταβολικής δραστηριότητας του μύκητα που προκλήθηκε από τα φαγοκύτταρα μόνο και από το αντιμυκητιακό φάρμακο μόνο και συγκρίθηκε με το αντίστοιχο ποσοστό που προκλήθηκε από το συνδυασμό φαγοκυττάρων και αντιμυκητιακού. Συνεργική ορίστηκε η αλληλεπίδραση όταν το αποτέλεσμα της επίδρασης του συνδυασμού ήταν σημαντικά μεγαλύτερο από το αθροιστικό αποτέλεσμα της επίδρασης των φαγοκυττάρων και του αντιμυκητιακού χωριστά. Αθροιστική ορίστηκε η αλληλεπίδραση όταν το αποτέλεσμα της επίδρασης του συνδυασμού ήταν σημαντικά μεγαλύτερο από το αποτέλεσμα της επίδρασης είτε μόνο των φαγοκυττάρων είτε μόνο του αντιμυκητιακού χωρίς όμως να είναι συνεργική. 89

90 2. Εφαρμογή του μαθηματικού μοντέλου Bliss Η ανάλυση του διπλού συνδυασμού αντιμικροβιακών παραγόντων έγινε με την εφαρμογή του μοντέλου Bliss. H εξίσωση που περιγράφει τη θεωρητική αναστολή της ανάπτυξης των μικροοργανισμών (ΙTHE) βασίζεται στην εξίσωση: ITHE = IA + IΒ (IA x IΒ) (11) όπου IA και IΒ είναι η επί της % αναστολή της ανάπτυξης των μυκήτων με την παρουσία δυο διαφορετικών αντιμικροβιακών παραγόντων. Προκειμένου να αναλύσουμε τις αλληλεπιδράσεις των παραγόντων που συνδυάζονται με βάση το μοντέλο Bliss, δημιουργήσαμε τις θεωρητικές καμπύλες συγκέντρωσης - αποτελέσματος με βάση την εξίσωση ITHE και τις πειραματικές καμπύλες με βάση τα πειραματικά αποτελέσματα. Στη συνέχεια, υπολογίστηκαν οι δείκτες αλληλεπίδρασης ΕC50,THE/ ΕC50,EXP, όπου ΕC50,THE και ΕC50,EXP οι θεωρητικές και πειραματικές φαρμακευτικές συγκεντρώσεις που αντιστοιχούν στο 50% της ανάπτυξής των μυκήτων, αντίστοιχα. Αν ο μέσος όρος και το 95% του διαστήματος εμπιστοσύνης είναι <1, τότε συμπεραίνουμε συνέργεια, ενώ αν είναι >1 συμπεραίνουμε ανταγωνισμό. 90

91 9. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 1. Επίδραση τεσσάρων αντιψευδομοναδικών παραγόντων (αμικασίνης, κεφταζιδίμης, σιπροφλοξασίνης, κολιμυκίνης) και κλαριθρομυκίνης σε βιοϋμένια και πλανκτονικά κύτταρα P. aeruginosa Στο συγκεκριμένο κομμάτι της μελέτης διερευνήθηκε η δράση αντιψευδομοναδικών παραγόντων και της κλαριθρομυκίνης σε οκτώ διαφορετικά κλινικά στελέχη P. aeruginosa. Για τον προσδιορισμό της ελάχιστης ανασταλτικής συγκέντρωσης (ΜΙC) φαρμάκων για τα πλανκτονικά κύτταρα, χρησιμοποιήθηκε τόσο η μεθοδος CLSI όσο και η χρωματομετρική μέθοδος ΧΤΤ [PL-MIC (CLSI) και PL-MIC (ΧΤΤ)]. Τα αποτελέσματα συνοψίστηκαν στον παρακάτω πίνακα (Πίνακας 9.1.1) και στα σχήματα (Σχήματα ). Στα σχήματα απεικονίστηκε η % καταστροφή των ΒΥ της P. aeruginosa (άξονας y), σε σχέση με διαδοχικές υποδιπλάσιες αραιώσεις του αντιμικροβιακού παράγοντα (άξονας x). Τα αποτελέσματα, για κάθε φάρμακο, είναι μέσοι όροι από 6 διαφορετικά πειράματα. Τα πρώτα δύο στελέχη ήταν το ένα ανθεκτικό (ΑΜΚr) και το άλλο ευαίσθητο (ΑΜΚs) στην αμικασίνη. Το ΑΜΚr εμφάνισε μεγαλύτερη ανθεκτικότητα στην αμικασίνη σε σχέση με το ΑΜΚs τόσο στα πλανκτονικά όσο και στα ΒΥ. Παρόλα αυτά, η μέγιστη καταστροφή των ΒΥ προκλήθηκε και στα δύο στελέχη στα 512 mg/l με καταστροφή που άγγιξε τη πλήρη εκρίζωση του στελέχους (ΑΜΚr: 92.4±2.3% και ΑΜΚs: 92.3±3.2%) (Σχήματα ). Παρόμοια συμπεράσματα μπόρεσαν να εξαχθούν και για τα άλλα δύο ζευγάρια στελεχών (CEFr vs CEFs και CΙΡr vs CΙΡs) όπου τα ανθεκτικά στελέχη παρουσίασαν μεγαλύτερη αντοχή στους αντιμικροβιακούς παράγοντες σε σχέση με τα ευαίσθητα. Η μέγιστη καταστροφή των ΒΥ που προκλήθηκε από την CEF ήταν 97.4±4.3% στα 256 mg/l για το CEFs και 78.0±1.9% στα 128 mg/l για το CEFr (Σχήματα

92 ). Επίσης, η μέγιστη καταστροφή των ΒΥ που προκλήθηκε και στα δύο στελέχη CΙΡr και CΙΡs ήταν στα 512 mg/l (CΙΡr: 95.1±5.6% και CΙΡs: 94.2±2.9%) (Σχήματα ). Τώρα όσον αφορά τα δύο στελέχη MERr και MERs, η μέγιστη καταστροφή των ΒΥ που προκλήθηκε και στα δύο στελέχη ήταν στα 128 mg/l (MERr: 88.1±2.2% και MERs: 94.1±3.4%) (Σχήματα ). Συμπερασματικά, θα μπορούσαμε να καταλήξουμε ότι ακόμα και σε μεγάλες συγκεντρώσεις αντιψευδομοναδικών παραγόντων δεν κατέστη δυνατή η πλήρης εκρίζωση στελεχών των ΒΥ. Επίσης, πρέπει να τονίσουμε ότι τα ΒΥ όλων των στελεχών έχουν σαφώς υψηλότερες MIC σε σχέση με τις πλανκτονικές μορφές τους. Πίνακας Ευαισθησία πλανκτονικών κυττάρων και βιοϋμενίων από στελέχη P. aeruginosa σε τέσσερις αντιψευδομοναδικούς παράγοντες mg/l AMKr AMKs CEFr CEFs CIPr CIPs PL MIC (CLSI) PL MIC (XTT) BF MIC (XTT) Συγκέντρωση που προκάλεσε τη μέγιστη καταστροφή στα ΒΥ Μέγιστη καταστροφή των ΒΥ (%) MERr (CST) MERs (CST) , ±2.3% 92.3 ±3.2% 78.0 ±1.9% 97.4 ±4.3% 95.1 ±5.6% 94.2 ±2.9% 88.1 ±2.2% 94.1 ±3.4% ΜΙC: ελάχιστη ανασταλτική συγκέντρωση, PL: πλανκτονικό, BF: βιοϋμένιο, ΑΜΚ: αμικασίνη, CEF: κεφταζιδίμη, CIP: σιπροφλοξασίνη, MER: μεροπενέμη, CST: κολιμυκίνη, R: ανθεκτικό, S: ευαίσθητο) 92

