ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΠΙΔΡΑΣΗΣ ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΩΝ ΚΑΙ ΤΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΣΤΙΣ ΑΝΑΠΑΡΑΓΩΓΙΚΕΣ ΠΑΡΑΜΕΤΡΟΥΣ ΤΩΝ ΧΟΙΡΙΝΩΝ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ, ΔΑΣΟΛΟΓΙΑΣ & ΦΥΣΙΚΟΥ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΤΜΗΜΑ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΖΩΙΚΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑΣ ΑΝΑΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΑΓΡΟΤΙΚΩΝ ΖΩΩΝ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΠΙΔΡΑΣΗΣ ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΩΝ ΚΑΙ ΤΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΣΤΙΣ ΑΝΑΠΑΡΑΓΩΓΙΚΕΣ ΠΑΡΑΜΕΤΡΟΥΣ ΤΩΝ ΧΟΙΡΙΝΩΝ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΑΠΟΣΤΟΛΟΣ ΜΑΡΑΝΤΙΔΗΣ ΓΕΩΠΟΝΟΣ ΕΠΙΒΛΕΠΟΥΣΑ ΑΥΔΗ ΜΕΛΠΟΜΕΝΗ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Α.Π.Θ. ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2014

2 Τριμελής Συμβουλευτική Επιτροπή 1. Μελπομένη ΑΥΔΗ, Καθηγήτρια Γεωπονική Σχολής Α.Π.Θ. 2. Αθανάσιος Παπαδόπουλος, Αν. Καθηγητής Τμήματος Βιολογίας Α.Π.Θ. 3. Γεώργιος Μιχαηλίδης, Επ. Καθηγητής Γεωπονικής Σχολής Α.Π.Θ. Επταμελής Εξεταστική Επιτροπή 1. Μελπομένη ΑΥΔΗ, Καθηγήτρια Γεωπονική Σχολής Α.Π.Θ. 2. Χαρίλαος Καρατζιάς, Καθηγητής Τμήματος Κτηνιατρικής Α.Π.Θ. 3. Ζήσης Μαμούρης, Καθηγητής Παν/μίου Θεσσαλίας 4. Αθανάσιος Παπαδόπουλος, Αν. Καθηγητής Τμήματος Βιολογίας Α.Π.Θ. 5. Γεώργιος Μιχαηλίδης, Επ. Καθηγητής Γεωπονικής Σχολής Α.Π.Θ. 6. Γεώργιος Βατζιάς, Επ. Καθηγητής Γεωπονικής Σχολής Α.Π.Θ. 7. Αλέξιος Πολύδωρας, Επ. Καθηγητής Γεωπονικής Σχολής Α.Π.Θ.

3 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η παρούσα Διδακτορική Διατριβή πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Φυσιολογίας Αναπαραγωγής Αγροτικών Ζώων του Τμήματος Γεωπονίας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, υπό την επίβλεψη της καθηγήτριας, Διευθύντριας του Εργαστηρίου και Διευθύντριας του Τομέα Ζωικής Παραγωγής, κ. Μελπομένης ΑΥΔΗ, κατά τα έτη Κατά τη διάρκεια των σπουδών μου υπήρξαν πολλά και σημαντικά άτομα τα οποία με βοήθησαν για την επίτευξη των στόχων μου. Πρώτη απ όλους θα ήθελα να ευχαριστήσω την επιβλέπουσα καθηγήτρια μου, κ. Μελπομένη ΑΥΔΗ, για την υποστήριξη και τα υλικά που μου παρείχε κατά τη διάρκεια της παραμονής μου στο Εργαστήριο, για τις γνώσεις που μου μετέδωσε κατά τη διάρκεια των σπουδών μου και για τη σημαντική καθοδήγησή και τις συμβουλές που μου προσέφερε κατά τη διάρκεια της συγγραφής της παρούσας διδακτορικής διατριβής και των αντίστοιχων επιστημονικών άρθρων και δημοσιεύσεων. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω τα άλλα δύο μέλη της Τριμελούς μου Επιτροπής, κ. Αθανάσιο Παπαδόπουλο και κ. Γεώργιο Μιχαηλίδη για τις υποδείξεις τους και τη βοήθεια που μου παρείχαν κατά την εκπαίδευσή μου και τη διευκόλυνση των πειραματισμών. Στο σημείο αυτό θα ήθελα να ευχαριστήσω και τον κ. Μπάνο, Καθηγητή του Τμήματος Κτηνιατρικής του Α.Π.Θ. ο οποίος συνέβαλε σημαντικά στο διδακτορικό μου, ως μέλος της Τριμελούς μου συμβουλευτικής επιτροπής κατά τα πρώτα χρόνια της διδακτορικής μου έρευνας. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω τους ιδιοκτήτες των χοιροτροφικών μονάδων που μου επέτρεψαν τη λήψη δειγμάτων από το ζωικό τους κεφάλαιο και μου παρείχαν την ελευθερία προς αναζήτηση των δεδομένων που αφορούσαν τα παραγωγικά χαρακτηριστικά των χοιρομητέρων τους. Θα είμαι πάντα ευγνώμων στα μέλη της οικογένειας Μπατάλα και την υπεύθυνη της μονάδας Σούζη Φλωρά από την Πιερία, στον κ. Θωμά Γκασνάκη και στο βοηθό του Παναγιώτη Κοντζαθανάση από 1

4 την Ημαθία και στον κ. Ιωάννη Δαρμάρη και την οικογένεια του από την Θεσσαλονίκη. Παράλληλα, θα ήθελα να ευχαριστήσω όλους αυτούς που με βοήθησαν με τις υποδείξεις τους καθόλη τη διάρκεια της διδακτορικής μου διατριβής. Τον κ. Αποστολίδη Απόστολο, Καθηγητή του Τμήματος Γεωπονίας Α.Π.Θ. και τους δύο υποψήφιους διδάκτορες του Εργαστηρίου του, Ιωάννη Γιάντση και Ανδρέα Γεωργιάδη. Τον κ. Γ. Λαλιωτη, διδάκτορα του Γεωπονικού Πανεπιστημίου Αθηνών για την αμέριστη βοήθεια του στην στατιστική επεξεργασία των πειραματισμών και την όλη εποικοδομητική συνεργασία μας. Το προσωπικό και την διοίκηση του Εργαστηρίου Αναλύσεων BIOPROBE πο υ μο υ έδωσαν την ευκαιρία να παρακολουθήσω το σεμινάριο της στατιστικής ανάλυσης και τα δύο σεμινάρια που αφορούσαν εργαστηριακές πρακτικές της μοριακής βιολογίας. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω τους γονείς μου, την αδερφή μου και τους φίλους μου, που στάθηκαν πάντα δίπλα μου, οικονομικά και πνευματικά, καθώς η υποστήριξη τους κρίθηκε αναγκαία για την υλοποίηση της διδακτορικής μου έρευνας. Στο σημείο αυτό, θα πρέπει να αναφέρω επίσης πως ένα σημαντικό γεγονός πριν από την έναρξη των σπουδών μου, ήταν η πρώτη θέση που πέτυχα στα αποτελέσματα των εξετάσεων για τα τροφεία του Ιδρύματος Κρατικών Υποτροφιών (Ι.Κ.Υ.). Τα μηνιαία τροφεία ήταν απαραίτητο συμπλήρωμα για την άνετη διαβίωσή μου στη Θεσσαλονίκη, καθόλη τη διάρκεια της διδακτορικής έρευνας. 2

5 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ... 1 ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ ΚΑΙ ΓΕΝΟΓΛΩΣΣΟΙ ΟΡΟΙ... 8 ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΠΙΝΑΚΩΝ ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΓΡΑΦΗΜΑΤΩΝ ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΕΙΚΟΝΩΝ Σελ. 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Πορεία της χοιροτροφίας Υφιστάμενη κατάσταση της χοιροτροφίας Παραγωγή χοίρειου κρέατος στην Ελλάδα ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑΣ Ο Σκοπός της Διατριβής και η δομή της ΜΕΡΟΣ Α ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η ΑΝΟΣΙΑ ΣΤΑ ΘΗΛΑΣΤΙΚΑ Η επίκτητη ανοσία Η έμφυτη ανοσία ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ ΣΤΗΝ ΕΜΦΥΤΗ ΑΝΟΣΙΑ ΤΡΟΠΟΣ ΔΡΑΣΗΣ ΤΩΝ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ Οικογένεια γονιδίων TLR Αναγνώριση βακτηρίων με TLR Αντιμικροβιακά πεπτίδια Τα πεπτίδια DEFENSINS

6 Η οικογένεια των β-defensins των χοίρων Τα γονίδια LEAPs Μορφή έκφρασης και ρύθμιση των BDs Ανοσσορυθμιστικές ιδιότητες των αντιμικροβιακών πεπτιδίων 45 Χημειοθεραπευτική δράση Αντιμικροβιακή δράση Συνεργιστικές και προσθετικές αντιμικροβιακές δραστηρ Συμπερασματικά ΜΕΡΟΣ Β 2.7. Η ΧΡΗΣΗ ΤΗΣ ΕΠΙΛΟΓΗΣ ΜΕ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥΣ ΔΕΙΚΤΕΣ ΣΤΗ ΖΩΙΚΗ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΟΙ ΕΞΕΛΙΞΕΙΣ ΣΤΗ ΜΟΡΙΑΚΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΤΩΝ ΧΟΙΡΩΝ ΜΕΓΕΘΟΣ ΤΟΚΕΤΟΜΑΔΑΣ ΤΩΝ ΧΟΙΡΩΝ Το γονίδιο BF Gene Το γονίδιο RBP4 Gene Το γονίδιο ESR2 Gene ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΕΡΟΣ Α 3.1. ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΟ ΕΞΕΤΑΣΗΣ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΚΟΚΚΩΔΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΜΕ LPS ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ RNA ΣΥΝΘΕΣΗ cdna Σχεδιασμός εκκινητών και Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμερ PCR πραγματικού χρόνου (Real-time PCR) Στατιστική ανάλυση

7 ΜΕΡΟΣ Β ΑΝΑΠΑΡΑΓΩΓΙΚΕΣ ΠΑΡΑΜΕΤΡΟΙ ΧΟΙΡΟΜΗΤΕΡΩΝ Μονάδα Μπατάλα Μονάδα Γκασνάκη Μονάδα Δαρμάρη ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΓΟΝΟΤΥΠΟΥ ΜΕ PCR-RFLP Το γονίδιο BF Το γονίδιο RBP Το γονίδιο ESR Στατιστική ανάλυση ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΜΕΡΟΣ Α 4.1. Διερεύνηση της έκφρασης των TLR γονιδίων και γονιδίων που κωδικοποιούν πεπτίδια με αντιμικροβιακή δραστηριότητα σε αναπαραγωγικά όργανα χοίρων Διερεύνηση της έκφρασης των TLR γονιδίων και γονιδίων που κωδικοποιούν πεπτίδια με αντιμικροβιακή δραστηριότητα σε in vitro παραγόμενα έμβρυα χοίρων α. Διερεύνηση της έκφρασης των TLR γονιδίων και γονιδίων που κωδικοποιούν πεπτίδια με αντιμικροβιακή δραστηριότητα σε κοκκώδη κύτταρα χοίρων Διερεύνηση της επίδρασης Λιποπολυσακχαρίτη (LPS) στα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων της οικογένειας TLR σε μικρά (<3 mm) και μεγάλα (>3 mm) κοκκώδη κύτταρα χοίρων ΜΕΡΟΣ Β ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΑΠΟ ΤΗ ΕΞΑΓΩΓΗ DNA ΑΠΟ ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΧΟΙΡΟΜΗΤΕΡΩΝ ΚΑΙ ΑΡΣΕΝΙΚΩΝ ΧΟΙΡΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΤΩΝ PCR ΤΩΝ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ DNA ΑΠΟ ΧΟΙΡΟΜΗΤΕΡΕΣ ΚΑΙ ΑΡΣΕΝΙΚΟΥΣ ΧΟΙΡΟΥΣ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΤΑ ΤΟΥ ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΟΥ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ BF

8 Διασπορά γονοτύπων, συχνότητα γονοτύπων και συχνότητα αλληλομόρφων Διασπορά γονοτύπων, συχνότητα γονοτύπων και συχνότητα αλληλομόρφων των αρσενικών χοίρων Συσχέτιση μεταξύ των γονοτύπων και των αναπαραγωγικών χαρακτηριστικών των χοιρομητέρων (ΤNB-NBA) ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΤΑ ΤΟΥ ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΟΥ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ RBP Διασπορά γονοτύπων, Συχνότητα γονοτύπων και Συχνότητα αλληλομόρφων Διασπορά γονοτύπων, Συχνότητα γονοτύπων και Συχνότητα αλληλομόρφων των αρσενικών χοίρων Συσχέτιση μεταξύ των γονοτύπων και των αναπαραγωγικών χαρακτηριστικών των χοιρομητέρων (ΤNB-NBA) ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΤΑ ΤΟΥ ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΟΥ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ ESR Διασπορά γονοτύπων, Συχνότητα γονοτύπων και Συχνότητα αλληλομόρφων Διασπορά γονοτύπων, Συχνότητα γονοτύπων και Συχνότητα αλληλομόρφων των αρσενικών χοίρων Συσχέτιση μεταξύ των γονοτύπων και των αναπαραγωγικών χαρακτηριστικών των χοιρομητέρων (ΤNB-NBA) ΣΥΣΧΕΤΙΣΗ ΜΕΤΑΞΥ ΤΗΣ ΣΥΧΝΟΤΗΤΑΣ ΤΩΝ ΓΟΝΟΤΥΠΩΝ ΑΝΑΜΕΣΑ ΣΕ ΔΥΟ ΟΜΑΔΕΣ ΧΟΙΡΟΜΗΤΕΡΩΝ Α. ΟΜΑΔΕΣ ΜΕ ΒΑΣΗ ΤΟΝ ΜΕΣΟ ΟΡΟ Β. ΑΚΡΑΙΕΣ ΟΜΑΔΕΣ ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΜΕΤΑΞΥ ΟΜΑΔΩΝ: ΓΟΝΙΔΙΟ BF ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΜΕΤΑΞΥ ΟΜΑΔΩΝ: ΓΟΝΙΔΙΟ RBP ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΜΕΤΑΞΥ ΟΜΑΔΩΝ: ΓΟΝΙΔΙΟ ESR

9 5. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΠΡΟΤΑΣΕΙΣ ΓΙΑ ΤΟ ΜΕΛΛΟΝ ΠΕΡΙΛΗΨΗ SUMMARY ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

10 ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ ΚΑΙ ΞΕΝΟΓΛΩΣΟΙ ΟΡΟΙ AMP Antimicrobial peptides Αντιμικροβιακά πεπτίδια APD Antimicrobial Peptides Database Βάση δεδομ. αντιμικροβ. πεπτιδίων bp Base pair Ζεύγη βάσεων BD Born dead Γεννηθέντα νεκρά χοιρίδια/τοκετό BM Born mummified Γεννηθ. μουμιοποιημένα χοιρίδια/τοκετό BSA Bovine Serum Albumin Αλβουμίνη ορού βοοειδούς CFB Complement Factor B cdna complementary DNA συμπληρωματικό DNA DNA Deoxyribonucleic Acid Δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ dntps deoxynucleotide triphosphates τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια EDTA Ethylenediaminetertaacetic acid EtBr Ethidium Bromide Βρωμιούχο αιθίδιο FMD Foot and Mouth Disease Αφθώδης πυρετός HDP Host defence peptides αμυντικά πεπτίδια ξενιστών LPS Lipopolysaccharide Λιποπολυσακχαρίτης LBP LPS binding protein πρωτεΐνη σύνδεσης του LPS LTA Lipotechoic acid MAS Marker-assisted Selection Επιλογή με δείκτες MAMP Microorganisms-associated Molecular Patterns Μοριακές δομές μικροοργανισμών MBC Mannan binding lectin MHC Major Histocompatibility Complex Μείζον Σύστημα Ιστοσυμβατότητας ΝΒΑ Number Born Alive Γεννηθέντα ζωντανά χοιρίδια/τοκετό NW Number weaned Απογαλακτισθέντα χοιρίδια/τοκετομάδα PAMP Pathogen Associated Molecular Patterns Μοριακές δομές παθογόνων pbds Porcine β-defensins β-defensins χοίρων PBS Phospate Buffer Saline Ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών αλάτων PCR Polymerase Chain Reaction Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης PGRP Peptidoglycan recognition proteins PRR Pattern Recognition Receptors Υποδοχείς Αναγνώρισης δομών QTL Quantitative traits loci Τόπος ποσοτικών χαρακτηριστικών RNA Ribonucleic Acid Ριβονουκλεϊκό οξύ RTase Reverse Transcriptase Αντίστροφη μεταγραφάση RT-PCR Reverse Transcription PCR. PCR Αντίστροφης Μεταγραφής SNP Single Nucleotide Polymorphism Μονονουκλεοτιδικός πολυμορφισμός 8

11 TLRs Toll-like receptor Υποδοχείς Toll-like ΤΝΒ Total Number Born Συνολικά γεννηθέντα χοιρίδια/τοκετό UV Ultra Violet Υπεριώδης ακτινοβολία --- Accession Number Αριθμός καταχώρησης anti-infection αντι-μολυσματικός anti-endotoxin αντι-ενδοτοξικός binding σύνδεση Chemotactic activity χημειοθεραπευτική δράση effector ενεργοποιητής elusion buffer ρυθμιστικό διάλυμα διάλυσης eosinophils ηωσινόφιλα exon εξώνιο Genebank Τράπεζα γονιδίων genome γονιδίωμα housekeeping gene γονίδιο αναφοράς intracellular ενδοκυτταρικός intron εσώνιο lipid λιπίδιο lipoteichoic acid λιποτειχοϊκό οξύ mast cells μαστοκύτταρα mucosa βλεννογόνος negative control αρνητικός μάρτυρας neutrophils ουδετερόφιλα pathogenicity παθογένεια pedigree γενεαλογία positive control θετικός μάρτυρας propagation διασπορά phagocytic vacuoles φαγοκυτταρικά κενοτόπια physiological settings φυσιολογικά περιβάλλοντα rearrangement αναδιάταξη recombinant ανασυνδυασμένος septic shock σηπτικό σοκ signal peptides σηματοδοτικά πεπτίδια specificity εξειδίκευση tail άκρο trait χαρακτηριστικό ultrafiltrate υπερδιήθηση 9

12 ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΠΙΝΑΚΩΝ Σελ. Πίν. 1: Ετήσια παραγωγή χοίρειου κρέατος στην Ε.Ε Πίν. 2: Σύγκριση των χαρακτηριστικών των υποδοχέων μεταξύ της έμφυτης και της επίκτητης ανοσίας Πίν. 3: Το μέγεθος τοκετομάδας ανά ομάδες φυλών χοίρων Πίν. 4: Η αποδοτικότητα των χοιρομητέρων ανά κατηγορία αποδόσεων Πίν. 5: Όνομα γονιδίου, αλληλουχία γονιδίου (5-3 ), θερμοκρασία PCR ( C), μέγεθος ενισχυμένου τμήματος γονιδίου, GenBank accession number, για τα γονίδια των οικογενειών TLR και BD Πίν. 6: Συνθήκες για την ενίσχυση του γονιδίου BF με την PCR Πίν. 7: Συνθήκες για την πέψη των προϊόντων της PCR για το γονίδιο BF gene Πίν. 8: Συνθήκες για την ενίσχυση του γονιδίου RBP4 με την PCR Πίν. 9: Συνθήκες για την πέψη των προϊόντων της PCR για το γονίδιο RBP4 gene Πίν. 10: Συνθήκες για την ενίσχυση του γονιδίου ESR2 με την PCR Πίν. 11: Συνθήκες για την πέψη των προϊόντων της PCR για το γονίδιο ESR2 gene Πίν. 12: Αναμενόμενες ζώνες του γονιδίου BF μετά την PCR-RFLP Πίν. 13: Διασπορά γονοτύπων, Συχνότητα γονοτύπων και Συχνότητα αλληλομόρφων του γονιδίου BF σε όλες τις χοιρομητέρες που μελετήθηκαν Πίν. 14: Γονότυποι αρσενικών για το γονίδιο BF gene Πίν. 15: Μέσος όρος του κάθε γονοτύπου του γονιδίου RBP4 για κάθε αναπαραγωγικό χαρακτηριστικό, σε όλες τι χοιρομητέρες της Μονάδας Μπατάλα (n=120) Πίν. 16: Μέσος όρος του κάθε γονοτύπου του γονιδίου RBP4 για κάθε αναπαραγωγικό χαρακτηριστικό, σε όλες τι χοιρομητέρες της Μονάδας Γκασνάκη (n = 280)

13 Πίν. 17: Μέσος όρος του κάθε γονοτύπου του γονιδίου RBP4 για κάθε αναπαραγωγικό χαρακτηριστικό, σε όλες τι χοιρομητέρες της Μονάδας Δαρμάρη (n = 20) Πίν. 18: Αναμενόμενες ζώνες του γονιδίου RBP4 μετά την PCR-RFLP Πίν. 19: Διασπορά γονοτύπων, Συχνότητα γονοτύπων και Συχνότητα αλληλομόρφων του γονιδίου RBP4 σε όλες τις χοιρομητέρες που μελετήθηκαν Πίν. 20: Γονότυποι αρσενικών για το γονίδιο RBP4 gene Πίν. 21: Μέσος όρος του κάθε γονοτύπου του γονιδίου RBP4 για κάθε αναπαραγωγικό χαρακτηριστικό, σε όλες τι χοιρομητέρες της Μονάδας Μπατάλα (n=120) Πίν. 22: Μέσος όρος του κάθε γονοτύπου του γονιδίου RBP4 για κάθε αναπαραγωγικό χαρακτηριστικό, σε όλες τι χοιρομητέρες της Μονάδας Γκασνάκη (n = 280) Πίν. 23: Μέσος όρος του κάθε γονοτύπου του γονιδίου RBP4 για κάθε αναπαραγωγικό χαρακτηριστικό, σε όλες τι χοιρομητέρες της Μονάδας Δαρμάρη (n = 20) Πίν. 24: Αναμενόμενες ζώνες του γονιδίου ESR2 μετά την PCR-RFLP Πίν. 25: Διασπορά γονοτύπων, Συχνότητα γονοτύπων και Συχνότητα αλληλομόρφων του γονιδίου ESR2 σε όλες τις χοιρομητέρες που μελετήθηκαν Πίν. 26: Γονότυποι αρσενικών για το γονίδιο ESR2 gene Πίν. 27: Μέσος όρος του κάθε γονοτύπου του γονιδίου ESR2 για κάθε αναπαραγωγικό χαρακτηριστικό, σε όλες τι χοιρομητέρες της Μονάδας Μπατάλα (n=120) Πίν. 28: Μέσος όρος του κάθε γονοτύπου του γονιδίου ESR2 για κάθε αναπαραγωγικό χαρακτηριστικό, σε όλες τι χοιρομητέρες της Μονάδας Γκασνάκη (n = 280) Πίν. 29: Μέσος όρος του κάθε γονοτύπου του γονιδίου ESR2 για κάθε αναπαραγωγικό χαρακτηριστικό, σε όλες τι χοιρομητέρες της Μονάδας Δαρμάρη (n = 20) Πίν. 21: Γενικοί μέσοι όροι κάθε αναπαραγωγικού χαρακτηριστικού (division point) και μέσοι όροι των σχηματιζόμενων ομάδων αποδόσεων για την Μονάδα Μπατάλα (n = 120)

14 Πίν. 22: Γενικοί μέσοι όροι κάθε αναπαραγωγικού χαρακτηριστικού (division point) και μέσοι όροι των σχηματιζόμενων ομάδων αποδόσεων για την Μονάδα Γκασνάκη (n = 280) Πίν. 23: Μέσοι όροι των γονοτύπων που αντιστοιχούν στις σχηματιζόμενες ομάδες αποδόσεων για την Μονάδα Μπατάλα (n = 120). Mean ± SE Πίν. 24: Μέσοι όροι των γονοτύπων που αντιστοιχούν στις σχηματιζόμενες ομάδες αποδόσεων για την Μονάδα Γκασνάκη (n = 280). Mean ± SE Πίν. 25: Γενικοί μέσοι όροι κάθε αναπαραγωγικού χαρακτηριστικού (division point) και μέσοι όροι των σχηματιζόμενων ομάδων αποδόσεων για την Μονάδα Μπατάλα (n = 120) Πίν. 26: Γενικοί μέσοι όροι κάθε αναπαραγωγικού χαρακτηριστικού (division point) και μέσοι όροι των σχηματιζόμενων ομάδων αποδόσεων για την Μονάδα Γκασνάκη (n = 280) Πίν. 27: Μέσοι όροι των ακραίων ομάδων υψηλών και χαμηλών αποδόσεων για την Μονάδα Μπατάλα (n = 120). Mean ± SE Πίν. 28: Μέσοι όροι των ακραίων ομάδων υψηλών και χαμηλών αποδόσεων για την Μονάδα Γκασνάκη (n = 280). Mean ± SE Πίν. 29: Μέσοι όροι των ακραίων ομάδων υψηλών και χαμηλών αποδόσεων για την Μονάδα Μπατάλα (n = 120). Mean ± SE Πίν. 30: Μέσοι όροι των ακραίων ομάδων υψηλών και χαμηλών αποδόσεων για την Μονάδα Γκασνάκη (n = 280). Mean ± SE Πίν. 31: Μέσοι όροι των γονοτύπων που αντιστοιχούν στις ακραίες ομάδες αποδόσεων για την Μονάδα Μπατάλα (n = 120). Mean ± SE Πίν. 32: Μέσοι όροι των γονοτύπων που αντιστοιχούν στις ακραίες ομάδες αποδόσεων για την Μονάδα Γκασνάκη (n = 280). Mean ± SE

15 ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΓΡΑΦΗΜΑΤΩΝ Σελ. Γράφημα 1: Ποσοστό ετήσια παραγωγής χοίρειου κρέατος στην Ε.Ε. (Eurostat, 2012) Γράφημα 2: Επίπεδα έκφρασης των γονιδίων της οικογένειας TLR σε σχέση με το επίπεδο έκφρασης του γονιδίου της ακτίνης Γράφημα 3: Επίπεδα έκφρασης των γονιδίων της οικογένειας β- defensins σε σχέση με το επίπεδο έκφρασης του γονιδίου της ακτίνης Γράφημα 4: Επίπεδα έκφρασης των γονιδίων της οικογένειας TLR σε σχέση με το επίπεδο έκφρασης του γονιδίου της ακτίνης. στα μικρά και μεγάλα κοκκώδη κύτταρα των χοίρων, μετά από προσδιορισμό με real-time PCR Γράφημα 5: Επίπεδα έκφρασης του γονιδίου TLR1 σε σχέση με το επίπεδο έκφρασης του γονιδίου της ακτίνης. στα μικρά και μεγάλα κοκκώδη κύτταρα των χοίρων, μετά από προσδιορισμό με real-time PCR σε διαφορετικά διαστήματα παρουσίας LPS Γράφημα 6: Επίπεδα έκφρασης του γονιδίου TLR2 σε σχέση με το επίπεδο έκφρασης του γονιδίου της ακτίνης. στα μικρά και μεγάλα κοκκώδη κύτταρα των χοίρων, μετά από προσδιορισμό με real-time PCR σε διαφορετικά διαστήματα παρουσίας LPS Γράφημα 7: Επίπεδα έκφρασης του γονιδίου TLR4 σε σχέση με το επίπεδο έκφρασης του γονιδίου της ακτίνης. στα μικρά και μεγάλα κοκκώδη κύτταρα των χοίρων, μετά από προσδιορισμό με real-time PCR σε διαφορετικά διαστήματα παρουσίας LPS Γράφημα 8: Επίπεδα έκφρασης του γονιδίου TLR5 σε σχέση με το επίπεδο έκφρασης του γονιδίου της ακτίνης. στα μικρά και μεγάλα κοκκώδη κύτταρα των χοίρων, μετά από προσδιορισμό με real-time PCR σε διαφορετικά διαστήματα παρουσίας LPS Γράφημα 9: Επίπεδα έκφρασης του γονιδίου TLR6 σε σχέση με το επίπεδο έκφρασης του γονιδίου της ακτίνης. στα μικρά και μεγάλα κοκκώδη κύτταρα των χοίρων, μετά από προσδιορισμό με real-time PCR σε διαφορετικά διαστήματα παρουσίας LPS

16 Γράφημα 10: Επίπεδα έκφρασης του γονιδίου TLR9 σε σχέση με το επίπεδο έκφρασης του γονιδίου της ακτίνης. στα μικρά και μεγάλα κοκκώδη κύτταρα των χοίρων, μετά από προσδιορισμό με real-time PCR σε διαφορετικά διαστήματα παρουσίας LPS Γράφημα 11: Επίπεδα έκφρασης του γονιδίου TLR10 σε σχέση με το επίπεδο έκφρασης του γονιδίου της ακτίνης. στα μικρά και μεγάλα κοκκώδη κύτταρα των χοίρων, μετά από προσδιορισμό με real-time PCR σε διαφορετικά διαστήματα παρουσίας LPS

17 ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΕΙΚΟΝΩΝ Σελ. Εικ. 1: Ο Υποδοχέας Mannan-binding lectin (MBL) προσκολλάται στην ιδιαίτερη κατανομή συγκεκριμένης ομάδας υδρογονανθράκων που βρίσκονται στην σωστή απόσταση μεταξύ τους (Janeway κ.α., 2001) Εικ. 2: Πορεία των διαδοχικών ενώσεων που συμβαίνουν κατά την παρουσία LPS στον ξενιστή (Janeway κ.α., 2001) Εικ. 3: Κάτοψη της Μονάδας Μπατάλα Εικ. 4: Κάτοψη της Μονάδας Γκασνάκη Εικ. 5: Κάτοψη της Μονάδας Δαρμάρη Εικ. 6: Έκφραση των γονιδίων της οικογένειας TLR στην ωοθήκη Εικ. 7: Έκφραση των γονιδίων της οικογένειας b-defensins και του γονιδίου phamp στην ωοθήκη Εικ. 8: Έκφραση των γονιδίων της οικογένειας TLR στον ωαγωγό Εικ. 9: Έκφραση των γονιδίων της οικογένειας b-defensins και του γονιδίου phamp στον ωαγωγό Εικ. 10: Έκφραση των γονιδίων της οικογένειας TLR στον όρχι Εικ. 11: Έκφραση των γονιδίων της οικογένειας b-defensins και του γονιδίου phamp στον όρχι Εικ. 12: Έκφραση των γονιδίων της οικογένειας TLR στην επιδιδυμίδα Εικ. 13: Έκφραση των γονιδίων της οικογένειας b-defensins και του γονιδίου phamp στην επιδιδυμίδα Εικ. 14: Έκφραση των γονιδίων της οικογένειας TLR σε έμβρυα χοίρων Εικ. 15: Έκφραση των γονιδίων της οικογένειας b-defensins και του γονιδίου phamp σε έμβρυα χοίρων Εικ. 16: Έκφραση των γονιδίων της οικογένειας TLR σε κοκκώδη κύτταρα (μικρά, < 3mm) Εικ. 17: Έκφραση των γονιδίων της οικογένειας b-defensins και του γονιδίου phamp σε κοκκώδη κύτταρα (μικρά, < 3mm)

18 Εικ. 18: Έκφραση των γονιδίων της οικογένειας TLR σε κοκκώδη κύτταρα (μεγάλα, > 3mm) Εικ. 19: Έκφραση των γονιδίων της οικογένειας b-defensins και του γονιδίου phamp σε κοκκώδη κύτταρα (μεγάλα, > 3mm) Εικ. 20: Απεικόνιση ηλεκτροφόρησης δειγμάτων DNA από χοιρομητέρες Εικ. 21: Απεικόνιση ηλεκτροφόρησης προϊόντων PCR από χοιρομητέρες για το γονίδιο BF Εικ. 22: Απεικόνιση ηλεκτροφόρησης προϊόντων PCR από χοιρομητέρες για το γονίδιο RBP Εικ. 23: Απεικόνιση ηλεκτροφόρησης προϊόντων PCR από χοιρομητέρες για το γονίδιο ESR Εικ. 24: Οι τρεις γονότυποι του γονιδίου BF Εικ. 25: Οι τρεις γονότυποι του γονιδίου RBP4 gene Εικ. 26: Οι τρεις γονότυποι του γονιδίου RBP4 gene

19 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1. Πορεία της χοιροτροφίας Από την αρχαιότητα ως σήμερα, στην πορεία εξέλιξης της χοιροτροφίας διακρίνονται τρεις σταθμοί που σχετίζονται άμεσα με τις συνθήκες διαβίωσης των ανθρώπων: Ο πρώτος σταθμός είναι η εξημέρωση του άγριου χοίρου, που ζούσε στα δάση, κατά την 7 η χιλιετία π. Χ. Στην περίοδο που ακολούθησε, δεν υπήρξε καμία προσπάθεια βελτίωσης των αποδόσεων των χοίρων. Οι συνθήκες εκτροφής ήταν υποτυπώδεις ενώ η διατροφή ήταν φτωχή και βασιζόταν περισσότερο στη βόσκηση (Κατσαούνης & Σπαής, 1998). Ο δεύτερος σταθμός είναι η δημιουργία των πρώτων σταθεροποιημένων φυλών με υψηλές παραγωγικές ιδιότητες γύρω στα τέλη του 18 ου αιώνα και στις αρχές του 19 ου. Η προσπάθεια αυτή ξεκίνησε από την Βρετανία ενώ στη συνέχεια επεκτάθηκε και σε άλλες χώρες της δυτικής Ευρώπης (Κατσαούνης & Σπαής, 1998). Οι σημερινές φυλές των οικόσιτων χοίρων προέρχονται από διασταυρώσεις άγριων χοίρων από την Ευρώπη (Sus scrofa) και φυλών με χαρακτηριστικά μικρότερο σωματικό βάρος και υψηλότερες αναπαραγωγικές ικανότητες που προέρχονται από ασιατικές περιοχές (Sus vittatus) (Gordon, 1997). Οι συνθήκες εκτροφής βελτιώθηκαν σε σχέση με το παρελθόν και παράλληλα υπήρξε η τάση εκτροφής καθαρόαιμων φυλών. Η διατροφή στη δυτική Ευρώπη βασιζόταν στα υποπροϊόντα επεξεργασίας αγελαδινού γάλακτος (τυρόγαλα) ενώ στην Αμερική βασιζόταν στο καλαμπόκι. Κατά την περίοδο αυτή οι αποδόσεις των χοίρων βελτιώθηκαν, όμως η εκτροφή δεν κατάφερε να φτάσει σε επίπεδα υψηλής εντατικοποίησης. Πέρα από τα βελτιωμένα κρεοπαραγωγικά χαρακτηριστικά στους παχυνόμενους χοίρους, οι χοιρομητέρες παρουσίαζαν μεγαλύτερη πολυδυμία, ενώ κατάφερναν να απογαλακτίζουν 8 με 9 χοιρίδια σε αντίθεση με τις άγριες χοιρομητέρες που απογαλακτίζουν την συγκεκριμένη περίοδο το πολύ 5 χοιρίδια ανά τοκετό (Κατσαούνης & Σπαής, 1998). 17

20 Ο τρίτος σταθμός είναι η μετάβαση της χοιροτροφίας στη βιομηχανική παραγωγή, και αυτό παρατηρήθηκε περισσότερο στη δεκαετία του 50, όπου λόγω των οικονομικών και κοινωνικών συνθηκών που διαμορφώθηκαν μετά τον 2 ο Παγκόσμιο Πόλεμο εμφανίστηκε μεγάλη διαφοροποίηση στις ανάγκες των καταναλωτών. Η ζήτηση σε κρέας αυξήθηκε σημαντικά ενώ παράλληλα η βοοτροφία και πτηνοτροφία δεν ήταν πλέον αρκετή για να καλύψει τις ανάγκες της τότε αγοράς (Κατσαούνης & Σπαής, 1998). Οι κυριότεροι παράγοντες που διαμόρφωσαν τις συνθήκες για την ανάπτυξη της χοιροτροφίας κατά την περίοδο αυτή είναι (Κατσαούνης & Σπαής, 1998): Η αύξηση του πληθυσμού και η παράλληλη άνοδος του βιοτικού επιπέδου, η οποία προκάλεσε αύξηση της ζήτησης κρέατος, την οποία η χοιροτροφία ήταν σε θέση να καλύψει γρήγορα. Ο χοίρος παράγει άφθονο κρέας, ενώ παρατηρείται γρήγορη εναλλαγή γενεών η οποία επιτρέπει τη γενετική του βελτίωση μέσα σε σύντομο χρονικό διάστημα Ο χοίρος μπορεί να εκτραφεί μαζικά και σε περιορισμένο χώρο. Ο χοίρος παρουσιάζει υψηλό δείκτη μετατρεψιμότητας τροφής (ΔΜΤ) και το κόστος παραγωγής του χοιρινού κρέατος είναι μικρότερο σε σχέση μ εκείνου των μηρυκαστικών. Στην Ελλάδα, η πρώτη Εθνική προσπάθεια ανάπτυξης της χοιροτροφίας έγινε κατά τη δεκαετία του 50. Δημιουργήθηκαν οι πρώτες μονάδες οικογενειακού τύπου με 2 ως 5 χοιρομητέρες καθώς και κάποιες επιχειρηματικές εκμεταλλεύσεις με 10 ως 30 χοιρομητέρες. Οι συνθήκες εκτροφής ήταν κακές και χαρακτηρίζονταν από τους ακατάλληλους χώρους ενώ η διατροφή ήταν χαμηλού επιπέδου, με άμεσες συνέπειες την χαμηλή παραγωγικότητα. Παράλληλα η παραγωγή σφαγίων ήταν χαμηλής ποιότητας και υπήρχε ο κίνδυνος μετάδοσης διαφόρων νοσημάτων, παράγοντες οι οποίοι κρατούσαν την παραγωγή σε χαμηλό επίπεδο (Κατσαούνης & Σπαής, 1998). Στη δεκαετία του 60, παρατηρήθηκε μεγάλη άνοδος της χοιροτροφίας στην Ελλάδα. Χάρη στα μέτρα της Πολιτείας και με τη βοήθεια της Αγροτικής Τράπεζας τόσο σε πιστωτικό όσο και σε τεχνικό επίπεδο, η χοιροτροφία άρχισε να 18

