Feb Mai Cursul 1

Transcript

1 Feb Mai 2014 Cursul 1

2 Fluxul informaţiei genetice genă (ADN) transcriere genetică transcript primar (ARN) procesarea transcriptului ARN mesager traducerea informatiei genetice peptid ARN ribozomal ARN de transfer ARN antisens Structura Materialului Genetic ADN = acid deoxiribonucleic ARN = acid ribonucleic ADN şi ARN = un fel de polimeri Unităţile de bază (monomerii) = nucleotide, legate între ele prin legături covalente - fosfodiesterice Deci, ADN şi ARN = structuri polinucleotidice

3 Nucleotid = datp deoxyadenosine triphosphate bază azotată pentoză (un zahar format din 5 atomi de carbon) un rest de radical fosforic Adenina şi guanina = purine dgtp deoxyguanosine triphosphate dctp deoxycytidine triphosphate Timina şi citozina = pirimidine dttp deoxythymidine triphosphate Thymine O CH 3

4 În structura ADN nucleotidele sunt legate între ele prin legături fosfodiesterice (de tip covalent) Lanţuri polinucleotidice Catene polinucleotidice

5 Majoritatea moleculelor de ADN = 2 catene polinucleotidice = ADN dublu-catenar = ADN d.c. Întotdeauna : o A de pe o catenă se împerechează cu o T de pe cealaltă catenă şi invers (o T, cu o A) o G se împerechează cu o C, şi invers Împerecherea = formarea de legături de hidrogen 2 legături de hidrogen între A şi T A T 3 legături de hidrogen între G şi C G C Cele două catene sunt legate între ele prin legături de hidrogen Cele două catene sunt complementare una cu cealaltă. Într-o moleculă de ADN d.c. numărul de A = numărul de T numărul de G = numărul de C

6 Legile lui Chargaff 1. cele 2 catene polinucleotidice sunt complementare una faţă de cealaltă Aceasta înseamnă că unei adenine de pe una din catene îi corespunde o timină pe cealaltă catenă, de care se leagă prin 2 legături de hidrogen (A = T); se spune, deci, că adenina este complementară cu timina. În mod similar, guanina este complementară cu citozina, de care se leagă prin 3 legături de hidrogen (G C). Se deduce că legăturile de hidrogen permise sunt: A = T şi G C În moleculele de acizi nucleici dublucatenare dar formate dintr-o catenă ADN şi o catenă ARN (asemenea molecule hibrid se formează de obicei în procesul de transcriere genetică), adeninelor din catena ADN le corespund în catena ARN molecule de uracil. Şi în acest caz se formează tot două legături de hidrogen: A = U. 2. într-o moleculă de acid nucleic d.c. purinele sunt în raport echimolar cu pirimidinele Această regulă este, de fapt, o consecinţă a primei legi. Astfel, dacă oricărei A de pe una din catene îi corespunde o T pe cealaltă catenă şi oricărei G îi corespunde o C, atunci numărul moleculelor de adenină este egal cu numărul celor de timină, adică A = T şi, respectiv, G = C. Prin adunarea celor două ecuaţii, se deduce: A + G = T + C. Deci, numărul purinelor dintr-o moleculă de acid nucleic d.c. este egal cu numărul pirimidinelor. Altfel spus, cele două tipuri de molecule se află în raport echimolar. 3. cele două catene polinucleotidice dintr-o moleculă de acid nucleic d.c. sunt antiparalele O catenă polinucleotidică are două capete: la un capăt se află carbonul din poziţia 5 (C5 ) al unei pentoze, iar la celălalt capăt se află carbonul din poziţia 3 (C3 ) al unei alte pentoze. În interiorul unei celule o asemenea catenă polinucleotidică este sintetizată chiar în această direcţie: 5 3. Cele 2 catene polinucleotidice ale unei molecule d.c. sunt în orientări inverse una faţă de cealaltă: capul 5 al fiecăreia corespunde cu capul 3 al celeilalte. Cele 2 catene sunt antiparalele.

7 P - fosfat Albastru - zahar Baze: ATGC

8 Două reprezentări ale dublului helix ADN. (a) Dublu-helix ADN de formă B. Scheletul glucido-fosforic (în gri şi marcat cu linii roşii ii) se află la exteriorul helixului. Bazele azotate se află la interior. Sunt marcate curbura majoră şi cea minoră a helixului. (b) Structura schematizată a unui ADN dublu-helix. Cele două schelete glucido-fosforice (în verde închis şi deschis) sunt în orientare inversă: 5 3, faţă de 3-5. Bazele azotate de pe cele două catene sunt prezentate în albastru şi roşu.

9 Dublul helix

10

11 Parametri helicali n = numărul de nucleotide per tur de spiră (de elice) h = distanţa dintre perechile de nucleotide adiacente P = pasul elicei şi este distanţa traversată de-a lungul axei helixului de un tur complet de spiră (adică de o rotaţie de 360 o ). P poate fi exprimat în raport cu numărul de nucleotide dintr-un tur (n) şi cu distanţa dintre 2 nucleotide în procesul de rotaţie (h) t = unghiul de răsucire sau de rotaţie a perechile de baze azotate; acestea nu sunt perfect perpendiculare pe axa helixului (sau, altfel spus, două perechi de baze adiacente nu sunt coplanare), ci sunt înclinate cu un unghi de răsucire t care, de obicei, este 34,6 o. Aceaste este de fapt cauza pentru care cele două catene se răsucesc una în jurul celeilalte, formând o structură de dublu-helix. Valorile acestori parametri pot varia între anumite limite şi determină mai multe forme topologice ale moleculei de ADN d.c. Forma B reprezintă conformaţia cel mai des întâlnită în celule. Are un diametru de aproximativ 20 Angstrom (Å), iar distanţele dintre perechile de baze este de aproximativ 3,4 Å. În această conformaţie există o medie de 10,4 baze azotate per tur de spiră, iar unghiul de rotaţie dintre 2 baze adiacente este de +34,6º. Forma A se întâlneşte în celule în regiunile dublucatenare ale moleculelor de ARN şi în dublu-helixurile hibride ADN ARN ce se formează în procesele de transcriere genetică. Are un diametru de aproximativ 23 A, 11 baze per tur de spiră şi un unghi de +34,7º. Forma Z este mai subţire (un diametru de 18A), 12 baze per tur şi un unghi de -30º între ele. Datorită acestui lucru, formele A şi B sunt denumite de dreapta, iar forma Z este de stânga.