93 % Καταστροφή μικροοργανισμών στελέχους ΑΜΚs % Καταστροφή μικροοργανισμών στελέχους ΑΜΚr Πλαγκτονικά κύτταρα Βιοϋμένια Συγκέντρωση Αμικασίνης (ΑΜΚ, mg/l) Σχήμα In vitro δράσεις της αμικασίνης (ΑΜΚ) έναντι βιοϋμενίων από το στέλεχος P. aeruginosa ΑΜΚr. Με μπλε χρώμα παριστάνονται τα πλανκτονικά κύτταρα και με κόκκινο χρώμα τα βιοϋμένια. Η οριζόντια κόκκινη γραμμή παριστά τη MIC-50% Συγκέντρωση Αμικασίνης (ΑΜΚ, mg/l) Σχήμα In vitro δράσεις της αμικασίνης (ΑΜΚ) έναντι βιοϋμενίων από το στέλεχος P. aeruginosa ΑΜΚs. Με μπλε χρώμα παριστάνονται τα πλανκτονικά κύτταρα και με κόκκινο χρώμα τα βιοϋμένια. Η οριζόντια κόκκινη γραμμή παριστά τη MIC-50%. 93

94 % Καταστροφή μικροοργανισμών στελέχους CEFs % Καταστροφή μικροοργανισμών στελέχους CEFr Συγκέντρωση Κεφταζιδίμης (CEF, mg/l) Σχήμα In vitro δράσεις της κεφταζιδίμης (CEF) έναντι βιοϋμενίων από το στέλεχος P. aeruginosa CEFr. Με μπλε χρώμα παριστάνονται τα πλανκτονικά κύτταρα και με κόκκινο χρώμα τα βιοϋμένια. Η οριζόντια κόκκινη γραμμή παριστά τη MIC-50% Συγκέντρωση Κεφταζιδίμης (CEF, mg/l) Σχήμα In vitro δράσεις της κεφταζιδίμης (CEF) έναντι βιοϋμενίων από το στέλεχος P. aeruginosa CEFs. Με μπλε χρώμα παριστάνονται τα πλανκτονικά κύτταρα και με κόκκινο χρώμα τα βιοϋμένια. Η οριζόντια κόκκινη γραμμή παριστά τη MIC-50%. 94

95 % Καταστροφή μικροοργανισμών στελέχους CIPs % Καταστροφή μικροοργανισμών στελέχους CIPr Συγκέντρωση Σιπροφλοξασίνης (CΙΡ, mg/l) Σχήμα In vitro δράσεις της σιπροφλοξασίνης (CΙΡ) έναντι βιοϋμενίων από το στέλεχος P. aeruginosa CΙΡr. Με μπλε χρώμα παριστάνονται τα πλανκτονικά κύτταρα και με κόκκινο χρώμα τα βιοϋμένια. Η οριζόντια κόκκινη γραμμή παριστά τη MIC-50% Συγκέντρωση Σιπροφλοξασίνης (CΙΡ, mg/l) Σχήμα In vitro δράσεις της σιπροφλοξασίνης (CΙΡ) έναντι βιοϋμενίων από το στέλεχος P. aeruginosa CΙΡs. Με μπλε χρώμα παριστάνονται τα πλανκτονικά κύτταρα και με κόκκινο χρώμα τα βιοϋμένια. Η οριζόντια κόκκινη γραμμή παριστά τη MIC-50%. 95

96 % Καταστροφή μικροοργανισμών στελέχους MERs % Καταστροφή μικροοργανισμών στελέχους MERr Συγκέντρωση Κολιμυκίνης (CST,mg/L) Σχήμα In vitro δράσεις της Κολιμυκίνης (CST) έναντι βιοϋμενίων από το στέλεχος P. aeruginosa MERr. Με μπλε χρώμα παριστάνονται τα πλανκτονικά κύτταρα και με κόκκινο χρώμα τα βιοϋμένια. Η οριζόντια κόκκινη γραμμή παριστά τη MIC-50% Συγκέντρωση Κολιμυκίνης (CST,mg/L) Σχήμα In vitro δράσεις της Κολιμυκίνης (CST) έναντι βιοϋμενίων από το στέλεχος P. aeruginosa MERs. Με μπλε χρώμα παριστάνονται τα πλανκτονικά κύτταρα και με κόκκινο χρώμα τα βιοϋμένια. Η οριζόντια κόκκινη γραμμή παριστά τη MIC-50%. 96

97 2. Συνδυαστική δράση των ανθρώπινων πολυμορφοπύρηνων με α- ντιμικροβιακούς παράγοντες έναντι της P. aeruginosa. Η επίδραση των φαγοκυττάρων έναντι ΒΥ και πλανκτονικών κυττάρων της P. aeruginosa εκτιμήθηκε με τη χρωματομετρική μέθοδο ΧΤΤ. Στις πλάκες κυτταροκαλλιεργειών που υπήρχε ώριμο ΒΥ ή πλανκτονικά κύτταρα προστέθηκε ποσότητα PMNs σε Ε:Τ αναλογίες που κυμαινόταν από 1:20 μέχρι 1:10, Στην συνέχεια τα αποτελέσματα αναλύθηκαν στατιστικά και η καταστροφή των μικροοργανισμών εξαρτιόταν από την συγκέντρωση των PMNs. Συνολικα, η δράση των ουδετερόφιλων απέναντι στην P. aeruginosa ήταν περιορισμενη. Με εξαιρεση το στέλεχος ΑΜΚr και CEFs, η καταστροφή που προκάλεσαν τα ΡΜΝ στα ώριμα ΒΥ ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε σχέση με τα πλανκτονικά κύτταρα και κυμάνθηκε από 9%±1,4% για τα ΒΥ και από 11%±2,1% για τα πλανκτονικά κύτταρα του στελέχους ΑΜΚr(1:20; Μη στατιστικά σημαντικό)(σχ ). Για το ΑΜΚs στέλεχος οι αντίστοιχες τιμες ήταν 13,4%±1,8% για τα ΒΥ και 26,5%±2,9% (1:10; P <0,01) (Σχ ). Για το στέλεχος CEFr, οι αντίστοιχες τιμές ήταν 9.3% ±0,5% και 16.5% ±1.6% (1:20; P< 0,01) (Σχ ) και για το CEFs ήταν 18% ±4,1% έναντι 22% ±2,5% (1:10; Μη στατιστικά σημαντικό) (Σχ ). Ενώ για τα στελεχη CIPr και CIPs ήταν 14% ±2,6% έναντι 10% ±1.6% (1:20; Μη στατιστικά σημαντικό) (Σχ ) και 10% ±1,1% έναντι 22% ±5,4% (1:10; Μη στατιστικά σημαντικό) (Σχ ). Για την CST και την CLAR, δεν είχαμε στατιστικά σημαντικά αποτελέσματα και δεν παρατέθηκαν σχετικά στοιχεία. Γενικά, και για τις δυο κατηγορίες στελεχών, ανθεκτικά και ευαίσθητα, η % καταστροφη των ΒΥ από τα ΡΜΝ κυμάνθηκε από 9%-14% για 1:20 E:T και από 10% -18% για 1:10 E:T.(Σχημ ). Συγκριτικά, η καταστροφή των πλανκτονικών κυττάρων από τα ΡΜΝ κυμάνθηκε 11%-23% για 1:20 E:T και από 20% -32% για 1:10 E:T (Σχημ ). Η συνδυασμένη επίδραση των ανθρώπινων φαγοκυττάρων (PMNs) με καθένα από τους αντιψευδομοναδικούς παράγοντες (AMK, CIP, CEF, CST και CLAR) στα ΒΥ και στα πλανκτονικά κύτταρα από P. aeruginosa, μετά από 24 ώρες συνεπώασης, εκτιμήθηκε με τη χρωματομετρική μέθοδο ΧΤΤ. Στα σχήματα που ακολουθούν, φαίνεται συγκριτικά η συνδυασμένη επί-