21 συστηματοποιείται. Ιδρύθηκαν μικρές μονάδες οικογενειακής μορφής που ακολουθούσαν ορθούς κανόνες διαχείρισης και είχαν σχετικά βελτιωμένα ζώα. Στα μετέπειτα χρόνια, η εξέλιξη της χοιροτροφίας ήταν ραγδαία. Οι μικρές μονάδες οικογενειακής μορφής αυξήθηκαν σε μέγεθος και έγιναν περισσότερες, ενώ παράλληλα ιδρύθηκαν μεγάλες επιχειρηματικές μονάδες με μεγάλη παραγωγή χοιρινού κρέατος. Επίσης, ο παλιός πληθυσμός για αναπαραγωγή αντικαταστάθηκε από ζώα που προέρχονταν απευθείας από το εξωτερικό. Η διαχείριση των ζώων άρχισε να γίνεται με ειδικά μηχανήματα ενώ η διατροφή βασιζόταν πια σε μίγματα εμπλουτισμένα με βιταμίνες και ιχνοστοιχεία. Το παραγόμενο κρέας κάλυπτε τις απαιτήσεις του καταναλωτικού κοινού, ενώ παράλληλα είχαν εξαλειφθεί οι κίνδυνοι μετάδοσης ασθενειών από τους χοίρους προς τον άνθρωπο (Κατσαούνης & Σπαής, 1998). Ενδεικτικά αναφέρεται πως το 1965 υπήρχαν περίπου χοίροι με αποδόσεις τόνους κρέατος όπου αντιστοιχούσε στο 18% της συνολικής παραγωγής κρέατος και κάλυπτε σε αξία το 4% της ζωικής παραγωγής στην Ελλάδα (Κατσαούνης και Γκουντρομίχος, 1973) Υφιστάμενη κατάσταση της χοιροτροφίας Η παραγωγή χοιρινού κρέατος στην Ευρωπαϊκή Ένωση (Ε.Ε.) βασίζεται στη σταβλισμένη διαχείριση των ζώων και η διατροφή τους καλύπτεται με κατάλληλα μίγματα ζωοτροφών. Ένα σημαντικό χαρακτηριστικό είναι πως το κόστος διατροφής των χοίρων αποτελεί το μεγαλύτερο μέρος του συνολικού κόστους παραγωγής, το οποίο κυμαίνεται στο 65 %. Επίσης η παραγωγή χοιρινού κρέατος δεν υποστηρίζεται από τα συνήθη μέτρα Κοινής Αγροτικής Πολιτικής (Κ.Α.Π.) ενώ τα προβλήματα που αντιμετωπίζει αφορούν κυρίως την ποιότητα του κρέατος, την παραγωγικότητα των χοιρομητέρων και τη μόλυνση του περιβάλλοντος. Η Ε.Ε. παρουσιάζει ετήσια παραγωγή που το 2012 έφτασε τα 23 εκατ. τόνους χοιρινού κρέατος και είναι ο δεύτερος μεγαλύτερος παραγωγός στον κόσμο μετά την Κίνα. Οι κυριότερες χώρες παραγωγής χοιρείου κρέατος εμφανίζονται στον Πίν

22 Πίν. 1: Ετήσια παραγωγή χοίρειου κρέατος στην Ε.Ε. (Eurostat 2012) Κατάταξη Χώρα Ποσοστό χοίρειου κρέατος 1 η Γερμανία 24,7 % 2 η Ισπανία 15,3 % 3 η Γαλλία 9,1 % 4 η Πολωνία 7,9 % 5 η Δανία 7,6 % 6 η Κάτω Χώρες 5,9 % -- Ελλάδα 0,5 % Η ετήσια κατά κεφαλή κατανάλωση χοιρινού κρέατος στην Ε.Ε. υπολογίζεται περίπου στα 42 κιλά αλλά διαφέρει σημαντικά μεταξύ των κρατών- μελών. Η προσφορά του χοιρινού κρέατος αντιμετώπισε έκτακτα γεγονότα όπως ήταν η σπογγώδης εγκεφαλοπάθεια των βοοειδών (ΣΕΒ) την περίοδο και ο αφθώδης πυρετός το 2001 στα πρόβατα της βόρειας Ευρώπης (Ηνωμένο Βασίλειο, Ιρλανδία, Γαλλία και Ολλανδία). Οι καταναλωτές στην Ε.Ε. θα εξακολουθήσουν να προτιμούν το χοιρινό κρέας, αν και ο ρυθμός αύξησης της κατά κεφαλήν κατανάλωσής ίσως να μην αυξάνεται το ίδιο για τα επόμενα χρόνια κυρίως λόγω της επικείμενης πρόβλεψης για αύξηση της κατανάλωσης βοδινού κρέατος. Η Ε.Ε. δεν υποστηρίζει ενεργά τους παραγωγούς χοιρινού κρέατος, ενώ όταν το κάνει, γίνεται σε περιορισμένη κλίμακα και αφορά, κυρίως, στην περιστασιακή ενίσχυση ιδιωτών και επιστροφές από εξαγωγές, όταν οι συνθήκες της αγοράς το απαιτούν. Για τον λόγο αυτό γίνεται ξεκάθαρο πως τα εισοδήματα των παραγωγών χοιρείου κρέατος εξαρτώνται μόνο από την ανταγωνιστικότητα των χοιροτροφικών επιχειρήσεων και, κυρίως, από την δυνατότητα παραγωγής ή εύρεσης ζωοτροφών καλής ποιότητας και χαμηλού κόστους. Τα περιβαλλοντικά προβλήματα που δημιουργούν οι χοιροτροφικές μονάδες, έχουν μπει στο στόχαστρο της Ε.Ε. και η λειτουργία των χοιροτροφικών επιχειρήσεων αναμένεται ότι θα επηρεαστεί άμεσα από τα μέτρα που πρόκειται να 20

23 εφαρμοστούν, καθώς οι παραγωγοί του χοιρινού κρέατος θα υποχρεωθούν, τόσο από τη νομοθεσία της Ε.Ε. όσο και από τις εθνικές νομοθεσίες των κρατών τους, να συμμορφώνονται με όλο και αυστηρότερες προσαρμογές στην ήδη υπάρχουσα νομοθεσία. Παράλληλα, οι απαιτήσεις των καταναλωτών χοιρινού κρέατος θα συνεχίσουν να επηρεάζουν τα ποιοτικά χαρακτηριστικά του. Τα κινήματα των καταναλωτών αλλά και οικολογικές οργανώσεις θα απαιτούν τη θέσπιση καλύτερων συνθηκών διαχείρισης και σταυλισμού των ζώων, γεγονός που θα επιφέρει ακόμη μεγαλύτερο κόστος παραγωγής Παραγωγή χοίρειου κρέατος στην Ελλάδα Στην Ελλάδα η χοιροτροφία θεωρείται από τους δυναμικούς κλάδους του αγροτικού τομέα και της οικονομίας. Η συμμετοχή του χοιρινού κρέατος στην Ακαθάριστη Αξία Ζωικής Παραγωγής για το 2010 ήταν περίπου στο 20 %, στην εγχώρια παραγωγή κρέατος, για το 2011 ήταν στο 25 % και στη συνολική κατανάλωση χοιρινού κρέατος στη χώρα μας για το 2012 ήταν περίπου στο 35 %. Από την έναρξη της χοιροτροφίας στην Ελλάδα, δημιουργήθηκαν μεγάλες χοιροτροφικές μονάδες χωρίς εμπειρία και τεχνική υποδομή, με αποτέλεσμα, ακόμα και στις μέρες μας, να παρατηρούνται χαμηλοί δείκτες παραγωγικότητας και υψηλό κόστος παραγωγής, να εξαρτώνται απόλυτα από χώρες του βορρά για εισαγωγή ζώων υψηλού γενετικού δυναμικού και να στεγάζονται σε σταβλικές εγκαταστάσεις χαμηλών προδιαγραφών, πολλές φορές προβληματικές ή και ακατάλληλες. Η πολιτική που εφαρμόστηκε στο χοιρινό κρέας για μεγάλη περίοδο ήταν εσφαλμένη. Υπήρξε αστυνόμευση των τιμών πώλησης του κρέατος, σε περίοδο που το κόστος παραγωγής αυξανόταν πολύ περισσότερο από τον πληθωρισμό ενώ η χρηματοδότηση από τις τράπεζες ήταν άλλοτε ελλιπής και άλλοτε χαρακτηριζόταν από υψηλό και ασύμφορο κόστος για τους παραγωγούς. Η κάλυψη των ζημιών που προέκυπταν με την προσπάθεια των χοιροτρόφων να αυξήσουν την παραγωγή υπό καθεστώς χαμηλής παραγωγικότητας δεν ήταν πάντοτε επιτυχής. Παρατηρήθηκε 21

24 μεγάλη απώλεια εισοδημάτων, κυρίως λόγω υπερβολικής αύξησης των επιτοκίων από 6% το 1975 σε 28% το Ακολούθησαν διάφορες πολιτικές για την επίλυση των προβλημάτων, κυρίως μέσω της εφαρμογής ρυθμίσεων των οφειλών, τις οποίες όμως οι παραγωγοί και πάλι δεν ήταν σε θέση να καλύψουν με τον τρόπο που είχαν εφαρμοστεί. Τα αποτέλεσμα όλων αυτών των ενεργειών ήταν η υπερχρέωση του κλάδου της χοιροτροφίας, η οποία ταλανίζει μέχρι και σήμερα πολλούς παραγωγούς και παρά την επίσημη αναγνώρισή της, δεν σχεδιάστηκε ποτέ μία σταθερή και ολοκληρωμένη λύση για την αντιμετώπισή της. Στην ελληνική επικράτεια, οι χοιροτροφικές μονάδες είναι κυρίως μικρομεσαίου μεγέθους και δεν υπάρχουν συνεργασίες μεταξύ των παραγωγών. Το αποτέλεσμα είναι ότι δεν παρατηρείται καμία προσπάθεια βελτίωσης, δεν δημιουργείται καμία προοπτική για βελτίωση μέσω της ανταγωνιστικότητας κι επομένως η ποιότητα του κρέατος και η παραγωγικότητα παραμένουν σταθερά σε χαμηλότερα επίπεδα σε σχέση με τις βόρειες χώρες της Ε.Ε. Η εγχώρια παραγωγή χοιρινού κρέατος δεν καλύπτει τις ανάγκες της ελληνικής αγοράς. Στα μέσα της δεκαετίας του 80, ο βαθμός αυτάρκειας είχε φτάσει στο 85 %, όμως το 2012 μειώθηκε στο 35 %. Η ετήσια παραγωγή χοιρινού κρέατος από τόνους το 1990, μειώθηκε σε το Παράλληλα οι ετήσιες εισαγωγές έφτασαν τους τόνους, συνολικής αξίας 427 εκατομ.. Η αυτάρκεια της χώρας αναμένεται να μειωθεί, λόγω της αυξητικής τάσης της κατανάλωσης, που βρίσκεται περίπου στους τόνους και της πτωτικής τάσης της παραγωγής, η οποία βρίσκεται περίπου στους τόνους. Γράφημα 1: Ποσοστό ετήσιας παραγωγής χοίρειου κρέατος στην Ε.Ε. (Eurostat, 2012) 22

25 2. ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑΣ 2.1. Ο σκοπός της διδακτορικής διατριβής και η δομή της Ο σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η μελέτη της αναπαραγωγής των χοίρων και η εν δυνάμει βελτίωση της παραγωγικότητας τους, αναφορικά με την βελτίωση των αναπαραγωγικών χαρακτηριστικών των χοιρομητέρων με σκοπό την αύξηση των παραγόμενων χοιριδίων και την προστασία του αναπαραγωγικού συστήματος των αρσενικών και θηλυκών χοίρων από διάφορες ασθένειες. Για τον λόγο αυτό, ο πειραματικός σχεδιασμός αποφασίστηκε να βασιστεί σε σύγχρονες γνώσεις και τεχνικές γονιδιακής τεχνολογίας. Για τις ανάγκες συγγραφής της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής θεωρήθηκε αναγκαίο να γίνει διαχωρισμός των δύο βασικών κατευθύνσεων έρευνας που πραγματοποιήθηκε. Έτσι, η δομή της διατριβής χωρίζεται σε δύο Μέρη: Το Μέρος Α αναφέρεται στη μελέτη της έκφρασης ορισμένων γονιδίων σε διάφορα αναπαραγωγικά όργανα των χοίρων, σε σειρές κυττάρων και σε έμβρυα χοίρων παραγόμενα in vitro. Στη συγκεκριμένη κατεύθυνση έλαβε χώρα ο προσδιορισμός της έκφρασης των γονιδίων της οικογένειας TLR (Toll-like receptors) καθώς επίσης και της οικογένειας των β-defensins. Το ανοσοποιητικό σύστημα διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην προστασία του αναπαραγωγικού συστήματος των χοιρομητέρων και επηρεάζει την φυσιολογική λειτουργία των οργάνων του καθώς επίσης και τη γονιμότητα. Καθώς λοιπόν τα προαναφερθέντα γονίδια παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανοσία των οργανισμών, στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκε το πρότυπο έκφρασης τους στην ωοθήκη, τον ωαγωγό, τον όρχι και την επιδιδυμίδα των χοίρων, στα κοκκώδη κύτταρα που περιβάλλουν το ωάριο καθώς επίσης και σε έμβρυα χοίρων παραγόμενα in vitro. Επίσης έγινε προσδιορισμός της επίδρασης της επώασης με λιποπολυσακχαρίτες (LPS) στα επίπεδα έκφρασης των παραπάνω γονιδίων στα κοκκώδη κύτταρα σε συνάρτηση με τον χρόνο. 23

26 Το Μέρος Β αναφέρεται στον προσδιορισμό των πολυμορφισμών ορισμένων γονιδίων που σχετίζονται με την αναπαραγωγή και την πιθανή τους σχέση με παραγωγικά χαρακτηριστικά των χοιρομητέρων που εκτρέφονται στην ελληνική επικράτεια. Για τον λόγο αυτό επιλέχθηκαν τρία γονίδια. Το γονίδιο που κωδικοποιεί τον B Factor (BF gene), το γονίδιο που κωδικοποιεί την Retinol Binding Protein 4 (RBP4 gene) και το γονίδιο που κωδικοποιεί τον Estrogen Receptor 2 (ESR2 gene) τα οποία μελετήθηκαν σε 420 χοιρομητέρες που προέρχονταν από τρεις εμπορικές χοιροτροφικές μονάδες της Ελλάδας. Τα παραγωγικά χαρακτηριστικά που συσχετίστηκαν με τους πολυμορφισμούς των παραπάνω γονιδίων αφορούν το μέγεθος της τοκετομάδας εκφρασμένο σε Συνολικό Αριθμό Χοιριδίων (TNB) και σε Αριθμό Ζωντανών Χοιριδίων (NBA), τον Αριθμό Απογαλακτισθέντων χοιριδίων (NW) και τον Αριθμό Γεννηθέντων Νεκρών (BD) ή Μουμιοποιημένων χοιριδίων (BM). 24

27 ΜΕΡΟΣ Α ΕΙΣΑΓΩΓΗ Στα θηλαστικά, η άμυνα του οργανισμού ανιχνεύει την εισβολή ενός παθογόνου μικροοργανισμού μέσω των Υποδοχέων Αναγνώρισης Δομών (PRRs, Pattern Recognition Receptors) (Bauer & Hartmann, 2008). Μία οικογένεια τέτοιων υποδοχέων, που μελετάται συστηματικά τα τελευταία χρόνια είναι οι υποδοχείς TLRs. Οι TLRs είναι πρωτεΐνες που έχουν διατηρηθεί αναλλοίωτες κατά την εξέλιξη των ειδών και παίζουν σημαντικό ρόλο ως υποδοχείς αναγνώρισης δομώn. Πρόσφατες έρευνες έχουν διαλευκάνει την λειτουργία τους κατά την μικροβιακή μόλυνση. Έχει παρατηρηθεί πως οι TLRs αναγνωρίζουν συγκεκριμένα συστατικά από μικροοργανισμούς, κι επιφέρουν αντιδράσεις του έμφυτου ανοσοποιητικού συστήματος (Bauer & Hartmann, 2008). Για να γίνουν όλα αυτά πιο κατανοητά, κρίνεται αναγκαία η συνοπτική παρουσίαση της λειτουργίας του ανοσοποιητικού συστήματος, και κυρίως του τρόπου δράσης της έμφυτης ανοσίας των θηλαστικών Η ΑΝΟΣΙΑ ΣΤΑ ΘΗΛΑΣΤΙΚΑ Το ανοσοποιητικό σύστημα των θηλαστικών χωρίζεται σε δύο τύπους ανοσίας: την έμφυτη (innate) και την επίκτητη (adaptive) ανοσία (Bauer & Hartmann, 2008). Η επίκτητη ανοσία χρησιμοποιεί μία μεγάλη ποικιλία από υποδοχείς που δημιουργήθηκαν ύστερα από ανακατανομή των γονιδίων με σκοπό να αναγνωρίζεται μία συγκεκριμένη και παράλληλα μεγάλη ποικιλία αντιγόνων. Αντίθετα, η έμφυτη ανοσία βασίζεται σε υποδοχείς που δημιουργήθηκαν από κωδικοποίηση του γωνιδιώματος, για να αναγνωρίζουν τα κοινά χαρακτηριστικά από πολλά παθογόνα (Janeway κ.α., 2001). 25

28 Στην πραγματικότητα, οι μηχανισμοί της έμφυτης ανοσίας διακρίνουν πολύ αποτελεσματικά τα κύτταρα που ανήκουν στον ξενιστή από τα κύτταρα των παθογόνων, δηλαδή τα ξένα σώματα, επιφέροντας έτσι τις κατάλληλες αντιδράσεις από την επίκτητη ανοσία (Janeway κ.α., 2001). Επομένως γίνεται αντιληπτό πως η έμφυτη ανοσία είναι αυτή που εντοπίζει αρχικά τους παθογόνους οργανισμούς που εισβάλουν στον ξενιστή, κι ένας από τους ρόλους της είναι να ενεργοποιήσει στη συνέχεια τις αντιδράσεις της επίκτητης ανοσίας. Η Επίκτητη Ανοσία Η επίκτητη ανοσία χαρακτηρίζεται από εξειδίκευση στην δράση της. Αυτό συμβαίνει διότι οι υποδοχείς της δημιουργούνται ύστερα από επιλογή από μία μεγάλη ποικιλία λεμφοκυττάρων που φέρουν συγκεκριμένους υποδοχείς, οι οποίοι δημιουργούνται από ανακατανομή διαφόρων γονιδίων μετά από κάθε μόλυνση του ξενιστή από κάποιον παθογόνο οργανισμό (Bauer & Hartmann, 2008). Αυτός ο μηχανισμός επιτρέπει στον ξενιστή να δημιουργήσει ανοσολογική μνήμη και να δράσει άμεσα σε περίπτωση νέας προσβολής του ξενιστή από το ίδιο παθογόνο. Ωστόσο, παίρνει χρόνο σε συγκεκριμένους κλώνους να επεκταθούν και να διαφοροποιηθούν σε επιδρώντα κύτταρα πριν μπορέσουν να λειτουργήσουν ως άμυνα για τον ξενιστή. Για τον λόγο αυτό, το επίκτητο ανοσοποιητικό σύστημα δεν μπορεί να επιφέρει άμεσες αντιδράσεις στα παθογόνα που εισβάλουν (Bauer & Hartmann, 2008). Η Έμφυτη Ανοσία Για να επιφέρει άμεσες αντιδράσεις όταν έρχεται αντιμέτωπος με ένα παθογόνο, ο ξενιστής είναι εξοπλισμένος με ένα σύστημα έμφυτης, μη προσαρμόσιμης άμυνας, με την οποία διαμορφώνονται προειδοποιητικά φράγματα έναντι των μολυσματικών ασθενειών. Τον ρόλο αυτό αναλαμβάνει η έμφυτη ανοσία (Bauer & Hartmann, 2008). 26

29 Παρόλο που το έμφυτο ανοσοποιητικό σύστημα περιγράφηκε αρχικά από τον Elie Metchnikoff εδώ κι έναν αιώνα, είχε για χρόνια αγνοηθεί. Ωστόσο, το 1996, ο Hoffmann και οι συνεργάτες του παρουσίασαν πως η πρωτεΐνη Toll της δροσοφίλης (Drosophila melanogaster) είναι απαραίτητη στις μύγες αυτές για να επιφέρει αποτελεσματική ανοσολογική αντίδραση έναντι του παθογόνου μικροοργανισμού Aspergillus fumigatus. Η έρευνα αυτή μας έδωσε την αφορμή να δούμε πως το έμφυτο ανοσοποιητικό σύστημα λειτουργεί ως ανιχνευτής των παθογόνων μέσα στον ξενιστή (Bauer & Hartmann, 2008). Ολόκληρος ο μηχανισμός της έμφυτης ανοσίας βασίζεται στο γεγονός πως οι στόχοι προς αναγνώριση από την άμυνα του οργανισμού είναι μοριακές δομές των μικροοργανισμών που διατηρούνται αναλλοίωτες κατά την αναπαραγωγή και εξέλιξή τους. Για τον λόγο αυτό, όπως αναφέρθηκε και στην εισαγωγή, οι υποδοχείς της έμφυτης ανοσίας ονομάζονται υποδοχείς αναγνώρισης δομών (Pattern Recognition Receptors, PRRs) (Bauer & Hartmann, 2008). Οι μοριακές δομές που εντοπίζουν οι υποδοχείς του ξενιστή πάνω στους παθογόνους οργανισμούς αρχικά ονομάζονταν μοριακές δομές σχετιζόμενες με παθογόνα (Pathogen-associated molecular patterns, PAMPs). Ωστόσο, είναι πιο κατάλληλο να τα ορίζουμε ως μοριακές δομές σχετιζόμενες με μικροοργανισμούς (Microorganisms-associated molecular patterns, MAMPs) καθώς δεν βρίσκονται μόνο σε παθογόνους αλλά και σε μη παθογόνους μικροοργανισμούς (Bauer & Hartmann, 2008). Τα MAMPs δημιουργούνται αποκλειστικά από τα μικρόβια και όχι από τους ξενιστές, έτσι είναι καλοί στόχοι για την έμφυτη ανοσία καθώς διακρίνεται εύκολα που ανήκουν (Bauer & Hartmann, 2008). Επιπλέον τα MAMPs είναι ουσιώδη για την επιβίωση των μικροβίων (Bauer & Hartmann, 2008). Αυτό σημαίνει πως πιθανότατα θα βρίσκονται πάντα στους παθογόνους μικροοργανισμούς, δίνοντας έτσι πάντοτε το ερέθισμα στους υποδοχείς 27

30 της έμφυτης ανοσίας των ξενιστών να τα εντοπίζουν και να τα διακρίνουν ως ξένα σώματα. Τέλος, τα MAMPs διατηρούν τη δομή τους σταθερή μεταξύ όμοιων μικροοργανισμών. Το γεγονός αυτό επιτρέπει στην έμφυτη ανοσία να αντιδράσει προς τους μικροοργανισμούς χωρίς να απαιτείται μεγάλη ποικιλία από PRRs (Bauer & Hartmann, 2008) ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ ΣΤΗΝ ΕΜΦΥΤΗ ΑΝΟΣΙΑ Στην επιφάνεια της κυτταρικής μεμβράνης των κυττάρων που αποτελούν το έμφυτο ανοσοποιητικό σύστημα, εκκρίνονται και εγκαθίστανται ως υποδοχείς ορισμένα μόρια πρωτεϊνών, τα οποία έχουν την ικανότητα να αναγνωρίζουν τα κοινά στοιχεία των διαφόρων παθογόνων μικροοργανισμών (Janeway κ.α., 2001). Τα γενικά χαρακτηριστικά αυτών των υποδοχέων διαφέρουν από τους υποδοχείς της επίκτητης ανοσίας. Στον Πίν. 2 εμφανίζονται οι κυριότερες διαφορές τους. Πιο συγκεκριμένα, το σύστημα της έμφυτης ανοσίας χρησιμοποιεί υποδοχείς που κωδικοποιούνται από γονίδια που κληρονομούνται αναλλοίωτα κατά την αναπαραγωγή, ενώ το σύστημα της επίκτητης ανοσίας χρησιμοποιεί υποδοχείς αντιγόνων από γονίδια που συναρμολογούνται από ξεχωριστά τμήματα γονιδίων κατά την ανάπτυξη των κυττάρων, με μία διαδικασία η οποία οδηγεί κάθε κύτταρο να εκφράζει έναν υποδοχέα εξαιρετικής εξειδίκευσης (Janeway κ.α., 2001). Επομένως, σε αντίθεση με τους υποδοχείς που ρυθμίζουν την επίκτητη ανοσία, οι υποδοχείς του έμφυτου ανοσοποιητικού συστήματος συνήθως δεν διαδίδονται ως κλώνοι διότι σε όλα τα κύτταρα του ίδιου τύπου βρίσκεται πάντοτε παρούσα μια συγκεκριμένη ομάδα υποδοχέων. Κατά συνέπεια, η στενή σύνδεση των παθογόνων με αυτούς τους υποδοχείς προκαλεί πολύ γρήγορες αντιδράσεις, οι οποίες τίθενται σε εφαρμογή χωρίς την καθυστέρηση που επιβάλλεται στην κλωνική διάδοση των κυττάρων κατά την επίκτητη ανοσία (Janeway κ.α., 2001). 28

31 Πίν. 2: Σύγκριση των χαρακτηριστικών των υποδοχέων μεταξύ της έμφυτης και της επίκτητης ανοσίας (Janeway κ.α., 2001) Χαρακτηριστικό Υποδοχέα Έμφυτη Επίκτητη Ανοσία Ανοσία Εξειδίκευση που κληρονομείται με το γονιδίωμα Ναι Όχι Εκφράζεται απ όλα τα κύτταρα ίδιου τύπου (πχ. μακροφάγα) Ναι Όχι Επιφέρει άμεση αντίδραση Ναι Όχι Αναγνωρίζει ευρύ φάσμα παθογόνων Ναι Όχι Κωδικοποιείται σε πολλαπλά τμήματα των γονιδίων Όχι Ναι Απαιτεί αναδιοργάνωση του γονιδίου Όχι Ναι Διαδίδονται με κλώνους Όχι Ναι Ικανό για αναγνώριση μεγάλης ποικιλίας μοριακών δομών Όχι Ναι Οι υποδοχείς του έμφυτου ανοσοποιητικού συστήματος ρυθμίζουν ένα πλήθος διαφορετικών λειτουργιών. Πολλοί είναι φαγοκυτταρικοί υποδοχείς, οι οποίοι διεγείρουν την απορρόφηση των παθογόνων που αναγνωρίζουν. Ορισμένοι άλλοι δρουν διαφορετικά, όπως για παράδειγμα ο υποδοχέας f-met-leu-phe, ο οποίος ενώνεται με συγκεκριμένα πεπτίδια που παράγονται από τα βακτήρια, και οδηγεί ουδετερόφιλα προς τα σημεία της μόλυνσης. Μια τρίτη λειτουργία, η οποία μπορεί να ρυθμίζεται από ορισμένους από τους φαγοκυτταρικούς υποδοχείς καθώς επίσης και από εξειδικευμένους υποδοχείς, είναι να ενεργοποιήσουν κάποια μόρια τα οποία θα συνεισφέρουν στις προκαλούμενες αντιδράσεις της έμφυτης ανοσίας και μόρια τα οποία θα επηρεάσουν την ανταπόκριση και την φύση κάθε άλλης επακόλουθης αντίδρασης της επίκτητης ανοσίας (Janeway κ.α., 2001) ΤΡΟΠΟΣ ΔΡΑΣΗΣ ΤΩΝ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ Υποδοχείς με εξειδίκευση στην επιφάνεια των παθογόνων. Όπως έχει ήδη αναφερθεί, οι επιφάνειες των μικροοργανισμών συνήθως φέρουν επαναλαμβανόμενες μοριακές δομές. Το έμφυτο ανοσοποιητικό σύστημα 29

32 αναγνωρίζει τέτοια παθογόνα μέσω των υποδοχέων, οι οποίοι προσκολλώνται σε τμήματα αυτών των δομών (Janeway κ.α., 2001). Οι υποδοχείς αυτοί, κατά τους Janeway κ.α. (2001) είναι γνωστοί ως μόρια αναγνώρισης δομών (pattern recognition molecules) ενώ κατά τους Uematsu & Akira (2008) είναι γνωστοί ως υποδοχείς αναγνώρισης δομών (pattern recognition receptors, PRRs). Η αναγνώριση του παθογόνου και η διάκρισή του ως ξένο σώμα, υπόκειται στην αναγνώριση συγκεκριμένων ουσιών, οι οποίες βρίσκονται σε συγκεκριμένες μεταξύ τους αποστάσεις και διακρίνονται ως ιδιαίτερες κατανομές. Οι ιδιαίτερες αυτές κατανομές βρίσκονται μόνο στα παθογόνα μικρόβια και όχι στα κύτταρα του ξενιστή (Janeway κ.α., 2001). Εικ. 1: Ο Υποδοχέας Mannan-binding lectin (MBL) προσκολλάται στην ιδιαίτερη κατανομή συγκεκριμένης ομάδας υδρογονανθράκων που βρίσκονται στην σωστή απόσταση μεταξύ τους (Janeway κ.α., 2001). Όπως φαίνεται στην Εικ.1, ο υποδοχέας Mannan-binding lectin (MBL), λόγω της δομής του, προσκολλάται μόνο στην ομάδα των υδρογονανθράκων που είναι αριστερά, ενώ δεν μπορεί να προσκολληθεί στην επιφάνεια του κυττάρου που βρίσκεται δεξιά, επειδή η κατανομή των υδρογονανθράκων είναι διαφορετική. 30

33 Επομένως, ο οργανισμός αναγνωρίζει ως ξένο σώμα το κύτταρο που βρίσκεται αριστερά και ο αντίστοιχος υποδοχέας του παραμένει προσκολλημένος σε αυτό. Στη συνέχεια ακολουθεί η προσκόλληση φαγοκυττάρων του ξενιστή, πάνω στο σύμπλοκο υποδοχέας-παθογόνο. Αυτό γίνεται είτε μετά από άμεση αλληλεπίδραση με τον υπάρχοντα υποδοχέα, είτε με άλλους υποδοχείς που προκαλούν την προσκόλληση των φαγοκυττάρων. Με τον τρόπο αυτό ξεκινάει η φαγοκύτωση κι επομένως η θανάτωση των συγκεκριμένων παθογόνων, καθώς επίσης επιφέρονται και άλλες κυτταρικές αντιδράσεις (Janeway κ.α., 2001). Κατά μια δεύτερη περίπτωση, πολλά φαγοκύτταρα είναι ταυτόχρονα εφοδιασμένα με διάφορους υποδοχείς που αναγνωρίζουν άμεσα τις επιφάνειες των παθογόνων. Οι ιδιότητες τους για αναγνώριση παθογόνων είναι όμοιες με αυτές των υπόλοιπων υποδοχέων. Η δομή τους εμπεριέχει πολλές προεξοχές και πολλές περιοχές αναγνώρισης συγκεκριμένων υδρογονανθράκων. Ωστόσο, επειδή βρίσκονται πάνω στην επιφάνεια των φαγοκυττάρων, μπορούν να δράσουν άμεσα ως υποδοχείς και για τα φαγοκύτταρα (Janeway κ.α., 2001). Οι υποδοχείς των φαγοκυττάρων Όπως ήδη αναφέρθηκε, τα μακροφάγα που προσκολλώνται στα παθογόνα προκαλούν φαγοκύτωση. Πέρα όμως από αυτό, τα μακροφάγα μπορούν επίσης να επιφέρουν αντιδράσεις της έμφυτης ανοσίας, και αντιδράσεις οι οποίες στη συνέχεια ενεργοποιούν την επίκτητη ανοσία. Βέβαια, τέτοιου είδους σήματα δεν φαίνεται να εκπέμπονται από όλους τους υποδοχείς των φαγοκυττάρων (Janeway κ.α., 2001). Οι πιο καλά προσδιορισμένες περιπτώσεις τέτοιου είδους προκαλούνται από τους Toll Receptors, οι οποίοι φαίνεται να λειτουργούν αποκλειστικά ως υποδοχείς εκπομπής σημάτων. Αυτοί οι υποδοχείς, παρατηρήθηκαν αρχικά στην Drosophila (Janeway κ.α., 2001). 31

34 2.5. ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑ ΓΟΝΙΔΙΩΝ TLR Η οικογένεια των TLR είναι μία σημαντική ομάδα υποδοχέων μέσω των οποίων η έμφυτη ανοσία αναγνωρίζει τους μικροοργανισμούς που εισβάλουν στο σώμα του ξενιστή. Τα TLR είναι μόρια-κλειδιά για περιορισμό των μικροβίων με την στρατολόγηση φαγοκυττάρων προς μολυσμένους ιστούς και επακόλουθη θανάτωση μικροβίων. Πρόσφατες γονιδιακές έρευνες έχουν δείξει πως τα TLR ανιχνεύουν οργανισμούς όπως βακτήρια, μύκητες, πρωτόζωα και ιούς (Bauer & Hartmann, 2008). Ο τρόπος δράσης των συγκεκριμένων υποδοχέων, φαίνεται πως δεν είναι η αναγνώριση και η άμεση προσκόλληση τους στα παθογόνα, αλλά εμπλέκονται καθαρά στην πρόκληση της κατάλληλης αντίδρασης σε διαφορετικές κλάσεις παθογόνων (Janeway κ.α., 2001). Για παράδειγμα, στην Drosophila, κάποιο μέλος της οικογένειας των υποδοχέων Toll προκαλεί την παραγωγή αντιμυκητιακών πεπτιδίων ως αντίδραση σε μυκητιακές μολύνσεις, ενώ κάποιο άλλο μέλος της οικογένειας των Toll, επιδρά στην έναρξη μιας αντιμικροβιακής αντίδρασης από τον οργανισμό (Janeway κ.α., 2001). Στα θηλαστικά, η οικογένεια των υποδοχέων Toll, αποτελείται από πρωτεΐνες που ονομάζονται Toll-like receptors (Janeway κ.α., 2001). Στη συνέχεια αναφέρονται ορισμένα από τα σημαντικότερα παραδείγματα υποδοχέων της οικογένειας Toll-like receptors. ΑΝΑΓΝΩΡΙΣΗ ΠΑΘΟΓΟΝΩΝ ΜΕ TLR Κάθε ένα από τα TLR εντοπίζει συγκεκριμένες μικροβιακές μοριακές δομές που σχετίζονται με παθογένειες και ενεργοποιεί συγκεκριμένες διόδους ενημέρωσης (Liu κ.α., 2009). Μετά από μία εκτενή βιβλιογραφική ανασκόπηση, έχει βρεθεί πως το κάθε μέλος της οικογένειας των TLR εντοπίζει και είναι σε θέση να ανταποκριθεί στην παρουσία συγκεκριμένων μικροοργανισμών ή βιοχημικών ουσιών. Πιο συγκεκριμένα: 32