12

13 Denaturarea şi renaturarea moleculelor de ADN dublu-catenare

14 Tipuri de molecule ADN

15 Tipuri de molecule ADN ADN monocatenar (mc) unele virusuri, de ex. parvovirusuri ADN dublucatenar (dc) circular ADN ul unor virusuri Cromozom bacterian Plasmide bacteriene ADN mitocondrial ADN cloroplastic ADN dc circular de la virusul SV40 ADN dc circular din mitocondrii umane linear Unele virusuri, de ex. Adenovirusuri, virusuri herpes, varicella etc Cromozomi de la eucariote ADN dc linear uman in replicare

16 Replicarea ADN Toate moleculele de ADN, lineare sau circulare, se replică Dpdv chimic, replicarea = sinteza unei catene noi de ADN, folosind drept matriță o altă catenă ADN, pe bază de complementaritate (A T, G C) O moleculă ADN d.c. se desface (se desfac legăturile de hidrogen şi se separă cele 2 catene una de cealaltă) Fiecare din aceste 2 catene este folosită drept matriță: pe fiecare matriță se sintetizează o catenă nouă 1 moleculă ADN dc replicare 2 molecule ADN dc 1 moleculă m ADN dc Desfacerea legăturilor de H 2 molecule ADN mc Ataşarea area primerilor Prelungirea primerilor şi formarea catenelor noi catene parentale catene fiice

17 1 moleculă m ADN dc Desfacerea legăturilor de H 2 molecule ADN mc Ataşarea area primerilor Prelungirea primerilor şi formarea catenelor noi catene parentale catene fiice T G T T A A C T G G C A T A C A A T T G A C C G T A T G T T A A C T G G C A T A C A A T T G A C C G T A T G A C A T T A A C T G G C A T C A T T G T T A A C T G G C A T A C A A T T G A C C G T A T A A C T G G C A T C A T A C A A T T G A C C G T A A C A A T T G A C C G T A

18

19

20 Replicarea ADN se desfăşoară la bifurcarea de replicare zonă unde desface dublul helix Ptr fiecare din cele 2 catene iniţiale (parentale), se sintetizează o catenă nouă, pe bază de complementaritate : - acolo unde pe catena parentală este o A, pe catena nouă vine o T, şi invers - acolo unde pe catena parentală este o G, pe catena nouă vine o C, şi invers Fiecare din catenele parenatale este folosită ca matriţă ptr sinteza unei catene noi Sinteza catenei noi se face in direcţie ie Ptr că în ADN d.c. cele 2 catene sunt în orientare inversă (una 5 3, iar cealaltă 3 5 ), sinteza celor 2 catene noi se face în direcţie opusă, dar întotdeauna în sens 5 3 La o bifurcaţie de replicare - una din catene este sintetizată continuu, de la un singur primer = catena conducătoare, leading - cealaltă catenă este sintetizată din bucăţi = fragmente Okazaki, fiecare pornind de la un primer catenă întârziată, lagging

21 1 moleculă m ADN dc P P bifurcatie de replicare Dublul helix se desface mai departe Bifurcatia de replicare se deplaseaza (spre stanga) P Atasarea unui nou primer Catena intarziata (lagging) Sinteza discontinua, de la mai multi primeri Catena conducatoare (leading) Sinteza continua, de la un singur primer Fragmente Okazaki

22 1 moleculă m ADN dc P P bifurcatie de replicare Dublul helix se desface mai departe Bifurcatia de replicare se deplaseaza (spre stanga) P Atasarea unui nou primer Catena intarziata (lagging) Sinteza discontinua, de la mai multi primeri Catena conducatoare (leading) Sinteza continua, de la un singur primer Fragmente Okazaki

23

24 Trei moduri posibile de replicare

25

26 De reținut 1 moleculă ADN dc replicare 2moleculeADNdc Fiecare catenă a moleculei parentale = matriță ptr sinteza unei catene noi Sinteza catenelor noi se face prin complementaritate cu catenele vechi: A T, G C Sinteza unei noi catene ADN începe intotdeauna de la un primer ADN polimeraza poate adăuga nucleotide pornind de la un cap 3 OH liber, dar nu poate iniția sinteza unui lanț polinucleotidic Primer = un fragment oligonucleotidic scurt, de obicei ARN O catenă nouă se sintetizează întotdeauna în direcție 5 3 Una din catenele noi este sintetizată continuu, pornind de la un singur primer Cealaltă catenă este sintetizată discontinuu, pornind de la mai mulți primeri, este formată din fragmente = fragmente Okazaki

27 Feb Mai 2014 Cursul 2

28 Enzimologia replicării ADN Pre inițiere Etape Regiunea unde începe replicarea moleculei de ADN = origine a replicării O moleculă ADN poate avea: 1 regiune ori Cromozom bacterian Plasmide bacteriene ori C ori V Pre inițiere Inițiere Elongare Terminare Cromozomul bacterian este un replicon unic

29

30 mai multe regiuni ori Cromozomi de la eucariote Cromozomii de tip eucariot sunt structuri multirepliconice

31 (după Watson, 2013, Molecular Biology of the Gene, 7th Edition)

