ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΑΝΟΙΚΤΑ ΑΚΑΔΗΜΑΪΚΑ ΜΑΘΗΜΑΤΑ. Βασική Γενετική. Η γενετική των βακτηρίων & των βακτηριοφάγων

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΑΝΟΙΚΤΑ ΑΚΑΔΗΜΑΪΚΑ ΜΑΘΗΜΑΤΑ Βασική Γενετική Η γενετική των βακτηρίων & των βακτηριοφάγων Διδάσκουσα: Επίκουρη Καθηγήτρια Αμαλία-Σοφία Αφένδρα

2 Άδειες Χρήσης Το παρόν εκπαιδευτικό υλικό υπόκειται σε άδειες χρήσης Creative Commons. Για εκπαιδευτικό υλικό, όπως εικόνες, που υπόκειται σε άλλου τύπου άδειας χρήσης, η άδεια χρήσης αναφέρεται ρητώς.

3 Η ΓΔΝΔΣΙΚΗ ΣΩΝ ΒΑΚΣΗΡΙΩΝ & ΣΩΝ ΒΑΚΣΗΡΙΟΥΑΓΩΝ

4 Βακςήοια Μξμξκύςςαοξι ποξκαοσχςικξί ξογαμιρμξί. Ποξρβάλλξμςαι από ιξύπ πξσ ξμξμάζξμςαι βακςηοιξτάγξι. Μπξοξύμ μα μεςατέοξσμ DNA από έμα κύςςαοξ ρε έμα άλλξ, μόμξ καςά μία καςεύθσμρη. Αμαπςύρρξμςαι ρε ςοσβλία, όπξσ ρυημαςίζξμςαι απξικίεπ ξοαςέπ με ςξ μάςι, ξι ξπξίεπ ποξέουξμςαι από έμα κύςςαοξ.

5 Βακςήοια Σα βακςηοιακά κύςςαοα είμαι γεμεςικά ςασςόρημα (κλώμξι). Σξ βακςήοιξ πξσ υοηριμξπξιείςαι ρσυμόςαςα είμαι ςξ εμςεοξβακςήοιξ Escherichia coli. Η γεμεςική αμάλσρή ςξσπ ποαγμαςξπξιήθηκε μεςά ςημ αμακάλσφη και μελέςη ςχμ μηυαμιρμώμ μεςατξοάπ γεμεςικξύ σλικξύ μεςανύ ςξσπ.

6

7 Escherichia coli υοώρη καςά Gram

8 Βακςήοια Σα βακςήοια μεςατέοξσμ γεμεςικό σλικό από έμα κύςςαοξ ρε έμα άλλξ με ςοείπ διατξοεςικξύπ μηυαμιρμξύπ. Kαι ρςξσπ ςοειπ μηυαμιρμξύπ, ςξ γεμεςικό σλικό πξσ μεςατέοεςαι διαςίθεςαι από έμα κύςςαοξ πξσ ξμξμάζεςαι δόςηπ. Σξ κύςςαοξ πξσ λαμβάμει ςξ γεμεςικό ασςό σλικό ξμξμάζεςαι δέκςηπ.

9 Βακςήοια Σφηευξθ (conjugation): ζνα βακτθριακό κφτταρο μεταφζρει DNA ςε ζνα άλλο με άμεςθ επαφι των δφο κυττάρων. Μεταςχθματιςμόσ (transformation): ζνα βακτθριακό κφτταρο αποκτά DNA από το περιβάλλον και το ενςωματϊνει ςτο δικό του γενετικό υλικό. Μεταγωγι (transduction): οριςμζνοι ιοί βακτθρίων είναι ςε κζςθ να πάρουν ζνα τμιμα DNA από ζνα βακτιριο και να το ειςάγουν ςε ζνα άλλο.

10 Βακτιρια Μεταλλαγμζνα ςτελζχθ: Αυξότροφα Τροφικι απαίτθςθ: απϊλεια τθσ ικανότθτασ βιοςφνκεςθσ ενόσ αμινιξζοσ ι μιάσ βιταμίνθσ Στελζχθ φυςικοφ τφπου: Πρωτότροφα Παράδειγμα: E. coli trp ade thi + Θρεπτικι απαίτθςθ για το αμινοξφ κρυπτοφάνθ και τθν πουρινικι βάςθ αδενίνθ Οχι απαίτθςθ για τθ βιταμίνθ κειαμίνθ.

11 Γξμιδιακή υαοςξγοάτηρη ρςα βακςήοια μέρχ ςηπ ρύζεσνηπ

12 ύζεσνη Δμα βακςηοιακό κύςςαοξ μεςατέοει DNA ρε έμα άλλξ με άμερη επατή ςχμ δύξ κσςςάοχμ. Δόςηπ Πλαρμίδιξ Σοιυίδιξ Βακςηοιακό υοχμόρχμα σζεσκςική γέτσοα Δέκςηπ

13

14 Βακςηοιακή ρύζεσνη Δέκςηπ (F - ) σζεσκςική γέτσοα Δόςηπ (F + )

15 μίγμα αμάμινη απόγξμξι Πλύρη κσςςάοχμ Δμβξλιαρμόπ ~ 10 8 κσςςάοχμ ΜΜ = Minimal medium Δλάυιρςξ θοεπςικό μέρξ αμάπςσνηπ Δεμ αμαπςύρρξμςαι απξικίεπ Αμάπςσνη ποχςόςοξτχμ απξικιώμ Δεμ αμαπςύρρξμςαι απξικίεπ Οι Lederberg & Tatum (1946) διαπίρςχραμ γεμεςικό αμαρσμδσαρμό μεςανύ κσςςάοχμ E. coli.