98 δραση των φαγοκυττάρων με καθένα από τους αντιψευδομονδικούς παράγοντες στην καταστροφή της P. aeruginosa υπό μορφή ΒΥ και πλανκτονικών κυττάρων. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν σαν % ποσοστά της καταστροφής που προκαλείται στο βακτήριο (ελάττωση της μεταβολικής δραστηριότητάς του) από τα φαγοκύτταρα, τον παράγοντα ή το συνδυασμό τους σε σχέση με τα controls (βακτήριο που επωάστηκε μόνο με RPMI-1640, όπου η καταστροφή του θεωρείται 0%). Τα δεδομένα στα σχήματα αποτελούν μέσους όρους από διαφορετικά πειράματα (βλ. λεζάντα σχημάτων). 98

99 % Καταστροφή μικροοργανισμών P.aeruginosa - AMKr iv. Συνδυαστική δράση αμικασίνης (ΑΜΚ) Κατά τη συνεπώαση της ΑΜΚ με τα ΡΜΝ έναντι των ΒΥ και των πλανκτονικών κυττάρων της AMKr παρατηρήθηκαν αρκετά συνεργιστικά αποτελέσματα (ΒΥ, 1:20 με 2 mg/l και 1:10 με 8-32 mg/l; ΠΛΚ, 1:20 με 2 mg/l και 8 mg/l και 1:10 με 8 mg/l; P< 0,01, Σχ ). Αντίστοιχα, κατά τη συνδυαστική δράση της ΑΜΚ με τα ΡΜΝ παρατηρήθηκαν επίσης αρκετά συνεργιστικά αποτελέσματα και πιο συγκεκριμένα έναντι των ΒΥ biofilms (1:20 και 1:10 με 8 mg/l) και των πλανκτονικών κυττάρων (1:10 με 2 mg/l) της AMKs (P< 0,01, Σχ ). Για ολές τις υπόλοιπες συνθήκες παρατηρήθηκαν προσθετικές αλληλεπιδράσεις και σε καμια περίπτωση δεν παρατηρηθηκε ανταγωνισμός (Σχ ) PMN[1:10] + C3 PMN[1:10] + C2 PMN[1:10] + C1 PMN[1:20] + C3 PMN[1:20] + C2 PMN[1:20] + C1 AMK C3=32 mg/l AMK C2=8 mg/l AMK C1=2 mg/l PMN[1:10] PMN[1:20] Σχήμα Επίδραση αμικασίνης (AMK) σε συνδυασμό με ανθρώπινα φαγοκύτταρα (PMNs) στα βιοϋμένια και στα πλανκτονικά κύτταρα του στελέχους P. aeruginosa ΑΜΚr.

100 % Καταστροφή μικροοργανισμών P.aeruginosa - AMKs PMN[1:10] + C3 PMN[1:10] + C2 PMN[1:10] + C1 PMN[1:20] + C3 PMN[1:20] + C2 PMN[1:20] + C1 AMK C3=32 mg/l AMK C2=8 mg/l AMK C1=2 mg/l PMN[1:10] PMN[1:20] Σχήμα Επίδραση αμικασίνης (AMK) σε συνδυασμό με ανθρώπινα φαγοκύτταρα (PMNs) στα βιοϋμένια και στα πλανκτονικά κύτταρα του στελέχους P. aeruginosa ΑΜΚs. Σχήμα Επίδραση αμικασίνης (AMK) σε συνδυασμό με ανθρώπινα φαγοκύτταρα (PMNs) στα βιοϋμένια και στα πλανκτονικά κύτταρα των στελεχών P. aeruginosa AMKr και ΑΜΚs. Η στατιστική ανάλυση και οι συγκρίσεις έγιναν ανάμεσα στα δύο στελέχη. (*: p<0,005, **: p<0,01) 100

101 Σχήμα Επίδραση αμικασίνης (AMK) σε συνδυασμό με ανθρώπινα φαγοκύτταρα (PMNs) στα βιοϋμένια και στα πλανκτονικά κύτταρα των στελέχών P. aeruginosa AMKr και ΑΜΚs. Η στατιστική ανάλυση και οι συγκρίσεις έγιναν ανάμεσα σε ΒΥ και πλανκτονικά κύτταρα των δύο στελεχών. (*: p<0,005, **: p<0,01) 101

102 v. Συνδυαστική δράση κεφταζιδίμης (CEF) Η κεφταζιδίμη προκάλεσε στατιστικώς σημαντική καταστροφή στο ευαίσθητο στέλεχος (CEFs) σε σχέση με το ανθεκτικό (CEFr) στις συγκεντρώσεις 8 και 32 mg/l στα πλανκτονικά κύτταρα. Αντίθετα, η CEF προκάλεσε στατιστικώς σημαντική καταστροφή στα ΒΥ του CEFs σε σχέση με τα BY του CEFr μόνο στα 2 mg/l (p<0,01) (σχήμα 9.6.8). Επίσης, στα ΒΥ, σε όλες τις συγκεντρώσεις παρατηρήθηκε ότι η συνδυαστική δράση της CEF και των PMNs ήταν εμφανώς μικρότερη για το CEFr σε σχέση το CEFs με τα πλανκτονικά κύτταρα (p<0,01). Στα πλανκτονικά κύτταρα, σε συγκεκριμένες συνθήκες παρατηρήθηκε ότι η συνδυασμένη καταστροφή των PMNs και της CEF ήταν στατιστικώς μεγαλύτερη στο CEFs σε σχέση με το CEFr (PMNs 1: mg/l και PMNs 1: και 32 mg/l) (Σχήμα 9.6.8). Όταν τα ΒΥ συγκρίθηκαν με τα πλανκτονικά κύτταρα, παρατηρήθηκε ότι η καταστροφή των ΒΥ ήταν στατιστικώς μικρότερη σε σχέση με τα πλανκτονικά κύτταρα στο CEFr σε όλες τις συγκεντρώσεις φαρμάκων και ουδετεροφιλων. Αντίθετα, το ίδιο φαινόμενο παρατηρήθηκε μόνο σε ορισμένες συγκεντρώσεις (PMNs 1: mg/l και PMNs 1: mg/l) στο CEF-S (Σχήμα 9.6.9). Τέλος, ανταγωνισμός παρατηρήθηκε όταν τα PMNs σε Ε:Τ αναλογία 1:20 συνδυάστηκαν με CEF (8 και 32 mg/l) στα πλανκτονικά κύτταρα και 8 mg/l στα ΒΥ του CEFs. Επίσης ανταγωνισμός παρατηρήθηκε όταν τα PMNs σε Ε:Τ αναλογία 1:20 συνδυάστηκαν με CEF (2, 8 και 32 mg/l) στα πλανκτονικά κύτταρα του CEFr.