32 Sinteza ADN este catalizată de o clasă de enzime = ADN polimeraze ADN polimerazele o mână care prinde joncțiunea/regiunea matriță primer Prin analogie, cele 3 domenii peptidice deget mare (thumb) degete (fingers) palma / podul palmei (palm) conține situl activ, catalitic leagă 2 ioni metalici bivalenți 2 Mg 2+ sau 2 Zn 2+

33 Ordinea evenimentelor în n sinteza ADN: Nucleotidul nou se împerechează cu următorul nucleotid liber de pe matriță Numai un nucleotid nou complementar cu cel liber de pe matriță ă se poate împerechea Domeniul palm asigură spațial complementaritatea nucleotidului nou şi nucleotidul liber de pe matriță Domeniul degete se strânge în n jurul joncțiunii catenă veche matriță catenă nouă Acum conformația enzimei poziționează ionează corect cei 2 ioni metalici Are loc reacția de formare a legăturii fosfodiesterice şi i ataşarea area nucleotidului nou la primer 1 Mg P primer primer 3 OH 5 P primer 3 O 5 P primer 3 O + dntp α P β P γ P atac nucleofilic al grupării α fosfat al dntp asupra grupării 3 O 5 P primer dntp 3 OH + β P γ P 1 Mg legătură fosfodiesterică Se redeschide domeniul degete Regiunea / joncțiunea matriță primer(+1 dntp) se deplasează cu 1 pereche de baze ADN polimeraza este gata ptr următorul ciclu,, ptr p adăugarea următorului nucleotid

34 1 Mg P primer primer 3 OH 5 P primer 3 O 5 P primer 3 O + dntp α P β P γ P atac nucleofilic al grupării α fosfat al dntp asupra grupării 3 O 5 P primer dntp 3 OH + β P γ P 1 Mg legătură fosfodiesterică

35 Ordinea evenimentelor în n sinteza ADN: Nucleotidul nou se împerechează cu următorul nucleotid liber de pe matriță Numai un nucleotid nou complementar cu cel liber de pe matriță ă se poate împerechea Domeniul degete se strânge în n jurul joncțiunii catenă veche matriță catenă nouă Acum conformația enzimei poziționează ionează corect cei 2 ioni metalici Are loc reacția de formare a legăturii fosfodiesterice şi i ataşarea area nucleotidului nou la primer Se redeschide domeniul degete Regiunea / joncțiunea matriță primer(+1 dntp) se deplasează cu 1 pereche de baze ADN polimeraza este gata ptr următorul ciclu,, ptr p adăugarea următorului nucleotid

36 La o bifurcație de replicare, ambele catene ADN sunt sintetizate împreună în n acelaşi i timp

37 Inițierea unei noi catene ADN necesită un primer Toate ADN polimerazele au nevoie de un cap 3 OH 3 liber, al unui nucleotid ADN polimerazele nu pot iniția ia sinteza de ADN nu pot ataşa a primul nucleotid Pot doar prelungi, prin p formarea unei prime legături fosfodiesterice pornind de la un cap 3 OH 3 liber Primer = fragment oligonucleotidic m.c. m ce oferă ADN polimerazei un cap 3 OH liber În n celule (in( vivo) ) primerii = fragmente ARN În anumite tehnici ( n anumite tehnici (in vitro) ) se pot utiliza şi i primeri ADN În n celule, enzima ce sintetizează primeri = PRIMAZĂ = o ARN polimerază specială Primerii = fragmente ARN m.c., de nucleotide Primaza acționează atât pe catena conducătoare,, cât şi i pe cea întârziată,, dar : Catena conducătoare necesită un singur primer,, de la el sinteza ADN mergând continuu Catena întârziată necesită mai mulți i primeri, de la fiecare sintetizându se se câte un fragment Okazaki

38 Primerii trebuie apoi îndepărtați Pentru terminarea replicării unei catene întârziate, primerii trebuie îndepărtați i din structura fragmentelor Okazaki, şi înlocuiți i cu ADN Îndepărtarea primerilor RNaza H Taie legăturile fosfodiesterice dintr o o catenă ARN, în n cadrul unui dublu helix hibrid ADN : ARN Umplerea golurilor ADN polimerază Formarea ultimei legături fosfodiesterice ADN ligază

39 Separarea celor 2 catene parentale ADN helicaze La bifurcația ia de replicare, separarea celor 2 catene parentale prin ruperea legăturilor de H, este e realizată de ste realizată de ADN helicaze Proteine hexamerice cu formă de inel inelul intră pe una din cele două catene parentale şi i avansează pe ea, rupând legăturile de H dintre cele 2 catene Monocatenele ADN sunt stabilizate proteine Ssb Catenenele parentale desfăcute (denumite şi i monocatene) sunt stabilizate prin ataşare are de proteine Ssb Single stranded binding Monocatenele parentale sunt astfel disponibile ptr a fi utilizate e ca matriță în n sinteza de catene ADN noi

40

41 Suprarăsucirile sunt îndepărtate Topoizomeraze Desfacerea dublului helix parental şi i avansarea bifurcației iei de replicare produce suprarăsuciri în n fața a bifurcației. iei. Aceste suprarăsuciri sunt eliminate prin tăieri ale dublului helix, urmate u de derăsucire şi i re ligare Topoizomeraze Acționează pe ADN dc nereplicat, în n fața a bifurcației iei de replicare Taie una sau ambele catene ADN topoizomeraze de clasă I topoizomeraze de clasă II Rămân ataşate ate la capul tăiat şi îl l derăsucesc față ă de catenă netăiată Rămân ataşate ate la capetele tăiate şi i trec zona netăiată prin tăietură În n ambele cazuri, topoizomerazele refac legăturile pe care le au tăiat Scade gradul de răsucire a moleculei ADN parentale şi, astfel, helicaza poate desface mai departe legăturile de hidrogen dintre catenele parentale