35 Ο υποδοχέας TLR1 αναγνωρίζει ορισμένα βακτήρια και αναγνωρίζει τους δεσμούς Triacyl Lipopeptides (Uematsu & Akira, 2008). Ο υποδοχέας TLR2 αναγνωρίζει το οξύ lipoteichoic acid (LTA) όπως επίσης και τις λιποπρωτεΐνες και τις πεπτιδογλυκάνες (peptidoglycans) από τα Gram+ βακτήρια (Totemeyer κ.α., 2003). Πιο συγκεκριμένα, έχει αναφερθεί ότι το TLR2 αναγνωρίζει τα βακτήρια Staphylococcus aureus, Treponema maltophilum, τα πρωτόζωα Trypanosoma cruzi, Leishmania major, Leishmania donovani, Plasmodium falciprum, Toxoplasma gondii, Trypanosoma cruzi και τους μύκητες Saccharomyces cerevisiae, Candida alibicans (Uematsu & Akira, 2008). Ο υποδοχέας TLR3 σχετίζεται με την αναγνώριση του RNA διπλού έλικα (double-stranded RNA) που δημιουργείται από ιούς κατά τη διάρκεια της αντιγραφής ή της μεταγραφής. Επίσης έχει αναφερθεί ότι αναγνωρίζει το συνθετικό RNA διπλού έλικα, όπως επίσης και το οξύ polyriboinosinic polyribocytidylic acid (Poly I:C) (Barton, 2007, Matsumo κ.α., 2004). Ο υποδοχέας TLR4 ανταποκρίνεται στους λιποπολυσακχαρίτες (LPS), το βασικό συστατικό της εξωτερικής μεμβράνης των Gram- βακτηρίων. Επίσης αναγνωρίζει τα πρωτόζωα Toxoplasma gondii, Trypanosoma cruzi, Plasmodium falciprum και τους μύκητες Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans και Cryptococcus neoformans (Uematsu & Akira, 2008). Ο υποδοχέας TLR5 αναγνωρίζει και αντιμετωπίζει τα βακτήρια που φέρουν δεσμούς που ενώνουν τα μόρια μιας σφαιρικής πρωτεΐνης (flagellin) (Uematsu & Akira, 2008). Ο υποδοχέας TLR6 αναγνωρίζει τα μυκοπλάσματα, τα Gram+ βακτήρια, τον μύκητα Saccharomyces cerevisiae και το πρωτόζωο Trypanosoma cruzi (Uematsu & Akira, 2008). 33

36 Οι υποδοχείς TLR7 και TLR8 αναγνωρίζουν το RNA μονού έλικα (singlestranded RNA, ssrna) το οποίο βρίσκεται στα γενώματα των RNA ιών (Krishnan κ.α., 2007, Pichlmair & Reis e Sousa, 2007). Ο υποδοχέας TLR9 αναγνωρίζει δομές cytosine-phosphate-guanine (CpG motifs) τα οποία είναι κοινά τόσο στο DNA των βακτηρίων όσο και των ιών (Krishnan κ.α., 2007, Takeuchi & Akira, 2007). Επίσης αναγνωρίζει τα πρωτόζωα Babesia bovis, T. cruzi και T. Brucei (Uematsu & Akira, 2008). Επιπλέον, υπάρχουν πολλές αναφορές που περιγράφουν την έναρξη της ανταπόκρισης του έμφυτου ανοσοποιητικού συστήματος μέσω της διέγερσης από διάφορα TLR σε ασθενείς που είχαν μολυνθεί από ιούς (Liu κ.α., 2009). Το γονίδιο του υποδοχέα TLR4 παρουσίασε κλιμακούμενη έκφραση σε λεμφοειδή ιστό της ρινικής περιοχής κατά τη διάρκεια οξέως σταδίου αφθώδους πυρετού (Foot and Mouth Disease, FMD) σε βοοειδή (Zhang κ.α., 2006). Επίσης, το ίδιο γονίδιο παρουσίασε βελτίωση στην έκφραση του και παράλληλη ενισχυμένη παραγωγή IFN-β και IL-6 σε Β κύτταρα μολυσμένα από τον ιό της Ηπατίτιδας Γ (Machida κ.α., 2006). Οι υποδοχείς TLR7 και TLR8 φαίνεται να εμπλέκονται στην ανταπόκριση του έμφυτου ανοσοποιητικού συστήματος του ανθρώπινου parechovirus (Triantafilou κ.α., 2005, Liu κ.α., 2009). Παρακάτω περιγράφονται αναλυτικότερα η δομή και οι τρόποι δράσης ορισμένων από τα πιο σημαντικά μέλη των γονιδίων της οικογένειας των TLRs: Toll-like Receptors 1 & 6 Οι υποδοχείς TLR1 και TLR6 έχουν όμοια δομή με τον υποδοχέα TLR2 που περιγράφεται παρακάτω. Διαμορφώνουν ένα ετεροδιμερές το οποίο εμπλέκεται στη διαμόρφωση των περίπλοκων δομών που διαμορφώνονται στο λιπώδες τμήμα των λιποπρωτεϊνών (Bauer & Hartmann, 2008). 34

37 Toll-like Receptor 2 Ο υποδοχέας TLR2 αναγνωρίζει διάφορα συστατικά των βακτηρίων όπως λιποπρωτεΐνες/λιποπεπτίδια και πεπτιδογλυκάνες από Gram+ και Gram- βακτήρια, και το λιποτειχοϊκό οξύ από Gram+ βακτήρια, την ουσία phenol-soluble modulin από τον Staphylococcus aureus, και γλυκολιπίδια (glycolipids) από το Treponema maltophilum (Bauer & Hartmann, 2008). Ωστόσο, δεν είναι σε όλες τις περιπτώσεις γνωστός ο τρόπος λειτουργίας με τον οποίο επιτυγχάνει την αναγνώριση αυτή (Janeway κ.α., 2001). Ο υποδοχέας TLR2 έχει επίσης αναφερθεί πως εμπλέκεται στην αναγνώριση των λιποπολισακχαριτών από μη-εντεροβακτήρια, συμπεριλαμβανομένων των Leptospira interrogans, Porphyromonas gingivalis και Helicobacter pylori. Αυτοί είναι μη τυπικοί λιποπολυσακχαρίτες των οποίων η δομή είναι διαφορετική από εκείνη των συνηθισμένων λιποπολισακχαριτών που ανήκουν σε Gram- βακτήρια ((Bauer & Hartmann, 2008). Toll-like Receptor 4 Ο υποδοχέας TLR4 είναι ουσιώδης για την αναγνώριση των λιποπολυσακχαριτών (lipopolysaccharides, LPS), οι οποίοι αποτελούνται από ένα λιπίδιο Α (ενδοτοξίνη), έναν κύριο ολιγοσακχαρίτη κι ένα αντιγόνο O-antigen. Ο υποδοχέας TLR4 αναγνωρίζει το λιπίδιο A των λιποπολυσακχαριτών (Bauer & Hartmann, 2008). Οι λιποπολυσακχαρίτες των βακτηρίων είναι ένα συστατικό του κυτταρικού τοιχώματος των Gram- βακτηρίων, το οποίο είναι γνωστό εδώ και καιρό για την ικανότητά του να επιφέρει στον ξενιστή μια σημαντική αντίδραση γνωστή ως σηπτικό σοκ (Janeway κ.α., 2001). 35

38 Εικ. 2: Πορεία των διαδοχικών αντιδράσεων που συμβαίνουν κατά την παρουσία LPS στον ξενιστή (Janeway κ.α., 2001). Για την αναγνώριση των λιποπολυσακχαριτών είναι απαραίτητη η ύπαρξη υποδοχέων TLR4, καθώς επίσης και της πρωτεΐνης CD14 και άλλων ουσιών σε διάφορα κύτταρα όπως μακροφάγα και δενδριτικά κύτταρα (Bauer & Hartmann, 2008). Οι λιποπολυσακχαρίτες σχετίζονται με μία βοηθητική πρωτεΐνη, την LPSbinding protein (LPB) που βρίσκεται στον ορό του αίματος, η οποία μετατρέπει τα ολιγομερή κολλοειδή σωματίδια των λιποπολυσακχαριτών σε μονομερή για να παραληφθούν από την πρωτεΐνη CD14, η οποία είναι εξαιρετικής έλξης πρωτεΐνη της μεμβράνης των κυττάρων. Η CD14 συγκεντρώνει τους λιποπολισακχαρίτες για να ενωθούν με το σύμπλεγμα των TLR4-MD2 (Bauer & Hartmann, 2008). 36

39 Ίσως για τον λόγο αυτό, από τις καλύτερα χαρακτηρισμένες πρωτεΐνες στην έμφυτη ανοσία είναι η πρωτεΐνη του πλάσματος LBP και η πρωτεΐνη-υποδοχέας CD14, η οποία ενώνεται στον δεσμό της LBP με τον λιποπολυσακχαρίτη. Τόσο η LBP όσο και η CD14 έχουν μία επαναλαμβανόμενη δομή πλούσια σε λευκίνη (Janeway κ.α., 2001). Παρόλο που οι λεπτομέρειες της δομικής συνένωσης δεν έχουν πλήρως διερευνηθεί, το σύμπλεγμα LPS:LBP ενώνεται με την πρωτεΐνη CD14, η οποία είτε βρίσκεται ελεύθερη στο πλάσμα, είτε συγκρατείται στην επιφάνεια του κυττάρου από ένα άκρο phosphoinositol glycolipid. Αυτή η συνένωση, επιφέρει μία αντίδραση του κυττάρου, η οποία έχει πρόσφατα μελετηθεί και αναλύεται παρακάτω (Janeway κ.α. 2001). Όπως φαίνεται και στην Εικ.2, αρχικά ενώνονται οι λιποπολυσακχαρίτες των παθογόνων με την πρωτεΐνη LBP. Στην συνέχεια, το σύμπλοκο αυτό ενώνεται με την πρωτεΐνη CD14 και συγκρατείται πάνω στην επιφάνεια του κυττάρου του ξενιστή. Ακολούθως, ο υποδοχέας TLR4 που βρίσκεται επίσης στην επιφάνεια του κυττάρου του ξενιστή πλησιάζει το σύμπλοκο CD14:LBP:LPS και αντιδρά με αυτό. Το αποτέλεσμα της αντίδρασης είναι η ενεργοποίηση ενός μεταγραφικού παράγοντα, του NFκB, μέσα στον πυρήνα του κυττάρου, ο οποίος με τη σειρά του ενεργοποιεί γονίδια που εμπλέκονται στην άμυνα του οργανισμού ενάντια στην μόλυνση. Η πορεία της εκπομπής σήματος από τον υποδοχέα Toll στην Drosophila, επιφέρει την παραγωγή διαφόρων αντιμικροβιακών πεπτιδίων, τα οποία μπορούν να συνεισφέρουν κατά της μόλυνσης (Janeway κ.α., 2001). Στους ανθρώπους και σε άλλα σπονδυλωτά που εξετάστηκαν, η ενεργοποίηση του παράγοντα NFκΒ από τον υποδοχέα Toll οδηγεί στην παραγωγή διαφόρων σημαντικών ρυθμιστών της έμφυτης ανοσίας, όπως οι κυτοκίνες και οι χεμοκίνες (Janeway κ.α., 2001). Την ίδια στιγμή, η έναρξη των αντιδράσεων της επίκτητης ανοσίας προκαλείται με τη βοήθεια δύο πρωτεϊνών που ονομάζονται CD80 και CD86, οι 37

40 οποίες βρίσκονται στην επιφάνεια της κυτταρικής μεμβράνης και εκφράζονται τόσο από τα μακροφάγα όσο και από τα δενδριτικά κύτταρα των ιστών σε αντίδραση της εκπομπής σήματος από το TLR4 για την παρουσία του LPS (Janeway κ.α., 2001). Τα μόρια αυτά, μαζί με τα αντιγόνα των μικροβίων παρουσία των μακροφάγων και των δενδριτικών κυττάρων είναι υπεύθυνα για την ενεργοποίηση των CD4 T κύτταρων, τα οποία είναι απαραίτητα για την έναρξη των περισσοτέρων αντιδράσεων της επίκτητης ανοσίας. Για να αντιμετωπίσει ένα CD4 T κύτταρο, το δενδριτικό κύτταρο πρέπει να μεταβεί σε έναν κοντινό λεμφαδένα μέσο του οποίου περνούν T κύτταρα μέσω του κυκλοφορικού, και αυτή η μετάβαση διεγείρεται από κυτοκίνες όπως η TNF-α, η οποία επίσης επηρεάζεται από τον υποδοχέα TLR4. Για τον λόγο αυτό φαίνεται ξεκάθαρα, πως η ενεργοποίηση της επίκτητης ανοσίας, βασίζεται σε μόρια που προκύπτουν ως αποτέλεσμα της δράσης της έμφυτης ανοσίας (Janeway κ.α., 2001). Toll-like Receptor 5 O υποδοχέας TLR5 είναι υπεύθυνος για την αναγνώριση της πρωτεΐνης με την ονομασία flagellin, μιας δομικής πρωτεΐνης των βακτηρίων, η οποία διαμορφώνει το μεγαλύτερο μέρος του μαστιγίου. Η πρωτεΐνη αυτή συνεισφέρει στην μολυσματικότητα των βακτηρίων καθώς προσκολλάται στις επιφάνειες των κυττάρων του ξενιστή και στη συνέχεια εισβάλει στο εσωτερικό του (Bauer & Hartmann, 2008). Toll-like Receptor 9 Ο υποδοχέας TLR9, μετά από πειράματα που έγιναν σε ποντίκια, φαίνεται πως ελέγχει την αναγνώριση της δομής CpG στο DNA των βακτηρίων. Το DNA των βακτηρίων είναι ένα ισχυρό διεγερτικό της ανοσολογικής αντίδρασης του ξενιστή. Η διέγερση της ανοσίας ρυθμίζεται από τις μη μεθυλιωμένες (unmethylated) δομές CpG. Στα σπονδυλωτά ζώα, η συχνότητα των δινουκλεοτιδίων CpG μειώνεται εξαιρετικά και τα νουκλεοτίδια της κυτοσίνης από τα δινουκλεοτίδια CpG είναι 38

41 εξαιρετικά μεθυλιωμένα, το οποίο οδηγεί στην ακύρωση της ανοσοδιεγερτικής δραστηριότητας (Bauer & Hartmann, 2008). Συμπερασματικά Ο τρόπος λειτουργίας των υποδοχέων της οικογένειας TLR έχει μελετηθεί εκτενώς κι έχει διευκρινιστεί ιδιαίτερα τις τελευταίες δεκαετίες. Οι υποδοχείς TLR εμπλέκονται σημαντικά στην προστασία των ξενιστών ενάντια στις μολύνσεις από βακτήρια, καθώς επίσης και στις μολύνσεις από μύκητες, πρωτόζωα και ιούς (Bauer & Hartmann, 2008). Ορισμένα από τα μόρια που αναγνωρίζονται από υποδοχείς LTR (TLR ligands), και ειδικότερα τα νουκλεϊκά οξέα, συντίθενται in vitro και έχουν ήδη χρησιμοποιηθεί για αγωγές κατά μολύνσεων από ιούς αλλά και αλλεργικές ασθένειες (Bauer & Hartmann, 2008). Επομένως, στο μέλλον αναμένεται μια πιο συστηματική μελέτη των υποδοχέων TLR με σκοπό την αναγνώριση των εξειδικευμένων στόχων καθενός από αυτά και την διευκρίνιση του ρόλου τους σε όλα τα όργανα του κάθε είδους ζώων, καθώς η γνώση αυτών των πληροφοριών θα είναι απαραίτητη για τη δημιουργία νέων, πιο αποτελεσματικών-στοχευμένων και λιγότερο επικίνδυνων φαρμάκων, από τις φαρμακοβιομηχανίες. 39

42 2.6. ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΑ ΠΕΠΤΙΔΙΑ Τα αμυντικά πεπτίδια ξενιστών (Host Defense Peptides, HDPs) είναι σημαντικά στοιχεία της έμφυτης (φυσικής) ανοσίας, τα οποία υπάρχουν τόσο στο φυτικό, όσο και στο ζωικό βασίλειο. Σε πολλά ζώα, κυρίως στα ασπόνδυλα, τα πεπτίδια αυτά παρέχουν μία πρωταρχική προστασία του ανοσοποιητικού συστήματος και συνήθως ονομάζονται αντιμικροβιακά πεπτίδια (Antimicrobial Peptides, AMPs). Αντίθετα, στα ανώτερα σπονδυλωτά ζώα, επιπλέον της ισχυρής αντιμικροβιακής δραστηριότητας, πολλά από αυτά τα πεπτίδια έχουν ανοσσορυθμιστική δραστηριότητα και κατά συνέπεια ονομάζονται αμυντικά πεπτίδια ξενιστών (Sang & Blecha, 2009). Αρχικά, η σημασία των αντιμικροβιακών πεπτιδίων στην ανοσία των θηλαστικών είχε υποτιμηθεί σε σχέση με τον ρόλο τους στην ανοσία άλλων, λιγότερο περίπλοκων συστημάτων, όπως αυτά των φυτών και των ασπόνδυλων ζώων. Παρόλα αυτά, καθώς η σημασία των αμυντικών συστημάτων της έμφυτης ανοσίας των θηλαστικών καθιερώθηκε, εδραιώθηκε στη συνέχεια και ο ουσιώδης ρόλος των αντιμικροβιακών πεπτιδίων στο ανοσοποιητικό σύστημα των θηλαστικών. Σήμερα, οι επιστήμονες γνωρίζουν πως η σημασία των αντιμικροβιακών πεπτιδίων στα θηλαστικά ίσως να βασίζεται στους πολλαπλούς τους ρόλους, και για να γίνει αυτό πιο κατανοητό, απαιτείται η πλήρης κατανόηση αυτών των εξαιρετικής ανομοιομορφίας μορίων που αναφέρονται ως αντιμικροβιακά πεπτίδια (Lai & Gallo, 2009). Μέχρι σήμερα, έχουν ταυτοποιηθεί ή εντοπιστεί περισσότερα από 1200 αντιμικροβιακά πεπτίδια από διαφορετικούς ξενιστές. Ορισμένα από αυτά βρίσκονται στην λίστα της ιστοσελίδας της Βάσης Δεδομένων των Αντιμικροβιακών Πεπτιδίων (Antimicrobial Peptide Database, APD) η ο ο πα ί είναι η εξής: Τα περισσότερα από αυτά τα πεπτίδια διατηρούν συγκεκριμένα κοινά χαρακτηριστικά, όπως το μικρό τους μέγεθος (12-50 αμινοξέα), και το θετικό τους φορτίο. Βασιζόμενοι στην σύνθεση των αμινοξέων τους, το μέγεθός τους και της δομής τους, τα αντιμικροβιακά πεπτίδια μπορούν να χωριστούν σε διάφορες κατηγορίες όπως: α) πεπτίδια με δομή α-έλικα, β) πεπτίδια με δομή β- 40

43 πτυχωτής επιφάνειας, η οποία σταθεροποιείται με γέφυρες δισουλφιδίων (disulfide bridges) ή γ) πεπτίδια με εκτεταμένες ή κυκλικές δομές (Lai & Gallo, 2009). Η έκφραση των αντιμικροβιακών πεπτιδίων διαφέρει ανάλογα με τον τύπο του κυττάρου ή του ιστού στον οποίο βρίσκονται, όμως στις περισσότερες περιπτώσεις τα αντιμικροβιακά πεπτίδια εκφράζονται παράλληλα ως ομάδες που δρουν ταυτόχρονα. Για παράδειγμα, στο δέρμα εμφανίζονται παράλληλα περισσότερα από 20 αντιμικροβιακά πεπτίδια και πρωτεΐνες, συμπεριλαμβανομένων των cathelicidins, των β-defensins και άλλων (Lai & Gallo, 2009). Οι πληροφορίες που αφορούν την ανοσολογική λειτουργία των περισσοτέρων από αυτά τα πεπτίδια είναι σχετικά λίγες, και είναι σχεδόν απίθανο οι ανοσορυθμιστικές δράσεις των αντιμικροβιακών πεπτιδίων των θηλαστικών να είναι επίσης ένα συστατικό της βιολογίας των αμέτρητων αντιμικροβιακών πεπτιδίων που παράγονται από τα περισσότερα προκαρυοτικά και ασπόνδυλα ζώα. Για τον λόγο αυτό, το πρώτο σημαντικό θέμα που προσφέρεται προς συζήτηση σχετικά με τα αντιμικροβιακά πεπτίδια είναι ότι μοιάζουν μεταξύ τους μόνο στην ικανότητά τους να σκοτώνουν άμεσα ή να εμποδίζουν την ανάπτυξη των μικροβίων. Επειδή η λειτουργία αυτή προσφέρεται συνήθως μέσω της ικανότητάς τους να επηρεάζουν τη δομή της λιπώδους μεμβράνης, τα αντιμικροβιακά πεπτίδια έχουν ορισμένες μακρινές δομικές ομοιότητες. Ωστόσο, η ανοσολογική επίδραση των αντιμικροβιακών πεπτιδίων είναι πιθανό να είναι εξαιρετικά συγκεκριμένη και να διακρίνεται μεταξύ συγκεκριμένων οικογενειών αντιμικροβιακών πεπτιδίων (Lai & Gallo, 2009). Τα αντιμικροβιακά πεπτίδια αποτελούν μία ετερογενή ομάδα πεπτιδίων αν ληφθεί υπόψη η πρωτοταγής και δευτεροταγής δομή τους, το αντιμικροβιακό τους δυναμικό, οι επιδράσεις τους στα κύτταρα των ξενιστών και η ρύθμισή της έκφρασής τους (Auvynet & Rosenstein, 2009). Τα περισσότερα αντιμικροβιακά πεπτίδια είναι μικρά (12 50 αμινοξέα), έχουν θετικό φορτίο και ειδική δομή η οποία τα καθιστά ικανά να αλληλεπιδρούν με βακτηριακές μεμβράνες. Τα κατιονικά πεπτίδια χωρίζονται σε διάφορες 41

44 υποοικογένειες, εκ των οποίων στα θηλαστικά έχουν ερευνηθεί εκτενέστερα οι cathelicidins και οι defensins (Auvynet & Rosenstein, 2009). Προς το παρόν, η επιστήμη έχει επικεντρώσει το ενδιαφέρον της στα πιο πρόσφατα ευρήματα που αφορούν στην ρύθμιση της διαδικασίας της αντιγραφής των cathelicidins και των defensins, και τους μηχανισμούς μέσω των οποίων ρυθμίζουν διάφορες πλευρές του ανοσοποιητικού συστήματος και των ασθενειών (Auvynet & Rosenstein, 2009). Πέρα από τα cathelicidins και τα defensins, υπάρχουν και άλλα αμυντικά πεπτίδια ξενιστών, όπως το hepcidin και το LEAP-2, οι πρωτεΐνες αναγνώρισης πεπτιδογλυκανών (Peptidoglycan recognition proteins, PGRP) και η NK-Lysin (Sang & Blecha, 2009). Είναι φανερό πως τα αμυντικά πεπτίδια ξενιστών διαμορφώνουν μία ευρεία γκάμα από μικρά, κυρίως κατιονικά πεπτίδια που έχουν βρεθεί σε διάφορα είδη. Τα ώριμα πεπτίδια γενικά αποτελούνται από αμινοξέα. Λειτουργικά, η αντιμικροβιακή και ανοσορυθμιστική δραστηριότητα των αμυντικών πεπτιδίων ξενιστών συχνά αποδίδεται σε μεμβρανολυτικούς μηχανισμούς και μηχανισμούς προσκόλλησης αντίστοιχα (Sang & Blecha, 2009). Τα πεπτίδια DEFENSINS Τα πεπτίδια defensins είναι κατιονικά πεπτίδια που περιέχουν 6 κυστεΐνες που διαμορφώνουν 3 εσωμοριακούς δεσμούς δισουλφιδίων. Με βάση την θέση των 6 κυστεϊνών και την αλληλουχία τους, τα μέλη αυτής της οικογένειας πεπτιδίων έχουν κατηγοριοποιηθεί σε α-defensins, β-defensins και θ-defensins (Auvynet & Rosenstein, 2009). Τα defensins εκφράζονται ευρέως και στα θηλαστικά έχουν βρεθεί πάνω από 100. Με βάση το κύτταρο, θα ασκήσουν την λειτουργία τους είτε στο εσωκυτταρικό είτε στο εξωκυτταρικό τμήμα. Επιδεικνύουν βακτηριοκτόνα, μυκητοκτόνα και αντιμικροβιακή δράση. Τα defensins είτε αποθηκεύονται στα κοκκίδια των 42

45 ουδετερόφιλων ή στα κύτταρα Paneth, είτε εκκρίνονται από μονοκύτταρα, μακροφάγα και επιθηλιακά κύτταρα. Όταν απελευθερώνονται στο εξωκυτταρικό περιβάλλον, ασκούν την αντιμικροβιακή τους δραστηριότητα άμεσα, επιτιθέμενα στην μικροβιακή μεμβράνη και στο ενδοκυτταρικό τμήμα. Επιπλέον, τα defensins είναι μεσολαβητές στην ενδοεπικοινωνία μεταξύ του έμφυτου και του επίκτητου ανοσοποιητικού συστήματος (Auvynet & Rosenstein, 2009). Η οικογένεια των β-defensins των χοίρων Παρά την πιθανότητα ύπαρξης πολλών περισσοτέρων μελών, το προφίλ των χοίρειων defensins είναι σχετικά απλό σε σύγκριση με τα χοίρεια cathelicidins. Στους χοίρους, μόνο η υποομάδα των β-defensins πιστεύεται πως είναι η πιο συντηρημένη στην τριτοταγή δομή τους (Sang & Blecha, 2009). Το πρώτο pbd (pbd1) είχε ανακαλυφθεί χρησιμοποιώντας εκφυλισμένους εκκινητές για να ενισχύσει cdna από ιστούς της γλώσσας (Sang & Blecha, 2009). Σχετικά με την δομή των γονιδίων, τα χοίρεια pbds, όπως φαίνεται από το pbd1, αποτελούνται γενικώς από δύο μικρά εξόνια, στα οποία το εξόνιο 1 κωδικοποιεί περιοχές που συμπεριλαμβάνουν σηματοδοτικά πεπτίδια και το εξόνιο 2 αρχικά κωδικοποιεί τα ώριμα πεπτίδια. Ωστόσο, τα εσώνια διαφέρουν μεταξύ των γονιδίων pbds. Για παράδειγμα, τα pbd1, pbd2, pbd3 και pbd4 έχουν 1,5 8,0 0,9 και 4,2 kb εσώνια, αντίστοιχα (Sang & Blecha, 2009). Τα πεπτίδια LEAPs Το γονίδιο hepcidin, που αρχικά ονομαζόταν LEAP-1 και το γονίδιο LEAP-2 αντιπροσωπεύουν μία άλλη υποομάδα από πλούσια σε κυστεΐνη αμυντικά πεπτίδια ξενιστών (Sang & Blecha, 2009) και εκφράζονται κυρίως στο συκώτι (Sang κ.α., 2006). Και τα δύο αυτά αντιμικροβιακά πεπτίδια είναι πλούσια σε κυστεΐνη και σχηματίζουν δισουλφιδικό δεσμό και η μικροβιοκτόνα ικανότητά τους έχει επιβεβαιωθεί με απομονωμένα ή συνθετικά, ώριμα πεπτίδια (Sang κ.α., 2006). 43

46 Το γονίδιο hepcidin είχε απομονωθεί με υπερδιήθηση σε ούρα ανθρώπου και πλάσμα και ακολούθως έχει ταυτοποιηθεί σε ποντίκια, αρουραίους, σκύλους και διάφορα είδη ψαριών. Επιπλέον της αντιμικροβιακής του δράσης, το γονίδιο hepcidin είναι μία ορμόνη η οποία ρυθμίζει την πρόσληψη σιδήρου και στον άνθρωπο η έλλειψη της hepcidin, είναι υπεύθυνη για την κληρονομική αιμοχρωμάτωση (Sang & Blecha, 2009). Ο σίδηρος είναι ένα ουσιώδες ιχνοστοιχείο για τον ξενιστή αλλά και τον παθογόνο οργανισμό και παίζει έναν απαραίτητο ρόλο σε διάφορες φυσιολογικές διαδικασίες. Κατά την μόλυνση, η ζήτηση σε σίδηρο είναι ουσιώδης στην βακτηριακή ανάπτυξη και την παθογένεια. Επιπλέον, ο σίδηρος του ξενιστή μπορεί ν αυξήσει τον κίνδυνο ασθένειας λειτουργώντας ως ένα διαθέσιμο ουσιώδες θρεπτικό συστατικό για τους εισβολείς όπως βακτήρια, μύκητες και πρωτόζωα. Η βακτηριακή μολυσματικότητα έχει βελτιωθεί πολύ από τον ελεύθερο, διαθέσιμο σίδηρο, για τον λόγο αυτό, τα επιτυχημένα παθογόνα έχουν αναπτύξει μία ή περισσότερες μεθόδους για να λαμβάνουν σίδηρο από τους ξενιστές. Η αντιγραφή των ιών είχε συσχετιστεί με τον ενισχυμένο κυτταρικό μεταβολισμό και αυτή η διαδικασία απαιτούσε επίσης σίδηρο από τον ξενιστή, σημαντικό για την αποτελεσματική διασπορά στον κυτταρικό ξενιστή του. Είχε προηγουμένως παρατηρηθεί ότι μια μείωση του σιδήρου στο πλάσμα ή τον ορό κατά τη διάρκεια της μόλυνσης ίσως να ήταν τμήμα ενός συντονισμένου μηχανισμού άμυνας του ξενιστή (Sang & Blecha, 2009). Ομοίως με το γονίδιο Hepcidin, το LEAP-2 είχε απομονωθεί με υπερδιήθηση σε ανθρώπινο αίμα κι επίσης έχει βρεθεί σε μη ανθρώπινα πρώτιστα, ποντίκια, βοοειδή, χοίρους και πτηνά (Sang κ.α., 2006). 44

47 ΜΟΡΦΗ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΚΑΙ ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΩΝ BDs Η μορφή έκφρασης των αντιμικροβιακών πεπτιδίων δεν είναι όμοια μεταξύ των ειδών, και μεταξύ ενός είδους ρυθμίζεται από την καταγωγή των κυττάρων, το στάδιο διαφοροποίησης/ενεργοποίησης του κυττάρου και τον τύπο του ιστού (Yang κ.α., 2004). Ορισμένα αντιμικροβιακά πεπτίδια συνθέτονται σε απουσία μόλυνσης ή φλεγμονής, ενώ άλλα ρυθμίζονται σε ανταπόκριση μιας ενδογενούς ή λόγω μόλυνσης ειδοποίησης, υπαινίσσοντας διαφορετικές λειτουργίες γι αυτά τα πεπτίδια κάτω από διαφορετικά φυσιολογικά περιβάλλοντα. Επιπλέον, η διαφορετική πρωτεολυτική επεξεργασία μπορεί να ρυθμίζει την δραστηριότητά τους, και κατ επέκταση, την ικανότητά τους να ρυθμίζουν την ανοσία (Auvynet & Rosenstein, 2009). Συμπερασματικά, ο συνδυασμός των αμυντικών πεπτιδίων που παράγεται από διαφορετικούς τύπους κυττάρων σε ένα συγκεκριμένο ιστό μπορεί να μετατρέψει θετικά ή αρνητικά τις κυτταρικές λειτουργίες, προβάλλοντας βακτηριακές διαιρέσεις στο έπακρο, και όχι απαραίτητα μέσω της άμεσης θανάτωσης, αλλά μέσω τη εγκαθίδρυσης κυκλωμάτων κυτταρικής ανοσίας (Auvynet & Rosenstein, 2009). ΑΝΟΣΟΡΥΘΜΙΣΤΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΤΩΝ ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΩΝ ΠΕΠΤΙΔΙΩΝ Μέσω της διάρρηξης των βακτηριακών μεμβρανών, τα αντιμικροβιακά πεπτίδια συμμετέχουν ως η άμεση προσπάθεια του έμφυτου ανοσοποιητικού συστήματος. Πολλαπλά αντιμικροβιακά πεπτίδια βρίσκονται ταυτόχρονα στο ίδιο σημείο και πιστεύεται ότι δουλεύουν σε συνεργασία, έτσι ώστε να αντιμετωπίσουν τη μόλυνση αποτελεσματικά (Auvynet & Rosenstein, 2009). Συχνά συζητείται πως η ελάχιστη ανασταλτική συγκέντρωση των αντιμικροβιακών πεπτιδίων που απαιτείται για να αντιμετωπίσει αποτελεσματικά την μικροβιακή μόλυνση σπάνια βρίσκεται σε in vivo συνθήκες, παρά το γεγονός πως η 45

48 γονιδιακή έκφραση των αντιμικροβιακών πεπτιδίων είναι περισσότερο υπό τον έλεγχο των μεταγραφικών παραγόντων που σχετίζονται με το έμφυτο ανοσοποιητικό σύστημα (Auvynet & Rosenstein, 2009). Ωστόσο, επιπλέον στη συγκέντρωση αυτών των φυσικών αντιβιοτικών, η αντοχή της μικροβιακής μεμβράνης (πχ. ο στόχος των αντιμικροβιακών πεπτιδίων) σε ένα δεδομένο ιονικό περιβάλλον, είναι μέρος της αποτελεσματικότητας της αντιμικροβιακής δραστηριότητας. Πιο συγκεκριμένα, έχει πρόσφατα αποδειχτεί πως ο S. aureus και η Escherichia coli που αναπτύσσονται σε διαλύματα που περιέχουν άνθρακα, είναι πιο ευάλωτα στις φυσιολογικές συγκεντρώσεις των αντιμικροβιακών πεπτιδίων, ως αποτέλεσμα των αλλαγών στη βακτηριακή έκφραση γονιδίων που μεταφράζουν σε αλλαγές στο πάχος της κυτταρικής μεμβράνης και την έκφραση διαφόρων γονιδίων που σχετίζονται με την μολυσματικότητα (Ayvynet & Rosenstein, 2009). Για τον λόγο αυτό, η ισορροπία στις ιονικές συνθήκες του ξενιστή είναι ένα σημαντικό στοιχείο που πρέπει να ληφθεί υπόψη όταν εξετάζεται η αντιμικροβιακή δραστηριότητα ενός δεδομένου πεπτιδίου (Auvynet & Rosenstein, 2009). Επίσης, θα έπρεπε να ληφθεί υπόψη ότι η μικροβιοκτόνα δράση των περισσότερων αντιμικροβιακών πεπτιδίων είναι πολύ αποτελεσματική στο ενδοκυτταρικό τμήμα, στα φαγοκυτταρικά κενοτόπια και πάνω στη εξωτερική επιφάνεια της επιδερμίδας και της, τρία τμήματα που παρουσιάζουν χαμηλή συγκέντρωση αλάτων (Auvynet & Rosenstein, 2009). Τα κύτταρα της έμφυτης ανοσίας, όπως τα ουδετερόφιλα, τα κύτταρα του συνδετικού ιστού και τα ιοσινόφιλα μπορούν να σχηματίσουν εξωκυτταρικές παγίδες οι οποίες αποτελούνται από δομές χρωματίνης-dna, πάνω στις οποίες προσκολλούνται τα αντιμικροβιακά πεπτίδια και τα ένζυμα, δημιουργώντας τελικά ένα δίκτυ στο οποίο τα μικρόβια παγιδεύονται και σκοτώνονται (Wartha κ.α., 2007). Ένας μηχανισμός που βασίζεται στην οξιδάση του NAPDH ξεκινά μία αλληλουχία η οποία οδηγεί στην αποσύνθεση του πυρήνα και της κυτταρικής 46

49 μεμβράνης (von Kockritz-blickwede & Nizet, 2009), οδηγώντας σε κυτταρικό θάνατο και σε σχηματισμό των εξωκυτταρικών παγίδων. Επίσης, αυξάνοντας την τοπική συγκέντρωση των αντιμικροβιακών πεπτιδίων, και θανατώνοντας αποτελεσματικά τα μικρόβια, είναι πιθανό να σκεφθεί κανείς πως οι εξωκυτταρικές παγίδες περιορίζουν την δράση των μικροοργανισμών, μειώνοντας με τον τρόπο αυτό την καταστροφή των ιστών (Auvynet & Rosenstein, 2009). Πέρα από αποτελεσματική αντιμικροβιακή δράση, τα αντιμικροβιακά πεπτίδια ρυθμίζουν την ανοσία. Φαίνεται πως συμμετέχουν σε κάθε πλευρά της, ενισχύοντας την αντίδραση την ανοσία για αποφυγή της μόλυνσης, κι επίσης εμποδίζοντας άλλες προ-μολυσματικές αντιδράσεις ώστε ν αποφευχθεί ανεξέλεγκτη μόλυνση. Επιπλέον, ορισμένα αντιμικροβιακά πεπτίδια συνεργάζονται με τις κυτοκίνες και τροποποιούν την ανοσορυθμιστική τους δραστηριότητα (Auvynet & Rosenstein, 2009). Χημειοθεραπευτική δράση Επιπλέον της άμεσης μικροβιοκτόνας δράσης τους, τα αντιμικροβιακά πεπτίδια παρουσιάζουν χημειοθεραπευτική δράση, κυρίως σε λευκοκύτταρα και άλλα μη ανοσολογικά κύτταρα σε μικρές συγκεντρώσεις (Ayvynet & Rosentsein, 2009). Αντιμικροβιακή δράση Τα αμυντικά πεπτίδια ξενιστών των χοίρων, συμπεριλαμβανομένων των PR- 39, PFs, PMAPs, PG-1, pbd2 και NK-lysin, έχει αναφερθεί πως θανατώνουν διάφορους μικροοργανισμούς (Sang & Blecha, 2009). Πολυάριθμα είδη από Gram+ και Gram βακτήρια έχουν εκτενώς δοκιμαστεί ενάντια σε Cathelicidins των χοίρων. Αυτό πιθανώς να αντικατοπτρίζει την προγενέστερη ιστορία των cathelicidins των χοίρων έναντι άλλων αμυντικών πεπτιδίων των χοίρων. Τα PR-39 και PR-26 έδειξαν σημαντική αποτελεσματικότητα έναντι Gram- και Gram+ βακτηρίων με ελάχιστες ανασταλτικές συγκεντρώσεις κάτω από 5 mm (~20 μg/ml). Ωστόσο, υπάρχουν εξαιρέσεις μεταξύ και των δύο ομάδων 47