103 % Καταστροφή μικροοργανισμών P.aeruginosa - CEFs % Καταστροφή μικροοργανισμών P.aeruginosa - CEFr PMN[1:10] + C3 PMN[1:10] + C2 PMN[1:10] + C1 PMN[1:20] + C3 PMN[1:20] + C2 PMN[1:20] + C1 CEF C3=32 mg/l CEF C2=8 mg/l CEF C1=2 mg/l PMN[1:10] PMN[1:20] Σχήμα Επίδραση κεφταζιδίμης (CEF) σε συνδυασμό με ανθρώπινα φαγοκύτταρα (PMNs) στα βιοϋμένια και στα πλανκτονικά κύτταρα του στελέχους P. aeruginosa CEFr PMN[1:10] + C3 PMN[1:10] + C2 PMN[1:10] + C1 PMN[1:20] + C3 PMN[1:20] + C2 PMN[1:20] + C1 CEF C3=32 mg/l CEF C2=8 mg/l CEF C1=2 mg/l PMN[1:10] PMN[1:20] Σχήμα Επίδραση κεφταζιδίμης (CEF) σε συνδυασμό με ανθρώπινα φαγοκύτταρα (PMNs) στα βιοϋμένια και στα πλανκτονικά κύτταρα του στελέχους P. aeruginosa CEFs. 103

104 Σχήμα Επίδραση κεφταζιδίμης (CEF) σε συνδυασμό με ανθρώπινα φαγοκύτταρα (PMNs) στα βιοϋμένια και στα πλανκτονικά κύτταρα των στελεχών P. aeruginosa CEFr και CEFs. Η στατιστική ανάλυση και οι συγκρίσεις έγιναν ανάμεσα στα δύο στελέχη. (*: p<0,005, **: p<0,01) Σχήμα Επίδραση κεφταζιδίμης (CEF) σε συνδυασμό με ανθρώπινα φαγοκύτταρα (PMNs) στα βιοϋμένια και στα πλανκτονικά κύτταρα των στελέχών P. aeruginosa CEFr και CEFs. Η στατιστική ανάλυση και οι συγκρίσεις έγιναν ανάμεσα σε ΒΥ και πλανκτονικά κύτταρα των δύο στελεχών. (*: p<0,005, **: p<0,01) 104

105 % Καταστροφή μικροοργανισμών P.aeruginosa - CIPr vi. Συνδυαστική δράση σιπροφλοξασίνης (CIP) Η σιπροφλοξασίνη προκάλεσε δοσοεξαρτώμενες καταστροφές τόσο στα πλανκτονικά κύτταρα όσο και στα ΒΥ και των δύο στελεχών (σχήμα ) για όλες τις συγκεντρώσεις που ελέγχθηκαν. Όταν τα ΒΥ συγκρίθηκαν με τα πλανκτονικά κύτταρα, παρατηρήθηκε ότι η καταστροφή των ΒΥ ήταν στατιστικώς μικρότερη σε σχέση με τα πλανκτονικά κύτταρα στο CIPs σε όλες τις συγκεντρώσεις φαρμάκων και ουδετερόφιλων. Tο ίδιο φαινόμενο παρατηρήθηκε σχεδόν σε όλες τις συγκεντρώσεις φαρμάκων και ουδετερόφιλων για το CIPr, με εξαίρεση ορισμένων συνθήκες (PMNs 1: mg/l και PMNs 1: mg/l, p< 0,01) (Σχήμα ). Τέλος, συνέργεια παρατηρήθηκε όταν τα PMNs σε Ε:Τ αναλογία 1:20 και 1:10 συνδυάστηκαν με CIP (2 mg/l) στα πλανκτονικά κύτταρα ενώ ανταγωνισμός όταν τα PMNs σε Ε:Τ αναλογία 1:20 συνδυάστηκαν με CIP (32 mg/l) στα ΒΥ του CIPr. Επίσης ανταγωνισμός παρατηρήθηκε όταν τα PMNs σε Ε:Τ αναλογία 1:20 συνδυάστηκαν με CIP (2 mg/l) στα πλανκτονικά κύτταρα του CIPs και όταν τα PMNs σε Ε:Τ αναλογία 1:20 συνδυάστηκε με CIP (2 mg/l) και όταν τα PMNs σε Ε:Τ αναλογία 1:10 συνδυάστηκε με CIP (8 mg/l) στα ΒΥ του CIPs (Σχήμα ) PMN[1:10] + C3 PMN[1:10] + C2 PMN[1:10] + C1 PMN[1:20] + C3 PMN[1:20] + C2 PMN[1:20] + C1 CIP C3=32 mg/l CIP C2=8 mg/l CIP C1=2 mg/l PMN[1:10] PMN[1:20]

106 % Καταστροφή μικροοργανισμών P.aeruginosa - CIPs Σχήμα , Επίδραση σιπροφλοξασίνης (CIP) σε συνδυασμό με ανθρώπινα φαγοκύτταρα (PMNs) στα βιοϋμένια και στα πλανκτονικά κύτταρα του στελέχους P. aeruginosa CIPr PMN[1:10] + C3 PMN[1:10] + C2 PMN[1:10] + C1 PMN[1:20] + C3 PMN[1:20] + C2 PMN[1:20] + C1 CIP C3=32 mg/l CIP C2=8 mg/l CIP C1=2 mg/l PMN[1:10] PMN[1:20] Σχήμα Επίδραση σιπροφλοξασίνης (CIP) σε συνδυασμό με ανθρώπινα φαγοκύτταρα (PMNs) στα βιοϋμένια και στα πλανκτονικά κύτταρα του στελέχους P. aeruginosa CIPs. Σχήμα Επίδραση σιπροφλοξασίνης (CIP) σε συνδυασμό με ανθρώπινα φαγοκύτταρα (PMNs) στα βιοϋμένια και στα πλανκτονικά κύτταρα των στελεχών P. aeruginosa CIPr και CIPs. Η στατιστική ανάλυση και οι συγκρίσεις έγιναν ανάμεσα στα δύο στελέχη. (*: p<0,005, **: p<0,01) 106