42

43 Specializarea ADN polimerazelor În n fiecare celulă există mai multe tipuri (specii moleculare) de ADN polimeraze, fiecare având un rol distinct inct Rolul central al ADN polimerazelor Replicarea corectă şi i eficientă a genomului Alte roluri Replicarea golurilor lăsate de excizarea primerilor ARN Replicarea golurilor formate în n procesele de reparare ADN Replicarea unor molecule ADN extracromozomale plasmide, ADN mitocondrial, ADN platidial Deşi i numele proteinelor este diferit de la o specie la alta, activitățile ile enzimatice desfăşurate pentru replicarea ADN cromozomal sunt practic aceleaşi i la organisme extrem de îndepărtate filogenetic bacterii, drojdii, om

44

45 Viteza ADN polimerazei este crescută de SLIDING CLAMPS Procesivitatea mare a ADN polimerazei la bifurcația ia de replicare ADN pol adaugă milioane de nucleotide fără să se desprindă de pe ADN Replicarea rapidă a cromozomului Viteza foarte mare a ADN polimerazei O proteină denumită sliding sliding clamp

46 Sliding clamps sunt poziționate de CLAMP LOADERS Proteinele sliding clamps sunt deschise şi i poziționate ionate pe molecula de ADN de către alte proteine clamp loaders Au 5 subunități şi i folosesc ATP La E.coli,, clamp loader = complexul g (γ)( În n celulele EK, clamp loader = factorul de replicare C (RF C)

47 Sinteza ADN la bifurcația de replicare La bifurcația ia de replicare, catenele conducătoare şi întârziată (leading şi lagging) ) sunt sintetizate simultan La o aceeaşi i bifurfacție ie funcționează mai multe ADN pol ie de replicare se formează un complex proteic = ADN polimeraza III holoenzimă La E.coli,, la o singură bifurcație de replicare se formează un complex proteic ADN pol III holoenzima 3 copii ADN pol III miez 1 sliding clamp loader 1 sliing clamp

48

49

50 F IGUR E 9 24 Binding of the DNA helicase to DNA Pol III holoenzyme stimulates the rate of DNA strand separation. The t subunit of the sliding clamp loader interacts with both the DNA helicase and the DNA polymerase at the replication fork. (a) When this interaction occurs, the DNA helicase unwinds the DNA at approximately the same rate as the DNA polymerases replicate the DNA. (b) If the DNA helicase is not associated with DNA Pol III holoenzyme, DNA unwinding slows by 10 fold. Under these conditions, the DNA polymerases can replicate faster than the DNA helicase can separate the strands of unreplicated DNA. This allows the DNA Pol III holoenzyme to catch up to the DNA helicase and re form the replisome.

51

52 Arthur Kornberg

53 Aparat enzimatic care realizează replicarea ADN : ADN polimerază (III) holoenzima Primază = enzimă e complexă,, formată f din mai multe subunităţi i cu diverse funcţii; cea mai importantă funcţie : formarea legăturilor fosfodiesterice dintre deoxiribonucleotide Primază = o ARN polimerază,, sintetizează s scurte catene de ARN numite primeri Ligaza formează legături fosfodiesterice între nucleotide Helicază desface legăturile de hidrogen dintre cele 2 catene parentale Proteine Ssb (Single-Stranded Stranded Binding) se leagă de monocatene ADN şi i le stabilizează Topoizomeraze relaxează dublul helix,, scade s numărul de spire / kpb Topoizomeraze Nu poate porni sinteza catenei noi de novo,, ci o poate doar prelungi Are nevoie de o catenă scurtă pe care sa o prelungească - PRIMER 3 ADN pol III miez (palm, fingers, thumb) 1 sliding clamp 1 clamp loader RNază H scoate ribonucleotidele ce formează primerii ADN pol I umple golurile lăsate de RNaza H

54 Feb Mai 2014 Cursul 3

55 INIȚIEREA REPLICĂRII ADN Pre inițiere Etape Regiunea unde începe replicarea moleculei de ADN = origine a replicării O moleculă ADN poate avea: 1 regiune ori Cromozom bacterian Plasmide bacteriene ori C ori V Pre inițiere Inițiere Elongare Terminare Cromozomul bacterian este un replicon unic

56

57 mai multe regiuni ori Cromozomi de la eucariote Cromozomii de tip eucariot sunt structuri multirepliconice

58 INIȚIEREA REPLICĂRII ADN Replicarea unei molecule de ADN NU începe în n orice punct al moleculei, ci în n anumite situsuri = origini de replicare (ori) Formarea unei bifurcaţii ii de replicare necesită separarea celor 2 catene parentale Replicon = fragment de ADN replicat de la 1 origine de replicare Cromozomul de E.coli are 1 ori cromozom unirepliconic (replicon unic) Majoritatea bacteriilor au cromozomi unirepliconici Fiecare cromozom de la eucariote are mai multe regiuni ori cromozomi multirepliconici Sistemul de iniţiere iere a replicării ADN este format din 2 componente: Componenta ADN = regiunea ori, denumită şi replicator are o anumită secvenţă ă de nucleotide Componenta proteică = proteine de iniţiere, iere, denumite şi iniţiator iator, PRIMOSOM se ataşează la ori (replicator)

59 Majoritatea secvenţelor elor replicator de la diverse organisme conţin: - o regiune de legare a proteinelor de iniţiere iere - o regiune bogată în n A/T uşor de desfăcut legăturile de H de către proteinele iniţiator iator Situsul oric este în n afara acestei regiuni E.coli 5 cutii dna A (9) = regiuni 9-merice9 aici se ataşează proteina Dna A 3 regiuni 13-merice (13) bogate în n A/T aici se desface dublul helix SV40 4 situsuri P = regiuni 5-merice5 aici se ataşează proteina iniţiator iator antigenul T 2 regiuni EP (Early Palindrome) = 20 pb aici se desface dublul helix E.coli SV40 S.cerevisiae situsuri de ataşare are 5 dna A, 9-mers 4 P, 5-mers 2 A, B1 proteine iniţiator iator Dna A antigenul T ORC situsuri de desfacere 3 13-mers 2 EP (20pb) 1 B2 S.cerevisiae 2 regiuni A, B1 aici se ataşează proteina ORC 1 regiune B2 aici se ataşează helicaza aici se desface dublul helix