50 των βακτηρίων. Για παράδειγμα, τα Gram- Pseudomonas aeruginosa και Proteus vulgaris και τα S. aureus και Bacillus subtilis, μπορούσαν να αντέξουν τo PR-39 σε ελάχιστη ανασταλτική συγκέντρωση μεγαλύτερη των mm (~ ng/ml). Επιπλέον, η δραστηριότητα έναντι διαφορετικών καλλιεργειών του ίδιου είδους βακτηρίων ποικίλει επίσης πχ. η MIC έναντι της Salmonella typhimurium ή του Bacillus megaterium κυμαίνεται μεταξύ 0,125 ως 2,1 mm και 0,3 ως 8 mm αντίστοιχα. Ομοίως, τα PFs είναι περισσότερο αποτελεσματικά έναντι των Gramβακτηρίων όπως η E. Coli και λιγότερο αποτελεσματικά έναντι των Gram+ (Sang & Blecha, 2009). Τα PMAPs δείχνουν όμοια δραστηριότητα έναντι των Gram+ και Gramβακτηρίων με MICs γενικώς γύρω στα 5 mm, ωστόσο, ορισμένα βακτήρια όπως ο Proteus mirabilis και ο S. aureus αντιστέκονται στα PMAP-36 ή PMAP-37 σε συγκεντρώσεις μεγαλύτερες από 32 mm. Τα PMAPs είναι επίσης αποτελεσματικά έναντι μυκήτων και νηματωδών, ωστόσο, σε MICs περίπου 5 10 φορές υψηλότερες από αυτές για τα γενικά είδη βακτηρίων (Sang & Blecha, 2009). Συνεργιστικές και προσθετικές αντιμικροβιακές δραστηριότητες Σημαντική συνεργιστική δράση έχει παρατηρηθεί όταν εκτιμάται η επίδραση του pbd1 με τα cathelicidins, το PR-39 (PR-26) ή το PG-3. Όταν ελέγχθηκαν μόνα τους, το pbd1 σε 30 mg/ml ή τα cathelicidins σε 2,5 5 mg/ml ήταν ανενεργά ή λιγότερα ενεργά έναντι στην E. Coli και την S. typhimurium. Ωστόσο, ο συνδυασμός των pbd1 με κάθε ένα από τα cathelicidins αύξησε την βακτηριοκτόνα (bactericidal) δράση (Sang & Blecha, 2009). Συμπερασματικά Τα HDPs των χοίρων, που αντιπροσωπεύονται κυρίως από τα 11 cathelicidins και τα 13 β-defensins, αποτελούν μία ομάδα σημαντικών ενεργοποιητών στο ανοσοποιητικό σύστημα των χοίρων. Οι προσπάθειες στην έρευνα θα συνεχιστούν προς την κατεύθυνση της ανάπτυξης αντιμικροβιακών ουσιών ευρέως φάσματος που βασίζονται στα φυσικά HDPs (Sang & Blecha, 2009). 48

51 Ωστόσο, ο μοριακός χειρισμός αυτών των ενεργοποιητών του φυσικού ανοσοποιητικού συστήματος των χοίρων προς την κατεύθυνση της διέγερσης συνεργιστικών ή προσθετικών αντιμικροβιακών δραστηριοτήτων, είναι ένα άλλο πεδίο έρευνας που απαιτεί αυξημένη προσοχή (Sang & Blecha, 2009). Επειδή η αντιμικροβιακοί και οι ανοσορυθμιστικοί τομείς πολλών από αυτά τα πεπτίδια μπορούν να διαχωριστούν δομικά, είναι εφικτό τα αντιδραστήρια που βασίζονται στα χοίρεια HDPs να μπορούν να βελτιστοποιηθούν. Επιπλέον, επειδή οι χοίροι είναι ένα ιδανικό μοντέλο έρευνας πολλών ασθενειών του ανθρώπου (πχ. διαβήτης και ατοπική δερματίτιδα), θα είναι πολύ σημαντικό να διευκρινιστεί πως τα HDPs εμπλέκονται σε αυτές τις ασθένειες (Sang & Blecha, 2009). Η εξέλιξη των φαρμάκων και των θεραπευτικών αγωγών που βασίζεται στα HDPs είναι ελκυστικές προτάσεις για τουλάχιστον δύο λόγους. Πρώτον, η αφθονία των HDPs, τα οποία έχουν βελτιωθεί μέσω της χρόνιας επιλογής, παρέχοντας μία εκτεταμένη και κατανοητή δομική πηγή για σχεδιασμό φαρμάκων. Δεύτερον, θεωρητικές αναλύσεις (in vivo και in vitro) προσφέρουν εφικτά μέσα για βελτίωση των συγκεκριμένων λειτουργιών που κατευθύνονται προς την μικροβιακή και την ανοσσορυθμιστική δραστηριότητα (Sang & Blecha, 2009). Μέχρι σήμερα, οι περισσότερες προσπάθειες προς την εξέλιξη των θεραπευτικών HDP-φαρμάκων έχουν κατευθυνθεί προς τα αντι-μολυσματικά και αντι-ενδοτοξινικά αντιδραστήρια. Δυστυχώς, τα περισσότερα θεραπευτικά με βάση τα HDPs, συμπεριλαμβανομένων και ορισμένων πεπτιδίων που βασίζονται στα χοίρεια PGs, έχουν αποτύχει να συνεχίσουν έως το τελικό στάδιο των κλινικών δοκιμών ή των ρυθμιστικών εγκρίσεων. Ωστόσο, το επεκτεινόμενο ρεπερτόριο των χοίρειων β-defensins και άλλων νέων HDPs ίσως να παρέχει μία νέα πλούσια πηγή για τον καθορισμό αποτελεσματικών αντιμικροβιακών ουσιών ή ανοσσορυθμιστικών υποψηφίων (Sang & Blecha, 2009). 49

52 ΜΕΡΟΣ Β 2.7. Η ΧΡΗΣΗ ΤΗΣ ΕΠΙΛΟΓΗΣ ΜΕ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥΣ ΔΕΙΚΤΕΣ ΣΤΗΝ ΖΩΙΚΗ ΠΑΡΑΓΩΓΗ Εισαγωγή Παραδοσιακά, η επιλεκτική αναπαραγωγή των αγροτικών ζώων αποσκοπούσε προς τη βελτίωση της γενετικής σύστασης των ντόπιων πληθυσμών ζώων, ούτως ώστε να τους επιτρέψει να επιβιώσουν και να αναπτυχθούν στο συγκεκριμένο περιβάλλον, και να παρέχουν τροφή και μεταφορικό μέσο στον άνθρωπο. Αυτή η επιλεκτική αναπαραγωγή οδήγησε στην ανάπτυξη ζώων με χαρακτηριστικούς φαινοτύπους που θα μπορούσαν να ταξινομηθούν ως ξεχωριστές φυλές. Το 1993 υπήρχαν 783 φυλές βοοειδών, 863 φυλές προβάτων και 263 φυλές χοίρων παγκοσμίως. Παρόλα αυτά, κατά τα τελευταία χρόνια ο αριθμός των φυλών σε κάθε είδος είναι ταχέως μειούμενος. Η ποικιλομορφία των φαινοτύπων που εμφανιζόταν στις διάφορες φυλές των αγροτικών ζώων ελέγχεται από μία ισόποση γενετική ποικιλομορφία, η οποία παρέχει τη δυνατότητα για επιλογή ζώων με εξαιρετική απόδοση σε συγκεκριμένα επιθυμητά χαρακτηριστικά, όπως ο ρυθμός αύξησης, η σύνθεση των προϊόντων (π.χ. γάλα, κρέας, αυγά κλπ), η γονιμότητα, η επιβίωση σε διάφορα περιβάλλοντα και η αντοχή σε ασθένειες. Η τεχνολογική πρόοδος, όπως η χρήση της τεχνητής σπερματέγχυσης και η εμβρυομεταφορά σε ορισμένα είδη και η εφαρμογή στατιστικών μεθόδων για βελτίωση της επιλογής για γενετικό κέρδος, έχουν ήδη εφαρμοστεί στον αναπτυγμένο κόσμο. Αυτές οι τεχνικές επέφεραν μεγάλη βελτίωση σε χαρακτηριστικά απλής παραγωγής τα οποία μπορούν να μετρηθούν (ποσοτικά χαρακτηριστικά). Συνεπώς, σε χώρες όπου το οικονομικό περιβάλλον υποστηρίζει την γεωργίακτηνοτροφία υψηλών αποδόσεων, υπήρξε μία θεαματική αύξηση του επιπέδου παραγωγής από την επιλεκτική βελτίωση των αγροτικών ζώων. 50

53 Πιθανά προβλήματα Όμως, η βελτίωση ενός χαρακτηριστικού που επιτυγχάνεται μέσω της επιλεκτικής αναπαραγωγής σχετίζεται συχνά με απώλειες σε άλλα χαρακτηριστικά. Όπου οι πρωταρχικοί παράγοντες που προωθούν την φυσική επιλογή είναι η αναπαραγωγική επιτυχία και η αντοχή στις ασθένειες, η τεχνητή επιλογή στα οικόσιτα είδη έχει στις περισσότερες περιπτώσεις αγνοήσει χαρακτηριστικά που σχετίζονται με την υγεία, προς όφελος της βελτίωσης παραγωγικών χαρακτηριστικών. Παρόλα αυτά, η παραγωγή βασίζεται στην καλή υγεία, και προκειμένου να διατηρηθεί το επίπεδο της υγείας των οικόσιτων ζώων, οι στρατηγικές της διαχείρισης τους ολοένα και περισσότερο βασίζονται σε κτηνιατρική μεσολάβηση και στην προληπτική χρήση αντιβιοτικών. Πρόσφατα παρατηρήθηκαν πολυάριθμα προβλήματα υγείας στον άνθρωπο που σχετίζονται με ασθένειες που μεταδίδονται από τα οικόσιτα ζώα (ζωονόσοι), όπως η μόλυνση του ανθρώπινου πληθυσμού με E. coli και Salmonella μέσω της επαφής με αγροτικά ζώα και μολυσμένα προϊόντα διατροφής. Γι αυτό, ενώ η επιλογή ζώων που βασίστηκε σε φαινοτυπικές αξίες ήταν ιδιαίτερα επιτυχής στην αύξηση της παραγωγής και τη μείωση του κόστους παραγωγής, ένας περιορισμένος αριθμός παραγωγικών χαρακτηριστικών βελτιώθηκε. Για να υπάρξει ανταπόκριση στις καταναλωτικές απαιτήσεις και για να αναπτυχθεί μια αειφόρα βιομηχανία, είναι απαραίτητο να καλυφθούν τα πιθανά προβλήματα που σχετίζονται με τις παραδοσιακές μεθόδους επιλογής μέσω της πλήρους εκμετάλλευσης των νέων τεχνολογιών που είναι διαθέσιμες για την επιλογή των γενετικά ανώτερων ζώων. Δυνατότητες για εφαρμογή μοριακής γενετικής Αν η επιλογή μέσω των φαινοτύπων χρησιμοποιείται μεμονωμένα υπάρχουν αναπόφευκτα κάποιες επιλογές που θα έχουν αλληλοσυγκρουόμενα αποτελέσματα. 51

54 Για παράδειγμα, τα αλληλόμορφα ενός συγκεκριμένου γονιδίου μπορεί να είναι ευεργετικά για ένα χαρακτηριστικό, αλλά να έχουν αρνητική επίδραση σε κάποιο άλλο. Παράλληλα, διαφορετικά γονίδια συμμετέχουν συνήθως στην ρύθμιση διαφορετικών χαρακτηριστικών. Παρόλα αυτά, όταν γονίδια που ελέγχουν διαφορετικά χαρακτηριστικά βρίσκονται πολύ κοντά μεταξύ τους σε ένα χρωμόσωμα φαίνεται πως μόνο ένας γονιδιακός τόπος ελέγχει και τα δύο χαρακτηριστικά γιατί τα αλληλόμορφα στους συνδεδεμένους γονιδιακούς τόπους γενικά θα κληρονομηθούν μαζί. Ακόμη όμως και με πολύ στενά συνδεδεμένα γονίδια, τα αλληλόμορφα που βρίσκονται μαζί στους προγόνους ενός συγκεκριμένου ατόμου θα αλλάξουν εξαιτίας του ανασυνδυασμού μεταξύ τους. Η γνώση των αλληλομόρφων σε συγκεκριμένους γονιδιακούς τόπους θα βοηθήσει στην εύρεση ατόμων που φέρουν τα επιθυμητά αλληλόμορφα και θα επιτρέψει την άμεση επιλογή των γενετικά ανώτερων ζώων σε διαφορετικούς γονιδιακούς τόπους ταυτόχρονα. Επομένως, θεωρητικά τουλάχιστον, μία στρατηγική επιλογής για καλύτερη απόδοση σε ένα πλήθος χαρακτηριστικών θα μπορούσε να αναπτυχθεί με την χρήση γενετικών δεικτών, ακόμα και όταν σε φαινοτυπικό επίπεδο τα χαρακτηριστικά φαίνεται να μην είναι συμβατά. Η κύρια πρόκληση που αντιμετωπίζουν οι μοριακοί γενετιστές είναι να εντοπίσουν δείκτες γονιδίων που επηρεάζουν την φαινοτυπική διακύμανση των χαρακτηριστικών που τους ενδιαφέρουν. Οι επιστήμονες έχουν εστιάσει κυρίως σε λειτουργικούς πολυμορφισμούς των γονιδίων που επηρεάζουν τη διαφοροποίηση του χαρακτηριστικού. Όταν ο λειτουργικός πολυμορφισμός γίνει γνωστός είναι εφικτό να γίνει πρόγνωση της επίδρασης του συγκεκριμένου αλληλομόρφου σε όλα τα ζώα του πληθυσμού. 52

55 Στην απλούστερη περίπτωση η παρατηρούμενη διακύμανση σε ορισμένα χαρακτηριστικά ελέγχεται άμεσα από ένα μόνο γονίδιο, το οποίο μπορεί να έχει περιορισμένο αριθμό αλληλομόρφων και τότε αναφερόμαστε σε ποιοτικά γνωρίσματα. Στα γνωρίσματα αυτά το γονίδιο ελέγχει το γνώρισμα και το αλληλόμορφο καθορίζει τον φαινότυπο. Για παράδειγμα, το χρώμα στα βοοειδή ελέγχεται από το γονίδιο melanocyte hormone receptor και το αλληλόμορφο άγριου τύπου επιφέρει μαύρο χρωματισμό ενώ ένα αλληλόμορφο που φέρει μια μετάλλαξη που αλλάζει τη λειτουργία του επιφέρει καφέ χρωματισμό. Παρόλα αυτά, τα χαρακτηριστικά που είναι σημαντικά στην ζωική παραγωγή είναι γενικά πιο περίπλοκα. Ελέγχονται από μεγάλο αριθμό γονιδίων και έχουν ένα μεγάλο εύρος διακύμανσης στους παρατηρούμενους φαινότυπους. Ο ρυθμός αύξησης και η γαλακτοπαραγωγή είναι παραδείγματα δύο χαρακτηριστικών που παρουσιάζουν μια συνεχή φαινοτυπική διακύμανση. Τέτοιου είδους χαρακτηριστικά ονομάζονται ποσοτικά χαρακτηριστικά. Η διακύμανση στα ποσοτικά χαρακτηριστικά ελέγχεται από διάφορους γενετικούς τόπους, ο καθένας εκ των οποίων είναι υπεύθυνος για ένα μικρό ποσοστό της συνολικής διακύμανσης. Γενετικοί δείκτες Οι γενετικοί δείκτες επισημαίνουν περιοχές (θέσεις) στα χρωμοσώματα ενός είδους και αντιπροσωπεύουν πολυμορφισμούς της αλληλουχίας του DNA στην περιοχή αυτή. Ανάλογα με τη μέθοδο ανίχνευσης των πολυμορφισμών, μπορούν να πάρουν διαφορετικές μορφές όπως μορφολογικοί, βιοχημικοί ή μοριακοί δείκτες. Ένα παράδειγμα ενός τέτοιου μορφολογικού γενετικού δείκτη είναι το χρώμα του τριχώματος, το οποίο χρησιμοποιήθηκε στα πρώιμα προγράμματα επιλογής για την καθιέρωση διαφόρων φυλών αγροτικών ζώων, π.χ. ο λευκός χρωματισμός προσώπου στα βοοειδή της φυλής Hereford και η λευκή ζώνη στα βοοειδή της φυλής Belted Galloway και στους χοίρους της φυλής Saddleback. 53

56 Πιο πρόσφατα, πολυμορφισμοί πρωτεϊνών, ιδιαίτερα στις ομάδες αίματος, έχουν χρησιμοποιηθεί για να επικυρωθούν οι γενεαλογίες σε διάφορα είδη, συμπεριλαμβανομένων των αλόγων, των βοοειδών και του σκύλου. Τέτοιοι δείκτες πρωτεϊνών είναι γενικά μη πρακτικοί στη χρήση ως γονιδιακοί δείκτες καθώς είναι σχετικά σπάνιοι και σε ορισμένες περιπτώσεις η πρωτεΐνη εκφράζεται σε χαμηλά επίπεδα, κάνοντας δύσκολη την ανίχνευση, ή βρίσκονται μόνο σε συγκεκριμένους ιστούς. Η πιο πρόσφατη κατηγορία δεικτών είναι αυτοί που βασίζονται σε πολυμορφισμούς στην αλληλουχία του DNA και ονομάζονται μοριακοί δείκτες. Οι πρώτοι μοριακοί δείκτες που αναπτύχθηκαν αφορούν πολυμορφισμούς μήκους περιοριστικών τμημάτων DNA (Restriction fragment length polymorphisms, RFLPs). Η ανάλυση RFLP χρησιμοποιεί περιοριστικά ένζυμα βακτηρίων που προσκολλώνται και κόβουν τα μόρια του DNA σε πολύ συγκεκριμένης αναγνώρισης αλληλουχίες οι οποίες συνήθως έχουν μήκος από 4 ως 6 ζεύγη βάσεων. Υπάρχει ένα μεγάλο πλήθος περιοριστικών ενζύμων, καθένα εκ των οποίων έχει μία διαφορετική συγκεκριμένη θέση αναγνώρισης. Η διαφοροποίηση στις θέσεις αναγνώρισης των περιοριστικών ενζύμων στο γονιδίωμα θα μπορούσαν να προσδιοριστούν μέσω της πέψης γενωμικού DNA με ένα ένζυμο περιορισμού και παρατηρώντας τα τμήματα που προκύπτουν μέσα σε γέλη ηλεκτροφόρησης. Δείκτες που βασίζονται στην αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης Με την επινόηση της τεχνικής της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (PCR) που προκάλεσε επανάσταση στην μοριακή γενετική αναπτύχθηκαν πλήθος μοριακών δεικτών που ανιχνεύουν πολυμορφισμούς στο επίπεδο του DNA. Αυτή η τεχνική χρησιμοποιεί δύο μικρές αλληλουχίες DNA που ονομάζονται εκκινητές (με μήκος συνήθως μεταξύ 20 ως 25 bp, ζεύγη βάσεων) ώστε να ξεκινήσει η αντιγραφή ενός συγκεκριμένου τμήματος του μορίου του DNA. Μία θερμοανθεκτική DNA πολυμεράση χρησιμοποιείται στη συνέχεια για να αντιγράψει το DNA επεκτείνοντας τους εκκινητές και συνθέτοντας τη 54

57 συμπληρωματική αλληλουχία του DNA. Η επαναλαμβανόμενη μετουσίωση (denature) του DNA, επαναπροσκόλληση των εκκινητών και αντιγραφή του DNA θα ενισχύσει εκθετικά την αλληλουχία-στόχο που βρίσκεται μεταξύ των εκκινητών. Τελειώνοντας η διαδικασία ενίσχυσης, υπάρχει ικανοποιητική ποσότητα DNA για ανάλυση, απευθείας μέσω της ηλεκτροφόρησης. Το DNA που ενισχύθηκε με την PCR μπορεί να υποστεί πέψη από ένα ένζυμο περιορισμού και να παρατηρηθεί μέσα σε γέλη ηλεκτροφόρησης ώστε να διαπιστωθεί αν τα τμήματα της PCR έχουν διαχωριστεί. Η αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης και η τεχνική PRC-RFLP χρησιμοποιούνται συχνά σε διαγνωστικά τεστ ώστε να διαπιστωθεί ο γονότυπος σε μία γνωστή μετάλλαξη. Πολυμορφισμός ενός νουκλεοτιδίου και αλληλουχία γονιδιώματος Οι γενετικές διαφοροποιήσεις χωρίζονται σε δύο κατηγορίες: - Εισαγωγή ή εξαγωγή μιας αλληλουχίας DNA (indels) ή - αλλαγή στην αλληλουχία των νουκλεοτιδίων (συνήθως επηρεάζουν μία μεμονωμένη βάση). Οι πολυμορφισμοί ενός νουκλεοτιδίου (Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs) είναι πολύ πιο συχνοί από τα indels, και συμβαίνουν σε μεγάλη συχνότητα σε μη κωδικές και σε κωδικές περιοχές του γονιδιώματος. Πρόσφατες εκτιμήσεις από μελέτες αλληλούχισης του γονιδιώματος υποδεικνύουν ότι τα SNPs συμβαίνουν κάθε 200 ζεύγη βάσεων κατά μέσο όρο. Οι SNPs που βρίσκονται μέσα σε κωδικές περιοχές μπορεί να μην έχουν επίδραση στην πρωτεΐνη που κωδικοποιείται από το συγκεκριμένο γονίδιο (σιωπηλός 55

58 πολυμορφισμός) ή μπορεί να επιφέρουν αλλαγή σε ένα αμινοξύ στην αλληλουχία της πρωτεΐνης. Η εμπορική εφαρμογή της επιλογής με δείκτη ή γονίδιο στη ζωική παραγωγή Τις τελευταίες δεκαετίες οι εφαρμογές της μοριακής γενετικής κατευθύνθηκαν και προς τον εντοπισμό γονιδίων ή γενετικών δεικτών που επηρεάζουν χαρακτηριστικά με ιδιαίτερη σημασία στην ζωική παραγωγή (ποσοτικά χαρακτηριστικά) (Andersson, 2001). Αυτό δημιούργησε ευκαιρίες να ενισχυθούν τα προγράμματα γενετικής βελτίωσης του ζωικού κεφαλαίου με άμεση επιλογή των γονιδίων ή των περιοχών του γονιδιώματος που επηρεάζουν οικονομικά γνωρίσματα μέσω της επιλογής με δείκτες (Marker-assisted selection, M.A.S.) (Dekkers & Hospital, 2002). Τα αποτελέσματα ήταν ιδιαίτερα χρήσιμα κυρίως σε γνωρίσματα που είναι δύσκολο να βελτιωθούν με τη συμβατική επιλογή (γνωρίσματα με χαμηλή κληρονομικότητα ή γνωρίσματα των οποίων η μέτρηση του φαινοτύπου είναι δύσκολη, δαπανηρή, δυνατή μόνο αργά στη ζωή, είτε δεν είναι δυνατή για τους υποψηφίους της επιλογής) (Dekkers, 2004). Για το σκοπό αυτό, πολλές θεωρητικές μελέτες έχουν διεξαχθεί κατά τη διάρκεια των προηγούμενων δεκαετιών να αξιολογήσουν τις στρατηγικές για τη χρήση των πληροφοριών της μοριακής γενετικής στα προγράμματα επιλογής. Η επιπλέον βελτίωση στην επιλογή που είχε προβλεφθεί από διάφορες μελέτες οδήγησαν σε μεγάλη αισιοδοξία για τη χρήση των πληροφοριών της μοριακής γενετικής στα βιομηχανικά προγράμματα αναπαραγωγής. Σε γενικές γραμμές, αν και οι πληροφορίες της μοριακής γενετικής έχουν χρησιμοποιηθεί σε προγράμματα της βιομηχανίας για αρκετές δεκαετίες και αυξάνονται, η επέκταση στη χρήση δεν έφτασε στις αρχικές προσδοκίες (Dekkers, 2004). Η ευκολία της εφαρμογής και η πιθανότητα για επιπλέον γενετικό κέρδος είναι μεγάλη. Ευκαιρίες για τη χρήση μοριακών πληροφορίες υπάρχουν, αλλά η επιτυχής εφαρμογή τους απαιτεί μια συνολική ολοκληρωμένη στρατηγική που είναι 56

59 στενά συνδεδεμένο με τους επιχειρηματικούς στόχους. Η σημερινή στάση απέναντι στην επιλογή μέσω δεικτών είναι επομένως υπό συγκρατημένη αισιοδοξία (Dekkers, 2004). Χαρακτηριστικά Οι μοριακοί δείκτες έχουν χρησιμοποιηθεί για τον εντοπισμό γονιδιακών τόπων (loci) ή χρωμοσωμικών περιοχών (chromosomal regions) που επηρεάζουν μονογονιδιακά γνωρίσματα και ποσοτικά γνωρίσματα Τα μονογονιδιακά γνωρίσματα περιλαμβάνουν γενετικές ανωμαλίες, γενετικές διαταραχές, και την εμφάνιση. Για τους σκοπούς της ανίχνευσης και εφαρμογής των QTL, τα ποσοτικά γνωρίσματα μπορούν να ταξινομηθούν σε: α) Συστηματικά καταγραφόμενα χαρακτηριστικά, β) Χαρακτηριστικά δύσκολα στην καταγραφή (πρόσληψη τροφής, ποιότητα προϊόντος), και γ) χαρακτηριστικά που δεν έχουν καταγραφεί (αντοχή σε ασθένειες). Κάθε ένα από αυτά μπορεί να υποδιαιρεθεί περαιτέρω σε χαρακτηριστικά: i) που καταγράφονται και στα δύο φύλα, ii) σε φυλοπεριορισμένα χαρακτηριστικά, και iii) σε χαρακτηριστικά που καταγράφονται αργά στη ζωή. Η ικανότητα για την ανίχνευση QTL εξαρτάται από τη διαθεσιμότητα των φαινοτυπικών δεδομένων και μειώνεται κατά σειρά α, β, γ και σε κάθε μία από αυτές με τη σειρά i, ii και iii. Οι σαρώσεις γονιδιωμάτων, οι οποίες απαιτούν περισσότερα φαινοτυπικά δεδομένα από τις αναλύσεις με υποψήφια γονίδια, συχνά χρησιμοποιείται για την ανίχνευση QTL για τα χαρακτηριστικά της κατηγορίας α, ενώ οι προσεγγίσεις με υποψήφια γονίδια χρησιμοποιούνται πιο συχνά για να προσδιοριστούν QTL για χαρακτηριστικά που δεν καταγράφονται συστηματικά (β και γ). 57

60 Στρατηγικές για τη χρήση μοριακών δεδομένων στην επιλογή Για τους σκοπούς της γενετικής βελτίωσης, μπορούν να χρησιμοποιηθούν ορισμένοι δείκτες για την ενίσχυση μιας επιλεγμένης φυλής ή για να επωφεληθούμε μεταξύ των διακυμάνσεων που παρατηρούνται μεταξύ διαφόρων φυλών. Οι περισσότερες εφαρμογές των δεικτών σε ζωικό κεφάλαιο, ωστόσο, βασίζονται στην επιλογή εντός-φυλής. Η βασική πρακτική σε όλες τις εφαρμογές της μοριακής γενετικής για τη γενετική βελτίωση περιλαμβάνει τη δημιουργία ενός μοριακού σκορ, αν και η σύνθεση αυτού του σκορ διαφέρει από εφαρμογή σε εφαρμογή (Dekkers & Hospital, 2002). Για παράδειγμα, το μοριακό σκορ θα μπορούσε να βασίζεται στην παρουσία ή απουσία ορισμένων αλληλομόρφων ή γενότυπων, ή σε εκτιμήσεις επιδράσεων του δείκτη ή του QTL, τα οποία μπορούν να συνοψιστούν πάνω στον τόπο (loci) όταν επιλέγονται πολλαπλές περιοχές QTL (Lande & Thompson, 1990). Ο βασικός στόχος των προγραμμάτων επιλογής είναι να βελτιώσει τον πληθυσμό για έναν ολοκληρωμένο στόχο αναπαραγωγής πολλαπλών γνωρισμάτων (multiple-trait breeding goal). Ο στόχος αυτός μπορεί, κατ 'αρχήν, να μορφοποιηθεί ως συνδυασμός γενετικών γνωρισμάτων. Εφαρμογή της Επιλογής με Δείκτες από την βιομηχανία - Παραδείγματα εμπορικά διαθέσιμων γενετικών εξετάσεων (tests) Σήμερα, ένας σημαντικός αριθμός γενετικών εξετάσεων είναι διαθέσιμος προς χρήση από τον κλάδο της ζωικής παραγωγής. Ορισμένες εφαρμογές της γενετικής επιλογής για μεμονωμένα γονίδια προϋπήρχαν της εποχής της μοριακής γενετικής, συμπεριλαμβανομένης της επιλογής σε εμφανείς γενετικές ανωμαλίες και την γενική εικόνα των ζώων, τη δοκιμή αλοθάνης ως φυσική εξέταση για το γονίδιο RYR, και τη χρήση της ομάδας αίματος Β, ως ένα φυσιολογικό δείκτη για την επιλογή για ανθεκτικότητα στις ασθένειες των πουλερικών, η οποία ξεκίνησε τη δεκαετία του 1960 (Hansen κ.α., 1967, Hansen & Law, 1970). 58

61 Αρκετές από τις υπάρχουσες εξετάσεις χρησιμοποιούνται μόνο για την επιλογή ζώων σε περιορισμένη έκταση (within-house selection), όπως για παράδειγμα οι δείκτες PICmarq, οι οποίοι χρησιμοποιούνται από την εταιρία Pig Improvement Cooperation στις Η.Π.Α., ενώ άλλες είναι διαθέσιμες μέσω εμπορικών υπηρεσιών. Παρά το γεγονός ότι υπάρχει ένας μεγάλος αριθμός επιστημονικών εκθέσεων σχετικά με την ανίχνευση των QTL για τα ζώα (π.χ., Bidanel και Rothschild, 2002, Bovenhuis & Schrooten, 2002, Hocking, 2003), τα περισσότερα από αυτά εντοπίστηκαν σε πειραματικούς πληθυσμούς χρησιμοποιώντας διασταυρώσεις μεταξύ φυλών ή γραμμών (Andersson, 2001). Τέτοιες μελέτες προσδιορίζουν QTL που διαφέρουν σε συχνότητα μεταξύ των φυλών, αλλά τα αποτελέσματα δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν άμεσα για την επιλογή εντός των φυλών. Μπορούν, όμως να παρέχουν ένα σημαντικό βήμα για την αναγνώριση των δεικτών QTL που διαχωρίζονται εντός των φυλών χρησιμοποιώντας προσεγγίσεις με υποψήφια γονίδια (Rothschild & Soller, 1997). Ένα παράδειγμα είναι η ανίχνευση των πρόσθετων μεταλλάξεων στο γονίδιο RN, γνωστή ως PRKAG3, τα οποία έχει βρεθεί ότι διαχωρίζονται στις εμπορικές γραμμές των χοίρων χρησιμοποιώντας μια προσέγγιση με υποψήφιο γονίδιο θέσης σε μία περιοχή QTL που ανιχνεύθηκε σε μια διασταύρωση μεταξύ δύο εμπορικών φυλών (Ciobanu κ.α., 2001). Μια προσέγγιση είναι να ακολουθήσει κανείς μια breed-cross ανάλυση QTL σε εμπορικές γραμμές σε συγκεκριμένες περιοχές, η οποία έχει φανεί να είναι επιτυχής στους χοίρους (Evans κ.α., 2003) και έχει χρησιμοποιηθεί στα βοοειδή. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την εξεύρεση δεικτών που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την επιλογή. Μια σημαντική εξαίρεση για τη χρήση των πειραματικών διασταυρώσεων στην πρώτη φάση της ανίχνευσης QTL είναι τα βοοειδή γαλακτοπαραγωγής, για τα οποία οι σαρώσεις γονιδιωμάτων βασίζεται κατά κύριο λόγο στις μεγάλες οικογένειες των αρσενικών που είναι διαθέσιμες στη βιομηχανία, με γνωστά αποτελέσματα για τις κόρες ή τις εγγονές τους (Weller κ.α., 1990, Bovenhuis και Schrooten, 2002). Έτσι προκύπτουν αποτελέσματα για τη χρήση 59

62 δεικτών από πάρα πολλές περιοχές QTL (Boichard κ.α., 2002, Spelman, 2002, Bennewitz κ.α., 2003, Khatkar κ.α., 2004). Παραδείγματα εφαρμογών της επιλογής με δείκτες Η κύρια εφαρμογή και τις δυνατότητες για τη χρήση των δεικτών για την ενίσχυση της γενετικής βελτίωσης του ζωικού κεφαλαίου είναι μέσω της επιλογής εντός της φυλή. Αυτό απαιτεί δείκτες που εντοπίζουν τη μεταβλητότητα σε χαρακτηριστικά εντός της φυλής. Αν και αρκετές γενετικές εξετάσεις είναι διαθέσιμα για την πραγματοποίηση τέτοιας επιλογής, ο βαθμός στον οποίο χρησιμοποιούνται σε εμπορικά προγράμματα αναπαραγωγής είναι ασαφής, όπως είναι ο τρόπος με τον οποίο χρησιμοποιούνται (δηλ. στρατηγικές Ι, II, ή III ), και κατά πόσον η χρήση τους οδηγεί σε μεγαλύτερη ανταπόκριση στην επιλογή. Οι δείκτες έχουν κυρίως χρησιμοποιηθεί, όπως αποδεικνύεται από την αφθονία τους, μεταξύ των διαθέσιμων εξετάσεων. Οι δείκτες επιτρέπουν την επιλογή σε όλο τον πληθυσμό και αυτό διευκολύνει την χρήση τους. Μερικές από τις προηγούμενες εφαρμογές του MAS στα ζώα ήταν πριν από την εποχή της μοριακής γενετικής π.χ., επιλογή για την αντοχή της νόσου σε πουλερικά χρησιμοποιώντας ένα τεστ Elisa για την ομάδα αίματος, και την επιλογή στο γονίδιο της αλοθάνης σε χοίρους χρησιμοποιώντας την δοκιμή αλοθάνης. Στη συνέχεια, αρκετές γενετικές δοκιμασίες έχουν χρησιμοποιηθεί για την επιλογή των μεταφορέων υπολειπόμενων γενετικών ελαττωμάτων σε είδη ζώων. Ένα από τα πρώτα παραδείγματα της χρήσης ενός δείκτη για ποσοτικό γνώρισμα ήταν η δοκιμή για το γονίδιο υποδοχέα οιστρογόνου (ESR) (Rothschild κ.α., 1996, Short κ.α., 1997), το οποίο έχει χρησιμοποιηθεί σε αρκετές εμπορικές γραμμές ενίσχυση της επιλογής για το μέγεθος τοκετομάδας. Οι Plastow κ.α. (2003) ανέφεραν επίσης τη χρήση περισσότερων από 15 δεικτών για διάφορα χαρακτηριστικά που σχετίζονται με την αναπαραγωγή, την πρόσληψη τροφής, την ανάπτυξη, την σύνθεση του σώματος, και της ποιότητας του κρέατος σε χοίρους. Επίσης ανέφεραν την πρόσφατη χρήση ενός συνδυασμού από 60