16 Πώμα από βαμβάκι Πίερη ή αμαοοότηρη ςέλευξπ Α ςέλευξπ Β Υίλςοξ πόοχμ μικοήπ διαμέςοξσ Σξ πείοαμα ασςό (Davis) απέδεινε όςι η τσρική επατή μεςανύ ςχμ βακςηοιακώμ κσςςάοχμ είμαι απαοαίςηςη, για μα ρσμβεί γεμεςικόπ αμαρσμδσαρμόπ

17 Διαρςαύοχρη μεςανύ κσςςάοχμ F + & F - Πλαρμίδιξ F σζεσκςικό πλαρμίδιξ Λειςξσογίεπ Tra: Γξμίδια tra Δμαονη αμςιγοατικήπ μεςατξοάπ orit (origin of transfer= =αουή μεςατξοάπ) Αμςιγοατή κσλιόμεμξσ κύκλξσ Σασςόυοξμη μεςατξοά ςηπ μιαπ αλσρίδαπ ρςξ δέκςη Ολξκλήοχρη μεςατξοάπ & αμςιγοατήπ Κσκλξπξίηρη πλαρμίδιξσ Απξυχοιρμόπ κσςάοχμ

18 Κύςςαοα Τφηλήπ συμόςηςαπ Αμαρσμδσαρμξύ Σξ πλαρμίδιξ F εμρχμαςώμεςαι ρςξ υοχμόρχμα ςξσ νεμιρςή ςξσ. Η εμρχμάςχρη ποαγμαςξπξιείςαι με διαρκελιρμό ρε ειδικέπ θέρειπ επάμχ ρςξ βακςηοιακό υοχμόρχμα (αμαρσμδσαρμόπ ενειδικεσμέμηπ θέρηπ). Σα ρςελέυη-δόςεπ πξσ δημιξσογξύμςαι ξμξμάζξμςαι Hfr (High frequency of recombination = Τφηλή ρσυμόςηςα αμαρσμδσαρμξύ).

19 Πλαρμίδιξ F, ~100 kb Φοχμόρχμα E. coli Φοχμξρχμικό DNA, ~ kb DNA ρςελέυξσπ Hfr Φοχμόρχμα κσςςάοξσ Hfr

20 Δημιξσογία ρςελέυξσπ Hfr Δμρχμαςχμέμξ πλαρμίδιξ F ςέλευξπ Hfr

21 Κφτταρα Υψθλισ Συχνότθτασ Αναςυνδυαςμοφ ύζεσνη μεςανύ κσςςάοξσ Hfr και F - : μέοξπ ςξσ υοχμξρώμαςξπ ςξσ δόςη μεςατέοεςαι με ςξ πλαρμίδιξ F. Η ρύζεσνη διακόπςεςαι ποιμ μεςατεοθεί έμα ξλόκληοξ αμςίγοατξ ςξσ υοχμξρώμαςξπ. Σξ ςμήμα ςξσ υοχμξρώμαςξπ πξσ έυει μεςατεοθεί αμαρσμδσάζεςαι ρσμήθχπ με ςξ υοχμόρχμα ςξσ δέκςη.

22 Μεςατξοά DNA από ρςέλευξπ Hfr Η μία αλσρίδα ςξσ πλαρμίδιξσ F μαζί με μέοξπ ςξσ υοχμξρώμαςξπ ςξσ δόςη μεςατέοεςαι ρςξ δέκςη, όπξσ και αμςιγοάτεςαι. Η άλλη μξμή αλσρίδα ςξσ υοχμξρώμαςξπ ςξσ δόςη με ςξ εμρχμαςχμέμξ πλαρμίδιξ F παοαμέμει ρςξ δέκςη και αμςιγοάτεςαι.

23 Παοάδειγμα ρύζεσνηπ με δόςη Hfr Hfr (leu + str S ) X F - (leu - str R ) Θοεπςικό μέρξ υχοίπ λεσκίμη: αμάπςσνη ςξσ Hfr Θοεπςικό μέρξ με ρςοεπςξμσκίμη: αμάπςσνη ςξσ F - Θοεπςικό μέρξ υχοίπ λεσκίμη, με ρςοεπςξμσκίμη: Αμάπςσνη ςξσ F - πξσ έυει λάβει μέρχ ρύζεσνηπ ςξμ υοχμξρχμικό δείκςη leu +

24 azi ton gal lac gal lac ton azi azi: αζίδιξ ton: μόλσμρη από τάγξ Σ1 υημαςική απεικόμιρη μεςατξοάπ δεικςώμ ρσμαοςήρει ςξσ υοόμξσ

25

26 συμόςηςα (%) εμτάμιρηπ ςχμ γεμεςικώμ υαοακςηοιρςικώμ ςξσ ρςελέυξσπ Hfr ρςα μεςαρσζεσγμέμα ρςελέυη str R 8 min 10 min 17 min 25 min Φοόμξπ (min) Φαοςξγοάτηρη υοχμξρώμαςξπ

27 Γεμεςικόπ υάοςηπ ςξσ υοχμξρώμαςξπ ςξσ E.coli Οι απξρςάρειπ μεςανύ ςχμ γξμιδίχμ εκτοάζξμςαι ρε λεπςά

28 Φοχμόρχμα Hfr Πλαρμίδια F Πλαρμίδιξ F εμρχμαςχμέμξ κξμςά ρςξ γξμίδιξ lac ςξσ υοχμξρώμαςξπ ςξσ κσςςάοξσ Hfr Δναγχγή ςξσ F ημείξ αμςαλλαγήπ Φοχμόρχμα υχοίπ ςα F & lac πλαρμίδιξ F : F + lac