60 Proteinele iniţiator: iator: - se ataşează la replicator,, situs-specific: specific: E.coli 5 cutii dnaa - interacţionează ionează cu alte proteine pe care le aduc la replicator - unele desfac dublul helix în n reginile adiacente situsului de legare Principalele etape ale iniţierii ierii replicării cromozomului E.coli (a) Mai multe exemplare de proteină DnaA-ATP ATP situsurile dnaa (b) Desfacerea dublului helix în n zona situsurilor 9-mers 9 (c) Ataşarea area helicazei bacteriene Dna B, adusă a de către Dna C (complexul Dna B Dna C) (d) Deplasarea helicazei îndepărtează proteinele Dna A hill.com/sites/dl/free/ /126997/animation17.html

61

62 Cromozomii de la EK se replică o singură dată per ciclu celular Replicarea ADN cromozomal numai în n faza S a ciclului celular În n faza S este replicată o dată şi i doar o singură dată toată cantitatea de ADN cromozomal Originile de replicare de pe cromozomii EK sunt separate de ~ 30 kpb : crz EK mici au > 10 ori crz umani mari au mii de ori Ptr ca fiecare crt EK să fie replicat integral în n timpul fiecărei faze S, trebuie t activat un număr suficient de mare de ori (nu neapărat toate ori,, dar d dacă sunt prea puţine, atunci anumite regiuni din genom vor rămâne ne-replicate) În n mod normal, nici un ori nu poate iniţia ia 2 runde de replicare în n aceeaşi i fază S; S deci, este e inactivat până la următoarea S Un crz EK cu 5 secvenţe e replicator - mai întâi sunt activate secvenţele ele 3 şi i 5 - se formează 2 bucle de replicare 4 bifurcaţii ii de replicare bidirecţională ională - secvenţele ele ori de pe moleculele fiice sunt blocate până la următoarea rundă (X) - elongarea bifurcaţiilor iilor de replicare depăşeşte replicatorii 2 şi i 4 înainte ca aceştia să se activeze - ca urmare, 2 şi i 4 nu se mai activează,, iar refginile respective sunt replicate în n mod pasiv - în n contrast, replicatorul 1 se iniţiază iază înainte ca replicarea să ajungă în n regiunea lui Prezenţa a pe un crz a mai multor replicatori decât ar fi necesar este o redundanţă,, dar d asigură replicarea completă a fiecărui crz.

63 Încărcarea helicazei Prima etapă în n iniţierea ierea replicării la EK La EK, etapele iniţierii ierii replicării ADN se desfăşoară în n faze distincte ale ciclului celular şi în n ordine diferită faţă ă de PK Încărcarea helicazei la toţi i replicatorii în G1 (înainte de S) Activarea replicatorilor (inclusiv activarea helicazei) Asamblarea replisomului în S Încărcarea helicazei pe crz EK - proteina ORC~ATP se ataşează la replicator - se ataşează proteina Cdc6 - helicaza (Mcm2-7) este adusă de Cdt1 - helicaza este încărcată pe ADN (ca dimer) - sunt eliberate Cdc6 şi i Cdt1 Cdc6, Cdt1 sunt similare cu DnaC de la PK

64 Helicazele încărcate sunt activate de 2 protein-kinaze: CDK (cyclin-dependent dependent-kinase) ce sunt activate la intrarea în n faza S [ Protein-kinaze = proteine care ataşează ează,, covalent, c grupări fosfat la alte proteine, ţintă ] DDK (Dbf4-dependent dependent-kinase), Aceste 2 protein-kinaze sunt activate la inrarea in faza S si, fie direct, fie prin intermediul altor proteine: - desfac helicaza in monomer - ataseaza cate un monomer de helicaza pe cate o monocatena ADN - In final are loc asamblarea replisomului = complex proteic Primaza (ADN pol ) ADN pol ADN pol Clamp,, clamp loader Helicaza

65 G1 + ORC Incarcarea helicazei pe ADN S Activarea helicazei Deschiderea dublului helix Formarea replisomului

66 TERMINAREA REPLICĂRII MOLECULELOR ADN Necesită un set de evenimente specifice Diferă de la molecule ADN CIRCULARE la molecule ADN LINEARE Terminarea replicării ADN circular cromozomul E.coli Replicarea avansează pe cele 2 bifurcaţii (replicare bidirecţională) Molecula ia forma literei greceşti THETA replicare pe model THETA La terminarea replicării, cele 2 molecule fiice ramân legate una de alta într-o structură de tip catenan Catenan = structură formată din 2 cercuri interconectate (2 zale dintr-un lanţ) Separarea celor 2 cromozomi = segregare Ptr că cei 2 crz sunt circulari: segregarea = decatenare Topoizomerază II Topoisomerase 1 and 2.flv Topoizomeraze de clasă II - taie una din cele 2 molecule (ambele catene) - trage molecula întreagă (netăiată) prin tăietură - reface molecula tăiată

67 Terminarea replicării ADN linear - cromozomii de la eucariote 1. Deşi cromozomii d ela EK sunt molecule ADN lineare, datorită dimensiunii mari, la terminarea replicării cele 2 molecule fiice sunt înfăşurate una în jurul celeilalte Topoizomeraze de clasă II 2. Replicarea catenei întârziate ridică probleme în regiunile terminale ale cromozomilor (telomere) - ultimul primer se găseşte exact la capătul 3 al catenei parentale - după îndepărtarea acestui primer de către RNaza H, molecula rămâne cu o catenă mai lungă capul 3 -dacă procesul s-ar opri aici, atunci la fiecare rundă de replicare, cromozomii s-ar scurta semnificativ, în final cu pierdere de gene Telomeraza