63 δείκτες στις εμπορικές γραμμές των χοίρων, καθώς και προσπάθειες για την αντικατάσταση σημαντικών QTL περιοχών με δείκτες. Στις αγελάδες γαλακτοπαραγωγής, εκτός από την χρήση δεικτών για γενετικές ανωμαλίες και παραλλαγές στην πρωτεΐνη γάλακτος, μελετήθηκε ένας δείκτης κοντά στο γονίδιο της προλακτίνης (Cowan κ.α., 1990) και έχει χρησιμοποιηθεί για προεπιλογή των νεαρών ταύρων (Cowan κ.α., 1997). Οι ίδιοι ανέφεραν επίσης τη χρήση διαφόρων πρόσθετων δεικτών για την επιλογή των βελτιωτών ταύρων και την προεπιλογή των νεαρών ταύρων. Προγράμματα επιλογής που κάνουν χρήση γενετικών δεικτών έχουν διεξαχθεί σε διάφορα προγράμματα αναπαραγωγής γαλακτοπαραγωγών αγελάδων, συμπεριλαμβανομένων της προ-επιλογής των νεαρών ταύρων με βάση μελέτες QTL στις ΗΠΑ (Georges κ.α. 1995, Zhang κ.α. 1998), στη Νέα Ζηλανδία (Spelman, 2002) και στην Ολλανδία (Spelman κ.α. 1996, Arranz κ.α. 1998, Coppieters κ.α. 1998). Στη Γαλλία (Boichard κ.α., 2002) και στη Γερμανία (Bennewitz κ.α., 2003) έχει αναφερθεί η θέσπιση εθνικών προγραμμάτων γενετικής αξιολόγησης που χρησιμοποιούν γενετικούς δείκτες για την παροχή πληροφοριών για τη χρήση τους σε προγράμματα γενετικής βελτίωσης από οργανώσεις με βοοειδή γαλακτοπαραγωγής. Στα κρεοπαραγωγά βοοειδή, πολλοί δείκτες είναι διαθέσιμοι στο εμπόριο και χρησιμοποιούνται από μεμονωμένους κτηνοτρόφους. Στα πρόβατα, αναφέρθηκαν έρευνες με πρόγραμμα γενετικής βελτίωσης που σχετίζονται με ένα γονίδιο που βρίσκεται σε μικρή απόσταση από το γονίδιο Carwell (Nicoll κ.α., 1998). Επιπλέον, έχουν αναφερθεί διάφοροι δείκτες που σχετίζονται με την αναπαραγωγή και τις ασθένειες, συμπεριλαμβανομένης της τρομώδους νόσου των προβάτων. Εκτίμηση της επιτυχίας των εμπορικά διαθέσιμων εξετάσεων MAS Η επίδραση της επιλογής με Δείκτες (MAS) για γενετική βελτίωση είναι δύσκολο να ποσοτικοποιηθεί, ακόμη και κάτω από πειραματικές συνθήκες, επειδή οι διαφορές στην απόκριση αναμένεται να είναι μεγάλος, ιδιαίτερα αν λάβουμε υπόψη ότι τα γνωρίσματα που επιλέγονται για χρήση MAS αποτελούν μέρος ενός στόχου με 61

64 πολλαπλά γνώρισμα αναπαραγωγής, και συχνά δεν είναι διαθέσιμα κατάλληλοι έλεγχοι. Ωστόσο η ανταπόκριση των προγραμμάτων επιλογής με δείκτες (MAS) μπορεί να αξιολογηθεί σε διαφορετικά επίπεδα: 1) Οι μεταβολές στις συχνότητες των γονιδίων στον επιλεγμένο τόπο του γενετικού δείκτη 2) Η επίδραση των συγκεκριμένων γονιδιακών τόπων ή περιοχών στο γνώρισμα του πληθυσμού-στόχου 3) Η βελτίωση του πληθυσμού ή σε επιλεγμένα άτομα στο συνολικό γενετικό επίπεδο για το χαρακτηριστικό γνώρισμα που μας ενδιαφέρει ΟΙ ΕΞΕΛΙΞΕΙΣ ΣΤΗ ΜΟΡΙΑΚΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΤΩΝ ΧΟΙΡΩΝ Η μοριακή ανάλυση του γονιδιώματος έχει βελτιώσει τον τρόπο που οι επιστήμονες εξετάζουν τις γενετικές διαφορές που υπάρχουν μεταξύ των εμπορικών και των μη βελτιωμένων χοίρων. Κατά τα τελευταία χρόνια, οι προσπάθειες έχουν κατευθυνθεί προς την ανάπτυξη γενετικών χαρτών που αποτελούνται από ανώνυμους γενετικούς δείκτες αλλά και γνωστά γονίδια (Rothschild, 2000). Οι διάφοροι συγκριτικοί χάρτες γονιδιώματος που έχουν αναπτυχθεί, έχουν βοηθήσει σημαντικά στην αναζήτησή μας για ενδιαφέροντα και δυνητικά χρήσιμα γονίδια στο χοίρο. Η κάλυψη αυτών των γενετικών χαρτών είναι πλέον επαρκής για να επιτρέψει στους ερευνητές να διεξάγουν αναλύσεις με βάσει τις οποίες θα είναι σε θέση να συνδέσουν συγκεκριμένους γενετικούς τόπους με διάφορα ποσοτικά γνωρίσματα (Rothschild, 2000). Αυτές οι αναλύσεις σύνδεσης των QTL με ποσοτικά γνωρίσματα, περιλαμβάνουν μια σάρωση του γωνιδιώματος όπου γενικά χρησιμοποιούνται η F2 γενιά ή προγονικός έλεγχος από πολλές οικογένειες και προκύπτουν γονότυποι για πολλούς ( >100 ) δείκτες, κατανεμημένοι σε ολόκληρο το γονιδίωμα (Rothschild, 2000). 62

65 Αρκετά τέτοια πειράματα βρίσκονται σε εξέλιξη ή έχουν πρόσφατα ολοκληρωθεί και αρχίζουν να παράγουν ενδιαφέροντα και χρήσιμα αποτελέσματα. Προσεγγίσεις με υποψήφια γονίδια και τεχνικές συγκριτικής χαρτογράφησης έχουν επίσης επιτυχία στον εντοπισμό γονιδίων που επηρεάζουν διάφορα χαρακτηριστικά (Rothschild, 2000). Οι αναλύσεις με υποψήφια γονίδια λαμβάνουν χώρα όταν ένα γονίδιο επιλέγεται με βάση την φυσιολογία του χαρακτηριστικού. Σύμφωνα με αυτή την πρακτική, επιλέγεται ένα υποψήφιο γονίδιο, το οποίο πιθανολογείται ότι επηρεάζει την απόδοση του γνωρίσματος. Στη συνέχεια, η πρακτική αυτή συμπληρώνεται από συγκριτική ανάλυση του γονιδίου, η οποία επιτρέπει στους ερευνητές να βρουν "υποψήφια γονίδια θέσης" στις περιοχές που σχετίζονται με πιθανά QTL (Rothschild, 2000). Μέχρι σήμερα, έχουν βρεθεί πολλά σημαντικά γονίδια με την χρήση της πρακτικής προσέγγισης με υποψήφια γονίδια. Άμεση αλλά και μελλοντική γενετική βελτίωση θα προκύψει από τους πιο λεπτομερείς γενετικούς χάρτες και την αυξανόμενη κατανόηση της λειτουργίας και της δομής των μεμονωμένων γονιδίων και των οικογενειών γονιδίων που είναι υπεύθυνα για τα οικονομικά γνωρίσματα στους χοίρους (Rothschild, 2000). Παρακάτω γίνεται μια εξέταση στις πρόσφατες ανακαλύψεις της χαρτογράφησης γονιδίων και της κατάστασης των αναλύσεων των γονιδίων και των QTL στον χοίρο καθώς επίσης και ορισμένες προβλέψεις για τις μελλοντικές εξελίξεις και τις εφαρμογές τους στη βιομηχανία. Η τεχνολογία αυτή έχει επεκταθεί σε διάφορους κλάδους της παραγωγής των χοίρων, όπως για παράδειγμα: - στην ανάπτυξη και την απόδοση των χοίρων, - στην ποιότητα του κρέατος, - στην ανθεκτικότητα στις ασθένειες των χοίρων, και - στα αναπαραγωγικά χαρακτηριστικά των χοίρων. 63

66 Η κατάσταση στο χάρτη του γονιδιώματος των χοίρων Η προσπάθεια που απαιτείται για την παραγωγή πληροφοριών χαρτογράφησης είναι πολύ σημαντική αλλά παράλληλα επίπονη, πολυδάπανη και χρονοβόρα. Για τον λόγο αυτό οι επιστήμονες συνειδητοποίησαν από νωρίς ότι μια συλλογική προσπάθεια για τη χαρτογράφηση των γονιδίων σε ζώα θα ήταν η πιο παραγωγική προσέγγιση (Rothschild, 2000). Στην Ευρώπη αναπτύχθηκε το ερευνητικό έργο PiGMaP (Archibald κ.α., 1995), το οποίο χρηματοδοτήθηκε από την Ευρωπαϊκή Οικονομική Κοινότητα (E.O.K.). Στo PiGMaP συμμετείχαν 18 ευρωπαϊκά εργαστήρια και συνολικά άλλα 7 εργαστήρια από τις Η.Π.Α., την Ιαπωνία και την Αυστραλία (Rothschild, 2000). Στις Η.Π.Α., το USDA ξεκίνησε δύο προσπάθειες. Το USDA-ARS διευθύνει ένα σημαντικό έργο γονιδιακής χαρτογράφηση στο Κέντρο Ερευνών «Meat Animal Research Center» στο Clay Center της Νεμπράσκα. Δεύτερον, το 1993 αναπτύχθηκε υπό τη διεύθυνση του USDA-CSR το Εθνική Ερευνητικό Πρόγραμμα «National Animal Genome Research Program». Αυτό το πρόγραμμα είχε σχεδιαστεί για να παρέχει μία δομή η οποία θα συντονίσει τη συνεργασία στη χαρτογράφηση των γονιδίων σε όλα τα είδη, συμπεριλαμβανομένων των χοίρων. Επιστήμονες του κράτους, από ιδιωτικά πανεπιστήμια και ομοσπονδιακά εργαστήρια δημιούργησαν συνεργατικά μία επιτροπή για το γονιδίωμα των χοίρων (Swine Genome Technical Committee) (Rothschild, 2000). Οι δραστηριότητες του Συντονιστή της U.S. Pig Genome Coordinator, σε συνδυασμό με τις δραστηριότητες του USDA-ARS και άλλα διεθνή προγράμματα χαρτογράφησης του γονιδίου επέτρεψαν την ταχύτερη εξέλιξη της κατάστασης του γονιδιακού χάρτη των χοίρων τα τελευταία χρόνια. Το 1989, μόνο 50 γονίδια και δείκτες είχαν χαρτογραφηθεί στο χοίρο, και πολλοί από αυτούς ήταν δείκτες ομάδας αίματος ή ισοενζύμων (Rothschild, 2000). Οι προσπάθειες όλων αυτών των ερευνών έφεραν αποτελέσματα και το 2012 δημοσιεύτηκε ολόκληρο το γονιδίωμα του χοίρου, γεγονός που προσφέρει περαιτέρω βελτίωση του χοίρου καθώς επίσης και πιο εκτεταμένη χρήση του ως βιο-ιατρικό μοντέλο (Groenen κ.α. 2012). 64

67 Καθώς όλο και περισσότερα γονίδια τοποθετούνται στο συγκριτικό χάρτη των χοίρων, ο χάρτης του ανθρώπινου γονιδιώματος θα έχουν αυξημένη χρησιμότητα στην αναζήτηση για μεμονωμένα γονίδια που είναι υπεύθυνα για τα χαρακτηριστικά οικονομικού συμφέροντος (Rothschild, 2000). Αναπαραγωγικά χαρακτηριστικά των χοίρων Δεδομένης την ανάγκης για συλλογή πληροφοριών από μεγάλες οικογένειες και της δυσκολίας και του χρόνου που απαιτείται για την απόκτηση πληροφοριών σχετικά με τα γνωρίσματα αναπαραγωγής, δεν αποτελεί έκπληξη το γεγονός ότι τα αποτελέσματα των σαρώσεων για αυτά τα γνωρίσματα είναι περιορισμένα (Rothschild and Ruvinsky, 2011). Γονιδιακές θέσεις QTL Οι αρχικές έρευνες έδειξαν ενθαρρυντικά αποτελέσματα στο χρωμόσωμα 8. Ο Wilkie κ.α. (1996)ανέφεραν μια πιθανή γονιδιακή θέση QTL για το μήκος της μήτρας και τον ρυθμό ωοθυλακιορρηξίας σε διαφορετικές χρωμοσωμικές θέσεις του χρωμοσώματος 8. Ο Rathje κ.α. (1997) ανέφεραν μια αρκετά μεγάλη γονιδιακή θέση QTL για το ποσοστό ωοθυλακιορρηξίας (+3,07 ωάρια) στο χρωμόσωμα 8 επίσης, αλλά υπήρχε κάποια απόσταση από την γονιδιακή θέση QTL για την ωοθυλακιορρηξία από αυτή που παρατηρήθηκε από τον Wilkie και τους συνεργάτες του. Σε ένα γαλλικό πείραμα για QTL (Milan κ.α., 1998) ένα QTL για αυξημένο μέγεθος γέννας ενός χοιριδίου βρέθηκε στην ίδια περιοχή στο χρωμόσωμα 8 όπως του Rathje (Rothschild and Ruvinsky, 2011). Το QTL με το μεγάλο ποσοστό ωοθυλακιορρηξίας/μέγεθος τοκετομάδας στο χρωμόσωμα 8 είχε ενδιαφέρον, δεδομένου ότι χαρτογραφήθηκε σε μια περιοχή όμοια με το γονίδιο για την γονιμότητα στα πρόβατα Booroola. Είναι ενδιαφέρον ότι, χρησιμοποιώντας ένα ενιαίο δείκτη μικροδορυφορικών (ΟΡΝ) στην ίδια περιοχή του χρωμοσώματος 8 (Short κ.α., 1997, Van der Steen κ.α., 1997) βρέθηκαν επίσης 65

68 σημαντικές επιδράσεις στο μέγεθος τοκετομάδας σε εμπορικές γραμμές χοίρων (Rothschild and Ruvinsky, 2011). Υπάρχουν περαιτέρω ενδείξεις για τουλάχιστον ένα QTL για το μέγεθος τοκετομάδας στην κορυφή του χρωμοσώματος 8 (Rohrer κ.α., 1999) και ίσως ενός ακόμη κοντά στο κεντρομερίδιο. Περιορισμένες αναλύσεις QTL αναφέρουν περισσότερες θέσεις QTL για αναπαραγωγικά χαρακτηριστικά στα χρωμοσώματα 4 και 6 (Wilkie κ.α., 1996), στο χρωμόσωμα 7 (Wilkie, κ.α., 1996; Milan, κ.α., 1998) και τα χρωμοσώματα 4, 13 και 15 (Rathje κ.α., 1997). Υποψήφια γονίδια που σχετίζονται με αναπαραγωγικά χαρακτηριστικά στους χοίρους Η ανάλυση για υποψήφια γονίδια της αναπαραγωγής έχει δείξει σημαντικά αποτελέσματα (Rothschild, 2000). Γονίδιο ESR Το γονίδιο ESR είναι ένα από τα πιο επιτυχημένα παραδείγματα υποψηφίων γονιδίων που σχετίζονται με αναπαραγωγικά χαρακτηριστικά στους χοίρους. Τα αποτελέσματα έδειξαν καθαρά ότι ο υποδοχέας των οιστρογόνων (ESR) συνδέεται σε σημαντικό βαθμό με το μέγεθος τοκετομάδας (Rothschild κ.α., 1996, Short κ.α., 1997). Οι εκτιμήσεις των αλληλομόρφων ποικίλλουν από 1,15 χοιρίδια/τοκετομάδα σε συνθετικά της φυλής Meishan ως 0,42 χοιρίδια/τοκετομάδα σε γραμμές της φυλής Large White. Τα αποτελέσματα αυτά δεν έχουν επιβεβαιωθεί από σαρώσεις QTL, χρησιμοποιώντας διασταυρώσεις που αφορούν Meishan και Large White χοίρων. Αυτό μπορεί να οφείλεται στο μικρό μέγεθος δείγματος ή στο γεγονός ότι το αλληλόμορφο γονίδιο του ESR δεν διαχωριζόταν στους πληθυσμούς που χρησιμοποιήθηκαν στις σαρώσεις QTL. Ο δείκτης ESR ενσωματώθηκε με επιτυχία στους δείκτες επιλογής για γραμμές χοιρομητέρων που βασίζονται στη φυλή Large White, αυξάνοντας το ποσοστό της γενετικής ανταπόκρισης σε κοπάδια πυρήνες. Επιπλέον, έχει παρατηρηθεί αύξηση του μέσου μεγέθους τοκετομάδας σε διασταυρωμένα προϊόντα που προέρχονται από αυτές τις γραμμές (Rothschild, 2000). 66

69 Περισσότερα γονίδια Επίσης έχουν αναφερθεί διάφορες συσχετίσεις με αναπαραγωγικά χαρακτηριστικά που αφορούν τον υποδοχέα γάμμα του ρετινοϊκού οξέος (RARG), τον υποδοχέα 1Α της μελατονίνης (MTNRIA) (Messer κ.α., 1996, Ollivier κ.α., 1997) και το γονίδιο της ωοθυλακιοτρόπου ορμόνης βήτα (FSHB) (Li κ.α., 1998) (Rothschild and Ruvinsky, 2011). Ερευνητές στο Iowa State University, έδειξαν ότι ο υποδοχέας της προλακτίνης (PRLR) συνδέεται σημαντικά με το μέγεθος της τοκετομάδας (Vincent κ.α., 1998). Αυτό έχει επιβεβαιωθεί και σε δύο μικρότερες μελέτες στο Ohio State University και στο WAU στην Ολλανδία (Rothschild, 2000). Επίσης, η πρωτεΐνη 4 σύνδεσης της ρετινόλης (RBP4 Retinol binding protein 4) σε μια μελέτη που περιλαμβάνει σχεδόν γέννες φαίνεται πως συνδέεται με μια αύξηση της τάξης των 0,25 χοιριδίων/τοκετομάδα (Rothschild and Ruvinsky, 2011). Οι περισσότερες από τις αναλύσεις υποψηφίων γονιδίων έχουν χρησιμοποιήσει σημαντικά περισσότερες χοιρομητέρες και γέννες από τις αναλύσεις QTL και αυτό μπορεί να εξηγήσει την έλλειψη επιβεβαίωσης από τις αναλύσεις QTL στις ίδιες περιοχές που έχουν αναφερθεί οι επιδράσεις των υποψηφίων γονιδίων μέχρι σήμερα (Rothschild and Ruvinsky, 2011). Η χρήση της μοριακής γενετικής και η γενετική ποικιλομορφία Μια περιοχή που ξεκίνησε να γίνεται χρήση των μοριακών δεικτών και των γονιδίων είναι ο τομέας της γενετικής ποικιλομορφίας. Αρχικά γινόταν εξέταση του πολυμορφισμού ενός ενζύμου, ενώ αργότερα χρησιμοποιήθηκαν οι μικροδορυφόροι. Ένα παράδειγμα αυτής της προσέγγισης είναι το «European biodiversity project», που συντονίζεται από τον L. Ollivier από τη Γαλλία (Laval κ.α, 2000). Κατά καιρούς έχει αναφερθεί πως οι προσεγγίσεις με ανώνυμους δείκτες δεν επαρκούν για να καθορίσουν τη λειτουργική ποικιλομορφία και ότι θα πρέπει να χρησιμοποιούνται οι πολυμορφισμοί σε επίπεδο γνωστών γονιδίων για τον σκοπό αυτό (Ciobanu κ.α., 2001, Rothschild 1999). Η προσέγγιση αυτή χρησιμοποιήθηκε εκτενώς από τον 67

70 Ciobanu και τους συνεργάτες του (Ciobanu κ.α., 2001) για να παρουσιάσει τις διαφορές σε λειτουργικά γονίδια μεταξύ των δύο αυτόχθονων φυλών χοίρων στη Ρουμανία (Rothschild and Ruvinsky, 2011). Η χρήση της επιλογής με δείκτες στους χοίρους Πληροφορίες στο επίπεδο του DNA μπορούν να βοηθήσουν τους κτηνοτρόφους και τους γενετιστές για να καθορίσουν μια συγκεκριμένη σημαντική μετάλλαξη, όπως έγινε και με το αλληλόμορφο της αλοθάνης (Halothane allele). Μπορούν όμως να χρησιμοποιηθούν και για να βοηθήσουν στην επιλογή των ποσοτικών γνωρισμάτων συμπεριλαμβανομένων εκείνων που μπορούν να επιλεγούν με παραδοσιακά μέσα (Rothschild, 2000). Οι μοριακές πληροφορίες μπορούν να αυξήσουν την ακρίβεια της επιλογής και κατά συνέπεια, την μεγαλύτερη επιτυχία της επιλογής (Rothschild, 2000). Το μέγεθος της επιπλέον απόκρισης που λαμβάνεται μέσω των σχημάτων της επιλογής με δείκτες έχει ληφθεί υπόψη από πολλούς ερευνητές από θεωρητική άποψη (Rothschild, 2000). Ο Gibson (2002) και άλλοι ερευνητές έχουν δείξει ότι υπάρχει ένα βραχυπρόθεσμο όφελος από τη χρήση της MAS, αλλά σε ορισμένες περιπτώσεις αυτό μπορεί να οδηγήσει σε μακροχρόνια προβλήματα. Ωστόσο, αυτό είναι πάνω από ένα σχετικά μεγάλο χρονικό διάστημα. Οι Meuwissen και Goddard (1996) έλαβαν υπόψη ένα διαφορετικό σύνολο υποθέσεων και εξέτασαν κυρίως την επίδραση σε χαρακτηριστικά όπως η αναπαραγωγή και η ποιότητα του κρέατος που είναι δύσκολο να εξελιχθούν με τις παραδοσιακές μεθόδους. Οι Dekkers και Van Arendonk (1998) έδειξαν ότι τα αποτελέσματα αυτά μπορούν να βελτιωθούν περαιτέρω με τη χρήση της θεωρίας ελέγχου για τη βελτιστοποίηση της απόκρισης. Σημαντικότερο όλων είναι ότι αυτές οι βελτιώσεις μπορούν να συνεχιστούν, καθώς εντοπίζονται διαρκώς νέοι δείκτες. Για παράδειγμα, οι νέοι δείκτες μπορούν να προστεθούν στους δείκτες επιλογής, καθώς οι παλιοί δείκτες αρχίζουν να φθάνουν σε προσαρμογή (fixation) (Rothschild, 2000). 68

71 Στις μέρες μας, σημαντική πρόοδος γίνεται με τη χρήση των υποψηφίων γονιδίων χρησιμοποιώντας εργαλεία όπως η RFLP, ένα εξαιρετικά ισχυρό εργαλείο, που δημιουργεί γρήγορα ένα μεγάλο αριθμό δεικτών σε ενδιαφέροντες πληθυσμούς (Rothschild, 2000). Εκτός από την εκτεταμένη έρευνα σε υφιστάμενους πληθυσμούς, πολλά πειράματα QTL είναι σε εξέλιξη για τις αποδόσεις, την αναπαραγωγή και τα χαρακτηριστικά ποιότητας του κρέατος (Nezer κ.α., 1996; Van Oers κ.α., 1996) (Rothschild, 2000). Πολλές αναλύσεις υποψηφίων γονιδίων και QTL έχουν δώσει ενδιαφέροντα αποτελέσματα. Οι σαρώσεις για QTL εντόπισαν αρκετά χρωμοσώματα και έγιναν στόχοι για περαιτέρω επιβεβαίωση της χρωματοσωμικής περιοχής και συγκριτική ανάλυση υποψηφίων γονιδίων λόγω της θέσης που βρίσκονται (Rothschild and Ruvinsky, 2011). Επιπλέον πειράματα, άλλοτε επιβεβαιώνουν τις περιοχές και οδηγούν σε ενδεχόμενη απομόνωση ενός γονιδίου ή γονιδίων του ενδιαφέροντος και άλλοτε παράγουν αντικρουόμενα αποτελέσματα. Τέτοια αντικρουόμενα αποτελέσματα μπορεί να οφείλονται στις επιδράσεις των απλοτύπων, στην επίσταση ή στις επιδράσεις των γονοτύπων του υπόβαθρου (background genotype effects), ή στη δειγματοληψία. Δεδομένου ότι θα θέλαμε να ανιχνεύσουμε όχι μόνο μεγάλες αλλά και μέτριες γονιδιακές επιδράσεις, ο αριθμός των χρησιμοποιούμενων ζώων σε κάθε πείραμα θα πρέπει να αυξηθεί ή θα πρέπει να παρουσιαστούν και να συγκεντρωθούν πολλά πειραματικά αποτελέσματα (Rothschild and Ruvinsky, 2011). Αρκετά έρευνες εντοπίζουν κομμάτια νέων γονιδίων από συγκεκριμένους ιστούς σε χοίρους και λαμβάνονται υπόψη αποτελέσματα που βρέθηκαν σε διασταυρώσεις που αφορούν τον αγριόχοιρο και τις κινεζικές φυλές και εξετάζονται σε εμπορικές γραμμές. Μέθοδοι όπως η χρήση των τσιπ DNA ή συστοιχιών για την εξέταση της γονιδιακής έκφρασης προσφέρουν γνώσεις σχετικές με τα περίπλοκα χαρακτηριστικά οικονομικής σημασίας στο χοίρο. Αυτές οι μέθοδοι προσφέρουν σημαντική βοήθεια στις προσπάθειες βελτίωσης των χοίρων (Rothschild and Ruvinsky, 2011). 69

72 2.9. ΜΕΓΕΘΟΣ ΤΟΚΕΤΟΜΑΔΑΣ Το μέγεθος της τοκετομάδας των χοιρομητέρων παίζει ένα σημαντικό ρόλο στο κέρδος του παραγωγού μιας χοιροτροφικής εκμετάλλευσης. Μάλιστα η αξία ενός τέτοιου χαρακτηριστικού τα τελευταία χρόνια είναι περισσότερο σημαντική, καθώς άλλες παράμετροι που ελέγχουν το κέρδος του παραγωγού έχουν σχεδόν φτάσει σε ένα υψηλό επίπεδο και δεν φαίνεται πως μπορούν να επηρεάσουν σε μεγάλο βαθμό το τελικό ύψος τους εισοδήματος. Στον Πίν. 2 παρουσιάζεται το μέγεθος της τοκετομάδας στις καθαρές φυλές. Πίν. 3: Mέγεθος τοκετομάδας ανά ομάδα φυλών χοίρων (Παπαδόπουλος, 2005) Ομάδες φυλών Ομάδα κινέζικων φυλών Meishan Fenjing, Erhualian, Jianxing Δυτικές φυλές: Ομάδα Α Large White, Landrace Δανίας, Yorkshire, Chester White Δυτικές φυλές: Ομάδα Β Pietrain, Landrace Βελγίου, Hampshire, Duroc, Poland China Αριθμός χοιριδίων/τοκετό , Το μέγεθος της τοκετομάδας σε υβριδικές χοιρομητέρες είναι μεγαλύτερο. Για τα δεδομένα της Ελλάδας, ανάλογα με το ύψος των αποδόσεων των χοιρομητέρων ανά τοκετό, χωρίζονται σε τέσσερις κατηγορίες (Πίν. 3): Πίν. 4: Αποδοτικότητα χοιρομητέρων σε κατηγορίες (Παπαδόπουλος, 2005) Αποδοτικότητα Αριθμός χοιριδίων/τοκ Χαμηλή 8 Μεσαία 8 10 Καλή 10 11,5 Εξαιρετική > 11,5 Το ετήσιο παραγωγικό δυναμικό των χοιρομητέρων στις χώρες τις Ευρωπαϊκής Ένωσης βρίσκεται κατά μέσο όρο στα 22 απογαλακτισθέντα χοιρίδια ανά έτος ενώ στην Ελλάδα υπολογίζεται στα Ωστόσο, υπάρχουν ορισμένες χοιροτροφικές μονάδες στη χώρα μας που φθάνουν και ξεπερνούν το Ευρωπαϊκό μέσο όρο (Βακάκης, 2008). 70

73 2.10 ΤΟ ΓΟΝΙΔΙΟ BF Ένα από τα υποψήφια γονίδια που σχετίζονται με διάφορα αναπαραγωγικά χαρακτηριστικά στους χοίρους είναι το γονίδιο Complement Factor B (CFB, BF gene), το οποίο κωδικοποιεί την properdin, μια μονόκλωνη αλυσίδα γλυκοπρωτεΐνης (93kDa) που συντίθεται στο ήπαρ και στα ενδοθυλιακά, στα επιθυλιακά και στα mesenchymal κύτταρα (Colten, 1994). Έχει εντοπιστεί στην κεντρομερή περιοχή του 7 ου χρωμοσώματος των χοίρων SSC7 (Pinton κ.α. 2000; Ponsuksili κ.α. 2001). Σε αυτή την περιοχή έχουν βρεθεί διάφορα QTLs αλλά και άλλα γονίδια που σχετίζονται με αναπαραγωγικά χαρακτηριστικά (Cassady κ.α., 2001, Geffrotin κ.α., 1991). Από άποψη φυσιολογικής λειτουργίας, το γονίδιο BF βελτιώνει το ανοσοποιητικό σύστημα και παίζει έναν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του επιθυλίου της μήτρας (Hasty κ.α., 1993). Ένας από τους πολυμορφισμούς του γονιδίου BF εντοπίστηκε αρχικά μετά από πέψη του γονιδίου με το ένζυμο SmaI από τους Jiang & Gibson το 1998 ύστερα από μελέτη των πολυμορφισμών του συγκεκριμένου γονιδίου σε διάφορες φυλές και διασταυρώσεις χοίρων. Αποτελέσματα των μελετών του συγκεκριμένου πολυμορφισμού έχουν αυξήσει το ενδιαφέρον της μελέτης του, καθώς διαφαίνεται πως ίσως υπάρχει μια σύνδεση μεταξύ των διαφόρων γονοτύπων του γονιδίου και του μεγέθους της τοκετομάδας των χοιρομητέρων. Πιο συγκεκριμένα, οι Buske κ.α. (2005) αναφέρουν πως παρατήρησαν μια εμφανή συγκέντρωση των γονοτύπων ΒΒ μεταξύ δύο ομάδων χοιρομητέρων που είχαν διαχωριστεί σύμφωνα με τις αποδόσεις τους ως προς τα TNB και NBA και η διαφορά μεταξύ των δύο ομάδων βρέθηκε να είναι κοντά στο επίπεδο σημαντικότητας του 5%. Σε μία άλλη έρευνα βρέθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των αποδόσεων των χοιρομητέρων με διαφορετικούς γονοτύπους ως προς τα TNB και NBA στις πολύτοκες χοιρομητέρες, ενώ η διαφορά αυτή δεν ήταν στατιστικά σημαντική για τις πρωτόγεννες χοιρομητέρες (Chen κ.α., 2009). 71

74 Για τους παραπάνω λόγους, κρίνεται σημαντική η μελέτη του πολυμορφισμού του γονιδίου BF gene σε ελληνικούς πληθυσμούς χοιρομητέρων και ο πιθανός συσχετισμός του γονιδίου αυτού με αναπαραγωγικά χαρακτηριστικά και κυρίως με τα TNB και NBA των χοιρομητέρων που εκτρέφονται στη χώρα μας ΤΟ ΓΟΝΙΔΙΟ RBP4 Ένα άλλο υποψήφιο γονίδιο που σχετίζεται με διάφορα αναπαραγωγικά χαρακτηριστικά στους χοίρους είναι το γονίδιο RBP4. Το γονίδιο αυτό εκφράζεται κατά τη διάρκεια της ταχείας επιμήκυνσης της βλαστοκύστης των χοίρων (Yelich κ.α., 1997). Αυτή είναι μια σημαντική περίοδος για την επιβίωση του εμβρύου. Πιο συγκεκριμένα, οι Harney κ.α. (1993) έχουν βρει αυξημένα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου RBP4 στο ενδομήτριο των εγκύων χοιρομητέρων, μεταξύ των 10 και 12 ημερών της εγκυμοσύνης. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι αυτή η μεταφορική πρωτεΐνη της Βιταμίνης Α παίζει ένα σημαντικό ρόλο στη φυσιολογία της μήτρας και του εμβρύου κατά τη διάρκεια των πρώτων ημερών της εγκυμοσύνης. Επιπλέον, η πρωτεϊνη που κωδικοποιεί το συγκεκριμένο γονίδιο έχει βρεθεί πως είναι ένα προϊόν που εκκρίνεται σε μεγάλο βαθμό από το έμβρυο πριν την εμφύτευσή του στη μήτρα (Trout κ.α., 1991). Επομένως, το γονίδιο RBP4 ερευνήθηκε αρχικά ως ένα από τα υποψήφια γονίδια που σχετίζονται με το μέγεθος της τοκετομάδας κυρίως λόγω της πιθανής συμμετοχής του στην εμβρυική ανάπτυξη (Rothschild κ.α., 2000). Μία αρχική μελέτη που διενεργήθηκε σε χοιρομητέρες με υψηλά αναπαραγωγικά χαρακτηριστικά και σε άλλες χοιρομητέρες παρουσίασε μία εκτιμώμενη επίδραση του γονιδίου RBP4 κατά 0,4 χοιρίδια/τοκετό (Ollivier κ.α., 1997). Σε μία επόμενη έρευνα, οι Rothschild κ.α. (2000) έκαναν έλεγχο της πιθανότητας να βρεθεί μια τέτοια επίδραση σε εμπορικές γραμμές χοιρομητέρων. Τα αποτελέσματα αυτής της έρευνας έδειξαν ότι υπήρχε μια θετική επίδραση του γονιδίου κατά 0,23 χοιρίδια/τοκετό (p<0.05) για τα TNB και κατά 0,15 72

75 χοιρίδια/τοκετό για τα NBA υποδηλώνοντας ότι το γονίδιο RBP4 πιθανόν να επηρεάζει το μέγεθος της τοκετομάδας σε ορισμένες γραμμές χοίρων. Ωστόσο, κάποιες έρευνες που διενεργήθηκαν αργότερα σε άλλες εμπορικές γραμμές, αλλά και σε καθαρές φυλές, δεν παρουσίασαν παραπλήσια αποτελέσματα σε όλες τις περιπτώσεις. Ορισμένες φορές παρατηρούνταν η ίδια τάση αλλά τα αποτελέσματα δεν ήταν στατιστικά σημαντικά σε όλες τις κατηγορίες χοιρομητέρων (Wang κ.α., 2006) ή περιοριζόταν σε ορισμένους τοκετούς (Terman κ.α., 2007). Για τους παραπάνω λόγους, το συγκεκριμένο γονίδιο αποφασίστηκε να συμπεριληφθεί στον πειραματικό σχεδιασμό της συγκεκριμένης διδακτορικής έρευνας ΤΟ ΓΟΝΙΔΙΟ ESR2 Ένα ακόμη υποψήφιο γονίδιο που σχετίζεται με διάφορα αναπαραγωγικά χαρακτηριστικά των χοιρομητέρων είναι το γονίδιο ESR 2 (Estrogen Receptor 2). Το συγκεκριμένο γονίδιο αναφέρεται ότι σχετίζεται στενά με την ανάπτυξη των ωοθυλακίων αλλά και με την διαδικασία της προεμφύτευσης λόγω της υψηλής δέσμευσης που σχετίζονται με τα οιστρογόνα. Επίσης, ο πιθανός εμβρυοτροφικός ρόλος του γονιδίου ESR2, το κάνει έναν ισχυρό υποψήφιο που ίσως θα μπορούσε εν μέρει να εξηγήσει την παραλλακτικότητα των χοιρομητέρων όσων αφορά τα διάφορα αναπαραγωγικά τους χαρακτηριστικά. Το γονίδιο ESR2 έχει ήδη χαρακτηριστεί στον αρουραίο (Kuiper κ.α., 1997), στο ποντίκι (Tremblay κ.α., 1997), στον άνθρωπο (Mosselman κ.α., 1996) και αργότερα στον χοίρο (Kowalski κ.α., 2002) και δείχνει να έχει περιοχές που παραμένουν σταθερές. Παρόλα αυτά έχουν αναφερθεί και ορισμένα σημεία πολυμορφισμού (Munoz κ.α., 2004). Πιο συγκεκριμένα, μια μετάλλαξη (c.949g>a; p.317val>met) στο 73