29 Γξμιδιακή υαοςξγοάτηρη ρςα βακςήοια μέρχ ςξσ μεςαρυημαςιρμξύ

30 Μεςαρυημαςιρμόπ Δμα βακςηοιακό κύςςαοξ απξκςά DNA από ςξ πεοιβάλλξμ και ςξ εμρχμαςώμει ρςξ δικό ςξσ γεμεςικό σλικό. Δότθσ Ελεφκερο DNA Δζκτθσ

31 Frederick Griffith, 1928 Μίγμα: μεκοχμέμξι παθξγόμξι πμεσμξμιόκξκκξι (Streptococcus pneumonia) + ζχμςαμξί μη παθξγόμξι Δμερη ρε πξμςίκια Θάμαςξπ από ρηφαιμία ςξ αίμα ςχμ μεκοώμ πξμςικιώμ απξμξμώθηκαμ παθξγόμα κύςςαοα πμεσμξμιξκόκκχμ.

32 Oswald Avery, Colin MacLeod, Maclyn McCarty, 1944 H ξσρία πξσ μεςατέοθηκε από ςα μεκοχμέμα παθξγόμα κύςςαοα πμεσμξμιξκόκκχμ ρςα ζχμςαμά μη παθξγόμα ήςαμ DNA.

33 Πνξεία κεηαζρεκαηηζκνύ Πξόζδεζε ηνπ DNA ζην εμσηεξηθό πεξίβιεκα ηνπ θπηηάξνπ. Μεηαθνξά ηνπ DNA ζην εζσηεξηθό ηνπ θπηηάξνπ δηακέζνπ ηεο θπηηαξηθήο κεκβξάλεο. Απηόλνκε αλαπαξαγσγή (πιαζκίδην), ή ελζσκάησζε κε αλαζπλδπαζκό ζην γνληδίσκα ηνπ θπηηάξνπ μεληζηή (ρξσκνζσκηθό ηκήκα ηνπ θπηηάξνπ-δόηε). Δθθξαζε ηεο γελεηηθήο πιεξνθνξίαο πνπ θέξεη ην DNA.

34 Δλεύθεοξ DNA Κσςςαοικό ςξίυχμα ύμπλξκξ DNA Νξσκλεξςίδια Κσςςαοξπλαρμαςική μεμβοάμη Δλεύθεοξ DNA από μεκοό βακςήοιξ Φοχμόρχμα Μεςαρυημαςιρμέμξ βακςήοιξ Δμζσμξ καςαβξλιρμξύ ςξσ DNA DNA πξσ μεςατέοθηκε

35 Δπηδεθηηθόηεηα: Η ηθαλόηεηα ησλ βαθηεξίσλ λα πξνζιακβάλνπλ μέλν DNA. Βαθηήξηα κε θπζηθή επηδεθηηθόηεηα Παξαγσγή εμεηδηθεπκέλσλ πξσηετλώλ ππεύζπλσλ γηα ηελ είζνδν θαη ηελ αληηγξαθή ηνπ DNA ζην λέν μεληζηή (Bacillus subtilis, Streptococcus, Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae, θ.ά. Βαθηήξηα κε ηερλεηή επηδεθηηθόηεηα Δπίδξαζε ηνπ θπηηαξηθνύ πεξηβιήκαηνο από εμσγελείο παξάγνληεο, όπσο δηζζελή θαηηόληα (θπξίσο Ca 2+ θαη Mg 2+ ), πνιπαηζπιεληθή γιπθόιε, ζρεκαηηζκό πξσηνπιαζηώλ (αθαίξεζε ηνπ θπηηαξηθνύ ηνηρώκαηνο), θ.ά.

36 Μεηαζρεκαηηζκόο κε ειεθηξνώζκσζε (electroporation) Eθαξκoγή πςειήο ηάζεο ζην βαθηεξηαθό ελαηώξεκα Σρεκαηηζκόο πξνζσξηλώλ νπώλ ζην θπηηαξηθό πεξίβιεκα (νη νπνίεο κεηά απνθαζίζηαληαη) Γηέιεπζε ηνπ DNA κέζσ ησλ νπώλ ζην εζσηεξηθό ηνπ θπηηάξνπ Δθαξκνγή ηεο κεζόδνπ ζε πνιιά βαθηήξηα, θπξίσο ζε απηά πνπ δελ κεηαζρεκαηίδνληαη κε ηηο παξαπάλσ κεζόδνπο Δθαξκνγέο Χαξηνγξάθεζε γνληδίσλ Δηζαγσγή εηεξόινγσλ γνληδίσλ ζε πξνθαξπσηηθνύο (βαθηήξηα) θαη επθαξπσηηθνύο νξγαληζκνύο (δπκνκύθεηεο, θπηά) κε ζθνπό ηε γελεηηθή βειηίσζε.

37 Φοχμξρχμικό DNA Κύςςαοα E. coli Amp s Amp r Μεςαρυημαςιρμόπ με πλαρμίδιξ Amp r Κύςςαοα E. coli Amp r + πλαρμίδιξ

38 Αοιθμόπ μεςαρυημαςιρμέμχμ κσςςάοχμ σγκέμςοχρη DNA (mg/ml) Γοατική παοάρςαρη ςηπ απόδξρηπ μεςαρυημαςιρμξύ ρσμαοςήρει ςηπ ρσγκέμςοχρηπ ςξσ DNA.