68 TELOMERAZA = o ADN pol l ce nu necesită primer separat Capetele cromozomilor eucariotici = TELOMERE Repetiţii ii cap-coadă ale unei secvenţe e bogate în n TG de e ex., telomerele cromozomilor umani = repetiţii ii ale secvenţei ei 5 TTAGGG 3 Majoritatea acestor repetiţii ii sunt d.c., dar capul 3 3 al fiecărui cromozom se prelungeşte monocatenar Această structură acţionează ca o nouă origine de replicare pentru o ADN polimerază specială s - TELOMERAZA TELOMERAZA = ribonucleoproteină r = Complex de proteine, una din ele = reverstranscriptază telomerazică TERT O moleculă de ARN = ARN telomerazic TER - include o scurtă regiune complementară cu repetiţia ia telomerică La om: 5 AAUCCCAAUC 3 - ca şi i alte ADN pol, extinde capul 3 3 al unui primer - pe post de primer, foloseşte capul 3 -OH 3 al catenei parentale - pe post de catenă matriţă ă foloseşte ARN-ul propriu - astfel, extinde capul 3 3 al catenei ADN parentale - telomeraza se desprinde de pe catena ADN, se deplasează spre capul 3 şi i se reaşează ează Procesul se reia de multe ori Capul 3 -OH 3 este prelungit cu multe repetiţii ii TTAGGG Apoi telomeraza se desprinde complet ADN pol obişnuită prelungeşte capul 5 5 În n final, la EK cromozomii au capul 3 3 extins, prelungit monocatenar

69 MBOG 8 Action of telomerase

70 Ordinea evenimentelor în n replicarea telomerelor - Telomeraza (T) se aşează a cu ARN-ul propriu (TER) în n zona de complementariatte a monocatenei ADN de la capul 3 -OH3 - extinde această monocatenă ADN,, folosind drept primer capul 3 -OH 3 al acesteia drept matriţă propriul ARN - T repetă de multe ori acest ciclu Extinde capul 3 3 cu multe repetiţii ii [ TTAGGG ] - apoi T se desprinde complet - capul 5 5 este prelungit, pe modelul unei catene întârziate, de către o ADN pol obişnuită În n final, la EK cromozomii au capul 3 3 extins, prelungit monocatenar

71 REPLICAREA ADN recapitulare I. INIŢIEREA IEREA ori 1 ori pe crz bacterian crz unirepliconic n ori pe crz EK crz multirepliconici Replicon = secvenţă ă ADN replicată de la un ori Secvenţele ele ADN din ori au funcţie de replicator situsuri de legare a proteinelor iniţiator iator + Proteine iniţiator iator = PRIMOSOM regiunile A/T, uşor de desfăcut Aici se formează bucla de replicare PK Complexul proteic primosom Proteina DnaA se ataşează la cutiile dnaa Distorsionarea ADN în n zona de legare Desfacerea dublului helix în n regiunile A/T PK Complexul proteic de iniţiere iere Proteina ORC~ATP se ataşează la replicator + proteine CDC ( - DnaC) Încărcarea helicazei (MCM)) pe ADN G1 + proteine CDK Activarea helicazei S Încărcarea helicazei (DnaB)) pe ADN de către DnaC Desfacerea dublului helix Formarea buclei de replicare cu cele 2 bifurcaţii ii Asamblarea replisomului Formarea buclei de replicare cu cele 2 bifurcaţii ii Asamblarea replisomului

72 II. ELONGAREA REPLISOM Primază Helicază ADN polimerază Proteine ajutătoare Sliding Clamp,, Clamp C loader RNază Ligază PK ADN pol III holoenzima 3 copii ADN pol III miez 1 sliding clamp 1 clamp loader Catena ADN nouă este sintetizată în n direcţie ie Catena ADN matriţă ă este citită în n direcţie ie inversă Catena ADN nouă este sintetizată prin complementaritate cu cea vechev La o bifurcaţie ie de replicare Una din catenele noi = catena c conducătoare,, in direcţia ia de deplasare a bifurcaţiei iei Cealaltă catenă nouă = catena întârziată, în n direcţie ie inversă

73 Funcţii Principala proteină de iniţiere a replicării Desfacerea legăturilor de H - Helicază Stabilizarea monocatenelor ADN DnaA DnaB Ssb Procariote ORC MCM RPA Eucariote Sinteză de primeri Primază = o ARN polimerază specială Menţine ADN pol pe ADN şi îi creşte procesivitatea Încarcă sliding clamp pe ADN ADN polimeraza replicativă Procesarea fragmentelor Okazaki (a) Eliminarea primerilor (b) Umplerea golurilor prin sinteză ADN (c) Ligarea fragmentelor Okazaki Derăsucirea ADN parental în faţa buclei de replicare Derăsucirea moleculelor d.c. fiice Terminarea replicării PK segregarea celor 2 crz bacterieni EK terminarea replicării la telomere DnaG Sliding Clamp ( -Clamp) Clamp Loader (subunităţi: ) ADN pol III miez RNaza H ADN pol I ADN ligaza H Topoizomerază de clasă I Topoizomerază de clasă II (ADN girază) Topo cls I, Topo cls II Topoizomerază cls II ADN pol PCNA RFC ADN pol pe catena întârziată ADN pol pe cat.conducătoare RNaza H Dna2, FEN1 ADN ligaza I Topoizomerază de clasă I Topoizomerază de clasă II Topo cls I, Topo cls II Telomeraza

