.aiavramidis.gr ΖΑΡΟΜΥΤΙΔΟΥ Ε.

Transcript

1

2

3 ΒΙΤΑΜΙΝΗ D Είναι μία στεροειδής λιποδιαλυτή βιταμίνη που από ένα ατυχές ιστορικό γεγονός στις αρχές της δεκαετίας του 1920 ταξινομήθηκε ως βιταμίνη παρά ως στεροειδή ορμόνη. Χαρακτηρίζεται και ως προ-ορμόνη Είναι ο γενικός όρος που χρησιμοποιείται για να περιγράψει τις 2 κύριες μορφές στεροειδών παραγώγων (μεταβολιτών) της 25 υδροξυβιταμίνης D (25OHD) που κυκλοφορούν στο αίμα: την βιταμίνη D 3 (Χοληκαλσιφερόλη ή 25OHD 3 ) και την βιταμίνη D 2 (Εργοκαλσιφερόλη ή 25OHD 2 ) Βιταμίνη D 3 παράγεται κατά 80-90% κυρίως στο δέρμα υπό την επίδραση της υπεριώδους ακτινοβολίας Βιταμίνη D 2 προέρχεται από διαιτητικές πηγές φυτικής προέλευσης.

4 Η ΒΙΤΑΜΙΝΗ D ΚΑΙ ΟΙ ΔΙΑΦΟΡΕΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΕΣ ΚΑΤΑΣΤΑΣΕΙΣ ΕΛΕΙΨΗ/ΑΝΕΠΑΡΚΕΙΑ ΒΙΤΑΜΙΝΗΣ D: 1. Σοβαρές σκελετικές διαταραχές: ραχίτιδα στα παιδιά οστεομαλακία στους ενήλικες, η υπερπαραθυρεοειδισμό ( αύξηση οστικού μεταβολισμού ελάττωση της οστικής πυκνότητας του οστού) 2. Εξωσκελετικές διαταραχές: ΣΔ, ΣΝ, αυτοάνοσα νοσήματα, καρκίνο, κατάθλιψη, άνοια, επιληψία, Πολυκυστικές ωοθήκες

5 ΣΥΝΘΕΣΗ ΚΑΙ ΜΕΤΑΒΟΛΙΚΟ ΜΟΝΟΠΑΤΙ ΒΙΤΑΜΙΝΗΣ D Ανεξαρτήτως από την διαδρομή εισόδου της βιταμίνης στον οργανισμό, το 85%-90% αυτής και των μεταβολιτών της, μεταφέρεται στην κυκλοφορία συνδεδεμένη με μια ειδική πρωτεΐνη μεταφοράς: την δεσμευτική πρωτεΐνη βιταμίνης D (vitamin D binding protein, ή DBP), ενώ ένα 10%-15% είναι συνδεδεμένο με αλβουμίνη και λιποπρωτεΐνες. Το ελεύθερο (μη συνδεδεμένο) κλάσμα που είναι λιγότερο από 1% και θεωρείται μόνο ότι αυτό το κλάσμα να είναι βιολογικά ενεργό Στο τέλος της διαδικασίας, η δραστική μορφή της βιταμίνης D (1,25-διυδροξυ βιταμίνη D ), απελευθερώνεται στην κυκλοφορία του αίματος.