107 Σχήμα Επίδραση σιπροφλοξασίνης (CIP) σε συνδυασμό με ανθρώπινα φαγοκύτταρα (PMNs) στα βιοϋμένια και στα πλανκτονικά κύτταρα των στελεχών P. aeruginosa CIPr και CIPs. Η στατιστική ανάλυση και οι συγκρίσεις έγιναν ανάμεσα σε ΒΥ και πλανκτονικά κύτταρα των δύο στελεχών. (*: p<0,005, **: p<0,01) 107

108 % Καταστροφή μικροοργανισμών P.aeruginosa MERr vii. Συνδυαστική δράση κολιμυκίνης (CST) Η συνδυαστική δράση της CST με PMNs και για τα δυο στελέχη προκάλεσε μεγαλύτερη καταστροφή στα πλανκτονικά κύτταρα σε σχέση με τα ΒΥ. Όταν συνδυάστηκαν PMNs σε Ε:Τ αναλογία 1:10 με CST (1 και 4 mg/l) και όταν συνδυάστηκαν PMNs σε Ε:Τ αναλογία 1:20 με CST (4 mg/l) παρατηρήθηκε συνέργεια για το ευαίσθητο στέλεχος MERs. Επίσης συνέργεια παρατηρήθηκε όταν PMNs συνδυάστηκαν σε Ε:Τ α- ναλογία 1:20 με CST (16 mg/l) για το στέλεχος MERr. Αν και στα πλανκτονικά κύτταρα δεν παρατηρήθηκε συνέργεια, σε Ε:Τ αναλογία 1:20 των PMNs με CST (1 και 4 mg/l) παρατηρήθηκαν αθροιστικά αποτελέσματα αλλά μόνο για το ανθεκτικό στέλεχος PMN[1:10] + C3 PMN[1:10] + C2 PMN[1:10] + C1 PMN[1:20] + C3 PMN[1:20] + C2 PMN[1:20] + C1 CST C3=16 mg/l CST C2=4 mg/l CST C1=1 mg/l PMN[1:10] PMN[1:20] Σχήμα Επίδραση κολιμυκίνης (CST) σε συνδυασμό με ανθρώπινα φαγοκύτταρα (PMNs) στα βιοϋμένια και στα πλανκτονικά κύτταρα του στελέχους P. aeruginosa MERr.

109 % Καταστροφή μικροοργανισμών % Καταστροφή μικροοργανισμών P.aeruginosa MERs PMN[1:10] + C3 PMN[1:10] + C2 PMN[1:10] + C1 PMN[1:20] + C3 PMN[1:20] + C2 PMN[1:20] + C1 CST C3=16 mg/l CST C2=4 mg/l CST C1=1 mg/l PMN[1:10] PMN[1:20] Σχήμα Επίδραση κολιμυκίνης (CST) σε συνδυασμό με ανθρώπινα φαγοκύτταρα (PMNs) στα βιοϋμένια και στα πλανκτονικά κύτταρα του στελέχους P. aeruginosa MERs Πλαγκτονικά κύτταρα CST-R Βιοϋμένια CST-R Πλαγκτονικά κύτταρα CST-S Βιοϋμένια CST-S PMN[1:10] + C3 PMN[1:10] + C2 PMN[1:10] + C1 PMN[1:20] + C3 PMN[1:20] + C2 PMN[1:20] + C1 CST C3=16 mg/l CST C2=4 mg/l CST C1=1 mg/l PMN[1:10] PMN[1:20] Σχήμα Επίδραση κολιμυκίνης (CST) σε συνδυασμό με ανθρώπινα φαγοκύτταρα (PMNs) στα βιοϋμένια και στα πλανκτονικά κύτταρα των στελεχών P. aeruginosa MERr και MERs. Η στατιστική ανάλυση και οι συγκρίσεις έγιναν ανάμεσα στα δύο στελέχη. 109

110 viii. Συνδυαστική δράση κλαριθρομυκίνης (CLAR) Η κλαριθρομυκίνη τόσο στα ΒΥ όσο και στα πλανκτονικά κύτταρα του ευαίσθητου στελέχους προκάλεσε δοσοεξαρτώμενη καταστροφή. Η ίδια παρατήρηση για το ίδιο στέλεχος έ- γινε και όταν συνδυαστηκε και με PMNs σε Ε:Τ αναλογίες 1:20 και 1:10, Όσον αφορά το CLARr στέλεχος, όταν τα PMNs σε αναλογίες 1:20 συνδυάστηκαν με συγκεντρώσεις CLAR (2-200 mg/l) προκάλεσαν δοσοεξαρτώμενες καταστροφές στα ΒΥ. Τέλος, παρατηρήθηκε ανταγωνισμός στο CLARs όταν η CLAR συνδυάστηκε με PMNs τόσο στα πλανκτονικά (1:20 σε συνδυασμό με 20 mg/l και 1:10 σε συνδυασμό με 200 mg/l) όσο και στα ΒΥ (1:20 και 1:10 σε συνδυασμό με 2 και 20 mg/l).

111 % Καταστροφή μικροοργανισμών P.aeruginosa - CLARs % Καταστροφή μικροοργανισμών P.aeruginosa - CLARr PMN[1:10] + C3 PMN[1:10] + C2 PMN[1:10] + C1 PMN[1:20] + C3 PMN[1:20] + C2 PMN[1:20] + C1 CLAR C3=200 mg/l CLAR C2=20 mg/l CLAR C1=2 mg/l PMN[1:10] PMN[1:20] Σχήμα Επίδραση κλαριθρομυκίνης (CLAR) σε συνδυασμό με ανθρώπινα φαγοκύτταρα (PMNs) στα βιοϋμένια και στα πλανκτονικά κύτταρα του στελέχους P. aeruginosa CLARr PMN[1:10] + C3 PMN[1:10] + C2 PMN[1:10] + C1 PMN[1:20] + C3 PMN[1:20] + C2 PMN[1:20] + C1 CLAR C3=200 mg/l CLAR C2=20 mg/l CLAR C1=2 mg/l PMN[1:10] PMN[1:20] Σχήμα Επίδραση κλαριθρομυκίνης (CLAR) σε συνδυασμό με ανθρώπινα φαγοκύτταρα (PMNs) στα βιοϋμένια και στα πλανκτονικά κύτταρα του στελέχους P. aeruginosa CLARs. 111

112 % Καταστροφή μικροοργανισμών Πλαγκτονικά κύτταρα CLAR-R Βιοϋμένια CLAR-R Πλαγκτονικά κύτταρα CLAR-S Βιοϋμένια CLAR-S PMN[1:10] + C3 PMN[1:10] + C2 PMN[1:10] + C1 PMN[1:20] + C3 PMN[1:20] + C2 PMN[1:20] + C1 CLAR C3=200 mg/l CLAR C2=20 mg/l CLAR C1=2 mg/l PMN[1:10] PMN[1:20] Σχήμα Επίδραση κλαριθρομυκίνης (CLAR) σε συνδυασμό με ανθρώπινα φαγοκύτταρα (PMNs) στα βιοϋμένια και στα πλανκτονικά κύτταρα των στελεχών P. aeruginosa CLARr και CLARs. Η στατιστική ανάλυση και οι συγκρίσεις έγιναν ανάμεσα στα δύο στελέχη. 112