39 DNA δόςηπ Βακςηοιακόπ νεμιρςήπ Απξμόμχρη & πέφη DNA δόςη Δημιξσογία ςμημάςχμ διατόοχμ μεγεθώμ Κύςςαοα δέκςεπ: αμαρσμδσαρμόπ με ςξ DNA ςξσ δόςη ημείξ γεμεςικξύ αμαρσμδσαρμξύ Μεςαρυημαςιρμόπ βακςηοίξσ με γξμόςσπξ a - b - c - Γξμόςσπξι μεςαρυημαςιρμέμχμ κσςςάοχμ - μεςαρυημαςιρμόπ μεςαρυημαςιρμόπ μεςαρυημαςιρμόπ ρσμμεςαρυημαςιρμόπ ρσμμεςαρυημαςιρμόπ

40 Γξμιδιακή υαοςξγοάτηρη ρςα βακςήοια μέρχ ςηπ μεςαγχγήπ

41 Μεςαγχγή Δόςηπ Ποξρβξλή από τάγξ Καςακεομαςιρμόπ ςξσ υοχμξρώμαςξπ Οοιρμέμξι ιξί βακςηοίχμ είμαι ρε θέρη μα πάοξσμ έμα ςμήμα DNA από έμα βακςήοιξ και μα ςξ ειράγξσμ ρε έμα άλλξ Υάγξι πξσ πεοέυξσμ DNA ςξσ κσςςάοξσ

42 Μεςατξοά ςξσ 1% ςξσ βακςηοιακξύ υοχμξρώμαςξπ. Βακςηοιξτάγξι ή τάγξι: Καςηγξοία ιώμ πξσ ποξρβάλλξσμ μόμξ βακςηοιακά κύςςαοα.

43 Αγθπξνβόιεζε ηνπ θάγνπ ζηελ εμσηεξηθή επηθάλεηα ησλ βαθηεξηθώλ θπηηάξσλ. Γηέιεπζε ηνπ DNA ηνπ θάγνπ κέζσ ηνπ θνξκνύ ηνπ ζην εζσηεξηθό ηνπο. Γύν πηζαλέο πνξείεο: Λπηηθή πνξεία Λπζηγνληθή πνξεία

44 Λπηηθή πνξεία Δλεξγνπνίεζε θαγηθώλ γνληδίσλ θαηαθεξκαηηζκόο ηνπ βαθηεξηαθνύ γνληδηώκαηνο. Δλεξγνπνίεζε κεραληζκώλ αλαπαξαγσγήο ηνπ θάγνπ ζρεκαηηζκόο ώξηκσλ απνγόλσλ. Λύζε βαθηεξηαθνύ θπηηάξνπ από ηνπο ώξηκνπο θάγνπο (ιπηηθνί ή κνιπζκαηηθνί), νη νπνίνη θαη απειεπζεξώλνληαη. Δλαηώξεκα ησλ ειεπζεξσκέλσλ απνγόλσλ ηνπ θάγνπ κε ηα πξντόληα ιύζεο ησλ θπηηάξσλ θαγηθό ιύκα (phage lysate). Δπίζηξσζε θαγηθνύ ιύκαηνο ζε ηξπβιίν: κεηά από κεξηθέο ώξεο ζρεκαηηζκόο δηαπγώλ θειίδσλ ζην ππόζηξσκα ηεο βαθηεξηαθήο αλάπηπμεο αληηζηνηρεί ζε απνπζία βαθηεξηαθώλ θπηηάξσλ. Η θειίδα απηή νλνκάδεηαη πιάθα θαη πξνέξρεηαη από έλαλ θάγν, ν νπνίνο απειεπζέξσζε ηνπο απνγόλνπο ηνπ κεηά από έλαλ ιπηηθό θύθιν, νη νπνίνη κόιπλαλ ηα γεηηνληθά θύηηαξα.

45 Βιξλξγικόπ κύκλξπ ςξσ μξλσρμαςικξύ τάγξσ T2

46 Υαγικέπ πλάκεπ ρε επιρςοχμέμη καλλιέογεια E. coli Διασγείπ / καθαοέπ πεοιξυέπ ή πλάκεπ Δπιρςοχμέμη κσςςαοική καλλιέογεια

47 Δξμή ςξσ τάγξσ Σ4 Δλεύθεοξπ τάγξπ σρςαςικά ςξσ Σ4 κεταλή ασυέμαπ & δακςύλιξπ Ποξρβάλλχμ τάγξπ κξομόπ ρχλημίρκξι κξομξύ δίρκξπ βάρηπ ιμίδια ξσοάπ