76 εξώνιο 5 έχει αναφερθεί πως σχετίζεται με το μέγεθος τοκετομάδας των χοίρων (Buske κ.α., 2006), όμως παρατηρούνται διαφοροποιήσεις στα αποτελέσματα των συσχετίσεων των γονοτύπων του γονιδίου μεταξύ διαφορετικών πληθυσμών (Munoz κ.α., 2004, Munoz κ.α., 2007, Buske κ.α., 2006, Rembel κ.α., 2010). Η χοιροτροφική παραγωγή στην Ελλάδα χαρακτηρίζεται ως ένας από τους δυναμικούς κλάδους της αγροτικής οικονομίας, αν και αντιμετωπίζει κάποια προβλήματα λόγω των μειωμένων αποδόσεων των χοιρομητέρων σε σχέση με τον Ευρωπαϊκό μέσο όρο. Το γονίδιο ESR2 φαίνεται πως σχετίζεται με την απόδοση των χοιρομητέρων σε φυλές και γραμμές χοιρομητέρων που εκτρέφονται στο εξωτερικό. Για τον λόγο αυτό, επιλέχθηκε ώστε να μελετηθεί αν υπάρχει ο πολυμορφισμός του γονιδίου αυτού στις χοιρομητέρες που εκτρέφονται στην Ελλάδα και αν οι γονότυποι που αντιστοιχούν στον συγκεκριμένο πολυμορφισμό σχετίζονται με την αύξηση ή τη μείωση των αποδόσεων των χοιρομητέρων, καθώς μια τέτοια πληροφορία θα ήταν χρήσιμη σε μελλοντικά σχήματα βελτίωσης των χοιρομητέρων της Ελλάδας. 74

77 3. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΕΡΟΣ Α Στο συγκεκριμένο κεφάλαιο αναφέρονται τα υλικά και οι μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν για την διερεύνηση της έκφρασης δύο μεγάλων οικογενειών γονιδίων, των TLR και των β-defensins. Τα υλικά που χρησιμοποιήθηκαν για την διερεύνηση της έκφρασης των γονιδίων στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής έρευνας ήταν αναπαραγωγικά όργανα χοίρων, κοκκώδη κύτταρα χοίρων καθώς και έμβρυα χοίρων. Πιο συγκεκριμένα, πραγματοποιήθηκε: Α. Μελέτη της έκφρασης των γονιδίων που ανήκουν στις οικογένειες Toll-like receptors (TLR) και β-defensins στις παρακάτω κατηγορίες: 1. Αναπαραγωγικά όργανα αρσενικών χοίρων (όρχεις και επιδιδυμίδες) και θηλυκών χοίρων (ωοθήκες και ωαγωγοί). 2. Κοκκώδη κύτταρα από χοιρομητέρες. 3. Έμβρυα χοίρων παραγόμενα με in vitro γονιμοποίηση. Β. Ποσοτικοποίηση της έκφρασης των γονιδίων της οικογένειας TLR σε κοκκώδη κύτταρα χοίρων (προερχόμενα από μικρά και μεγάλα ωοθυλάκια) τα οποία έχουν καλλιεργηθεί παρουσία LPS για διαφορετικά χρονικά διαστήματα (0, 6, 12 και 24 ώρες) παρουσία ή μη του συστατικού LPS (Lipopolysaccharide). 75

78 3.1. Αντικείμενο εξέτασης Α. Αναπαραγωγικά Όργανα χοίρων Τα αναπαραγωγικά όργανα που χρησιμοποιήθηκαν για την έκφραση των γονιδίων προέρχονταν από δύο υγιή και αναπαραγωγικά ώριμα άτομα της φυλής Large-White που βρίσκονταν στον Ν. Φλώρινας. Οι χοίροι θανατώθηκαν στο τοπικό σφαγείο - ανατομείο, που ανήκει στο Τ.Ε.Ι. Δυτικής Μακεδονίας και βρίσκεται στις εγκαταστάσεις του Τ.Ε.Ι. στη Φλώρινα. Αμέσως μετά τη σφαγή, από την θηλυκή χοίρο αφαιρέθηκαν οι δύο ωοθήκες και οι δύο ωαγωγοί ενώ από τον αρσενικό χοίρο αφαιρέθηκαν οι όρχεις και οι επιδιδυμίδες. Τα όργανα συσκευάστηκαν άμεσα μέσα σε φύλλα αλουμινίου και κατά τη μεταφορά τους διατηρήθηκαν σε υγρό άζωτο (-196 C), ενώ στη συνέχεια αποθηκεύτηκαν στο Εργαστήριο σε βαθειά κατάψυξη (-80 C) μέχρι να αναλυθούν. Β. Κοκκώδη κύτταρα χοίρων Αρχικά έγινε συλλογή από ωοθήκες θηλυκών χοίρων, οι οποίες στη συνέχεια μεταφέρθηκαν στο εργαστήριο και από κάθε ωοθήκη αναρροφήθηκε το υγρό των μικρών (<3mm) και των μεγάλων (<3mm) ωοθυλακίων. Από το ωοθυλακικό υγρό απομονώθηκαν τα κοκκώδη (granulose) κύτταρα. Στη συνέχεια έγινε απομόνωση του RNA των κοκκωδών κυττάρων και το RNA έφτασε στο Εργαστήριο Φυσιολογίας Αναπαραγωγής Α.Ζ. στη Θεσσαλονίκη, αποθηκευμένο σε ξηρό πάγο. Στη συνέχεια έγινε σύνθεση cdna όπως περιγράφεται παρακάτω. Γ. Έμβρυα χοίρων Τα in vitro παραγόμενα έμβρυα χοίρων που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα διδακτορική έρευνα προμηθεύτηκαν από συνεργαζόμενο εργαστήριο. 76

79 3.2. Καλλιέργεια κοκκωδών κυττάρων με LPS Στο σημείο αυτό περιγράφεται η διαδικασία συλλογής των κοκκωδών κυττάρων και στη συνέχεια η καλλιέργειά τους με LPS. Στο Εργαστήριο έφτασε το RNA σε ξηρό πάγο, και εν συνεχεία ακολούθησε σύνθεση cdna όπως περιγράφεται σε ακόλουθο κεφάλαιο. Αρχικά έγινε συλλογή ωοθηκών από θηλυκά γουρούνια ηλικίας περίπου έξι μηνών. Από κάθε ωοθήκη αναρροφήθηκε το υγρό των μικρών (<3mm) και των μεγάλων (<3mm) ωοθυλακίων. Από το ωοθυλακικό υγρό απομονώθηκαν τα κοκκώδη (granulose) κύτταρα. Στη συνέχεια τα κύτταρα χωρίστηκαν ανά κύτταρα ανά well και καλλιεργήθηκαν σε DMEM-F12 σε συνθήκες διοξειδίου στους 37 C. Η καλλιέργεια ξεκίνησε στις Την επόμενη ημέρα και στις αντίστοιχες ώρες πραγματοποιήθηκαν οι παρακάτω εργασίες: 9.00 Προσθήκη 1 μg LPS/ml ή ανά κύτταρα (ώρα 0) Συλλογή κυττάρων από 6 wells χωρίς LPS και απομόνωση RNA (Τρία φιαλίδια eppendorf μ0-μικρά κύτταρα και τρία Μ0-μεγάλα) Συλλογή κυττάρων από 6 wells χωρίς LPS και απομόνωση RNA (ώρα 6) (Τρία φιαλίδια eppendorf μc6-μικρά κύτταρα και τρία ΜC6-μεγάλα) Συλλογή κυττάρων από 6 wells με LPS και απομόνωση RNA (Τρία φιαλίδια eppendorf μ6-μικρά κύτταρα και τρία Μ6-μεγάλα) Συλλογή κυττάρων από 6 wells χωρίς LPS και απομόνωση RNA (ώρα 12) (Τρία φιαλίδια eppendorf μc12-μικρά κύτταρα και τρία ΜC12-μεγάλα) Συλλογή κυττάρων από 6 wells με LPS και απομόνωση RNA (Τρία φιαλίδια eppendorf μ12-μικρά κύτταρα και τρία Μ12-μεγάλα) Μετά την παραμονή και των τελευταίων ομάδων κοκκωδών κυττάρων παρουσία LPS για 24 ώρες, ολοκληρώθηκε η διαδικασία καλλιέργειας την επόμενη ημέρα: 9.00 Συλλογή κυττάρων από 6 wells χωρίς LPS και απομόνωση RNA (ώρα 24) (Τρία φιαλίδια eppendorf μc24-μικρά κύτταρα και τρία ΜC24-μεγάλα) Συλλογή κυττάρων από 6 wells με LPS και απομόνωση RNA (Τρία φιαλίδια eppendorf μc24-μικρά κύτταρα και τρία ΜC24-μεγάλα) 77

80 3.3. Απομόνωση RNA Η απομόνωση RNA στο Εργαστήριο έγινε με τη χρήση του εμπορικού σκευάσματος TRI Reagent Nucleospin RNA II, Extraction Kit της εταιρίας Macherey Nagel, Γερμανίας. Τα βήματα για την απομόνωση του RNA απ όλους τους ιστούς πραγματοποιηθήκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή: ΒΗΜΑ 1 - Έγινε προετοιμασία και ζύγιση των δειγμάτων. Τα δείγματα αρχικά βρίσκονταν σε βαθειά κατάψυξη (-80 C). Με τη βοήθεια του υγρού αζώτου, και με μηχανική άλεση, μετατράπηκαν σε λεπτή σκόνη, από την οποία ζυγίστηκε συγκεκριμένη ποσότητα για την περαιτέρω διαδικασία της απομόνωσης. ΒΗΜΑ 2 - Επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 5 λεπτά ΒΗΜΑ 3 - Φυγοκέντρηση στις στροφές/λεπτό για 10 λεπτά και μεταφορά του εναιωρήματος σε νέο φιαλίδιο ΒΗΜΑ 4 - Προσθήκη 200 μl χλωροφόρμιο για κάθε ένα ml αντίδρασης ΒΗΜΑ 5 - Φυγοκέντρηση στις στροφές/λεπτό για 15 λεπτά ΒΗΜΑ 6 - Προσθήκη 500 μl ισοπροπανόλης για κάθε ένα ml αντίδρασης - Ανάδευση για 10 δευτερόλεπτα ΒΗΜΑ 7 - Φυγοκέντρηση στις στροφές/λεπτό για 8 λεπτά - Απομάκρυνση εναιωρήματος 78

81 ΒΗΜΑ 8 - Προσθήκη 1 ml αιθανόλης (75%) για κάθε ένα ml αντίδρασης ΒΗΜΑ 9 - Φυγοκέντρηση στις στροφές/λεπτό για 5 λεπτά - Αφαίρεση αιθανόλης - Γρήγορο στέγνωμα στον αέρα ΒΗΜΑ 10 - Διάλυση του RNA σε ρυθμιστικό διάλυμα Μετά από την απομόνωση του RNA, για κάθε δείγμα ακολουθήθηκε η εξής διαδικασία: 1. Έλεγχος της συγκέντρωσης και ποιότητας του δείγματος με συσκευή φωτομέτρησης BioPhotometer (Eppendorf), στα 260 και 280 nm. 2. Προσθήκη RNAse Inhibitor για να μην καταστραφεί το RNA (αποδόμηση) Χρησιμοποιήθηκε 1 unit / μg RNA λαμβάνοντας υπόψη ότι σε κάθε μl RNAse Inhibitor (Invitrogen) περιέχονται 40units 3. Έλεγχος για τυχόν ύπαρξη DNA στο δείγμα Εφαρμογή PCR σε δείγμα του RNA μαζί με Positive (σε DNA) και Negative Control. Η απουσία DNA επιβεβαιώνεται όταν κατά την ηλεκτροφόρηση σε gel αγαρόζης, εμφανιστεί φωτεινή ζώνη μόνο στο Positive Control. 4. Χειρισμός με DNAse Ο χειρισμός με DNAse γίνεται για να καταστραφεί τυχόν DNA μέσα στο δείγμα του RNA, κάνοντας χρήση του αντίστοιχου κιτ που παρέχεται από την εταιρία Fermentas, και ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή (1 U/μg of RNA). 79

82 3.4. Σύνθεση cdna Η διαδικασία σύνθεσης cdna χρησιμοποιείται για να γίνει μετατροπή του RNA σε cdna, με τη βοήθεια του οποίου θα γίνει η μελέτη της έκφρασης των γονιδίων στους διάφορους ιστούς από τους οποίους έχουν προέλθει τα δείγματα του RNA. Η συγκεκριμένη μετατροπή ονομάζεται αντίστροφη μεταγραφή και είναι απαραίτητη καθώς το μονόκλονο RNA δεν είναι κατάλληλο για χρήση σε PCR, σε αντίθεση με το δίκλονο cdna που δημιουργείται. Για όλα τα δείγματα RNA χρησιμοποιήθηκε η μεθοδολογία που περιγράφετε στο αντίστοιχο εμπορικό σκεύασμα της εταιρίας Bioline. Παρακάτω βρίσκονται οι συνθήκες λειτουργίας του κιτ. Σύνθεση cdna (BIOLINE) RNA 10,5 μl ( 3 μg) Θερμοκρασία και χρόνος παραμονής Rand.Hex 4 μl 25 C για 10 min dntps 1 μl 42 C για 60 min 5x buffer 4 μl 70 C για 10 min H2O - R.T. 0,5 μl Σύνολο 20 μl cdna Στο τέλος της διαδικασίας γίνεται έλεγχος της ποιότητας του cdna και αν περιέχει DNA. Για τις ανάγκες της συγκεκριμένης διατριβής χρησιμοποιήθηκε ένα γονίδιο αναφορά που βρέθηκε ότι περιέχει εσώνια. Συγκεκριμένα, χρησιμοποιήθηκε το γονίδιο β-actin με θετικό και αρνητικό μάρτυρα (Οι ποσότητες που χρησιμοποιήθηκαν είναι όμοιες με αυτές που αναφέρονται στη σελίδα 82. Οι συνθήκες είναι 94 C για 5 λεπτά, 35 κύκλοι αποτελούμενοι από 94 C, 58 C και 72 C για 30 δευτερόλεπτα κάθε ένα από τα τρία βήματα και 72 C για 10 λεπτά). Τα γονίδια αναφοράς εκφράζονται σε όλους τους ιστούς, και για τον λόγο αυτό αναμένεται να εμφανιστεί μία φωτεινή ζώνη σε όλα τα δείγματα, εκτός από το Negative Control. Παράλληλα, η χρήση ενός τέτοιου γονιδίου, που τυγχάνει να περιέχει κάποιο intron, μας δίνει τη δυνατότητα να εντοπίσουμε διαφορά στο μήκος της φωτεινής ζώνης σε περίπτωση που μέσα στο δείγμα βρίσκεται και DNA, οπότε θα εμφανίζεται και μια φωτεινή ζώνη στο ίδιο μήκος με αυτό που βρίσκεται και το Positive Control. 80

83 3.5. Σχεδιασμός εκκινητών και Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης Ο σχεδιασμός των εκκινητών για όλα τα γονίδια που έλαβαν μέρος στην παρούσα διδακτορική έρευνα έγινε με τη βοήθεια του λογισμικού Primer 3 το οποίο διατίθεται στο διαδίκτυο χωρίς χρέωση (Λογισμικό Ανοιχτού Κώδικα). Για κάθε μία αντίδραση PCR που πραγματοποιήθηκε σε όλα τα δείγματα και για όλα τα γονίδια που έλαβαν μέρος στην παρούσα διδακτορική διατριβή, σε κάθε φιαλίδιο προστέθηκαν τα παρακάτω συστατικά: 1 μl cdna 200nM από κάθε εκκινητή 1 mm dntps 1 unit Taq ανασυνδυασμένη DNA πολυμεράση (Invitrogen) και H 2 O μέχρι την διαμόρφωση τελικού όγκου 25 μl Στον Πίν. 5 παρουσιάζονται όλα τα γονίδια που ελέγχθηκαν στην παρούσα διδακτορική έρευνα, καθώς επίσης οι αλληλουχίες των εκκινητών, η θερμοκρασία και οι κύκλοι που χρησιμοποιήθηκαν στην PCR, το αναμενόμενο μέγεθος των ενισχυμένων τμημάτων καθώς επίσης και η ονομασία με την οποία αναφέρεται το κάθε γονίδιο στην Genebank. 81

84 Πίν. 5: Όνομα γονιδίου, αλληλουχία γονιδίου (5-3 ), θερμοκρασία PCR ( C), μέγεθος ενισχυμένου τμήματος γονιδίου, GenBank accession number, για τα γονίδια των οικογενειών TLR και BD. Γονίδιο Αλληλουχία εκκινητών θ C αρ. κύκλων Μέγεθος τμήματος GenBank TLR1 TLR2 TLR3 TLR4 TLR5 TLR6 TLR7 TLR8 TLR9 5 -GTCAGTCAGCACCGCAGTAA-3 5 -CAGACAAACTGGAGGGTGGT-3 5 -TCTGTCTTGTGACCCTGCTG-3 5 -AGCTCTGAGGTTCACGCATT-3 5 -ATTGGGCAAGAACTCACAGG-3 5 -CAAGGCGAAAGAGTCGGTAG-3 5 -GTTGTCTTCCGTGGCATTTT-3 5 -AAGCCTAGGGAGGGAATGAA-3 5 -CTGGAAGCCTTCAGTTACGC-3 5 -TGTTGAGAAACCAGCTGACG-3 5 -GAAGCCCTGCCCATATGTAA TTCCAAATCCAGAAGGATGC-3 5 -CCTTCTTCCTCCTTGCCTCT GGCTGAAATTCACTGCCATT-3 5 -GCAAAGACCACCACCAACTT-3 5 -ATCCGTCAGTCTGGGAATTG-3 5 -GAACTGCAACTGGCTCTTCC-3 5 -TGGACGAAGTCAGAGTCGTG-3 56 C bp NM_ C bp AB C bp DQ C bp AB C bp NM_ C bp NM_ C bp NM_ C bp AB C bp AB TLR10 5 -GTCTCCCAATTTCGTCCAGA-3 5 -TGAGAGCTTTCAGTGCAGGA-3 57 C bp NM_ BD1 BD3 BD4 5 -ACCGCCTCCTCCTTGTATTC-3 5 -GGTGCCGATCTGTTTCATCT-3 5 -TTGTTCCTGATGCCTCTTCC-3 5 -ATTTTCGGCCACTCACAGAA-3 5 -CCGTGAGGGTGAAATTAGGA-3 5 -GATACACAGGCCTGGAAGGA-3 56 C bp NM_ C bp AY C bp AY BD CCAAGGATCATGCAGAAAGA-3 5 -TAAGGGAGGAGAGGCTGACA-3 BD TTCTCCCAAGGTCCTTTTCA-3 5 -TAGACCTCGCAATTCCCATC-3 BD ATTCTTGGCCCTACCCTGTT-3 5 -TCCTGGTCCCCCTAATATCC-3 BD CCACTACCTCCCGAAGATCA TTGCTGTCCCCTCAATATCC-3 BD CGCCATCAAAATATCGTCCT GTGTGCTCCTTCTGGAGGTC-3 58 C bp DQ C bp NM_ C bp BK C bp NM_ C bp NM_ β- Actin 5 - GCCCTGGACTTTGAAAATGA CCTGATGTCAATGTCGCACT-3 58 C bp EU

85 3.6. PCR πραγματικού χρόνου (Real-time PCR) Η αντίδραση PCR πραγματικού χρόνου είναι μια μέθοδος που ενισχύει ακολουθίες DNA λογαριθμικά και τις προσδιορίζει ποσοτικά. Η παρακολούθηση της πορείας της αντίδρασης είναι ορατή καθόλη τη διάρκεια της και για τον λόγο αυτό ονομάζεται PCR πραγματικού χρόνου. Σε αντίθεση με την συμβατική PCR, γίνεται ανίχνευση της αύξησης φθορισμού που αντιστοιχεί στη σύνθεση του νέου προϊόντος, ενώ στο τέλος γίνεται ποσοτικοποίηση του προϊόντος της αντίδρασης και δεν είναι απαραίτητη η ηλεκτροφόρηση του τελικού προϊόντος σε πηκτή αγαρόζης. Τα αποτελέσματα εκφράζονται σε συσχέτιση με την ένταση της έκφρασης ενός άλλου γνωστού γονιδίου αναφοράς. Για τις ανάγκες τις συγκεκριμένης διατριβής χρησιμοποιήθηκε η συσκευή LightCycler της εταιρίας Roche Molecular Biochemicals Στατιστική ανάλυση Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης των γονιδίων της οικογένειας TLR και των γονιδίων της οικογένειας β-defensins προσδιορίστηκαν με το λογισμικό ScionImage software v Το πρόγραμμα μετράει την ένταση-φωτεινότητα της παρατηρούμενης ζώνης σε καθαρό αριθμό. Η σχετική έκφραση κάθε υπό εξέταση γονιδίου προσδιορίστηκε ως: ένταση φωτεινότητας παρατηρούμενης ζώνης του υπό εξέταση γονιδίου/ ένταση φωτεινότητας παρατηρούμενης ζώνης του γονιδίου αναφοράς. Ο μέσος όρος και το τυπικό σφάλμα υπολογίστηκαν για όλα τα δεδομένα. Οι στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των επιπέδων έκφρασης υπολογίστηκαν με την ανάλυση student t-test του λογισμικού SPSS v. 16. Όλα τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα. Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης των γονιδίων της οικογένειας TLR που αφορούν την έκφραση των γονιδίων στα κοκκώδη κύτταρα παρουσία LPS υπολογίστηκαν ως ο μέσος όρος των τριών επαναλήψεων της εφαρμογής της τεχνικής real-time PCR σε όλα τα δείγματα που μελετήθηκαν. 83

86 ΜΕΡΟΣ Β Μετά από εκτενή βιβλιογραφική ανασκόπηση σε γονίδια που σχετίζονται με αναπαραγωγικά χαρακτηριστικά στους χοίρους, έγινε συγκριτική μελέτη των υποψηφίων γονιδίων και επιλέχθηκαν τα γονίδια που θα χρησιμοποιηθούν στη συγκεκριμένη διδακτορική έρευνα. Η τεχνική που εφαρμόστηκε για την διερεύνηση των συγκεκριμένων μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών (SNPs) ονομάζεται PCR RFLP (Polymerase Chain Reaction Restriction Fragment Length Polymorphism). Συνολικά μελετήθηκαν τρία γονίδια που σχετίζονται με αναπαραγωγικά χαρακτηριστικά σε χοίρους: - Γονίδιο BF, - γονίδιο RBP4 και - γονίδιο ESR2. Η έρευνα πραγματοποιήθηκε σε τρεις εμπορικές χοιροτροφικές μονάδες. Συνολικά μελετήθηκαν 420 χοιρομητέρες. Οι 400 προέρχονταν από μεγάλες εμπορικές μονάδες και ήταν διασταυρώσεις των φυλών Landrace/Large White ενώ τα αρσενικά Duroc/Pietrain/Landrace/Large White σε διάφορες αναλογίες. Στην πρώτη μονάδα έγινε εξαγωγή DNA σε 120 χοιρομητέρες και σε 8 αρσενικούς χοίρους ενώ στη δεύτερη μονάδα έγινε εξαγωγή DNA σε 280 χοιρομητέρες και σε 8 αρσενικούς χοίρους. Οι υπόλοιπες 20 χοιρομητέρες προέρχονταν από μια εκτατική μονάδα χοίρων και οι χοιρομητέρες ήταν της ελληνικής αυτόχθονης φυλής (μαύρα) ή διασταυρώσεις τους με αγριόχοιρους των ορεινών περιοχών της Μακεδονίας. 84

87 ΑΝΑΠΑΡΑΓΩΓΙΚΕΣ ΠΑΡΑΜΕΤΡΟΙ ΧΟΙΡΟΜΗΤΕΡΩΝ Για τον παραπάνω αριθμό δειγμάτων είχαν συλλεχθεί πληροφορίες που αφορούν τις παρακάτω αναπαραγωγικές παραμέτρους: TNB Συνολικά γεννηθέντα χοιρίδια / τοκετό Στα Συνολικά γεννηθέντα χοιρίδια / τοκετό συμπεριλαμβάνονται όλα τα χοιρίδια που παραλαμβάνονται από μία χοιρομητέρα σε έναν τοκετό, δηλαδή το σύνολο της τοκετομάδας και περιλαμβάνει τα χοιρίδια που γεννήθηκαν ζωντανά, τα χοιρίδια που γεννήθηκαν νεκρά και τα χοιρίδια που γεννήθηκαν μουμιοποιημένα. NBA Γεννηθέντα ζωντανά χοιρίδια / τοκετό Στα Γεννηθέντα ζωντανά χοιρίδια / τοκετό προσμετρούνται ανά χοιρομητέρα και ανά τοκετό μόνο τα χοιρίδια που γεννήθηκαν ζωντανά και δεν συμπεριλαμβάνονται τα νεκρά και τα μουμιοποιημένα χοιρίδια NBD Γεννηθέντα νεκρά χοιρίδια / τοκετό Στα Γεννηθέντα νεκρά χοιρίδια / τοκετό προσμετρούνται ανά χοιρομητέρα και ανά τοκετό μόνο τα χοιρίδια που είναι γεννημένα νεκρά κατά την ώρα του τοκετού και δεν συμπεριλαμβάνονται τα μουμιοποιημένα. NBM Γεννηθέντα μουμιοποιημένα χοιρίδια / τοκετό Στα Γεννηθέντα μουμιοποιημένα χοιρίδια / τοκετό προσμετρούνται ανά χοιρομητέρα και ανά τοκετό μόνο τα χοιρίδια που είναι μουμιοποιημένα. Τα συγκεκριμένα χοιρίδια είναι αυτά που είχαν πρόωρο εμβρυικό θάνατο και παρέμειναν στη μήτρα χωρίς να προκαλέσουν αποβολή. NW - Απογαλακτισθέντα χοιρίδια / τοκετομάδα Στα Απογαλακτισθέντα χοιρίδια / τοκετομάδα συμπεριλαμβάνονται τα χοιρίδια που κατάφεραν να απογαλακτισθούν από κάθε χοιρομητέρα, μετά από μια περίοδο παραμονής με την μητέρα τους η οποία κυμαίνεται γύρω στις 40 ημέρες. 85

88 Συλλέχθηκαν επίσης και τα παρακάτω δεδομένα που περιγράφουν την αναπαραγωγική ικανότητα κάθε χοιρομητέρας: Πλήθος αποβολών ανά χοιρομητέρα Ημερομηνία εισαγωγής κάθε χοιρομητέρας στην αναπαραγωγή Ηλικία χοιρομητέρας ανά τοκετό, Ημερομηνία τοκετών για κάθε χοιρομητέρα Στη συνέχεια αναφέρονται συνοπτικά ορισμένες πληροφορίες που σχετίζονται με τις τρείς χοιροτροφικές μονάδες στις οποίες έγινε δειγματοληψία, για τις ανάγκες τις παρούσας διδακτορικής έρευνας: - Μονάδα Μπατάλα - Μονάδα Γκασνάκη - Μονάδα Δαρμάρη 86

89 Μονάδα Μπατάλα Εικ. 3: Κάτοψη της Μονάδας Μπατάλα Η συγκεκριμένη μονάδα βρίσκεται στον Νομό Πιερίας. Εκτρέφει περίπου 730 χοιρομητέρες (διασταύρωση μεταξύ Large White x Landrace) και από αυτές επιλέχτηκαν οι 120. Η επιλογή ήταν τυχαία, όμως οι 85 από αυτές ήταν κόρες από 4 συγκεκριμένους αρσενικούς, κι αυτό καθώς θεωρήθηκε πως θα ήταν καλύτερο για να παραμείνει η γενετική ποικιλότητα των χοιρομητέρων σε χαμηλά επίπεδα, ούτως ώστε να περιοριστεί η επίδραση του πατέρα στο μέγεθος της τοκετομάδας. Ο πρώτος τοκετός όλων των χοιρομητέρων ήταν στην ηλικία των 12 μηνών. Επίσης όλες οι χοιρομητέρες είχαν τουλάχιστον 5 γέννες. Όλες οι χοιρομητέρες γονιμοποιούνται με Τεχνητή Σπερματέγχυση με σταθερή ποσότητα φρέσκου σπέρματος που προέρχεται από αρσενικά των διασταυρώσεων Duroc x Pietrain. Οι συνθήκες διατροφής και σταυλισμού παραμένουν σταθερές για όλες τις χοιρομητέρες. Τα αναπαραγωγικά χαρακτηριστικά των χοιρομητέρων καταγράφονται συστηματικά σε ατομικές καρτέλες των χοιρομητέρων και διαμορφώνουν μια βάση δεδομένων σε εξειδικευμένο πρόγραμμα ηλεκτρονικών υπολογιστών. Η διάρκεια συλλογής των δεδομένων που χρησιμοποιήθηκαν για τους πειραματισμούς ξεπερνούσε τα 3 χρόνια. Επίσης έγινε ανάλυση του DNA όλων των αρσενικών που βρίσκονταν στην μονάδα. 87

90 Μονάδα Γκασνάκη Εικ. 4: Κάτοψη της Μονάδας Γκασνάκη Η συγκεκριμένη μονάδα βρίσκεται στον Νομό Ημαθίας και εκτρέφει περίπου 700 χοιρομητέρες (διασταύρωση μεταξύ Large White x Landrace) εκ των οποίων για τις ανάγκες των πειραματισμών επιλέχτηκαν με τυχαία επιλογή 280. Ο πρώτος τοκετός όλων των χοιρομητέρων είναι περίπου στην ηλικία των 12 μηνών. Επίσης όλες οι χοιρομητέρες που συμμετείχαν στους πειραματισμούς είχαν τουλάχιστον 5 γέννες. Όλες οι χοιρομητέρες γονιμοποιούνται με Τεχνητή Σπερματέγχυση με σταθερή ποσότητα φρέσκου σπέρματος που προέρχεται από διασταυρωμένα αρσενικά εισαγωγής από το εξωτερικό (Duroc x Pietrain / Landrace). Οι συνθήκες διατροφής και σταυλισμού παραμένουν σταθερές για όλες τις χοιρομητέρες. Τα αναπαραγωγικά χαρακτηριστικά των χοιρομητέρων καταγράφονται συστηματικά και διαμορφώνουν μια βάση δεδομένων σε εξειδικευμένο πρόγραμμα ηλεκτρονικών υπολογιστών. Η διάρκεια συλλογής των δεδομένων που χρησιμοποιήθηκαν για τους πειραματισμούς ξεπερνούσε τα 3 χρόνια. Επίσης στη συγκεκριμένη μονάδα έγινε ανάλυση του DNA των πιο συχνά χρησιμοποιούμενων για γονιμοποίηση αρσενικών. 88

91 Μονάδα Δαρμάρη Εικ. 5: Κάτοψη της Μονάδας Δαρμάρη Η συγκεκριμένη μονάδα βρίσκεται σε μία ορεινή περιοχή, κοντά στο χωριό Στεφανινά του Νομού Θεσσαλονίκης όπου εκτρέφονται χοιρομητέρες της ντόπιας ελληνικής φυλής (μαύρα) όπως επίσης και διασταυρώσεις μαύρων θηλυκών με αγριόχοιρους της περιοχής. Η χοιροτροφική μονάδα είναι καθαρά εκτατικής μορφής και οι διατροφή των χοίρων βασίζεται στην βόσκηση και στην καθημερινή συμπλήρωση της διατροφής με αλεσμένους και μη δημητριακούς καρπούς μεταξύ των οποίων αραβόσιτος, κριθάρι, σιτάρι και πίτυρα. Παρόλα αυτά, τα τελευταία χρόνια έχει δημιουργηθεί ένας περιορισμένος χώρος στον οποίο γίνονται οι τοκετοί των χοιρομητέρων και στο ατομικό κελί κάθε μιας φυλάσσονται τα νεογέννητα μέχρι τον απογαλακτισμό τους. Η επιχείρηση περιλαμβάνει συνολικά γύρω στις 50 χοιρομητέρες. Η γονιμοποίησή των χοιρομητέρων γίνεται από αρσενικούς αγριόχοιρους που βρίσκονται ελεύθεροι στην ευρύτερη δασική έκταση, ενώ καθίσταται σαφές πως δεν υπάρχουν περεταίρω πληροφορίες γι αυτούς. Στον πειραματικό σχεδιασμό για της ανάγκες της συγκεκριμένης διδακτορικής διατριβής χρησιμοποιήθηκαν συνολικά 20 χοιρομητέρες, οι οποίες επιλέχτηκαν τυχαία. Όλες οι χοιρομητέρες βρίσκονταν κάτω από τις ίδιες συνθήκες διατροφής και σταυλισμού. Τα παραγωγικά τους δεδομένα παρακολουθούνται από τους ιδιοκτήτες της μονάδας και τα βιβλία της μονάδας ενημερώνονται συστηματικά. 89

92 Προσδιορισμός γονότυπου με την τεχνική PCR-RFLP Η PCR-RFLP είναι μια δημοφιλής τεχνική που χρησιμοποιείται ευρέως στη διερεύνηση των πολυμορφισμών σε διάφορα γονίδια. Σε μία ανάλυση PCR-RFLP, αρχικά γίνεται η ενίσχυση ενός τμήματος από το DNA και στη συνέχεια ακολουθεί περαιτέρω επεξεργασία του ενισχυμένου τμήματος με το κατάλληλο ένζυμο περιορισμού. Η ανάλυση PCR-RFLP περιλαμβάνει διάφορα στάδια μεταξύ των οποίων: την ενίσχυση του τμήματος με τη μετάλλαξη μέσω της PCR, την επώαση των ενισχυμένων τμημάτων με το ένζυμο περιορισμού την ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης ώστε να εμφανιστούν τα τμήματα που θα προκύψουν. Παρακάτω γίνεται λεπτομερής επεξήγηση της απομόνωσης DNA, που είναι απαραίτητο για την εφαρμογή της τεχνικής PCR και στη συνέχεια δίνεται η μεθοδολογία της ενίσχυσης του τμήματος με την μετάλλαξη (PCR) και η πέψη του (επώαση με ένζυμο περιορισμού) Η ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΤΟΥ DNA Το DNA προήλθε από αίμα ή τρίχες χοιρομητέρων και στη συνέχεια ακολουθήθηκε η μέθοδος Polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism (PRC-RFLP). Η εξαγωγή DNA έγινε με το Nucleospin blood or tissue kits (Macherey- Nagel, Germany). Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε ηλεκτροφόρηση για τον έλεγχο του DNA και ακολούθησε PCR με τις ακόλουθες συνθήκες: Περίπου 150 ng γενωμικού DNA ενισχύθηκαν σε αντίδραση τελικού όγκου 25 μl που περιείχε 200 nm από κάθε εκκινητή, 1mM dntps και 1 unit MyTaq DNA πολυμεράση (Bioline). 90

93 ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ DNA ΑΠΟ ΤΡΙΧΕΣ Για την απομόνωση του DNA από τι τρίχες των χοίρων χρησιμοποιήθηκαν τα εμπορικά κιτ απομόνωσης Genomic DNA from Tissue, της εταιρίας Macherey-Nagel. Τα Lysis Buffer (Τ1 και Β3) είναι ρυθμιστικά διαλύματα απαραίτητα για την επώαση των δειγμάτων με την Proteinase K ενώ τα Wash Buffer (BW και B5) είναι ρυθμιστικά διαλύματα απαραίτητα για τον καθαρισμό του DNA από τα υπόλοιπα συστατικά των κυττάρων, κατά τη φυγοκέντρηση των δειγμάτων. Το Elution Buffer είναι ρυθμιστικό διάλυμα για την αραίωση του DNA κατά το τελευταίο βήμα της απομόνωσης. Πριν την έναρξη της διαδικασίας απομόνωσης πραγματοποιούνταν η προετοιμασία των ρυθμιστικών διαλυμάτων Β3 και Β5, καθώς και της Proteinase Κ, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Όλα τα συστατικά που χρησιμοποιήθηκαν για την προετοιμασία των ρυθμιστικών διαλυμάτων περιλαμβάνονται στο κιτ, με εξαίρεση την αιθανόλη (absolute ethanol) που προστίθεται στο ρυθμιστικό διάλυμα Β5 και έχει προμηθευτεί από το εμπόριο. BHMA 1 Προετοιμασία δείγματος - Κόβονται με χειρουργικό ψαλίδι, απευθείας μέσα σε αποστειρωμένο φιαλίδιο χωρητικότητας 1,5 ml (τύπου Eppendorf), 100 ρίζες από τις τρίχες κάθε χοιρομητέρας. ΒΗΜΑ 2 Πρό-λυση - Προστίθενται 180 μl ρυθμιστικού διαλύματος Τ1 και στη συνέχεια 25μl Proteinase K (συγκέντρωσης 22mg/ml) - Τα δείγματα αναδεύονται με ανακίνηση σε αναδευτήρα τύπου Vortex - Στη συνέχεια τοποθετούνται σε κλίβανο για επώαση στους 56 C, για όλη τη διάρκεια της νύχτας (περίπου 12 ώρες) με συνεχή ανάδευση. 91