113 MERs MERr CLARs CLARr CIPs CIPr CEFs CEFr AMKs AMKr Πλανκτονικά κύτταρα Βιοϋμένια mg/l No PMN PMN No PMN PMN ±SE ±SE ±SE ±SE ±SE PMN 1:20 1:10 PMN 1:20 1:10 ±SE 0 0,0 0,0 10,6 2,1 19,8 3,3 0,0 0,0 8,9 1,4 14,5 2,4 2 11,8 2,0 11,8 2,0 11,8 1,7 9,8 1,6 9,8 1,6 9,8 3,5 8 20,9 2,9 20,9 4,3 20,9 2,8 19,5 2,7 19,5 4,3 19,5 5, ,9 2,6 41,9 2,3 41,9 3,9 33,1 1,6 33,1 2,3 33,1 3,6 0 0,0 0,0 22,9 5,9 26,5 2,9 0,0 0,0 0,0 5,9 0,0 1,8 2 22,6 0,7 22,6 5,5 22,6 4,7 19,9 4,8 19,9 5,5 19,9 2,4 8 53,9 3,2 53,9 6,5 53,9 7,5 26,2 5,8 26,2 3,0 26,2 5, ,2 4,1 57,2 7,5 57,2 2,8 40,3 4,6 40,3 3,7 40,3 7,1 0 0,0 0,0 16,5 1,6 31,9 3,0 0,0 0,0 0,0 1,6 0,0 4,5 2 26,7 3,7 26,7 3,7 26,7 4,2 20,6 4,4 20,6 3,0 20,6 4,2 8 27,4 3,5 27,4 3,5 27,4 5,3 25,8 8,3 25,8 6,9 25,8 4, ,8 4,7 32,8 4,7 32,8 6,0 28,1 6,1 28,1 5,2 28,1 12,9 0 0,0 0,0 15,2 3,5 22,3 2,5 0,0 0,0 0,0 3,5 0,0 4,1 2 31,0 1,8 31,0 1,8 31,0 4,5 33,4 3,5 33,4 4,7 33,4 4,5 8 51,2 2,9 51,2 2,9 51,2 4,8 46,0 7,2 46,0 5,1 46,0 4, ,0 1,9 58,0 1,9 58,0 5,7 45,9 11,3 45,9 5,5 45,9 5,7 0 0,0 0,0 9,6 1,6 28,7 3,2 0,0 0,0 0,0 1,6 0,0 3,9 2 7,7 4,0 7,7 4,0 7,7 2,6 14,3 3,4 14,3 4,0 14,3 12,4 8 31,5 1,3 31,5 4,2 31,5 8,2 18,0 3,6 18,0 4,2 18,0 10, ,4 1,7 43,4 1,8 43,4 0,9 42,8 1,9 42,8 1,8 42,8 1,2 0 0,0 0,0 19,2 0,6 21,7 5,4 0,0 0,0 0,0 0,6 0,0 1,1 2 51,6 5,8 51,6 3,7 51,6 6,1 24,7 4,8 24,7 3,7 24,7 10,0 8 58,7 4,6 58,7 4,3 58,7 6,7 54,2 2,8 54,2 4,3 54,2 8, ,6 6,6 62,6 1,4 62,6 0,5 59,4 3,0 59,4 1,4 59,4 5,6 0 0,0 0,0 14,3 2,1 21,9 0,9 0,0 0,0 8,2 3,0 16,4 2,0 2 22,1 4,0 22,1 4,5 22,1 1,3 16,9 1,5 16,9 8,4 16,9 2, ,9 6,4 32,9 1,9 32,9 3,6 24,2 3,6 24,2 2,5 24,2 4, ,7 1,9 39,7 1,9 39,7 6,3 27,6 3,8 27,6 7,5 27,6 5,2 0 0,0 0,0 7,1 4,8 31,1 3,4 0,0 0,0 13,4 2,8 26,8 4,1 2 30,3 1,8 30,3 4,2 30,3 4,7 23,9 9,8 23,9 6,6 23,9 7, ,8 11,0 16,8 5,5 16,8 7,0 34,6 3,3 34,6 5,5 34,6 3, ,6 10,0 32,6 14,0 32,6 18,9 38,9 7,0 38,9 10,5 38,9 17,5 0 0,0 0,0 31,2 14,5 41,1 11,4 0,0 0,0-0,8 2,6 0,4 2,3 1 40,1 13,4 3,8 6,7 19,0 7,8 15,4 6,5 22,8 1,5 16,0 3,9 4 43,2 2,3 11,4 9,0 13,6 12,3 23,1 1,3 23,9 1,9 23,0 6, ,6 8,3 13,2 1,5 36,9 13,9 19,7 1,9 21,2 4,6 19,6 1,5 0 0,0 0,0 39,3 27,1 15,7 10,2 0,0 0,0 10,9 8,3 16,9 3,5 1 5,8 2,9 13,5 2,6 22,1 1,1 5,8 2,9 13,5 2,6 22,1 1,1 4-3,5 8,5 18,6 5,0 22,8 5,7-3,5 8,5 18,6 5,0 22,8 5, ,4 2,4 20,7 4,7 26,0 3,2 15,4 2,4 20,7 4,7 26,0 3,2 Πίνακας Επίδραση 5 αντιβακτηριακών παραγόντων σε συνδυασμό με ανθρώπινα φαγοκύτταρα (PMNs) στα βιοϋμένια και στα πλανκτονικά κύτταρα σε διαφορετικά στελέχη P. aeruginosa.

114 CLARs CLARr MERs MERr CIPs CIPr CEFs CEFr AMKs AMKr Πλανκτονικά κύτταρα Βιοϋμένια mg/l PMN 1:20 PMN 1:10 PMN 1:20 PMN 1: ΣΥΝ 8 ΣΥΝ ΣΥΝ ΣΥΝ 32 ΣΥΝ 0 2 ΣΥΝ 8 ΣΥΝ ΣΥΝ ANT 8 ANT 32 ANT ANT ANT 32 ANT 0 2 ΣΥΝ ΣΥΝ 8 32 ANT 0 2 ANT ANT 8 ANT ANT ANT ANT 4 ANT ANT 16 ANT ANT 0 1 ANT ΣΥΝ ΣΥΝ 4 ANT ΣΥΝ ΣΥΝ ΣΥΝ 16 ANT ANT 0 2 ANT ANT ANT 20 ANT ANT ANT 200 ANT Πίνακας Η συνδυαστική δράση 5 αντιβακτηριακών παραγόντων σε συνδυασμό με ανθρώπινα φαγοκύτταρα (PMNs) στα βιοϋμένια και στα πλανκτονικά κύτταρα σε διαφορετικά στελέχη P. aeruginosa (ΣΥΝ: συνέργεια, ΑΝΤ: ανταγωνισμός).