48 Υάγξπ Σ4

49 Βακςηοιξτάγξι Σ4 καςά ςημ αγκσοξβόληρή ςξσπ ρςξ ενχςεοικό πεοίβλημα βακςηοίξσ

50 Λπζηγνληθή πνξεία Δλζσκάησζε ηνπ ρξσκνζώκαηνο ηνπ θάγνπ ζην βαθηεξηαθό γνληδίσκα ζε εηδηθή ζέζε πξόζδεζεο ηνπ βαθηεξίνπ. Τν θαλόκελν απηό νλνκάδεηαη ιπζηγνλία. Σ απηή ηε ρξνληθή θάζε ην ελζσκαησκέλν θαγηθό DNA νλνκάδεηαη πξνθάγνο. Αληηγξαθή ηνπ ρξσκνζώκαηνο ηνπ θάγνπ κε ην βαθηεξηαθό ρξσκόζσκα όια ηα ζπγαηξηθά θύηηαξα ζα πεξηέρνπλ ην θαγηθό ρξσκόζσκα. Τα θύηηαξα απηά νλνκάδνληαη ιπζηγνληθά θύηηαξα γηα ην ζπγθεθξηκέλν θάγν. Φάγνη πνπ αθνινπζνύλ ιπζηγνληθό θύθιν ήπηνη θάγνη. Ο πξνθάγνο δηαηεξείηαη ζηε ιπζηγνληθή θαηάζηαζε από κία θαγηθή πξσηεΐλε πνπ δξά ζαλ θαηαζηνιέαο θαη εκπνδίδεη ηελ έθθξαζε γνληδίσλ πνπ είλαη ππεύζπλα γηα ην ιπηηθό θύθιν. Αλ ν θαηαζηνιέαο θαηαζηξαθεί από εμσηεξηθνύο παξάγνληεο (π.ρ. ππεξηώδεο αθηηλνβνιία), ηόηε ν θάγνο αθνινπζεί ην ιπηηθό θύθιν.

51 ΛΤΣΙΚΟ ΚΤΚΛΟ Υαγικό DNA Βακςηοιακό DNA ΛΤΙΓΟΝΙΑ Σξ ταγικό DNA εμρχμαςώμεςαι ρςξ βακςηοιακό γξμιδίχμα (ςα κύςςαοα επιζξύμ) Απελεσθεοώμξμςαι ξι απόγξμξι ςξσ τάγξσ λ από ςξ βακςήοιξ πξσ έυει σπξρςεί λύρη Σξ λσρξγξμικό βακςήοιξ διαθέςει αμξρία ρε πεοαιςέοχ μόλσμρη ΔΠΑΓΩΓΗ Aπελεσθεοώμεςαι ταγικό DNA και ειρέουεςαι ρςξ λσςικό κύκλξ Λσςικόπ και λσριγξμικόπ κύκλξπ ςξσ βακςηοιξτάγξσ λ (Molecular Biology of the Cell, Alberts et al.)

52 Βιξλξγικόπ κύκλξπ ςξσ ήπιξσ τάγξσ λ

53 υημαςική απεικόμιρη βακςηοιξτάγξσ λ Κύκλξπ ζχήπ: min Βακςηοιξτάγξπ λ DNA τάγξσ ( bp) κεταλή ρχλημίρκξι κξομξύ κχμική πεοιξυή ιμίδιξ ξσοάπ

54 τάγξπ λ copyright Ross Inman

55 αμαπςσρρόμεμξι απόγξμξι ςξσ λ χμαςίδια ςχμ απξγόμχμ ςξσ τάγξσ λ καςά ςη διάοκεια ςηπ χοίμαμρήπ ςξσπ ρε κύςςαοα Escherichia coli.

56 Φαοςξγοάτηρη βακςηοιακξύ υοχμξρώμαςξπ μέρχ μεςαγχγήπ Ποαγμαςξπξιείςαι με ήπιξσπ τάγξσπ: λ & P1 ςξσ E. coli, P22 ςξσ Salmonella typhimurium Δύξ ςύπξι μεςαγχγήπ: Γεμικεσμέμη μεςαγχγή Δνειδικεσμέμη μεςαγχγή

57 Γεμικεσμέμη μεςαγχγή

58 Γεμικεσμέμη μεςαγχγή Lederberg & Zinder, 1952: Μελέςη ςηπ πεοίπςχρηπ ρύζεσνηπ ρςξ Salmonella typhimurium πξσ ποξκαλεί ςστξειδή πσοεςό ρε ζώα. Δταομξγή ςχμ πειοαμάςχμ ςχμ Lederberg & Tatum, Davis. Δεμ απαιςείςξ επατή ςχμ κσςςάοχμ ρςξ πείοαμα ςξσ Davis διηθηςόπ παοάγχμ ήπιξπ τάγξπ ςξσ S. typhimurium Ρ22. Φαοακςηοιρςικό ςηπ γεμικεσμέμηπ μεςαγχγήπ: Οπξιξδήπξςε ςσυαίξ ςμήμα ςξσ βακςηοιακξύ υοχμξρώμαςξπ μπξοεί μα μεςατεοθεί.

59 Βακςηοιακό υοχμόρχμα ρε κύςςαοα πξσ έυξσμ ποξρβληθεί από τάγξ Ρ1 Βακςήοιξ δόςηπ leu + DNA τάγξσ πξλλαπλαριαρμέμξ Βακςηοιακό υοχμόρχμα καςακεομαςιρμέμξ σμάθοξιρη ώοιμχμ τάγχμ Λύρη ςξσ κσςςάοξσ νεμιρςή Βακςήοιξ δέκςηπ leu - Αμαρσμδσαρμόπ Βακςήοιξ δέκςηπ Πξλλξί απόγξμξι Ρ1 Μεςα-μεςαγχγικό βακςήοιξ δέκςηπ leu +

60 Γεμικεσμέμη μεςαγχγή Θεχοηςικά, όλα ςα γξμίδια μπξοξύμ μα σπξρςξύμ μεςαγχγή Φαοςξγοάτηρη ςξσ βακςηοιακξύ υοχμξρώμαςξπ αμάλξγη με ασςή ςξσ μεςαρυημαςιρμξύ Δείκςεπ επιλξγήπ: υοηριμξπξιξύμςαι για ςξμ εμςξπιρμό ςχμ κσςςάοχμ πξσ έυξσμ σπξρςεί μεςαγχγή Μη επιλεγμέμξι δείκςεπ: δείκςεπ πξσ έυξσμ σπξρςεί ρσμμεςαγχγή με ςξμ δείκςη επιλξγήπ > Απόδεινη ςηπ ρύμδερηπ μεςανύ ςξσπ Γεμεςικξί υάοςεπ ρύμδερηπ λεπςήπ δξμήπ (λεπςξμεοείπ)