74 III. TERMINAREA PK PK Cromozomul bacterian = ADN dc CIRCULAR Cromozomii eucariotelor = ADN dc LINEAR Terminarea replicării 2 molecule ADN dc circulare interconectate Terminarea replicării capul 3 3 al moleculei parentale este extins Desfacerea celor 2 molecule TOPO cls II TELOMERAZA (a) Prelungeşte capul 3 3 cu multe repetiţii ii TTAGGG - Primer = capul 3 3 al catenei vechi - Matriţă = ARN telomerazic (TER) Acest proces de reverstranscriere se repetă de multe ori (b) Se desprinde complet de pe ADN (c) ADN pol prelungeşte capul 5 5 (sinteză prin fragmente Okazaki) În n final, cromozomii au capul 3 3 extins, prelungit monocatenar

75 Alfabet grecesc Literă mare Literă mică Se citeşte Literă mare Literă mică Se citeşte alfa niu beta ksi gama omicron delta pi epsilon rho (ro) zeta sigma eta tau theta ipsilon iota phi (fi) kappa chi (hi) lambda psi miu omega

76 Feb Mai 2014 Cursul 4

77 De la ADN la cromozomi În n celule, moleculele de ADN sunt asociate cu proteine Fiecare moleculă ADN + proteinele asociate = cromozom, şi i la PK, şi i la EK Cuvântul cromozom : chroma = culoare, soma = corp cromozom = corp colorat Împachetarea ADN ului în n cromozomi îndeplineşte mai multe funcții : ADN ul celular are dimensiune mai mare decât celula ptr a încăpea în n celulă,, ADN ul trebuie compactat Împachetarea ADN ului şi i asocierea cu proteine protejează față ă de alterări ADN ul nud este destul de instabil în n celule, spre deosebire de cromozomi, care sunt mult mai stabili Doar în n formă compactată în n cromozomi, ADN ul poate fi transmis eficient şi i egal la cele 2 celule fiice Crz conferă o organizare globală fiecărei molecule de ADN,, organizare o ce conferă şi i accesibilitate către ADN ½ din masa unui crz EK = proteine Cromatină = regiuni din ADN asociate cu proteine Majoritatea proteinelor asociate cu moleculele de ADN = proteine cu g.m. g Mică,, bazice HISTONE Alte proteine asociate cu ADN : NON HISTONE reglează replicarea,, repararea, recobinarea şi i transcrierea Primul rol improtant al proteinelor asociate cu ADN, în n mod special al histonelor, este compactarea moleculelor de ADN De ex: grosimea medie a unei pb = 3,4 Å 1 celulă c umană conține 3 x 10 9 pb / set haploid, ~ Å ~ 1 m 1 cel. are în n nucleu ( φ =10 15mm) 15mm) 2 m de ADN

78 Fiecare celulă are un anumit număr, specie-specific, de cromozomi PK Nu există membrană nucleară nu există nucleu Majoritatea PK au 1 cromozom = 1 moleculă de ADN d.c. d circular Cromozomul bacterian nucleoid ADN extracromozomal: PK pot avea şi i plasmide (molecule ADN dc, de obicei circulare) Organismele se înmulțesc prin diviziune celulară simplă fisiune binară EK Majoritatea celulelor EK sunt DIPLOIDE: : au câte 2 exemplare din fiecare crz, dar cele 2 exemplare nu sunt s identice Număr par de cromozomi în n nucleu (2n),( fiecare crz = 1 moleculă ADN d.c. d linear ADN extracromozomal: în n mitocondrii, cloroplaste câte molecule ADNdc circular ADN mt Diploidia asigură înmulțirea de tip sexuat a organismelor EK gameții au ½ nr.crz Organismele EK (majoritatea) se înmulțesc prin reproducere sexuată (câte 1 exemplar din fiecare tip de crz) Celule 2n meioză Gameți n fecundație unirea a 2 gameți Celule 2n

79 Cromozomul la procariote c r o m o so m b a cter ia n p l i er e c i r ca 5 0 d o m e n i i p e r c r o m o so m b a cter ia n REP su p r a r a su ci r e REP d o m en i i su p r a sp i r a l i z a t e n ega tiv A D N gir a za

80 Cromozomul la eucariote

81

82

83 SPECIE Nr.total crz Nr.seturi haploide Nr.crz. / set haploid Forma crz Dimensiune genom [Mpb] P R O C A R I O T E Escherichia coli circular 4,6 Staphylococcus aureus circular 2,8 Vibrio cholerae circular Agrobacterium tumefaciens C, 1 L 5,7 E U C A R I O T E Saccharomyces cerevisiae drojdia de bere 32 1 sau 2 16 linear 12,1 Caenorhabditis elegans linear 97 Arabidopsis thaliana linear 125 Allium cepa linear Pisum sativum mazăre linear 4500 Drosophila melanogaster linear 180 Mus musculus linear 2600 Felis catus pisica domestică Canis familiaris câine linear linear Sus scrofa porc domestic linear 2700 Ovis aries oaie linear 2700 Bos taurus vaca domestică linear 2900 Equus caballus cal linear 2600 Gorilla gorilla linear 2900 Pan troglodytes linear 3300 Homo sapiens linear 3200

84 Organismele mai complexe au densitate genică scăzută

85 NUCLEOZOMUL Nucleosomes Are the Building Blocks of Chromosomes În n celulele EK, majoritatea cantității ii ADN este împachetat în n NUCLEOSOMI Nucleosom = miez de 8 protenie histonice + regiunea ADN înfăşurată în n jurul lor ADN ul dintre 2 nucleosomi adiacenți i = ADN linker (de legătură) Asamblarea/împachetarea mpachetarea în n nucleosomi = prima etapă şi i esențială în n compactarea ADN ului Prin asamblare/împachetare mpachetare în n nucleosomi, ADN ul se scurtează de 6 ori ADN înfăşurat în n jurul unui octamer histonic ~ 147 pb, de 1,7 ori Aspect de mărgele pe un fir H2A H2B H3 H4