115 Τα αποτελέσματα των συνδυαστικών μελετών έδειξαν ότι όλοι οι συνδυασμοί της ΑΜΚ με τα ΡΜΝs είχαν συνεργητικά ή προσθετικά αποτελέσματα όσον αφορά την καταστροφή τόσο των ΒΥ όσο και των ΠΛΚ κυττάρων, στα αντίστοιχα στελέχη. Σε αντίθεση με την ΑΜΚ, στις CEF και CIP παρατηρήθηκαν 83% και 58% συνεργητικά ή προσθετικά αποτελέσματα. Η μέγιστη καταστροφή ΒΥ παρατηρήθηκε όταν ΡΜΝ σε αναλογία Ε:Τ 1:10 συνδυάστηκαν με 32 mg/l των συγκεκριμένων αντιβιοτικών: για την ΑΜΚ 48% εναντίον των στελεχών AMKr και AMKs; 31% και 60% για την CEF εναντίον των στελεχών CEFr και CEFs; Και 69% για την CIP εναντίον των στελεχών CIPr και CIPs, αντίστοιχα. Από τα τρία ανθεκτικά σε αντιβιοτικά στελέχη που χρησιμοποιήθηκαν, παρατηρήθηκε μεγάλη αντισταση στα αντιβιοτικά τόσο στα ΒΥ όσο και στα ΠΛΚ της ΑΜΚr και CEFr όταν χρησιμοποιήθηκε μεγάλη συγκέντρωση αντιβιοτικών και πιο συγκεκριμένα 128 mg/l. Το ίδιο φαινόμενο παρατηρήθηκε και με το στέλεχος CIPr όταν χρησιμοποιήθηκαν 64 mg/l. 4. Συνδυαστική δράση αντιμυκητιακών παραγοντων έναντι βιοϋμενίων της C. albicans Δυο τύποι πειραμάτων πραγματοποιήθηκαν. Στον πρώτο τύπο προστέθηκαν ταυτόχρονα στα ώριμα ΒΥ αντιμυκητιακά φάρμακα και επωάστηκαν μαζί (ταυτόχρονη προσθήκη α- ντιμυκητιακών φαρμάκων), ενώ στον δευτερο τύπο προστέθηκε αρχικά ποσότητα εχινοκανδίνης στα ΠΛΚ για να σχηματιστούν ΒΥ και μετά το σχηματισμό των ΒΥ προστέθηκε και η αζόλη (σταδιακή προσθήκη αντιμυκητιακών φαρμάκων). Στη ταυτόχρονη προσθήκη, όταν προστέθηκε στην C. albicans, CAS (0,008-0,25 mg/l) και PSC ( mg/l) παρατηρήθηκαν συνεργητικές αλληλεπιδράσεις (μέσο ΔΕ: 39%, [6% - 54%]; μέσο SE, 7% [1% - 9%]) (Σχ ). Ο συνδυασμός CAS (0, mg/l) με VRC ( mg/l) οδήγησε σε αδιάφορα αποτελέσματα. Επίσης, ανταγωνιστικές αλληλεπιδράσεις παρατηρήθηκαν στα ΠΛΚ της C. albicans: 1) όταν προστέθηκε AND (0,008 0,03 mg/l) και VRC ( mg/l) (μέσο ΔΕ:-12%, [-19% - -4%]; μέσο SE, 2% [1% - 3%]) (Σχ ) και 2) όταν προστέθηκε AND (0,03 0,5 mg/l) και PSC ( mg/l) (μέσο ΔΕ:-49%, [-84% - -22%];

116 μέσο SE, 8% [5% - 12%]) (Σχ ). Επίσης, όλοι οι συνδυασμοί που μελετήθηκαν, CAS με PSC ή VRC και AND με PSC ή VRC, παρουσίασαν αδιάφορα αποτελέσματα στα ΒΥ. Με εξαίρεση, τις ανταγωνιστικές αλληλεπιδράσεις στα ΠΛΚ κύτταρα της C. parapsilosis με CAS (1-16mg/L) και PSC ( mg/L); (μέσο ΔΕ:-38%, [-52% - -22%]; μέσο SE, 6% [3% - 9%]) (Σχ ), στους υπόλοιπους συνδυασμούς της C. parapsilosis δεν παρατηρήθηκαν ούτε συνεργητικές ούτε α- νταγωνιστικές αλληλεπιδράσεις. Στην σταδιακή προσθήκη αντιμυκητιακών φαρμακων, και αφου σχηματίστηκαν τα ΒΥ της C. albicans παρουσία CAS, δεν προστέθηκε καμία αζόλη. Παρατηρήθηκε έτσι μια ελάχιστη καταστροφή των μυκήτων σε όλο το εύρος των συγκεντρώσεων της CAS (0-5,9%) (Σχ ). Όταν όμως σε συγκεντρώσεις CAS (0,008-0,064mg/L) προστέθηκαν 128 mg/l PSC (32,7% για PSC μόνη της και 39,2 47,7% για το συνδυασμό CAS με PSC; P < 0,01), ή CAS (0,064 mg/l με 256 mg/l PSC (35,8% για PSC μόνη της και 45,1% για το συνδυασμό CAS με PSC; P < 0,01) παρατηρήθηκε σημαντική καταστροφή. Επίσης, σημαντική αυξηση στην καταστροφή των μυκήτων παρατηρήθηκε όταν η CAS (0,016-0,064 mg/l) συνδυάστηκε με 512 mg/l PSC (41.2% για την PSC μόνη της και % για το συνδυασμό CAS με PSC; P < 0,01) (Σχ ). Όταν τα ΒΥ της C. albicans επωάστηκαν παρουσία μιας σειράς συγκεντρώσεων AND (0,008 0,064 mg/l) και στη συνέχεια δεν προστέθηκε καμία αζόλη, η καταστροφή των ΒΥ δεν ξεπέρασε το 15%. Όταν όμως προστέθηκε η VRC τότε παρατηρήθηκε σημαντική αυξηση στην καταστροφή των μυκήτων. Πιο συγκεκριμένα, όταν σε συγκεντρώσεις AND (0,032 ή 0,064 mg/l) προστέθηκαν 64 mg/l VRC η % καταστροφή των ΒΥ αυξήθηκε από 33,8% για VRC μόνη της σε 46,0% και 45,4% αντίστοιχα για το συνδυασμό ΑΝD με VRC; P < 0,01). Επίσης, όταν σε συγκεντρώσεις AND (0,016-0,064 mg/l) προστέθηκαν 128 mg/l VRC τότε παρατηρήθηκε αυξηση της καταστροφής των ΒΥ από 39,2 47,3% σε αντίθεση με το 31,9% για VRC μόνη της (P < 0,01). Επιπλεόν συνδυασμοί που είχαν σημαντικές αυξήσεις στην καταστροφή των ΒΥ ήταν: 1) όταν σε AND (0,032 mg/l) προστέθηκαν 128 mg/l VRC η % καταστροφή των ΒΥ αυξήθηκε από 39,0% για VRC μόνη της σε 49,1% για το συνδυασμό ΑΝD με VRC; P < 0,01) και 2) όταν σε AND (0,