6 ΠΟΙΑ ΒΙΤΑΜΙΝΗ D ΘΑ ΕΚΤΙΜΗΣΟΥΜΕ; ΤΙ ΕΙΝΑΙ ΠΡΟΤΙΜΟΤΕΡΟ ΝΑ ΜΕΤΡΗΣΟΥΜΕ ΜΙΑ ΒΙΟΛΟΓΙΚΑ ΑΝΕΝΕΡΓΗ ΜΟΡΦΗ ΒΙΤΑΜΙΝΗΣ D Ή ΤΗΝ ΕΝΕΡΓΗ ΜΟΡΦΗ ΤΗΣ; Αν και η βιολογικά δραστική ορμόνη είναι 1,25-διυδρόξυβιταμίνηD3 ή (1,25(OH)2D3 προτιμάται ως προϊόν μέτρησης η ολική 25 (ΟΗ) D, συμπεριλαμβανομένου και τις 2 μορφές βιταμίνης D2 και D3, (βιολογικά αδρανείς) Τα επίπεδα της 25-ΟΗ ύδροξυβιταμίνης D αντανακλούν με μεγαλύτερη ακρίβεια τα αποθέματα βιταμίνης D του σώματος. Υπάρχουν όμως και περιπτώσεις που πραγματικά χρειάζεται να γνωρίζουμε τα επίπεδα της 1,25(OH)2D3: Ανεξήγητη υπερασβεστιαιμία (αναζήτηση για λέμφωμα ή κοκκιωματώδη νόσο) Πιθανολογούμενη γενετική ραχίτιδα στα παιδιά Υποψία οστεομαλακίας προκαλούμενης από όγκο Κάποιες περιπτώσεις νεφρολιθίασης ή υπερασβεστιουρίας Σε ΧΝΑ ασθενείς 4 ου και 5 ου σταδίου ( 1,25(OH)2D3), η μέτρηση της 25(ΟΗ)D ΑΠΟΤΕΛΕΙ ΤΗΝ ΠΙΟ ΑΞΙΟΠΙΣΤΗ ΕΞΕΤΑΣΗ για την μέτρηση των αποθηκών της βιταμίνης D.

7 ΟΛΙΚΗ 25 (ΟΗ) D Είναι δύσκολο να μετρηθεί με ακρίβεια Οι δυσκολίες μέτρησης οφείλονται : 1. στην υδρόφοβη και λιπόφιλη φύση της, 2. στην ισχυρή σύνδεση της με την DPB, 3. Στην σύνδεση της με την αλβουμίνη, 4. στις διασταυρούμενες αντιδράσεις των μεταβολιτών της D (π.χ. 24,25- διυδροξυβιταμίνη ή 3-epi25(OH)D) 5. στις παρεμβολές στις αναλύσεις από τα ετεροφυλικά αντισώματα 6. στο μεγάλο εύρος των τιμών της βιταμίνης στα δείγματα Η παραγωγή της δεν ρυθμίζεται από την PTH Χρόνος ημίσειας ζωής ~ 15 ημέρες 1,25-ΔΙΥΔΡΟΞΥΒΙΤΑΜΙΝΗ D3 Δαπανηρή μέθοδος προσδιορισμού Δύσκολη τεχνική ανάλυση λόγω της χαμηλής της συγκέντρωσης και της φυσικοχημικής της συμπεριφοράς Δεν αποτελεί τον αντιπροσωπευτικό δείκτη μέτρησης της βιταμίνης D, καθώς η τιμή της αυξομειώνεται με την πρόσληψη Ca Η παραγωγή της ρυθμίζεται από την PTH και τα επίπεδα του φωσφόρου. Σε σοβαρή ανεπάρκεια η 1,25(OH)2D3 εμφανίζεται με πολύ χαμηλά επίπεδα. Η έλλειψη της βιταμίνης D ή η μερική αποκατάσταση της, μπορεί να οδηγήσει σε αύξηση των επιπέδων της 1,25(OH)2D3 Χρόνο ημίσειας ζωής ~ 15h