61

62 Δνειδικεσμέμη μεςαγχγή

63 Δνειδικεσμέμη μεςαγχγή συμόςηςα εμτάμιρηπ ςηπ γεμικεσμέμηπ μεςαγχγήπ: 10-5 Οι τάγξι πξσ μεςατέοξσμ DNA ξμξμάζξμςαι μεςαγχγικξί τάγξι. Σα βακςήοια ρςα ξπξία έυει ρσμβεί γεμεςικόπ αμαρσμδσαρμόπ με DNA πξσ μεςατέοεςαι από τάγξσπ ξμξμάζξμςαι μεςα-μεςαγχγικά ρςελέυη. Φαοςξγοάτηρη βακςηοιακξύ υοχμξρώμαςξπ αμάλξγη ποξπ ςξσπ ποξηγξύμεμξσπ ςοόπξσπ μεςατξοάπ γεμεςικξύ σλικξύ μεςανύ βακςηοίχμ. Μειξμέκςημα: μπξοξύμ μα υαοςξγοατηθξύμ μόμξ γξμίδια πξσ απέυξσμ μέυοι 1,5 min ρςξ γεμεςικό υάοςη ςξσ E. coli.

64 Ποξκαλείςαι από ήπιξσπ τάγξσπ Μεςαγχγή στίρςαμςαι μόμξ ρσγκεκοιμέμα μέοη ςξσ βακςηοιακξύ υοχμξρώμαςξπ και όυι ξπξιξδήπξςε Παοάδειγμα ενειδικεσμέμξσ μεςαγχγξύ τάγξσ απξςελεί ξ τάγξπ λ, ξ ξπξίξπ μξλύμει ςημ E. coli. Σξ γξμιδίχμα ςξσ λ εμρχμαςώμεςαι ρςξ βακςηοιακό υοχμόρχμα ρε ρσγκεκοιμέμη θέρη μεςανύ ςχμ πεοιξυώμ gal και bio >>> δημιξσογία λυσιγόμου βακςήοιξσ Ασςή η θέρη ρςξ υοχμόρχμα ςηπ E. coli ξμξμάζεςαι att λ (attachment site, θέρη ποξρκόλληρηπ για ςξμ λ) Ομόλξγη με μια θέρη ρςξ DNA ςξσ λ πξσ ξμξμάζεςαι att Σξ υοχμόρχμα ςξσ λ εμρχμαςώμεςαι με έμαμ απλό διαρκελιρμό

65 ςέλευξπ E. coli πξσ λσριγξμξπξιεί ξ τάγξπ λ: E. coli K12 Όςαμ πεοιέυει ςξμ ποξτάγξ λ: E. coli K12(λ) K12: gal + (μπξοεί μα καςαβξλίρει γαλακςόζη χπ πηγή άμθοακα) Αμιυμεύριμξπ ταιμόςσπξπ: επίρςοχρη ςχμ κσςςάοχμ ρε ρςεοεό θοεπςικό μέρξ με γαλακςόζη χπ πηγή άμθοακα μαζί με μία υοχρςική η ξπξία μεςαβάλλει ςξ υοώμα ςηπ αμάλξγα με ςα ποξψόμςα ζύμχρηπ ςηπ γαλακςόζηπ ςξ θοεπςικό ασςό μέρξ: απξικίεπ gal + :οξζ gal: λεσκέπ Με επαγχγή ςξσ ποξτάγξσ: νεκιμά ξ λσςικόπ κύκλξπ.

66 Fig 7-30 ημεία ποόρδερηπ att Φοχμόρχμα E. coli Δμζσμα εμρχμάςχρηπ Ο τάγξπ λ έυει εμρχμαςχθεί ρςξ υοχμόρχμα ςξσ E. coli Φοχμόρχμα E. coli Σξ μξμςέλξ ςξσ Campbell για ςημ εμρχμάςχρη ςξσ τάγξσ λ ρςξ υοχμόρχμα ςξσ E. coli.

67 Έμαονη ςξσ λσςικξύ κύκλξσ: ςξ υοχμόρχμα ςξσ τάγξσ ρυημαςίζει θηλιά >>> μξμόπ διαρκελιρμόπ ρςιπ θέρειπ att λ/att >>> νευχοιρςό κσκλικό υοχμόρχμα λ σμήθχπ: η εκςξμή ςξσ υοχμξρώμαςξπ ςξσ λ είμαι ακοιβήπ πάμια: ξ διαρκελιρμόπ επιςελείςαι ρε διατξοεςικέπ θέρειπ >>> δημιξσογείςαι έμα μη τσριξλξγικό κσκλικό ποξψόμ DNA ςη δεύςεοη πεοίπςχρη: έμα ςμήμα ςξσ υοχμξρώμαςξπ ςξσ λ έυει απξμείμει ρςξ βακςηοιακό υοχμόρχμα έμα ςμήμα ςξσ βακςηοιακξύ υοχμξρώμαςξπ, πξσ πεοιλαμβάμει ςξ γξμίδιξ gal +, έυει ποξρςεθεί ρςξ σπόλξιπξ ςμήμα ςξσ υοχμξρώμαςξπ ςξσ λ

68 Καμξμικόπ ρυημαςιρμόπ θηλειάπ Σσυαίξπ ρυημαςιρμόπ θηλειάπ με εμρχμάςχρη ςξσ gal