117 ή 0,064 mg/l) προστέθηκαν 512 mg/l VRC η % καταστροφή των ΒΥ αυξήθηκε από 52,6% για VRC μόνη της σε 60,4% και 64,8% για το συνδυασμό ΑΝD με VRC; P < 0,01). Σημαντικές αυξήσεις στην καταστροφή των ΒΥ παρατηρήθηκαν όταν τα ΒΥ της C. parapsilosis σχηματίστηκαν παρουσία μικρών συγκεντρώσεων εχινοκανδινών και στην συνέχεια προστέθηκε σε αυτά μια αζόλη. Πιο συγκεκριμένα, όταν τα ΒΥ σχηματίστηκαν παρουσία CAS (0,008-0,064 mg/l) και στη συνέχεια δεν προστέθηκε καμια αζόλη η καταστροφή δεν ξεπερνούσε το 8%, ενώ όταν η CAS (0,008-0,064 mg/l) συνδυάστηκε με 512 mg/l PSC, παρατηρήθηκε αυξηση στην καταστροφή των ΒΥ από 40,2% για την PSC μόνη της σε 49,0-58,5% για το συνδυασμό CAS - PSC; P < 0,01). Ομοίως, όταν CAS (0,032 mg/l) συνδυάστηκε με 256 mg/l PSC, παρατηρήθηκε αυξηση στην καταστροφή των ΒΥ από 35,8% για την PSC μόνη της σε 44,4% για το συνδυασμό CAS - PSC; P < 0,01). Σημαντική καταστροφή παρατηρήθηκε επίσης όταν συνδυάστηκε AND με VRC. Πιο συγκεκριμένα, όταν τα ΒΥ σχηματίστηκαν παρουσία AND (0,008-0,064 mg/l) και στη συνέχεια δεν προστέθηκε VRC η καταστροφή δεν ξεπερνούσε το 5%, ενώ όταν AND (0,008-0,064 mg/l) συνδυάστηκε με 256 ή 512 mg/l VRC, παρατηρήθηκε αυξηση στην καταστροφή των ΒΥ από 48,6% για τα 256 mg/l VRC μόνη της σε 66,9% και 74,6% για το συνδυασμό AND-VRC ή από 67,3% για τα 512 mg/l VRC μόνη της σε 77,6-91,1% για το συνδυασμό AND-VRC; P < 0,01). 117

118 % ΔΕ (Eind-Eobs) % ΔΕ (Eind-Eobs) 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% -10% %-0% 0%-10% 10%-20% 20%-30% 30%-40% 40%-50% 50%-60% Σχήμα : Οι αλληλεπιδράσεις της συνδυασμένης δράσης δυο αντιμυκητιακών φαρμάκων (PSC & CAS) έναντι πλανκτονικών κυττάρων της C. albicans αποτυπωμένες σε ένα διάγραμμα επιφάνειας μετά από ανάλυση με το μοντέλο Bliss. Το επίπεδο στο σημείο 0 (zero plane: ΔΕ=0) αντιπροσωπεύει αδιάφορες αλληλεπιδράσεις μεταξύ των δυο αντιμυκητιακών παραγόντων, ενώ θετικές τιμές (ΔΕ>0) μας δείχνουν συνέργεια και αρνητικές τιμές (ΔΕ<0) μας δείχνουν α- νταγωνισμό. 16 5% 0% -5% -10% -15% -20% Anidulafungin (mg/l) %--15% -15%--10% -10%--5% -5%-0% 0%-5% 118

119 % ΔΕ (Eind- Eobs) Σχήμα : Οι αλληλεπιδράσεις της συνδυασμένης δράσης δυο αντιμυκητιακών φαρμάκων (AND & VRC) έναντι πλανκτονικών κυττάρων της C. albicans αποτυπωμένες σε ένα διάγραμμα επιφάνειας μετά από ανάλυση με το μοντέλο Bliss. Το επίπεδο στο σημείο 0 (zero plane: ΔΕ=0) αντιπροσωπεύει αδιάφορες αλληλεπιδράσεις μεταξύ των δυο αντιμυκητιακών παραγόντων, ενώ θετικές τιμές (ΔΕ>0) μας δείχνουν συνέργεια και αρνητικές τιμές (ΔΕ<0) μας δείχνουν α- νταγωνισμό. 0% -10% -20% -30% -40% -50% -60% -70% -80% Ανιντουλαφουγκίνη (mg/l) % Σχήμα : Οι αλληλεπιδράσεις της συνδυασμένης δράσης δυο αντιμυκητιακών φαρμάκων (AND & PSC) έναντι πλανκτονικών κυττάρων της C. albicans αποτυπωμένες σε ένα διάγραμμα επιφάνειας μετά από ανάλυση με το μοντέλο Bliss. Το επίπεδο στο σημείο 0 (zero plane: ΔΕ=0) αντιπροσωπεύει αδιάφορες αλληλεπιδράσεις μεταξύ των δυο αντιμυκητιακών παραγόντων, ενώ θετικές τιμές (ΔΕ>0) μας δείχνουν συνέργεια και αρνητικές τιμές (ΔΕ<0) μας δείχνουν α- νταγωνισμό. 119

120 % ΔΕ (Εind- Eobs) 5. Συνδυαστική δράση αντιμικροβιακών και αντιμυκητιακών παραγοντων έναντι μικτών βιοϋμενίων της P. aeruginosa και της C. albicans 70% 60% 50% 40% % % 10% 0% Voriconazole (mg/l) % Amikacin (mg/l) 60%-70% 50%-60% 40%-50% 30%-40% 20%-30% 10%-20% 0%-10% -10%-0% Σχήμα : Οι αλληλεπιδράσεις της συνδυασμένης δράσης δυο αντιμικροβιακών φαρμάκων (ΑΜΚ & VRC) έναντι μικτών πλανκτονικών κυττάρων P. aeruginosa και C. albicans αποτυπωμένες σε ένα διάγραμμα επιφάνειας μετά από ανάλυση με το μοντέλο Bliss. Το επίπεδο στο σημείο 0 (zero plane: ΔΕ=0) αντιπροσωπεύει αδιάφορες αλληλεπιδράσεις μεταξύ των δυο αντιμυκητιακών παραγόντων, ενώ θετικές τιμές (ΔΕ>0) μας δείχνουν συνέργεια και αρνητικές τιμές (ΔΕ<0) μας δείχνουν ανταγωνισμό.

121 % ΔΕ (Eind-Eobs) 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% % Amikacin (mg/l) Anidulafungin (mg/l) 60%-70% 50%-60% 40%-50% 30%-40% 20%-30% 10%-20% 0%-10% -10%-0% Σχήμα : Οι αλληλεπιδράσεις της συνδυασμένης δράσης δυο αντιμικροβιακών φαρμάκων (ΑΜΚ & AND) έναντι μικτών πλανκτονικών κυττάρων P. aeruginosa και C. albicans αποτυπωμένες σε ένα διάγραμμα επιφάνειας μετά από ανάλυση με το μοντέλο Bliss. Το επίπεδο στο σημείο 0 (zero plane: ΔΕ=0) αντιπροσωπεύει αδιάφορες αλληλεπιδράσεις μεταξύ των δυο αντιμυκητιακών παραγόντων, ενώ θετικές τιμές (ΔΕ>0) μας δείχνουν συνέργεια και αρνητικές τιμές (ΔΕ<0) μας δείχνουν ανταγωνισμό. 121