8 FREE 25(ΟΗ)D ΕΙΝΑΙ ΕΝΑΣ ΑΞΙΟΠΙΣΤΟΣ ΔΕΙΚΤΗΣ; Βάση της θεωρίας, «υπόθεσης των ελεύθερων ορμονών»: Η βιολογική δραστηριότητα μίας δεδομένης ορμόνης επηρεάζεται από την συγκέντρωση της ελεύθερης ορμόνης, και όχι από την συγκέντρωση της ορμόνης που μεταφέρεται συνδεμένη με την πρωτεΐνη του πλάσματος Έγινε παρόμοιος συσχετισμός του ελευθέρου κλάσματος της 25(ΟΗ)D και των μεταβολιτών της. Τα συμπεράσματα από το τελευταίο workshop που έλαβε χώρα στην Βοστώνη τον Μάρτιο του 2016 είναι τα παρακάτω: Οι μετρήσεις της FREE 25(ΟΗ)D είναι πιο αξιόπιστες σε σύγκριση με τις μετρήσεις της ολικής 25(ΟΗ)D: Σε ασθενείς με ηπατική ανεπάρκεια και σε εγκυμονούσες Στους υγιείς ενήλικες συνδέεται στενά με τις συγκεντρώσεις της ολικής 25(ΟΗ)D Διαπιστώθηκε αρνητική συσχέτιση ανάμεσα στην FREE 25(ΟΗ)D και στην PTH Υπό συζήτηση είναι το ερώτημα εάν οι μετρήσεις της FREE 25(ΟΗ)D υπερέχουν των μετρήσεων της ολικής βιταμίνης

9 ΠΟΙΟΣ Ο ΡΟΛΟΣ ΤΗΣ DBP ΣΤΗΝ ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΤΗΣ ΒΙΤΑΜΙΝΗΣ D; Η κυκλοφορούσα 25 (OH) D είναι συνδεδεμένη με τη την δεσμευτική πρωτεΐνη βιταμίνης (DBP) ή με ειδική ομάδα συμπλέγματος (Gc) ~ κατά 85%. Η συγκέντρωσης της ολικής 25 (ΟΗ) D μπορεί να επηρεαστεί από την συγκέντρωση της DBP ( συγκέντρωση της DBP στον ορό συγκέντρωση της 25(ΟΗ)D στον ορό) Η DBP επηρεάζεται από φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις. Αυξάνει κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης, και μειώνεται σε περίπτωση τραύματος και στους αιμοκαθαιρόμενους ασθενείς με ένα διακυμαινόμενο βαθμό. Η συγκέντρωση της DBP διαφέρει ανάλογα στις φυσιολογικές παραλλαγές του γενοτύπου της DBP (Gc). Μέχρι τώρα έχουν ταυτοποιηθεί περισσότεροι από 120 πολυµορφισµοί του γονιδίου της DBP και οι περισσότερο μελετημένοι πολυµορφισµοί του γονιδίου της DBP είναι οι Gc- 1f, Gc-1s και Gc-2, που χαρακτηρίζονται από μία αλλαγή του αμινοξέος.

10 ΠΟΙΟΣ Ο ΡΟΛΟΣ ΤΗΣ DBP ΣΤΗΝ ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΤΗΣ ΒΙΤΑΜΙΝΗΣ D; Ο γονότυπος Gc-2 συνδέεται με χαμηλότερες συγκεντρώσεις DBP και χαμηλότερες συγκεντρώσεις της ολικής 25 (ΟΗ) D. Οι γονότυποι της Gc ποικίλλουν ανά χώρα και φυλή. Ο Gc-1f είναι πιο κοινός στις αφρικανικές χώρες και σε ορισμένες ασιατικές χώρες. Οι Gc-1s και Gc-2 είναι πιο κοινοί στις ευρωπαϊκές χώρες και στους Αμερικανούς της λευκής φυλής.

11 ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΒΙΤΑΜΙΝΗΣ D

12 ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΒΙΤΑΜΙΝΗΣ D ΡΑΔΙΟΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΕΣ ΜΕΤΡΗΣΕΙΣ (RIA) ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΕΣ ΜΕΤΡΗΣΕΙΣ (IMMUNOASSAYS) ΑΜΕΣΕΣ ΜΕΤΡΗΣΕΙΣ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ (DIRECT DETECTION METHODS) ΧΕΙΡΟΚΙΝΗΤΕΣ ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΕΣ ΜΕΤΡΗΣΕΙΣ (MANUAL) ΑΥΤΟΜΑΤΟΠΟΙΗΜΕΝΕΣ ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΕΣ ΜΕΤΡΗΣΕΙΣ (AUTOMATED) LC-MS/MS HPLC