86 Histonele = proteine mici, încărcate pozitiv Histonele = cele mai abundente proteine asociate cu ADN la EK proteine mici, încărcate pozitiv (conținut ridicat în n AA încărcat pozitiv) KDa H2 H4 H4 21 KDa H1 5 tipuri: H1, H2A, H2B, H3, H4 histonele miez 2 x [ H2A, H2B, H3, H4 ] = MIEZUL NUCLEOSOMULUI 1 x H1 1 se leagă la ADN ul linker, dintre 2 nucleosomi

87 Miezul proteic al nucleosomului are formă de disc În n soluție, cele c 4 tipuri t de histone se asamblează astfel: H2A + H2B heterodimer H2A H2B H2B H3 + H4 heterodimer H3 H4 H4 2 heterodimeri H3 H4 H4 tetramer H3 H4 H4

88 H2A H2B H3 H4 Asamblarea unui nucleosom este realizată într o o anumită ordine: 1. Dimerizarea histonelor H3 + H4 heterodimer [H3 H4] H4] 2 x [H3 H4] H4] tetramer 4[H3 H4] H4] 2 x H2A dimer 2[H2A] 2 x H2B dimer 2[H2B] 2. Inițierea ierea nucleosomului 1 tetramer 4[H3 H4] H4] se ataşează la ADN 3. Terminarea formării nucleosomului dimeri 2[H2a] şi i 2[H2B] se ataşează la acest complex NUCLEOSOM

89

90 STRUCTURA CROMATINEI Eucromatina şi i Heterocromatina De foarte multe ori, cromozomii nu se colorează uniform: Eucromatina se colorează mai slab este mai activă ca rată de transcriere Heterocromatina se colorează mai intens este mai puțin activă ca rată de transcriere Histona H1 seleagă la ADN linker dintre nucleosomi Odată formați i nucleosomii, următarea etapă în împachetarea moleculelor de ADN = legarea histonei H1 H1 = o proteină mică, încărcată pozitiv,, se leagă la ADN ul dintre nucleosomi Se leagă la ADN în n 2 zone: o zonă este exact în n afara unui nucleosom o zonă este regiunea centrală de înfăşurare a ADN în n jurul histonelor miez În n acest mod, H1 1 stabilizează s asocierea ADN ului cu proteinele nucleosomale şi i deci, stabilizează structura nucleosomului

91 Adăugarea histonei H1 H un nivel superior de compactare a ADN ului

92 Următoarea etapă de compactare = FIBRA DE 30 nm Eviden 2 modele m de structură a fibrei de 30 nm Modelul SOLENOID Evidențiată iată şi in vitro şi in vivo Se formează un superhelix ce conține 6 nucleosomi n per spiră ADN ul linker se găseşte spre interiorul superhelixului, dar NU trece prin axul central l al acestuia Zonele de intrare şi ieşire a ADN din nucleosomi NU sunt accesibile Lungimea ADN ului linker variază (distanța dintre 2 nucleosomi) Modelul ZIGZAG Se formează un superhelix ce conține 4 nucleosomi n per spiră ADN ul linker TRECE prin axul central al superhelixului Zonele de intrare şi ieşire a ADN din nucleosomi nu sunt mai accesibile Regiunile cu linker mai lung (deci cu densitate mai mică de nucleosomi) ) ai a fibra de 30 nm cu structură ZIGZAG Într un acelaşi i nucleu se pot întâlni în n simultan ambele forme

93 Regiunile amino terminale ale histonelor sunt necesare ptr formarea fibrei 30 nm Cozile amino terminale ale histonelor nucleosomale (H2A, H2B, H3, H4) interacționează ionează cu nucleosomii adiacenți

94 Următoarea etapă în n compactarea ADN = formarea de bucle mari Formarea nucleosomilor + formarea fibrei 30 nm compactarea ADN cu scurtare pînă p la de 40 de ori Este încă insuficient este necesară compactarea mai puternică a ADN Model: Fibra 30nm formează bucle mari,, de kpb, ținute de o structură proteică denumită NUCLEAR SCAFFOLD (traducere ad literam: : schelă s nucleară) 2 clase de proteine: Topo II: : la baza fiecărei bucle,, menține forma buclată; ; buclele sunt topoizomeri Proteine SMC (Structural Maintenance of Chromosome) Se formează fibra de cromatină = structură s de bază a cromozomilor

95 Chromosome Structure Changes as Eukaryotic Cells Divide Gradul de condensare a materialului genetic variază în n timpul unui ciclu celular Interfază condensare mai redusă a materialului genetic,, permite transcriere, replicare, reparare După replicare,, moleculele fiice: asamblare nucleosomi formarea fibrei 30nm coeziunea cromatidelor surori complex proteic denumit coezină În n interfază nu se văd cromozomii ca entități i distincte citologic; sunt vizibile doar blocuri cromatice cromatină, unele colorate mai slab eucromatină,, altele a colorate mai intens heterocromatină

96 Profază continuă condensarea cromatinei (deci, a materialului genetic) formarea cromozomilor ca entități vizibile la microscop (procesul se mai numeşte şi condensarea cromozomilor ) La sfârşitul diviziunii celulare reîncepe procesul de decondensare a cromozomilor, pâna la gradul de fibră de cromatină

97

98 DEZASAMBLAREA / ASAMBLAREA NUCLEOSOMILOR în replicarea ADN Nucleosomii sunt dezasamblați i pe molecula parentală, în n fața a bifurcației iei de replicare asamblați i pe moleculele fiice, în n ordinea anterior prezentată Tetramerii H3 H4 H4 vechi trec ca atare, fie la una din moleculele noi, fie f la cealaltă Dimerii H2A şi i H2B vechi nu trec direct la moleculele noi, ci intâi în n soluție.

99