69 Δπξμέμχπ ρςημ πεοίπςχρη ασςή: ρςξ γξμιδίχμα εμόπ απξγόμξσ τάγξσ πεοιέυεςαι έμα βακςηοιακό γξμίδιξ (ή γξμίδια) >>> έυξσμε έμα μεςαγχγό τάγξ εδώ, ςξμ λd gal + (d: ελαςςχμαςικόπ (defective), επειδή δεμ είμαι όλα ςα γξμίδια ςξσ τάγξσ παοόμςα και ςξ gal + σπξδεικμύει όςι έυει απξκςηθεί ςξ γξμίδιξ gal ςξσ βακςηοιακξύ κσςςάοξσνεμιρςή) Ασςό ςξ ταιμόμεμξ είμαι παοόμξιξ με ςη δημιξσογία F λόγχ ελαςςχμαςικήπ εκςξμήπ ςξσ παοάγξμςα F. Ωρςόρξ, ξ τάγξπ λd gal + μπξοεί μα αμςιγοατεί και μα λύρει ςξ κύςςαοξ-νεμιρςή μέρα ρςξ ξπξίξ δημιξσογήθηκε, επειδή όλα ςα γξμίδια ςξσ τάγξσ λ είμαι ακόμα παοόμςα: μεοικά βοίρκξμςαι ρςξ υοχμόρχμα ςξσ τάγξσ, εμώ ςα σπόλξιπα βοίρκξμςαι ρςξ βακςηοιακό υοχμόρχμα.

70 Υαιμόμεμξ ςξσ μη τσριξλξγικξύ ρυημαςιρμξύ βοόυξσ: ρπάμιξ γεγξμόπ Σξ λύμα τάγχμ πξσ παοάγεςαι από ςημ αουική μόλσμρη πξσ απεικξμίζεςαι πεοιέυει: κσοίχπ καμξμικξύπ τάγξσπ λίγξσπ μεςαγχγξύπ τάγξσπ gal + (1/10 5 ) Λόγχ ςηπ μικοήπ αμαλξγίαπ ςχμ μεςαγχγώμ τάγχμ, ςξ λύμα ξμξμάζεςαι μεςαγχγό λύμα υαμηλήπ ρσυμόςηςαπ (LFT, low-frequency transducing)

71 Η μόλσμρη βακςηοιακώμ κσςςάοχμ gal με λύμα LFT παοάγει δύξ ειδώμ ρςελέυη εκ μεςαγχγήπ: ςξ έμα, ξ τάγξπ λ άγοιξσ ςύπξσ εμρχμαςώμεςαι ρςημ καμξμική ςξσ θέρη att λ Καςόπιμ ξ τάγξπ λd gal + εμρχμαςώμεςαι με διαρκελιρμό μέρα ρςιπ κξιμέπ αλληλξσυίεπ ςξσ λ >>> εμρχμάςχρη και ςχμ δύξ ειδώμ τάγχμ >>>> δημιξσογία εμόπ διπλξύ λσριγόμξσ βακςήοιξσ Δπίρηπ, ςξ βακςήοιξ καθίρςαςαι εςεοόζσγξ gal + /gal και για ςξ λόγξ ασςό μπξοεί μα ζσμώρει γαλακςόζη.

72 Σξ βακςήοιξ πξσ ρυημαςίζεςαι είμαι αρςαθέπ: Μπξοεί μα επαυθεί ξ λσςικόπ κύκλξπ Ο τάγξπ λ άγοιξσ ςύπξσ διαθέςει μια πλήοη ρειοά γξμιδίχμ για ςημ αμςιγοατή ςξσ ιξύ. Δπξμέμχπ ελέγυει ςξ ρυημαςιρμό βοόυξσ και ςημ αμςιγοατή ςξσ εασςξύ ςξσ, καθώπ και ςξσ λd gal +. Με ςημ ιδιόςηςα ασςή, ξ τάγξπ λ άγοιξσ ςύπξσ δοα χπ βοηθητικός φάγος. Δτόρξμ μπξοξύμ μα είμαι λd gal + ςόρξι τάγξι, όρξι και ξ μιρόπ αοιθμόπ ςχμ απξγόμχμ τάγχμ, ςξ μέξ ασςό λύμα ξμξμάζεςαι μεταγωγό λύμα υψηλής συχμότητας (HFT, high-frequency transducing).

73 Λσριγξμικά μεςα-μεςαγχγικά κύςςαοα Μεςα-μεςαγχγικά κύςςαοα πξσ ποξήλθαμ από αμαρσμδσαρμό

74 Ο δεύςεοξπ ςύπξπ ρςελέυξσπ εκ μεςαγχγήπ πξσ δημιξσογείςαι από ςξ αουικό λύμα είμαι ρςαθεοόπ. Δημιξσογείςαι όςαμ έμαπ μόμξ τάγξπ λd gal + μξλύμει έμα κύςςαοξ. Σξ γξμίδιξ gal + πξσ τέοεςαι από ςξ τάγξ μπξοεί μα αμςαλλαγεί με ςξ βακςηοιακό γξμίδιξ gal μέρχ διπλξύ διαρκελιρμξύ. Έμα ςέςξιξ ρςέλευξπ εκ μεςαγχγήπ είμαι ρςαθεοό, επειδή ςξ βακςηοιακό υοχμόρχμα πεοιέυει μόμξ έμαμ ςύπξ ςξσ γξμιδίξσ gal και δεμ έυει εμρχμαςώρει καμέμα από ςα γξμίδια ςξσ τάγξσ. Η ενειδικεσμέμη μεςαγχγή επιςοέπει ςη μεςαγχγή μόμξ μικοώμ ςμημάςχμ ςξσ βακςηοιακξύ υοχμξρώμαςξπ πξσ βοίρκξμςαι ρςιπ δύξ πλεσοέπ ςξσ ποξτάγξσ. Η ενειδικεσμέμη μεςαγχγή υοηριμξπξιείςαι για ςη μεςατξοά ειδικώμ γξμιδίχμ μεςανύ βακςηοίχμ για παοάδειγμα, για ςημ καςαρκεσή ρςελευώμ με ρσγκεκοιμέμξσπ γξμξςύπξσπ.