94 (Οι οδηγίες χρήσης αναφέρουν πως πριν την προσθήκη της Proteinase K, τα δείγματα μεταφέρονται διαδοχικά 4 φορές από τους 56 C σε υγρό άζωτο και στη συνέχεια γίνεται η προσθήκη της Proteinase K. Επιλέξαμε την αποφυγή αυτής της μεταχείρισης καθώς σε δοκιμαστικό πειραματισμό δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στην απομόνωση του DNA μεταξύ δειγμάτων που υπέστησαν την παραπάνω διαδικασία και δειγμάτων που διαχειρίστηκαν χωρίς υγρό άζωτο) ΒΗΜΑ 3 - Λύση - Μετά το πέρας της επώασης, τα δείγματα αναδεύονται στη συσκευή Vortex - Στη συνέχεια προστίθενται 200 μl ρυθμιστικού διαλύματος Β3 και ακολουθεί έντονη ανάδευση - Τα δείγματα επωάζονται στους 70 C για 30 λεπτά. (Παρατηρήθηκε πως τα 10 λεπτά που αναφέρονται στις οδηγίες χρήσης του κιτ δεν ήταν αρκετά ώστε να διαλυθούν οι τρίχες των χοιρομητέρων σε ικανοποιητικό βαθμό). - Στη συνέχεια γίνεται φυγοκέντρηση των δειγμάτων για 5 λεπτά στις x g στροφές ανά λεπτό (περίπου rpm) και το περιεχόμενο χωρίς το ίζημα (τρίχες) μεταφέρεται σε νέα φιαλίδια των 1,5 ml τύπου Eppendorf BHMA 4 - Ρύθμιση του DNA binding conditions - Στη συνέχεια προστίθενται 210 μl απόλυτης αιθανόλης (96 100%) και γίνεται έντονη ανάδευση Vortex ΒΗΜΑ 5 Δέσμευση DNA - Μεταφέρεται όλο το διάλυμα κάθε δείγματος στα αντίστοιχα φίλτρα που παρέχονται από το κιτ (Nucleospin Tissue Column) και υφίστανται φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στις rpm - Απομακρύνεται το περιεχόμενο που πέρασε από το φίλτρο και τα φίλτρα τοποθετούνται στη θέση τους ΒΗΜΑ 6 1 η πλύση 92

95 - Τοποθετούνται στο φίλτρο 500 μl ρυθμιστικού διαλύματος BW και ακολουθεί φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στις rpm - Απομακρύνεται το περιεχόμενο που πέρασε από το φίλτρο και τα φίλτρα τοποθετούνται στη θέση τους 2 η πλύση - Τοποθετούνται στο φίλτρο 600 μl ρυθμιστικού διαλύματος Β5 και ακολουθεί φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στις rpm - Απομακρύνεται το περιεχόμενο που πέρασε από το φίλτρο και τα φίλτρα τοποθετούνται στη θέση τους ΒΗΜΑ 7 Απομάκρυνση αιθανόλης - Χωρίς την προσθήκη κάποιου άλλου συστατικού, τα δείγματα επανατοποθετούνται για φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στις rpm για να διασφαλιστεί η πλήρης απομάκρυνση της αιθανόλης ΒΗΜΑ 8 Απομόνωση DNA - Στη συνέχεια τα φίλτρα τοποθετούνται μέσα σε αποστειρωμένα φιαλίδια των 1,5 μl (τύπου Eppendorf) - Τοποθετούνται 60 μl ρυθμιστικού διαλύματος BE που έχει προθερμανθεί στους 70 C - Ακολουθεί επώαση των δειγμάτων σε θερμοκρασία δωματίου για 3 λεπτά και φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στις rpm - Επαναλαμβάνεται η προηγούμενη διαδικασία με άλλα 60 μl ρυθμιστικού διαλύματος ΒΕ και στο τέλος έχουμε 120 μl DNA μέσα στο tube. Buffer BE: Ρυθμιστικό διάλυμα διάλυσης (5mM Tris/HCl, ph 8,5) (Στις οδηγίες χρήσης του κιτ αναφέρεται η προσθήκη 100 μl ρυθμιστικού διαλύματος ΒΕ, επώαση για 1 λεπτό σε θερμοκρασία δωματίου και μια φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στις rpm. Όμως παρατηρήθηκε πως αυτή η μεθοδολογία δεν ήταν ικανοποιητική, έτσι υιοθετήθηκε η μεθοδολογία που περιγράφετε στο Βήμα 8). 93

96 ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΗΣ ΕΠΙΤΥΧΙΑΣ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗΣ DNA Ο έλεγχος της επιτυχίας απομόνωσης DNA γίνεται σε δύο στάδια, εκ των οποίων στο πρώτο γίνεται έλεγχος της καθαρότητας και της ακεραιότητας του DNA 1 ος έλεγχος: Έλεγχος με φασματοφωτόμετρο O έλεγχος της επιτυχίας απομόνωσης του γενωμικού DNA με προσδιορισμό της συγκέντρωσης του DNA γίνεται με τη συσκευή φωτομέτρησης (φασματοφωτόμετρο). 2 ος έλεγχος: Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης O έλεγχος της επιτυχίας απομόνωσης του DNA με ηλεκτροφόρηση γίνεται σε πηκτή αγαρόζης συγκέντρωσης 1 % με σκοπό να διαπιστωθεί το υψηλό μοριακό βάρος, η καθαρότητα (Καθαρές ζώνες χωρίς ύπαρξη πρωτεϊνών) και η ακεραιότητα του. Η τεχνική αυτή περιγράφετε αναλυτικά στο Κεφάλαιο 5. 94

97 Το γονίδιο BF To GenBank Accession number του γονιδίου BF gene είναι: M59240 Η αλληλουχία των εκκινητών του γονιδίου BF gene είναι (Buske κ.α., 2006): 5 -ACTGCTATGACGGTTACACTCTCCG-3 5 -TCCAAGAGCCACCTTCCTGG-3 Στον Πίν. 6 παρουσιάζονται οι συνθήκες της τεχνικής PCR για την ενίσχυση του γονιδίου BF, και στον Πίν. 7 εμφανίζονται οι συνθήκες για την πέψη των προϊόντων της PCR. Πίν. 6: Συνθήκες για την ενίσχυση του γονιδίου BF gene με την PCR. Βήματα Θ και διάρκεια Αριθμός κύκλων Αρχική αποδιάταξη Αποδιάταξη Προσαρμογή εκκινητών Επιμήκυνση Τελική επιμήκυνση 95 C για 5 min 95 C για 30s 55 C για 30s 72 C για 45s 72 C για 10 min 35 κύκλοι Πίν. 7: Συνθήκες για την πέψη των προϊόντων της PCR για το γονίδιο BF gene Αντιδραστήριο Προϊόν PCR (390 bp) Ένζυμο SmaI (Takara) Ρυθμιστικό διάλυμα BSA Συνολικός όγκος αντίδρασης Διάρκεια της πέψης Ποσότητα 10 μl ( 1 μg) 10 U 2 μl 2 μl 20 μl Όλη νύχτα Η ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της πέψης έγινε σε gel αγαρόζης 2.5% με ρυθμιστικό διάλυμα 1x TBΕ. Το gel περιείχε βρωμιούχο αιθίδιο και φωτογραφήθηκε σε συσκευή εκπομπής υπεριώδους ακτινοβολίας UV. 95

98 Το γονίδιο RBP4 To GenBank Accession number του γονιδίου RBP4 gene είναι: GU Η αλληλουχία των εκκινητών του γονιδίου RBP4 gene είναι (Rothschild κ.α., 2000): 5 -GAGCAAGATGGAATGGGTT-3 5 -CTCGGTGTCTGTAAAGGTG-3. Στον Πίν. 9 παρουσιάζονται οι συνθήκες της τεχνικής PCR για την ενίσχυση του γονιδίου RBP4, και στον Πίν. 10 εμφανίζονται οι συνθήκες για την πέψη των προϊόντων της PCR. Πίν. 8: Συνθήκες για την ενίσχυση του γονιδίου RBP4 με την PCR. Βήματα Θ και διάρκεια Αριθμός κύκλων Αρχική αποδιάταξη Αποδιάταξη Προσαρμογή εκκινητών Επιμήκυνση Τελική επιμήκυνση 95 C για 5 min 95 C για 30s 56 C για 30s 72 C για 45s 72 C για 10 min 30 κύκλοι Πίν. 9: Συνθήκες για την πέψη των προϊόντων της PCR για το γονίδιο RBP4 gene Αντιδραστήριο Προϊόν PCR (550 bp) Ένζυμο MspI (Takara) Ρυθμιστικό διάλυμα BSA Συνολικός όγκος αντίδρασης Διάρκεια της πέψης Ποσότητα 10 μl ( 1 μg) 10 U 2 μl 2 μl 20 μl 3 ώρες Η ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της πέψης έγινε σε gel αγαρόζης 2.5% με ρυθμιστικό διάλυμα 1x TBE. Το gel περιείχε βρωμιούχο αιθίδιο και φωτογραφήθηκε σε συσκευή εκπομπής υπεριώδους ακτινοβολίας UV. 96

99 Το γονίδιο ESR2 To GenBank Accession number του γονιδίου ESR2 gene είναι: AF Η αλληλουχία των εκκινητών του γονιδίου ESR2 gene είναι (Munoz κ.α., 2004): 5 -AAAATACTGATACCCACCCCACAT-3 5 -CGCCACATCAGCCCCACCAT-3 Στον Πίν. 12 παρουσιάζονται οι συνθήκες της τεχνικής PCR για την ενίσχυση του γονιδίου BF, και στον Πίν. 13 εμφανίζονται οι συνθήκες για την πέψη των προϊόντων της PCR. Πίν. 10: Συνθήκες για την ενίσχυση του γονιδίου ESR2 gene με την PCR. Βήματα Θ και διάρκεια Αριθμός κύκλων Αρχική αποδιάταξη Αποδιάταξη Προσαρμογή εκκινητών Επιμήκυνση Τελική επιμήκυνση 95 C για 5 min 95 C για 30s 56 C για 30s 72 C για 45s 72 C για 10 min 30 κύκλοι Πίν. 11: Συνθήκες για την πέψη των προϊόντων της PCR για το γονίδιο ESR2 gene Αντιδραστήριο Προϊόν PCR (218 bp) Ένζυμο Hsp92II (Takara) Ρυθμιστικό διάλυμα BSA Συνολικός όγκος αντίδρασης Διάρκεια της πέψης Ποσότητα 10 μl ( 1 μg) 5 U 2 μl 2 μl 20 μl 3 ώρες Η ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της πέψης έγινε σε gel αγαρόζης 2.5% με ρυθμιστικό διάλυμα 1x TBE. Το gel περιείχε βρωμιούχο αιθίδιο και φωτογραφήθηκε σε συσκευή εκπομπής υπεριώδους ακτινοβολίας UV. 97

100 Στατιστική ανάλυση Οι συχνότητες των γονοτύπων, οι συχνότητες των αλληλομόρφων γονιδίων και οι εκτιμήσεις για την ισορροπία Hardy-Weinberg υπολογίστηκαν με το λογισμικό PopGene Software v σύμφωνα με τους τύπους που περιγράφονται από τους Falconer & MacKay, Οι στατιστικές μελέτες που χρησιμοποιήθηκαν σε κάθε χοιροτροφική μονάδα ξεχωριστά με το λογισμικό SPSS program (version 16.0). Επίσης έγινε χρήση του GLM (Μεικτό γραμμικό πρότυπο) για την ανάλυση των συσχτίσεων μεταξύ των γονοτύπων των γονιδίων και των αναπαραγωγικών χαρακτηριστικών των χοιρομητέρων. Τα αναπαραγωγικά χαρακτηριστικά συμπεριλαμβάνουν τα TNB Συνολικά γεννηθέντα χοιρίδια (ανά τοκετό) NBA Γεννηθέντα ζωντανά χοιρίδια (ανά τοκετό) NW Απογαλακτισθέντα χοιρίδια (ανά τοκετομάδα) Το μοντέλο που χρησιμοποιήθηκε είναι το εξής: Y ij =μ+g i +L j +G*L+e ij, όπου Y ij = τιμή χαρακτηριστικού, μ= γενικός μέσος όρος, G i = γονότυπος (i=1,2,3), L j = αριθμός τοκετού (j=2,3, 4), G i *L j = αλληλεπίδραση μεταξύ γονότυπου και αριθμού τοκετού, e i,j = τυπικό σφάλμα. Για μία πιο λεπτομερή στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων διαμορφώθηκαν δύο ομάδες χοιρομητέρων. Η διαμόρφωση των δύο ομάδων βασίστηκε στη μέση απόδοση κάθε χοιρομητέρας για το αντίστοιχο αναπαραγωγικό χαρακτηριστικό. 98

101 Έγιναν δύο ομάδες με βάση το μέσο όρο των αναπαραγωγικών χαρακτηριστικών όπου βρέθηκε ο μέσος όρος και η κάθε μία από τις δύο ομάδες περιελάμβανε όλες τις χοιρομητέρες που βρίσκονταν εκατέρωθεν του μέσου όρου. Επίσης έγινε η προσπάθεια διαμόρφωσης δύο περισσότερο ακραίων ομάδων, όπου κάθε μία περιελάμβανε το 25% των χοιρομητέρων με τις καλύτερες και το 25% των χοιρομητέρων με τις χειρότερες αποδόσεις για κάθε αναπαραγωγικό χαρακτηριστικό. Η συσχέτιση των δύο ομάδων με τους γονοτύπους εξετάστηκε με το παρακάτω μαθηματικό μοντέλο: Y ijk =μ+g i +L j +G r +G*Gr+L*G r +e ijk, όπου Y ijk = τιμή χαρακτηριστικού, μ= γενικός μέσος όρος, G i = γονότυπος (i=1,2,3), L j = αριθμός τοκετού (j=2,3, 4), Gr k = ομάδα; υψηλών ή χαμηλών επιδόσεων (k=1,2), G i *Gr k = αλληλεπίδραση μεταξύ γονότυπου και ομάδας, L j *Gr k = αλληλεπίδραση μεταξύ αριθμού τοκετού και ομάδας, e ijk = τυπικό σφάλμα. 99

102 4. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΜΕΡΟΣ Α 4.1. Διερεύνηση της έκφρασης των TLR γονιδίων και γονιδίων που κωδικοποιούν πεπτίδια με αντιμικροβιακή δραστηριότητα σε αναπαραγωγικά όργανα χοίρων. Για τις ανάγκες του συγκεκριμένου πειράματος χρησιμοποιήθηκαν όργανα από ενήλικα ζώα της φυλής Large White (Ημερομηνία δειγματοληψίας: ). Συγκεκριμένα, απομονώθηκαν: όργανα θηλυκών χοίρων (ηλικία 12 μηνών): ωοθήκη και ωαγωγός όργανα αρσενικών χοίρων (ηλικία 8 μηνών): όρχις κι επιδιδυμίδα. Στα παραπάνω όργανα έγινε απομόνωση RNA και στη συνέχεια, με την χρήση της μεθόδου RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR) διερευνήθηκε η έκφραση: των γονιδίων της οικογένειας TLR (TLR 1 TLR 10) και των γονιδίων που κωδικοποιούν πεπτίδια με αντιμικροβιακή δραστηριότητα (8 γονίδια της οικογένειας β-defensins: pbd1, pbd3, pbd4, pbd108, pbd114, pbd123, pbd125, pbd129, και του γονιδίου phamp). 100

103 Τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων της οικογένειας TLR και των γονιδίων της οικογένειας β-defensins σε σχέση με το επίπεδο έκφρασης του γονιδίου της ακτίνης, στην ωοθήκη, παρουσιάζονται στο Γράφημα 1 και Γράφημα 2 αντίστοιχα. Σχετική ένταση ζώνης Ωοθήκη Ωαγωγός Όρχις Επιδιδυμίδα Έμβρυο Γράφημα 1: Επίπεδα έκφρασης των γονιδίων της οικογένειας TLR σε σχέση με το επίπεδο έκφρασης του γονιδίου της ακτίνης. Σχετική ένταση ζώνης Ωοθήκη Ωαγωγός Όρχις Επιδιδυμίδα Έμβρυο Γράφημα 2: Επίπεδα έκφρασης των γονιδίων της οικογένειας β-defensins σε σχέση με το επίπεδο έκφρασης του γονιδίου της ακτίνης. Στα Γραφήματα 1 και 2, το επίπεδο έκφρασης υπολογίστηκε με βάση το ποσό της οπτικής έντασης κάθε γονιδίου (TLR ή β-defensin) σε σχέση με την οπτική ένταση τριών ζωνών του γονιδίου της ακτίνης. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα, με επίπεδο σημαντικότητας στο P< Τα αποτελέσματα που παρουσιάζουν σχεδόν ίδιο μέσο όρο στο ίδιο όργανο/ιστό δεν διαφέρουν σημαντικά. Οι στήλες με διαφορετικό εκθέτη στο ίδιο όργανο/ιστό διαφέρουν σημαντικά. 101

104 Ωοθήκη Τα αποτελέσματα των πειραματισμών δείχνουν πως στην ωοθήκη εκφράζονται όλα τα μέλη της οικογένειας των γονιδίων TLR (Εικ. 6). Πιο συγκεκριμένα, τα πρώτα 5 TLRs εκφράζονται σε μεγαλύτερο βαθμό (P<0.001) σε σχέση με τα υπόλοιπα 5. Ladder TLR1 TLR2 TLR3 TLR4 TLR5 TLR6 TLR7 TLR8 TLR9 TLR10 Αρν. Μ. Εικ. 6: Έκφραση των γονιδίων της οικογένειας TLR στην ωοθήκη. Στην πρώτη στήλη βρίσκεται μάρτυρας 100 bp και στην τελευταία αρνητικός μάρτυρας. Επίσης, από τα β-defensins, το pbd1 και pbd108 εμφάνισαν τα μεγαλύτερα επίπεδα έκφρασης (P<0.001) στην ωοθήκη, σε σχέση με τα υπόλοιπα γονίδια (Εικ. 7). Ladder pbd1 pbd3 pbd4 pbd108 pbd114 pbd123 pbd125 pbd129 HAMP Αρν. Μ. Εικ. 7: Έκφραση των γονιδίων της οικογένειας b-defensins και του γονιδίου phamp στην ωοθήκη. Στην πρώτη στήλη βρίσκεται μάρτυρας 100 bp και στην τελευταία αρνητικός μάρτυρας. Τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων της οικογένειας TLR και των γονιδίων της οικογένειας β-defensins σε σχέση με το επίπεδο έκφρασης του γονιδίου της ακτίνης, στην ωοθήκη, παρουσιάζονται στο Γράφημα 1 και Γράφημα 2 αντίστοιχα. 102

105 Ωαγωγός Τα αποτελέσματα των πειραματισμών δείχνουν πως στον ωαγωγό εκφράζονται όλα τα μέλη της οικογένειας των γονιδίων TLR (Εικ. 8). Επιπλέον, τα γονίδια TLR3, TLR4 και TLR5 εμφανίζουν υψηλότερο βαθμό έκφρασης από τα υπόλοιπα. Ladder TLR1 TLR2 TLR3 TLR4 TLR5 TLR6 TLR7 TLR8 TLR9 TLR10 Αρν. Μ. Εικ. 8: Έκφραση των γονιδίων της οικογένειας TLR στον ωαγωγό. Στην πρώτη στήλη βρίσκεται μάρτυρας 100 bp και στην τελευταία αρνητικός μάρτυρας. Ομοίως με την ωοθήκη, και στον ωαγωγό, τα pbd1 και pbd108 εμφάνισαν τα μεγαλύτερα επίπεδα έκφρασης (P<0.001) σε σχέση με τα υπόλοιπα γονίδια (Εικ. 9). Ladder pbd1 pbd3 pbd4 pbd108 pbd114 pbd123 pbd125 pbd129 HAMP Αρν. Μ. Εικ. 9: Έκφραση των γονιδίων της οικογένειας b-defensins και του γονιδίου phamp στον ωαγωγό. Στην πρώτη στήλη βρίσκεται μάρτυρας 100 bp και στην τελευταία αρνητικός μάρτυρας. Τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων της οικογένειας TLR και των γονιδίων της οικογένειας β-defensins σε σχέση με το επίπεδο έκφρασης του γονιδίου της ακτίνης, στον ωαγωγό, παρουσιάζονται στο Γράφημα 1 και Γράφημα 2 αντίστοιχα. 103

106 Όρχις Τα αποτελέσματα των πειραματισμών δείχνουν πως στον όρχι εκφράζονται όλα τα μέλη της οικογένειας των γονιδίων TLR (Εικ. 10). Τα γονίδια TLR3 και TLR5 παρουσιάζουν υψηλότερο βαθμό έκφρασης (P<0.001) σε σχέση με την έκφραση των υπολοίπων γονιδίων στον όρχι. Ladder TLR1 TLR2 TLR3 TLR4 TLR5 TLR6 TLR7 TLR8 TLR9 TLR10 Αρν. Μ. Εικ. 10: Έκφραση των γονιδίων της οικογένειας TLR στον όρχι. Στην πρώτη στήλη βρίσκεται μάρτυρας 100 bp και στην τελευταία αρνητικός μάρτυρας. (Εικ. 11). Στον όρχι τα υψηλότερα επίπεδα έκφρασης παρουσιάζονται στα BD1 και BD3 Ladder pbd1 pbd3 pbd4 pbd108 pbd114 pbd123 pbd125 pbd129 HAMP Αρν. Μ. Εικ. 11: Έκφραση των γονιδίων της οικογένειας b-defensins και του γονιδίου phamp στον όρχι. Στην πρώτη στήλη βρίσκεται μάρτυρας 100 bp και στην τελευταία αρνητικός μάρτυρας. Τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων της οικογένειας TLR και των γονιδίων της οικογένειας β-defensins σε σχέση με το επίπεδο έκφρασης του γονιδίου της ακτίνης, στον όρχι, παρουσιάζονται στο Γράφημα 1 και Γράφημα 2 αντίστοιχα. 104

107 Επιδιδυμίδα Τα αποτελέσματα των πειραματισμών δείχνουν πως στην επιδιδυμίδα εκφράζονται όλα τα μέλη της οικογένειας των γονιδίων TLR (Εικ. 12). Στο συγκεκριμένο όργανο, τα γονίδια που εκφράζονται σε υψηλότερο βαθμό από τα υπόλοιπα είναι τα γονίδια TLR1, TLR2, TLR3 και TLR5. Ladder TLR1 TLR2 TLR3 TLR4 TLR5 TLR6 TLR7 TLR8 TLR9 TLR10 Αρν. Μ. Εικ. 12: Έκφραση των γονιδίων της οικογένειας TLR στην επιδιδυμίδα. Στην πρώτη στήλη βρίσκεται μάρτυρας 100 bp και στην τελευταία αρνητικός μάρτυρας. Στην επιδιδυμίδα, όλα τα γονίδια της οικογένειας b-defensins που μελετήθηκαν εκφράζονται (Εικ. 13). Ladder pbd1 pbd3 pbd4 pbd108 pbd114 pbd123 pbd125 pbd129 HAMP Αρν. Μ. Εικ. 13: Έκφραση των γονιδίων της οικογένειας b-defensins και του γονιδίου phamp στην επιδιδυμίδα. Στην πρώτη στήλη βρίσκεται μάρτυρας 100 bp και στην τελευταία αρνητικός μάρτυρας. Τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων της οικογένειας TLR και των γονιδίων της οικογένειας β-defensins σε σχέση με το επίπεδο έκφρασης του γονιδίου της ακτίνης, στην επιδιδυμίδα, παρουσιάζονται στο Γράφημα 1 και Γράφημα 2 αντίστοιχα. 105

108 Γενικές παρατηρήσεις για την έκφραση των γονιδίων στα αναπαραγωγικά όργανα των χοίρων Γενικά, τα γονίδια TLR3 και TLR5 παρουσίασαν υψηλότερα επίπεδα έκφρασης και στα τέσσερα αναπαραγωγικά όργανα που μελετήθηκαν, ενώ το TLR9 παρουσίασε τα χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης. Επίσης, από τα αποτελέσματα προκύπτει πως τα γονίδια BD4, BD114 και BD123 εκφράζονται μόνο στην επιδιδυμίδα και σε κανένα άλλο από τα όργανα που μελετήθηκαν. Ορισμένα από τα μέλη των γονιδίων της οικογένειας TLR έχει αναφερθεί πως εκφράζονται στις γονάδες του ανθρώπου και τους ωαγωγούς (Zarember and Godowski, 2002; Pioli κ.α., 2004). Επίσης υπάρχουν προηγούμενες αναφορές έκφρασης ορισμένων γονιδίων TLR σε ωαγωγούς προβατίνων (Chang κ.α., 2009), καθώς επίσης και στην ωοθήκη των πτηνών (Michailidis κ.α., 2010). Παρομοίως με τα αποτελέσματα της συγκεκριμένης διδακτορικής έρευνας, όλα τα γονίδια της οικογένειας TLR βρέθηκε να εκφράζονται στην επιδιδυμίδα των ποντικών (Palladino κ.α., 2007). Επίσης οι Linton κ.α., (2008) αναφέρουν ότι τα TLR1, TLR4 και TLR6 εκφράζονται στο ενδομήτριο των χοίρων. Όσον αφορά τα αποτελέσματα σχετικά με την έκφραση των αντιμικροβιακών πεπτιδίων, ομοίως με τα αποτελέσματα αυτής της διδακτορικής διατριβής έχουν αναφερθεί ότι το BD1 εκφράζεται σε υψηλό βαθμό (P<0.001) στο αναπαραγωγικό σύστημα του ενήλικα αρσενικού αρουραίου (Palladino κ.α., 2007), ενώ παράλληλα οι Chen κ.α. (2009) αναφέρουν την έκφραση των γονιδίων BD1 και BD3 στις ωοθήκες των χοίρων της φυλής Meishan και άλλων διασταυρώσεων. Επιπλέον, σύμφωνα με τους Sang κ.α. (2006), τα γονίδια BD3, BD123, BD125 και BD129 εκφράζονται σε υψηλότερα επίπεδα από τα υπόλοιπα γονίδια της οικογένειας των β-defensins στους όρχεις και στην επιδιδυμίδα. Αντιθέτως, από τα αποτελέσματα αυτής της διδακτορικής έρευνας προκύπτει ότι τα υψηλότερα επίπεδα έκφρασης στην επιδιδυμίδα εμφανίζουν τα γονίδια BD4, BD108, BD114 και BD123 και μόνο το γονίδιο BD1 στους όρχεις. Η διαφορά αυτή πιθανολογείται πως παρουσιάζεται λόγω της διαφορετικής φυλής αλλά και του διαφορετικού πειραματικού σχεδιασμού. 106

109 4.2. Διερεύνηση της έκφρασης των TLR γονιδίων και γονιδίων που κωδικοποιούν πεπτίδια με αντιμικροβιακή δραστηριότητα σε in vitro παραγόμενα έμβρυα χοίρων. Για τους συγκεκριμένους πειραματισμούς έγινε απομόνωση RNA από in vitro παραγόμενα έμβρυα χοίρων και στη συνέχεια έγινε διερεύνηση της έκφρασης γονιδίων με την μέθοδο RT-PCR. Τα γονίδια που ερευνήθηκαν ανήκουν στην οικογένεια των TLR γονιδίων (TLR 1 TLR 10) και γονιδίων που κωδικοποιούν πεπτίδια με αντιμικροβιακή δραστηριότητα (8 γονίδια της οικογένειας β-defensins: pbd1, pbd3, pbd4, pbd108, pbd114, pbd123, pbd125, pbd129, και του γονιδίου phamp). Στην Εικ. 14 εμφανίζονται τα αποτελέσματα της έκφρασης των γονιδίων της οικογένειας TLR στα in vitro παραγόμενα έμβρυα. Στα έμβρυα εμφανίζονται τα γονίδια TLR1, TLR3 και TLR8. Μάλιστα το γονίδιο TLR1 εμφανίζει τον υψηλότερο βαθμό έκφρασης από τα υπόλοιπα (P<0.001). Επίσης τα γονίδια TLR3 και TLR8 εμφανίζεται να έχουν σχεδόν το ίδιο επίπεδο έκφρασης. Ladder TLR1 TLR2 TLR3 TLR4 TLR5 TLR6 TLR7 TLR8 TLR9 TLR10 Αρν. Μ. Εικ. 14: Έκφραση των γονιδίων της οικογένειας TLR σε έμβρυα χοίρων. Στην πρώτη στήλη βρίσκεται μάρτυρας 100 bp και στην τελευταία αρνητικός μάρτυρας. Από την οικογένεια των β-defensins μόνο τα γονίδια BD3, BD108 and BD123 φαίνεται πως εκφράζονται στα έμβρυα των χοίρων, και αυτά σε χαμηλά επίπεδα έκφρασης. Ladder pbd1 pbd3 pbd4 pbd108 pbd114 pbd123 pbd125 pbd129 HAMP Αρν. Μ. Εικ. 15: Έκφραση των γονιδίων της οικογένειας b-defensins και του γονιδίου phamp σε έμβρυα χοίρων. Στην πρώτη στήλη βρίσκεται μάρτυρας 100 bp και στην τελευταία αρνητικός μάρτυρας. 107

110 4.3. Διερεύνηση της έκφρασης των TLR γονιδίων και γονιδίων που κωδικοποιούν πεπτίδια με αντιμικροβιακή δραστηριότητα σε κοκκώδη κύτταρα χοίρων. Για τις ανάγκες του συγκεκριμένου πειράματος, έγινε απομόνωση κοκκωδών κυττάρων από μικρά (<3 mm) και μεγάλα ωοθυλάκια (>3 mm) που προέρχονταν από ωοθήκες υγιών χοιρομητέρων ηλικίας περίπου 6 μηνών. Στα παραπάνω κύτταρα έγινε η διερεύνηση της έκφρασης όλων των γονιδίων της οικογένειας TLR (TLR 1 TLR 10) με την τεχνική Real-Time PCR (PCR πραγματικού χρόνου). Όπως φαίνεται και στο Γράφημα 4, η ανάλυση RT-PCR που εφαρμόστηκε στο RNA που προερχόταν από κοκκώδη κύτταρα χοίρων (μικρά και μεγάλα) που καλλιεργήθηκαν in vitro, όλα τα γονίδια της οικογένειας των Toll-like receptors εκφράζονται στα κοκκώδη κύτταρα που προέρχονται από μικρά και μεγάλα ωοθυλάκια θηλυκών χοίρων. Η ποσοτική ανάλυση που πραγματοποιήθηκε με την real-time PCR, ούτως ώστε να διερευνηθούν πιθανές διαφορές στα επίπεδα της έκφρασης των γονιδίων TLR μεταξύ των κοκκωδών κυττάρων που απομονώθηκαν από μικρά και από μεγάλα ωοθυλάκια θηλυκών χοίρων. Στο Γράφημα 4 εμφανίζονται τα επίπεδα της έκφρασης των γονιδίων TLR στα κοκκώδη κύτταρα, μετά την προσαρμογή των αποτελεσμάτων σε σύγκριση με την έκφραση του γονιδίου της β-ακτίνης. Η ανάλυση με real-time PCR, έδειξε πως δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές (P > 0,05) μεταξύ των επιπέδων έκφρασης των γονιδίων στα κοκκώδη κύτταρα, εκτός από τα γονίδια TLR8 και TLR9, όπου παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά (P < 0,05) μεταξύ των δύο ομάδων κυττάρων. 108

111 2,5 Small Μικρά folicles ωοθυλάκια Large Μεγάλα follicles ωοθυλάκια 2 Relative Σχετική expression έκφραση 1,5 1 0,5 0 TLR1 TLR2 TLR3 TLR4 TLR5 TLR6 TLR7 TLR8 TLR9 TLR10 Γράφημα 3: Επίπεδα έκφρασης των γονιδίων της οικογένειας TLR σε σχέση με το επίπεδο έκφρασης του γονιδίου της ακτίνης, στα μικρά και μεγάλα κοκκώδη κύτταρα των χοίρων, μετά από προσδιορισμό με real-time PCR. Τα αποτελέσματα που προκύπτουν από τη συγκεκριμένη έρευνα δείχνουν πως όλα τα μέλη των γονιδίων της οικογένειας TLR εκφράζονται στα κοκκώδη κύτταρα που προέρχονται από μικρά και μεγάλα ωοθυλάκια θηλυκών χοίρων. Η έκφραση όλων των τύπων γονιδίων της οικογένειας TLR, τα οποία καλύπτουν την αναγνώριση από μέρους του ξενιστή των Gram θετικών και Gram αρνητικών βακτηρίων, του RNA διπλής και μονής έλικας και του βακτηρίου της flagellin ενδυναμώνει τον ισχυρισμό ότι τα γονίδια TLR εμπλέκονται στον μηχανισμό άμυνας των ωοθυλακίων των χοιρομητέρων ενάντια σε ένα ευρύ φάσμα από μικροοργανισμούς. Στη συνέχεια εμφανίζονται οι εικόνες που προέκυψαν από τη διερεύνηση της έκφρασης όλων των γονιδίων της οικογένειας TLR (TLR 1 TLR 10) και των γονιδίων που κωδικοποιούν πεπτίδια με αντιμικροβιακή δραστηριότητα (8 γονίδια της οικογένειας β-defensins: pbd1, pbd3, pbd4, pbd108, pbd114, pbd123, pbd125, pbd129, και του γονιδίου phamp). 109

112 Κοκκώδη κύτταρα μικρά(<3mm) Ladder TLR1 TLR2 TLR3 TLR4 TLR5 TLR6 TLR7 TLR8 TLR9 TLR10 Αρν. Μ. Εικ. 16: Έκφραση των γονιδίων της οικογένειας TLR σε κοκκώδη κύτταρα (μικρά, < 3mm). Στην πρώτη στήλη βρίσκεται μάρτυρας 100 bp και στην τελευταία αρνητικός μάρτυρας. Ladder pbd1 pbd3 pbd4 pbd108 pbd114 pbd123 pbd125 pbd129 HAMP Αρν. Μ. Εικ. 17: Έκφραση των γονιδίων της οικογένειας b-defensins και του γονιδίου phamp σε κοκκώδη κύτταρα (μικρά, < 3mm). Στην πρώτη στήλη βρίσκεται μάρτυρας 100 bp και στην τελευταία αρνητικός μάρτυρας. Κοκκώδη κύτταρα μεγάλα (>3mm) Ladder TLR1 TLR2 TLR3 TLR4 TLR5 TLR6 TLR7 TLR8 TLR9 TLR10 Αρν. Μ. Εικ. 18: Έκφραση των γονιδίων της οικογένειας TLR σε κοκκώδη κύτταρα (μεγάλα, > 3mm). Στην πρώτη στήλη βρίσκεται μάρτυρας 100 bp και στην τελευταία αρνητικός μάρτυρας. Ladder pbd1 pbd3 pbd4 pbd108 pbd114 pbd123 pbd125 pbd129 HAMP Αρν. Μ. Εικ. 19: Έκφραση των γονιδίων της οικογένειας b-defensins και του γονιδίου phamp σε κοκκώδη κύτταρα (μεγάλα, > 3mm). Στην πρώτη στήλη βρίσκεται μάρτυρας 100 bp και στην τελευταία αρνητικός μάρτυρας. 110

113 4.4. Διερεύνηση της επίδρασης Λιποπολυσακχαρίτη (LPS) στα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων της οικογένειας TLR σε μικρά (<3 mm) και μεγάλα (>3 mm) κοκκώδη κύτταρα χοίρων. Για τις ανάγκες των συγκεκριμένων πειραματισμών χρησιμοποιήθηκαν ωοθήκες από υγιείς χοιρομητέρες ηλικίας περίπου 6 μηνών. Συγκεκριμένα, έγινε απομόνωση κοκκωδών κυττάρων από μικρά (<3 mm) και μεγάλα ωοθυλάκια (>3 mm). Στη συνέχεια τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν παρουσία ή απουσία λιποπολυσακχαρίτη. Στην συνέχεια έγινε απομόνωση RNA από κοκκώδη κύτταρα που προέρχονταν από τις παρακάτω καλλιέργειες κυττάρων: Ώρα 0 - Κύτταρα χωρίς LPS (μ0 και M0) Ώρα 6 - Κύτταρα χωρίς LPS και με LPS (μc6 και MC6) και (μ6 και Μ6) Ώρα 12 - Κύτταρα χωρίς LPS και με LPS (μc12 και MC12) και (μ12 και Μ12) Ώρα 24 - Κύτταρα χωρίς LPS και με LPS (μc24 και ΜC24) και (μ24 και M24) Στις παραπάνω σειρές κυττάρων έγινε ποσοτικοποίηση της έκφρασης ορισμένων γονιδίων της οικογένειας TLR με την τεχνική της Real-Time PCR (PCR πραγματικού χρόνου). m: κοκκώδη κύτταρα από μικρά ωοθυλάκια (<3mm) M: κοκκώδη κύτταρα από μεγάλα ωοθυλάκια (>3mm) Σχετική έκφραση Γράφημα 4: Επίπεδα έκφρασης του γονιδίου TLR1 σε σχέση με το επίπεδο έκφρασης του γονιδίου της ακτίνης. στα μικρά και μεγάλα κοκκώδη κύτταρα των χοίρων, μετά από προσδιορισμό με real-time PCR σε διαφορετικά διαστήματα παρουσίας LPS. 111