13 ΑΡΧΕΣ ΔΕΚΑΕΤΙΑΣ 70 ΤΕΛΗ ΤΟΥ ΑΡΧΕΣ ΤΟΥ ΑΙΩΝΑ ΙΣΤΟΡΙΚΗ ΑΝΑΔΡΟΜΗ Η πρώτη μέθοδος που περιγράφηκε για την ανίχνευση της D ήταν η δεσμευτική ανταγωνιστική πρωτεΐνη μετά από διαχωρισμό με ένα διαλύτη (competitive protein binding after solvent extraction), ή Competitive protein binding assay (CPBA) Εφαρμόστηκε η τεχνική της υγρής χρωματογραφίας υψηλής πίεσης (HPLC). Αναπτύχθηκε η πρώτη ραδιοϊσοτοπική ανάλυση (RIA), ενώ παράλληλα εκείνη την περίοδο εφαρμόστηκε και η ενζυμοανοσολογική τεχνική (ELISA) ή χημειοφωταύγειας (CLIA). Εφαρμόστηκε η τροποποιημένη τεχνική της υγρής χρωματογραφίας υψηλής πίεσης, η διπλή φασματομετρία μαζών (tandem mass spectrometry ή LC-MS/MS) ως gold standard μέθοδος.

14 ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ ΚΑΙ ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ ΤΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ RIA ΜΕTA ΑΠO ΕΚΧΥΛΙΣΗ ΔΙΑΛΥΤΗ Diasorin (Μ) RIA ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΕΚΧΥΛΙΣΗ ΔΙΑΛΥΤΗ IDS (Μ) ΑΜΕΣΗ ΕΝΖΥΜΟΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΗ (EIA) IDS (Μ) Liaison Total Diasorin (Α) ΧΗΜΕΙΟΦΩTΑΓΕΙΑ isys IDS (Α) Elecys Roche Ανταγωνιστική μέθοδος (Α) Η εκχύλιση του διαλύτη ελαχιστοποιεί το «matrix effects» Σχετικώς οικονομική μέθοδος Απλή τεχνική Σχετικώς οικονομική μέθοδος Απλή τεχνική Σχετικώς οικονομική μέθοδος Ευρέως χρησιμοποιούμενη Απλή τεχνική Υψηλή διεκπεραιωτική ικανότητα Απλή τεχνική Υψηλή διεκπεραιωτική ικανότητα Απλή τεχνική Υψηλή διεκπεραιωτική ικανότητα Χρονοβόρα διαδικασία συγκριτικά με τις άμεσες ανοσολογικές μεθόδους Παραγωγή ραδιενεργών αποβλήτων Πιθανότητα εμφάνισης «matrix effects» Πιθανότητα εμφάνισης «matrix effects» Υποεκτίμηση της 25-hydroxyvitamin D2 Πιθανότητα εμφάνισης «matrix effects» Πιθανότητα εμφάνισης «matrix effects» Υποεκτίμηση της 25-hydroxyvitamin D2 Πιθανότητα εμφάνισης «matrix effects» Ανιχνεύει μόνο την 25-hydroxyvitamin D3