75 Φαοςξγοάτηρη γξμιδίχμ ρε βακςηοιξτάγξσπ

76 Φαοςξγοάτηρη γξμιδίχμ ρε βακςηοιξτάγξσπ Ίδιεπ αουέπ με ςιπ ποξηγξύμεμεπ πεοιπςώρειπ. Κύςςαοα εμόπ βακςηοιακξύ ρςελέυξσπ μξλύμξμςαι ςασςόυοξμα με τάγξσπ διατξοεςικώμ γξμξςύπχμ. Μεςά ςη μόλσμρη ξι τάγξι ειρέουξμςαι ρςξ λσςικό κύκλξ.

77 Διπλή ποξρβξλή κσςςάοξσ E. coli από δύξ τάγξσπ

78 h + : μξλύμει ςα Β, όυι ςα Β/2 - θξλέπ πλάκεπ h : μξλύμει ςα Β & Β/2 - διασγείπ πλάκεπ r + : μικοέπ πλάκεπ - αρατήπ πεοίμεςοξπ r : μεγάλεπ πλάκεπ - εσδιάκοιςη πεοίμεςοξπ h + r : θξλέπ μεγάλεπ πλάκεπ, εσδιάκοιςη πεοίμεςοξπ hr + : εσδιάκοιςεπ μικοέπ πλάκεπ, αρατήπ πεοίμεςοξπ E. coli B E. coli B/2

79 Fig 7-25

80

81 h + : μξλύμει ςα Β, όυι ςα Β/2 θξλέπ πλάκεπ h : μξλύμει ςα Β & Β/2 διασγείπ πλάκεπ r + : μικοέπ πλάκεπ αρατήπ πεοίμεςοξπ r : μεγάλεπ πλάκεπ εσδιάκοιςη πεοίμεςοξπ h + r : θξλέπ μεγάλεπ πλάκεπ, εσδιάκοιςη πεοίμεςοξπ hr + : εσδιάκοιςεπ μικοέπ πλάκεπ, αρατήπ πεοίμεςοξπ h + r + : θξλέπ μικοέπ πλάκεπ hr : εσδιάκοιςεπ μεγάλεπ πλάκεπ Πλάκεπ πξσ έυξσμ ποξκύφει από ςξσπ απξγόμξσπ ςηπ διαρςαύοχρηπ h - r + x h + r -

82 Αμάλσρη λεπςήπ δξμήπ εμόπ γξμιδίξσ βακςηοιξτάγξσ

83 r+: θξλή πλάκα δσρδιάκοιςα άκοα rii: μεγάλη, διασγήπ πλάκα με εσδιάκοιςα όοια

84 Ποξκαςαοκςικόπ γεμεςικόπ υάοςηπ λεπςήπ δξμήπ ςηπ πεοιξυήπ rii ςξσ τάγξσ T4 (Benzer, διασταυρώσεις 60 διαφορετικώμ μεταλλαγμέμωμ στελεχώμ στημ περιοχή rii)

85 Δξκιμαρίεπ ρσμπληοχμαςικόςηςαπ για ςξμ ποξρδιξοιρμό ςχμ λειςξσογικώμ μξμάδχμ ςηπ πεοιξυήπ rii ςξσ τάγξσ T4 (α) σμβαίμει ρσμπληοχμαςικόςηςα. (β) Δε ρσμβαίμει ρσμπληοχμαςικόςηςα.

86 Τέλος Ενότητας

87 Χρηματοδότηση Το παρόν εκπαιδευτικό υλικό έχει αναπτυχθεί στα πλαίσια του εκπαιδευτικού έργου του διδάσκοντα. Το έργο «Ανοικτά Ακαδημαϊκά Μαθήματα στο Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων» έχει χρηματοδοτήσει μόνο τη αναδιαμόρφωση του εκπαιδευτικού υλικού. Το έργο υλοποιείται στο πλαίσιο του Επιχειρησιακού Προγράμματος «Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση» και συγχρηματοδοτείται από την Ευρωπαϊκή Ένωση (Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο) και από εθνικούς πόρους.

88 Σημειώματα

89 Σημείωμα Ιστορικού Εκδόσεων Έργου Το παρόν έργο αποτελεί την έκδοση 1.0. Έχουν προηγηθεί οι κάτωθι εκδόσεις: Έκδοση 1.0 διαθέσιμη εδώ.

90 Σημείωμα Αναφοράς Copyright Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων, Διδάσκουσα: Επίκουρη Καθηγήτρια Αμαλία-Σοφία Αφένδρα. «Βασική Γενετική. Η γενετική των βακτηρίων & των βακτηριοφάγων». Έκδοση: 1.0. Ιωάννινα Διαθέσιμο από τη δικτυακή διεύθυνση:

91 Σημείωμα Αδειοδότησης Το παρόν υλικό διατίθεται με τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Αναφορά Δημιουργού - Παρόμοια Διανομή, Διεθνής Έκδοση 4.0 [1] ή μεταγενέστερη. [1]