114 Τα επίπεδα της έκφρασης του γονιδίου TLR1 αυξάνονται καθώς αυξάνεται ο χρόνος παραμονής των δειγμάτων με την ουσία LPS. Με μια πιο λεπτομερής παρατήρηση του γραφήματος, γίνεται εμφανές πως στις 12 ώρες, η έκφραση του TLR1 είναι σχεδόν διπλάσια σε σχέση με την αρχική και για τις δύο ομάδες των κοκκωδών κυττάρων. Επίσης, η μεγαλύτερη αύξηση παρατηρείται στις 24 ώρες, όπου η άυξηση των επιπέδων έκφρασης του γονιδίου είναι 4τραπλάσια στα κοκκώδη κύτταρα από μικρά ωοθυλάκια και 3πλάσια στα κοκκώδη κύτταρα από μεγάλα ωοθυλάκια. Σχετική έκφραση m: κοκκώδη κύτταρα από μικρά ωοθυλάκια (<3mm) M: κοκκώδη κύτταρα από μεγάλα ωοθυλάκια (>3mm) Γράφημα 5: Επίπεδα έκφρασης του γονιδίου TLR2 σε σχέση με το επίπεδο έκφρασης του γονιδίου της ακτίνης. στα μικρά και μεγάλα κοκκώδη κύτταρα των χοίρων, μετά από προσδιορισμό με real-time PCR σε διαφορετικά διαστήματα παρουσίας LPS. Ομοίως με τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου TLR1, και τα επίπεδα της έκφρασης του γονιδίου TLR2 αυξάνονται καθώς ο χρόνος περνάει. Πιο συγκεκριμένα, στα κοκκώδη κύτταρα από μικρά ωοθυλάκια η έκφραση του γονιδίου διπλασιάζεται στις πρώτες 6 ώρες της παρουσίας του LPS, και παραμένουν διπλάσια σε σχέση με το αρχικό επίπεδο. Επίσης, τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου TLR2 στα κοκκώδη κύτταρα που προέρχονται από μεγάλα ωοθυλάκια αρχικά παραμένουν σχετικά σταθερά ενώ στις 12 ώρες παρουσίας του LPS διπλασιάζονται και στις 24 ώρες 4τραπλασιάζονται. 112

115 m: κοκκώδη κύτταρα από μικρά ωοθυλάκια (<3mm) M: κοκκώδη κύτταρα από μεγάλα ωοθυλάκια (>3mm) Σχετική έκφραση Γράφημα 6: Επίπεδα έκφρασης του γονιδίου TLR4 σε σχέση με το επίπεδο έκφρασης του γονιδίου της ακτίνης. στα μικρά και μεγάλα κοκκώδη κύτταρα των χοίρων, μετά από προσδιορισμό με real-time PCR σε διαφορετικά διαστήματα παρουσίας LPS. Τα επίπεδα της έκφρασης του γονιδίου TLR4 αυξάνονται καθώς αυξάνεται ο χρόνος παραμονής των δειγμάτων με την ουσία LPS. Πιο αναλυτικά παρατηρείται πως στα κοκκώδη κύτταρα που προέρχονται από μικρά ωοθηλάκια, τα επίπεδα έκφρασης διπλασιάζοναι στις 12 ώρες παραμονής με LPS και παραμένουν σταθερά μέχρι και τις 24 ώρες. Πιο εμφανής αύξηση παρατηρείται στα κοκκώδη κύτταρα από μεγάλα ωοθηλάκια όπου τα επίπεδα έκφρασης στις 6 ώρες τριπλασιάζονται, στις 12 ώρες σχεδόν 4πλασιάζονται ενώ στις 24 ώρες 5πλασιάζονται. Σχετική έκφραση m: κοκκώδη κύτταρα από μικρά ωοθυλάκια (<3mm) M: κοκκώδη κύτταρα από μεγάλα ωοθυλάκια (>3mm) Γράφημα 7: Επίπεδα έκφρασης του γονιδίου TLR5 σε σχέση με το επίπεδο έκφρασης του γονιδίου της ακτίνης. στα μικρά και μεγάλα κοκκώδη κύτταρα των χοίρων, μετά από προσδιορισμό με real-time PCR σε διαφορετικά διαστήματα παρουσίας LPS. 113

116 Τα επίπεδα της έκφρασης του γονιδίου TLR5 θα μπορούσε να θεωρηθεί πως αυξάνονται καθώς αυξάνεται ο χρόνος παραμονής των δειγμάτων με την ουσία LPS. Για την ακρίβεια, στα κοκκώδη κύτταρα που προέρχονται από μικρά ωοθηλάκια, τα επίπεδα έκφρασης εμφανίζονται σταθερά καθόλη τη διάρκεια επώασης τους με LPS (για 24 ώρες). Παράλληλα, στα κοκκώδη κύτταρα που προέρχονται από τα μεγάλα ωοθυλάκια, τα επίπεδα έκφρασης διπλασιάζονται στις 12 ώρες επώασης με LPS και παραμένουν διπλάσια μέχρι και τις 24 ώρες. Σχετική έκφραση m: κοκκώδη κύτταρα από μικρά ωοθυλάκια (<3mm) M: κοκκώδη κύτταρα από μεγάλα ωοθυλάκια (>3mm) Γράφημα 8: Επίπεδα έκφρασης του γονιδίου TLR6 σε σχέση με το επίπεδο έκφρασης του γονιδίου της ακτίνης. στα μικρά και μεγάλα κοκκώδη κύτταρα των χοίρων, μετά από προσδιορισμό με real-time PCR σε διαφορετικά διαστήματα παρουσίας LPS. Όσων αφορά τα επίπεδα της έκφρασης του γονιδίου TLR6 στα κοκκώδη κύτταρα που προέρχονται από μικρά ωοθυλάκια, φαίνεται πως ομοίως με την περίπτωση του γονιδίου TLR5, παραμένουν σταθερά καθόλη τη διάρχεια επώασης τους με LPS. Επίσης, τα κοκκώδη κύτταρα που προέρχονται από μεγάλα ωοθυλάκια εμφανίζουν μία απότομη αύξηση της έκφρασης του γονιδίου TLR6, όπου στις 6 ώρες επώασης παρατηρείται 5πλασιαμός των επιπέδων έκφρασης, ενώ καθώς αυξάνεται ο χρόνος παραμονής των δειγμάτων με την ουσία LPS, τα επίπεδα παραμένουν αυξημένα αλλά με λιγότερη ένταση. 114

117 Σχετική έκφραση m: κοκκώδη κύτταρα από μικρά ωοθυλάκια (<3mm) M: κοκκώδη κύτταρα από μεγάλα ωοθυλάκια (>3mm) Γράφημα 9: Επίπεδα έκφρασης του γονιδίου TLR9 σε σχέση με το επίπεδο έκφρασης του γονιδίου της ακτίνης. στα μικρά και μεγάλα κοκκώδη κύτταρα των χοίρων, μετά από προσδιορισμό με real-time PCR σε διαφορετικά διαστήματα παρουσίας LPS. Τα επίπεδα της έκφρασης του γονιδίου TLR9 στα κοκκωδη κύτταρα από μικρά ωοθυλάκια εμφανίζονται σταθερά έως και ελαφρώς μειούμενα καθώς αυξάνεται ο χρόνος παραμονής των δειγμάτων με την ουσία LPS. Αντίθετα, στα κοκκώδη κύτταρα που προέρχονται από μεγάλα ωοθυλάκια δεν παρατηρείται η ίδια πορεία. Ενώ στις 6 ώρες παρατηρείται μια μικρή μείωση της έκφρασης, στη συνέχεια παρατηρείται μια θεαματική αύξηση όπου η έκφραση 7πλάσιάζεται σε σχέση με την αρχική στις 12 ώρες ενώ στις 24 ώρες τα επίπεδα έκφρασης επιστρέφουν ξανά στα αρχικά. Σχετική έκφραση m: κοκκώδη κύτταρα από μικρά ωοθυλάκια (<3mm) M: κοκκώδη κύτταρα από μεγάλα ωοθυλάκια (>3mm) Γράφημα 10: Επίπεδα έκφρασης του γονιδίου TLR10 σε σχέση με το επίπεδο έκφρασης του γονιδίου της ακτίνης. στα μικρά και μεγάλα κοκκώδη κύτταρα των χοίρων, μετά από προσδιορισμό με real-time PCR σε διαφορετικά διαστήματα παρουσίας LPS. Τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου TLR10 εμφανίζονται σχεδόν σταθερά και στις δύο ομάδες κυττάρων καθόλη τη διάρκεια επώασης με LPS. 115

118 ΜΕΡΟΣ Β 4.5. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΑΠΟ ΤΗ ΕΞΑΓΩΓΗ DNA ΑΠΟ ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΧΟΙΡΟΜΗΤΕΡΩΝ Στην Εικόνα 20 εμφανίζονται ενδεικτικά ζώνες ορισμένων δειγμάτων DNA μετά από ηλεκτροφόρηση σε gel αγαρόζης 1% (Ladder 1kb). Τα δείγματα DNA προέρχονται από χοιρομητέρες της μονάδας Μπατάλα και της μονάδας Γκασνάκη αντίστοιχα. Εικ. 20: Απεικόνιση ηλεκτροφόρησης δειγμάτων DNA από χοιρομητέρες 116

119 4.6. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΤΩΝ PCR ΤΩΝ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ DNA ΑΠΟ ΧΟΙΡΟΜΗΤΕΡΕΣ ΚΑΙ ΑΡΣΕΝΙΚΟΥΣ ΧΟΙΡΟΥΣ Στις Εικόνες 21, 22 και 23 εμφανίζονται οι ζώνες των προϊόντων PCR μετά από ηλεκτροφόρηση σε gel αγαρόζης για τα γονίδια BF, RBP4 και ESR2 αντίστοιχα. Στην πρώτη στήλη βρίσκεται Ladder 100bp στη συνέχεια βρίσκονται 12 θέσεις με προϊόντα πέψης από κάθε γονίδιο και στην τελευταία στήλη εμφανίζεται το αποτέλεσμα του Negative Control για κάθε μία PCR εφαρμόστηκε. Ladder Neg. Εικ. 21: Απεικόνιση ηλεκτροφόρησης προϊόντων PCR από χοιρομητέρες για το γονίδιο BF (Μέγεθος γονιδίου BF: 390bp). Ladder Neg. Εικ. 22: Απεικόνιση ηλεκτροφόρησης προϊόντων PCR από χοιρομητέρες για το γονίδιο RBP4 (Μέγεθος γονιδίου RBP4: 550bp). Ladder Neg. Εικ. 23: Απεικόνιση ηλεκτροφόρησης προϊόντων PCR από χοιρομητέρες για το γονίδιο ESR2 (Μέγεθος γονιδίου ESR2: 218bp). 117

120 4.7. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΤΑ ΤΟΥ ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΟΥ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ BF Αποτελέσματα από τον προσδιορισμό των γονοτύπων των χοιρομητέρων και των κάπρων για το γονίδιο BF. Οι αναμενόμενες ζώνες του γονιδίου BF μετά την ηλεκτροφόρηση των δειγμάτων και την ηλεκτροφόρηση σε gel αγαρόζης εμφανίζονται στον Πίν. 12. Πίν. 12: Αναμενόμενες ζώνες του γονιδίου BF gene μετά την PCR-RFLP Γονότυπος ΒΒ ΑΒ ΑΑ Μέγεθος ζώνης 390 bp 390 bp, 237 bp και 153 bp 237 bp και 153 bp Οι ζώνες που προέκυψαν από την εφαρμογή της τεχνικής PCR-RFLP μετά από την πέψη των προϊόντων της PCR με το ένζυμο SmaI εμφανίζονται στην Εικ bp 237 bp 153 bp AA AA AA Ladder BB AB AB Εικ. 24: Οι τρεις γονότυποι του γονιδίου BF (Ladder 100bp) 118

121 Διασπορά γονοτύπων, συχνότητα γονοτύπων και συχνότητα αλληλομόρφων Στον Πίν. 13 παρουσιάζεται η διασπορά των γονοτύπων του γονιδίου BF στον πληθυσμό των χοιρομητέρων που μελετήθηκαν. Επίσης παρουσιάζεται η συχνότητα των γονοτύπων και η συχνότητα των δύο αλληλομόρφων του γονιδίου, όπως προέκυψαν από την μελέτη του πολυμορφισμού του γονιδίου BF, με την τεχνική PCR-RFLP. Πίν. 13: Διασπορά γονοτύπων, συχνότητα γονοτύπων και συχνότητα αλληλομόρφων του γονιδίου BF σε όλες τις χοιρομητέρες που μελετήθηκαν. BF gene Μονάδα Μπατάλα Μονάδα Γκασνάκη Μονάδα Δαρμάρη Διασπορά γονοτύπων ΑΑ ΑΒ ΒΒ Συχνότητα γονοτύπων ΑΑ ΑΒ ΒΒ 0 22,5 77,5 1,1 29,3 69, Συχνότητα αλληλομόρφων Α Β 0,11 0,89 0,16 0,84 0,15 0,85 Στη μονάδα Μπατάλα, το μεγαλύτερο μέρος του πληθυσμό των χοιρομητέρων, περίπου το 80 % φέρουν τον γονότυπο ΒΒ. Ένα μικρότερο ποσοστό περίπου 20 % είναι ετεροζύγωτες χοιρομητέρες ενώ καμία χοιρομητέρα δε βρέθηκε να φέρει τον γονότυπο ΑΑ. Ομοίως, στη μονάδα Γκασνάκη, οι περισσότερες χοιρομητέρες φέρουν τον γονότυπο ΒΒ, όμως στη συγκεκριμένη μονάδα βρέθηκαν και 3 χοιρομητέρες με τον γονότυπο ΑΑ. Στη μονάδα Δαρμάρη επίσης, οι περισσότερες χοιρομητέρες έφεραν το γονότυπο ΒΒ (70%) ενώ όπως και στη μονάδα Μπατάλα, δεν βρέθηκε χοιρομητέρα με τον γονότυπο ΑΑ. 119

122 Γονότυπος αρσενικών Στον Πίν. 14 εμφανίζονται οι γονότυποι των γονιδίων των αρσενικών χοίρων που χρησιμοποιούνται από τις δύο εμπορικές μονάδες για την γονιμοποίηση των χοιρομητέρων, οι οποίοι είναι οι αρσενικοί γεννήτορες για τις περισσότερες από τις χοιρομητέρες που χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα. Πίν. 14: Γoνότυποι αρσενικών για το γονίδιο BF gene BF gene Μονάδα Μπατάλα Μονάδα Γκασνάκη Μονάδα Δαρμάρη Διασπορά γονοτύπων ΑΑ ΑΒ ΒΒ Συχνότητα γονοτύπων ΑΑ ΑΒ ΒΒ ,5 37,5 50, Συχνότητα αλληλομόρφων Α Β ,31 0, Στη μονάδα Μπατάλα, όλα τα αρσενικά βρέθηκε να έχουν το ομοζύγωτο γονότυπο ΒΒ. Το αποτέλεσμα αυτό ήταν αναμενόμενο, καθώς καμία από τις χοιρομητέρες στη συγκεκριμένη μονάδα δε βρέθηκε να έχει τον γονότυπο ΑΑ. Στη μονάδα Γκασνάκη, τα μισά αρσενικά φέρουν τον γονότυπο ΒΒ ενώ μόνο ένα βρέθηκε να έχει τον γονότυπο ΑΑ. Η δειγματοληψία γενετικού υλικού κι επομένως η γενετική ανάλυση των αρσενικών αγριόχοιρων που χρησιμοποιούνται για γονιμοποίηση των χοιρομητέρων στη μονάδα Δαρμάρη δεν ήταν εφικτή. 120

123 Συσχέτιση μεταξύ των γονοτύπων και των αναπαραγωγικών χαρακτηριστικών των χοιρομητέρων (ΤNB-NBA) Στους Πίν. 15, 16 και 17 εμφανίζονται οι μέσοι όροι των αναπαραγωγικών χαρακτηριστικών των χοιρομητέρων για τα TNB και NBA και για τις μονάδες Μπατάλα, Γκασνάκη και Δαρμάρη αντίστοιχα, σε σχέση με το γονότυπο του BF. Πίν. 15: Μέσος όρος του κάθε γονότυπου του γονιδίου RBP4 για κάθε αναπαραγωγικό χαρακτηριστικό, σε όλες τι χοιρομητέρες της Μονάδας Μπατάλα (n=120) Γονότυπος Αναπαραγωγικό χαρακτηριστικό χοιρομητέρας ΤΝΒ ΝΒΑ NW ΑΑ ΑΒ 14,8 ± 0,4 a 12,2 ± 0,3 a 12,1 ± 0,2 a ΒΒ 15,7 ± 0,1 b 12,9 ± 0,2 b 12,4 ± 0,3 b Οι τιμές στην ίδια στήλη με διαφορετικό εκθέτη, παρουσιάζουν στατιστικά σημαντική διαφορά (a, b για p < 0.05 και c, d για p < 0.01) Στη μονάδα Μπατάλα, σχεδόν σε όλες τις περιπτώσεις που εξετάστηκαν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των γονοτύπων. Η μέση τιμή των χοιρομητέρων με γονότυπο AB ήταν 14,8 χοιρίδια ανά τοκετό ενώ για τις χοιρομητέρες με γονότυπο ΒΒ ήταν 15,7 χοιρίδια ανά τοκετό. Αυτό σημαίνει πως η διαφορά μεταξύ των δύο γονοτύπων βρίσκεται περίπου στο ένα χοιρίδιο όσων αφορά τα συνολικά γεννηθέντα χοιρίδια ανά τοκετό (TNB). Όσων αφορά τα ζωντανά γεννηθέντα χοιρίδια ανά τοκετό (NBA), η μέση τιμή στη μονάδα Μπατάλα βρέθηκε να έχει στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των δύο ομάδων, και οι χοιρομητέρες που φέρουν τον γονότυπο ΒΒ βρέθηκε ότι δίνουν ένα περισσότερο χοιρίδιο ανά τοκετό σε σχέση με τις χοιρομητέρες που φέρουν τον γονότυπο ΑΒ. Παρόμοια αποτελέσματα έχουν αναφερθεί και στο παρελθόν από τους Buske κ.α., (2005). Επίσης, οι χοιρομητέρες που φέρουν τον γονότυπο ΒΒ δίνουν 12,4 απογαλακτισθέντα χοιρίδια ανά τοκετομάδα, δηλαδή 0,3 χοιρίδια περισσότερα από τις χοιρομητέρες με γονότυπο ΑΒ. 121

124 Πίν. 16: Μέσος όρος του κάθε γονότυπου του γονιδίου RBP4 για κάθε αναπαραγωγικό χαρακτηριστικό, σε όλες τι χοιρομητέρες της Μονάδας Γκασνάκη (n = 280) Αναπαραγωγικό χαρακτηριστικό χοιρομητέρας Γονότυπος ΤΝΒ ΝΒΑ NW ΑΑ 12,6 ± 0,1 a 12,1 ± 0,2 a 11,7 ± 0,3 a ΑΒ 13,3 ± 0,1 b 12,3 ± 0,1 b 11,8 ± 0,2 b ΒΒ 14,1 ± 0,3 c 13,2 ± 0,3 c 12,2 ± 0,3 c Οι τιμές στην ίδια στήλη με διαφορετικό εκθέτη, παρουσιάζουν στατιστικά σημαντική διαφορά (a, b για p < 0.05 και c, d για p < 0.01) Στη μονάδα Γκασνάκη, παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των γονοτύπων και στα τρία αναπαραγωγικά χαρακτηριστικά που εξετάστηκαν. Σε όλες τις περιπτώσεις, η μέση τιμή των χοιρομητέρων που φέρουν τον γονότυπο ΒΒ ήταν μεγαλύτερη από τις χοιρομητέρες με γονότυπο ΑΒ, η οποία ήταν μεγαλύτερη σε σχέση με τις χοιρομητέρες με γονότυπο ΑΑ. Όσον αφορά τα συνολικά γεννηθέντα χοιρίδια, η μέση τιμή των χοιρομητέρων με γονότυπο ΒΒ ήταν 14,1, δηλαδή περίπου 1,5 χοιρίδιο μεγαλύτερη σε σχέση με τις χοιρομητέρες με γονότυπο ΑΑ. Επίσης, η διαφορά μεταξύ των ζωντανών χοιριδίων μεταξύ των χοιρομητέρων που φέρουν τον γονότυπο ΒΒ και αυτών με γονότυπο ΑΑ βρέθηκε στο 1,1 χοιρίδια ανά τοκετό ενώ και στα απογαλακτισθέντα χοιρίδια η διαφορά βρέθηκε στο 0,5 χοιρίδιο ανά τοκετομάδα. Πίν. 17: Μέσος όρος του κάθε γονότυπου του γονιδίου RBP4 για κάθε αναπαραγωγικό χαρακτηριστικό, σε όλες τι χοιρομητέρες της Μονάδας Δαρμάρη (n = 20) Γονότυπος Αναπαραγωγικό χαρακτηριστικό χοιρομητέρας ΤΝΒ ΝΒΑ NW ΑΑ ΑΒ 7,1 ± 0,2 a 6,1 ± 0,2 b 5,1 ± 0,2 c ΒΒ 7,2 ± 0,1 a 6,3 ± 0,3 b 5,2 ± 0,4 c Οι τιμές με διαφορετικό εκθέτη, παρουσιάζουν στατιστικά σημαντική διαφορά (a, b και c, για p < 0.01) Στη μονάδα Δαρμάρη, η τάση των χοιρομητέρων ΒΒ ήταν να δίνουν ελαφρώς περισσότερα χοιρίδια σε σχέση με τις χοιρομητέρες ΑΒ, όμως τα αποτελέσματα δεν 122

125 παρουσίασαν στατιστικά σημαντική διαφορά για κανένα από τα αναπαραγωγικά χαρακτηριστικά που μελετήθηκαν. Γενικές παρατηρήσεις για τη συσχέτιση μεταξύ των γονοτύπων του γονιδίου BF και των αναπαραγωγικών χαρακτηριστικών των χοιρομητέρων Τα αποτελέσματα από την μελέτη του πολυμορφισμού του γονιδίου BF, επιβεβαιώνουν τους ισχυρισμούς ότι το συγκεκριμένο γονίδιο σχετίζεται με το μέγεθος της τοκετομάδας. Πιο συγκεκριμένα, οι χοιρομητέρες με το γονότυπο BB βρέθηκε ότι δίνουν στατιστικά μεγαλύτερο μέγεθος τοκετομάδας σε σχέση με τις χοιρομητέρες με γονότυπο ΑΒ. Παράλληλα, το αλληλόμορφο Α του γονιδίου BF φαίνεται πως σχετίζεται με τις μικρότερες τοκετομάδες. Το γονίδιο BF προτείνεται να συμπεριλαμβάνεται στα μελλοντικά σχήματα βελτίωσης που βασίζονται σε γενετικούς δείκτες. 123

126 4.8. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΤΑ ΤΟΥ ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΟΥ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ RBP4 Στο συγκεκριμένο σημείο παραθέτονται τα αποτελέσματα από τον προσδιορισμό των γονοτύπων των χοιρομητέρων και των κάπρων για το γονίδιο RBP4. Οι αναμενόμενες ζώνες του γονιδίου RBP4 μετά την ηλεκτροφόρηση των δειγμάτων και την ηλεκτροφόρηση σε gel αγαρόζης εμφανίζονται στον Πίν. 18. Πίν. 18: Αναμενόμενες ζώνες του γονιδίου RBP4 μετά την PCR-RFLP Γονότυπος ΒΒ ΑΒ ΑΑ Μέγεθος ζώνης 190bp, 136bp και 125bp 190bp, 154bp, 136bp και 125bp 190bp, 154bp και 136bp Οι ζώνες που προέκυψαν από την εφαρμογή της τεχνικής PCR-RFLP και την ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της πέψης με το ένζυμο MspI, εμφανίζονται στην Εικ. 25. Εικ. 25: Οι τρεις γονότυποι του γονιδίου RBP4. 124

127 Διασπορά γονοτύπων, συχνότητα γονοτύπων και συχνότητα αλληλομόρφων Στον Πίν. 19 παρουσιάζεται η διασπορά των γονοτύπων του γονιδίου RBP4 στον πληθυσμό των χοιρομητέρων που μελετήθηκαν. Επίσης εμφανίζεται η συχνότητα των γονοτύπων και η συχνότητα των δύο αλληλομόρφων του γονιδίου, όπως προέκυψαν από την μελέτη με την μέθοδο PCR-RFLP. Πίν. 19: Διασπορά γονοτύπων, Συχνότητα γονοτύπων και συχνότητα αλληλομόρφων του γονιδίου RBP4 σε όλες τις χοιρομητέρες που μελετήθηκαν. RBP4 Μονάδα Μπατάλα Μονάδα Γκασνάκη Μονάδα Δαρμάρη Διασπορά γονοτύπων ΑΑ ΑΒ ΒΒ Συχνότητα γονοτύπων ΑΑ ΑΒ ΒΒ 29,2 48,3 22,5 27,8 58,2 14, Συχνότητα αλληλομόρφων Α Β 0,53 0,47 0,57 0,43 Οι τιμές στην ίδια στήλη με διαφορετικό εκθέτη, παρουσιάζουν στατιστικά σημαντική διαφορά (a, b για p < 0.05 και c, d για p < 0.01) 0 1 Στη μονάδα Μπατάλα εμφανίστηκαν και οι τρεις γονότυποι του γονιδίου RBP4, και το μεγαλύτερο μέρος του πληθυσμού βρέθηκε να αποτελείται από ετεροζύγωτα άτομα, ενώ το μικρότερο μέρος του πληθυσμού διαμόρφωναν οι χοιρομητέρες με τον γονότυπο BB. Ομοίως, στη μονάδα Γκασνάκη, οι περισσότερες χοιρομητέρες βρέθηκε να φέρουν την ετεροζύγωτη μορφή του γονότυπου του γονιδίου RBP4. Αντίθετα, στη μονάδα Δαρμάρη, όλες οι χοιρομητέρες που εξετάστηκαν βρέθηκε να έχουν αποκλειστικά τον γονότυπο ΒΒ, γεγονός που υποδηλώνει ότι πιθανότατα δεν υπάρχει παραλλακτικότητα του γονιδίου RBP4 στην ελληνική αυτόχθονη φυλή χοίρων. 125

128 Γονότυποι Αρσενικών Στον Πίν. 20 εμφανίζονται οι γονότυποι των γονιδίων των αρσενικών χοίρων που χρησιμοποιούνται από τις δύο εμπορικές μονάδες για την γονιμοποίηση των χοιρομητέρων, οι οποίοι είναι οι αρσενικοί γεννήτορες για τις περισσότερες από τις χοιρομητέρες που χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα. Πίν. 20: Διασπορά γονοτύπων, Συχνότητα γονοτύπων και συχνότητα αλληλομόρφων του γονιδίου RBP4 σε όλα τα αρσενικά που μελετήθηκαν RBP4 Μονάδα Μπατάλα Μονάδα Γκασνάκη Μονάδα Δαρμάρη Διασπορά γονοτύπων ΑΑ ΑΒ ΒΒ Συχνότητα γονοτύπων ΑΑ ΑΒ ΒΒ 33,3 50,0 16,7 25,0 62,5 12, Συχνότητα αλληλομόρφων Α Β 0,58 0,42 0,56 0, Στη μονάδα Μπατάλα, οι μισοί από τους 6 αρσενικούς είναι ετερόζυγοι, ένας δύο αρσενικοί φέρουν τον γονότυπο ΑΑ ενώ μόνο ένας φέρει τον γονότυπο ΒΒ. Στη μονάδα Γκασνάκη, τα περισσότερα αρσενικά που χρησιμοποιούνται για την γονιμοποίηση των χοιρομητέρων φέρουν τον ετεροζύγωτο γονότυπο ΑΒ, μόνο οι δύο από τους 8 φέρουν τον γονότυπο ΑΑ και μόνο ένας αρσενικός φέρει τον γονότυπο ΒΒ. Η δειγματοληψία γενετικού υλικού κι επομένως η γενετική ανάλυση των αρσενικών αγριόχοιρων που χρησιμοποιούνται για γονιμοποίηση των χοιρομητέρων στη μονάδα Δαρμάρη δεν ήταν εφικτή. 126

129 Συσχέτιση μεταξύ των γονοτύπων και των αναπαραγωγικών χαρακτηριστικών των χοιρομητέρων (ΤNB-NBA-NW) Στους Πίν. 21, 22 και 23 εμφανίζονται οι μέσοι όροι των αναπαραγωγικών χαρακτηριστικών των χοιρομητέρων για τα συνολικά γεννηθέντα χοιρίδια ανά τοκετό (TNB), τα γεννηθέντα ζωντανά χοιρίδια ανά τοκετό (NBA) και τα απογαλακτισθέντα χοιρίδια ανά τοκετομάδα (NW) για τις μονάδες Μπατάλα, Γκασνάκη και Δαρμάρη αντίστοιχα σε σχέση με το γονότυπο του γονιδίου RBP4. Πίν. 21: Μέσος όρος του κάθε γονότυπου του γονιδίου RBP4 για κάθε αναπαραγωγικό χαρακτηριστικό, σε όλες τι χοιρομητέρες της Μονάδας Μπατάλα (n=120) Γονότυπος Αναπαραγωγικό χαρακτηριστικό χοιρομητέρας ΤΝΒ ΝΒΑ NW ΑΑ 15,3 ± 0,2 a 13,2 ± 0,4 a 12,3 ± 0,1 a ΑΒ 15,1 ± 0,3 b 12,5 ± 0,2 b 12,1 ± 0,3 b ΒΒ 14,5 ± 0,1 c 12,1 ± 0,7 c 11,7 ± 0,2 c Οι τιμές στην ίδια στήλη με διαφορετικό εκθέτη, παρουσιάζουν στατιστικά σημαντική διαφορά (a, b για p < 0.05 και c, d για p < 0.01) Στη μονάδα Μπατάλα, οι χοιρομητέρες με γονότυπο ΑΑ εμφανίζουν περισσότερα συνολικά γεννηθέντα χοιρίδια ανά τοκετό σε σχέση με τις χοιρομητέρες που φέρουν τον γονότυπο ΑΒ και ΒΒ. Όμοια τάση παρουσιάζουν και τα αποτελέσματα που αφορούν τα γεννηθέντα χοιρίδια ανά τοκετό, όπου και πάλι οι χοιρομητέρες με γονότυπο ΑΑ παρουσιάζουν μεγαλύτερες τοκετομάδες. Επίσης, στην ίδια μονάδα, οι χοιρομητέρες που φέρουν τον γονότυπο ΑΑ παρουσιάζουν την μεγαλύτερη τιμή απογαλακτισθέντων χοιριδίων ανά τοκετομάδα. Σε όλες τις περιπτώσεις οι χοιρομητέρες με τον γονότυπο ΒΒ παρουσιάζουν τις μικρότερες αποδόσεις ενώ οι ετεροζύγωτες χοιρομητέρες εμφανίζουν ενδιάμεσες αποδόσεις. 127

130 Πίν. 22: Μέσος όρος του κάθε γονότυπου του γονιδίου RBP4 για κάθε αναπαραγωγικό χαρακτηριστικό, σε όλες τι χοιρομητέρες της Μονάδας Γκασνάκη (n = 280) Αναπαραγωγικό χαρακτηριστικό χοιρομητέρας Γονότυπος ΤΝΒ ΝΒΑ NW ΑΑ 13,9 ± 0,4 a 12,7 ± 0,3 a 11,9 ± 0,1 a ΑΒ 13,5 ± 0,1 b 12,6 ± 0,2 a 11,8 ± 0,2 a ΒΒ 13,1 ± 0,3 c 12,4 ± 0,3 a 11,6 ± 0,2 b Οι τιμές στην ίδια στήλη με διαφορετικό εκθέτη, παρουσιάζουν στατιστικά σημαντική διαφορά (a, b για p < 0.05 και c, d για p < 0.01) Ομοίως με τη μονάδα Μπατάλα, οι χοιρομητέρες με γονότυπο ΑΑ και στην μονάδα Γκασνάκη, εμφανίζουν περισσότερα συνολικά γεννηθέντα χοιρίδια ανά τοκετό σε σχέση με τις χοιρομητέρες που φέρουν τον γονότυπο ΑΒ και ΒΒ. Επίσης, οι ίδιες χοιρομητέρες παρουσιάζουν περισσότερα γεννηθέντα χοιρίδια ανά τοκετό σε σχέση με τις υπόλοιπες χοιρομητέρες. Ομοίως, οι χοιρομητέρες αυτές παρουσιάζουν την μεγαλύτερη τιμή απογαλακτισθέντων χοιριδίων ανά τοκετομάδα, ενώ είναι ξεκάθαρο επίσης πως και για τα τρία αναπαραγωγικά χαρακτηριστικά, οι χοιρομητέρες με τον γονότυπο ΒΒ παρουσιάζουν τις μικρότερες αποδόσεις και οι ετεροζύγωτες χοιρομητέρες εμφανίζουν ενδιάμεσες αποδόσεις. Πίν. 23: Μέσος όρος του κάθε γονότυπου του γονιδίου RBP4 για κάθε αναπαραγωγικό χαρακτηριστικό, σε όλες τι χοιρομητέρες της Μονάδας Δαρμάρη (n = 20) Γονότυπος Αναπαραγωγικό χαρακτηριστικό χοιρομητέρας ΤΝΒ ΝΒΑ NW ΑΑ ΑΒ ΒΒ 7,4 ± 1,6 6,3 ± 1,7 5,1 ± 1,3 Στη μονάδα Δαρμάρη, ο μέσος όρος των αποδόσεων σε όλα τα αναπαραγωγικά χαρακτηριστικά των χοιρομητέρων με γονότυπο ΒΒ παρουσιάζεται εμφανώς πιο χαμηλός σε σύγκριση με τις χοιρομητέρες από τις άλλες δύο μονάδες. Επίσης, όλες οι χοιρομητέρες φαίνεται κατά μέσο όρο να έχουν σχεδόν πάντα από ένα νεκρό χοιρίδιο ανά τοκετό ενώ παράλληλα χάνουν ένα ακόμα χοιρίδιο από το σύνολο της τοκετομάδας μέχρι τον απογαλακτισμό. 128

131 Γενικές παρατηρήσεις για τη συσχέτιση μεταξύ των γονοτύπων του γονιδίου RBP4 και των αναπαραγωγικών χαρακτηριστικών των χοιρομητέρων Τα αποτελέσματα από τη μελέτη του πολυμορφισμού του γονιδίου RBP4, που εξετάστηκε σε εμπορικές και σε εκτατικές μονάδες χοίρων, δείχνουν πως το συγκεκριμένο γονίδιο σχετίζεται με το μέγεθος της τοκετομάδας των χοιρομητέρων. Η στατιστική ανάλυση των δεδομένων αποκάλυψε πως υπήρχε στατιστικά σημαντική διαφορά στο μέγεθος της τοκετομάδας των ομοζύγωτων χοιρομητέρων με τις χοιρομητέρες AA να δίνουν μεγαλύτερες τοκετομάδες σε επίπεδο σημαντικότητας p< Επίσης, ολόκληρος ο πληθυσμός των χοιρομητέρων της εκτατικής εκμετάλλευσης, που κατά κύριο λόγο εμφανίζουν χαμηλές τοκετομάδες, παρουσίασε αποκλειστικά τον γονότυπο ΒΒ. Επομένως προκύπτει πως μεταξύ των δύο αλληλομόρφων, το αλληλόμορφο Β είναι αυτό που σχετίζεται με τις χαμηλές τοκετομάδες στις χοιρομητέρες. Για τον λόγο αυτό, προτείνεται το γονίδιο RBP4 να συμπεριλαμβάνεται στα μελλοντικά σχήματα βελτίωσης που βασίζονται στην επιλογή βάσει γενετικών δεικτών. 129

132 4.9. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΤΑ ΤΟΥ ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΟΥ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ ESR2 Αποτελέσματα από τον προσδιορισμό των γονοτύπων των χοιρομητέρων και των κάπρων για το γονίδιο ESR2. Οι αναμενόμενες ζώνες του γονιδίου RBP4 μετά την ηλεκτροφόρηση των δειγμάτων και την ηλεκτροφόρηση σε gel αγαρόζης εμφανίζονται στον Πίν. 24. Πίν. 24: Αναμενόμενες ζώνες του γονιδίου ESR2 μετά την PCR-RFLP Γονότυπος ΒΒ ΑΒ ΑΑ Μέγεθος ζώνης 142 bp 202 bp και 142 bp 202 bp Οι ζώνες που προέκυψαν από την εφαρμογή της τεχνικής PCR-RFLP και την ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR και της πέψης με το ένζυμο Hsp92II, εμφανίζονται στην Εικ. 25. Εικ. 25: Οι τρεις γονότυποι του γονιδίου ESR2 130