15 ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ ΚΑΙ ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ ΤΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ Υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης -HPLC (D) Υγρή χρωματογραφία διπλής φασματομετρίας μαζών LC/MS/MS (D) Διαδικασία αυτόματη ή ημιαυτόματη Ταυτόχρονος διαχωρισμός των μετρούμενων μεταβολιτών (25OHD2 and 25OHD3) Εφικτή η προτυποποίηση ελέγχου (standardization) Χαμηλό κόστος αντιδραστηρίου Ελαχιστοποίηση παρεμβολής του «matrix effects» Διαδικασία αυτόματη ή ημιαυτόματη Ταυτόχρονος διαχωρισμός των μετρούμενων μεταβολιτών (25OHD2 and 25OHD3) Εφικτή η προτυποποίηση ελέγχου (standardization) Χαμηλό κόστος αντιδραστηρίου Υψηλή ακρίβεια και πιστότητα Απαιτεί εξειδικευμένο προσωπικό Κάποιες διαδικασίες απαιτούν μεγάλο αριθμό δειγμάτων Πιθανή παρεμβολή από το επιμερές C3-25OHD Ακριβός εξοπλισμός Απαιτεί εξειδικευμένο προσωπικό Πιθανή παρεμβολή από το επιμερές C3-25OHD

16 Ο εργαστηριακός έλεγχος αποτελεί αναπόσπαστο κομμάτι της διαχείρισης των ασθενών: στην Διάγνωση, στην Παρακολούθηση και στο Θεραπευτικό αποτέλεσμα. Τα 2 σημαντικά χαρακτηριστικά για κάθε μέθοδο είναι: η Ακρίβεια (Accuracy) και η Πιστότητα (Precision). Προτυποποίηση (STANDARDIZATION): Είναι μία μέθοδος που συνδυάζει τις συχνότητες των ειδικών κατηγοριών σε μία και μοναδική τιμή, λαμβάνοντας υπόψη ένα σταθμισμένο μέσο όρο των συχνοτήτων αυτών. Η προτυποποίηση είναι: απαραίτητη για την μείωση των σφαλμάτων μέτρησης ιδιαίτερα χρήσιμη για τις βιοχημικές παραμέτρους, όπου οι κλινικές αποφάσεις και η διαχείριση των ασθενών βασίζεται σε όρια απόφασης που δεν σχετίζονται με τη μέθοδο μέτρησης.

17 ΠΡΟΤΥΠΟΠΟΙΗΣΗ ΒΙΤΑΜΙΝΗΣ D Το 1989 κρίθηκε αναγκαία η δημιουργία του DEQAS (The Vitamin D External Quality Assessment Scheme), σύγκριση μέσης τιμής των συμμετασχόντων εργαστηρίων ώστε να ελαχιστοποιηθεί η απόκλιση των αποτελεσμάτων λόγω διαφορετικής μεθοδολογίας του εκάστοτε εργαστηρίου. Επίσης ένα άλλο πρόγραμμα Προτυποποίησης, το VDSP (The Vitamin D Standardization Program), που κάνει ταυτόχρονη διακρίβωση μεταξύ των διαφορετικών εργαστηριακών κέντρων και σύγκριση μεταξύ των επιδημιολογικών μελετών και των κλινικών δοκιμών Η Ευρωπαϊκή μελέτη ODIN (Food based solutions for optimal vitamin D nutrition and health through the life cycle) εφαρμόζει το πρόγραμμα VDSP για την σύγκριση επιπέδων της ολικής βιταμίνης D ανάμεσα σε 14 πληθυσμιακές μελέτες.

18 ΣΥΝΟΨΗ Ως προϊόν μέτρησης προτιμάται η ολική 25 (ΟΗ) D, μαζί με τις 2 μορφές μεταβολιτών βιταμίνης D2 και D3, διότι αντανακλούν με μεγαλύτερη ακρίβεια τα αποθέματα βιταμίνης D του σώματος Η LC/MS/MS είναι πιο ακριβής μέθοδος συγκριτικά με τις ανοσολογικές μετρήσεις και στην παρούσα φάση θεωρείται ως gold standard Προγράμματα προτυποποίησης είναι απαραίτητα για την μείωση των σφαλμάτων μέτρησης. Παράγοντες που επηρεάζουν την μέτρηση της βιταμίνης D είναι η παρουσία των μεταβολιτών. Η μέτρηση της ελεύθερης βιταμίνης D μπορεί μερικώς να λύσει προβλήματα στην μέτρηση, ειδικότερα αυτά που προκαλούνται από την παρουσία της DBP.

19